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Liz Paola Domingues

CONSEQUÊNCIAS DO ESTRESSE DE DERROTA SOCIAL

(EPISÓDICO E CONTÍNUO) SOBRE OS EFEITOS PSICOMOTORES E

REFORÇADORES CONDICIONADOS DA NICOTINA EM

CAMUNDONGOS

São Paulo

2016

Dissertação de Mestrado apresentada à

Universidade Federal de São Paulo –

Escola Paulista de Medicina, para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Liz Paola Domingues




CAMUNDONGOS

Orientadora: Profa. Dra. Isabel Marian Hartmann de Quadros

São Paulo

2016

Dissertação de Mestrado apresentada à

Universidade Federal de São Paulo –

Escola Paulista de Medicina, para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Domingues, Liz Paola

Consequências do estresse de derrota social (episódico e contínuo) sobre os efeitos

psicomotores e reforçadores condicionados da nicotina em camundongos / Liz Paola

Domingues – São Paulo, 2016

xii, 56

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina.

Programa de Pós Graduação em Psicobiologia.

Título em inglês: Consequences of social defeat stress on nicotine – induced psychomotor

and rewarding effects in mice.

1. Dependência de drogas. 2. Sensibilização comportamental. 3. Preferência condicionada

ao lugar. 4. Estresse social. 5. Recompensa. 6.Efeito estimulante

iii

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA

Chefe do Departamento: Profª. Drª. Deborah Suchecki

Coordenadora do Programa de Pós-Graduação: Profª. Drª. Vânia D'Almeida

iv

LIZ PAOLA DOMINGUES




CAMUNDONGOS

Presidente da banca:

Profª. Drª. Isabel Marian Hartmann de Quadros

Branca examinadora:

Profª Drª Ana Regina Noto

Prof. Dr. Fábio Cardoso Cruz

Profª Drª Lisiane Bizarro Araújo

v

Dedicatória

Dedico essa dissertação à Angela Maria da Silva, por ter me ensinado a

não desistir dos meus sonhos. Eu te amo incondicionalmente, mãe.

vi

Agradecimentos

Gostaria de agradecer primeiramente a minha mãe, Angela, que desde o

meu nascimento não mediu esforços para me proporcionar as melhores

condições possíveis de vida, me apoiando a cada escolha e me ensinando a

acreditar que todos os meus sonhos são possíveis, eu só preciso lutar por eles

de forma honesta. Obrigada por estar ao meu lado em todas as batalhas, me

fortalecendo com o seu amor. Agradeço ao restante de minha família, incluindo

meu pai, irmãos e sobrinhos, que me motivaram a persistir em meus objetivos

de vida e, assim, seguir neste caminho de formação. E a meus filhotes, Moreno

e Elvis, por toda a alegria e carinho que tanto aquecem meu coração.

Agradeço também as amigas e amigos que estiveram ao meu lado ao

longo desses últimos dois anos, me apoiando em meio a dificuldades e

multiplicando as alegrias. Quanta sorte a minha ter encontrado vocês!

Sou muito agradecida pela pessoa Isabel Quadros, que me recebeu com

tanto carinho e se dedicou a me orientar durante esta etapa de meu processo de

formação. Sua atenção e cuidado garantiu não somente que eu construísse e

executasse um projeto de mestrado, mas que vivenciasse ao máximo todas as

oportunidades da pós graduação e, assim, crescesse ainda mais cientificamente.

Um agradecimento especial a Giovana e a Cristiane, que além da amizade me

possibilitaram conhecer o significado de trabalho em grupo. O Dream Team me

proporcionou imenso crescimento profissional e pessoal.

Não posso deixar de agradecer aos funcionários do Departamento de

Psicobiologia, as equipes de cuidado com os animais, limpeza, técnica e

administrativa, cujos trabalhos possibilitaram as melhores condições possíveis

para desenvolvimento deste estudo.

Por fim, agradeço ao financiamento do Conselho Nacional de

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - 131585/2014-2), a

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e a

Associação Fundo de Incentivo à Pesquisa (AFIP).

vii

Sumário

Dedicatória ......................................................................................................... v

Agradecimentos ................................................................................................ vi

Sumário ............................................................................................................ vii

Lista de Figuras ................................................................................................. ix

Lista de Abreviaturas ......................................................................................... x

Resumo ............................................................................................................. xi

Abstract ............................................................................................................ xii

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1

1.1. Tabagismo ......................................................................................... 1

1.2. Aspectos neurobiológicos da dependência ao tabaco ...................... 2

1.3. Sensibilização Comportamental ........................................................ 5

1.4. Preferência Condicionada ao Lugar (PCL) ........................................ 7

1.5. Estresse como fator de vulnerabilidade à dependência de drogas ... 8

2. OBJETIVOS ............................................................................................... 13

2.1. Objetivos Específicos ...................................................................... 13

3. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 14

3.1. Sujeitos experimentais ........................................................................ 14

3.2. Drogas ................................................................................................. 14

3.3. Estresse de derrota social ................................................................... 15

3.4. Avaliação da atividade locomotora ...................................................... 18

3.5. Condicionamento de preferência ao lugar ........................................... 18

3.6. Análise estatística ................................................................................ 19

4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS ............................ 20

4.1. Estudo 1: Consequências de dois protocolos de derrota social

(episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores da nicotina ............. 20

4.1.1. Experimento 1: Impacto da derrota social sobre os efeitos

psicomotores da nicotina (desafios sequenciais) ....................................... 20


psicomotores da nicotina (desafios em dias separados) ............................ 24

viii

4.2. Estudo 2: Consequências de dois protocolos de derrota social (episódica e

contínua) sobre os efeitos reforçadores condicionados da nicotina ................ 30

4.2.1. Experimento 3: Padronização da PCL induzida por nicotina ...... 30

4.2.2. Experimento 4: Consequências da derrota social sobre a aquisição

da PCL induzida por nicotina ........................................................................... 32

5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 37

5.1. Interações entre estresse de derrota social e efeitos psicomotores da

nicotina ....................................................................................................... 37

5.2. Interações entre estresse de derrota social e efeitos reforçadores

condicionados da nicotina .......................................................................... 39

6. CONCLUSÃO ............................................................................................ 44

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................... 45

Anexo 1

ix

Lista de Figuras

Figura 1. Ilustração da via da recompensa cerebral .......................................... 3

Figura 2. Esquema dos protocolos de Derrota Social ......................................17

Figura 3. Linha do tempo experimento 1 – Impacto da derrota social sobre os

efeitos psicomotores da nicotina (desafios sequenciais) ................................... 21

Figura 4. Resultados experimento 1 – Avaliação locomotora pós protocolo de

derrota social (desafios sequenciais) ............................................................... 23

Figura 5. Linha do tempo experimento 2 – Impacto da derrota social sobre os

efeitos psicomotores da nicotina (desafios em dias separados) ..................... 25


derrota social (desafios em dias separados) ................................................... 27


derrota social (desafio metanfetamina) ............................................................ 29

Figura 8. Linha do tempo experimento 3 – Padronização PCL induzida por

nicotina ............................................................................................................. 31

Figura 9. Resultados experimento 3 – Padronização da PCL induzida por nicotina

.......................................................................................................................... 32

Figura 10. Linha do tempo experimento 4 – Consequências da derrota social

sobre a aquisição da PCL induzida por nicotina .............................................. 33

Figura 11. Resultados experimento 4 – Influências da derrota social sobre a

aquisição de PCL induzida por nicotina ........................................................... 34


PCL em animais previamente estressados ..................................................... 36

x

Lista de Abreviaturas

ACTH Hormônio Adrenocorticotrófico

CRF Fator Liberador de Corticotrofina

HPA Hipotálamo-Pituitária-Adrenal

mRNA RNA mensageiro

NAc Núcleo Accumbens

PCL Preferência Condicionada ao Lugar

PFC Córtex Pré-Frontal

VTA Área Tegmentar Ventral

xi

Resumo

Objetivo: Investigar as consequências de dois protocolos de estresse de derrota

social (episódica e continua) sobre os efeitos psicomotores e reforçadores

condicionados da nicotina. Métodos: Foi utilizado o modelo do residente intruso,

no qual o sujeito experimental (camundongo intruso) foi derrotado diariamente

por um camundongo agressor diferente. Após cada período de confronto o

camundongo intruso retornou para sua gaiola moradia (derrota episódica) ou

permaneceu coabitando com o residente por 24 horas (derrota continua). Após

o período de 10 dias do protocolo de derrota social os animais foram

direcionados para os testes locomotores ou para a preferência condicionada ao

lugar (PCL). Tanto para avaliação locomotora quanto para indução de PCL pós

protocolo de derrota social foi utilizada a dose de 0,1 mg/kg de nicotina.

Resultados: Ambos os protocolos de derrota social (episódica e continua)

induziram redução da atividade locomotora a curto prazo, efeito potencializado

pela nicotina somente no grupo exposto à derrota episódica. Essa atenuação

locomotora induzida tanto pelo estresse quanto pela nicotina não foi observada

10 dias após o fim do protocolo de derrota social. Nenhum dos protocolos de

derrota social favoreceu a aquisição de preferência ou aversão condicionada ao

lugar induzida por nicotina. Uma semana após a exposição à nicotina durante

protocolo de PCL, o grupo exposto previamente a derrota episódica apresentou

atenuação locomotora induzida por nicotina. Conclusão: Foram observadas

diferentes consequências dos protocolos de derrota social episódica e continua

sobre os efeitos psicomotores da nicotina, havendo favorecimento do efeito

atenuador de atividade locomotora da droga pelo grupo derrota continua nos

testes a curto prazo. Uma semana após exposição repetida à nicotina durante

protocolo de PCL o grupo derrota episódica, mas não continua, também

apresentou redução da atividade locomotora induzida pela droga. Nenhum dos

protocolos de derrota social favoreceu a aquisição de preferência ou aversão

condicionada induzida por nicotina.

xii

Abstract

Objective: This study aimed to investigate the consequences of two types of

repeated social defeat stress (episodic and continuous) on nicotine-induced

psychomotor effects and conditioned reward in mice. Methods: Using the

resident-intruder model, experimental mice (intruder) were defeated by an

aggressive one (resident). After each daily defeat, intruders returned to their

homecage (episodic stress) or cohabitated with the aggressor for 24h

(continuous stress), until the next defeat. After the 10-day stress protocol,

different batches of mice received nicotine (0.1 mg/kg, s.c.) in locomotor tests

(short- and long-term), or for conditioned place preference (CPP). Results: Both

defeat protocols induced short-term (within 24h) locomotor suppression, which

was potentiated by nicotine only after continuous defeat stress. Ten days after

the final defeat, locomotor suppression was no longer observed due to stress or

nicotine. Nicotine failed to induce place preference or aversion after either defeat

protocol. Only the episodic defeat group showed nicotine-induced locomotor

suppression one week after the additional nicotine exposure during the CPP

protocol. Conclusion: Our findings indicate that different consequences of

episodic and continuous stress on nicotine psychomotor effects were observed

shortly after stress. Differential long-term effects on nicotine locomotor response

were only observed when stressed mice were further exposed to repeated

nicotine administration (during CPP). Also, neither episodic nor continuous defeat

stress facilitated the acquisition of conditioned place preference or aversion to

nicotine.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Tabagismo

O consumo do tabaco teve origem na América antiga, havendo indícios

de seu uso pela população indígena cerca de 10 mil anos atrás (Castaldelli-Maia

et al, 2016). Seu uso foi disseminado pela Europa a partir do século XVI e

diversas formas de consumo foram desenvolvidas com o passar dos séculos,

havendo a ascensão do cigarro em meados do século XIX (Rosemberg, 2003).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (2015), atualmente 21% da

população mundial adulta é fumante. No Brasil, dados do II Levantamento

Domiciliar Sobre o Uso de Drogas Psicotrópicas no Brasil (2005) indicam que

10% da população preenche critérios de dependência ao tabaco, enquanto a

Pesquisa Nacional de Saúde (PNS, 2013) relata que 14,7 % da população

brasileira é fumante. O fumo do tabaco está intimamente relacionado com mais

de 90% dos casos de câncer de pulmão (OMS, 2008), 85% das mortes

decorrentes de doenças pulmonares, como enfisema e bronquite (INCA, 2015),

além de 25% dos casos de doenças cardiovasculares e derrames (Benowitz,

2010; OMS, 2015). Por esse motivo, a Organização Mundial de Saúde considera

o tabagismo a principal causa de morte evitável no mundo, com número de óbitos

que ultrapassam cinco milhões de registros ao ano, dos quais cerca de 200 mil

apenas no Brasil (INCA, 2015).

O tabagismo é classificado como doença pela Organização Mundial de

Saúde, uma vez que possui potencial de induzir dependência. A dependência de

drogas de abuso é caracterizada por um conjunto de fenômenos fisiológicos,

cognitivos e comportamentais decorrentes do uso de substâncias psicotrópicas,

na qual a substância em questão adquire valor sobressaliente em relação a

outros aspectos da vida do indivíduo (OMS, 2015). A última edição do Catálogo

Internacional de Doenças (CID-10) contempla o tabagismo em sua classificação

F17 – “Transtornos mentais e comportamentais devido ao uso de fumo”,

definindo a síndrome de dependência pela manifestação de um conjunto de

sintomas (3 ou mais, no período de 12 meses), dentre eles o desenvolvimento

de tolerância aos efeitos da substância, a perda de controle e compulsão pelo

2

seu uso, a negligência de atividades em decorrência do uso da substância, a

manutenção do uso apesar de prejuízos associados, e a manifestação da

síndrome de abstinência no caso de interrupção do uso (CID-10). A última edição

do Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM–V) também

considera o tabagismo como um “Transtorno por uso de substâncias”, sob código

305.1, o qual pode ser classificado como leve, moderado ou grave conforme a

quantidade de sintomas apresentados no período de 12 meses.

Apesar de ser possível encontrar mais de 4 mil substâncias químicas nos

derivados do tabaco, a nicotina é a substância farmacologicamente ativa

considerada responsável por seus efeitos reforçadores e pelo desenvolvimento

de dependência pelos usuários crônicos (Stolerman & Jarvis, 1995; Benowitz,

2010). Pelo seu modo de consumo mais comum, ou seja, através do fumo do

tabaco, a nicotina leva cerca de 10 segundos para atingir o sistema nervoso

central (Benowitz et al, 2009). Esse curto intervalo de tempo entre consumo e

efeito vem a favorecer seu potencial de induzir dependência (Benowitz, 2010),

uma vez que facilita a associação entre o uso da substância e a manifestação

dos efeitos desejados. Os principais efeitos da nicotina estão relacionados com

a promoção de prazer e redução do estresse e ansiedade, além de favorecer

aspectos cognitivos como concentração e tempo de reação a estímulos

(Benowitz, 2010). Assim como outras substâncias psicotrópicas, como o álcool,

cocaína e anfetaminas, a nicotina é capaz de alterar o funcionamento cerebral

aguda e cronicamente, modificando a plasticidade neuronal de forma a favorecer

a instalação da dependência (Robinson & Berridge, 2001).

1.2. Aspectos neurobiológicos da dependência ao tabaco

Wise & Bozarth (1987) propõe que os efeitos reforçadores das drogas de

abuso são decorrentes da ativação de um mecanismo cerebral comum, o

sistema de recompensa cerebral. Este sistema contempla as regiões da área

tegmentar ventral (VTA), do núcleo accumbens (NAc) e do córtex pré-frontal

(PFC) (Pierce & Kalivas, 1997), havendo modulação de seu funcionamento por

diversas vias neurais (figura 1). De forma simplificada, a VTA possui projeções

dopaminérgicas para o NAc e para o PFC, enquanto o PFC possui projeções

glutamatérgicas para o NAc e para a VTA. Já o NAc possui projeções

3

GABAérgicas para a VTA. (Pierce & Kalivas, 1997). A via dopaminérgica

mesolímbica parece ser crucial para o processo de desenvolvimento da

dependência de substâncias (Koob, 1992; Robinson e Berridge, 2001; Polter &

Kauer, 2014).

O aumento da liberação de dopamina no núcleo accumbens é uma resposta

comum a quase todas as drogas de abuso (Di Chiara & Imperato, 1988) e parece

estar relacionado com a predição de estímulos que geram reforços de valores

positivos (Di Chiara, 2000; Shim et al, 2001), ou seja, que aumentam a

probabilidade de repetição do comportamento relacionado (Skinner, 2003). As

substâncias psicotrópicas como cocaína, heroína e etanol podem sensibilizar a

neurotransmissão dopaminérgica mesolímbica, tornando-a hiper-responsiva à

ação dessas substâncias e aumentando a saliência dos comportamentos

relacionados a seu consumo, os quais se tornam mais atrativos e desejados

(Reid et al, 1996; Robinson & Berridge, 2001; Shim et al, 2001; Sanchis-Segura

& Spanagel, 2006; Steketee & Kalivas, 2011). A exposição repetida, portanto,

torna a substância e os estímulos associados a ela progressivamente mais

Figura 1. Ilustração simplificada de cérebro humano (esquerda) e de roedor (direita),

mostrando a localização das estruturas da via da recompensa cerebral e suas projeções

dopaminérgicas (DA), glutamatérgicas (Glu) e GABAérgicas (GABA). NAc, Núcleo

Accumbens; PFC, Córtex Pré Frontal; VTA, Área Tegmentar Ventral.

4

atraentes e capazes de favorecer o comportamento de busca pela droga, de

acordo com a teoria de Robinson e Berridge (2001). DiFranza e Wellman (2005)

sugerem ainda que a sensibilização à nicotina, em particular, potencializa sua

capacidade de suprimir os mecanismos de fissura (do inglês “craving”, desejo

intenso de consumir a substância), o que levaria à uma resposta homeostática

de aumento na geração da fissura. Assim, o aumento exacerbado da fissura

ocorrido com a retirada de nicotina também viria a favorecer o comportamento

de busca por essa substância (DiFranza & Wellman, 2005, 2007).

A nicotina, assim como outras drogas de abuso, também é capaz de ativar e

induzir modificações no funcionamento da via da recompensa cerebral. O

mecanismo de ação da nicotina se dá através da ativação dos receptores

colinérgicos nicotínicos, que são canais iônicos dependentes de ligante

amplamente difundidos pelo cérebro e geralmente ativados pelo

neurotransmissor acetilcolina (DiFranza & Wellman, 2005; Benowitz, 2010;

Feduccia et al, 2012). No entanto, a ligação de moléculas de nicotina também

pode induzir a ativação desses receptores, levando à abertura do canal e

possibilitando o influxo de cátions, o que pode vir a ocasionar despolarização

neuronal (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012). Esses receptores estão

presentes tanto na pré quanto na pós sinapse, podendo assim modular a

liberação de neurotransmissores (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012). Os

receptores nicotínicos são compostos por cinco subunidades, combinadas entre

os nove tipos de subunidades α (α2 a α10) e três tipos de subunidades β (β2 a β4)

(Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014). Os receptores

do tipo α4β2, em particular, aparentam estar diretamente relacionados com o

processo de dependência à nicotina (Arik et al, 2009; Benowitz, 2010; Feduccia

et al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014), havendo indícios de sua participação na

ativação dopaminérgica e nos efeitos comportamentais induzidos pela droga,

conforme observado em estudos com camundongos knock out para os genes da

subunidade α4 ou β2 (para revisão, ver Benowitz, 2010, Feduccia et al, 2012;

Picciotto & Mineur, 2014).

A nicotina age diretamente sobre os receptores nicotínicos da VTA

promovendo a estimulação dos neurônios dopaminérgicos que se projetam

dessa região para o núcleo accumbens (Di Chiara, 2000; Benowitz, 2010;

Steketee & Kalivas, 2011). Ao mesmo tempo, a nicotina age nos receptores

5

nicotínicos dos terminais neuronais glutamatérgicos, potencializado a liberação

de glutamato e consequente estimulação dos neurônios dopaminérgicos por

esse neurotransmissor (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto & Mineur,

2014). A nicotina também age em receptores localizados em neurônios

GABAérgicos, no entando, a rápida dessensibilização desses receptores acaba

por reduzir a liberação de GABA e, consequentemente, o controle inibitório sobre

os neurônios dopaminérgicos (Benowitz, 2010; Feduccia et al, 2012; Picciotto &

Mineur, 2014). A ação da nicotina, portanto, vem a favorecer a excitabilidade dos

neurônios dopaminérgicos que se projetam para o núcleo accumbens, levando

ao aumento de dopamina nessa estrutura, o que pode ser observado por horas

após administração da droga (para revisão, ver Vezina et al, 2007; Feduccia et

al, 2012; Picciotto & Mineur, 2014).

Os efeitos reforçadores da nicotina podem ser evidenciados

experimentalmente com a autoadministração operante, utilizando a via

intravenosa para a administração voluntária da droga (Olivier et al, 2007; Le Foll

et al, 2009; Leão et al, 2012; Cohen et al, 2012, 2015), e por processos como o

de condicionamento de preferência ao lugar (para revisão, ver Bardo & Bevins,

2000; Sanchis-Segura & Spanagel, 2006), como utilizado neste estudo. Já os

efeitos estimulantes da nicotina podem ser avaliados pelo processo de

sensibilização comportamental (para revisão, ver Sanchis Segura & Spanagel,

2006; DiFranza & Wellman, 2007; Steketee & Kalivas, 2011), o qual também foi

avaliado neste estudo.

1.3. Sensibilização Comportamental

A sensibilização comportamental é um fenômeno comum a diversas

substâncias psicotrópicas, como cocaína, heroína, etanol e nicotina (para

revisão, ver Sanchis Segura & Spanagel, 2006; DiFranza & Wellman, 2007;

Steketee & Kalivas, 2011). Em modelos experimentais, o processo de

sensibilização comportamental caracteriza-se pelo aumento duradouro da

atividade locomotora decorrente da administração repetida da droga (Domino,

2001; Robinson & Berridge, 2001; Shim et al, 2001; Steketee & Kalivas, 2011),

refletindo alterações neuroadaptativas ocorridas na via da recompensa cerebral,

6

as quais potencializam a resposta dopaminérgica à droga em questão (Robinson

et al, 1993, 2001).

Dados da literatura e estudos prévios do nosso laboratório demonstraram que

os efeitos da nicotina são dependentes de dose e do tempo de tratamento

(Clarke & Kumar, 1983; Domino, 2001; DiFranza & Wellman, 2007). Clarke e

Kumar (1998) observaram que, agudamente, a dose de 0,1 mg/kg de nicotina

não induziu alterações locomotoras em ratos, enquanto a dose de 0,4 mg/kg

induziu redução da atividade locomotora nos primeiros 20 minutos pós

administração da droga. Observaram também que a administração diária da

dose de 0,4 mg/kg levaria a uma tolerância a esse efeito de atenuação da

atividade locomotora, havendo manifestação do efeito estimulante dessa dose

após 1 semana de administração crônica. Domino (2001) também observou o

efeito redutor da atividade locomotora induzido pela administração aguda de

nicotina na dose de 0,32 mg/kg e, menos marcadamente, pela dose de 0,1

mg/kg, em ratas. Ambas as doses também produziram estimulação locomotora

após 6 dias de administração crônica, efeito mais saliente para a dose de 0,32

mg/kg. Em nosso laboratório a dose de 0,1 mg/kg não proporcionou efeitos

locomotores agudos, porém apresentou uma tendência a induzir efeitos

estimulantes após administração crônica, em camundongos. A dose de 0,4

mg/kg agudamente induziu uma considerável redução da atividade locomotora,

efeito tolerado após administração crônica. A estimulação locomotora que

caracteriza a sensibilização comportamental, no entanto, só foi observada

quando houve reexposição à droga (teste desafio) após um período de retirada.

Já a dose de 1,0 mg/kg também induziu supressão locomotora agudamente, no

entanto não houve desenvolvimento de tolerância a esse efeito mesmo após

administração crônica ou período de abstinência (dados não publicados).

A sensibilização neural e de respostas comportamentais à nicotina podem

contribuir para o desenvolvimento e manutenção da dependência, assim como

para a reinstalação da busca pela droga (para revisão, ver Robinson & Berridge,

1993, 2001; Sinha, 2001; Di Franza & Wellman, 2005; Steketee & Kalivas, 2011).

Há evidências de que a sensibilização à nicotina pode durar por até 4 semanas

e ser eliciada por pistas contextuais que tenham sido previamente pareadas com

a droga (DiFranza & Wellman, 2007). Dados sugerem que a sensibilização à

nicotina também é capaz de aumentar o consumo da droga em protocolo de livre

7

escolha (two-bottle choice) (Renda & Nashmi, 2014), potencializar a aquisição e

motivação para busca de nicotina por autoadministração operante (Neugebauer

et al, 2014), e aumentar a aquisição da preferência condicionada ao lugar

induzida por nicotina (Hilario et al, 2012).

1.4. Preferência Condicionada ao Lugar (PCL)

A preferência condicionada ao lugar (PCL) é um dos procedimentos

utilizados para avaliação dos efeitos condicionados induzidos por estímulos

reforçadores de naturezas variadas, como drogas, alimentos ou comportamento

sexual (para revisão, ver Bardo & Bevins, 2000). A PCL é baseada no

pareamento de um estímulo incondicionado (no caso, o ambiente onde o

estímulo é experienciado) aos efeitos do estímulo reforçador de interesse. Com

a repetição desse pareamento, o ambiente (estímulo incondicionado) associado

ao estímulo passa a eliciar um comportamento de aproximação (preferência) ou

evitação (aversão), de acordo com as características do estímulo (para revisão,

ver Sanchis-Segura & Spanagel, 2006). Em doses consideradas reforçadoras,

as drogas de abuso induzem uma preferência condicionada ao lugar em que o

animal foi pareado com a droga (estímulo reforçador). Ou seja, quando tendo

livre acesso a todos os ambientes o animal passa a maior parte do tempo

naquele que havia sido associado aos efeitos da droga, mesmo na ausência

desta.

Risinger e Oakes (1995) testaram a PCL para quatro doses de nicotina

(0,25; 0,5; 1,0 e 2,0 mg/kg) injetadas intraperitonealmente (i.p.) em

camundongos suíços albinos. Observaram efeitos dependentes de dose após 8

sessões de condicionamento, com preferência condicionada induzida pela dose

de 0,5 mg/kg e aversão condicionada induzida pela dose de 2,0 mg/kg, enquanto

as doses de 0,25 e 1,0 mg/kg demonstraram efeitos neutros. Outros grupos

também relataram efeitos de preferência / aversão dependentes de dose da

nicotina em outras espécies/linhagens de roedores e sob diferentes protocolos

experimentais (Kim et al, 1999; Leão et al, 2009; Sershen et al, 2009; Pastor et

al, 2013).

8

1.5. Estresse como fator de vulnerabilidade à dependência de

drogas

O estresse pode ser entendido como um conjunto de respostas

adaptativas a estímulos internos ou externos, denominados agentes estressores,

(Selye, 1936; 1985; Koob & Le Moal, 2001; Chartoff & Carlezon Jr, 2014). Essa

resposta adaptativa possui componentes fisiológicos, psicológicos e

comportamentais, manifestando-se, por exemplo, pela ativação do sistema

nervoso simpático, dos sistemas emocionais do cérebro, e do eixo hipotálamo-

pituitaria-adrenal (HPA) (Selye 1936; Koob & Le Moal, 2001; Sinha, 2001, 2008;

Chartoff & Carlezon Jr, 2014). O eixo HPA é responsável pela regulação da

liberação de glicocorticoides na corrente sanguínea, apresentando um ritmo

circadiano de funcionamento basal (Dallman, 1993). Sua ativação se dá pela

ação do fator liberador de corticotrofina (CRF) hipotalâmico sobre a pituitária,

estimulando a liberação do hormônio adrenocorticotrófico (ACTH). O ACTH é

liberado na corrente sanguínea e age sobre o córtex da glândula adrenal,

estimulando a liberação de glicocorticoides, como o cortisol (em humanos) e

corticosterona (em roedores). Os glicocorticoides, por sua vez, regulam

negativamente o funcionamento do eixo HPA, agindo sobre a pituitária de forma

a inibir a liberação de ACTH (Dallman, 1993; Koob & Le Moal, 2001; Koob, 2008).

Os agentes estressores levam à ativação do eixo HPA pela indução da liberação

de CRF (Dallman, 1993) e, cronicamente, podem levar a alterações em seu

funcionamento que agreguem valores patológicos à resposta de estresse

(Dallman, 1993; Koob & Le Moal, 2001), como aumento da ansiedade, prejuízos

cognitivos e comprometimentos endócrinos (Koob & Le Moal, 2001). O CRF

também é produzido por outras regiões além do hipotálamo, como a amigdala

central e o núcleo leito da estria terminal (Sawchenko et al, 1993; Koob & Le

Moal, 2001; Stamatakis et al, 2014). George Koob (1993) considera que esse

CRF extra hipotalâmico também esteja envolvido nas respostas adaptativas ao

estresse. No entanto, os glicocorticoides regulam positivamente esse sistema

extra hipotalâmico do estresse, estimulando a liberação de CRF (Koob & Le

Moal, 2001).

9

As drogas de abuso, como cocaína, heroína, álcool e nicotina, também

são consideradas agentes estressores e, assim, são capazes de ativar o eixo

HPA (Koob, 2008; Chartoff & Carlezon Jr, 2014). Estudos sugerem que a

nicotina, particularmente, é capaz de modificar a liberação de CRF, ACTH e

glicocorticoides (Matta et al, 1998; Chen et al, 2008; Yu et al, 2008). Matta e

colaboradores (1998) observaram que a infusão intracerebral de nicotina induz

a liberação de ACTH, o que não foi observado com a administração direta de

nicotina em células da pituitária, sugerindo que a ação dessa droga decorra da

estimulação da liberação de CRF hipotalâmico. Já Yu e colaboradores (2008)

observaram que a autoadministração crônica de nicotina leva à uma redução no

número de células hipotalâmicas marcadas com mRNA de CRF, sugerindo que

cronicamente a nicotina venha a suprimir a liberação desse hormônio.

Corroborando com esses dados, Chen e colaboradores (2008) observaram que

a autoadministração aguda de nicotina leva ao aumento dos níveis de ACTH e

corticosterona em ratos, o que deixou de ser observado com a autoadministração

crônica da droga. No entanto, a autoadministração crônica de nicotina

potencializou a liberação desses hormônios frente à um estresse brando de

choque nas patas, sugerindo uma sensibilização desse mecanismo de resposta

a um estressor de natureza distinta (Chen et al, 2008).

O estresse é um importante fator de risco para o aumento da

vulnerabilidade ao uso prejudicial de drogas de abuso, podendo interferir desde

o uso inicial até a própria dependência e recaída (Sinha, 2001, 2008; Bruijnzeel,

2012). Diversos estudos mostram uma associação entre eventos estressantes e

aumento do abuso de drogas. O histórico de eventos estressores na infância,

como agressões físicas, abuso sexual e psicológico, se mostra como fator de

risco para o abuso de substâncias na vida adulta (Sinha, 2001, 2008). O estresse

vivido na vida adulta, como a perda de suporte social, também está associado

ao consumo de drogas de abuso (Sinha, 2001, 2008). Considera-se que o

consumo de substâncias como uma resposta de enfrentamento para o estresse

está associado ao uso abusivo e dependência (Miczek et al, 2008; Sinha, 2008).

Em relação à nicotina, o estresse parece estar relacionado tanto com o aumento

no número de cigarros consumidos, quanto com a fissura e recaída em

indivíduos abstêmios (Cohen & Lichtenstein, 1990; Niaura et al, 2002).

10

Modelos animais demonstram que o estresse é capaz de sensibilizar o

sistema dopaminérgico de recompensa cerebral de maneira semelhante ao que

ocorre com a administração repetida de drogas de abuso, tornando os animais

mais sensíveis aos efeitos estimulantes e reforçadores dessas substâncias

(Robinson & Berridge 1993; Aguilar et al, 2013; Miczek et al, 2008; Miczek et al,

2011; Bardo et al, 2013; Garcia-Keller et al, 2013). Essa sensibilização do

sistema de recompensa cerebral pode ser decorrente tanto da ação dos

glicocorticoides (Stephens & Wand, 2012; Montoya et al, 2014) quanto do CRF

extra hipotalâmico (Koob & Le Moal, 2001; Polter & Kauer, 2014; Stamatakis et

al, 2014) sobre a VTA, núcleo accumbens e estruturas modulatórias do sistema

de recompensa.

Estressores sociais parecem ser cruciais no aumento da vulnerabilidade

para instalação de comportamentos relacionados à dependência (Miczek et al,

2008; Aguilar et al, 2013). Estudos demonstram que a exposição repetida a

breves episódios de derrota social pode potencializar a estimulação locomotora

(sensibilização cruzada), a taxa de aquisição e da motivação para

autoadministração de cocaína e anfetamina (Kabbaj et al, 2001; Covington &

Miczek 2005; Quadros & Miczek 2009; para revisão, ver Miczek et al, 2008).

McLaughlin e colaboradores (2006) observaram que o estresse crônico de

derrota social também foi capaz de potencializar a aquisição da preferência

condicionada ao lugar induzida por cocaína em camundongos.

No entanto, variações nos protocolos de estresse de derrota social

parecem atuar de formas distintas nas neuroadaptações dopaminérgicas do

núcleo accumbens e nos comportamentos relacionados à dependência de

drogas (Miczek et al, 2011). Protocolos de derrota social intermitente (derrota

episódica) induzem nos animais derrotados uma resposta dopaminérgica

sensibilizada a um desafio com a droga, sensibilização locomotora cruzada e

aumento da autoadministração de psicoestimulantes, conforme mencionado

anteriormente (Quadros & Miczek, 2009; Miczek et al, 2011). Já protocolos de

estresse de derrota contínua, no qual os animais derrotados permanecem

coabitando com os animais agressores (Berton et al, 2006; Miczek et al, 2011),

observa-se redução dos níveis basais de dopamina, além da indução de

tolerância ao efeito estimulante e redução do consumo de cocaína (Miczek et al,

2011). Isso sugere que estresse social contínuo promoveria anedonia e déficits

11

motivacionais na busca por reforçadores, além de alterações opostas àquelas

induzidas pela derrota episódica no funcionamento da via dopaminérgica

mesolímbica (Miczek et al, 2011).

Além disso, as consequências do estresse de derrota social também

parecem variar conforme a droga administrada. Diferente dos psicoestimulantes,

não foram observados grandes impactos da derrota social episódica no consumo

de heroína (Cruz et al, 2011). Já as consequências sobre os efeitos reforçadores

do álcool são variáveis (Blanchard et al, 1987; Van Erp et al, 2000; Croft et al,

2005) e dependentes da intensidade dos confrontos (Norman et al, 2015).

Estudos prévios do nosso grupo mostraram que animais expostos cronicamente

a derrota social contínua apresentam supressão da hiperatividade locomotora

induzida pelo etanol, além de facilitação da PCL induzido pela mesma droga. Em

contrapartida, animais que foram expostos ao estresse de derrota social

episódica não apresentam alteração da resposta locomotora ao etanol, nem

parecem alterar seus efeitos reforçadores na PCL (manuscrito em preparação).

Especificamente em relação à nicotina, os efeitos do estresse parecem

ser controversos. Há evidências de que o estresse crônico de restrição

potencializa os efeitos estimulantes da nicotina em ratos (Cruz et al, 2008), o que

não foi observado para o estresse de isolamento social (McCormick et al, 2005).

Ratos expostos ao estresse crônico moderado também apresentaram

sensibilização cruzada aos efeitos estimulantes da nicotina, assim como

aumento na busca por nicotina no protocolo de autoadministração operante

(Leão et al, 2012). No entanto, Al-Hasani e colaboradores (2013) relataram que

o estresse crônico moderado não interferiu nos efeitos reforçadores da nicotina,

avaliados por protocolo de PCL. Zou e colaboradores (2014) também não

observaram consequências do estresse de derrota social episódica sobre a

autoadministração operante de nicotina.

Tendo em vista que os dois tipos de estresse de derrota social – episódica

e contínua - podem influenciar os comportamentos relacionados à dependência

de drogas de maneiras distintas, este estudo teve por objetivo comparar as

consequências desses dois tipos de estresse sobre os efeitos psicomotores e

reforçadores condicionados da nicotina, em camundongos. Nossa hipótese era

a de que haveriam consequências distintas dos dois protocolos de derrotas sobre

os efeitos da nicotina, com aumento dos efeitos psicomotores e facilitação da

12

instalação de preferência condicionada à nicotina em decorrência da derrota

episódica, enquanto a derrota contínua reduziria os efeitos da droga.

13

2. OBJETIVOS

Este projeto teve por objetivo verificar e comparar as consequências de dois

protocolos de estresse de derrota social (episódica e contínua) sobre os efeitos

psicomotores e reforçadores condicionados da nicotina em camundongos.

2.1. Objetivos Específicos

Estabelecer uma curva dose-resposta do condicionamento de preferência

ao lugar induzido pela nicotina.

Verificar as consequências da exposição prévia ao estresse de derrota

social episódica e contínua sobre os efeitos psicomotores da nicotina.

Verificar as influências do estresse de derrota social episódica e contínua

sobre a preferência ou aversão condicionada ao lugar induzida pela

nicotina.

14

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Sujeitos experimentais

Foram utilizados camundongos suíços albinos machos, adultos (60 dias),

provenientes do biotério central do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de

Modelos Experimentais) da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Os

animais foram mantidos no biotério do departamento de Psicobiologia da

UNIFESP/EPM, individualmente (exceto quando mencionado) em gaiolas

plásticas (30 x 19 x 13 cm) forradas com sabugo, tendo livre acesso a água e

ração. Os animais foram mantidos em condições controladas de temperatura (22

± 1 ºC) e luz (ciclo claro/escuro de 12 horas, com fase clara iniciada às 7:00

horas). Os experimentos foram realizados na fase clara. Todos os

procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Utilização Animal da

UNIFESP, conforme parecer número 2406280214 (Anexo 1).

3.2. Drogas

Nicotina 99% (Sigma, St Louis, MO) foi diluída em salina (0,9% NaCl, pH 7,2)

e injetada subcutaneamente (doses de 0,1; 0,4 e 1,0 mg/kg). As doses de

nicotina foram escolhidas com base na literatura (Clarke & Kumar, 1983; Risinger

& Oakes, 1995; Domino, 2001; DiFranza & Wellman, 2005) e em estudos piloto.

Estudos prévios de nosso grupo demonstraram que a dose de 0,1 mg/kg não

apresenta efeitos locomotores agudos, porém apresenta uma tendência a induzir

efeitos estimulantes após administração crônica em camundongos. A dose de

0,4 mg/kg agudamente induz uma considerável atenuação da atividade

locomotora, efeito tolerado após administração crônica. Já a dose de 1,0 mg/kg

também induz atenuação locomotora agudamente, no entanto não há

desenvolvimento de tolerância a esse efeito mesmo após administração crônica.

Dados da literatura sugerem que as doses de 0,1 e 1,0 mg/kg de nicotina tendem

a ser neutras no condicionamento de preferência / aversão ao lugar, não

induzindo nenhuma das situações propostas (Risinger & Oakes, 1995), enquanto

15

a dose intermediária (0,4 mg/kg) tende a induzir preferência condicionada ao

lugar (Pastor et al, 2013).

A metanfetamina utilizada no experimento 4.1.2. foi doada pela Polícia

Federal (São Paulo, Brasil) e testada quanto a seu grau de pureza. A

metanfetamina foi diluída em salina e injetada intraperitonealmente (dose de 1,0

mg/kg). A dose de metanfetamina foi baseada em estudos do nosso laboratório

que demonstraram um claro efeito estimulante após administração aguda

(Abrahao et al, 2009; Soeiro et al, 2012).

A administração das drogas e do veículo (salina) foi feita no volume de 10

ml/kg.

3.3. Estresse de derrota social

Os sujeitos experimentais desse estudo foram separados em dois grupos:

grupo controle e grupo estresse social. Os animais do grupo estresse, chamados

de “intrusos”, foram introduzidos na gaiola-moradia de animais coespecíficos,

chamados de “residentes”, para episódios de derrota social. Os residentes

agressores eram camundongos suíços albinos, machos, alojados em parceria

com uma fêmea e previamente treinados e estabilizados para a apresentação de

comportamentos agressivos contra machos da mesma espécie. O treino dos

residentes agressores consistiu na apresentação de camundongos “estímulo”

machos, de forma similar ao episódio de derrota social, até que o residente

apresentasse estabilidade no comportamento agressivo no confronto com outro

animal. O comportamento era considerado estável quando o animal realizasse

comportamento de perseguição e ataque sempre que exposto a um

camundongo “estímulo”, o que geralmente acontecia após 4 a 6 sessões de

treino, ocorridas em dias intercalados.

O episódio de derrota social consiste em três fases: iniciação, derrota e

ameaça (Tornatzky & Miczek, 1993) (figura 2). Após retirada da fêmea, o intruso

foi colocado na gaiola moradia do residente e mantido separado deste por uma

divisória de acrílico transparente com paredes perfuradas, por um período de 5

minutos (fase de iniciação). Esta divisória permite o contato auditivo, olfativo e

visual entre os animais, mas o animal intruso é protegido de mordidas

16

potencialmente prejudiciais. Durante a fase de derrota a divisória de acrílico foi

retirada e o residente teve oportunidade de perseguir, ameaçar e atacar o animal

intruso até que este assumisse postura de submissão, ou seja, postar-se ereto

sobre as patas traseiras, com cabeça inclinada para cima e orelhas retraídas

(Miczek et al, 1982). A fase de derrota teve duração de até 5 minutos, sendo

terminada antes caso o intruso apresentasse sinais de submissão por um

período de 4 segundos consecutivos, levasse 15 mordidas ou apresentasse

feridas aparentes. Ao término da fase de derrota os animais foram novamente

separados por divisória de acrílico e mantidos assim (fase de ameaça) por um

período de 5 minutos (derrota episódica) ou 24 horas (derrota contínua), neste

caso com livre acesso a água e alimento.

Ambos os protocolos de derrota social (episódica e contínua)

desenvolvidos em todos os experimentos deste trabalho foram realizados ao

longo de 10 dias, com um episódio de derrota por dia. Houve rotação dos

residentes agressores, de forma que a cada dia o intruso era apresentado a um

novo residente, de forma a evitar habituação.

Animais do grupo controle para a derrota episódica foram mantidos

isolados em suas gaiolas moradia, sendo manipulados apenas para pesagem e

limpeza. Já os animais do grupo controle para a derrota contínua foram mantidos

aos pares, separados por divisória perfurada de acrílico, durante os 10 dias de

protocolo. Estes animais também tiveram rotação diária de seus pares, conforme

descrito por Golden e colaboradores, 2011.

Ao fim dos 10 dias de protocolo de estresse, todos os animais retornaram

para suas gaiolas individuais.

17

Figura 2. Esquema dos protocolos de derrota social, indicando camundongo intruso

(preto) e camundongo residente agressor (branco). Diferença dos protocolos está no

período pós confronto, no qual o intruso da derrota episódica retorna para sua gaiola

moradia (a) e o intruso da derrota contínua permanece em coabitação com o

residente agressor (b) até o próximo confronto com um novo residente.

18

3.4. Avaliação da atividade locomotora

A atividade locomotora dos animais foi avaliada em caixas automáticas de

registro de locomoção Opto – M3, com dimensão de 47,5 x 25,7 x 20,5 cm

(Columbus Instruments, Columbus, Ohio), e contendo 16 pares de feixes

fotoelétricos no eixo horizontal. A interrupção subsequente de dois feixes

adjacentes foi registrada como uma unidade de atividade locomotora. A atividade

locomotora dos animais foi registrada por 30 minutos, imediatamente após

administração de droga ou veículo nos dias de teste.

3.5. Condicionamento de preferência ao lugar

O condicionamento de preferência ao lugar foi feito em caixas de acrílico

fosco divididas em três compartimentos (Insight Ltda, Brasil). Os compartimentos

laterais tinham as mesmas dimensões (15,5 cm x 12,5 cm x 12 cm, 4 pares de

feixes fotoelétricos), mas padrões distintos nas paredes internas e piso: um lado

possuía padrões verticais preto/branco nas paredes e grade de aço inoxidável

no piso, enquanto o outro lado possuía padrões horizontais preto/branco nas

paredes e barras de aço inoxidável no piso. Os compartimentos laterais eram

ligados por um compartimento central neutro (9,5 cm x 12,5 cm x 12 cm, 2 pares

de feixes fotoelétricos), com paredes em cinza e chapa de aço inoxidável no piso.

Os compartimentos eram separados por portas removíveis que permitiam o

confinamento dos animais em cada um dos compartimentos ou, quando abertas,

o livre acesso do animal a todo o aparelho. Os feixes fotoelétricos registraram o

tempo de permanência em cada compartimento.

O protocolo de condicionamento de preferência ao lugar utilizado foi

adaptado de Risinger e Oakes (1995) e consistiu em três fases: 1 – Teste pré –

condicionamento: no primeiro dia os animais foram individualmente colocados

no aparelho sem administração prévia de droga ou veículo, tendo livre acesso a

todos os compartimentos por quinze minutos. Os animais foram então

distribuídos em dois grupos (veículo e nicotina) conforme o tempo de

permanência em cada compartimento. Baseado em experimentos anteriores,

utilizou-se protocolo do tipo unbiased (sem viés), de forma que, em média, os

19

níveis de preferência inicial pelos dois compartimentos laterais foram similares

entre os grupos durante o teste pré – condicionamento. A escolha pelo

compartimento pareado com nicotina foi aleatória, porém balanceada para que

houvessem animais pareados com droga nos dois compartimentos laterais. 2 –

Fase de condicionamento: Os animais receberam administração diária de droga

ou veículo, seguido de imediato confinamento no compartimento previamente

estabelecido por um período de 15 minutos. Foram realizadas 8 sessões de

condicionamento, 4 pareadas com droga em um compartimento e 4 pareadas

com veículo no compartimento oposto, em dias alternados. Quando necessário,

4 pareamentos adicionais (2 droga, 2 veículo) foram realizados após o teste pós

condicionamento. 3 – Teste pós – condicionamento: 24 horas após o último

condicionamento foi realizado o teste pós condicionamento, exatamente

conforme descrição do primeiro teste. O tempo de permanência em cada

compartimento foi registrado em todos os testes.

3.6. Análise estatística

Todos os dados estão apresentados como média ± erro padrão (EP). A

atividade locomotora foi analisada por análise de variância (ANOVA) de medidas

repetidas, utilizando o fator grupo (controle ou estresse) como variável

independente e desafios (salina ou nicotina) como medidas repetidas. A

preferência condicionada ao lugar também foi avaliada por ANOVA de medidas

repetidas, considerando o fator grupo (controle e estresse, ou dose de nicotina)

como variável independente e o fator testes (pré e pós condicionamento) como

medidas repetidas. Em caso de detecção de efeitos significativos pela ANOVA,

a análise a posteriori utilizada foi o teste de Newman-Keuls para múltiplas

comparações. A preferência condicionada ao lugar também foi analisada por

teste t de Student pareado, considerando os testes pré e pós condicionamento

para cada grupo. Em todos os casos o nível de significância foi fixado em 5%.

20

4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E RESULTADOS


(episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores da nicotina

Objetivo: Verificar as consequências da exposição prévia ao estresse de derrota

social episódica e contínua sobre os efeitos psicomotores da nicotina.


psicomotores da nicotina (desafios sequenciais)

Após aclimatização ao laboratório durante pelo menos 7 dias, os

camundongos foram expostos à caixa de atividade locomotora por um período

de 30 minutos (teste de reação à novidade). Os animais foram divididos em dois

grupos: controle e estresse, os quais apresentavam níveis semelhantes de

resposta locomotora à novidade, assim como semelhantes médias de peso

corporal. Os animais do grupo estresse foram então expostos aos dois

protocolos de derrota social (episódica ou contínua), conforme descrito

previamente (item 3.3), por um período de 10 dias. Houve dois grupos controles

separados, um para cada protocolo de derrota social, como mencionado no item

3.3. Vinte e quatro horas após o último episódio de derrota social (para derrota

episódica) ou após o fim do período de coabitação (para derrota contínua), os

animais de ambos os grupos foram deslocados para outra sala. Foram então

testados nas caixas de atividade locomotora após administração de veículo

(salina), por um período de 30 minutos (desafio salina). Os animais foram então

retirados das caixas de atividade, receberam administração da dose de 0,1

mg/kg de nicotina e imediatamente retornaram para mais 30 minutos de teste

nas caixas de atividade (desafio nicotina). Os desafios salina e nicotina foram

realizados novamente 10 dias após o fim dos protocolos de derrota social, como

mostrado na linha do tempo (figura 3).

21

Para avaliação das consequências da derrota social sobre os efeitos

psicomotores da nicotina optamos por trabalhar apenas com a dose de 0,1

mg/kg, uma vez que esta apresenta efeitos agudos neutros e tendência a efeitos

crônicos estimulantes, conforme descrito no item 3.2. Nossa hipótese era a de

que o estresse de derrota social episódica, mas não contínua, viria a favorecer

a expressão do efeito estimulante dessa dose (sensibilização cruzada).

A ANOVA de uma via não mostrou diferenças estatísticas preexistentes

entre grupo controle e estresse durante o teste de reação à novidade (figuras 4a

e 4c). A ANOVA de medidas repetidas comparando o grupo estresse de derrota

social episódica e seu controle durante os testes locomotores (salina e nicotina)

detectou diferenças significativas para o fator testes (F(3,51)=17,23; p<0,001), mas

não para o fator grupo (F(1,51)=1,47; p=0,24) ou para a interação entre fatores

(F(3,51)=0,35; p=0,79). Análise a posteriori desprotegida indicou que a nicotina

induziu redução da atividade locomotora no grupo controle, tanto a curto quanto

a longo prazo, em comparação com os respectivos desafios salina. O grupo

Figura 3. Linha do tempo experimento 1 – impacto da derrota social sobre

os efeitos psicomotores da nicotina (desafios sequenciais). Durante este

protocolo um grupo de animais passou por dez dias de derrota social

episódica (controles mantidos isolados), enquanto outro grupo passou por

10 dias de derrota social contínua (controles mantidos aos pares). A barra

cinza corresponde ao período do protocolo de derrota social. Neste

experimento os desafios foram conduzidos no mesmo dia, de forma

sequencial: 24 horas (desafios a curto prazo) e 10 dias (desafios a longo

prazo) após o fim de cada protocolo de derrota social a atividade

locomotora dos animais foi testada após administração de salina e, em

seguida, após administração de nicotina (0,1 mg/kg).

22

derrota episódica apresentou redução da atividade locomotora induzida por

nicotina a curto, mas não a longo prazo, quando comparado com os respectivos

desafios salina. Não houve diferenças entre grupos controle e estresse episódico

em nenhum dos testes (figura 4b).

Para o protocolo de derrota social contínua a ANOVA de medidas

repetidas não detectou diferenças para o fator grupo (F(1,54)=0,12; p=0,74), no

entanto houve diferenças estatisticamente significativos para o fator testes

(F(3,54)=53,21; p=0<001) e para a interação entre os fatores grupo e testes

(F(3,54)=4,23; p=0,009). Análise a posteriori indicou que tanto o grupo controle

quanto o grupo derrota contínua apresentaram atividade locomotora reduzida

após administração de nicotina nos testes a curto e a longo prazo, em

comparação com os respectivos desafios salina. Não houve diferenças entre os

grupos (controle e estresse contínuo) em nenhum dos testes (figura 4d).

23

Figura 4. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no teste de reação à

novidade (antes do início das derrotas; a, c) e nos desafios salina e nicotina (0,1

mg/kg, s.c.) (b, d) em camundongos expostos aos protocolos de estresse crônico

de derrota social episódica (a, b) ou contínua (c, d). Desafios a curto prazo foram

conduzidos 24 horas após o fim dos protocolos de derrota social, enquanto os

desafios a longo prazo foram conduzidos 10 dias após o fim desses protocolos.

Os desafios salina e nicotina foram realizados em sequência: animais receberam

salina e tiveram atividade locomotora registrada por 30 minutos, logo em seguida

receberam administração de nicotina e voltaram para as caixas de atividade para

mais 30 minutos de registro. + atividade locomotora no desafio nicotina diferente

do respectivo desafio salina (p<0,05).

24

Em experimentos anteriores de padronização (dados não mostrados),

havíamos observado a ausência de efeitos locomotores para a administração

aguda de nicotina na dose de 0,1 mg/kg, em camundongos “naive”. Assim,

consideramos inesperada a supressão locomotora apresentada pelos animais,

principalmente dos grupos controle de ambos os protocolos de derrota social

(episódica e contínua). Levantamos três hipóteses quanto ao que poderia estar

induzindo esse efeito: 1. A droga utilizada poderia ter deteriorado; 2. O efeito da

droga seria diferente para animais alojados em grupo (como durante a

padronização) e animais em isolamento social (neste experimento); 3. O

momento de administração da droga interfere em seus efeitos, já que neste

experimento a nicotina foi administrada em sequência ao desafio salina,

enquanto que na padronização o efeito da nicotina foi testado separadamente.

Testamos essas hipóteses em experimentos adicionais (dados não mostrados)

que demonstraram que o efeito atenuador da atividade locomotora induzido pela

dose de 0,1 mg/kg de nicotina estava sendo favorecido pelos desafios

sequenciais, no qual o efeito da nicotina foi avaliado imediatamente após os

animais terem sido testados com salina.

Uma vez que o protocolo utilizado neste experimento teve fatores não

previstos influenciando os resultados, optamos por realizar um novo experimento

para avaliação das consequências da derrota social sobre os efeitos

psicomotores da nicotina, no qual os desafios salina e droga seriam realizados

em dias distintos.


psicomotores da nicotina (desafios em dias separados)

O segundo experimento, para análise das consequências da derrota

social sobre os efeitos psicomotores da nicotina, foi realizado de forma similar

ao primeiro, descrito no item 4.1.1, passando pelo teste de reação à novidade e

10 dias de derrota social (protocolos de derrota episódica e derrota contínua). A

única diferença entre os experimentos está no momento de realização dos

25

desafios salina e nicotina: no experimento 2, todos os animais passaram pelo

desafio salina três horas após o último episódio de derrota social (derrota

episódica) ou período de coabitação (derrota contínua), enquanto o desafio

nicotina foi realizado 24 horas após o fim do protocolo de derrota social. Os

desafios salina e nicotina foram repetidos respectivamente 9 e 10 dias após o

fim do protocolo de derrota social. Dois dias após o último desafio nicotina foi

realizado um desafio adicional, com a dose de 1,0 mg/kg de metanfetamina,

como mostrado na linha do tempo (figura 5).

A ANOVA de uma via não mostrou diferenças estatísticas preexistentes

entre grupo controle e estresse durante o teste de reação à novidade (figuras 6a

e 6c). A ANOVA de medidas repetidas comparando o grupo estresse de derrota

episódica e seu controle durante os testes locomotores (salina e nicotina) não

identificou diferença significativa para o fator grupo (F(1,48)=1,29; p=0,27), mas

revelou efeito significativo para o fator testes locomotores (F(3,48)=8,621;

p<0,001), além de interação significativa entre os fatores grupo e testes

Figura 5. Linha do tempo experimento 2 – impacto da derrota social sobre os efeitos

psicomotores da nicotina (desafios em dias separados). Durante este protocolo um grupo

de animais passou por dez dias de derrota social episódica (controles mantidos isolados),

enquanto outro grupo passou por 10 dias de derrota social contínua (controles mantidos

aos pares). Barra cinza corresponde ao período do protocolo de derrota social. Neste

experimento os desafios foram conduzidos em dias diferentes: os desafios a curto prazo

foram realizados 3 horas (salina) e 24 horas (nicotina) após o fim de cada protocolo de

derrota social, enquanto os desafios a longo prazo foram conduzidos 9 e 10 dias após o

fim desses protocolos.

26

locomotores (F(3,48)=3,701; p=0,018). Nos animais do grupo controle, análise a

posteriori indicou uma supressão locomotora induzida por nicotina no desafio a

curto prazo, em comparação com o respectivo desafio salina (p<0,05), efeito que

não foi observado no desafio a longo prazo. Já no grupo submetido ao estresse

episódico, observou-se ausência de efeitos locomotores induzidos pela nicotina,

em comparação com as respostas locomotoras à salina, tanto nos desafios a

curto quanto a longo prazo. No entanto, o grupo derrotado apresentou maior

atividade locomotora nos desafios a longo prazo (salina e nicotina) do que nos

respectivos desafios a curto prazo (p<0,05). Isso sugere uma redução da

atividade locomotora nos testes de curto prazo (até 24 horas) pós protocolo de

estresse de derrota episódica, que retorna a níveis mais altos nos desafios a

longo prazo. Não houve diferenças entre grupos controle e estresse de derrota

episódica em nenhum dos testes (figura 6b).

Para o protocolo de derrota social contínua a ANOVA de medidas

repetidas indicou um efeito significativo para os fatores grupos (F(1,42)=18,6;

p=0,001) e testes locomotores (F(3,42)=5,8; p=0,002), além de significativa

interação entre os fatores (F(3,42)=4,13; p=0,012). Análise a posteriori da

interação indicou diferenças entre os grupos controle e estresse de derrota

contínua nos dois desafios a curto prazo (salina e nicotina), nos quais o grupo

derrota contínua apresentou menor atividade locomotora em relação ao grupo

controle (p<0,05). Não foram observadas diferenças entre grupos nos testes a

longo prazo. Comparações entre os testes do grupo derrota contínua indicaram

uma tendência de intensificação da atenuação locomotora induzida pela nicotina

durante os desafios a curto prazo (p=0,06). Essa redução de atividade

locomotora não foi observada no desafio nicotina a longo prazo. Neste teste, o

grupo estressado continuamente apresentou maior atividade locomotora do que

no desafio nicotina a curto prazo (p<0,05), sugerindo tolerância aos efeitos

psicomotores da nicotina. Foi observada atenuação locomotora induzida por

nicotina durante o desafio a curto prazo do grupo controle (p<0,05 em relação

ao respectivo desafio salina), efeito que não foi observado no desafio a longo

prazo (figura 6d).

27

Figura 6. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no teste de reação à

novidade (antes do início das derrotas; a, c) e nos desafios salina e nicotina (0,1

mg/kg, s.c.) (b, d) em camundongos expostos aos protocolos de estresse crônico

de derrota social episódica (a, b) ou contínua (c, d). Desafios salina e nicotina

foram conduzidos em dias separados: desafios a curto prazo foram conduzidos 3

horas (salina) e 24 horas (nicotina) após o fim dos protocolos de derrota social,

enquanto os desafios a longo prazo foram conduzidos 9 dias (salina) e 10 dias

(nicotina) após o fim desses protocolos. * atividade locomotora diferente do grupo

controle no mesmo teste; + atividade locomotora diferente do desafio salina

equivalente; # atividade locomotora diferente entre o referido desafio a curto e a

longo prazo. Em todos os casos, p<0,05.

28

Com o intuito de verificar a capacidade dos animais de apresentar

resposta estimulante frente a um psicoestimulante típico, nós comparamos os

dados do segundo desafio salina (desafio a longo prazo) com os dados

referentes ao desafio metanfetamina (realizado dois dias após o último desafio

nicotina). Para o protocolo de derrota social episódica a ANOVA de medidas

repetidas não detectou diferenças significativas para o fator grupo (F(1,16)=0,11;

p=0,74) ou para a interação entre fatores (F(1,16)=0,07; p=0,79). Também não

foram observadas diferenças para os fatores grupo (F(1,14)=2,43; p=0,14) e

interação entre fatores (F(1,14)=0,05; p=0,83) para o protocolo de derrota social

contínua. No entanto, para cada protocolo de derrota social (episódica e

contínua) a ANOVA de medidas repetidas detectou efeito significativo para o

fator teste: F(1,16)=21,35 (p<0,001) para derrota episódica (figura 7a) e

F(1,14)=13,52 (p=0,002) para derrota contínua (figura 7b). Análise a posteriori

desprotegida indicou que a metanfetamina induziu significativa hiperatividade

locomotora (p<0,05) para ambos os grupos (controle e estresse) do protocolo de

derrota episódica, enquanto no protocolo de derrota social contínua a

hiperatividade induzida por metanfetamina foi observada somente para o grupo

controle (p<0,05), havendo apenas uma tendência de estimulação para o grupo

derrota contínua (p=0,068).

29

Figura 7. Resposta locomotora (média ± EP) registradas no desafio salina

e metanfetamina (1 mg/kg, i.p.) em camundongos expostos aos protocolos

de estresse crônico de derrota social episódica (a) ou contínua (b). Desafio

salina foi conduzido 9 dias após o fim do protocolo de derrota social,

enquanto desafio metanfetamina foi conduzido 2 dias após o último

desafio nicotina. + atividade locomotora diferente do desafio salina

(p<0,05)

30


(episódica e contínua) sobre os efeitos reforçadores condicionados

da nicotina

Objetivo:

- Estabelecer uma curva dose-resposta do condicionamento de

preferência ao lugar induzido pela nicotina.

- Verificar as influências do estresse de derrota social episódica e contínua

sobre a preferência ou aversão condicionada ao lugar induzida pela nicotina.

4.2.1. Experimento 3: Padronização da PCL induzida por nicotina

Os animais alojados em grupos (4 a 5 animais por caixa) e, após período

de aclimatização ao laboratório, foram expostos ao protocolo de PCL descrito

previamente (item 3.5). Com base nos dados do teste pré-condicionamento

esses animais foram divididos em 4 grupos, conforme o tratamento a ser

recebido durante o protocolo de PCL: salina (grupo controle); nicotina 0,1 mg/kg;

nicotina 0,4 mg/kg e nicotina 1,0 mg/kg. Foram realizadas então 8 sessões de

pareamento (1 sessão por dia) e 1 teste pós condicionamento, conforme descrito

previamente (ver figura 8).

31

Os dados da preferência condicionada ao lugar estão apresentados como

escore de preferência, ou seja, porcentagem de tempo de permanência no

compartimento pareado com nicotina menos a porcentagem de tempo de

permanência no compartimento pareado com veículo em cada teste (média

±EP). A ANOVA de medidas repetidas não detectou efeito significativo para os

fatores tratamento (F(3,36)=0,41; p=0,74), testes (F(1,36)=2,14; p=0,15) ou para a

interação entre esses fatores (F(3,36)=2,01; p=0,130), sugerindo que nenhuma

das doses de nicotina induziu preferência ou aversão condicionada ao lugar. No

entanto, apesar da ausência de significância estatística, o grupo tratado com a

dose de 0,4 mg/kg de nicotina aparentou apresentar uma tendência a aversão

ao ambiente pareado com a droga. Uma análise complementar com esse grupo,

teste T pareado entre os testes pré e pós condicionamento, confirmou esse efeito

não detectado pela ANOVA de medidas repetidas (t=3,84, p=0,003), indicando

o condicionamento de aversão ao lugar induzido pela dose de 0,4 mg/kg de

nicotina. Análise com teste T pareado não detectou diferenças entre os testes

pré e pós condicionamento para nenhum dos outros grupos (figura 9).

Figura 8: Linha do tempo experimento 3 – padronização do

protocolo de preferência condicionada ao lugar induzida por

nicotina. Cores alternadas indicam pareamento com nicotina (■) ou

salina (■).

32

Uma vez que trabalhamos em cima da hipótese de que o estresse de

derrota social viria a potencializar os efeitos reforçadores da nicotina, optamos

por utilizar a dose mais baixa da droga (0,1 mg/kg), que neste momento

apresentou efeitos neutros. Esperávamos que após exposição ao estresse de

derrota social episódica, mas não contínua, essa mesma dose viria a induzir

preferência ou aversão condicionada ao ambiente em que foi pareada.

4.2.2. Experimento 4: Consequências da derrota social sobre a

aquisição da PCL induzida por nicotina

Como descrito previamente (item 3.3), os animais foram distribuídos em

grupos controle e estresse e expostos a 10 dias de protocolo de derrota social

(episódica e contínua). Como mostrado na linha do tempo (figura 10), sete dias

após o fim do protocolo de derrota social os animais foram submetidos ao

protocolo de PCL para nicotina, com 8 pareamentos iniciais seguidos do teste

Figura 9. Escore de preferência (porcentagem, média ± EP) na padronização do

protocolo de preferência condicionada ao lugar induzida por nicotina. * diferença

entre os testes pré e pós condicionamento para o referido grupo (p<0,05).

33

pós condicionamento. Devido à ausência de condicionamento após 8

pareamentos, foram realizados ainda 4 pareamentos adicionais e um novo teste

pós condicionamento, sendo que somente este último teste pós

condicionamento foi considerado para análise. Cinco e sete dias após o término

do protocolo de PCL, os animais tiveram sua atividade locomotora avaliada após

administração de salina e nicotina (0,1 mg/kg, s.c.), respectivamente.

Foram considerados para análise somente o teste pré condicionamento e

o segundo teste pós condicionamento, uma vez que o primeiro teste pós

condicionamento não indicou nenhuma alteração nos escores de preferência

(dados não mostrados). A ANOVA de medidas repetidas não detectou efeito

significativo para os fatores grupo (controle e estresse) (F(1,15)=0,86; p=0,77),

testes (F(1,15)=1,63; p=0,22) ou para a interação entre esses fatores (F(1,15)=0,12;

p=0,73) para o protocolo de derrota episódica, e nem para os mesmo fatores do

protocolo de derrota contínua (grupo (F(1,16)=1,90; p=0,19), testes (F(1,16)=1,23;

p=0,28), interação (F(1,16)=2,16; p=0,16). A exposição crônica tanto à derrota

episódica (figura 11a) quanto à derrota contínua (figura 11b) não interferiu com

a aquisição da preferência ou aversão condicionada induzida por nicotina. Nas

mesmas condições, ambos os grupos controle também não apresentaram

preferência significativa pelo ambiente pareado com nicotina mesmo após os 4

pareamentos adicionais (2º teste pós condicionamento). O grupo controle da

derrota episódica, no entanto, pareceu apresentar uma tendência à aversão ao

Figura 10. Linha do tempo experimento 4 – Consequências da derrota social sobre

a aquisição da PCL induzida por nicotina. Barra cinza corresponde ao período do

protocolo de derrota social. Cores alternadas indicam pareamento com nicotina (■)

ou salina (■). Somente o teste pré condicionamento e o segundo teste pós

condicionamento (dia 31) foram considerados para análise da PCL.

34

ambiente pareado com nicotina, o que não foi evidenciado pela análise com teste

t de Student (t=1,81; p=0,11).

Cinco e sete dias após o protocolo de PCL os animais foram desafiados com

salina e nicotina, respectivamente. Para o protocolo de derrota episódica, a

ANOVA de medidas repetidas detectou efeito significativo do fator desafio

Figura 11. Escore de preferência pelo compartimento associado à nicotina

(porcentagem, média ± EP) no protocolo de preferência condicionada ao lugar

induzida por nicotina (0,1 mg/kg), conduzido 7 dias após o fim dos protocolos

de 10 dias de derrota social episódica (a) e contínua (b), com seus respectivos

grupos controle.

35

(F(1,15)=6,77; p=0,02), mas ausência de efeito para o fator grupo (F(1,15)=2,20;

p=0,16) ou para a interação entre fatores(F(1,15)=2,53; p=0,13). A análise a

posteriori desprotegida revelou que somente o grupo derrota episódica

apresentou supressão locomotora induzida por nicotina em comparação com o

desafio salina, efeito não observado no grupo controle (figura 12a). A ANOVA de

medidas repetidas para o protocolo de derrota contínua identificou diferenças

significativos para o fator desafio (F(1,16)=6,13; p=0,02), mas não para o fator

grupo (F(1,16)=1,43; p=0,25) ou para a interação entre fatores (F(1,16)=1,99;

p=0,18). A análise a posteriori revelou que o grupo controle apresentou resposta

locomotora reduzida no desafio nicotina, em comparação com o desafio salina,

enquanto o grupo derrota contínua não apresentou nenhum efeito da nicotina

(figura 12b).

36

Figura 12. Atividade locomotora (média ± EP) registrada nos desafios salina

e nicotina (0,1 mg/kg), conduzidos 5 e 7 dias após o fim do protocolo de PCL,

respectivamente, em animais previamente expostos cronicamente ao

estresse de derrota social episódica (a) ou contínua (b). + atividade

locomotora diferente entre desafios salina e nicotina (p<0,05).

37

5. DISCUSSÃO

Este foi o primeiro estudo que sistematicamente comparou dois tipos de

estresse de derrota social (episódica e contínua), com tempos de duração

equivalentes, ocorrendo simultaneamente e utilizando o mesmo grupo de

residentes agressores em ambos os protocolos. Também foi o primeiro estudo a

avaliar as consequências da derrota social crônica sobre os efeitos psicomotores

e reforçadores condicionados da nicotina.

Nossa hipótese de que os protocolos de derrota social episódica e contínua

promoveriam efeitos distintos sobre os efeitos psicomotores e reforçadores

condicionados da nicotina foi parcialmente confirmada. Observamos que o

estresse de derrota social contínua, e não episódica, como esperado, viria a

aumentar os efeitos psicomotores da nicotina a curto prazo, favorecendo uma

atenuação da atividade locomotora após administração da droga. No entanto,

animais com histórico de exposição à nicotina após protocolo de estresse de

derrota episódica (durante PCL) apresentaram atenuação locomotora quando

reexpostos à nicotina após período de retirada da droga, o que não foi observado

pelos animais previamente expostos à derrota contínua. Nosso estudo não

confirmou nossa hipótese de que o estresse de derrota social episódica facilitaria

a PCL induzida por nicotina, enquanto o estresse de derrota social contínua viria

a prevenir a PCL, de forma similar às consequências da derrota episódica e

contínua na autoadministração de cocaína (Miczek et al, 2011).

5.1 Interações entre estresse de derrota social e efeitos

psicomotores da nicotina

Dados da literatura indicam que o estresse caracteristicamente induz

redução da atividade locomotora (Martinez et al, 1998; Blanchard et al, 2001;

Beery & Kaufer, 2015), assim como observamos em nosso estudo. No entanto,

esta foi uma consequência imediata da derrota social crônica, observada nos

desafios a curto prazo (ocorridos até 24 horas após o fim do protocolo de

38

estresse) mas não nos desafios a longo prazo (ocorridos 9-10 dias após o

protocolo de estresse). Em nosso estudo, a redução da atividade locomotora foi

consequência de ambos os protocolos de derrota social (contínua e episódica),

no entanto, Miczek et al (2011) reportou que o protocolo crônico de derrota

contínua, mas não episódica, reduziria os comportamentos exploratórios em

testes de campo aberto ocorridos poucas horas após a derrota social. Assim

como em nosso estudo, nenhum dos protocolos de derrota social afetou a

atividade locomotora dos animais frente a um desafio com salina 10 dias após o

fim do protocolo de estresse (Miczek et al, 2011). A ausência de supressão

locomotora logo após o protocolo de derrota social episódica indicada por Miczek

e colaboradores (2011) pode ser decorrente de diferenças nos protocolos, uma

vez que o protocolo de derrota social episódica consistiu em quatro confrontos

espaçados em 72 horas (4 derrotas em 10 dias), enquanto o protocolo de derrota

social contínua compreendeu cinco derrotas semanais ao longo de cinco

semanas (Miczek et al, 2011). Em nossos dois protocolos de estresse, houve 10

derrotas em 10 dias, e nessas condições, ambos os tipos de derrota promoveram

redução de atividade motora exploratória a curto prazo.

Em animais com histórico de derrota social episódica a nicotina não induziu

alterações da atividade locomotora. No entanto, esta droga pareceu potencializar

a supressão locomotora de curto prazo induzida pelo estresse de derrota social

contínua. Houve tolerância a este efeito no desafio com nicotina a longo prazo.

Nossos dados sugerem que as consequências do estresse sobre os efeitos

psicomotores da nicotina podem ser diferentes conforme o protocolo de derrota

social, assim como entre diferentes estressores. Por exemplo, Cruz e

colaboradores (2008) relataram que o estresse crônico de restrição favoreceu o

efeito estimulante da nicotina em ratos, enquanto outro estudo não detectou

nenhum efeito significativo do estresse utilizando protocolo semelhante (Zago et

al, 2012). Utilizando o estresse crônico variado, Leão e colaboradores (2012)

observaram que a exposição ao estresse aumentou a estimulação induzida por

nicotina. No entanto, todos esses experimentos que observaram favorecimento

do efeito estimulante da nicotina foram realizados em ratos. Portanto há a

possibilidade de diferentes perfis de sensibilidade e de resposta ao estresse

crônico ou à própria nicotina, em espécies diferentes (ratos e camundongos,

39

neste caso). Há relatos de que o estresse de derrota social em camundongos

induz sensibilização cruzada a um desafio com metanfetamina (Yap et al, 2007),

mas não ao efeito estimulante do etanol (Norman et al, 2015). Dessa forma, é

possível que diferentes consequências da derrota social sejam observadas

conforme a droga administrada.

Curiosamente, em animais derrotados que foram expostos à nicotina durante

protocolo de preferência condicionada ao lugar, observamos efeitos a longo

prazo da droga, durante o desafio nicotina realizado 29 dias após a derrota

social. Neste momento, o grupo derrotado episodicamente apresentou resposta

locomotora reduzida no desafio nicotina, enquanto o grupo derrotado

continuamente não foi afetado pela droga. Enquanto em nosso estudo a

exposição ao estresse e à nicotina ocorreram em diferentes fases do protocolo,

outros estudos avaliaram as consequências da exposição concomitante ao

estresse e nicotina. Kita e colaboradores (1999) observaram que ratos que

recebem nicotina imediatamente após cada sessão de estresse psicológico, no

qual testemunhavam outros ratos recebendo choque nas patas, apresentaram

estimulação locomotora exacerbada nos dias 5 e 10 do tratamento combinado.

Harris e colaboradores (2014) relataram que a exposição à nicotina durante

estresse de restrição preveniu a supressão locomotora de curto prazo induzida

pelo protocolo de estresse, no entanto não foram observados efeitos da nicotina

a longo prazo (ver também Zago et al, 2012). Sendo assim, podemos dizer que

não somente o tipo de estressor como também o intervalo entre a exposição ao

estresse e à droga pode ser crítico na determinação das consequências da

exposição ao estresse sobre os efeitos psicomotores da nicotina.

5.2. Interações entre estresse de derrota social e efeitos reforçadores

condicionados da nicotina

Dados da literatura sugerem que a nicotina pode induzir tanto preferência

condicionada ao lugar (Risinger & Oakes, 1995, Kashkin & Witte, 2005; Brunzell

et al, 2009; Brielmaier et al, 2008; Ise et al, 2014; Kutlu et al, 2015) quanto

40

aversão condicionada ao lugar (Risinger 1995; Ise 2014; Kutlu et al, 2015;

Jorenby et al, 1990), efeitos que são dependentes da dose da droga e da

linhagem dos animais. Em nosso estudo não observamos a indução de

preferência nem de aversão condicionada após os protocolos de estresse de

derrota social. O experimento de padronização do protocolo de preferência /

aversão condicionada induzido por nicotina (item 4.2.1) demonstrou que a dose

de 0,4 mg/kg de nicotina induzia aversão condicionada ao lugar, então optamos

por trabalhar com a dose de 0,1 mg/kg, a qual se mostrou neutra neste e também

em outro estudo com camundongos (Risinger & Oakes, 1995). Nos baseamos

na hipótese de que o estresse favoreceria a aquisição de preferência

condicionada ao lugar induzida por essa dose, como observado por Brielmaier e

colaboradores (2012) com a dose de 0,2 mg/kg de nicotina, a qual induziu

preferência condicionada ao lugar em ratos adolescentes estressados, mas não

teve efeito nos animais controle.

Alguns fatores podem ter influenciado nossos resultados, como o intervalo

entre a exposição ao estresse e ao protocolo de PCL ou o tipo de estressor

utilizado. Em nosso estudo o protocolo de preferência condicionada ao lugar teve

início uma semana após o fim dos protocolos de derrota social, no entanto

Brielmaier e colaboradores (2012) relataram que uma única sessão de estresse

de choque nas patas favoreceu a aquisição de preferência condicionada

induzida por nicotina, utilizando apenas uma sessão de condicionamento 24

horas após o evento estressor. Por outro lado, Al-Hasani e colaboradores (2013)

também não viram interferência da exposição ao estresse crônico moderado na

aquisição de preferência condicionada ao lugar induzida por nicotina, em

protocolo iniciado 24 horas após o fim do protocolo de estresse.

Em nosso estudo nós avaliamos as consequências da exposição crônica

ao estresse de derrota social na aquisição da PCL induzida por nicotina. Outros

estudos sugerem que a exposição ao estresse pode ser relevante em outras

fases do protocolo de PCL, como a extinção ou reinstalação da preferência pelo

ambiente pareado com a droga. Leão e colaboradores (2009) e Jackson e

colaboradores (2013) observaram que um único dia de estresse de restrição ou

dois dias de estresse de nado forçado, respectivamente, induziram a

reinstalação da preferência ao lugar induzida por nicotina. Leão e colaboradores

41

(2010) também reportaram que a exposição ao estresse crônico de restrição

retarda a extinção da preferência condicionada induzida por nicotina, mas não

interfere com a reinstalação por. Al-Hasani e colaboradores (2013) observou que

o estresse crônico moderado também não interfere com a reinstalação de PCL

induzida por administração aguda da droga.

Ainda que em nosso estudo o estresse social não tenha afetado a

aquisição de PCL induzida por nicotina, dados da literatura sugerem que ele

pode afetar a PCL induzida por outras drogas em camundongos (Montagud-

Romero et al, 2015; Ribeiro do Couto et al, 2009). Ribeiro do couto e

colaboradores (2009) utilizaram diferentes condições de alojamento como

estressores sociais crônicos em camundongos adolescentes e adultos,

avaliando as consequências dessas experiências sobre a aquisição da

preferência condicionada ao lugar induzida por cocaína. Os animais foram

alojados em grupo (n=4 por gaiola moradia), isoladamente, em superlotação

(introdução de um novo animal a cada dois dias, até que houvessem 8 animais

por gaiola moradia) ou pareados com uma fêmea, permanecendo nessas

condições por duas semanas até o início e também durante todo o protocolo de

PCL. Observaram que a condição de isolamento social preveniu a aquisição de

preferência condicionada pela dose de 3,125 mg/kg de cocaína em

camundongos adolescentes, não sendo reportados outros prejuízos de

aquisição para doses mais elevadas ou para camundongos adultos. No entanto,

em camundongos adultos alojados em grupo, o isolamento social ocorrido após

a aquisição da PCL potencializou a reinstalação da preferência após

administração aguda de cocaína. Da mesma forma, a ocorrência prévia de um

episódio de derrota social também potencializou a reinstalação da PCL (Ribeiro

do Couto et al, 2009). Já Montagud-Romero e colaboradores (2015) verificaram

que a exposição a um episódio de derrota social antes de cada sessão de

condicionamento na PCL por cocaína (1,0 mg/kg) viria a prevenir a instalação de

preferência em camundongos adolescentes, no entanto, além de não interferir

na aquisição de PCL em animais adultos, também veio a favorecer a reinstalação

dessa preferência frente à uma exposição aguda à droga.

A variabilidade de influências do estresse nos efeitos reforçadores da

nicotina também foi observada em protocolos de autoadministração operante,

42

nos quais os animais devem desempenhar determinado comportamento para

que ocorra o recebimento da droga. Leão e colaboradores (2012) relataram que

o estresse crônico moderado aumentou a motivação para busca de nicotina em

protocolo de autoadministração em razão progressiva. Por outro lado, Zou e

colaboradores (2014) observaram que a exposição repetida ao estresse de

derrota social episódica não afetou a aquisição da autoadministração de nicotina

nem o padrão de resposta em protocolo de razão progressiva. Buczek e

colaboradores (1999) observaram que uma única sessão de estresse de choque

nas patas induziria a reinstalação da busca por nicotina em protocolo de

autoadministração operante. É possível também que cada tipo de estressor

induza consequências diferentes conforme a droga testada. Por exemplo, Cruz

e colaboradores (2011) relataram que ratos expostos ao estresse de derrota

social episódica apresentaram aumento escalado da autoadministração de

cocaína e speedball (mistura de cocaína e heroína), mas não de heroína, durante

uma sessão com 24 horas de acesso à droga.

Nosso estudo não confirmou nossa hipótese de que o estresse de derrota

social episódica facilitaria a PCL induzida por nicotina, enquanto o estresse de

derrota social contínua viria a prevenir a PCL; de forma similar às consequências

da derrota episódica e contínua na autoadministração de cocaína (Miczek et al,

2011).

No entanto, observamos perfis de resposta diferentes entre os grupos

controle de cada protocolo de derrota social (episódica e continua). Ainda que

não tenham sido encontradas diferenças significativas, o grupo controle

episódico deslocou-se no sentido de permanecer mais tempo no ambiente

pareado com a droga, enquanto o grupo controle contínuo deslocou-se no

sentido de permanecer mais tempo no ambiente pareado com veículo. Uma

análise comparativa entre a resposta desses dois grupos no segundo teste pós

condicionamento (ANOVA de uma via) revelou que essas repostas são

significativamente opostas (F(1,14)=4,96; p=0,04). Já nos testes locomotores

realizados após o protocolo de PCL, o grupo controle contínuo, mas não

episódico, apresentou redução da atividade locomotora após administração de

nicotina (p<0,05). Esse perfil diferente de resposta observada entre os grupos

controle episódico e contínuo pode ser decorrente de influencias sociais, como

43

as condições de alojamento. É sabido que as condições sociais influenciam as

respostas às drogas de abuso (para revisão ver Aguilar et al (2013); Bardo et al,

2013), sendo que o isolamento social por si só é considerado um agente

estressor capaz de modificar o efeito dos psicoestimulantes (Ribeiro do Couto et

al (2009); Aguilar et al (2013); Bardo et al, 2013). Devemos considerar que em

nosso experimento os animais controles da derrota episódica foram

permanentemente mantidos em isolamento social, enquanto os animais

controles da derrota contínua permaneceram aos pares, ainda que sem contato

físico, durante os 10 dias do protocolo de derrota social. Essas diferenças

observadas nas respostas dos dois grupos reforça a necessidade de utilização

de grupos controles apropriados para cada protocolo de derrota social,

permitindo assim reduzir a interferência de fatores sociais além daqueles de

interesse no estudo.

O estudo das consequências do estresse sobre os efeitos

comportamentais e reforçadores das drogas de abuso é fundamental para o

avanço no entendimento dos mecanismos neurobiológicos envolvidos nessa

questão e suas manifestações. A utilização do estresse de derrota social, além

de favorecer a análise de um comportamento orgânico aos camundongos,

permite uma aproximação das condições clínicas, uma vez que a maioria dos

eventos estressores vivenciados por seres humanos são de natureza social.

Além disso, o entendimento de que diferentes tipos de estressores, ainda que de

natureza similares, podem induzir consequências distintas, e que essas

consequências podem também variar conforme a droga de abuso em questão,

permite uma melhor avaliação dos casos de vulnerabilidade à dependência de

substâncias, podendo auxiliar na elaboração de estratégias de prevenção e

tratamento da dependência de drogas.

44

6. CONCLUSÃO

Este foi o primeiro estudo que sistematicamente comparou dois tipos de

estresse de derrota social (episódica e contínua) sobre os efeitos psicomotores

e reforçadores da nicotina. Ambos os protocolos de estresse crônico de derrota

social induziram redução da atividade locomotora a curto prazo, consequência

que não foi mais observada 9 dias após o fim dos protocolos de estresse. Houve

tendência de potencialização desse efeito supressor inicial induzido pela derrota

social contínua, mas não episódica, após administração de nicotina; no entanto,

10 dias após o fim do protocolo de estresse esse efeito sedativo da nicotina foi

tolerado. Nenhum dos protocolos de derrota social facilitou a aquisição da

preferência ou aversão condicionada induzida por nicotina, porém, os animais

derrotados episodicamente apresentaram supressão locomotora induzida por

nicotina uma semana após o fim do protocolo de PCL, enquanto o grupo

derrotado continuamente apresentou sinais de tolerância a esse efeito supressor

da nicotina.

A utilização do estresse de derrota social permite uma aproximação das

condições clínicas, uma vez que a maioria dos eventos estressores vivenciados

por seres humanos são de natureza social. Além disso, o entendimento de que

diferentes tipos de estressores, ainda que de natureza similares, podem induzir

consequências distintas, e que essas consequências podem também variar

conforme a droga de abuso em questão, permite uma melhor avaliação dos

casos de vulnerabilidade à dependência de substâncias, podendo auxiliar na

elaboração de estratégias de prevenção e tratamento da dependência de

drogas.

45

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO 1

Rua Botucatu, 572, 1º andar conjunto 14 CEP 04023-061 São Paulo - tel: 55 (11) 5571-1062 / fax: 55 (11) 5539-7162

Horário de atendimento: das 9:00 as 13:00hs : e-mail:[email protected]

CEUA Nº 2406280214

São Paulo, 17 de abril de 2014

CEUA N 2406280214

IImo(a). Sr(a).

Pesquisador(a): Liz Paola Domingues

Depto/Disc: Departamento De Psicobiologia, Disciplina De Psicofarmacologia

Pesquisadores associados: Giovana Camila De Macedo (unifesp); Profa Dra Isabel Marian Hartmann De Quadros

(orientador)

Título do projeto: "Efeitos do estresse de derrota social sobre os efeitos estimulantes e reforçadores condicionados da nicotina

em camundongos".

Parecer Consubstanciado da Comissão de Ética no Uso de Animais UNIFESP/HSP

Atualmente cerca de um terço da população mundial é fumante, sendo que 10% da população brasileira preenche critérios de

dependência ao tabaco. O tabagismo é considerado a principal causa de morte evitável no mundo; no Brasil os números

ultrapassam 200 mil óbitos ao ano em decorrência deste hábito. A principal ação da nicotina relacionada com o

desenvolvimento da dependência é a ativação do sistema de recompensa cerebral levando ao aumento de dopamina no

núcleo accumbens, o que é comum a quase todas as drogas de abuso e está relacionado aos efeitos reforçadores das

mesmas. O estresse social é capaz de induzir neuroadaptações no sistema de recompensa cerebral de maneira semelhante

ao que ocorre com a administração repetida de drogas de abuso, sendo capaz então de potencializar seus efeitos reforçadores.

Pouco foi descrito a respeito das influências do estresse de derrota social sobre os comportamentos relacionados à

dependência de nicotina. Tendo em vista que ambos os tipos de estresse de derrota social – episódico e contínuo - podem

influenciar os comportamentos relacionados à dependência de drogas de maneiras opostas, este projeto tem o interesse de

comparar as consequências desses dois tipos de estresse sobre os efeitos estimulantes e reforçadores condicionados da

nicotina, em camundongos. Para avaliar possíveis alterações nos efeitos estimulantes ou depressores da nicotina, será

avaliada a resposta locomotora a um desafio com a droga, após os animais terem sido expostos a cada tipo de estresse social.

Já os efeitos reforçadores condicionados da nicotina serão analisados pelo modelo de condicionamento de preferência ao

lugar (CPP).

ANIMAIS:

Serão utilizados:

198 Camundongos heterogênicos Suíço albino, Machos, idade: 3 meses

Procedência: Biotério CEDEME - registro CEUA/UNIFESP: 01

Manutenção: Biotério do Departamento de Psicobiologia - registro CEUA/UNIFESP: 19

30 Camundongos heterogênicos Suíço albino, Fêmeas, idade: 3 meses

Procedência: Biotério CEDEME - registro CEUA/UNIFESP: 01

Manutenção: Biotério do Departamento de Psicobiologia - registro CEUA/UNIFESP: 19

VIGÊNCIA DO ESTUDO:

início previsto para: março/2014 com término previsto para: março/2016

A Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de São Paulo/Hospital São Paulo, na reunião de 17/04/2014,

ANALISOU e APROVOU todos os procedimentos apresentados neste protocolo.

1. Comunicar toda e qualquer alteração do protocolo.

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2. Comunicar imediatamente ao Comitê qualquer evento adverso ocorrido durante o desenvolvimento do protocolo.

3. Os dados individuais de todas as etapas da pesquisa devem ser mantidos em local seguro por 5 anos para possível auditoria

dos órgãos competentes.

4. Relatórios parciais de andamento deverão ser enviados anualmente à CEUA até a conclusão do protocolo.

consequÊncias do estresse de derrota social ......o consumo do tabaco teve origem na américa...

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