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CNR - Istituto di Bioscienze e Biorisorse, Perugia
Luciana Baldoni
Composizione varietale
degli oli di oliva mediante analisi del DNA
I Metodi di Controllo – Il Controllo dei Metodi Torino, 9-10 Novembre 2017
L’ampia gamma di oli extra
vergine di oliva è conseguenza:
del grandissimo numero di
varietà ancora in coltivazione,
dell’area geografica di
produzione e delle condizioni
pedo-climatiche locali
delle tecnologie di
produzione, estrazione e
stoccaggio
Gli oli extra vergine di oliva
L’olio di oliva è il prodotto alimentare sottoposto
al maggior numero di contraffazioni in Europa
Le più diffuse contraffazioni degli oli extra vergine di oliva si
basano sulla diversa reputazione, notorietà e prezzo di certi oli
rispetto ad altri (es. Olio Italiano 100%, DOP e IGP)
Il principale bersaglio di questo tipo di contraffazioni sono
le varietà impiegate per costruire l’olio
Le analisi chimiche e fisiche classiche
non sono in grado di rilevare le miscelazioni
improprie degli oli
Il patrimonio varietale dell’olivo
Italia 538 42% del patrimonio mondiale
Spagna 183 14%
Francia 88 7%
Grecia 52 4%
Turchia 45 3,5%
Tunisia 44 3,5%
Algeria 41 3,2%
Portogallo 24 1,9%
Altri paesi 260 20%
TOTALE 1.275
Cloni?
Popolazioni varietali?
Sinonimia (Frantoio-Raggiola)
Omonimia (Rosciola)
Toponimia (Nostrale di Rigali,
Moraiolo dei Monti Martani)
Morfonimia (Pendolino, Limona)
Perchè la caratterizzazione molecolare è necessaria?
Cultivar,
Ecotipi locali,
Genotipi rari,
Selvatici
Varietà locali
Varietà cosmopolite
Varietà migranti
Presenza di virus o altri
microrganismi non patogeni
Confusione sull’identità varietale
dovuta a diverse ragioni
Principali varietà del Mediterraneo
PicholineMarocaine, Haouzia, Menara
Picual, Hojiblanca, Picudo, Lechinde Sevilla, Manzanilla, Gordal,
Arbequina, Cornicabra, Blanqueta, Empeltre, Villalonga, Farga
Galega, Azeiteira, Cordovil, Cobrancosa
Sigoise, Chemlal
Koroneiki, Adramitini, Amigdalolia, Chalkidiki, Kalamon, Konservolia, Mastoidis Zaity, Sorani, Kaissy
ChemlaliSfax, Chetoui, Oueslati
Ayvalik, Domat, Gemlik, Izmir Sofralik, Memecik,
Zutica, BugaKalinjot, Bardi Tirana
Oblica, Levantinka, Lastovka,
Toffahi, Hamed
Aglandau, Bouteillan, Grossane,Lucques,Picholine,Tanche
Nabali, Barnea, Kadesh, Merhavia,
Soury
Bianchera,
Ad ogni paese / regione / territorio di coltivazione corrispondono
varietà locali specifiche e ben diverse da quelle coltivate altrove
Taggiasca, Moraiolo, Olivastra, Bianchera, Rasara, Casaliva, Gargna’,Nostrana Brisighella, Frantoio, Leccino, Dritta, Canino, RajaSabina, Gentile Chieti , Raggiola, Piantone Mogliano,
Nera di Collotorto, Cima Melfi, Carolea, Cassanese, Ottobratica, OgliarolaLeccese,Coratina, Peranzana, Cima Bitonto, Cellina Nardò,
Rotondella, Pisciottana, Gentile Larino,Biancolilla, Cerasuola, Tonda Iblea, NocellaraBelice, Nera Di Gonnos,
Bosana
Diffusione geografica di alcune varietà di olivo
Solo poche varietà hanno raggiunto una diffusione molto
ampia, interessando diversi paesi e continenti (es.
Arbequina, Arbosana, Koroneiki)
Marker molecolari ‘regionali’
Le varietà locali sono fortemente
imparentate tra loro e quindi si possono
distinguere come gruppi separati
Ciascun gruppo è discriminato da marcatori
regione-specifici
Collection Mondiale de l’Oliviere - Marrakech, Marocco
Olive Germplasm Bank - Cordova, Spagna
Collezione Germoplasma di Olivo CNR – Regione Umbria - Lugnano in Teverina (TR), Italia
Altre collezioni di Grecia, Libano, Giordania, Argentina
Disponibilità di una banca dati dei profili DNA
delle principali varietà di olivo
Progetto Europeo BEFORE
Coordinamento scientifico:
CNR-ISAFOM-IBBR Perugia, Italia
Obiettivi
Stabilire protocolli comuni di identificazione
molecolare e morfologica delle varietà di olivo
L’analisi del DNA applicata
agli oli di oliva extra vergine
Il DNA caratterizza in maniera
inequivocabile ciascun individuo,
varietà o specie diversa
Consente di stabilire a posteriori
quali sono la/le varietà da cui l’olio è
stato estratto
E’ utile per verificare se sono state
operate miscelazioni o sostituzioni
con oli di altre specie
Solo l’analisi del DNA è in grado di identificare le varietà e/o
specie che hanno contribuito alla preparazione di un olio
Potenzialità applicative
Identificare le cultivar usate per
la preparazione dell’olio
Dimostrare l’assenza di varietà
diverse da quelle attese
Verificare l’assenza di oli di
specie oleaginose diverse da
olivo (nocciolo, girasole, colza,
mais, o soia)
Rilevare l’assenza di olive
danneggiate dalla mosca
(Bactrocera oleae) o da altri
patogeni
Testare l’assenza di OGM
Presupposti dellarintracciabilità molecolare
(Budker et al., 2002)
Il DNA si conserva in tracce nell’olio
per lungo tempo (1-3 anni)
Il DNA si degrada
progressivamente, rimanendo in
frammenti sempre più brevi ma
rilevabili
Le tracce di DNA si possono
estrarre dall’olio, purificare e
rendere analizzabile
Dopo 1 ciclo PCR:
2 copie
Dopo 2 cicli PCR:
4 copie
Dopo 3 cicli PCR:
8 copie
Dopo 4 cicli PCR:
16 copie
Da 1
frammento
di DNA Frammento di DNA originale
Nuovo frammento
Si ottengono
milioni di
copie per
PCR
(Polymerase
Chain
Reaction)
Il DNA è l’unica molecola che può essere moltiplicata in vitro tramite PCR
15.000 SNP ottenuti da
approccio Genotyping-By-
Sequencing
3.000 SNP ottenuti dal
sequenziamento dei geni
espressi
NGS, GBS
RNA-seq
Breeding,
Selezione
assistita
Mappatura
genetica
Analisi del
DNA degli oli
Genotyping
Altre applicazioni Applicazioni
Sviluppo di nuovi marcatori varietà-specifici basati su
Single Nucleotide Polymorphisms (SNP)
G
A
A
A
Mutazione su varietà target
Sequenza comune a più varietà
SNP nella sequenza del gene SUT1
Cultivar 1
Cultivar 2
Cultivar 3
Heterozygous AG
Homozygous AA
Homozygous GG
I marcatori SSR usati per l’analisi del DNA degli oli
145 160
183 210
145 148
190
154
190 198210
1 2 3
210
148
156
154
190198
4 5 6
190 183
160156 145156
210
210
156
A quali varietà
corrispondono quegli
alleli nella bottiglia?
Profilo SSR di 6 varietà
I marcatori SNP varietà-specifici
1 2 3
4 5 6
A G T
G C T
8 9
A CT
L'olio è stato fatto
con le cv. 1, 4, 7
7
Profilo SNP di 8 varietà
cv. MORAIOLO
DNA da foglia
cv. MORAIOLO
DNA da olio
Confronto tra profili di DNA estratto da foglia e da olio
ACP1 alleli 1-3C
304 316 bp
304 316 bp
ACP1 alleli 1-3C
378 426 bp
350 378 bp
350 378 bp 426 bp
Olio delle cv. Moraiolo e Coratina
cv. MORAIOLO alleli 350-378 bp
cv. CORATINA alleli 378-426 bp
DNA da miscela di olio
MORAIOLO/CORATINA
alleli 350-378-426 bp
Marcatori plastidiali specie-specifici (bar-coding)
SSR plastidiali polimorfici tra specie
oleaginose diverse (nocciolo, mais, olivo)
ccSSR-11 ccSSR-12 CCMP1
NO
CC
IOL
O
LD 100 bp LD 100 bp
NO
CC
IOL
O
OL
IVO
MA
IS
OL
IVO
MA
IS
NO
CC
IOL
O
MA
IS
MA
IS
OL
IVO
OL
IVO
NO
CC
IOL
O
Mediante Real Time PCR è possibile quantificare il contributo
percentuale di ciascuna varietà in una miscela di oli
PCR Cycles
Delt
a R
n
Quantificazione del contributo di ciascuna
varietà in un blend di oli
PCR Cycles
Ma va tenuta in
considerazione la
possibile diversa
storia di ciascun olio
componente il blend
Nuovi sistemi di amplificazione-detection ad alta
sensibilità, rapidità, portabilità, quantificabilità
LAMP: Loop-mediated isothermal AMPlification
Digital PCR
Microfluidics
NALF (Nucleic Acid Lateral Flow)
Point-of-Care methods
CONSIGLIO NAZIONALE DELLE RICERCHE
Istituto di Bioscienze e Biorisorse, Perugia
www.cnr.ibbr.it
Tel. (+39) 075 5014866
Mob. (+39) 328 3760912
Luciana Baldoni
Roberto Mariotti
Nicolò Cultrera
Saverio Pandolfi