contagem de coliformes em placas e nmp
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Profa Leila Larisa Medeiros Marques
Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em
alimentos
DefiniçãoCOLIFORMES TOTAIS: grupo de bactérias
constituído por bacilos gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares e que fermentam a lactose com produção de aldeído, ácido e gás a 35ºC em 24-48 horas. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.
COLIFORMES FECAIS OU COLIFORMES TERMOTOLERANTES: são coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás à temperatura de 44,5 ± 0,2°C em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli, sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella e Citrobacter também apresentam essa capacidade.
Definição
Coliformes- significado em alimentosTotais: Utilizado para avaliar as condições
higiênicas, sendo que altas contagens significam contaminação pós-processamento, limpezas e sanificações deficientes, tratamento térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento ou estocagem.
Termotolerantes: empregado como indicador de contaminação fecal, ou seja, de condições higiênico-sanitárias, visto presumir-se que a população deste grupo é constituída de uma alta proporção de E. coli, que tem seu habitat no trato intestinal do homem e de outro animais. Além de indicar possibilidade de presença de outros patógenos entéricos.
TécnicasTécnicas
» Plaqueamento (sólido): aplica-se a amostras de matérias-primas, alimentos e rações, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado ≥ 100 UFC/g ou mL.
»NMP (líquido) em alimentos: aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.
»NMP (líquido) em água e gelo: Aplica-se a amostras de água e de gelo usados em estabelecimentos produtores de alimentos. O valor é obtido em NMP/100mL.
Pesquisa de coliformes: método em placas.Amostra: açúcar cristal, morango, coxinha e
hambúrguer
Ágar cristal violeta (VRBA) sais biliares e cristal violeta que inibem Gram+; Vermelho neutro (indicador)- revela a fermentação da lactose.
Bile bovina e corante verde brilhante que inibem Gram+.
Sais biliares – inibem Gram+; Mistura de fosfatos– impedem a acidificação do meio.
Eosina e azul de metileno são corantes inibidores de Gram +. Com a fermentação da lactose e produção de ácido, ocorre precipitação desses corantes que fornecem o brilho verde metálico característico da E. coli.
Caldo verde brilhante bile 2% lactose
Caldo EC
Ágar eosina azul de metileno (EMB)
45C°/24 a 48h
Plaqueamento sobrecamada
Prova confirmativa para coliformes totais
Prova presuntivapara coliformes totais
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes
Em posição invertida
Cada colônia para um caldo verde brilhante
Para cada tubo positivo no caldo verde brilhante passar para um tubo de caldo EC
Selecionar 3 colônias típicas e 3 atípicas para investigar
15 mL
Caracterização da E. coli
De cada tubo EC positivo
Técnica de esgotamento – por estrias
Expressão dos resultadosR =(C x c x d)/r R = Resultado C = número de colônias contadas c = número de colônias confirmadas r = número de colônias repicadas d = diluição utilizada
Resultado final= Rt (colônias típicas) + Ra (colônias atípicas)
Exemplo de resultado finalDiluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10
atípicas.
Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos
testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: RT = 20 x 4 x 100/5 = 1.600
Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: RA = 10 x 2 x 100/5 = 400
O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:
Resultado final = RT + RA = 1600 + 400 = 2000 = 2,0 x 103 UFC/g ou mL.
Exemplo de resultado finalDiluição 10-2 = 30 colônias contadas, das quais 20 eram típicas e 10
atípicas.
Para confirmação, foram repicadas 5 colônias de cada tipo. Quatro colônias típicas e duas atípicas apresentaram resultado positivo nos
testes confirmativos. Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias típicas: RT = ?
Aplicando-se a fórmula, teremos para colônias atípicas: RA = ?
O resultado final será igual à soma das colônias típicas e atípicas confirmadas:
Resultado final = RT + RA = ????????????? UFC/g ou mL.
Exercício1. Na placa de VRBA e diluição 10-2 = 20 colônias contadas,
das quais 15 eram típicas e 5 atípicas; Para confirmação, foram repicadas 3 colônias de cada tipo para tubos verde brilhante e depois para tubos EC;
2. Todos os tubos de caldo verde brilhante repicados deram positivos para a confirmação de coliformes totais;
3. Para confirmação de coliformes termotolerantes, obtiveram-se dos 3 tubos repicados de colônias típicas, 2 positivos; e das 3 atípicas repicadas, 1 positiva.
4. Na pesquisa de E. coli, dos 3 tubos EC repicados (tanto de típicas quanto atípicas), 1 placa EMB típico deu positivo e 1 atípico positivo.
Diante destes resultados, pergunta-se:
1. Qual o valor para coliformes a 35°C?
2. Qual o valor para coliformes a 45°C?
3. Qual o valor de E. coli/mL?
Pesquisa de coliformes: Número mais provável (NMP)
Amostra: leite em pó, leite pasteurizado, água, açúcar refinado
NMPTécnica do número mais provável ou técnica dos
tubos múltiplos- estimativa da quantidade de Mo presentes na amostra;
Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três, cinco ou dez tubos;
Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes)
NMPa) Teste presuntivo para coliformes totais–
visa detectar a presença de microrganismos fermentadores de lactose. Meio utilizado: lauril sulfato triptose. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham.
b) Teste confirmativo para coliformes totais-meio caldo verde brilhante lactose Bile 2%. Princípio: turvamento e produção de gás por bactérias gram negativas, características do grupo coliforme.
c)Teste confirmativo para coliformes termotolerantes- utilização do meio de cultura seletivo “Caldo EC” e incubação em 44-45ºC. Princípio: turvamento e produção de gás, evidenciado pelo tubo de Durham.
c) Teste completo para pesquisa de E. coli - provas bioquímicas.
Poder tamponante
Inibe Gram+
Inibem Gram+
Inibe Gram+
NMP – série 3 tubos
Para cada EC+, um EMB
2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN
NMP – série 3 tubos (leite)
Para cada EC+, um EMB
2 colônias caract. de cada EMB em tubo de AN
De cada tubo AN
Exemplo
10-1
10-2
10-3
Tubos positivos
3
3
1
Em todos os tubos e Em todos os tubos e placas de TODAS as placas de TODAS as etapas, identificar o etapas, identificar o número da equipenúmero da equipe, o , o nome da amostra nome da amostra e o e o mais importante a mais importante a DILUIÇÃO que está ou DILUIÇÃO que está ou a DILUIÇÃO a DILUIÇÃO precedente !!!!!precedente !!!!!
Combinação tubos positivos 3:3:1 = 460 UFC/g ou mL, com 95% probabilidade de estar entre 90 e 2000 UFC/g ou mL
A tabela a ser consultada deverá ser a que oferece resultados de NMP para inóculos de 0,1, 0,01 e 0,001 g ou mL.
OBS: Para obter o NMP/g ou mL, para séries de 3 tubos, com inóculos de 1,0, 0,1 e 0,01 g ou mL, e respectivos intervalos de confiança 95%, dividir por 10 os valores da Tabela 1 correspondente ao arranjo de tubos positivos obtido na análise.
NMP- água e gelo
Quando o limite de aceitação for <2,0/100mL, usar série de 5 tubos.
Quando o limite de aceitação for <1,0/100mL, usar série de 10 tubos.
Caracterização da E. coli
De cada tubo EC positivo
Técnica de esgotamento – por estrias
Padrões microbiólógicosProduto Tolerânc
ia para amostra indicativa – Coliformes Totais ou a 35°C
Tolerância para amostra indicativa – Coliformes Termotolerantes ou a 45°C
Legislação Técnica a ser utilizada
Água para consumo humano
Ausência em 100mL
Ausência em 100mL
Portaria 518, 2004
NMP – série de 10 tubos
Leite pasteurizado C
4NMP/mL 2NMP/mL IN 51, 2002 NMP – série de 3 tubos- amostra pura
Leite em pó - 10NMP/g RDC 12, 2001
NMP – série 3 tubos- amostra diluída
Açúcar cristal - 102UFC/g RDC 12, 2001
Plaqueamento
Fonte: MADIGAN; MARTINKO; PARKER, 2004
1. Prova do Indol;2. Vermelho de metila-VM;3. Voges-Proskauer-VP;4. Citrato.
Testes bioquímicos para coliformes- identificação da E.
coli
1. Prova do IndolTriptofano triptofanase Indol + ácido pirúvico +
amônia desaminação
+ p-dimetilaminobenzaldeído +HCl + álcool (reativo de Kovacs)
Composto quinoidal (vermelho)CH2 do anel pirrólico da molécula do indol + o aldeído em meio ácido=
quinona
2. Vermelho de metila-VM
ácido láctico ácido acéticoGlicose fermentação ácido fórmico ácido mista ácido succínico
ácido etílicoINDICADOR:Vermelho de metila – escala de 4,4 a 6,0.pH 4,4 cor vermelha - prova positivapH 6,0 cor amarela (acetoína) - prova
negativa
3. Voges-Proskauer-VP Glicose
2 ác. pirúvico
descarboxilação
Acetilmetilcarbinol + ∝-naftol +KOH 40% Diacetila
(acetoína)
Diacetila + núcleo guanidina do ∝-naftol condensação Composto Vermelho
OBS .: cor cobre é resultado negativo
Agente oxidante
Catalisador
Fermentação butilenoglicol
4. Citrato
ciclo de KrebsCitrato citratase ciclo da fermentação do citrato
Citrato piruvato + CO2
CO2 + sódio carbonato de sódio
Amônia como
fonte de N
pH alto
Indicador de pH: azul de bromotimol
pH 8,4=coloração azul-da-prússiapH 6,9= coloração verdepH 6,0= coloração amarela;
Próxima semana: prova prática de bolores e leveduras1. Imprimir roteiro de prova;2. Estudar o roteiro, dúvidas tirar no horário
de PA;3. Cuidar com técnica e diluição.4. Trazer os materiais abaixo para prova:
Equipe 1
Equipe 2 Equipe 3 Equipe 4
AMOSTRASQueijo ralado
Geléia (a granel
de preferência)
Papinha infantil de
fruta
Doce de abobóra a
granel
Legislação Port. 357/97
RDC 12, 2001RDC 12,
2001
RDC 12, 2001
Padrão microbiológi
co? ? ? ?