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R-Biopharm AG
An der neuen Bergstraße 17
64297 Darmstadt, Germany
www.r-biopharm.com
Controlo da Qualidade em
Vinhos
Alergéneos em Vinhos
CVRVV
Porto, 23/02/2011
A R-Biopharm
Empresa alemã produtora de testes de análise e diagnóstico
Presente em Portugal na área alimentar através da Ambifood
Sede em Darmstadt
Gama de produtos
– Constituintes
– Resíduos
– GMO
– BSE / Animal ID
– Microbiologia / Higiene
– Alergéneos
A Ambifood
Fundada em 2001
Áreas Alimentar, Ambiental, Industrial
Fornecedora de métodos de análise e diagnóstico
Equipamentos
Missão
– Contribuir para a competitividade do tecido empresarial nacional
ALERGENEOS
1. Introdução
“O que é alimento para alguns,
pode ser veneno para outros”
Titus Lucretius Carus
(99-55 B.C.) Poeta Romano e autor de
“De Rerum Natura” (On the Nature of the Universe)
Reacções Adversas aos Alimentos
Reacção Adversa Reacção Tóxica
Reacção Psicossomática Reacção Não-Tóxica
Imunológica
Alergia Alimentar
Não-Imunológica
Intolerancia Alimentar
IgE induced
not IgE induced
enzymopathy
not defined
pharmacological
Bruijnzeel-Koomen C. et al., Allergy 59: 623, 1995
Alergia Alimentar
alergeneos, presentes nos alimentos causam reacções
adversas no sistema imunitário das pessoas alérgicas
Quase todos os alergeneos são proteinas
As reacções alérgicas são causadas pela presença de
anticorpos IgE
Acredita-se que cerca de 25% das pessoas possam
apresentar uma reacção alérgica a algum alimento
Apenas 2-3% duma reacção alérgica real consegue ser
provada
Maiores alergéneos
Crianças Adultos
Leite 70%
Ovos 40%
Amendoim 5%
Trigo 4%
Amendoim 23%
Peixe, marisco 10%
Leite 7%
Ovo 4%
Source: Weißbuch „Allergien in Deutschland“
(Allergies in Germany)
>90% alergias causadas pelo ” Big 8”
Amendoim
Leite
Ovos
Peixe
Crustáceos
Nozes
Soja
Cereais
Portugal
Leite, Peixe, Ovos, Cereais
5 a 10% população
Source: Sociedade Portuguesa de Alergrologia e Imunologia Clinica
União Europeia
13/2000/EC : rotulagem alimentar
89/2003/EC : rotulagem dos alergeneos
2005/26/EC: alergeneos isentos de rotulagem
2007/68/EC: alteração da lista do 2005/26/EC
1266/2010: rotulagem de vinhos, Junho 2012
2. Legislação Rotulagem
Austrália
Food Standard 1.2.3.
SO2, Caseínas e sais K, Ovo, Leite e Frutos Secos
Canadá
Healt Canada a partir de 4/08/12
Cola de peixe, Ovo, Leite, Caseína
Australia
(The Code 2000)
Canada
(Health Canada 2008)
China
(Food & Environ-mental
Hygiene Dept. 2005)
EU
(EU directives 2000-2007)
Japan
(Ministry of Health 2001) **
South Africa
(Foodstuffs, Cosmetics &
Disinfectants Act 1972)
United States
(FALCPA 2004)
Gluten (Cereals) X X X X X X X
Crustacean X X X X X X
Molluscs X X
Egg X X X X X X X
Fish X X X X X X
Shellfish X
Peanut X X X X X X X
Soybean X X X X X X
Milk X X X X X X X
Tree nuts * X X X X X X
Sulfites X X X
Sesame X X X
Celery X
Mustard X X
Lupine X
Buckwheat X
* Almond, brazil nut, cashew, hazelnut, macadamia, queensland nut, pecan, pine nuts, pistachios, walnut
** Abalone, squid, salmon roe, shrimp/prawn, oranges, crab, kiwifruit, beef, tree nuts, salmon, mackerel, soybeans, chicken (poultry),
pork, mushrooms, peaches, yams, apples and gelatin
3. Testes de análise em Vinhos
Enzimáticos
– Sulfitos, Cobre, Ferro,Tartárico
– Açucares …. Álcoois … Ácidos
Contaminantes
– OTA
Alergéneos
– Ovo
– Leite
– Lisosima
– Gluten
– Histamina
Outros
– Brettanomyces
3. Testes de determinação de Alergéneos
PCR
ELISA
Lat. Flow Tests
quantitative, suited for automation
semiquantitative, qualitative
qualitative
ELISA RIDASCREEN® / RIDASCREEN®FAST
Dip Stick RIDA®QUICK / BIOAVID
PCR GEN-IAL / SureFood®
Enzimatico Boehringer/Roche ou Enzytec
Anticorpos
proteinas, que pertencem ao grupo das globulinas
(imunoglobulinas, Ig)
Existem em todos os animais
Presentes no sangue, outros fluidos (saliva, etc.) e em
muitos tecidos.
Altamente especificas na detecção de estruturas
definidas nos antigeneos com terminações Fab.
Quase todas as moléculas podem actuar como antigeneo
Há 2 tipo de anticorpos usados:
- monoclonal e policlonal.
Anticorpos
Como detectar as suas reacções?
Os anticorpos são muito pequenos para serem vistos
Nem as suas reacções com os antigeneos podem ser vistas
Desenvolveram-se métodos para visualizar a reacção
precipitação
Marcação radioactiva
Marcação fluorescente
Marcação por enzimas
Marcação por enzimas
Anticorpos podem acoplar-se a enzimas
(ex. Glucoseoxidase, Fosfatase Alcalina, Peroxidase, etc.)
estas enzimas podem catalizar a reacção originando um
produto colorido
método:
Imunohistologia
EIA – Ensaio Imuno Enzimático
EIA
EIA – ENSAIO IMUNO ENZIMÁTICO
Sistema onde a reacção anticorpo/antigeneo é
visualizada pela mudança de cor, promovida por uam
enzima acoplada ao anticorpo ou ao antigeneo.
a cor pode ser desenvolvida como uma cor soluvel
numa fase liquida (microplaca EIA) ou um precipitado
insoluvel numa superficie (fase solida EIA) ou num
tecido (imunohistoquimica)
A tecnologia EIA é usada para detecção/determinação
de antigeneos e anticorpos
A detecção pode ser: sandwich EIA ou
competitivo EIA
Sandwich
ELISA
Competitive
ELISA
Sandwich ELISA Sandwich ELISA
Após a adição do padrão ou
da amostra ocorre a ligação
anticorpo-analito. Um
segundo anticorpo marcado,
especifico para a
determinação, é adicionado e
também se liga ao analito,
formando uma ligação tipo
“sandwich”. Depois adiciona-
se o substrato que reage com
a enzima originando uma
coloração, que é
directamente proporcional à
concentração do analito.
A1 mL vinho + 19 mL sol. extração quente
RIDASCREEN® FAST – procedimento (I)
1
2
3 Filtrar ou centrifugar
Mix vortex
Procedimento ELISA
Colocar os poços no suporte 1/amostra
RIDASCREEN® FAST – procedimento (II)
4
5 Adicionar 100 µL de cada padrão ou
amostra por poço
Procedimento ELISA
Lavar e bater vigorosamente
contra papel absorvente
RIDASCREEN® FAST Assays – procedimento (III)
Incubar10 min e limpar os
poços
Adiconar 250 µL sol lavagem
(3x)
6
7
8
Procedimento ELISA
Adicionar 100 µL conjugado
RIDASCREEN® FAST – procedimento (IV)
Diluir o conjugado
Incubar 10 min ambiente
9
10
11
Procedimento ELISA
Lavar (3 x),
Adicionar 100 µL substrato-/cromogéneo
RIDASCREEN® FAST – procedimento (V)
Incubar 10 min no escuro ambiente
Adicionar 100 µL stop solution
13
14
12
Procedimento ELISA
Medir a absorvância @ 450 nm.
Usar RIDASOFT Win para cálculo resultados
OD
RIDASCREEN® FAST – procedimento (VI)
15
Procedimento ELISA
Testes Kits
LOD (ppm)
LOQ (ppm)
Critérios OIV* (ppm)
LOD LOQ
RIDASCREEN® FAST
Casein
0,24 0,5 <0,5 ≥1
RIDASCREEN®FAST
Lysosime
0,02 0,05 <0,5 ≥1
RIDASCREEN® FAST
Ei/Egg Protein
0,27 0,5 <0,5 ≥1
RIDASCREEN® Gliadin –
AOAC OM
1,5 2,5 Outros: Recuperações 80 / 105%
Sem interferentes
*Resolução OIV/OENO 427/210
Aplicação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg (I)
2 amostras vinho tinto (Pinot noir and St. Laurent) clarificadas com ovo em pó.
Medição do teor em ovo ao longo de diferentes etapas:
Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)
VALIDAÇÕES
Aplicação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg (II)
Amostras de vinhos alemães e italianos recolhidos no mercado.
Uma amostra de vinho italiano continha a concentração de 1.7 mg/kg ovo.
N=10
Am. J. Enol. Vitic. 62:3 (2011)
Standard OD
(450 nm) Egg concn
(mg/L)
Calibrator 1 0.101 0.0
Calibrator 2 0.421 0.5
Calibrator 3 0.544 1.5
VALIDAÇÕES
Validação RIDASCREEN® FAST Ei/Egg
Differentes materiais (extrato clara de ovo, ovo em pó (NIST) clara ovo em pó adicionadas a
vinho tinto
Recuperações entre 76 – 110%
VALIDAÇÕES
Validação RIDASCREEN® FAST Casein
Diferentes materiais como leite em pó e UHT foram adicionados a vinho tinto.
Recuperações entre 78 – 117%
VALIDAÇÕES
Validação RIDASCREEN® FAST Casein
Caseina dissolvida em PBS-buffer contendo urea e adicionada a vinho tinto.
Recuperações entre 100 – 102%
A caseina adicionada diretamente ao vinho precipita, logo as recuperações serão mais
baixas.
VALIDAÇÕES
Validação RIDASCREEN® FAST Lysozym (I)
Adicionada a vinho branco e tinto lisozima liofilizada Sigma
(L6876).
Recuperações entre 100 – 120%
VALIDAÇÕES
Validação RIDASCREEN® FAST Lysozym (II)
Usadas duas preparações comerciais em vinho tinto e branco
1.) LALLZYME™ Lyso-easy (Lallemand)
• solução pronta a usar
• 22% solução, sem aditivos, estável @ TA / 6 meses
• especifica para gram-positivo (LAB)
• usada em várias etapas (no mosto para reduzir as LAB e no final da
fermentação alcoólica fermentação malolática).
2.) BactiCare (Erbslöh)
• produzida a partir da clara do ovo
Conclusão
Estamos convictos que os testes da gama RIDASCREEN® para a
determinação de
• caseina
• ovo
• lisosima
São métodos robustos e confiáveis para determinar concentrações
residuais de agentes de tratamento do vinho