conservaciÓ d’espÈcies vegetals en perill crÍtic a l...
TRANSCRIPT
Màster de Biodiversitat
CONSERVACIÓ D’ESPÈCIES VEGETALS EN PERILL CRÍTIC A L’ARXIPÈLAG DE
LES SALVATGES
Manuel Pomar Cloquell
Directora:
Roser Vilatersana Lluch
Institut Botànic de Barcelona - CSIC
Tutor:
José Manuel Blanco Moreno
Facultat de Biologia - UB
Setembre 2014
ÍNDEX
ABSTRACT- RESUM
1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS
2. MATERIAL I MÈTODES
2.1. Mostreig
2.2. Métodes moleculars
2.3. Anàlisi de les dades
3. RESULTATS
3.1. Demografia
3.2. Dades morfològiques
3.3. Dades genètiques
4. DISCUSSIÓ
5. CONCLUSIONS
6. AGRAÏMENTS
7. BIBLIOGRAFIA
ANNEXOS
1
ABSTRACT – RESUM
The Selvagem Pequena is one of the two main islands in the Macaronesian archipelago of the
Savage Islands (Ilhas Selvagens). The absence of introduced species, an exception amongst
the rest of Macaronesian islands, has preserved a unique system where we can find the narrow
endemic Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. Its demographic structure has been studied and
we have used AFLP markers in order to shed light on the genetic relationships between
individuals and to infer possible conservation strategies. This study revealed that the individuals
sampled form a single population of different age classes structured in four lineages or genetic
clusters with a high degree of gene flow and proven reproductive capacity. It has also been
found that the number of individuals is higher than previously expected (97 reproductively
individuals). Its current IUCN classification is hereby discussded according to the results of this
study.
KEYWORDS: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes, conservation, endemism,
Macaronesian archipelago, Selvagem Pequena
La Salvatge Petita és una de les dues illes principals de l’arxipèlag macaronèsic de les
Salvatges (Ilhas Selvagens). L’absència d’espècies introduïdes, una excepció entre la resta
d’illes de la Macaronèsia, ha preservat un sistema únic on hi podem trobar l’endemisme com
Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. D’aquest tàxon s’ha estudiat la demografia i s’ha explorat
la seva variabilitat genètica mitjançant marcadors AFLP, amb l’intenció de determinar les
relacions genètiques entre individus i per a inferir possibles estratègies de conservació. Aquest
estudi ha revelat que els individus mostrejats conformen una única població amb diferents
classes d’edat estructurada en quatre llinatges principals que presenten un alt grau de flux
genètic entre ells i bona capacitat reproductiva. També s’ha trobat que el nombre total
d’individus (97 individus reproductors) és major de l’esperat. Amb els estudis realitzats també
s’avalua la seva categoria UICN.
PARAULES CLAU: AFLP, Asparagus nesiotes subsp. nesiotes, conservació, endemisme,
Macaronèsia, Salvatge Petita,
1. INTRODUCCIÓ I OBJECTIUS
La Macaronèsia és una regió biogeogràfica fo
Atlàntic: les Açores, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que
comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d
volcànic (Fernández-Palacios
enclavament continental situat al sud
al., 2008) (Fig. 1).
Fig. 1. La Macaronèsia d’acord amb Médail & Quézel (1999)
La Macaronèsia representa un sistema
relicta d’Europa i el nord d’Àfrica,
continent a finals del Neogen
de la Macaronèsia, essent illes oceàniques,
d'espècies provinents del continent
d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes
es veu accentuada pel diferent grau d'aïllament i l'edat de
1997). Cal destacar la importànc
conservació de biodiversitat en
com a punts on se'n genera
d'endemismes (Cowie & Holland, 2006
2
I OBJECTIUS
és una regió biogeogràfica formada per cinc arxipèlags de l'o
, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que
comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d
Palacios et al., 2011). Alguns autors hi inclouen també un
enclavament continental situat al sud-oest del Marroc (Médail & Quézel, 1999;
. La Macaronèsia d’acord amb Médail & Quézel (1999).
Macaronèsia representa un sistema insular que destaca per la presència de flora
d’Europa i el nord d’Àfrica, supervivent de les extincions que es donaren al
gen (Vargas, 2007). La composició de la flora
de la Macaronèsia, essent illes oceàniques, prové de la colonització i establ
d'espècies provinents del continent en diferents temps geològics i de l'evolució
d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes
es veu accentuada pel diferent grau d'aïllament i l'edat de formació de cada illa (Cronk,
importància d’aquestes illes no només com a punts de
conservació de biodiversitat en quant a presència de paleoendemismes sinó també
com a punts on se'n genera in situ de nova, essent sistemes d'altíssima densitat
Cowie & Holland, 2006).
rmada per cinc arxipèlags de l'oceà
, Madeira, les Salvatges, les Canàries i Cap Verd, que
comparteixen un conjunt d'elements florístics i faunístics a més de ser tots d'origen
Alguns autors hi inclouen també un
Médail & Quézel, 1999; Kim et
er la presència de flora
supervivent de les extincions que es donaren al
e la flora dels arxipèlags
prové de la colonització i establiment
en diferents temps geològics i de l'evolució
d'aquestes un cop establertes. L’heterogeneïtat en la composició d'espècies entre illes
ormació de cada illa (Cronk,
com a punts de
quant a presència de paleoendemismes sinó també
sistemes d'altíssima densitat
3
L’origen d'aquesta regió biogeogràfica el trobem en els diferents esdeveniments de
caràcter volcànic que s'han donat al llarg dels darrers 70 milions d’anys (Ma). Aquests
han donat lloc a diversos grups d'illes, moltes d'aquestes sota l'actual nivell del mar,
destí que sol ser el típic en les dinàmiques geològiques de les illes volcàniques
(Fernández-Palacios et al., 2011).
D'aquests arxipèlags macaronèsics, el de les illes Salvatges (Ilhas Selvagens) és el
d’origen més antic, aproximadament 27 Ma (Geldmacher et al., 2001) i es troba en les
darreres fases de l'ontogènia de les illes volcàniques, caracteritzada per una topografia
d'altiplà i finalment una fase terminal de desaparició per l'efecte de l'erosió i els canvis
en el nivell del mar (Fernández-Palacios et al., 2011).
Aquest petit arxipèlag pertany administrativament a la regió autònoma de Madeira
(Portugal), tot i que geològicament forma part de la província volcànica de les
Canàries. L'arxipèlag de les Salvatges està constituït de dues illes principals, la
Salvatge Gran (Selvagem Grande) i la Salvatge Petita (Selvagem Pequena) així com
nombrosos illots i farallons, destacant l'Ilheu de Fora, veí de la Salvatge Petita (Fig. 2).
Fig. 2. Arxipèlag de les Salvatges. Les dues illes principals es troben a una distància d’uns 20 km.
4
Les illes es troben situades a mig camí entre Madeira i les Canàries, estant a 280 Km
de la primera i a 165 km de les segones i ja apareixen als mapes portolans del segle
XIV com l'Atles Català de Cresques però no varen ser visitades fins el segle XV i, tot i
així, despertaren poc interès per ésser considerades inhabitables. Més endavant, la
Salvatge Gran sí que fou explotada i habitada de manera puntual per mariners i
pescadors dels arxipèlags veïns, essent conegudes sobretot per les colònies de virot
de les Açores (Calonectris diomedea subsp. borealis), que foren caçats regularment
fins l'any 1967 per a la producció d'oli, però també per la presència de líquens que es
recol·lectaven per a la fabricació de tints (Ritsema, 2010).
Aquesta intermitent presència humana propicià la introducció d'espècies invasores tant
vegetals com animals, moltes d’elles com a aliment pels visitants ocasionals, que
afectaren profundament a la composició d'espècies original. Ja al segle XV hi foren
introduïdes cabres i conills així com indirectament també ratolins que reduïren molt la
flora nativa, provocant extincions o sovint només permetent-ne la supervivència als
racons més inaccessibles. Les cabres s'extingiren al segle XIX mentre que els conills
mantingueren la seva presència fins el 2003, any des del qual no se n’han registrat
observacions (Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004). En quant a plantes
introduïdes, el cas més notable és el de Nicotiana glauca, cultivada i després
naturalitzada al segle XIX i de la qual se'n fan programes d’eradicació actualment
(Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004).
Contràriament, la Salvatge Petita, molt més petita i hostil per a l'establiment humà va
romandre inalterada. Això ha permès que arribi fins als nostres dies un ecosistema
intacte i de composició única.
Actualment aquest arxipèlag té l'estatus de Reserva Natural Integral des del 1971 i es
troba classificat dins el pla d'ordenament del territori de l'ens autonòmic com Área de
Uso Proibido i estant administrativament dins el municipi de Funchal hi apareixen al
Pla Director Municipal com no edificables. La seva protecció recau sobre la Secretaria
Regional do Ambiente e dos Recursos Naturais per mitjà del Serviço do Parque
Natural da Madeira. Les visites estan estrictament regulades, requereixen un permís
especial i no és permès pernoctar-hi.
La Marinha de Guerra Portuguesa hi té presència com a encarregada de vetllar del
manteniment la Zona Econòmica Exclusiva (ZEE) portuguesa i porta a terme les
connexions entre illes.
L’àrea de treball d'aquest estudi es centra exclusivament en la Salvatge Petita (Fig. 3).
Amb una superfície d'unes 20 hectàrees, aquesta illa i el seu subarxipèlag són una
formació volcànica en la fase final de la seva ontogènia.
5
L'illa està formada per aglomerats piroclàstics de lapil·li (Geldmacher et al., 2001) i
presenta una topologia de plana coberta de sorres calcàries amb la única elevació
rocosa del Pico do Veado (49 m). Al contrari que la seva veïna major, la Salvatge
Petita només manté presència humana d'abril a novembre per guardes del parc que hi
fan torns de tres setmanes. Tota l’illa es troba sotmesa a una forta erosió i a una
pujada del nivell del mar, els efectes de la qual es veuen cada cop més accentuats
(Moreira, 1991).
En aquesta illa hi trobem nou dels onze endemismes propis de les illes Salvatges, dos
dels quals només presents a la Salvatge Petita (Hansen & Sunding, 1993) i un exclusiu
de la illa de Fora (subarxipèlag de la Salvatge Petita).
Fig. 3. Ortofoto de la Salvatge Petita (GeoPortal do LNEG - Laboratório Nacional de Energia e Geologia).
Aquest treball es troba integrat dins el projecte “Conservation of the critically
endangered endemic flora of the Selvagens Islands, Atlantic Ocean”, finançat pel
Mohammed Bin Zayed Species Conservation Fund i que es centra en l'estudi dels tres
endemismes exclusius de la Salvatge Petita: Argyranthemum thalassophilum
Humphries, Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes i Euphorbia anachoreta Svent.,
i amb un nombre d'efectius menor de 250 individus per al primer i de menys de 50 per
als dos darrers (Martín et al., 2008). Aquest estudi es centra en Asparagus nesiotes
subsp. nesiotes.
6
A la Macaronèsia hi podem trobar 14 representants del gènere Asparagus L.
(Asparagaceae; APG II, 2003) dels quals 12 són endemismes d’aquesta regió
biogeogràfica (Hansen & Sunding, 1993). Trobem en aquest gènere tant espècies
hermafrodites com dioiques (Lee et al., 1997) però totes són perennes, presentant un
rizoma subterrani proveït de tubercles radicals que produeixen tiges aèries, herbàcies
o llenyoses. Així doncs, una de les característiques d’aquest gènere, així com de
moltes monocotiledònies, és la capacitat per a generar clons. D’aquesta manera,
diferenciem entre genets i ramets, essent els primers definits com aquells individus
provinents d’un zigot i els segons aquells provinents de la fragmentació de parts
vegetatives d’un genet original o planta mare. No obstant, no cal descartar la presència
de mutacions somàtiques dins les espècies clonals (Scrosati, 2001). El pes de la
reproducció asexual en el conjunt de les poblacions pot variar bastant entre les
diferents espècies. La pol·linització d’aquest gènere és totalment entomòfila (Delaplane
et al., 2000) i en illes oceàniques s’ha observat que la dispersió de les llavors la porten
a terme tant sargantanes com ocells, a més d’aus rapinyaires com a dispersadors
secundaris (Nogales et al., 2007).
Asparagus nesiotes subsp. nesiotes és endèmica del subarxipèlag de la Salvatge
Petita (Marrero & Ramos, 1989). Forma mates densament ramificades de tiges
volubles, és hermafrodita i presenta nombre cromosòmic 2n = 6x = 60 (Bramwell et al.,
1976) (Fig. 4). La subespècie A. nesiotes subsp. purpurensis Marrero Rodr. & A.
Ramos la trobem en canvi amb una distribució fragmentada a les illes de
Fuerteventura, Lanzarote i la Graciosa i està inclosa al Libro Rojo de la Flora vascular
de España amb la categoria UICN En Perill (EN) (Santos Guerra et al., 2013).
La tècnica dels marcadors moleculars AFLP (Amplified Fragment Lenght
Polymorphisms ) està àmpliament usada per a avaluar la diversitat genètica d’espècies
clonals (Escaravage et al., 1998; Albert et al., 2003) i en projectes de conservació en
poblacions d’illes (Kim et al., 2004). Aquesta tècnica es basa en l'amplificació de
marcadors per PCR i va ser descrita per primera vegada per Vos et al. (1995). El seu
protocol d’execució inclou 5 passos principals: a) restricció del DNA i lligació dels
adaptadors als fragments de restricció, b) amplificació preselectiva amb PCR d’una
submostra dels fragments, c) amplificació selectiva , d) separació per electroforesi dels
fragments de DNA amplificats, i e) anàlisi i interpretació de les dades (Paun &
Schönswetter, 2012).
Respecte a altres tècniques, els marcadors AFLP ofereixen diversos avantatges,
principalment el fet de ser un mètode relativament econòmic, senzill, ràpid i fiable per a
generar un gran nombre de marcadors genètics informatius. El fet de detectar molta
variabilitat el fa molt adequat per a estudis a nivell subespecífic i
restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc
requereix cap coneixement previ de l’estructura i organit
d’això, són especialment útil
dels marcadors codominants
marcadors codominants tan
verificar-se l’homologia dels marcadors
per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).
Fig. 4. Detalls d’Asparagus nesiotes
7
variabilitat el fa molt adequat per a estudis a nivell subespecífic i l’ús
restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc
requereix cap coneixement previ de l’estructura i organització del genoma.
útils en estudis d’espècies poliploides ja que
marcadors codominants desapareixen, degut a que en aquests casos
tan sols poden discernir entre presència/absència
els marcadors, fa que aquesta tècnica sigui menys adequada
per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).
Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. (A). Flors. (B). Fruits. (C). Individu juvenil
de mesures morfològiques.
l’ús d’enzims de
restricció té l’avantatge de permetre una alta repetibilitat dels resultats. Tampoc
zació del genoma. A més
poliploides ja que els avantatges
aquests casos, els
entre presència/absència. Al no
menys adequada
per a inferir relacions a nivells taxonòmics superiors (Mueller & Wolfenberger, 1999).
Individu juvenil. (D). Presa
8
Els objectius d’aquest treball són:
• Determinar l’estat demogràfic de la població d’Asparagus nesiotes subsp.
nesiotes.
• Avaluar la diversitat genètica d’aquest tàxon.
• Determinar el pes que té la clonalitat en el tàxon.
• Estudiar l’existència de subpoblacions genèticament diferenciades.
• Avaluar la categoria d’amenaça segons els criteris de la UICN.
• Establir criteris per a la seva conservació.
2. MATERIAL I MÈTODES
2.1. Mostreig
Es va estudiar l’única població existent de A. nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge
Petita. Es comptaren el nombre d’individus de la població, considerant com a individu
(genet) cadascuna de les mates individualitzades. Cada individu es va georreferenciar
amb GPS (Garmin, Legend Cx) i es van prendre algunes mesures morfològiques:
alçada de la mata, dimensió horitzontal màxima i nombre de branques (considerades
cadascuna com a ramets). De cada individu es prengueren mostres de fulles i es
conservaren en sobres amb gel de sílice amb un codi d’identificació.
2.2. Mètodes moleculars
Extracció d’ADN : L’extracció d’ADN es va realitzar als laboratoris de l’Institut Botànic
de Barcelona utilitzant el protocol de CTAB (Doyle & Doyle, 1987) amb la
modificacions de Tel-Zur et al. (1999). El material es triturà amb esferes de plom dins
eppendorfs de 2 ml durant 3 minuts amb un triturador Retsch®. Les mostres passaren
per tres cicles de rentats de sorbitol a 4ºC, cada una d’elles incloïa un vòrtex i una
centrifugació de 3 minuts a 13000 rpm i decantat del sobrenedant. S’afegeiren 700 µl
del buffer d’extracció CTAB i es deixà incubar a 65ºC durant 30 minuts. Després d’això
es varen afegir 500 µl de cloroform-isoamilalcohol (24:1) i es centrifugà. Es va retirar la
fase superior (transparent) i es passà a un altre eppendorf amb tancament de
seguretat. S’hi varen afegir 350 µl d’isopropanol i es deixaren les mostres 5 minuts a
l’ultracongelador (-70ºC). Una vegada descongelat es centrifugà durant 3 minuts a
9
13000 rpm i es decantà el sobrenedant amb pipetes Pasteur de plàstic (una per
mostra). S’hi afegí 1ml d’etanol (70%) i es tornà a centrifugar. Es tornà a decantar amb
molta cura el sobrenedant, tenint en compte la fragilitat del pellet en la mostra
purificada. L’excés d’etanol es deixà eixugar dins una bomba de buit. Completat això,
es va resuspendre amb 50 µl de TE-buffer i 2,5 µl de RNAsa (1mg/ml) i es deixà
incubar a 37ºC almenys durant 30 minuts.
El contingut en ADN de les extraccions es va determinat per espectrofotometria amb
NanoDrop 1000 v.3.7.1 (Thermo Fisher Scientific). La concentració mínima requerida
per extracció era de 30 ng/µl. Segons els resultats obtinguts, s’ajustà la concentració
les mostres per a obtenir una quantitat mínima de de 250 ng, l’establerta per a aplicar
la tècnica d’AFLP.
Marcadors AFLP : La fase de Restricció es va portar a terme amb un volum total de 10
µl per mostra (5 µl ADN i 5 µl còctel de reactius). Per a cada mostra, els volums de
reactius varen ser de 3,6 µl d’H20, 1,0 µl d’EcoRl buffer, 0,1 µl de sèrum d’albúmina
bovina (BSA, New England BioLabs) a 1mg/ml. Els fragments d’ADN es varen digerir
amb els enzims de restricció 2,8 U Msel (New England BioLabs) i 10 U de EcoRl
(Roche) i s’incubaren 3 hores a 37ºC.
Per a la lligació el volum de reacció per mostra va ser de 12,5 µl (7,5 µl d’ADN
procedent de la restricció i 5 µl del còctel de reactius). El còctel de reactius va incloure
1,3 µl d’H20, 1,1 µl de X10 T4 buffer, 0,5 µl de BSA a 1mg/ml, 1 U Ligasa T4 (Roche) i
els adaptadors de Msel (10 µM) i EcoRl (50 µM). Es va incubar durant 16 hores a
16ºC. Després d’aquesta fase es realitzà una comprovació de l’acció dels enzims
mitjançant una electroforesi amb un gel d’agarosa a l’1% usant SYBR safe DNA gel
stain (Molecular Probes Inc.). Una vegada comprovat es diluïren les mostres a 1/10.
Per a la fase preselectiva el volum total per mostra va ser 12,5 µl (2,5 µl de la lligació
diluïda i 10µl de còctel de reactius). Els reactius del còctel varen ser 6,82 µl d’H20, 1,25
µl de Taq buffer (Applied Biosystems), 0,75 µl de MgCl2, 0,63 µl de dNTP (10 mM),
0,25 U AmpliTaq (Applied Biosystems) i 0,25 µl de cada un dels primers preselectius
EcoRI-A i MseI-C (10 µM els dos). Es va fer un segon gel de verificació i després
d’aquesta fase es diluïren les mostres a 1/10.
Per a la fase selectiva el volum total per mostra va ser de 13 µl (2 µl de mostra del
preselectiu diluït i 11 µl del còctel de reactius). Es varen fer servir eppendorfs
semiopacs per a evitar la degradació dels primers EcoRI fotosensibles, marcats amb el
fluorocrom VIC® (Applied Biosystems). El contingut del còctel de reactius va ser 6,45
µl d’ H20, 1,25 µl de buffer TaqGold (Applied Biosystems), 0,75 µl de MgCl2, 1 µl dNTP
10
(10mM), 1 µl BSA (1mg/ml), 1 U AmpliTaq Gold (Applied Biosystems) i els primers 0,1
µl de EcoRI-AXX(10 µM) i 0,25 µl MseI-CXX (10 µM).
Els productes d’amplificació selectiva junt amb 0,5 µl de l’estàndard de mida
GeneScan 500 LIZ van se analitzats per la Unitat de Genòmica del Parque Científico
de Madrid usant un seqüènciador automàtic ABI 3730 (Applied Biosystems). Després
de provar 30 parells de primers selectius amb 8 mostres, es varen escollir dos parells
(EcoRI-AGA/MseI-CTC i EcoRI-AGA/MseI-CTA) per realitzar l’estudi donat que eren
els més reproductibles i fàcils d’analitzar. Controls negatius es varen realitzar en totes
les diferents fases del procés d’AFLP per detectar contaminacions exògenes.
2.3. Anàlisi de les dades
Mapatge : Utilitzant el software ESRI ArcMap v.10.0® (ESRI, 2011) es va representar
la distribució de l’espècie sobre el mapa de corbes de nivell proporcionat pel Serviço
do Parque Natural da Madeira i per la Direção Regional de Florestas e Conservação
da Natureza da Madeira utilitzant les dades recollides al camp amb GPS. Els mapes
obtinguts es van editar posteriorment amb Adobe Illustrator 10®. Amb el visualitzador
de mapes online del GeoPortal del Laboratorio Nacional de Energia e Geologia s’han
descarregat les ortoimatges utilitzades. Els mapes descriptius de la regió
macaronèsica s’han editat a partir de les imatges obtingudes des d’aquest portal.
Anàlisis morfològiques : S’han realitzat models de regressió lineals entre els parells
de caràcters morfològics estudiats usant el programa R v.2.15.0 (R Development Core
Team, 2012) i el paquet DEDUCER v.1.7.9 (Fellows, 2012). Usant les tres mesures
morfològiques s’ha construït una Anàlisi de Components Principals (PCA) amb el
programa R, l’entorn R-Commander v.1.9-5 (Fox, 2005) i el paquet FactoMineR v.1.24
( Lê et al., 2008).
Anàlisis moleculars : L’anàlisi de les dades es portà a terme utilitzant el software
GeneMarker® v.1.85 (SoftGenetics) utilitzant els fragments entre 64 i 500 pb. Aquest
programa permet estandarditzar un patró en les mostres a partir del qual guiar-se en
les anàlisis dels AFLP i determinar els polimorfismes observats. El criteri de valoració
pot establir-se depenent del soroll de fons de les mostres. El resultat final és una
matriu de presència/absència que es pot exportar. S’han seguit les recomanacions de
Bonin et al. (2007) i s’han realitzat repeticions de mostres i les bandes ambigües i no
reproduïbles s’han extret de la matriu binària.
11
Aquesta matriu binària obtinguda s’ha analitzat de diferents maneres i amb programes
diversos. Per a adaptar el format de la matriu als programes que ho requerien s’ha
utilitzat el paquet AFLPdat (Ehrich, 2006) usant el programa R.
Per a explorar les relacions dins el dataset s’ha realitzat una anàlisi de coordenades
principals (PCoA) usant la distància euclídia binària mitjançant el mòdul d’anàlisi
multivariant Ginkgo (Bouxin, 2005) del paquet B-VegAna (De Cáceres et al., 2003).
També s’ha explorat amb UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
Mean) usant el coeficient de similitud de Dice (Dice, 1945) usant el programa
NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997). Per a representar l’agrupament de les dades i
distancies relatives entre parell d’individus simultàniament s’ha utilitzat l’algoritme
Neighbor-Net (Bryant & Moulton, 2004), implementat al programa SPLITSTREE4 v4.10
(Huson & Bryant, 2006) utilitzant la distància no corregida (p) entre tots els parells de
dades.
S’ha realitzat un test de Mantel (Mantel, 1967) per avaluar l’existència de correlació
entre la matriu de distàncies genètiques Dice i la matriu de distàncies geogràfiques
usant el programa NTSYSpc. La matriu de distàncies geogràfiques s’ha calculat amb
el programa Geographic Distance Matrix Generator v.1.2.3 (Ersts, 2011).
Paral·lelament s’ha analitzat l’estructura genètica de la població amb BAPS v.6.0
(Bayesian Analysis of Population Structure; Corander et al., 2008) escollint les opcions
de population mixture i clustering of individuals. S’han corregut 10 rèpliques per
cadascuna de les sis simulacions provades, de K=2 a K=8. La millor K es va escollir
amb la que presenta el major valor de log marginal likelihood [log (ml)]. Per tal de
mesurar la diferenciació genètica entre les subpoblacions (geogràfiques o resultants
de BAPS), s’han realitzat les anàlisis de variància molecular (AMOVA; Excoffier et al.,
1992) usant el programa ARLEQUIN v.3.5.1.2. (Excoffier et al., 2005) basant-se en les
distàncies euclidianes entre mostres i 1000 permutacions.
Per avaluar la contribució de la clonalitat en la diversitat genètica d’A. nesiotes subsp.
nesiotes s’han usat els programes GENOTYPE v.1.2 i GENODIVE v.1.1 (Meirmans &
Van Tienderen, 2004). Amb el primer s’ha obtingut el nombre de genotips (genets) i el
histograma amb la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells assumint
el model d’infinits al·lels (IAM) per a la matriu originada amb els marcadors AFLP.
Aquesta mesura de distància determina quin és el nombre de mutacions necessàries
per a transformar el genotip d’un individu en el genotip d’un altre sumant tots els loci.
El programa GENODIVE calcula els índex de clonalitat i proporciona una mesura
d’uniformitat genotípica (E). Aquesta mesura és un indicador de com els genotips
estan distribuïts a la població,quan E=1 tots els genotips tenen la mateixa freqüència.
La variabilitat genètica s’ha mesurat amb l’aproximació Bayesiana utilitzant el
12
programa HICKORY v.1.1 (Holsinger & Lewis, 2003) que te l’avantatge de no assumir
l’equilibri de Hardy-Weinberg.
El desequilibri de lligament es va inferit utilitzant l’índex d’associació modificat (��� )
independent del nombre de loci estudiats a través del programa MULTILOCUS v.1.2
(Agapow & Burt, 2001). Aquest índex té un valor esperat de 0 quan els loci no
presenten associació, com s’esperaria en panmixi. La significació de (��� ) s’ha testat
1000 vegades a l’atzar comparant el valor observat amb la hipòtesi nul·la
d’aparellament a l’atzar.
3. RESULTATS
3.1. Demografia
La població d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes de la Salvatge Petita consta de 97
individus repartits en tres àrees principals. Les dues més importants es troben als
vessants est (45 individus) i oest (50 individus) del Pico do Veado mentre que una
tercera es situa a l’extrem sud-oest de l’illa i consta de només 2 individus (Fig. 5). Els
individus es troben en bon estat i amb capacitat reproductora. Es comptabilitzen
individus de totes les classes d’edat i s’observa que les mates es distribueixen
exclusivament sobre sòls rocosos.
3.2. Dades morfològiques
Les dades recollides mostren una gran varietat de mides (Fig. 6): el nombre de ramets
oscil·la entre 1 i 378 amb una mitjana de 31,2 ; llargada màxima de branques entre 10 i
870 cm amb una mitjana de 272,6 cm i la alçada de la mata oscil·la entre 8 i 420 cm
amb una mitjana de 59,2 cm. Les mesures morfològiques estan lleugerament
correlacionades (llargada/alçada; r = 0,2605 , p < 0,001; llargada/nº ramets: r = 0,1583,
p < 0,001; alçada/nº ramets: r = 0.2425, p < 0,001).
La PCA de les tres dades morfològiques estudiades es troba representada en la Fig. 7,
diferenciant-se els individus distribuïts al vessants est i oest del Pico do Veado,
observant-se que els individus al costat est tenen una lleugera tendencia a presentar
un nombre menor de ramets.
13
Fig. 5. Distribució de dels individus d’A. nesiotes subsp. nesiotes sobre el mapa de corbes de nivell de la
Salvatge Petita.
Fig. 6. Histogrames per a les mesures morfològiques. (A). Nombre de ramets. (B). Llargada màxima de
branques. (C). Alçada de la mata.
14
Fig. 7. Representació gràfica del PCA de les mesures morfològiques realitzades en els individus de la
població de A. nesiotes subsp. nesiotes diferenciats segons la vessant. (A). Representació gràfica dels
individus segons les dues vessants. (B). Representació gràfica de les variables .
3.3. Dades genètiques
Amb els 93 individus analitzats genèticament s’ha obtingut una matriu binària de 99
loci dels quals el 78% són polimòrfics. Els nombre de loci trobats per individu varia de
47 (individu A017) a 91 (individu A105).
La relació entre els individus de la població es troba representada gràficament en la
Fig. 8 (Neighbor-Net) i Annexos 1 i 2 (PCoA i UPGMA respectivament). No s’ha trobat
correlació entre les distancies genètiques i geogràfiques (r = 0,049, p = 0,778).
L’anàlisi BAPS mostra que l’agrupació dels individus òptima es la de quatre clústers
(log (ml) = -2860,2303; P = 1) (Figs. 8 i 9). Els clústers 1, 2, 3 i 4 es composen de 30,
14, 39 i 10 individus respectivament. En la representació gràfica dels quatre clústers
sobre el mapa de corbes de nivell de l’illa trobem aquests dispersos en les tres
subpoblacions (Fig. 9). Aquesta agrupació dels individus per clústers ha estat
contrastada amb el resultat de l’Neighbor-Net (Fig. 8).
Les anàlisis d’AMOVA realitzades han donat com a resultat que la variabilitat genètica
entre les subpoblacions segons criteris geogràfics és molt baixa (< 2%), mentre que
entre els clúster de BAPS es del 29% (Taula 1).
15
Fig. 8. Diagrama Neighbor-Net aplicat a la matriu binària d’AFLP. S’ha representat a la mateixa figura els
diferents clústers obtinguts amb BAPS
16
Taula 1. Resultats de l’AMOVA basant-nos en les agrupacions d’individus segons el resultat de BAPS i
distribucions geogràfiques. El valor p s’ha estimat després de 1023 permutacions. ns: no significatiu.
Els estudis de la clonalitat, mostren l’absència de clons dins de la població d’A.
nesiotes subsp. nesiotes segons el mostreig realitzat ja que s’ha troben 93 genets i en
l’histograma de la distribució de la freqüència de les distàncies entre parells amb el
model IAM, s’observa l’absència de comparacions amb zero o pocs canvis, reflectint
l’absència de clonalitat en les mostres (Fig. 10). Els coeficients de clonalitat mostren
un nombre de genotips igual al nombre d’individus i un grau d’uniformitat clonal
(eveness) molt alt (E = 1) ja que tots els genotips estan presents amb la freqüència
d’1.
Segons les agrupacions geogràfiques, les mesures de variabilitat genètica bayesiana
de la població com de les subpoblacions es de 0,29; mentre que amb l’agrupació dels
individus seguint els clústers de BAPS la diversitat genètica varia de 0,22 a 0,28 (Taula
2). S’ha detectat una petita part de desequilibri de lligament a la població d’ A. nesiotes
subsp. nesiotes (��� = 0,028; p < 0,001). Amb les subpoblacions Est i Oest els resultats
han estat significatius tot i que també molt baixos (Taula 3).
Font de variació d.f. Suma de
quadrats Components
variància Percentatge de
variació Valor p F ST
BAPS
Entre clústers 3 242,62 3,41 29,01 0,000 0,29
Dins clústers 89 742,85 8,35 70,99
Est-Oest
Entre subpoblacions 1 18,15 0,16 1,50 0,042 0,01
Dins subpoblacions
91 967,31 10,63 98,50
Est-Oest-Sud
Entre subpoblacions 2 27,90 0,14 1,27 0,083 ns 0,01
Dins subpoblacions
90 957,56 10,64 98,73
Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus
Fig. 10. Histograma representant el nombre de canvis per parell de comparacions
17
Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus segons els clústers obtinguts per BAPS.
Fig. 10. Histograma representant el nombre de canvis per parell de comparacions
Fig. 9. Representació gràfica sobre el mapa de corbes de nivell de la distribució espacial dels individus
entre individus.
18
Població/Grup Mitjana 2,5% 97,5%
Est/Oest * * *
hs[Est] 0,290 (0,011) 0,272 0,312
Hs[Oest] 0,293 (0,013) 0,270 0,317
Hs 0,292 (0,011) 0,272 0,314
Ht 0,294 (0,011) 0,273 0,315
Est/Oest/Sud * * *
hs[Est] 0,290 (0,010) 0,271 0,311
hs[Oest] 0,294 (0,012) 0,272 0,317
hs[Sud] 0,289 (0,012) 0,267 0,313
Hs 0,291 (0,011) 0,271 0,313
Ht 0,293 (0,011) 0,274 0,315
BAPS * * *
hs[1] 0,230 (0,008) 0,213 0,244
hs[2] 0,252 (0,010) 0,233 0,272
hs[3] 0,280 (0,008) 0,263 0,295
hs[4] 0,216 (0,010) 0,195 0,237
Hs 0,244 (0,005) 0,233 0,244
Ht 0,301(0,005) 0,291 0,301
Taula 2. Diversitat genètica Bayesiana basada en la variació d’AFLP d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes. Entre parèntesi es mostra la desviació estàndard. El 2,5% i 97,5% mostren l’interval de
confiança. hs indica la diversitat genètica en termes d’heterozigositat mitjana en panmixi per a cada població o grup. Hs és la mitjana de les hs i Ht és l’heterozigositat panmíctica basada en la mitjana de
freqüències al·lèliques
�� �
Subpoblació Est 0,029 <0,001
Subpoblació Oest 0,026 <0,001
Població sencera 0,028 <0,001
Taula 3. Desequilibri de lligament trobat en la població i les subpoblacions geogràfiques d’Asparagus
nesiotes subsp. nesiotes.
19
4. DISCUSSIÓ
El resultat del recompte d’individus de l’única població d’ A. nesiotes subsp. nesiotes a
la Salvatge Petita (97 individus) resultà ser el doble del que s’havia determinat
prèviament (menys de 50 individus; veure Annex 3; Jardim et al., 2008). A més d’això,
hi trobem representants de totes les classes d’edat, des de plàntules, individus
juvenils, individus reproductors amb abundants flors i/o fruits, i individus senescents
però molt vigorosos (Fig. 4a-d). Si relacionem les característiques morfològiques
estudiades amb l’edat, es a dir, si considerem que al incrementar l’edat del individu
s’incrementa el nombre de ramets i de mida de la mata o de les branques, ens trobem
amb una població madura però amb molta regeneració ja que hi ha molts individus en
les primeres classes dels histogrames morfològics (Fig. 6). Els individus més
senescents, el més gran format per una mata de més de dos metres d’alçada i amb
més de 300 ramets (exclòs de la representació gràfica del PCA, Fig. 7) es troben al
vessant oest del Pico do Veado, degut possiblement a la orografia (Fig. 5) i, també, per
trobar-se més al resguard dels vents (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978).
La divisió genètica de la població en tres subpoblacions seguint criteris geogràfics (est,
oest, sud) no es veu reforçada per les anàlisi AMOVA realitzades (Taula 1) ja que
aquestes divisions expressen menys del 2% de la variabilitat trobada en tota la
població. No obstant, l’anàlisi BAPS divideix la població en 4 grups genètics o clústers
(Fig. 8). Aquests grups es troben distribuïts en tota l’àrea de distribució del tàxon (Fig.
9), fet que es veu recolzat per l’absència d’aïllament per distància entre els individus
mostrada pel test de Mantel. Per tant, es tracta d’una població no fragmentada que
presenta flux genètic entre les subpoblacions geogràfiques i, que tant, el rang d’acció
dels pol·linitzadors com dels agents dispersants de llavors no es veuen afectats per la
presencia del Pico do Veado.
Tot i tractar-se d’un tàxon amb capacitat per a generar clons i que la reproducció
asexual té un pes important en aquest gènere, els resultats del treball ens mostren que
tots els individus analitzats (93 en total) corresponen a genets. És a dir, cada mata
estudiada correspon a un individu genèticament diferent al altre. Tant les mutacions
somàtiques com errors en les anàlisis d’AFLP podrien afavorir la manca de detecció de
clons, no obstant, això es poc probable ja que les comparacions entre genotips indica
un mínim de sis canvis (Fig. 10). El tipus de sòl sobre el que creix A. nesiotes subsp.
nesiotes és un factor important que afavoreix els resultats trobats, ja els substrat rocós
no és el més adequat per a la reproducció i proliferació clonal a llarga distància.
20
L’alta variabilitat genètica observada en aquesta població (Taula 3) contrasta amb el
que succeeix en casos similars d’endemismes insulars on la diversitat és molt baixa i
sovint acompanyada de molt poc flux gènic (Crawford et al., 2001; Houliston et al.,
2012) ja que les poblacions amb baix nombre d’individus són més susceptibles a la
pèrdua i reorganització de la variabilitat per deriva genètica (Ellstrand & Ellam, 1993). I
a més, una població amb un nombre molt baix d’individus pot sofrir també pèrdua de
variació per fluctuacions degudes a factors externs atzarosos (Ellstrand et al., 1993).
Hi ha pocs estudis de variabilitat genètica en el gènere Asparagus (Sica et al., 2005;
Vijay et al., 2009) i en molts casos són difícilment comparables ja que utilitzen diferents
marcadors genètics i/o diferents paràmetres per a calcular aquesta variabilitat. De
totes maneres, comparant els nostres resultats amb l’estudi del tetraploide A.
acutifolius L. en diferents zones d’Itàlia, realitzat per Sica et al. (2005), veiem que, tot i
ser del mateix gènere, la variabilitat trobada en aquesta espècies és bastant més baixa
(Hs = 0,162) que la trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes (Hs = 0,291). No obstant, a
l’hora d’explorar aquests resultats obtinguts de variabilitat genètica en aquest tàxon,
cal tenir en compte el fet de que A. nesiotes subsp. nesiotes és un hexaploide i que en
les espècies que presenten aquest alt grau de ploïdia s’hi tendeix a observar una
variabilitat genètica més elevada (Soltis & Soltis, 2000). Aquesta alta variabilitat
trobada en una població petita, com es l’estudiada, podria explicar-se també per una
major retenció de la variació observada en aquest tipus de poblacions i que
ocasionalment pateixen nivells d’estrès moderat quan se les compara amb altres
poblacions d’igual mida en ambients més benignes (Lesica & Allendorf, 1992).
Els valors de diversitat genètica (Hs) trobada en A. nesiotes subsp. nesiotes són
similars als mostrats en la metaanàlisi de Nybom (2004), també amb marcadors
dominants, per a un seguit de trets vitals com són la forma de vida perenne i de llarga
durada (Hs = 0,25), l’endemicitat (Hs = 0,20) i la dispersió de llavors per ingesta (Hs =
0,24).
El grau de desequilibri per lligament es àmpliament usat per avaluar especies clonals
(Agapow & Burt, 2001) i també per estimar diferents escenaris evolutius com pot ser,
la presència de colls d’ampolla (Frankham et al., 2003). En les nostres anàlisis trobem
un lleuger desequilibri per lligament que no sembla ser causats ni per la presència de
reproducció asexual ni per la presència de recents colls d’ampolla, sinó que
probablement és degut al baix nombre d’individus de la població (Frankham et al.,
2003). Donat l’alt nivell de variabilitat genètica i la baixa quantitat de desequilibri per
lligament trobat en A. nesiotes subsp. nesiotes, es pot dir que el tàxon no està
genèticament depauperat.
21
Pel que fa a les amenaces a les quals s’enfronten les poblacions aïllades de
característiques similars al tàxon estudiat, hi trobem la deriva genètica, l’envelliment i
pèrdua de vigor, l’activitat humana i factors ambientals estocàstics (Lesica & Allendorf,
1992). Segons els resultats trobats en el present treball les dues primeres amenaces
enumerades no semblen afectar directament a la població d’A. nesiotes subsp.
nesiotes ja que encara que la presència d’individus senescents és bastant abundant
(Fig. 6), no representen una majoria i en tot cas queda clara la seva capacitat
reproductiva i robustesa. En quant a les activitats humanes que es puguin dur a terme
a la Selvagem Pequena, la potencialment més perjudicial pel tàxon són les derivades
de les visites incontrolades a l’àrea protegida de les Salvatges Petita. Cal remarcar
que la Salvatge Petita només està habitada pels guardes del parc durant sis mesos a
l’any, coincidint amb la temporada alta (Serviço do Parque Natural da Madeira, 2004) i
que correspon amb el període en el qual l’estat de la mar permet la connexió amb
Madeira i amb la resta de l’arxipèlag. La resta de l’any, tot i que l’onatge sol fer
impossible el desembarcament a l’illa, s’hi han registrat visites furtives.
Però tot i que en termes biològics l’espècie pugui semblar viable, les poblacions petites
tenen més probabilitat de veure’s abocades a l’extinció degut a fluctuacions ambientals
estocàstiques (Goodman,1987). El seu aïllament, l’escàs nombre d’individus i les
característiques geològiques de l’illa la posen en una situació especialment fràgil a
factors ambientals estocàstics com poden ser esllavissades, incendis provocats per
llamps i, fins i tot, s’ha d’incloure el risc de tsunamis dins la llista d’amenaces (Løvholt
et al., 2008). De totes maneres, el factor ambiental que suposa el risc principal a la
Salvatge Petita i també a la població d’A. nesiotes subsp nesiotes és la pujada del
nivell del mar i, amb aquesta, l’increment de l’erosió que pateix i que gradualment
redueix la superfície emergida de l’illa (Moreira, 1991; Courchamp et al., 2014). Dins
aquest sistema insular, A. nesiotes subsp. nesiotes hi juga un paper important
començant pel fet que és una font d’aliment per als rèptils de l’illa que, alhora, són els
principals dispersadors de llavors (Nogales et al., 2007). A banda d’això les espesses
mates creixen sobre elles mateixes formant concavitats que serveixen de refugi i de
lloc de cria per a Calonectris diomedea subsp. borealis, que forma una important
colònia a l’arxipèlag (López-Pujol et al., 2013).
Actualment la IUCN Red List of Threatened Species inclou Asparagus nesiotes a nivell
específic com espècie EN PERILL [EN B2ab(ii,v)] (Santos Guerra et al., 2013). En
aquesta fitxa s’inclouen tant les poblacions de Fuerteventura, Lanzarote, la Graciosa
22
(corresponents a A. nesiotes subsp. purpurensis) com les de la Salvatge Petita
(corresponent a A. nesiotes subsp. nesiotes). Al mateix temps, la subspècie endèmica
de les Canàries està també catalogada com EN PERILL [EN B2ab(ii,iii,iv)] (Santana et
al., 2004). La singularitat d’ A. nesiotes subsp.nesiotes i el fet que actualment hi ha una
absència total de flux gènic entre els dos tàxons fa recomanable la catalogació apart
de l’estat actual d’A. nesiotes subsp. nesiotes.
Els criteris de la UICN per a establir les diferents categories d’amenaça dels taxons
son referents a tendència demogràfica, reducció de l’àrea de distribució o nombre total
d’individus (UICN, 2012). En la bibliografia consultada es parla sempre d’A. nesiotes
subsp. nesiotes com a tàxon raríssim (Sventenius, 1968), amb nombre reduït
d’exemplars (Pérez de Paz & Acebes Ginovés, 1978) o de menys de 50 individus i
formant una població estable (Jardim et al., 2008). Per tant, no es disposen de dades
per inferir que hi hagi una tendència demogràfica a la baixa, ni en nombre d’individus
ni en l’àrea que ocupa. Per tot això, amb les dades que disposem després de realitzar
aquest estudi, i seguint els criteris de la UICN, es pot establir que aquest tàxon no
entra dins classificació de PERILL CRITIC (CR) ja que només compleix un dels
subapartats del criteri B, referent a la distribució geogràfica: àrea d’ocupació menor a
10 km² i coneguda a una sola localitat (criteri Ba) (UICN, 2012). Amb les dades de les
quals disposem, la classificació UICN per a Asparagus nesiotes subsp.nesiotes és de
EN PERILL (EN) segons el criteri D: mida de la població estimada en menys de 250
individus madurs [EN D].
Per una altra banda, si tenim en compte que la subpoblació sud és clarament sensible
a factors d’estocasticitat ambiental donat el seu baix nombre d’individus veiem que el
tàxon es troba al llindar de la classificació CR d’acord amb el criteri de reducció d’àrea,
es requereix un seguiment de la població a mig o llarg termini per avaluar possibles
canvis en la classificació IUCN.
Amb els resultats demogràfics i genètics obtinguts amb aquest treball, juntament amb
les observacions realitzades al camp, ens permeten suggerir una sèrie de mesures per
la de la conservació del tàxon: (a) conservació de llavor ex situ en un banc de
germoplasma del major nombre d’individus possibles donada l’alta variabilitat genètica
observada, assegurant--se de incloure en el mostreig llavors dels 4 clúster genètics,
seria apropiat realitzar la conservació d’un segon estoc de llavors en un segon banc de
germoplasma com a mesura de seguretat; (b) realitzar un seguiment de l’evolució
demogràfica de la població, i (c) reforçar el control de la presència humana a l’illa.
23
5. CONCLUSIONS
• El cens d’Asparagus nesiotes subsp. nesiotes és de 97 individus reproductors a
la Salvatge Petita que conformen una única població.
• Els individus es distribueixen geogràficament en tres grups principals, als
vessants est i oest del Pico do Veado (45 i 50 individus respectivament) i un
grup de dos individus al sud de l’illa.
• Hi ha una alta variabilitat genètica, tots els individus estudiats són genets
diferents i no s’observa clonalitat.
• Els resultats de BAPS indiquen que la població es troba estructurada en quatre
clústers genètics sense segregació geogràfica.
• Les amenaces per a aquest tàxon són fonamentalment degudes a
l’estocasticitat ambiental i les activitats humanes.
• La classificació UICN per a A. nesiotes subsp. nesiotes segons els resultats
obtinguts és de EN PERILL segons el criteri D [EN D].
• Les mesures recomanades de conservació inclouen la preservació ex situ del
germoplasma en banc de llavors, seguiment demogràfic i control de visites a
l’illa
6. AGRAÏMENTS
En primer lloc vull donar les gràcies a la meva directora, Roser Vilatersana, per
tot el que he après amb ella, per la seva santa paciència i per no desesperar
massa amb mi. Sense ella aquest treball no hagués estat possible. També vull
agrair el suport rebut per part del jefe Jordi López i del Sergi Massó en la
realització d’aquest treball així com a les companyes de despatx i penúries, la
Sònia i la Deborah. Agrair també a l’Alfonso i la Núria i a la resta del personal
de l’IBB que m’han ajudat quan ho necessitava i pel bon tracte rebut. Dono
també les gràcies al meu tutor, José Blanco per la seva ajuda i la fe dipositada ,
al Jordi Carreras per l’ajuda amb ArcMap i a Sara Isabel Correia Freitas
(Serviço do Parque Natural da Madeira) i Nuno da Conceicao Gouveis Serralha
(Direção Regional de Florestas e Conservação da Natureza – Madeira) per
elaborar el mapa de corbes de nivel de les illes Salvatges. Agraïment especial
a la meva família pel seu suport constant i als amics que m’han fet costat quan
24
ho necessitava. No vull acabar sense agrair l’ajuda espiritual del Padre Pio i de
San Benito Menni així com del les relíquies paganes que hagin pogut intervenir
en que aquest treball arribés a bon port.
7. BIBLIOGRAFIA
Agapow, P. & Burt, A. (2001). Indices of multilocus linkage disequilibrium. Molecular
Ecology Notes 1: 101–102.
Albert, T.; Raspé, O. & Jacquemart, A. L. (2003). Clonal structure in Vaccinium
myrtillus L. revealed by RAPD and AFLP markers. International Journal of Plant
Sciences 164: 649–655.
APG II (2003). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the
orders and families of flowering plants: APG II. Botanical Journal of the Linnean
Society 141: 399–436.
Bonin, A.; Ehrich, D. & Manel, S. (2007). Statistical analysis of amplified fragment
length polymorphism data: a toolbox for molecular ecologists and evolutionists.
Molecular Ecology 16: 3737–3758.
Bouxin, G. (2005). Ginkgo, a multivariate analysis package. Journal of Vegetation
Science 16: 355–359.
Bramwell, D.; Pérez de Paz, J. & Ortega, J. (1976). Studies in the flora of Macaronesia:
some chromosome numbers of flowering plants. Botánica Macaronésica 1: 9–16.
Bryant, D. & Moulton, V. (2004). Neighbor-net: an agglomerative method for the
construction of phylogenetic networks. Molecular Biology and Evolution 21: 255–265.
Corander, J.; Marttinen, P.; Sirén, J. & Tang, J. (2008). Enhanced Bayesian modelling
in BAPS software for learning genetic structures of populations. BMC Bioinformatics 9:
539.
25
Courchamp, F.; Hoffmann, B. D.; Russell, J. C.; Leclerc, C. & Bellard, C. (2014).
Climate change, sea-level rise, and conservation: keeping island biodiversity afloat.
Trends in Ecology and Evolution 29: 127–130.
Cowie, R. H. & Holland B. S. (2006). Dispersal is fundamental to biogeography and the
evolution of biodiversity on oceanic islands. Journal of Biogeography 33: 193–198.
Crawford, D. J.; Ruiz, E.; Stuessy, T. F.; Tepe, E.; Aqeveque, P.; Gonzalez, F.; Jensen;
R. J.; Anderson, G. J.; Bernardello, G.; Baeza, C. M.; Swenson, U. & Silva, M. (2001).
Allozyme diversity in endemic flowering plant species of the Juan Fernandez
Archipelago, Chile: ecological and historical factors with implications for conservation.
American Journal of Botany 88: 2195–2203.
Cronk, Q. C. B. (1997). Islands: stability, diversity, conservation. Biodiversity and
Conservation 6: 477–493.
De Cáceres, M.; Font, X.; García, R. & Oliva, F. (2003). VegAna, un paquete de
programas para la gestión y análisis de datos ecológicos. In: VII Congreso Nacional de
la Asociación Española de Ecología Terrestre, pp. 1484–1497. Barcelona.
Delaplane, K. S.; Mayer, D. R. & Mayer, D. F. (2000). Crop pollination by bees. Cabi
Publishing. Wallingford.
Dice, L. R. (1945). Measures of the amount of ecologic association between species.
Ecology 26: 297–302.
Doyle, J. J. & Doyle, J. L. (1990). Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus 12:
13–15
Ehrich, D. (2006). AFLPdat: a collection of R functions for convenient handling of AFLP
data. Molecular Ecology Notes 6: 603–604.
Ellstrand, N. C. & Elam, D. R. (1993). Population genetic consequences of small
population size: implications for plant conservation. Annual Review of Ecology and
Systematics 24: 217–242.
26
Ersts, P. J. (2011) Geographic Distance Matrix Generator (version 1.2.3). American
Museum of Natural History, Center for Biodiversity and Conservation. New York.
Escaravage, N.; Questiau, S.; Pornon, A.; Doche, B. & Taberlet, P. (1998). Clonal
diversity in a Rhododendron ferrugineum L.(Ericaceae) population inferred from AFLP
markers. Molecular Ecology 7: 975–982.
ESRI (2011). ESRI ArcGIS Desktop: Release 10. Environmental Systems Research
Institute. Redlands.
Excoffier, L.; Laval, G. & Schneider, S. (2005). Arlequin (version 3.0): an integrated
software package for population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics
Online 1: 47.
Excoffier, L.; Smouse, P. E. & Quattro, J. M. (1992). Analysis of molecular variance
inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human
mitochondrial DNA restriction data. Genetics 131: 479–491.
Fellows, I. (2012). Deducer: A data analysis GUI for R. Journal of Statistical Software
49: 1–15.
Fernández–Palacios, J. M.; de Nascimento, L.; Otto, R.; Delgado, J. D.; García-del-
Rey, E.; Arévalo, J. R. & Whittaker, R. J. (2011). A reconstruction of Palaeo-
Macaronesia, with particular reference to the long-term biogeography of the Atlantic
island laurel forests. Journal of Biogeography 38: 226–246.
Fox, J. (2005). The R commander: A basic–statistics graphical user interface to R.
Journal of Statistical Software 14: 1–42.
Frankham, R.; Ballou; J. D.; Briscoe, D. A. (2003). Introduction to conservation
genetics. Cambridge University Press. Cambridge.
Geldmacher, J.; Hoernle, K.; van den Bogaard, P.; Zankl, G. & Garbe-Schönberg, D.
(2001). Earlier history of the ≥ 70-Ma-old Canary hotspot based on the temporal and
geochemical evolution of the Selvagen Archipelago and neighboring seamounts in the
eastern North Atlantic. Journal of Volcanology and Geothermal Research 111: 55–87.
27
Goodman, D. (1987). Consideration of stochastic demography in the design and
management of biological reserves. Natural Resource Modelling 1: 205–223
Hansen, A. & Sunding, P. (1993). Flora of Macaronesia. Checklist of vascular plants. 4.
Revised edition. Sommerfeltia 17: 1–297.
Holsinger, K. E. & Lewis, P. O. (2003). HICKORY: A package for analysis of population
genetic data v1. 0. Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of
Connecticut. Storrs.
Houliston, G. J.; Dawson, M. I.; De Lange, P. J. & Heenan, P. B. (2012). Using AFLP
markers to inform population management of the endemic Chatham Island toetoe,
Austroderia turbaria (Poaceae). Pacific Conservation Biology 18: 33—40
Huson, D. H., & Bryant, D. (2006). Application of phylogenetic networks in evolutionary
studies. Molecular Biology and Evolution 23: 254–267.
Jardim, F.; Fernandes, F. & Carvalho, J. A. (2008). Asparagus nesiotes Svent. subsp.
nesiotes. In: Martín, J. L., Arechavaleta, M., Borges, P. A. V. & Faria, B. (eds.). Top
100. Las 100 especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea
biogeográfica de la Macaronesia, pp. 216–217. Consejería de Medio Ambiente y
Ordenación Territorial, Gobierno de Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.
Kim, S. C.; Lee, C. & Santos-Guerra, A. (2005). Genetic analysis and conservation of
the endangered Canary Island woody sow-thistle, Sonchus gandogeri (Asteraceae).
Journal of Plant Research 118: 147–153.
Kim, S. C.; McGowen, M. R.; Lubinsky, P.; Barber, J. C.; Mort, M. E. & Santos-Guerra,
A. (2008). Timing and tempo of early and successive adaptive radiations in
Macaronesia. PLoS One 3: e2139.
Lê, S.; Josse, J. & Husson, F. (2008). FactoMineR: an R package for multivariate
analysis. Journal of Statistical Software 25: 1–18.
Lee, Y.; Kanno, Y. & Kameya, T. (1997). Phylogenetic relationships in the genus
Asparagus based on the restriction enzyme analysis of the chloroplast DNA. Breeding
Science 47: 375–378.
28
Lesica, P. & Allendorf, F. W. (1992). Are small populations of plants worth preserving?
Conservation Biology 6: 135–139.
López-Pujol, J.; Vilatersana, R. & Carvalho, J. A. (2013). E-Opinió núm. 29: Crònica
(il·lustrada) d’un viatge al paradís: expedició a les Illes Salvatges. Portal de biologia de
la conservació de plantes. Laboratori de Botànica, Facultat de Farmàcia, Universitat de
Barcelona. Barcelona. Consultat juliol 2014, a http://hdl.handle.net/2445/46386
Løvholt, F.; Pedersen, G. & Gisler, G. (2008). Oceanic propagation of a potential
tsunami from the La Palma Island. Journal of Geophysical Research: Oceans 113:
C09026.
Mantel, N. (1967). The detection of disease clustering and a generalized regression
approach. Cancer Research 27: 209–220.
Marrero, A. & Ramos, A. (1989). Chorologic-taxonomic comment of Asparagus
nesiotes Svent. (Liliaceae). Botánica Macaronésica 18: 5–26.
Martín, J. L.; Arechavaleta, M.; Borges, P. A. V. & Faria, B. (2008). Top 100. Las 100
especies amenazadas prioritarias de gestión en la región europea biogeográfica de la
Macaronesia. Consejería de Medio Ambiente y Ordenación Territorial, Gobierno de
Canarias. Las Palmas de Gran Canaria.
Médail, F. & Quézel, P. (1999). The phytogeographical significance of SW Morocco
compared to the Canary Islands. Plant Ecology 140: 221–244.
Meirmans, P. G. & Van Tienderen, P. H. (2004). GENOTYPE and GENODIVE: two
programs for the analysis of genetic diversity of asexual organisms. Molecular Ecology
Notes 4: 792–794.
Moreira, M. E. (1991). A elevação do nível do ocenao no litoral das Ilhas Selvagens.
Finisterra: Revista Portuguesa de Geografia 26: 140–149.
Mueller, U. G. & Wolfenbarge, L. L. (1999). AFLP genotyping and fingerprinting. Trends
in Ecology & Evolution 14: 389–394.
29
Nogales, M.; Padilla, D. P.; Nieves, C.; Illera, J. C., & Traveset, A. (2007). Secondary
seed dispersal systems, frugivorous lizards and predatory birds in insular volcanic
badlands. Journal of Ecology, 95: 1394–1403.
Nybom, H. (2004). Comparison of different nuclear DNA markers for estimating
intraspecific genetic diversity in plants. Molecular Ecology, 13: 1143–1155.
Paun, O. & Schönswetter, P. (2012). Amplified fragment length polymorphism: an
invaluable fingerprinting technique for genomic, transcriptomic, and epigenetic studies.
In: Sucher, N. J., Hennell, J. R. & Carles, M. C. (eds.). Plant DNA Fingerprinting and
Barcoding – Methods and Protocols, pp. 75–87. Humana Press. New York.
Pérez de Paz, P. L. & Acebes Ginovés, J. R. (1978). Las Islas Salvajes: Contribución
al conocimiento de su flora y vegetación. In: Contribución al estudio de la historia
natural de las Islas Salvajes. Mueso de Ciencias Naturales del Excmo. Cabildo Insular
de Sta. Cruz de Tenerife. Santa Cruz de Tenerife.
R Development Core Team (2012). R: A language and environment for statistical
computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna.
Ritsema, A. (2010). The Selvagens, forgotten Atlantic Islands. Lulu.com. Deventler.
Rohlf, F. J. (1997) NTSYS–Pc. Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System,
v. 1.80. Exeter Software. New York.
Santana, I.; Scholz, S. & Naranjo, J. (2004). Asparagus nesiotes subsp. purpurensis
Marrero Rodr. et Ramos. In: Bañares, A.; Blanca, G.; Güemes, J., Moreno, J. C. &
Ortíz, S. (eds.) Atlas y libro rojo de la flora vascular amenazada de España, pp. 612–
613. Dirección General para la Biodiversidad, Publicaciones del O. A. P. N. Madrid.
Santos Guerra, A.; Draper, D.; Magos, J.; Duarte, M. C.; Tavares, M. & Carvalho, M.
(2013). Asparagus nesiotes. In: The IUCN Red List of Threatened Species. Version
2014.2. Consultat el 2 de setembre 2014, a http://www.iucnredlist.org/details/176453/0.
Scrosati, R. (2002). An updated definition of genet applicable to clonal seaweeds,
bryophytes, and vascular plants. Basic and Applied Ecology 3: 97–99.
30
Serviço do Parque Natural da Madeira (2004). As Ilhas Selvagens. Serviço do Parque
Natural da Madeira, Funchal.
Sica, M.; Gamba, G.; Montieri, S.; Gaudio, L. & Aceto, S. (2005). ISSR markers show
differentiation among Italian populations of Asparagus acutifolius L. BMC Genetics 6:
17.
Soltis, P. S. & Soltis, D. E. (2000). The role of genetic and genomic attributes in the
success of polyploids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 97: 7051–7057.
Sventenius, E. R. (1968). Plantae Macaronesienses novae vel minus cognitae. I. In:
Separatum Indices Seminum Horti Acclimatationis Plantarum Arautapensis, pp. 43-60.
Santa Cruz de Tenerife.
Tel-Zur, N.; Abbo, S.; Myslabodski, D. & Mizrahi, Y. (1999). Modified CTAB procedure
for DNA isolation from epiphytic cacti of the genera Hylocereus and Selenicereus
(Cactaceae). Plant Molecular Biology Reporter 17: 249–254.
UICN (2012). Categorías y Criterios de la Lista Roja de la UICN. Versión 3.1. Segona
edició. Comisión de la Supervivencia de Especies de la UICN, Unión Internacional
para la Conservación de la Naturaleza. Gland & Cambridge.
Vargas, P. (2007). Are Macaronesian islands refugia of relict plant lineages?: a
molecular survey. In: Weiss, S. & Ferrand, N. (eds). Phylogeography of Southern
European refugia, pp. 297–314. Springer. Dordrecht.
Vijay, N.; Sairkar, P.; Silawat, N.; Garg, R. K. & Mehrotra, N. N. (2009). Genetic
variability in Asparagus racemosus (Willd.) from Madhya Pradesh, India by random
amplified polymorphic DNA. African Journal of Biotechnology 8: 3135–3140.
Vos, P.; Hogers, R.; Bleeker, M.; Reijans, M.; Van de Lee, T.; Hornes, M. & Zabeau, M.
(1995). AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research 23:
4407–4414.
ANNEXOS:
1. Representacions del PCoA obtingut amb Ginkgo (De Cáceres et al., 2003)
2. Cladograma obtingut amb UPGMA mitjançant NTSYSpc v.2.02j (Rohlf, 1997)
3. Fitxa per a Asparagus nesiotes subsp. nesiotes a Martin et al. (2008)
Annex 1:
Representació del PCoA per a les variables 1 i 2
Representació del PCoA per a les variables 1 i 3
Coefficient
0.800.84
0.880.92
0.96
A001
A123
A097
A002
A007
A031
A074
A141
A048
A112
A006
A083n
A009
A126
A096
A051
A063
A107
A138
A116
A004
A079n
A093
A139
A131
A095n
A115
A078n
A003
A086
A022
A005
A053
A057
A010
A035
A140
A060
A021
A094
A065
A067
A011
A089
A134
A013
A082
A104
A129
A105
A106
A108
A125
A120
A136
A071
A109
A072
A121
A130
A084
A085
A119
A058
A044
A073
A049
A111
A062
A066
A132
A114
A113
A008
A033
A027
A101
A028
A064
A088
A061n
A137
A017
A025
A124
A030
A032
A024
A117
A036
A081n
A092
A075n
Annex 2
CA
NA
RIA
S
Distribución Distribuição
Subespecie endémica de Salvaje Pequeña.
Subespécie endémica da Selvagem Pequena.
Hábitat Habitat
Matorrales termomediterráneos pre-desérticos.
Matos termo-mediterrânicos pré-desérticos.
Factores y riesgos naturales que pueden agravar su situaciónFactores e riscos naturais que podem agravar a sua situação
Sequías. Tempestades y vendavales.
Secas. Tempestades e vendavais.
Factores limitantes para la recuperación de la especieFactores limitantes para a recuperação da espécie
Baja densidad poblacional. Aislamiento de subpoblaciones/indivi-
duos. Procesos de endogamia o empobrecimiento genético. Baja
tasa de crecimiento poblacional. Super�cie de hábitat reducida.
Baixa densidade populacional. Isolamento de subpopulações/indiví-
duos. Processos de endogamia ou empobrecimento genético. Baixa
taxa de crescimento populacional. Superfície de habitat reduzida.
Acciones de conservación propuestasAcções de conservação propostas
Campañas de concienciación social. Mantenimiento y conservación
del hábitat. (Re)introducción de nuevas (sub)poblaciones.
Campanhas de consciencialização social. Manutenção e conservação
do habitat. (Re)introdução de novas (sub)populações.
Estudios e investigacionesEstudos e investigação
Biología y ecología. Genética. Dinámica de poblaciones.
Biologia e Ecologia. Genética. Dinâmica de populações.
Estatus de protección Estatuto de protecção
Directiva Hábitat: -
Directiva Habitats: -
Convenio de Berna: -
Convenção de Berna: -
El Hierro La Palma La Gomera Tenerife Gran Canaria Fuerteventura Lanzarote
216216
Distribución mundialDistribuição mundial
Endemismo de Madeira
Endemismo da Madeira
Singularidad genéticaSingularidade genética
Endemismo insular
Endemismo insular
Tamaño poblacional (individuos)Tamanho populacional (indivíduos)
< 50 50 - 250 250 - 1.000 > 1.000
Evolución poblacionalEvolução populacional
Tamaño: Estable Tamanho: Estável
Área distrib.: Estable Área distrib.: Estável
Tendencia poblacionalTendência populacional
Tamaño: Estable Tamanho: Estável
Área distrib.: Estable Área distrib.: Estável
División Divisão Spermatophyta
Clase Classe Liliopsida
Orden Ordem Liliales
Familia Família Liliaceae
Autor R. Jardim, F. Fernandes & J. A. Carvalho
Asparagus nesiotes Svent. subsp. nesiotes