colorimetria e espectrofotometria 2012
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Mtodo que utiliza a intensidade da cor para determinar a concentrao de um analitoMtodo colorimtricoA concentrao determinada pela quantidade de luz absorvida
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Mtodos colorimtricosReaes colorimtricas: so aquelas em que os produtos finais tm uma cor e as intensidades das cores so medidas na faixa visvel do espectro (380nm - 680nm)
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Sensao fisiolgica associada a um comprimento de onda
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A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a regio do espectro visvelNossos olhos so capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visvel como cores diferentes.. A onda mais longa que conseguimos ver o vermelho, as mais curtas so azul e violeta.
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O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refrao maior na luz vermelha e menor na violeta.
As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz refratado por um prisma.
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As substncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvemAs cores absorvidas e refletidas so ditas complementares
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Se uma soluo absorve energia luminosa de comprimentos de onda situados entre 400nm e 480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao olho humano. Portanto o amarelo a cor complementar do azul
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Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde
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A maioria das anlises bioqumicas realizadas no laboratrio clnico baseia-se no princpio da quantidade de luz absorvida ou refletida
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Espectrofotometria Metodologia que utiliza a luz (radiao eletromagntica) para medir a concentrao qumica de um analito.
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EspectrofotometriaCapacidade de uma substncia ou produto derivado de uma reao bioqumica absorver ou emitir luz, em um determinado comprimento de onda, sob condies fsico-qumicas estabelecidas
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Leis de Lambert e BeerLei de Lambert:Quando a concentrao de um analito constante, a absoro depende do comprimento do caminho pticoLei de Beer:Quando o caminho ptico constante e igual a 1, a concentrao do analito diretamente proporcional quantidade de luz absorvida
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A absoro da luz tanto maior quanto mais concentrada for a soluo por ela atravessada: A soluo 20g/l absorve o dobro da soluo 10g/l.
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A absorbncia diretamente proporcional concentrao do composto na soluo
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O dispositivo utilizado para quantificar a energia de luz absorvida ou transmitida o ESPECTROFOTMETRO
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O ESPECTROFOTMETRO um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromtica atravs de uma soluo, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa soluo. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-ris com a separao das cores da luz branca).
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Mas que luz monocromtica esta?A cor da luz absorvida complementar cor observada
Ento Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar cor observada no produto corado
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Escolha do Comprimento de ondaUma soluo VERMELHA absorve o VERDE com maior intensidade e portanto deve-se escolher o comprimento de onda correspondente ao verde para medida da soluo vermelhaDeve-se utilizar uma faixa no espectro na qual a E0 radiante seja absorvida ao mximo
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Tabela Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde
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Espectrofotmetro - ComponentesSelecionador de comprimento de ondaCubeta para conter a soluo a ser analisadaLuz emitente ou fonte luminosaReceptor ou sistema fotomtrico
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Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetroA amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de vidro por ter uma melhor disperso.Os detectores devem ser altamente sensveis.Fonte de luzMonocromadorCompartimento para amostraDetector e dispositivo para leitura
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Esquema dos principais componentes de um espectrofotmetro
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Correspondem ao resultado da atuao de um ou mais reagentes sobre o analito para formar o produto corado. Determinao da concentrao de um analitoReaes colorimtricas:
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Exemplo: Dosagem de glicoseGLICOSE (soro) + Reagente de cor (KIT): tampo fosfato contendo p-Hidroxibenzoato, 4-Aminoantipirina (4-AAP), Glicose Oxidase e Peroxidase.
Processam-se as seguintes reaes:
Glicose + O2 + H2O GOD cido Glucnico + H2O2
2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2OProduto formado de colorao avermelhada
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Mas Como a intensidade da cor vai me dar a concentrao da substncia analisada?
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Determinao da concentrao de um analitoA determinao feita partir da comparao da cor obtida no teste com uma SOLUO PADRO (da mesma substncia) de concentrao conhecidaPadro de glicoseConc: 100mg/dl
TesteConc glicose: ?
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Determinao da concentrao de um analitoCaractersticas da soluo padroTer estabilidadePoder ser dissolvida em gua e dessecadaComposio definidaGrau de pureza de 99% ou maisPadro ou calibrador: substncia de valor conhecido
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Tabela 2 Cores e cores complementares na zona visvel do espectroComp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada) 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada595 - 650 Laranja Verde azulado 560 - 595 Amarelo-verde Roxo 500 - 560 Verde Roxo-vermelho490 - 500 Verde azulado Vermelho 480 - 490 Azul esverdeado Laranja 435 - 480 Azul Amarelo 380 - 435 Violeta Amarelo-verde
A cor avermelhada (do produto formado) medida no espectrofotmetro com absoro mxima no comprimento em 510nm
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Determinao da concentrao de um analitoNo espectrofotmetro eu obtenho a absorbncia da soluo padro e do teste.
Abs Pa ---------------Concentrao do PaAbs Teste ------------Concentrao do Teste
Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa
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Determinao da concentrao de um analitoClculo do FATOR DE CALIBRAO (FC)FC = concentrao Paabsorbncia do PaConc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa
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Funo do Fator de CalibraoObtendo-se o fator de calibrao, multiplica-se seu valor pelas leituras de absorbncias lidas pelo espectrofotmetro de cada amostra, chegando-se na medida em unidades ( mg/dL, g/L) do analito em questo.
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EXEMPLODOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUNEOPADRO: 100mg/dlAbsorbncia do padro: 0,210FATOR DE CALIBRAO: 100/0,210 = 833ABSORBNCIA (ABS) DA AMOSTRA = 0,095CONC. DA GLICOSE NA AMOSTRA = 0,095 x 833= 79mg/dl
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Dosagem de glicose Passo a passo
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Material necessrioEspectrofotmetroPipetasTubos de vidroSuporteKit de glicose
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Metodologia
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Identificao dos tubosBranco: usado para zerar o espectrofotmetro - normalmente gua destilada ou o reagente puro (quando este tem cor)Padro ou calibrador: substncia de valor conhecido e estvelAmostra teste: soro ou plasma do seu paciente
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LeituraA densidade tica (DO) ou absorbncia do padro da glicose cuja concentrao 100 mg/dL foi: 0,347
Esta leitura ser usada para extrair o clculo do fator de calibrao;
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LeituraA densidade tica(DO) ou absorbncia do teste de concentrao desconhecida foi: 0,341
Esta leitura ser usada para calcular a concentrao da amostra teste a partir da multiplicao pelo fator de calibrao;
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Clculo
Fator de calibrao= 100 mg/dl Abs do padroFator = 100 mg/dl 0,347Fator = 288
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ClculoConcentrao do teste: 288 x 0,341= 98,2
Porm como o valor de referncia da glicose : VR: 70 a 99 mg/dl
A concentrao do teste ser: 98 mg/dl
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AutomaoMltiplos testes;Pipetagem automticaRapidezPrecisoExatidoControle de qualidade
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Colorimetria/EspectrofotometriaUtilizao nas dosagens bioqumicas: Ex: glicose, uria, creatinina, colesterol, triglicrides, enzimas, ferro srico, etc
Hematologia: dosagem de hemoglobina
Sorologia: leitura final do mtodo de ELISA
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VantagensRapidez e facilidade das medidasAdequadas sensibilidade e especificidadeAparelhos de baixo custoBoa adaptao para automao, com exe-cuo em larga escala.
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CAUSAS DE VARIAES DOS RESULTADOS DOS EXAMES LABORATORIAISInterferentes:
Todo e qualquer fator que provoque ou favoreaa ocorrncia de alterao no resultado de umexame qualquer (drogas, alimentos, exerccio,etc).
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Ao dos Interferentes
Surgem alteraes metablicas cujo resultado um aumento do analito doseado, podendo causar consequentemente dvidas em sua interpretao
Estresse Glicose;Dieta rica em protenas UriaExerccio: TriglicridesFISIOLGICA
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QumicaAlguns interferentes podem atuar sobre o reativo, provocando uma alterao na reao de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotomtrica, conduzindo a um resultado errneo.
Ingesto de cido ascrbico: Glicose (GOD).Ingesto etanol: triglicrides, colesterolAo dos Interferentes
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Ao dos Interferentes
FsicaMuitas vezes a turvao de um soro lipmico pode induzir a leituras espectrofotomtricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados.Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.
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Classificao dos interferentes
FASE PR-ANALTICAFASE ANALTICAFASE PS-ANALTICAPacienteColeta da amostraSeparaoArmazenamentoProcessamento da amostraLeitura espectrofotomtricaClculosEmisso de resultadosAvaliao de resultadosElaborao do laudoEntrega do laudo ao paciente
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Fase pr-analticaInterferentes relacionados com o paciente: GravidezAtividade fsicaPosturaDietaIdadeUso de drogas (teraputicas ou de abuso)Infuso de frmacosLipemia e jejum
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Fase pr-analticaInterferentes relacionados com a coleta da amostraAplicao de torniqueteAnticoagulantesHemliseSeparao e preparo da amostra (trocas, plasma em contato com hemcias, exposio direta da luz, etc)
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Coleta de sangue
A diferena entre soro e plasma que o primeiro no contm fibrinognio, o qual foi utilizado para a formao do cogulo (fibrina).
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Anticoagulantes
Substncias que impedem a coagulao do sangue in vitro
Anticoagulantes:
EDTA (sequestra o Ca) Heparina ( atua impedindo a ao da trombina) Oxalatos (removem o Ca) Citratos (captao de Ca) Fluoreto (inibidor enzimtico, impedem a gliclise)
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Tubos adequados
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Tubos vcuoPadronizao da cor da tampaVermelha nenhum anticoagulantePrpura clara EDTA-K3Verde heparinaAzul citrato de sdioCinza fluoreto de NaAmarela Sem anticoagulante com gel
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ConsideraesO exame de laboratrio, apesar das similaridades, no pode ser considerado como um processo fabrilCada material, cada amostra e cada teste tm particularidades que exigem cuidado, ateno e conhecimento especficos
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Cada diagnstico uma vida... Obrigada
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