contrôle de la mort cellulaire par la voie des mapk1/3 sébastien cagnol equipe du dr ellen van...
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Contrôle de la mort cellulaire par la voie des MAPK1/3
Sébastien Cagnol
Equipe du Dr Ellen Van Obberghen-Schilling
Institut de Signalisation, Biologie du Développement et CancerCNRS UMR6543
Sous la direction du Dr Jean-Claude Chambard
La mort cellulaire programmée ou Apoptose
Conservée au cours de l’évolution
Mécanisme présent au sein de chaque cellule
Permet l’auto-élimination physiologique des cellules
La mort cellulaire programmée ou Apoptose
Au cours du développement embryonnaire
Dans l’organisme adulte
Maintien de l’homéostasie cellulaire et tissulaire
Remodelage des tissus
Renouvellement de certains tissus
Excès de mort cellulaire
Destruction tissulaire brutale (ischémie, hépatite)
Défauts de mort cellulaire
Maladies Autoimmunes
Maladies neurodégénératives
L’apoptose pathologique
Cancer
Les caspases
clivage auto-protéolytique
procaspases
caspases initiatrices
dimérisation
caspases effectrices
Les caspases
caspases effectrices
Modificationsdu cytosquelette
Fragmentation de l ’ADN et du noyau
Inhibition du potentiel mitochondrial
Réorganisation de la membrane plasmique
condensation cellulaire
corpsapoptotiques
caspase 8
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9Apoptosome
récepteursde mort
procaspase 9
cytochrome c
mitochondrie
FADD
L’activation des caspases
Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
procaspase 8
Bid
Apaf1
cytochrome c
mitochondrie
La voie mitochondriale
Stress cellulaire Agents antimitotiquesAgents génotoxiques
Apoptosome procaspase 9
Apaf1
cytochrome c
mitochondrie
Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
La voie mitochondriale
Apoptosome procaspase 9
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
cytochrome c
mitochondrie
Stress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
La voie mitochondriale
Apoptosome procaspase 9
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
récepteursde mort
cytochrome c
mitochondrie
FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
procaspase 8DISC
Les récepteurs de mort
Apoptosome procaspase 9
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
cytochrome c
mitochondrie
FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
procaspase 8
Les récepteurs de mort récepteursde mort
Apoptosome procaspase 9
caspase 8
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
récepteursde mort
cytochrome c
mitochondrie
FADDStress cellulaireAgents antimitotiquesAgents génotoxiques
procaspase 8
Bid
Les récepteurs de mort
Apoptosome procaspase 9
survieapoptose Facteurs de survie
matrice extracellulairesérum
cellules en prolifération
Survie cellulaire
PI3K
PKC MAPK
MEK
Raf
PKAJaksAKT
AMPc
Facteurs de survie
Les voies de survie
Croissance cellulaire
Prolifération cellulaire
Différenciation cellulaire
NFB
GTP
La voie des MAPK1/3
Prolifération
Différenciation
Survie cellulaire
Migration cellulaire
Ras
MEK1/2P P
Raf-1
MAPK1/3P
MAPK1/3P
P
KSR
GTP
Substrats cytosoliques
Substrats nucléaires
P
Récepteurs tyrosine kinase
Ras
Récepteurs couplés aux protéines G
Intégrines
B-Raf
MEK1/2
Raf1
MAPK1/3 MAPK1/3P P
P P
Le contrôle de l’activité des MAPK
Forme active phosphorylée Forme inactive
déphosphorylée
MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)
MEK1/2
Raf1
MAPK1/3 MAPK1/3P P
L’enlèvement du sérum inhibe les MAPK
Forme active phosphorylée
MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)
Forme inactivedéphosphorylée
pMAPK1/3
MAPK1
sérum : + -tamoxifène :
MEK1/2
Raf1
MAPK1/3 MAPK1/3
tam
tamoxifène
P P
P P
L’activation de Raf-1:ER maintient les MAPK actives
pMAPK1/3
MAPK1
sérum : + - -
+tamoxifène :
Raf-1:ER
Raf1
tam
ER
MAPK Phosphatases(MKP 1,2,3)
contraste de phase iodure de propidium
+ sérum
Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER
surviesérum
apoptose
apoptosesurvie
sérum
contraste de phase iodure de propidium
apoptose
contraste de phase iodure de propidium
MAPK
Raf1
tam
ER
Les fibroblastes CCL39 Raf-1:ER
L’activation de Raf:ER protège les cellules CCL39 contre la mort induite par enlèvement de sérum et d’ancrage (Le Gall. MBC 00 11,1103)
La voie des MAPK inhibe l’apoptose mitochondriale
mitochondrie
caspase 9
PAR
PARP
P
BclxL
tamoxifen (1M) : - - +
-sérum 24h
PARP
CCL39 Raf-1:ER
caspase 3
0 3 6 9 12 24
CCL 39
CCL 39BclxL
enlèvement de sérum ( h )
PARP
PARPp-MAPK
MAPK1
tamoxifène :
0 6 9 14 24
caspase 9
p-MAPK
MAPK1
procaspase 9p37p35
- - + - + - + - +
enlèvement de sérum (h) :
La voie des MAPK inhibe l’activité et l’activation de caspase 9
contrôle - sérum (14h) - sérum + tam
050
100150200250300
activ
ité c
aspa
se 9
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
cytochrome c
mitochondrie
L’apoptose mitochondriale
MAPK1/3
MEK1/2
Raf1
tam
ER
Apoptosome procaspase 9
contrôle - sérum (14h) - sérum + tam
dapi
caspase-3activée
cytochrome c
La voie des MAPK ne bloque pas la sortie du cytochrome c
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Apaf1
Apoptosome
fractionsprotéiques
lysatcellulaire
12000
0
20
40
60
80
669
443
200150
100
mAU
2.000 kDa
155 101Fractions :
Etude de la multimérisation d ’Apaf-1 par chromatographie d ’exclusion
colonne
cytochrome c
Apaf-1
cytochrome c
Apaf-1
Mr (kDa)
Fractions : 1 5 10 15
669 443 200
cytochrome c
Apaf-1
contrôle
- sérum+ tamoxifène
- sérum
La voie MAPK ne bloque pas l ’oligomérisation d ’Apaf1
Fractions : 1 10 20 30
669 443 200 150 66
contrôle
- sérum
Mr (kDA)
La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome
caspase 9
caspase 9
caspase 9- sérum+ tamoxifène
contrôle
Fractions : 1 10 20 30
669 443 200 150 66Mr (kDA)
Fractions de hautpoids moléculaire
concentrées
1 10 1 10 1 10
- sérum
La voie des MAPK ne bloque pas le recrutement de caspase 9 dans l ’apotosome
caspase 9
caspase 9
caspase 9
caspase 9
- sérum+ tamoxifène
contrôle
- sérum
- sérum+ tamoxifène
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
cytochrome c
mitochondrie
L’apoptose mitochondriale
MAPK1/3
MEK1/2
Raf1
tam
ER
Apoptosome procaspase 9
MEK1/2
MAPK1/3
Raf1
tam
P P
P P
ER
?
La protection par Raf1:ER est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ?
caspase 9
U0126 MEK1/2
MAPK1/3
Raf1
tam
P P
P P
caspase 9
ER
?
La protection est-elle dépendante des kinases MEK/MAPK ?
MAPK1/3
MEK1/2U0126
L’inhibition du clivage de caspase 9 dépend de l’activité MEK
0 0.3 1 3 10
-sérum (24h) + tam -S+S
p-MAPK
MAPK1
U0126 (µM) :
caspase 9
Raf1
tam
ER
apoptose
sérum
MAPK
sérum :
U0126 : 0 010 103
5% 1%
caspase 9
p-MAPK
0 4 6 8 10 12 14h
+ S - S - sérum + tamoxifène (24hr)
addition retardée de U0126 :
L’activité MEK est nécessaire de façon continue
caspase 9
MAPK1/3
MEK1/2U0126
Raf1
tam
ER
MEK1/2
MAPK1/3
Raf1
tam
P P
P P
protéineantiapoptotique
ER
?
La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ?
caspase 9
MEK1/2
MAPK1/3
Raf1
tam
P P
P P
protéineantiapoptotique
ER
?
La protection est-elle dépendante de l’induction d’une protéine antiapoptotique ?
caspase 9
émétine
+ S - S - sérum + tamoxifène (24hr)
MAPK1
0 2 4 6 8 haddition retardée d’émétine :
p-MAPK
L’effet protecteur de la voie MAPK dépend de la synthèse protéique
caspase 9
L’inhibition de caspase 9 dépend de mécanismes traductionnels et post-traductionnels
tamoxifène : - - -+ +
caspase 9 T125A
p-MAPK
Le mécanisme de protection ne dépend pas de la phosphorylation de caspase 9
sur son résidu T125
PETPCN
P
125
Allan et al, Nat Cell Biol 2003 5,647
caspase 9
- sérumNT
MAPK1/3P P
Conclusions
L’activation de la voie des MAPK inhibe le clivage de caspase 9
L’effet protecteur dépend de mécanismes traductionnelset post-traductionnels
L’activation de la voie des MAPK n’empêche pasla formation de l’apoptosome
caspases effectrices3,6,7
caspase 9
mitochondrie
MEK1/2
MAPK1/3 P P
P P
IAPs
Quel est le mécanisme d’inhibition ?
Raf1
tam
ER
caspase 9
XIAP
tamoxifen : - - +
-sérum 24h
Apoptosome procaspase 9
Rôle antiapoptotique de la voie MAPK dans les tumeurs
Développement tumoral
Inactivation de l’apoptosome
Mutation de B-Raf
MAPK1/3?
Le MAPK paradoxe
L’activation des MAPK induit la mort cellulaire
0 5 10 30 600 5 10 30 60
stimulationau sérum tamoxifèneexpo
stimulation (min) :
p-MAPK
MAPK1
Stimulation de la voie des MAPK dans les cellules HEK293 Raf1-ER
iodure de
propidium
L’activation prolongée des MAPK induit la mort des cellules HEK293
tamoxifène 24hcontrôle tamoxifène 48h
L’activation prolongée des MAPK induit l’ apoptose des cellules HEK293
0 13 18 24 30 40 48 72tamoxifène ( h ) :
MAPK1
p-MAPK
PARP
- + - +
ZVAD
tam (48h) :
PARP
AD
N s
ub-G
1 (%
)
0 24 48 720
10
20
40
30
50
tamoxifène ( h ) :
tamoxifène 48h (1M) : - + - + - +
CHX 1 g/mL
U0126 10 M
PARP
p-MAPK
MAPK1
L’apoptose dépend de l’activité MEK et de la synthèse protéique
Cycloheximide (CHX) = inhibiteur de la synthèse protéique
tamoxifène (48h):
10
30
35
40
25
20
15
5
14 24h 10
cliv
age
de P
AR
P (
%)
0
Une protéine apoptotique est accumulée durant les premières heures
addition retardée de cycloheximide
0 - + + + + +
tamoxifène (48h):
10
30
35
40
25
20
15
5
14 24h 10
0
0 - + + + + +
addition retardée de U0126 après
L’apoptose dépend d’une activation continue de la voie MAPK
cliv
age
de P
AR
P (
%)
caspase 8
caspases effectrices3,6,7
Apaf1
caspase 9
récepteursde mort
cytochrome c
mitochondrie
BclxL
Crm A
Apoptosome procaspase 9
CD8 Crm A BclxL
10
20
30
40
50
cliv
age
de P
AR
P (
%)
- + +tamoxifène (48h) :0
+
CD8
La mort induite par la voie MAPK dépend de la voie caspase 8
Cliv
age
de P
AR
P (
%)
- + - +- +tamoxifène (28h) : - +
5
10
15
0
CH11 TRAIL TNF
20
CH11TNFTRAIL
La voie MAPK favorise l’apoptose induite par les récepteurs de mort Fas et DR4/5
Fas DR4/5 TNFR
ligand (14h) :
La voie MAPK augmente l’expression de FADDpar un mécanisme post-transcriptionnel
tamoxifène ( h ) : 0 4 12 18 2414108
FADD
contrôletamoxifène ( 24h )
am
plifi
catio
n p
ar
RT
-PC
R
0 0.01 0.1 1 10quantité initiale d’ARN (ng)
0
10
20
30
40
50
FADD
36B4
MAPK1
CH11TRAIL
Fas DR4/5
caspase 8
FADD
La mort induite par la voie MAPK ne dépend pas des récepteurs de mort
FADD
MAPK1
- + + + +
siRNA GFP
siRNAFADD DN-FADD
PARP
DN-FADD
CH11TRAIL
FADD
Fas DR4/5
DN-FADD
siRNA FADD
caspase 8
tamoxifène (48h) :
- + ++IETD-fmk : - -
PARP
caspase 3active
caspase 8
- ++tamoxifène (48h) : +
Crm A:
+
-
La voie MAPK induit l’activation de caspase 8
procaspase 8
0 13 18 24 30 40 48 72tamoxifène ( h ) :
p42fragmentsclivés
p28
MAPK1
tamoxifène (48h) :
Conclusions partie 2
L’activation prolongée des MAPK1/3 induit l ’apoptose des cellules HEK293
La voie des MAPK active la caspase 8 indépendammentdes récepteurs de mort
La voie des MAPK augmente l’expression de FADD et favorise l ’apoptose induite par les récepteurs de mort
L’apoptotose dépend de mécanismes traductionnelset post-traductionnels
Perspectives partie 2
Activation de caspase 8 indépendante des récepteurs de mort
Augmentation d’expression de FADD est elle impliquée dansla régulation physiologique des récepteurs de mort ?
Ce mécanisme pourrait-il servir à réactiver l’apoptose dans les tumeur à forte activité MAPK ?
Implication dans les maladies neurodégénératives ?
Mécanismes d ’activation de caspase 8 ?
Mécanismes d’induction post-transcriptionnelle de FADD ?
Rôle dans des modèle physiologiques d ’apoptose induite par les récepteurs Fas et DR4/DR5 ?
Lien avec une activité nucléaire prolongée des MAPK ?
caspase 8
caspases effectrices
caspase 9
mitochondrie
MAPK1/3
Comment réconcilier les deux modèles ?
Bid
Apoptosome procaspase 9
Remerciements
Equipe Ellen Van Obberghen :Etienne Boulter Jean-Claude ChambardIvana Fantozzi Dominique GrallAnna MansourSylvie MaubantSamantha Sauze-Fernandez
INSERM U526 Dir P Auberger
INSERM U452 Dir P Boquet
Laboratoire d ’OncophamacologieDir: G Milano
Dr Urszula Hibner
Dr Alain Eychène
Equipe Anne-Odile HueberEquipe Gilles PagèsEquipe Jacques Pouysségur
UMR 6543
Association pour la Recherche sur le Cancer
La Ligue Régionale Contre le Cancer
Laboratoire du Dr Véronique Paquis
+S - sérum
ins Tam-Bim EL
Bim S
BIM
+S -S -S+Tam
LLNL :émetine :
++ +
Bim EL
P-MapK
BclXl
caspase 9
-
--
+
-
+
+
Tamoxifène :
U0126 :
p-MAPK
p-MEK
- sérum
-
Le mutant Raf T481A bloque le clivage de caspase 9
tamoxifène (48h) : - + - +
PARP
p-MAPK
MAPK3
cellules attachées
cellulesen suspension
tamoxifène (24h)
Cliv
age
de P
AR
P (
%)
0
10
20
30
40
50
tamoxifène: - + + + + +-CH11: - - - - + +-
DN-Fas : - - + - - +-
L’apoptose induite par la voie des MAPK ne dépend pas du récepteur Fas
* *
Morphologie des cellules HEK 293 mourantes