École doctorale « santé, sciences, technologies · 2012-02-28 · mathieu, marwan et abdallah...
TRANSCRIPT
![Page 1: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/1.jpg)
UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS
ÉÉCCOOLLEE DDOOCCTTOORRAALLEE «« SSaannttéé,, SScciieenncceess,, TTeecchhnnoollooggiieess »»
Service de Parasitologie - Mycologie - Médecine Tro picale, Faculté de Médecine
THÈSE présentée par :
Kamla MUSTFA
Soutenue le : 16 Décembre 2011
pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais
Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie / Parasitologie
EFFETS DES ANTIPALUDIQUES SUR LES STADES HÉPATIQUES ET LES STADES SEXUÉS (TRANSMISSION)
D’UNE PLASMODIE MURINE PLASMODIUM YOELII
THÈSE dirigée par : M. RICHARD-LENOBLE Dominique Professeur, Université de Tours
RAPPORTEURS :
M. CHABASSE Dominique Professeur, Université d’Angers M. DANIS Martin Professeur émérite, Université de Paris VI
JURY : M. CHABASSE Dominique Professeur, Université d’Angers M. CHANDENIER Jacques Professeur, Université de Tours M. DANIS Martin Professeur émérite, Université de Paris VI MME. LANDAU Irène Professeur émérite, Muséum National d'Histoire
Naturelle de Paris M. RICHARD-LENOBLE Dominique Professeur, Université de Tours
MEMBRE INVITE : M. DUONG Thanh Haï Docteur, Université de Tours
![Page 2: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/2.jpg)
Je dédie ce travail à ma famille et à mes proches.
Je n’ai pas besoin de vous dire combien je vous aime et que c’est votre
confiance en moi et vos encouragements qui m’ont aidé à supporter les
difficultés de l’éloignement.
C’est à vous ainsi qu’à vos familles que je dois toute ma reconnaissance :
à ma mère Salma,
mes sœurs Hawa, Radia, Ssaliha, Magbola, Aziza et ma petite sœur
Naïma,
mes frères Faraj et Ahmad.
A la mémoire de mon père Abdelrahim Al HUSSEIN MUSTFA
![Page 3: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/3.jpg)
2
Remerciements
Tout d’abord, toute ma reconnaissance va aux membres des équipes qui m’ont accueillie et
permis de réaliser cette thèse. Ainsi, je remercie :
À Tours
Le laboratoire de Parasitologie - Mycologie - Médecine tropicale
- Mon directeur de thèse, le professeur Dominique RICHARD-LENOBLE pour m’avoir
consacré du temps, pour ses précieux conseils et pour ses passionnantes anecdotes.
- Je remercie le docteur Thanh Haï DUONG ainsi que le professeur Jacques
CHANDENIER pour leurs conseils, leur soutien, leurs encouragements, leurs
corrections.
- Je remercie le docteur Nathalie VAN LANGENDONCK, pour la patience et la
disponibilité dont elle a su faire preuve pour m’initier à la PCR quantitative en temps
réel, ainsi que toute l’équipe du service de Parasitologie-Mycologie Médecine tropicale
du CHU de Bretonneau à Tours.
- Je tiens également à remercier, plus particulièrement, certaines personnes pour leurs
conseils et leurs qualités humaines, mesdames Jeannine BRISACIER et Dominique
VINCENT.
- Un grand merci à Monsieur Alain FERRER pour ses encouragements et ses conseils
scientifiques avisés.
L’équipe de l’animalerie. Merci à tous, notamment à Jérôme MONTHARU et Georges
ROSEAU.
Le service de Microscopie électronique du CHU Bretonneau. Je remercie le professeur Brigitte
ARBEILLE, Rustem UZBEKOV ainsi que tous les membres du service pour leur collaboration
et l’apprentissage de leur technique.
À Paris
Le Muséum National d’Histoire Naturelle
Je remercie en particulier Madame le professeur Irène LANDAU qui m’a co-dirigée sur une
grande partie de ce travail. Sa disponibilité, ses conseils, son encadrement, sa patience ont toute
ma reconnaissance. Jean-Marc CHAVETTE et Madame Françoise GONNET pour m’avoir aidé
![Page 4: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/4.jpg)
3
à la préparation de la collection de moustiques nécessaires à mes expériences. Enfin, Monsieur le
professeur Alain CHABAUD pour ses conseils.
Je souhaite ici remercier toutes les personnes qui m’ont aidé à réaliser des manips, à
résoudre des difficultés techniques, à me fournir des échantillons ou même pour les simples
discussions enrichissantes, aussi bien dans notre service à Tours qu’au muséum d’Histoire
Naturelle de Paris.
Merci également aux membres de jury et qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde
gratitude d’avoir accepté de juger mon travail.
De grands remerciements pour ma deuxième famille en France (créée au labo !) : Krystina
MENGUE ME NGOU (mon âme sœur), Christophe RANDIER, (mon grand frère) et Martine
BERTON (ma grande sœur) pour leur présence, leur soutien et leurs encouragements : ils étaient
autour de moi dans les moments difficiles ou heureux ; je n'oublierai pas les moments de joie que
nous avons partagé ensemble. Je n’oublie pas non plus Charles DOUCHET pour son soutien
moral et sa bonne humeur. De même, Madame Michèle BOIRON qui m’a aussi soutenue tout au
long de ses années.
Je remercie également mes amies SHATHA, SAHAR et MANEL et leurs maris
MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à
remercier toute la communauté libyenne de Tours à travers LAÏLA, NADIA, ZAHRA, HANAN,
AMEL, HADEL, Hassan ALSGIR, Hassan ALDROE et Saleh ALSALEH.
![Page 5: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/5.jpg)
4
Résumé
La chimie trouve encore sa place dans la prise en charge du paludisme entre la vaccination
très attendue et la moustiquaire imprégnée d’insecticides de plus en plus utilisée. Au cours de
son cycle, l’hématozoaire évolue en trois grandes périodes : l’impaludation correspondant au
développement intrahépatique des formes infectantes venues du moustique vecteur, la période de
la multiplication intra-érythrocytaire, la plus bruyante où l’action thérapeutique est primordiale,
enfin, la phase sexuée du parasite où les gamétocytes assurant la pérennité de l’espèce chez le
moustique vecteur. Le but de notre travail est d’étudier l’action de médicaments classiquement
efficaces sur les formes sanguines au niveau des formes intrahépatiques, assurant le
développement des formes asexuées et sexuées (gamétocytes). Ces dernières, en rapport avec la
transmission du paludisme. Il s’agit d’une étude expérimentale sur un modèle animal :
Plasmodium yoelii entretenu sur souris Swiss avec le vecteur Anopheles stephensi dont le cycle
parasitaire et le mode de transmission du parasite sont proches de ceux du paludisme humain.
Ont été testées : la Malarone®, la primaquine, la ferroquine et l’artésunate (dérivé de
l’artémisinine). L’activité sur le stade intrahépatique du parasite murin est étudiée par PCR
quantitative en temps réel. L’efficacité de la Malarone® sur le stade intra-hépatique est totale,
contrairement aux autres antipaludiques ayant une activité partielle. L’étude sur la
gamétocytogénèse et la transmission par la ferroquine et l’artésunate, prescrites à doses
infracuratives sur les formes asexuées, est mesurée quantitativement par la mesure de la
gamétocytémie et qualitativement en comptant la quantité d’oocystes (développés sur l’estomac
du moustique) témoins de l’activité des gamétocytes. Des lots de 30 moustiques se sont gorgés
avant traitement et 1h30 et 5 heures à la suite de la prise de thérapeutique. Quantitativement, on
note une augmentation des gamétocytes circulants quel que soit le médicament ou la dose (5 ou
10 mg/kg). Pour l’artésunate à 5 mg/kg, on a pu noter que la gamétocytémie était pratiquement
double de celle des témoins. Par contre, qualitativement, les premiers résultats (en microscopie
optique et électronique) montrent des altérations morphologiques des gamétocytes circulants
(amas de pigments, latéralisation des gamétocytes dans l’hématie) et une moindre infectivité des
gamétocytes pour les moustiques gorgés 1 et 5 heures après la prise de thérapeutique. Nous
avons statistiquement pu démontrer que l’infectivité des gamétocytes mesurée par la quantité
d’oocystes comptés sur l’estomac du moustique, était respectivement diminuée de 70 % pour la
ferroquine et de 85 % pour les souris traitées par l’artésunate. Des études complémentaires
chercheront à préciser les populations (âge) de gamétocytes atteintes par les thérapeutiques et
l’importance et la nature des altérations morphologiques des gamétocytes traités.
![Page 6: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/6.jpg)
5
Résumé en anglais
Chemistry still has a role in the management of malaria, alongside the mosquito netting
soaked in insecticide that is used increasingly, as we continue to await the long anticipated
vaccine. During its cycle, the hematozoon parasite develops through three major periods.
The first, malarial infection corresponds to the intrahepatic development of infective forms
from the mosquito vector; this period is not sensitive to treatment and is often asymptomatic.
The period of erythrocytic schizogony is the most urgent, and treatment activity is primordial.
Finally, the phase of sexual reproduction, when gametocytes develop within the erythrocytes
ensures the perpetuation of the species when these reach the blood-feeding vector mosquitoes.
The aim of our work was to study the effect on the forms intrahepatic and the forms sexual
gametocytes of drugs known to be effective on the asexual blood forms of the protozoan and
thus the potential repercussions on malaria transmission. This experimental study was conducted
with an animal model Plasmodium yoelii, maintained on Swiss mice, with the Anopheles
stephensi vector whose parasite cycle and modes of transmission are close to those of human
malaria. We tested: Malarone®, primaquine, ferroquine and artesunate (a derivative of
artemisinin). The activity on the stage of the parasite intrahepatic mouse was studied by
quantitative real-time PCR. The efficacy of Malarone ® on the intrahepatic stage was total,
contrary to the others antimalarials, who have a partial activity. The efficacy of ferroquine and
artesunate, prescribed at doses subcurative for the asexual forms, were tested against gametocyte
production, quantitatively by counting them in the blood and qualitatively by counting the
quantity of oocysts developed on the mosquito’s midgut, which are indicators of gametocyte
activity. Lots of 30 mosquitoes fed on each mouse before treatment and 5 hours after treatment.
Quantitatively, it had noted an increase circulating gametocytes, regardless of drug or dose (5 or
10 mg/kg). For artesunate at 5 mg/kg, we noted that the blood gametocyte level was almost
double that of the controls. On the other hand, qualitatively, the first results obtained with optical
and electronic microscopy showed morphologic alterations of the circulating gametocytes
(pigment clumping and lateralisation within red blood cells) and reduced infectivity of the
gametocytes for the mosquitoes that fed at 1 and 5 hours after treatment. We were able to
demonstrate statistically that the infectivity of gametocytes, measured by the quantity of oocysts
counted in the mosquito midgut, was reduced by 70% for those treated with ferroquine and by
85% for those from mice treated by artesunate.
Complementary studies will seek to specify the populations (age) of gametocytes damaged
by treatment and the importance and nature of their morphologic alterations.
![Page 7: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/7.jpg)
6
Table des matières Remerciements ............................................................................................................................................ 2
Résumé......................................................................................................................................................... 4
Résumé en anglais........................................................................................................................................ 5
Table des matières ....................................................................................................................................... 6
Liste des tableaux......................................................................................................................................... 8
Liste des figures............................................................................................................................................ 9
Liste des annexes........................................................................................................................................ 12
Liste des annexes........................................................................................................................................ 12
Liste des abréviations................................................................................................................................. 13
Introduction................................................................................................................................................ 14
Première partie : Généralités sur le paludisme......................................................................................... 16
I. Généralités .........................................................................................................................17
I. 1. Histoire du paludisme et de son traitement................................................................17
I. 2. Le parasite : historique et actualité ............................................................................18
I. 3. Évolution de la répartition du paludisme humain ......................................................20
I. 4. Les anophèles vecteurs du paludisme humain ...........................................................21
I. 5. Cycle évolutif du parasite et cibles thérapeutiques....................................................24
I. 5. 1. Cycle évolutif du parasite ..................................................................................24
I. 5. 2. Les cibles biologiques des antipaludiques .........................................................29
I. 6. Les gamétocytes.........................................................................................................31
I. 6. 1. Origine des gamétocytes ....................................................................................32
I. 6. 2. La morphologie des gamétocytes.......................................................................32
I. 6. 3. La gamétocytogénèse.........................................................................................34
I. 6. 4. La gamétogénèse................................................................................................38
I. 6. 5. L’infectivité des gamétocytes pour le moustique ..............................................39
II. La lutte contre le paludisme..............................................................................................43
II. 1. La lutte anti-vectorielle.............................................................................................43
II. 1. 1. Méthodes de lutte mécanique ...........................................................................44
II. 1. 2. Méthodes de lutte chimique..............................................................................44
II. 1. 3. Méthodes de lutte biologique ...........................................................................45
II. 2. Les antipaludiques ....................................................................................................45
II. 2. 1. Notion d’antipaludique.....................................................................................45
II. 2. 2. Histoire et actualité des antipaludiques ............................................................45
II. 2. 3. Classification des antipaludiques......................................................................46
![Page 8: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/8.jpg)
7
II. 2. 4. Structure chimique générale des antipaludiques ..............................................47
II. 2. 5. Le mode d’action des antipaludiques ...............................................................56
II. 2. 6. Chimiorésistance ..............................................................................................59
III. Présentation du travail de thèse.......................................................................................64
Deuxième partie : Matériel et Méthode ................................................................................................... 66
I. Matériel biologique............................................................................................................67
I. 1. Le parasite..................................................................................................................67
I. 2. L’hôte vertébré (intermédiaire)..................................................................................67
I. 3. L’hôte invertébré (le vecteur) ....................................................................................68
II. Thérapeutiques testées......................................................................................................68
III. Méthodes .........................................................................................................................69
III. 1. Méthodes portant sur le stade hépatique .................................................................69
III. 1. 1. Infestation et traitement des souris..................................................................72
III. 1. 2. PCR quantitative en temps réel .......................................................................75
III. 1. 3. Protocoles ........................................................................................................80
III. 2. Méthodes portant sur la gamétocytogénèse, les gamétocytes circulants et la
transmission du paludisme ................................................................................................83
III. 2. 1. Constitution des stocks de sang parasité et conservation................................83
III. 2. 2. Infestation des souris.......................................................................................83
III. 2. 3. Suivi des infections chez la souris...................................................................83
III. 2. 4. Etude quantitative des effets des traitements sur la gamétocytogénèse ..........84
III. 2. 5. Etude qualitative des effets des traitements sur : ............................................85
Troisième partie : Résultats....................................................................................................................... 90
Chapitre 1 - Le stade hépatique ................................................................................................................. 92
Chapitre 2 - Le stade sexué : la gamétocytogénèse et la transmission du paludisme............................ 100
AA// Etude quantitative des effets des traitements sur la gametocytogenese .............................100
BB// Etude qualitative des effets des traitements sur les gamétocytes .......................................115
I. La morphologie des gamétocytes circulants ....................................................................115
II. Le pourcentage des gamétocytes altérés.........................................................................117
III. Infectivité des gamétocytes chez le moustique .............................................................121
Discussion................................................................................................................................................. 128
Conclusions et perspectives ..................................................................................................................... 139
Bibliographie ............................................................................................................................................ 142
Annexes .................................................................................................................................................... 155
Résumé..................................................................................................................................................... 158
Résumé en anglais.................................................................................................................................... 158
![Page 9: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/9.jpg)
8
Liste des tableaux TABLEAU 1. CLASSIFICATION DE PLASMODIUM. ....................................................................................... 19
TABLEAU 2. CARACTERISTIQUES GENERALES DES 5 ESPECES DE PLASMODIUM PARASITES CHEZ
L’HOMME........................................................................................................................................... 19
TABLEAU 3. CLASSIFICATION DES DIFFERENTS TYPES DE RESISTANCE PARASITAIRE ET DES REPONSES
THERAPEUTIQUES EN ZONE DE FAIBLE TRANSMISSION ................................................................... 61
TABLEAU 4. DATES DE PREMIERE UTILISATION DES ANTIMALARIQUES ET D’APPARITION DE LA
RESISTANCE. ...................................................................................................................................... 63
TABLEAU 5. LES CARACTERISTIQUES BIOLOGIQUES CHEZ LA SOURIS INFESTEE AVEC P. YOELII EN
CONDITIONS DE LABORATOIRE (ADAPTE DE LANDAU ET GAUTRET, 1998)...................................... 70
TABLEAU 6. LES PROTOCOLES DU STADE HEPATIQUE EN DETAIL. ........................................................... 82
TABLEAU 7. ÉTUDE DE L’EFFET DE LA DOSE UNIQUE ET DE 2 DOSES SUBCURATIVES SUCCESSIVES DE
FERROQUINE SUR LA GAMETOCYTOGENESE .................................................................................. 103
TABLEAU 8. ÉTUDE DE L’EFFET DE DOSES SUBCURATIVES DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE SUR LA
GAMETOCYTOGENESE..................................................................................................................... 106
TABLEAU 9. EFFET DE L’ASSOCIATION FERROQUINE–ARTESUNATE SUR LA GAMETOCYTOGENESE...... 108
TABLEAU 10. EFFET DE 3 DOSAGES (5, 10, 50 MG/KG) D’ARTESUNATE SUR LA GAMETOCYTOGENESE 111
TABLEAU 11. ÉTUDE DE L’EFFET DE 2 DOSAGES DIFFERENTES D’ARTESUNATE ET DE FERROQUINE (5,
10MG/KG) SUR LA GAMETOCYTOGENESE ...................................................................................... 114
![Page 10: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/10.jpg)
9
Liste des figures FIGURE 1. REPARTITION MONDIALE DU PALUDISME (OMS).................................................................... 21
FIGURE 2. FEMELLE DU GENRE ANOPHELE SE GORGEANT........................................................................ 22
FIGURE 3. LE CYCLE DEVELOPPEMENT DU MOUSTIQUE. .......................................................................... 23
FIGURE 4. LE CYCLE PARASITAIRE DES PLASMODIES CHEZ L’HOTE (EXEMPLE DE L’HOMME). ................. 25
FIGURE 5. METABOLISME DU PARASITE DANS LE GLOBULE ROUGE PARASITE, « EX : P. FALCIPARUM ». 30
FIGURE 6. LES DIFFERENTS STADES DES GAMETOCYTES DE P. YOELII, QUANTITE ET QUALITE. .............. 33
FIGURE 7. FORMES CHIMIQUES DEVELOPPEES DES ANTIPALUDIQUES. ................................................... 54
FIGURE 8. MODE D’ACTION DES ANTIFOLIQUES ET ANTIFOLINIQUES (D’APRES CHARMOT, 1993) ........ 59
FIGURE 9. CINETIQUE DE LA PCR, COURBE EXPRIMANT L’INTENSITE DE LA FLUORESCENCE EMISE EN
FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES DE PCR EFFECTUES PAR LE THERMOCYCLEUR......................... 72
FIGURE 10. ETAPES DE LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL UTILISANT LE SYBR® GREEN. ................. 73
FIGURE 11. ANATOMIE SCHEMATIQUE D’UN MOUSTIQUE FEMELLE. ...................................................... 74
FIGURE 12. COURBE DE FUSION REPRESENTANT LA SPECIFICITE DU PRODUIT PCR AMPLIFIE ET DETECTE
PAR LE SYBR® GREEN I. ..................................................................................................................... 79
FIGURE 13. COURBE REPRESENTANT L’INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR ® GREEN I EN FONCTION
DU NOMBRE DE CYCLES DE PCR........................................................................................................ 79
FIGURE 14. DROITE DE REGRESSION (LINEAIRE) DE LA GAMME ETALON OBTENUE A PARTIR DES
RESULTATS APPORTES PAR LA FIGURE COURBE D’AMPLIFICATION D’UNE REACTION PCR (VALEUR
LOGARITHMIQUE).............................................................................................................................. 81
FIGURE 15. SCHEMA DE L’EXTRACTION DU TUBE DIGESTIF DU MOUSTIQUE........................................... 89
FIGURE 16. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES .... 93
FIGURE 17. STADES HEPATIQUES DETECTES PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL APRES
TRAITEMENT AVEC DIFFERENTS ANTIPALUDIQUES. ......................................................................... 93
FIGURE 18. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES .... 95
FIGURE 19. STADES HEPATIQUES DETECTES PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL APRES
TRAITEMENT AVEC DIFFERENTS ANTIPALUDIQUES. ......................................................................... 95
FIGURE 20. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES. ... 97
![Page 11: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/11.jpg)
10
FIGURE 21. STADES HEPATIQUES DETECTES PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL APRES
TRAITEMENT AVEC DIFFERENTS ANTIPALUDIQUES. ......................................................................... 97
FIGURE 22. INTENSITE DE FLUORESCENCE DU SYBR® GREEN EN FONCTION DU NOMBRE DE CYCLES .... 98
FIGURE 23. STADES HEPATIQUES DETECTES PAR PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL APRES
TRAITEMENT AVEC DIFFERENTS ANTIPALUDIQUES. ......................................................................... 98
FIGURE 24. EVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 101
FIGURE 25. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS ........ 102
FIGURE 26. ÉVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 105
FIGURE 27. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS ........ 105
FIGURE 28. EVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 107
FIGURE 29. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS ........ 108
FIGURE 30. EVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 110
FIGURE 31. EVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS. ....... 110
FIGURE 32. ÉVOLUTION DE LA PARASITEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS................ 112
FIGURE 33. ÉVOLUTION DE LA GAMETOCYTEMIE APRES TRAITEMENT EN FONCTION DU TEMPS. ....... 112
FIGURE 34. GAMETOCYTES ALTERES : FEMELLES (A), MALES (B) ............................................................ 116
FIGURE 35. GAMETOCYTES DE PLASMODIUM YOELII YOELII ALTERES DANS L'HEMATIE, 1H30 APRES
TRAITEMENT A LA FERROQUINE 5MG/KG ...................................................................................... 116
FIGURE 36. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES
D'ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS....................................................................................... 118
FIGURE 37. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES DE
FERROQUINE EN FONCTION DU TEMPS.......................................................................................... 118
FIGURE 38. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 2 DOSAGES DIFFERENTS
DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS...................................................... 120
FIGURE 39. ÉVOLUTION DU NOMBRE DE GAMETOCYTES APRES TRAITEMENT A 3 DOSAGES DIFFERENTS
DE FERROQUINE ET D’ARTESUNATE EN FONCTION DU TEMPS...................................................... 120
FIGURE 40. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE
(5MG/KG)......................................................................................................................................... 122
FIGURE 41. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE 123
![Page 12: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/12.jpg)
11
FIGURE 42. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE
(5MG/KG)......................................................................................................................................... 124
FIGURE 43. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A LA FERROQUINE
(10MG/KG)....................................................................................................................................... 125
FIGURE 44. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE
(10MG/KG)....................................................................................................................................... 125
FIGURE 45. NOMBRE MOYEN D’OOCYSTES PAR MOUSTIQUE APRES TRAITEMENT A L’ARTESUNATE, LA
FERROQUINE L’ASSOCIATION AXFQ 1 DOSE ET AXFQ 3 DOSES (5MG/KG POUR CHAQUE DOSE).. 127
![Page 13: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/13.jpg)
12
Liste des annexes ANNEXE 1 TECHNIQUE DE COLORATION DES LAMES.............................................................................. 156
![Page 14: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/14.jpg)
13
Liste des abréviations
Quantités :
mg : milligrammes
mL : millilitres
mm : millimolaires
µg : microgrammes
µl : microlitres
µM : micromolaires
nm : nanomètres
U : unités
Médicaments
AQ : amodiaquine
ATVQ : atovaquone
AX : artésunate
FQ : ferroquine
MAL : Malarone ®
PG : proguanil
PQ : primaquine
Autres
ADN : acid désoxyribonucléique
(abbreviation Anglophone: DNA)
ARN : acid ribonucléique
(abbreviation Anglophone: RNA)
CI : chlore
Ct : threshold cycle (“cycle seuil”)
dNTP : désosoxynucléotide tri-phosphate
G6PD : glucose-6-phosphate
déshydrogénase
IV : intra-veineuse (voie
d’administration)
K : potassium
Mg : magnésium
min : minutes
OMS : Organisation Mondiale de la
Santé
PCR : polymerase chain reaction
PPI : pour préparation injectable
qsq : quantité suffisante pour
QT-NASBA : real-time quantitative
nucleic acid sequence-based
amplification
Rnase : ribonucléase
rpm : rotation par minute
trs/min : tours par minute
UV : ultra-violets
VO : voie orale
VS. : versus
° C : degré Celsius
![Page 15: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/15.jpg)
Introduction
![Page 16: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/16.jpg)
15
Le paludisme grande endémie mondiale touche de 216 millions d'êtres humains dont 81% dans
la région Afrique de l’OMS, soit 174 millions de cas. Le nombre des décès dus au paludisme est
estimé à 655 000 pour l’année 2010, dont 91 % en Afrique. À l’échelle mondiale, 86 % des
décès imputables au paludisme ont frappé des enfants de moins de 5 ans. Le paludisme a été
classé dans les 3 maladies infectieuses causant mondialement le plus de morts avec le sida et la
tuberculose (WHO, 2011).
Cette parasitose est due à un hématozoaire du genre Plasmodium, transmis à l’homme par
la piqûre du moustique femelle du genre Anophèles. Cette érythrocytopathie est endémique dans
les régions chaudes et humides intertropicales.
Il existe 4 espèces de Plasmodium parasitant spécifiquement l’homme (P. falciparum, P.
vivax, P. malariae, P. ovale) et une nouvelle espèce P. knowlesi, peut naturellement passer du
singe à l’homme, le passage naturel de l’homme à l’homme n’est pas encore prouvé. Ce passage
du pathogène du singe à l’homme se fait par l’intermédiaire, soit d’Anopheles lateens qu’on
trouve dans les forêts et les exploitations fermières de Malaisie orientale et à Bornéo, soit
d’Anopheles cracens qui prédomine dans les forêts et vergers de Malaisie péninsulaire, de
Thaïlande et des Philippines.
On a découvert les plasmodies de rongeurs après la découverte de Plasmodium humain par
Laveran (1880). Les facilités d’élevages et manipulations des rongeurs, face aux difficultés liées
à l’essai chez l’homme, favorisent le développement des recherches expérimentales chez les
rongeurs. Les espèces plasmodiales les plus utilisées chez les rongeurs sont P. yoelii, P. berghei,
P. chabaudi et P. vinckei.
L’apparition de polychimiorésistances des souches éventuellement mortelles de
P. falciparum, entraîne une recherche permanente de nouvelles molécules, isolées ou mieux,
associées intervenant sur des cibles métaboliques différentes.
Les thérapeutiques actuellement disponibles sont destinées en priorité aux formes
sanguines pathogènes ; afin d’inhiber de façon complète la croissance parasitaire, d’autres
formes de parasites peuvent être ciblées, en particulier les formes hépatiques secondaires à
l’impaludation et les formes sexuées qui assure la transmission et la pérennité de l’espèce
plasmodiale.
Notre objectif a été d’étudier sur un modèle expérimental animal ayant un développement
cyclique proche du cycle chez l’homme, l’efficacité d’antipaludiques sur les formes asexuées
hépatiques et celles à potentiel sexué (gamétocytes) assurant la transmission.
![Page 17: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/17.jpg)
Première partie :
Généralités sur le paludisme
![Page 18: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/18.jpg)
17
II.. GGéénnéérraalliittééss
II.. 11.. HHiissttooiirree dduu ppaalluuddiissmmee eett ddee ssoonn ttrraaiitteemmeenntt
Le paludisme (de palus : marais) ou malaria (« mauvais air »), est défini d’abord
épidémiologiquement : les scientifiques comprennent qu’il se transmet dans les régions humides
et qu’il y a un rapport entre les marais et les syndromes fébriles (il était aussi connu sous le nom
de ( fièvre romaine des marais pontins » ou en France, « fièvre des marais poitevins »). Sur le
plan physiopathologique et épidémiologique, il s’agit d’une érythrocytopathie endémique due à
un hématozoaire du genre Plasmodium qui est transmise par la piqûre d’un moustique
hématophage femelle infesté appartenant au genre Anopheles et chez lequel le parasite assure sa
pérennité par un cycle ovogénique, cycle sexué faisant de l’anophèle l’hôte définitif du parasite.
Les premières traces d’atteinte palustre ont été relevées sur des momies égyptiennes datant
de plus de 5200 ans. Sur certaines d’entre elles, la présence d’ADN de Plasmodium a en effet été
détectée. Le premier qui a reconnu et décrit le parasite est un médecin français, Alphonse
Laveran, à Constantine en Algérie en 1880 ; il a reçu le Prix Nobel en 1907. Golgi en 1886 puis
Marchiafava et Celli en 1889, ont distingué 3 espèces parasites de l’homme : P. vivax, P.
falciparum et P. malariae et la 4e espèce, P. ovale, a été découverte par Stephens en 1922.
Une cinquième espèce paraît concerner l’homme, il s’agit de Plasmodium knowlesi, connu
chez les macaques à longue queue. En 1931, P. knowlesi a été reconnu comme agent d’une
infection mortelle chez ces macaques (Singh et al., 2004) en Malaisie et 34 ans plus tard, en
1965, on signale pour la première fois sa transmission naturelle chez l'homme en Malaisie (Chin
et al.,1965). Il est actuellement sensible à la chloroquine.
En 1897, la découverte du rôle d’un moustique de genre Anopheles comme agent de
transmission du paludisme est faite par Ronald Ross, médecin anglais vivant en Inde. Cette
découverte est confirmée par Battista Grassi en 1898.
La même année, trois médecins italiens : Amico Bignami, Giuseppe Bastianelli et Battista
Grassi décrivent le cycle complet du paludisme.
![Page 19: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/19.jpg)
18
II.. 22.. LLee ppaarraassiittee :: hhiissttoorriiqquuee eett aaccttuuaalliittéé
Classification du parasite (Tableau 1) :
Le genre Plasmodium est constitué de 9 sous-genres dont 3 sont capables de se développer
chez les mammifères, 4 chez les oiseaux et 2 chez les lézards. Ces 9 sous-genres comprennent
près de 200 espèces.
Les deux sous-genres qui se développent chez les primates dont l’homme sont :
� Le sous-genre Laverania qui comprend P. falciparum, Welch, 1897, qui n’a qu’une
génération de schizontes exo-érythrocytaires et dont les gamétocytes sont en forme de faux
(falciforme).
� Le sous-genre Plasmodium qui comprend :
o P. vivax, Grassi & Feletti, 1890 : responsable de la fièvre tierce souvent bénigne et
apparaissant très « vivace » dans l’hématie parasitée
o P. ovale, Stephens, 1922 : très proche du précédent et prenant sa place en Afrique
subsaharienne dans les groupes sanguins « Duffy négatif »
o P. malariae, Laveran, 1881: peu présent dans le monde, il est l’agent de la fièvre quarte
persistant longtemps dans le foie de l’homme parasité et parfois responsable d’atteintes
rénales sévères (néphrite quartane).
o P. knowlesi, Franchiti, 1927 : responsable du paludisme du singe macaque, il a été signalé
pour la première fois chez l’homme en 1932, et décrit comme une fièvre intermittente à
Bornéo. Il est proche génétiquement de Plasmodium vivax et microscopiquement de
Plasmodium falciparum puis malariae. Trois espèces sont exclusivement humaines : P.
falciparum, P. vivax et P. ovale. Les espèces P. malariae et P. knowlesi sont à la fois
humaines et simiennes (Tableau 2).
Ces plasmodies humaines sensibles depuis toujours aux dérivés de l'écorce de quinquina et
du Qinghaosu (Artemisia annua) sont apparues résistantes à ces molécules de synthèse très
utilisées dans le monde, en curatif comme en prophylactique. Ceci a nécessité la recherche et le
développement de nouvelles molécules ou d’associations de molécules actives, en particulier sur
l’espèce éventuellement mortelle : P. falciparum. Ces recherches ont porté sur les différentes
phases du métabolisme du cycle du paludisme.
![Page 20: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/20.jpg)
19
Règne Protiste
Sous –règne Protozoaire
Phylum sporozoaire ou Apicomplexa
Classe Sporozoea
Sous-classe Coccidies
Sous-ordre Haemospiridiidae
Ordre Coccidiida
Famille Plasmodiidae
Genre Plasmodium
Tableau 1. Classification de Plasmodium.
P. ovale P. vivax P. malariae P. falciparum P. knowlesi
Longévité 2 à 3 ans,
parfois 5 ans 2 à 3 ans
Peut
atteindre
20 ans
Généralement < 2
mois,
exceptionnellement
1 an
-
érythrocytes
infectés
Jeunes
hématies
Jeunes
hématies
Vieilles
hématies
Toutes
les hématies
Toutes les
hématies
Durée du
cycle 48 h 48 h 72 h 48 h 24
Tableau 2. Caractéristiques générales des 5 espèces de Plasmodium parasites chez l’homme.
![Page 21: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/21.jpg)
20
II.. 33.. ÉÉvvoolluuttiioonn ddee llaa rrééppaarrttiittiioonn dduu ppaalluuddiissmmee hhuummaaiinn
Cette endémie est largement distribuée à travers le monde (Figure 1). Elle est présente dans
les régions tropicales et sub-tropicales. La maladie est surtout présente dans les zones tropicales
chaudes et humides d’Afrique sub-saharienne, d’Asie, d’Amérique centrale et d’Amérique du
Sud. Dans les pays les plus pauvres, essentiellement en Afrique, elle est une cause importante de
mortalité infantile (Snow et al., 2001). Sur 300 à 500 millions d’accès cliniques par an, elle est
responsable de 1 à 3 millions de décès chaque année, dont près d’un million en Afrique
subsaharienne. Les enfants de moins de cinq ans et les femmes enceintes sont les cibles les plus
touchées.
La distribution mondiale est différente selon l’espèce plasmodiale en cause. P.
falciparum, le plus dangereux, est le plus présent. Cette espèce provoque à elle seule 120
millions de nouveaux cas. Les trois autres espèces de Plasmodium humains ont une distribution
plus restreinte.
P. ovale, espèce plus rare et qui ne tue pas, peut entraîner des rechutes 4 à 5 ans plus tard.
Il est présent en Afrique subsaharienne.
P. vivax, moins dépendant des écarts de température a une répartition plus étendue. On le
trouve dans le bassin méditerranéen, en Afrique du Nord, au Moyen Orient, en Turquie, à
Madagascar, sur l’île Maurice et aux Comores, dans toute la région tropicale d’Asie et dans les
régions de basse altitude de l’Amérique centrale et de l’Amérique du Sud ; il est absent en
Afrique de l’Ouest.
P. malariae n’est pas meurtrier mais peut entraîner des rechutes jusqu’à 20 ans après la
primo infection.
P. falciparum, le plus pathogène est le responsable majeur des cas mortels. Il est présent
dans les régions tropicales d’Afrique subsaharienne (où le taux de mortalité est le plus élevé et
où il représente plus de 90% des espèces identifiées chez les malades), d’Amérique Latine et
d’Asie.
Plasmodium knowlesi parasite étroitement lié à la répartition des singes macaques, est un
parasite décrit en Asie du Sud-Est, en particulier en Malaisie. Actuellement, plusieurs centaines
de cas ont été rapportés chez l'homme. Au microscope, P. knowlesi ressemble à P. malariae, ou à
P. falciparum en début de parasitémie. Comme P. malariae, il est sensible à la chloroquine.
![Page 22: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/22.jpg)
21
Figure 1. Répartition mondiale du paludisme (OMS)
II.. 44.. LLeess aannoopphhèèlleess vveecctteeuurrss dduu ppaalluuddiissmmee hhuummaaiinn
Il y a environ 430 espèces de moustiques Anopheles (Harbach, 2004) dont 70 sont capables
de transmettre le paludisme, et parmi celles-ci, seulement 40 sont des vecteurs d’importance
majeure (Service et Townson, 2002). Certains anophèles préfèrent piquer l’animal et ne
transmettent normalement pas de parasites à l’homme, ou alors très rarement. Les Anopheles font
partie de la sous-famille Anophelinae, de la famille Culicidae, du sous-ordre des Nématocères et
de l’ordre des diptères (Figure 2).
La transmission du paludisme humain en Afrique est effectuée essentiellement par A.
gambiae et A. funestus. Deux espèces, A. arabiensis et A. nili ont un rôle vecteur secondaire.
D'autres espèces d'anophèles ont été trouvées infectées, mais jouent un rôle négligeable par
rapport aux espèces précédentes. A. gambiae et A. arabiensis appartiennent au complexe A.
gambiae qui regroupe 7 espèces cryptiques reproductivement isolées. A. funestus est la seule
espèce du complexe A. funestus impliquée dans la transmission palustre humaine (Fontenille et
Lochouarn, 1999).
![Page 23: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/23.jpg)
22
Figure 2. Femelle du genre Anophèle se gorgeant.
(http://umvf.omsk-osma.ru/campus-parasitologie-mycologie/cycle2/poly/3003ico.html)
Chin et al., (1965) ont montré que P. knowlesi peut également être transmis du singe à l'homme.
Le moustique vecteur en cause est A. balabacencis (qui appartient au groupe A. leucosphyrus).
Dans le cycle biologique des moustiques (Figure 3), il y a quatre stades : l’œuf, la larve, la
pupe (nymphe) et l’adulte ; les trois premiers stades sont aquatiques et durent environ une
semaine ; les adultes mènent une vie aérienne ; ils se fécondent dans les deux jours suivant
l’émergence. Seules les femelles se nourrissent d'un repas sanguin dans lequel elles prélèvent les
protéines nécessaires au développement de leurs œufs ; les femelles seules sont responsables de
la transmission ; elles pondent les premiers œufs après un ou deux repas selon l’espèce, tandis
qu’elles pondent le lot suivant après un seul repas. La plupart des espèces d’anophèles piquent la
nuit. Certaines piquent juste après le coucher du soleil, d’autres piquent plus tard, aux environs
de minuit ou même aux petites heures matinales. Le mâle a des antennes garnies de longs poils
qui lui donnent une apparence touffue comme une moustache. Sur les antennes de la femelle, les
poils sont peu nombreux et courts (WHO, 2003).
![Page 24: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/24.jpg)
23
Figure 3. Le cycle développement du moustique.
(http://www.ars.corse.sante.fr/Dengue-et-Chikungunya.120081.0.html)
La capacité vectorielle est l’aptitude d’une espèce de moustique à transmettre l’infection et
à assurer le cycle de l’agent pathogène et est fonction de la longévité (MacDonald, 1957), de
l'anthropophilie et de la compétence vectorielle. Elle varie largement d’une espèce à l’autre et
dépend de plusieurs phénomènes successifs :
���� L’aptitude du vecteur à infecter
���� L’aptitude à assurer le développement parasitaire
���� L’aptitude à transmettre
Cette capacité vectorielle dépend également de facteurs (intrinsèques et extrinsèques)
susceptibles de conditionner chacun de ces trois phénomènes.
Les facteurs environnementaux favorisants
1. Le climat a des influences sur : la répartition et l’abondance des anophèles vecteurs, la
possibilité et le succès du développement sporogonique du parasite à l’intérieur du
vecteur, la modulation du contact homme-vecteur.
2. La température minimale pour le cycle sporogonique est 15°C pour P. vivax et P.
malariae, 20 à 25°C pour P. falciparum ; la température optimale est voisine de 27°C.
3. L’humidité, elle, favorise la longévité du vecteur. La diminution de l’humidité entraîne
une baisse de la longévité du vecteur, réduisant la transmission. Les pluies assurent une
![Page 25: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/25.jpg)
24
multiplication des vecteurs, en alimentant les gîtes larvaires, (l'humidité relative
conseillée est de 70 à 80% en insectarium).
4. L’altitude joue un rôle important dans l’extension du paludisme, en provoquant une
distribution locale du vecteur. Les Anophèles se trouvent rarement à des altitudes
supérieures à 2500 mètres (Service & Townson 2002) ; dès que l’altitude augmente, les
périodes de transmission deviennent plus courtes.
La résistance aux insecticides a été définie comme la présence, dans une population
d’insectes, de spécimens qui survivent à des doses qui, habituellement, tuent l’ensemble de cette
population (Mouchet et al, 2004).
La résistance des anophèles aux insecticides n’est pas un fait nouveau, la résistance aux
pyréthrinoïdes se développe parmi les vecteurs majeurs du paludisme, notamment par
l’intermédiaire de la mutation Kdr qui confère une résistance croisée à tous les pyréthrinoïdes, et
risque de compromettre l’efficacité des moustiquaires imprégnées.
Différents mécanismes de résistance sont possibles :
� une modification du comportement de l’insecte qui évite ainsi le contact avec l’insecticide,
� une modification de l’absorption ou de l’excrétion de l’insecticide,
� une modification des voies métaboliques permettant sa dégradation ou enfin une
modification de sa cible.
II.. 55.. CCyyccllee éévvoolluuttiiff dduu ppaarraassiittee eett cciibblleess tthhéérraappeeuuttiiqquueess
II.. 55.. 11.. CCyyccllee éévvoolluuttiiff dduu ppaarraassiittee
La morphologie du parasite change sans cesse dans son aspect, sa taille et son rapport extra ou
intracellulaire, au cours du cycle biologique (Figure 4). Néanmoins, les cycles biologiques des
différentes espèces sont proches, autorisant des études expérimentales cohérentes comparables
avec le développement parasitaire chez l’homme.
Les plasmodies sont des parasites principalement intracellulaires dont la multiplication
nécessite un hôte intermédiaire vertébré (homme) (impaludation et phase clinique) où se déroule
le cycle asexué ou schizogonie, et un hôte définitif invertébré (anophèle) chez qui se déroule la
multiplication sexuée ou sporogonie (la transmission).
![Page 26: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/26.jpg)
25
Figure 4. Le cycle parasitaire des plasmodies chez l’hôte (exemple de l’homme).
(http://dpd.cdc.gov/dpdx/html/Malaria.html : Malaria_LifeCycle(French_version))
II.. 55.. 11.. 11.. CCyyccllee hhuummaaiinn oouu sscchhiizzooggoonniiqquuee
Ce cycle se divise en cycle pré-érythrocytaire (hépatique ou asymptomatique) et cycle
érythrocytaire, ce dernier conduisant à la fièvre suite à l'éclatement des globules rouges et aux
toxines palustres.
II.. 55.. 11.. 11.. aa)) PPhhaassee dd’’iimmppaalluuddaattiioonn ((CCyyccllee eexxoo--éérryytthhrrooccyyttaaiirree oouu
PPhhaassee hhééppaattiiqquuee))
L’anophèle femelle infectée par des sporozoïtes dans ses glandes salivaires, en prenant le
sang nécessaire à sa ponte, bave chez l'hôte plusieurs centaines de sporozoïtes (forme parasitaire
libre extracellulaire possédant un complexe apical de pénétration), qui sont présents dans les
![Page 27: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/27.jpg)
26
glandes salivaires du moustique; ils pénètrent dans les capillaires sanguins, parfois dans les
tissus, circulent dans le sang pendant une trentaine de minutes, avant de pénétrer un hépatocyte.
Un grand nombre d’entre eux sont détruits par les phagocytes (macrophages) et par les
anticorps spécifiques chez les sujets immuns (Sidjanski et Vanderberg, 1997), essentiellement
dans la rate ; mais quelques-uns de ces sporozoïtes gagnent le foie en empruntant les sinusoïdes
et en traversant la barrière constituée par les cellules de Küpffer et les cellules endothéliales. Le
passage est assuré en moins de trente minutes. Grâce à une interaction de type ligand-récepteur,
ils pénètrent les hépatocytes. Le parasite peut, soit s’y cacher sous forme quiescente (cryptozoïte
ou hypnozoïte (Krotoski, 1989) responsable de rechutes tardives du paludisme, soit s’y
multiplier sous forme de mérozoïtes, entraînant un « corps bleu », image de l’hépatocyte
déformé par le parasite multiplié et qui en éclatant va libérer les éléments simples ou mérozoïtes.
Cette phase de multiplication intra-hépatique dure en moyenne entre 5 et 15 jours selon les
espèces.
L’éclatement de l’hépatocyte (corps bleus mûrs, cellules plasmodiales volumineuses (40-100
µm), contenant quelques milliers de noyaux (environ 30 000)), provoque la libération des
mérozoïtes qui ont alors trois destinées possibles :
o la mort in situ, prise en charge par le système réticulohistiocytaire hépatique,
o la pénétration d’un nouvel hépatocyte, débutant ainsi un cycle intra-hépatocytaire
secondaire, immédiat ou différé,
o la migration et la pénétration dans les hématies entraînant le paludisme maladie.
Cette phase hépatique du cycle plasmodial, asymptomatique, a été peu étudiée en termes
de thérapeutiques et demeure moins directement concernée par un traitement en urgence d’un
accès grave. Seules des molécules comme la primaquine, du groupe des amino-8-quinoléine,
sont connues pour avoir effet sur les formes intrahépatiques.
II.. 55.. 11.. 11.. bb)) PPhhaassee cclliinniiqquuee ((ccyyccllee éérryytthhrrooccyyttaaiirree))
Durant le stade intra-érythrocytaire apparaissent les signes cliniques. Après la pénétration
des mérozoïtes dans les hématies par endocytose (la membrane de l’hématie s’invagine), ceux-ci
se déplacent par mouvements amiboïdes vers le centre du globule rouge et forment une vacuole
nutritive remplie d’hémoglobine ; ils prennent alors une forme en anneau et se transforment en
trophozoïtes (2 à 3 µm) situé dans une vacuole parasitophore faite du matériel de la cellule hôte,
qui repoussent le cytoplasme érythrocytaire en périphérie (en entourant la vacuole nutritive).
![Page 28: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/28.jpg)
27
Ces trophozoïtes sont le siège d’une activité métabolique intense qui comprend la digestion de
l’hémoglobine et la polymérisation de l’hème en hémozoïne (ou pigment malarique), autant de
points métaboliques cibles des thérapeutiques.
Le trophozoïte grossit et son noyau se divise (3 à 5 fois) pour donner un schizonte, qui, une
fois mûr éclate à son tour en libérant, selon l’espèce, un nombre variable de mérozoïtes qui
envahissent de nouvelles hématies vierges colonisées à leur tour, tandis que de nouvelles
schizogonies endo-érythrocytaires se produisent (en 48 ou 72 heures selon les espèces décrites
chez l’homme).
L'éclatement des globules hébergeant des schizontes mûrs s'accompagne de la libération de
toxines (d'hémozoïne et de débris membranaires érythrocytaires) dans le sang, entraînant les
accès fébriles.
Le cycle, continu pendant la durée de l’infection, aboutit à l’augmentation progressive de
la densité parasitaire, jusqu’à ce que l’hôte développe une réponse immunitaire (générale ou plus
spécifiquement splénique) efficace ou que la thérapeutique agisse sur la multiplication du
parasite.
L’importance de la parasitémie est en rapport avec les signes cliniques dont le principal est
l’accès fébrile, pouvant s’accompagner d’une anémie, d’une hépatomégalie, d’une
splénomégalie ou de troubles neurologiques graves dans le cas de P. falciparum.
Après plusieurs cycles schizogoniques sanguins asexués, certains mérozoïtes et
trophozoïtes acquièrent un potentiel sexuel ; ne se divisant pas, ils se différencient en cellules à
potentiel sexué : les gamétocytes, mâles ou femelles, uninucléées, assureront la pérennité de
l’espèce par la poursuite du cycle chez le moustique.
Cette phase d’urgence clinique est la cible prioritaire des thérapeutiques curatives et
prophylactiques évaluées jusqu’à présent.
II.. 55.. 11.. 22.. CCyyccllee sseexxuuéé oouu ssppoorrooggoonniiqquuee cchheezz ll’’AAnnoopphhèèllee :: pphhaassee ddee
ttrraannssmmiissssiioonn
On peut schématiser la transmission en deux étapes :
II.. 55.. 11.. 22.. aa)) TTrraannssmmiissssiioonn dduu mmoouussttiiqquuee àà ll’’hhôôttee
Les gamétocytes ne vont continuer leur développement que s’ils sont absorbés par
l’anophèle femelle lors de son repas sanguin sur son hôte impaludé ; c’est donc en changeant
![Page 29: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/29.jpg)
28
d’hôte à partir de ce stade bloqué que le Plasmodium peut continuer son cycle. Il faut que le
nombre de gamétocytes ingéré soit suffisant pour que la fécondation chez le moustique puisse
avoir lieu. On admet qu’une densité gamétocytaire d’au moins vingt gamétocytes par millimètre
cube soit nécessaire pour que le vecteur puisse s’infecter (Coz et Picq, 1972). Seuls les
gamétocytes poursuivent leur développement alors que les autres stades du parasite, ingérés de la
même façon, sont digérés par le moustique.
II.. 55.. 11.. 22.. bb)) TTrraannssmmiissssiioonn ddee ll’’hhôôttee aauu mmoouussttiiqquuee
Les gamétocytes à potentiel mâle pompés par le moustique, s’exflagellent, donnant dans
l’estomac du vecteur de nombreux gamètes ou microgamètes (8 gamètes mâles haploïdes
flagellés de « 20 µm »). Les gamétocytes à potentiel femelle donnent un gamète femelle unique
(macrogamète), après expulsion des corpuscules chromatiniens.
Les microgamètes filamenteux peuvent fusionner avec un gamète femelle haploïde.
La fécondation (gamogonie) aboutit à la formation d’un zygote diploïde qui subit deux
méioses, en moyenne 5 heures après sa formation. Il se transforme alors en oocinète diploïde non
mobile (zygote et oocinète sont les deux seules formes diploïdes du parasite).
Après quelques heures de repas sanguin par méiose réductionnelle rapide, l’oocinète se
transforme en ookinète, œuf mobile qui possède un complexe apical de pénétration lui
permettant de traverser activement la paroi de l’appareil digestif pour se fixer au niveau du
feuillet externe où il s’enkyste sur sa partie externe en formant un oocyste d’où sortiront des
centaines de sporozoïtes infectants (les cellules parasitaires vont se multiplier par divisions
cellulaires pour libérer, en quelques jours et après éclatement de l’oocyste, un millier de
sporozoïtes ou cellules filles, mobiles).
Enfin, les sporozoïtes gagnent, en quelques jours, les glandes salivaires du moustique hôte
définitif pour s’y accumuler.
Au cours d’un repas sanguin ultérieur, quelques dizaines de sporozoïtes sont bavés et
pénètrent un nouvel individu. Une femelle anophèle possédant des sporozoïtes dans ses glandes
salivaires reste infestante toute sa vie.
Cette phase assure la pérennité du parasite ; peu de thérapeutiques curatives cliniquement
sont actives.
Dans cette étude, nous avons essayé d’évaluer l’action de thérapeutiques, isolées ou
associées, sur la gamétocytogénèse et sur l’infectivité des parasites pour les moustiques, et
d’aborder le rôle éventuel des chimiothérapies sur la transmission du paludisme.
![Page 30: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/30.jpg)
29
II.. 55.. 22.. LLeess cciibblleess bbiioollooggiiqquueess ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess
Dans cette partie, nous allons nous concentrer plus spécifiquement sur les cibles des
antipaludiques relatifs au stade érythorocytaire du parasite. Face à la résistance qui apparaît de
plus en plus rapidement lors de la commercialisation de nouveaux antipaludiques, il est
nécessaire, de comprendre le mode d'action cellulaire des antipaludiques. Le Plasmodium
dispose pour son développement intra-érythrocytaire d’un métabolisme et de moyens de défenses
spécifiques qui constituent autant de cibles plasmodiales (Figure 5).
II.. 55.. 22.. 11.. MMééttaabboolliissmmee vvaaccuuoollaaiirree
La vacuole nutritive du plasmodium dispose d’un pH acide et d’enzymes telles que des
hydrolases, des protéinases et des phosphatases acides. Elle est le siège de la digestion de
l’hémoglobine en vue d’obtenir les acides aminés indispensables à sa survie. Cette étape libère la
globine (partie protéique qui est hydrolysée en acides aminés) et l’hème toxique (union d’un
atome ferreux et d’un noyau tétrapyrrolique, la protoporphyrine). La cristallisation de l’hème est
un mécanisme pour détoxifier l’hème. Un complexe, l’hémozoïne ou pigment malarique
insoluble, est formé pour détourner le stress oxydatif. Nombre d’antipaludiques actuellement sur
le marché utilisent la vacuole nutritive comme cible privilégiée, en empêchant l’hydrolyse de la
globine ou la formation de l’hémozoïne (les quinolines, dont les « 4-aminoquinolines »), ou
encore en favorisant la production de radicaux libres dans la vacuole, comme l’artémisinine et
ses composés dérivés.
II.. 55.. 22.. 22.. MMééttaabboolliissmmee ccyyttooppllaassmmiiqquuee
Le cytoplasme comporte le cytosol et deux organites essentiels, les mitochondries et
l’apicoplaste. Ils sont nécessaires à la biosynthèse des acides nucléiques.
II.. 55.. 22.. 22.. aa)) LL’’aappiiccooppllaassttee :: llee mmééttaabboolliissmmee ddeess aacciiddeess nnuuccllééiiqquueess
La synthèse d’ADN se produit tout au long du cycle, dans l’hôte et le parasite. Mais les
deux sont incapables de synthétiser le noyau purique. Le parasite récupère les purines de l’hôte
pour la synthèse de ses acides nucléiques. La synthèse d’ADN et d’ARN est régie par plusieurs
enzymes, comme l’ADN polymérase, le Ribonucléotide réductase (RNRase), les
Topoisomérases I & II et l’ARN polymérase.
![Page 31: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/31.jpg)
30
Figure 5. Métabolisme du parasite dans le globule rouge parasité, « ex : P. falciparum ».
Facteurs intervenant dans le métabolisme du parasite dans le globule rouge, adapté de Biagini et al., Trends Parasitol 2003, 19: 479-487.
La majorité de ces enzymes sont des cibles antipaludiques, les fluoroquinolones, antibiotiques
qui peuvent inhiber les Topoisomérases (Touze et al., 2002).
II.. 55.. 22.. 22.. bb)) LLee ccyyttoossooll :: llee mmééttaabboolliissmmee ddeess ffoollaatteess
La métabolisation des folates est à la base de la synthèse des nucléotides, la biosynthèse
des pyrimidines et des acides aminés. Plusieurs enzymes de cette voie métabolique sont des
cibles antipaludiques. Ils se répartissent en deux groupes :
![Page 32: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/32.jpg)
31
� les antifoliques inhibent la dihydroptéroate synthase (DHPS) qui produit l’acide folique,
comme les sulfamides dont le sulfone.
� les antifoliniques inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR) qui produit l’acide
folinique comme la pyriméthamine et le proguanil (Winkler, et al., 1994).
II.. 55.. 22.. 22.. cc)) LLaa mmiittoocchhoonnddrriiee
Le parasite réalise le métabolisme mitochondrial pour avoir de l’énergie, grâce aux deux
enzymes : le cytochrome c réductase et la déhydroorotate déshydrogénase. Cette dernière, est
l’enzyme clé dans la biosynthèse des nucléotides. De telles modifications sont obtenues en
traitant par les amino-8-quinoléines (Primaquine) et les naphtoquinones (Rosenthal, 2003 et
Touze et al., 2002).
II.. 55.. 22.. 33.. MMééttaabboolliissmmee mmeemmbbrraannaaiirree
La membrane plasmique constitue de phospholipides, de canaux calciques et
parasitophores. Elle est le siège du trafic nutritionnel. Ce mécanisme d’efflux actif des
médicaments et de régulation du pH vacuolaire au cours du cycle érythrocytaire peut être ciblé
en bloquant les canaux calciques par des inhibiteurs spécifiques (Vérapamil) ou en modulant
l’efflux vacuolaire par les antidépresseurs tricycliques (desipramine, amitriptyline), les
phénothiazines (chlorpromazine) et des antihistaminiques de classe I (Touze et al., 2002). Cette
nouvelle voie métabolique fonctionne d’autant plus que les parasites sont fortement diffusés à
l'intérieur des cellules sanguines humaines. Les scientifiques doivent encore étudier si le parasite
utilise cette même voie au cours des autres étapes de son cycle de vie.
II.. 66.. LLeess ggaammééttooccyytteess
Les gamétocytes sont des cellules spécialisées assurant la transition entre l’hôte et le
moustique. Ils remplissent deux fonctions cellulaires très différentes, qui sont toutes deux
essentielles à la survie du parasite : ces fonctions fournissent un mécanisme efficace de
transmission de l'hôte vertébré au moustique vecteur et d’autre part, ils sont responsables des
événements du cycle de vie sexuelle qui ne sera achevé que dans le repas sanguin du moustique
(Sinden et al., 1996) C’est l’élément charnière permettant la poursuite du cycle chez le vecteur.
![Page 33: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/33.jpg)
32
II.. 66.. 11.. OOrriiggiinnee ddeess ggaammééttooccyytteess
Lors d’infections naturelles, la majorité des gamétocytes proviennent de mérozoïtes
d’origine sanguine apparus au cours de la multiplication des stades asexués (schizogonie
érythrocytaire). On n’observe pas, chez les plasmodies humaines, de production de gamétocytes
directement à partir des mérozoites hépatiques (Sinden, 1998), contrairement à d’autres espèces
(P. yoelii) où les gamétocytes proviennent de mérozoïtes hépatiques (Garnham, 1966). Lors de
l’infection par P. falciparum, l’observation de gamétocytes circulant ne se ferait que 7 à 15 jours
après l’identification de stades asexués intracellulaires (Eichner et al., 2001).
II.. 66.. 22.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess
Les gamétocytes de P. falciparum (falciformes) sont allongés, avec des extrémités
arrondies, légèrement incurvés, avec une face concave et une face convexe (formes en banane,
en croissant), contrairement aux gamétocytes des autres espèces humaines (P. malariae, P. ovale
et P. vivax), qui ont une forme arrondie.
En 1956, Field et Shute sont les premiers à décrire les stades de maturation des
gamétocytes chez P. falciparum. Les gamétocytes ne se développent que dans les organes profonds
(rate et moelle osseuse) : ils n’apparaissent dans le sang périphérique que sous leur forme
mature. Le stade mature V de P. falciparum est le seul à être présent dans le sang périphérique ;
donc le seul infectant pour le moustique (Trager et al., 1999). Pour les autres espèces humaines,
la gamétocytogénèse s’effectue également dans le sang périphérique où on peut donc rencontrer
des gamétocytes jeunes.
Aspects particuliers à Plasmodium yoelii
L’analyse morphologique des gamétocytes mâles de P. yoelii a permis de différencier
quatre types morphologiques : O, I, II et III, qui se succèdent chronologiquement (Figure 6) (les
transformations des gamétocytes femelles sont parallèles) (Landau et al., 1979).
Les jeunes gamétocytes immatures ne remplissent pas les hématies hôtes, leur
cytoplasme est bleu pâle, le pigment est fin. Leur noyau est rose clair et est formé de granules
chromatiniens. Ils sont surtout présents dans les hématies mûres.
![Page 34: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/34.jpg)
33
Figure 6. Les différents stades des gamétocytes de P. yoelii, quantité et qualité.
(d’après Landau et al., 1979)
Planche I : Microgamétocytes de P. yoelii classés par ordre chronologique.
1-2 : Jeunes gamétocytes immatures ; 3-4 : Gamétocytes O sains ; 5 : Gamétocyte O altéré ;
6-7-8 : Gamétocytes I ; 9-10 : Gamétocytes II (10 est légèrement altéré) ; 11-12-13-14-15 :
Gamétocytes III (14 et 15 ont un noyau fragmenté) ; 16 : Gamétocyte III altéré.
![Page 35: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/35.jpg)
34
Les gamétocytes de type O remplissent les globules rouges qui sont hypertrophiés. Le
noyau est d’un rose plus clair, presque incolore, il contient parfois quelques masses
chromatiniennes très denses. Le cytoplasme est lui d’un rose plus soutenu et comporte un
pigment fin.
Les gamétocytes de type I ont un noyau granuleux, il est de taille assez importante
(environ trois quarts du volume du parasite) ; rose, sa couleur est assez proche de celle du
cytoplasme. Ce dernier forme une bande périphérique plus ou moins régulière avec des pigments
chevauchant parfois le noyau.
Les gamétocytes de type II sont plus petits que les autres. Le noyau occupe environ la
moitié du volume du parasite, il est homogène, plus dense et plus coloré que le cytoplasme. Le
cytoplasme est gris clair, bleuté ou rose. Le pigment est abondant et se limite au cytoplasme.
Les gamétocytes de type III sont petits, plus denses et plus chromophiles. Leur noyau est
plus condensé, leur teinte plus foncée. Ils n’occupent plus que le tiers du parasite, ont souvent
une forme triangulaire et peuvent être morcelés en deux ou trois masses irrégulières.
Certains gamétocytes peuvent être dégénérés, ils apparaissent lors d’infections à taux
élevé, remplaçant ainsi les gamétocytes sains. Ils présentent un certain nombre d’altérations
morphologiques, dont le pigment en mottes. (Landau et al., 1979).
Gautret et al., 1996 ont observé que le microgamétocyte, stade 0 de la maturation des P.
vinckei petteri et P. yoelii yoelii, apparaît 27 heures après l’invasion des mérozoïtes.
Il faut 3 heures pour qu’un gamétocyte de type O passe au stade I pour P. vinckei petteri et
6 heures pour celui de P. yoelii yoelii ; 6 heures pour passer du type I au stade II pour P. vinckei
petteri et 3 heures pour P. yoelii yoelii ; 3 heures pour le type II pour devenir de type III chez les
deux espèces.
II.. 66.. 33.. LLaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee
Les gamétocytes sont des cellules à potentiel sexué spécialisées, assurant la pérennité de
l’espèce plasmodiale et la transition entre l’hôte et le moustique.
Ils remplissent deux fonctions cellulaires très différentes, qui sont toutes deux essentielles à la
survie du parasite :
• un mécanisme efficace de transmission de l'hôte vertébré au moustique vecteur d’une
part,
![Page 36: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/36.jpg)
35
• d’autre, ils sont responsables des événements du cycle de vie sexuelle, cycle qui ne sera
achevé que dans le repas sanguin du moustique (Sinden et al., 1996). C’est l’élément
charnière permettant la poursuite du cycle chez le vecteur.
Les facteurs qui provoquent la gamétocytogénèse :
II.. 66.. 33.. 11.. LLeess ffaacctteeuurrss ddee ll’’hhôôttee
II.. 66.. 33.. 11.. aa)) LL’’aannéémmiiee
L’anémie faite de stress s’accompagne souvent de poussées gamétocytaires. Schneweis et
al., en 1991, ont émis l’hypothèse qu’un produit de l’hémolyse soit responsable de la production
de gamétocytes infectants. Ils ont montré que la dilution avec érythrocytes lysés provoquait la
gamétocytogénèse (Schneweis et al., 1991 ; Nacher et al., 2002).
II.. 66.. 33.. 11.. bb)) LL’’iimmmmuunniittéé ddee ll’’hhôôttee vveerrttéébbrréé
Le stress immunitaire agit sur la gamétocytogénèse par son effet sur les lymphocytes (Smalley et
Brown, 1981). Les études sur l’immunité de l’hôte vertébré ont trouvé deux directions
inverses par rapport au nombre de gamétocytes produits :
A) in vivo:
� Production moindre de gamétocytes, chez les individus possédant une immunité
élevée dirigée contre le stade asexué, que chez ceux non immuns (Molineaux et
Gramiccia, 1980 ; Piper et al., 1999)
� Augmentation du taux de conversion de stade asexué en gamétocytes de P.
falciparum chez l’homme (Brockelman, 1982 ; Ono et al., 1986 ) : ainsi, la
diminution de la charge parasitaire par l’effet de l’immunité (environnement
défavorable), a favorisé la production de gamétocytes. Même phénomène chez les
rongeurs avec P.yoelii (Motard et al., 1995) et P.chabudi (Bucling et Read, 2001),
dans des souris immunisées.
B) in vitro : une stimulation de la gamétocytogénèse a également été trouvée en utilisant des
lymphocytes et du sérum de P. falciparum d’enfants infectés. (Smalley et Brown, 1981).
![Page 37: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/37.jpg)
36
II.. 66.. 33.. 11.. cc)) LLeess hhoorrmmoonneess ddee ll’’hhôôttee
L’insuline, la progestérone, le 17 β-œstradiol, la testostérone (Lingnau et al., 1993) et les
corticostéroïdes (Maswoswe et al., 1985) augmentent la production des gamétocytes de P.
falciparum.
II.. 66.. 33.. 11.. dd)) LL’’ââggee eett ll’’eennvviirroonnnneemmeenntt iinnttrraacceelllluullaaiirree ddeess
éérryytthhrrooccyytteess
L’âge des érythrocytes et l’état de leur environnement intracellulaire sont des paramètres
qui pourraient avoir un rôle dans la gamétocytogénèse (Trager et Gill, 1992). Les érythrocytes
jeunes (réticulocytes) sont les cibles préférées d’invasion par le gamétocyte : le nombre de
gamétocytes dans un sang riche en réticulocytes, est dix fois plus important que celui contenu
dans un sang ordinaire. (Trager et Gill 1992 ; Trager et al., 1999 ; Trager, 2005). Les
érythrocytes jeunes contiennent une teneur élevée en ARN et elles sont encore capables de
synthétiser l'hémoglobine (Bosch et al., 1993). Smally et Brown (1981) ont montré que le sérum
et les lymphocytes prélevés chez des enfants gambiens provoquaient in vitro une
gamétocytogenèse plus importante que les mêmes éléments provenant de sujets européens
immunologiquement neufs. Une chute rapide du taux de gamétocytes a été constatée à la suite de
la dilution des cultures de P. falciparum par l‘adjonction d'érythrocytes frais en vue d'abaisser la
parasitémie (Carter et Miller 1979).
D’autre part, Gautret et al., (1997) ont indiqué que le rôle de l’âge de la cellule hôte sur le
développement des Plasmodium de rongeurs apparaissait complexe. Ils ont trouvé que
l’augmentation des réticulocytes provoquée par l’injection de phénylhydrazine entraînait une
augmentation de la production des gamétocytes chez P. chabaudi et P. berghei, mais que la
gamétocytogénèse chez P. yoelii yoelii et P. vinckei petteri n’était pas modifiée, sachant que les
deux espèces, P. yoelii et P. berghei, ont une préférence pour les réticulocytes, et que P.
chabaudi et P. vinckei ont une affinité identique pour les hématies (jeunes et mûres).
II.. 66.. 33.. 22.. LLeess ffaacctteeuurrss ppaarraassiittaaiirreess
II.. 66.. 33.. 22.. aa)) LLaa ffoorrttee cchhaarrggee ppaarraassiittaaiirree aasseexxuuééee
La charge parasitaire augmente logarithmiquement dix fois plus à chaque cycle (Simpson
et al., 2002). On suppose que la gamétocytogénèse serait liée à une certaine souffrance du
parasite soumis à des conditions défavorables (Carter et Miller, 1979) ; l’augmentation de la
![Page 38: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/38.jpg)
37
parasitémie engendre une production élevée de gamétocytes (Alano et Carter, 1990). Dyer et
Day (2000) ont supposé qu'il y avait une relation inverse établie entre le nombre de parasites
asexués et la quantité de conversions en gamétocytes.
II.. 66.. 33.. 22.. bb)) LLeess ssoouucchheess
Certaines souches sont plus gamétocytogènes que d’autres (Graves et al., 1984). Certaines
études ont trouvé que la gamétocytogénèse des souches chloroquino-résistantes est augmentée
par rapport aux souches sensibles, que ce soit avec des Plasmodium de rongeurs ((Ramkaran et
Peters, 1965 ; lchimori et al., 1990) ou avec P. falciparum (Robert et al, 1996). Par contre, Hogh
et al., 1995 n’ont trouvé aucune différence d’augmentation entre les deux souches résistantes ou
sensibles.
La souche P. berghei (NK 65) ne produit plus de gamétocytes après plusieurs passages
chez un même hôte, mais elle pourrait redevenir gamétocytogène en changeant d'hôte (Birago et
al., 1982).
Il existe une variation entre les différents clones de la même souche de parasite ; Bhasin et
Trager (1984) ont isolé trois clones de la souche du Honduras (I/CDC) de P. falciparum, dont
deux (HB-1 et HB-3) étaient gamétocytogène, tandis que la troisième (HB-2) n’a pas produit de
gamétocytes.
II.. 66.. 33.. 22.. cc)) CCoo--iinnffeeccttiioonnss eett ccoonnttrrôôllee ddee llaa ccrrooiissssaannccee ddee
ll’’aauuttooccrriinnee
Les interactions, entre plusieurs génotypes qui existent chez le même hôte, sont moins
connues mais elles ont des conséquences importantes pour l’épidémiologie et l’évolution du
parasite. Taylor et al. (1997) ont trouvé que les interactions entre génotypes mixtes de P.
chabaudi, entraînaient une stimulation pour produire des gamétocytes. Il existe des dynamiques
interactives entre deux populations du parasite, qui peuvent être soit directes, par interaction
parasite-parasite autocrine, soit indirectes, par la compétition immunitaire (Dyer et Day, 2000).
II.. 66.. 33.. 33.. EEffffeett dduu ttrraaiitteemmeenntt cchhiimmiiqquuee ccllaassssiiqquuee ssuurr llaa
ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee eett//oouu lleess ggaammééttooccyytteess
� A la dose subcurative, les parasites souffrent sans être tués et ont tendance à favoriser la
gamétocytogénèse c’est le cas de la chloroquine avec P. chabaudi (Buckling et al., 1999).
![Page 39: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/39.jpg)
38
Buckling et al. (1997) ont montré que la gamétocytogénèse de P. chabaudi était deux fois
et demi celle de témoins, après traitement à la chloroquine. Par contre, Gautret et al.,
(2000) ont observé une diminution de gamétocytes de P. v. petteri trois jours après avoir
traité avec une dose subcurative de chloroquine ; les mêmes résultats ont été observés sur
le nombre de gamétocytes de P. falciparum en traitant à l’artésunate (Pukrittayakamee et
al., 2004).
� Certains antipaludiques à action lente (qui agissent avec retard) peuvent augmenter la
souffrance des parasites (sans les tuer) qui orientent alors leur développement vers la
gamétocytogénèse. Citons notamment le proguanil, la pyriméthamine et l’association
sulfadoxine+pyriméthamine (Sokhna et al., 2001).
� Certains antipaludiques ont des effets directs sur la gamétocytogénèse. Ils peuvent donc
influer indirectement sur la transmission par le biais d'une forte réduction ou d’une forte
de la densité gamétocytaire, comme les amino-4-quinoléine (la chloroquine est létale
pour les stades jeunes des gamétocytes), les dérivés de l’artémisinine, la quinine et
l’association sulfadoxine+pyriméthamine sont fortement gamétocytocides (Barber et al.,
1929 ; Buckling et al., 1999 ; Targett et al., 2001).
� Le retard au traitement est une cause d’augmentation du temps de souffrance du parasite
asexué (Sokhna et al., 2001).
II.. 66.. 44.. LLaa ggaammééttooggéénnèèssee
La gamétogenèse du Plasmodium se réalise dans l’estomac du moustique qui est donc l’hôte
définitif du Plasmodium. C’est la formation des gamètes quelques minutes après l’ingestion des
gamétocytes par le moustique, en conséquence d’une activation que les gamétocytes mâles et
femelles réalisent. Ils s’échappent de la membrane plasmique et de l’hématie hôte pour être
libres dans le bol alimentaire du moustique. Ces transformations sont différentes dans les
gamétocytes mâles et femelles. L’exflagellation chez les gamétocytes mâles se fait par
multiplication cellulaire et aboutit à la formation de 8 microgamètes flagellés, alors que les
gamétocytes femelles réalisent une activation sans multiplication cellulaire et produisent à la fin
un macrogamète. (Sinden, 1998).
![Page 40: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/40.jpg)
39
Les facteurs impliqués dans l’induction de la gamétogénèse :
1) Le changement de température : la chute de température entre l’homme (37°C) et le
moustique (inférieure de 5°C à celle de l'hôte vertébré) (Arnot et Gull ; 1998).
2) L’exposition à des molécules du moustique tel le GAF (gamétocyte activating factor) ou
l’acide xanthurénique (Billker et al., 1997).
3) La variation de pH : l’élévation de pH de l’estomac de moustique entre 8 et 8.3 a lieu suite à
une élévation de la pression en CO2 et du niveau de bicarbonates (Billker et al., 1998 ;
Bhattacharyya et al., 2001).
II.. 66.. 55.. LL’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess ppoouurr llee mmoouussttiiqquuee
L’infectivité peut être définie comme la capacité pour les gamétocytes mâles et femelles de
générer un œuf mobile, l’ookinète, puis un œuf fixe d’où naîtront les sporozoïtes, formes
infectantes pour l’homme, se trouvent dans les glandes salivaires du moustique. Elle dépend de
nombreux facteurs inhérents soit au parasite, soit à l’hôte, et qui interagissent entre eux (Lensen,
1996).
II.. 66.. 55.. 11.. FFaacctteeuurrss iinnfflluuaanntt ssuurr ll’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess mmoouussttiiqquueess lliiééss aauu
ppaarraassiittee
Un certain nombre de facteurs « parasite » ont été identifiés pour expliquer l’infectivité:
L’âge des gamétocytes : il influence le succès de l’infectivité pour le moustique, les jeunes
gamétocytes de stade V étant peu ou pas infectants chez P. falciparum ; Landau et al. en 1979
ont fait l’analyse morphologique des gamétocytes de P.yoelii yoelii et ont permis de différencier
quatre types morphologiques (O, I, II III) qui se succèdent chronologiquement. A l’intérieur de
chaque type, il y a des gamétocytes sains et d’autres altérés. Seules les formes jeunes (O et I)
sont infectantes pour le moustique, ceci est confirmé par le fait qu’aucune infection n’est obtenue
chez l’anophèle lorsque ces formes sont absentes du sang ingéré. L’apparition des formes
altérées coïncide avec la diminution de l’infectivité des gamétocytes. L’immaturité des
gamétocytes prélevés par le moustique peut être une des causes de leur « non infectivité » ; une
période de maturation des gamétocytes d’environ 1 ou 2 jours dans le sang périphérique, serait
nécessaire avant que ceux-ci ne deviennent infectants pour le moustique (Jeffery et Eyles, 1955).
Hawking et al., 1968 ont montré que les gamétocytes de P. knowlesi, P. cathemerium et P.
cynomologi, espèces à multiplication synchrone, n’étaient matures et infectants que la nuit
![Page 41: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/41.jpg)
40
pendant quelques heures (5 à 12 heures), heures qui coïncidaient avec la période où le vecteur
piquait le plus.
La densité gamétocytaire : elle a également une influence sur l’infectivité des gamétocytes pour
le moustique. Lumsden et Bertram (1940) ont noté que le maximum d’infectivité des
gamétocytes de P. gallinaceum chez le moustique Aêdes aegypti ne coïncide pas toujours avec le
maximum de production des gamétocytes : cette observation a été confirmée par Cantrell et
Jordan (1946). Cependant, il n’existe qu’une faible corrélation linéaire positive entre densité et
infectivité. Il existe une valeur minimum de la gamétocytémie pour laquelle il n’y a pas
d’infestation du moustique (Dearsly et al., 1990). Mais la gamétocytémie ne peut pas, à elle
seule, présager de la mesure de l’infectivité pour le moustique (Carter et Graves, 1988).
La disponibilité des gamétocytes : Landau et al., 1979 suggèrent que les gamétocytes infectants
de P. yoelii sont situés préférentiellement dans les capillaires. L’agrégation des gamétocytes
pourrait favoriser l’infection chez le moustique, même si le repas sanguin a été réduit (Pichon et
al ; 2000).
La forte parasitémie asexuée : elle réduit parfois l’infectivité des gamétocytes. Le mécanisme est
inconnu. L’existence d’une corrélation positive entre une forte densité de formes asexuées et un
faible pouvoir infectant est généralement admise (Rutledge et al., 1969). Les résultats de Landau
et al 1979 suggèrent fortement que la période de haute parasitémie asexuée est associée à une
période d’infectivité réduite des gamétocytes pour les moustiques. Il pourrait s’agir du rôle
inhibiteur sur l’infectivité de certaines cytokines, comme le tumor necrosis factor (TNF)
abondamment secrété lors des poussées parasitaires asexuées (Lensen et al., 1997 ; Naotunne et
al., 1993) et l’apoptose de la cellules d’ ookinète est responsable de la réduction de plus de 50%
de stades intra-stomacaux de P. berghei avant l’invasion de l’estomac de A. stephensi .( Al-
olayan et al., 2002).
Le sex- ratio des gamétocytes : certaines études indiquent qu’il n’aurait pas d’influence sur
l’infectivité des gamétocytes pour le moustique (Boudin et al., 1989 ; Noden et al., 1994 ; Read
et al., 1992) ; à l’opposé, d’autres études confirment le rôle du sex-ratio sur l’infectivité : il faut
en général de 3 à 6 fois plus de femelles que de mâles. (Paul et al., 2002 ; Robert et al., 1996).
Le sexe-ratio habituel présente une prédominance de femelles, un fait qui compense
biologiquement la production de 8 microgamètes à partir d'un gamétocyte mâle. Une condition
optimale d'infectivité serait celle d'un gamétocyte mâle pour deux à huit femelles. Les études ont
identifié deux facteurs influençant le sexe-ratio :
![Page 42: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/42.jpg)
41
� L’hormone de l’érythropoïétine synthétisée en réponse à une anémie, qui entraîne une
augmentation du nombre d’érythrocytes dans le sang, et une augmentation de la proportion
de gamétocytes mâles.
� Le pic gamétocytaire : une forte proportion de gamétocytes femelles apparaît, au moment du
pic gamétocytaire et deux semaines après ce pic (Robert et Boudin, 2003).
Les co- infections : Taylor et al 1997, indiquent que les taux de transmission des infections de
clones mixtes ont été 7 fois supérieurs à ceux de l’infection d’un seul clone.
II.. 66.. 55.. 22.. FFaacctteeuurrss iinnfflluuaanntt ssuurr ll’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess mmoouussttiiqquueess ll iiééss àà ll’’hhôôttee
ddééffiinniittiiff
II.. 66.. 55.. 22.. aa)) LL’’iimmmmuunniittéé bbllooqquuaanntt llaa ttrraannssmmiissssiioonn ((TTBBII)) nnaattuurreellllee
L’état immunitaire modifie l’infectivité des gamétocytes pour le moustique (McCarthy et
al., 1978). Le moustique absorbe, avec les gamétocytes, des facteurs sériques ou des cellules
sanguines qui ont un rôle sur l’infectivité des gamétocytes pour le moustique :
Facteur globulaire : il existe un facteur d’origine érythrocytaire indispensable pour transformer
l’ookinète de P. gallinaceum en oocyste dans l’estomac de l’anophèle ; le nombre d’oocystes
varie proportionnellement avec l’augmentation des hématocrites (jusqu’à 50% d’hématocrites)
du sang ingéré par le moustique (Rosenberg et al., 1984).
Facteurs sériques :
� Immunité non médiée par les anticorps
L’infectivité des gamétocytes est élevée au début de l’infection, mais elle diminue
rapidement lorsque le nombre d’hématies infectées augmente dans le sang (Cantrell et Jordan,
1946 ; Rutledege et al., 1969), surtout au moment de la crise (Landau et al., 1979 ; Naotunne et
al., 1991) ; cependant, les gamétocytes sont produits normalement. Les gamétocytes non
infectants redeviennent infectants lorsqu’ils sont transférés dans un sérum sain ou dans le sang
neuf d’une souris (P. cynomolgi ; P. yoelii nigeriensis) en moins de deux heures (Landau et al.,
1979, Naotunne et al., 1990). Des études ont observé que le sérum récolté après la crise,
diminuait l’infectivité des gamétocytes in vivo (Petit et al., 1982) et in vitro (Bastien et al.,
1987). Dearsly et al., 1990 ont montré que l’injection des souris fortement parasitées avec P.
berghei « clone 233L » (clone donnant uniquement des stades asexués), avait diminué
l’infectivité des gamétocytes. Cela signifie que l’immunité anti-stade sexué n’est pas le seul
![Page 43: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/43.jpg)
42
mécanisme qui bloque la transmission naturelle et que la présence de facteurs sériques bloque
l’infectivité in vivo liée aux stades asexués.
Les facteurs inflammatoires (comme l’oxyde nitrique) et des cytokines qui pourraient
jouer un rôle sur l'infectivité des gamétocytes (en ayant une action toxique sur les stades sexués
du parasite) ont été dépendants de la présence des globules blancs (Naotunne, et al., 1993) ;
l’action toxique du Tumor Necrosis Factor (TNFα) et de l’interféron gamma (INFγ) provoque
une baisse de l’infectivité des gamétocytes chez le singe infecté par P. cynomolgi ; après addition
d’anticorps anti-TNF et anti-INFγ au sérum de crise, les gamétocytes ont rétabli leur infectivité.
� Immunité médiée par les anticorps anti-gamètes
Les antigènes induisent la formation d’anticorps bloquant la transmission. Cela a été
démontré in vivo par vaccination des gamètes de P. berghei et P.yoelii nigeriensis chez le
rongeur, P.knowlesi chez le singe et P. gallinaceum chez le poulet (Gwadz et Green, 1978 ;
Carter et al., 1979 ; Mendis et Targett, 1979) ; in vitro, par l’utilisation d’anticorps monoclonaux
anti-gamètes de P.falciparum , P. vivax et P. gallinaceum (Kaushal et al., 1983 ; Rener et al.,
1980 ; Mendis et al., 1987). Voller et Bray en 1962 furent les premiers à démontrer l’existence
d’anti-gamétocytes contre P. falciparum. On peut classer les antigènes en deux groupes :
� Antigènes qui sont exprimés à la surface des gamètes mais aussi du gamétocyte
intracellulaire (ceux du gamétocyte sont internes au parasite entourant par la
membrane d’hématies, ils apparaissent en surface du gamète après la gamétogenèse)
et antigènes induisant la formation d’anticorps bloquant la fécondation.
� Antigènes qui sont synthétisés et exprimés après l’ingestion des gamétocytes par le
moustique : les anticorps dirigés contre ces antigènes, interrompent le développement
du parasite chez le moustique après la fécondation (Carter et al., 1979 ; Kaushal et al.,
1983 ; Grotendorst et al., 1984 ; Robert et Boudin, 2003).
Plusieurs anticorps dirigés contre des antigènes des gamétocytes de P. falciparum ont été
identifiés comme étant la cible d’anticorps bloquant la transmission :
� une protéine de 230 kDa (Pfs 230).
� une protéine de 25 kDa (Pfs 25) : exprimée à la surface du zygote, elle ne semble pas
exister chez le gamétocyte.
� deux protéines de 48 kDa et 45kDa sont exprimées à la surface des gamètes, composant
le complexe Pfs48/45 (Quakyi et al., 1987 ; Rener et al., 1980 ; Vermeulen et al., 1985).
� une protéine de plus de 2 megaDaltons (Feng et al., 1993).
![Page 44: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/44.jpg)
43
Les autres espèces de Plasmodium (P. gallinaceum, P. yoelii et P. berghei) présentent des
antigènes de surface analogue (Carter et al., 1988 ; Harte et al., 1985 ; Winger et al., 1988).
Une bonne corrélation entre les taux d’anticorps anti-Pfs230 et la diminution de
l’infectivité des gamétocytes avait été mise en évidence, mais aucune corrélation n’avait été
indiquée avec les anticorps anti-Pfs48/45(Graves et al., 1988). Plus tard, Graves et al., (1992)
ont démontré une relation entre la présence d’anticorps du Pfs48/45 et l’absence d’infectivité des
gamétocytes.
II.. 66.. 55.. 22.. bb)) LLeess lleeuuccooccyytteess eett llaa pphhaaggooccyyttoossee
La phagocytose est responsable de 84% des pertes parasitaires in vitro, alors qu’elle
n’atteint que 7% in vivo (Sinden et Smalley, 1976, Lensen, et al., 1998) ; en interprétant la courte
de demi -vie des gamètes dans l’estomac du moustique (quelques minutes), ce stade parasitaire
ne peut probablement pas être la cible d'une phagocytose dans l'estomac du moustique.
II.. 66.. 55.. 22.. cc)) LLaa cceelllluullee TT
Le transfert passif immunitaire de cellules T d’une souris immunisée à une souris non
immune, réduit la transmission (95%) ; l'effet est dû à une réduction significative du nombre de
gamétocytes de rongeur P. yoelii nigeriensis circulants lors de l'infection (Haret et al., 1985).
IIII.. LLaa lluuttttee ccoonnttrree llee ppaalluuddiissmmee
IIII.. 11.. LLaa lluuttttee aannttii--vveeccttoorriieellllee
Les recherches sur la mise au point d’un vaccin débuteront en 1969 à partir de sporozoïtes
irradiés de P. berghei (Nussenzweig et al., 1969). Un vaccin paraît être de plus en plus
souhaitable devant l’accroissement de la chloroquinorésistance et la mauvaise réponse des
insecticides. Les sujets vaccinés seraient partiellement protégés et empêcheraient la transmission.
La recherche concernant les vaccins vise la mise au point de 3 types de vaccins :
� Les vaccins anti-sporozoïtaire ou pré-érythrocytaire ;
� Les vaccins dirigés contre les stades érythrocytaires asexués ;
![Page 45: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/45.jpg)
44
� Les vaccins bloquant la transmission. Mais jusqu’à présent aucun vaccin efficace n’a
encore été trouvé.
Les moyens existants contre la morbidité et, la mortalité, restent du domaine des
médicaments naturel ou de synthèse unique ou associés et l’arrêt de la transmission peut-être
enrayé par la lutte anti-vectorielle, et la transmission. Cette première ligne de défense contre le
paludisme, revêt un caractère essentiellement préventif en limitant le contact entre l’homme et le
moustique par des méthodes mécaniques, chimiques, biologiques et génétiques, mais peut aussi
comprendre la lutte contre le vecteur lui-même.
IIII.. 11.. 11.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee mmééccaanniiqquuee
Elles consistent en l'aménagement du territoire afin d'éliminer les gîtes larvaires,
l’assèchement et le remblaiement des marais, le drainage des eaux utilisé en irrigation,
l’aménage de barrages et leurs fonctionnement et la suppression des plantes aquatiques ;
entraînant ainsi une baisse des sources de vecteurs. L'amélioration de l'habitat peut entraîner les
moustiques endophiles à devenir plus exophiles, ce qui peut diminuer leur espérance de vie.
Les moustiquaires imprégnées d'insecticides s'utilisaient comme lutte anti-vectorielle
contre le paludisme. En effet, les forces armées soviétiques, allemandes et américaines, au cours
de la deuxième guerre mondiale, ont utilisé des moustiquaires et vêtements imprégnés
d'insecticide dans le dessein de se protéger contre le paludisme. Au début des années 80, l'OMS a
commencé par s'intéresser aux moustiquaires.
IIII.. 11.. 22.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee cchhiimmiiqquuee
Elles utilisent des produits insecticides ou répulsifs (insectifuges, ce sont des substances
appliquées sur la peau exposée ou sur les vêtements pour repousser le vecteur). Les répulsif
actifs, employés couramment, sont le DEET, l’éthylhexanediol, le méthyl- phtalate et le
diméthyl-phtalate. Il existe cinq familles d'insecticides ayant chacune un mode d'action
particulier. Ce sont les organochlorés (D.D.T), les organophosphorés (Malathion, Témophos), les
carbanates (Propoxur), les pyréthrinoïdes « Perméthrine » (on place ces pyréthrinoïdes à
l’intérieur des habitations, à la surface des eaux stagnantes, afin de supprimer les gîtes larvaires,
toxine du Bacillus thuringiensiset BT14 ; et surtout l’emploi de moustiquaires) et les inhibiteurs
de croissance des insectes (Encore à l'état expérimental). On observe des phénomènes de
résistances croisées qui s'expriment au niveau enzymatique (D.D.T) ou physiologique
![Page 46: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/46.jpg)
45
(pyréthrinoïdes). La résistance des moustiques aux insecticides se développe ce qui oblige à
trouver d’autres approches, notamment la lutte biologique.
IIII.. 11.. 33.. MMéétthhooddeess ddee lluuttttee bbiioollooggiiqquuee
Elle repose sur l’utilisation de parasites comme les Mermithidae (des nématodes) et les
Coelomonryces (champignons de l’ordre des Blastocladiales), de bactéries entomopathogènes,
dont Bacillus thuringiensiset et B. shareicus, de prédateurs des anophèles (les larves des
Culicidae, mollusques, poissons larvivores), destinés à attaquer les différents stades du
moustique: malheureusement, ce moyen de lutte est une bonne solution pour la sauvegarde de
l'environnement mais il présente une rémanence faible pour un coût élevé (Mouchet et al., 2004).
La solution restante est la chimie. Cette dernière permet de lutter contre le parasite à
différents niveaux, chez l’homme et chez le moustique. On utilise des thérapeutiques
prophylactiques ou curatives, aussi bien au plan individuel que collectif.
IIII.. 22.. LLeess aannttiippaalluuddiiqquueess
IIII.. 22.. 11.. NNoottiioonn dd’’aannttiippaalluuddiiqquuee
C’est l’ensemble des produits chimiques (naturels ou synthétiques) administrés à l’homme
pour lutter contre le plasmodium, soit pour le tuer (plasmocides) soit pour inhiber son
développement plasmostatique.
IIII.. 22.. 22.. HHiissttooiirree eett aaccttuuaalliittéé ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess
L’histoire des antipaludiques a commencé depuis le 16e siècle, en 1630 avec la découverte des
écorces de quinquina qui ont été apportées du Pérou en Europe par Don Francisco Lopez. En
France, Pelletier et Caventou ont isolé l’élément actif (alcaloïde) dans les racines de quinquina :
c’était le début de la première chimiothérapie. Neuf ans avant la deuxième guerre mondiale, en
1930, fut découvert le premier antipaludique de synthèse. En 1971, des chimistes chinois ont
isolé des feuilles de la plante Qinghao (Artémisia annua), l’artémisinine qui est un sesquiterpène
lactone contenant un groupe endopéroxide, qui semble être responsable de l’activité
![Page 47: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/47.jpg)
46
antipaludique de la plante. Cette plante est utilisée depuis des millénaires dans la médecine
chinoise pour traiter les fièvres (Klayman, 1985).
Les antipaludiques sont des médicaments qui ont un champ d’action bien défini contre
différentes espèces de parasites de l’homme et de l’animal, et un degré variable d’activité contre
les différentes formes que prennent les hématozoaires au cours de leur cycle évolutif. Chez l’hôte
vertébré et chez le vecteur invertébré, les seuls antipaludiques naturels sont la quinine et
l’artémisinine. On peut classer les antipaludiques selon deux modalités : la classification
chimique et la classification selon le site d’action.
IIII.. 22.. 33.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess
IIII.. 22.. 33.. 11.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn cchhiimmiiqquuee
Cette classification tient compte de la structure chimique de la molécule, ce qui donne 11
groupes :
1- Alcaloïdes du quinquina (Quinine)
2- Amino-4-quinoléines (Chloroquine, Amodiaquine)
3- Amino-8-quinoléines (Primaquine)
4- Amino-9 acridines (Mépacrine)
5- Amino-alcools (Méfloquine, Halofantrine et Luméfantrine)
6- Dérivés de l’artémisinine (Artéméther, Artésunate, Artééther et Dihydroartémisinine)
7- Antifoliniques (Proguanil, Pyriméthamine et Triméthoprime)
8- Antifoliques (Sulfaoxine, Sulfaténe et Dapsone)
9- Hydroxynaphtoquinone (Atovaquone)
10- Antibiotiques
11- Les associations
IIII.. 22.. 33.. 22.. CCllaassssiiffiiccaattiioonn sseelloonn llee ssiittee dd’’aaccttiioonn
On peut classer les antipaludiques selon leur site d’action sur le parasite en 3 classes :
I. Schizonticides, actifs sur le cycle endo-érythrocytaire asexué. La plupart des
antipaludiques sont des schizontocides ; ils sont eux-mêmes classés dans deux groupes
selon leur mode d’action :
![Page 48: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/48.jpg)
47
1) Schizonticides tissulaires : qui ont une action lente et agissent sur les formes exo-
érythrocytaires (les schizontes exo-érythrocytaires) dans les hépatocytes chez
l’homme ; le proguanil, la primaquine, en sont des exemples.
2) Schizonticides sanguins : qui agissent sur les schizontes érythrocytaires. Ce sont
la chloroquine, la quinine, l’artésunate, la méfloquine, la sulfadoxine-
pyriméthamine, l’halofantrine et les antibiotiques.
II. Gamétocytocides : qui agissent en inhibant la transformation des gamétocytes « mâles et
femelles » du sang humain en gamètes chez le moustique ; ils entravent ainsi le cycle
sporogonique et interrompent la transmission de l’espèce plasmodiale. Les gamétotocides
sont tous des amino-8-quinoléines, qui sont tous toxiques.
III. Sporontocides : inhibent le développement des oocystes et des sporozoïtes chez les
anophèles (WHO, 1984).
IIII.. 22.. 44.. SSttrruuccttuurree cchhiimmiiqquuee ggéénnéérraallee ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess
En général, le noyau benzénique se retrouve dans la structure moléculaire de tous les
antipaludiques classiques (Figure 7).
IIII.. 22.. 44.. 11.. AAllccaallooïïddeess dduu qquuiinnqquuiinnaa ((llaa qquuiinniinnee eett sseess ddéérriivvééss))
La quinine
La quinine est en le principal composé et elle est le plus ancien des ces amino-alcools. Elle
contient un noyau quinoléine lié par un alcool secondaire à un noyau quinuclidine avec un
groupe méthoxyle en position 6 et un groupe vinyle lié au cycle quinuclidine.
Formule brute : C20H24N2O2
Nom chimique : Vinyl-1 quinuclidyl-2méthoxy-6quinoly-4carbinol
Chaque substitution sur la structure chimique de la quinine modifie les actions pharmacologiques
du composé (WHO, 1984). Woodward et Doering réalisèrent la synthèse totale de la quinine en
1945 (Hostettmann, 1997).
![Page 49: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/49.jpg)
48
IIII.. 22.. 44.. 22.. AAmmiinnoo--44--qquuiinnoollééiinneess
Ce sont les premiers antipaludiques de synthèse isolés entre 1938 et 1941. En général, ils
ont un noyau quinoléique, une chaîne latérale aminée en position 4 et un radical chloré en
position 7.
La chloroquine (Nivaquine®)
Formule brute : C18H26ClN3
Nom chimique : chloro-7 (diethylamino-4 ‘méthul-1’butylamino)-4 quinoléine.
L’amodiaquine (Flavoquine®)
Formule brute : C20H22ClN3O
Nom chimique : chloro-7 (diethylamino-3 hydroxy-4anilino)-4 quinoléine.
La Ferroquine
Les phénomènes de résistance chez le parasite se développant de plus en plus rapidement.
Il devient donc urgent de développer de nouvelles molécules antipaludiques pour lesquelles les
probabilités d’appariation de résistance sont minimes. La ferroquine est née de l’incorporation
d’un groupement ferrocénique au sein de la molécule de chloroquine (Biot, et al., 1997).
Formule brute : C23H24ClFeN3
IIII.. 22.. 44.. 33.. AAmmiinnoo--88--qquuiinnoollééiinneess
Synthétisés par Schulemann et ses collaborateurs vers les années 1920 en Allemagne ; la
primaquine est le chef de ce groupe qui contient aussi la pamaquine (première 8 aminoquinoléine
synthétisée en Allemagne), la rhodoquine, la pentaquine, l’isopentaquine et la quinocide.
La primaquine :
Formule brute : C15H21N3 .O2
Nom chimique : (amino-4 méthyl-1 butylamino)-8 méthoxy-6 quinoléine
La pamaquine :
Formule brute : C19H29N3O
Nom chimique : 1-N, 1-N-diéthyl-4-N-(6-méthoxyquinolin-8-yl) pentane-1,4-diamine
![Page 50: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/50.jpg)
49
IIII.. 22.. 44.. 44.. AAmmiinnoo--99 aaccrriiddiinneess
En 1932, Kikuth et ses collaborateurs ont introduit une chaîne basique
dialcoylaminoalcoyle dans le noyau acridine. Ceci a conduit à la découverte de la mépacrine (ils
ont remplacé le noyau quinoléine de la pamaquine par l’acridine).
La mépacrine
Formule brute : C19H29N3O
Nom chimique : (diéthylamino-4méthyl-1 butylamino)-8 méthoxy-6 quinoléine
La pyronaridine (aussi appelé : Malaridine®)
Formule brute : C29H32ClN5O2
Nom chimique : 4-[(7-Chloro-2-methoxybenzo[b]-1,5-naphthyridin-10-yl) amino]-2,6-bis (1-
pyrrolidinylmethyl) phenol
IIII.. 22.. 44.. 55.. AAmmiinnoo--aallccoooollss
La méfloquine (Lariam®) et l'halofantrine (Halfan®) sont des amino-alcools de synthèse
apparentés à la quinine, introduits récemment en thérapeutique (méfloquine et halofantrine) et en
chimioprophylaxie (méfloquine) par voie orale du paludisme (Le Bras et al., 1991).
La méfloquine (Lariam®)
Formule brute C17H16F6N2O
Nom chimique: (R*, S*)-2, 8-bis (trifluoromethyl) quinolin-4-yl]-(2-piperidyl) methanol
L’halofantrine (Halfan®)
Formule brute : C26H30Cl2F3NO
Nom chimique : 3-dibutylamino-1-[1,3-dichloro-6-(trifluoromethyl) phenanthren-9-yl]-propan-
1-ol
La luméfantrine (Benflumétol : est en association de la Cortem ®et Riamet®)
Formule brute : C30H32Cl3NO
Nom chimique : (Z) - 2,7-Dichloro-9- [méthylène (4-chlorophenyl)] - alpha [(dibutylamino)
méthyle] - 9H-fluorene-4-methanol
![Page 51: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/51.jpg)
50
IIII.. 22.. 44.. 66.. DDéérriivvééss ddee ll’’aarrttéémmiissiinniinnee
L’artémisinine est un sesquiterpène lactone dérivé de la plante Qinghao. Comme ses
dérivés, elle est hydrolysée en dihydroartémisinine. La structure de l’artémisinine est une lactone
sesquiterpènique avec deux atomes d'oxygène liés par un pont péroxyde au-dessus d'un cycle à
sept atomes de carbone.
Formule brute : C15H22O5
L’artéméther : (Paluther®) est un dérivé semi-synthétique de l'artémisinine
Formule brute : C16H26O5
Nom chimique : 3 6 9-triméhyl, 10-méthoxy, 3 12-époxydécahydro, 12-pyrano 1 2-benzodioxépine
L’artééther Formule brute : C17H28O5
Nom chimique : (3R,5aS,6R,8aS,9R,10S,12R,12aR)-10-éthoxydécahydro- 3,6,9-triméthyl-3,12-
époxy-12H-pyrano[4,3-j]-1,2-benzodioxépine
L’artésunate (Arsumax®) : C’est un dérivé hémisuccinate hydrosoluble de l’artémisinine.
Formule brute : C19H28O8
Nom chimique : dihydro artémisinine 10ά hémisuccinate
La dihydroartémisinine (Artenimol)
Formule brute : C15H24O5
Nom chimique : 3, 12-epoxy-12H-pyrano (4, 3-J)-1, 2-benzodioxepin-10-ol, décahydro-3, 6, 9-triméthyl-(3R- (3-α, 5a-β, 6-β, 8a-β, 9-α, 10-α, 12-β, 12aR*))
IIII.. 22.. 44.. 77.. AAnnttiiffoolliinniiqquueess
Ce sont des inhibiteurs de la réductase de l’acide dihydrofolate. Les antifoliniques et (les
antifoliques) sont connus depuis les années 1950.
Le Proguanil (Paludrine®) : il a un noyau benzénique et une chaîne est fixée à l’une de ses
extrémités à un noyau chlorophényl et à l’autre à un simple groupe alcoyle (isopropyle).
Formule brute : C11H16ClN5
Nom chimique : (p-chlorophényl)-1- isopropyl-5-biguanide
![Page 52: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/52.jpg)
51
La pyriméthamine (Malocide®) : c’est le plus efficace des inhibiteurs de la dihydrofolate
réductase synthétisée en 1951.
Formule brute : C12H13ClN4
Nom chimique : 5-(4-chlorophényl)-6–éthyl–2,4–pyrimidinediamine
IIII.. 22.. 44.. 88.. AAnnttiiffoolliiqquueess :: lleess ssuullffaammiiddeess ((ssuullffaaddooxxiinnee eett ssuullffaammeetthhooxxaazzoollee))
eett lleess ssuullffoonneess ((DDaappssoonnee))
Ils ne sont pas indiqués en monothérapie à cause de leur action lente et de la
chimiorésistance face à certaines souches de P. falciparum, mais en association avec la
pyriméthamine.
La sulfadoxine
Formule brute : C12H14N4O4S
Nom chimique : (amino-4 benzène sulfonyl)-6 diméthoxy-4,5 pyrimidine
La dapsone
Formule brute : C12H12N2O2S
Nom chimique : diamino-4,4’ diphènylsulfone
IIII.. 22.. 44.. 99.. HHyyddrrooxxyynnaapphhttooqquuiinnoonnee
L’atovaquone : hydroxynaphtoquinone inhibitrice des fonctions mitochondriales de
Plasmodium utilisée en association avec la Proguanil (Malarone®).
Formule brute : C22H19ClO3
Nom chimique : 2-[trans-4-(4-chlorophényl) cyclohéxyl]-3-hydroxynaphtalène-1,4-dione
IIII.. 22.. 44.. 1100.. AAnnttiibbiioottiiqquueess
Il existe plusieurs antibiotiques qui montrent une activité antipaludique. L’usage des
antibiotiques a pour intérêt d’éviter les rechutes en achevant l’élimination des parasites.
1-Les cyclines
o Les tétracyclines : sont utilisées en traitement curatif, en association, par exemple
avec la quinine (Karbwang et al., 1994) ; la tétracycline est un antibiotique produit
par une bactérie du genre Streptomyces.
![Page 53: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/53.jpg)
52
Formule brute C22H24N2O8
Nom chimique : 4-diméthylamino-1,4,4a,5,5a ,6,11,12a-octahydro-3,6,10,12,12a-
pentatydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacenecarboxamide.
o La doxycycline (Vibramycine®) inhibe la synthèse protéique mitochondriale
(Wiesner et al., 2003)
Formule brute : C22H24N2O8
Nom chimique : 4-dimethalamino-1,4,4a,5,5a,6,11,12a-octahydro-3,5,10,12,12a-
pentahydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthecenecarbonxamide
2-Les macrolides
Ils sont utilisés en association avec d’autres antibiotiques (érythromycine, spiramycine) ou
isolément (clindamycine) en cas de chimiorésistance:
o La clindamycine : C'est un dérivé semi-synthétique de la lincomycine, proche des
macrolides.
Formule brute: C18H33ClN2O5S
Nom chimique : méthyle7-chloro-6, 7,8-tridésoxy-6-(1methyl-trans-4-propyl-L-2
pyrrolidinecarboxamido)-1-thio-L-thréo-α-D-galacto-
octopyranosidemonohydrochloride.
o L’azithromycine est dérivée de l'érythromycine par addition d'un atome d'azote dans
le cycle lactone de l'érythromycine A
Formule brute: C38H72N2O12
Nom chimique : 9-désoxy-9a-aza-9a-méthyl-9a-homoérythromycine A.
![Page 54: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/54.jpg)
53
Chloroquine Amodiaquine Ferroquine
Amino-4-quinoléines
Pipéraquine
Primaquine Pamaquine
Amino-8-quinoléines
Mépacrine Pyronaridine
Amino-9-acridines
Quinine Méfloquine Luméfantrine Halofantrine
Amino-alcools
Arthéméther Arthééther Artésunate Dihydroartémisinine
Dérivés de l’artémisinine
![Page 55: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/55.jpg)
54
Figure 7. Formes chimiques développées des antipaludiques.
(http://en.wikipedia.org)
Proguanil
Pyriméthamine
Antifoliniques
Sulfadoxine
Dapsone
Antifoliques
Hydroxynaphtoquinon
Atovaquone
Doxycycline Tétracycline Clindamycine
Azithromycine
Antibiotiques
![Page 56: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/56.jpg)
55
IIII.. 22.. 44.. 1111.. LLeess aassssoocciiaattiioonnss dd’’aannttiippaalluuddiiqquueess
L’apparition de polychimiorésistances de certaines souches des plasmodies chez l’espèce
la plus dangereuse (P. falciparum) suscite la recherche permanente de nouvelles molécules,
isolées ou associées si possible entre différents produits actifs sur des cibles métaboliques
différentes. Le concept de combinaison thérapeutique est basé sur l’action potentielle synergique
ou additive de deux médicaments ou plus, dans le but d’améliorer l’efficacité et de retarder
l’apparition de la résistance aux composants individuels de l’association.
Les nouveaux antipaludiques qui ont fait l’objet de développement récent sont tous
associés, au moins en bithérapie, et se démarquent de la plus ancienne des associations, la
sulfadoxine-pyriméthamine capable de sélectionner rapidement des mutants résistants. Certaines
associations sont fixes : l’atovaquone-proguanil, l’artéméther-luméfantrine et la chlorproguanil-
dapsone (« Lapdap® » est abandonnée depuis plusieurs années). D’autres associations sont libres,
associant toujours un dérivé de l’artémisinine: artésunate-méfloquine, artésunate-amodiaquine,
artéméther-proguanil et artésunate-sulfadoxine-pyriméthamine (WHO, 2000).
En prophylaxie, les associations chloroquine-proguanil (Savarine®) et atovaquone-
proguanil (Malarone®) sont recommandées selon les zones de chloroquino-résistance.
D’après le programme « Roll Back Malaria », un traitement combiné consiste
«l’association additive de deux thérapeutiques, afin d’améliorer leur efficacité thérapeutique et
de retarder l’apparition de résistance à chacun des constituants de cette association ». Il y a deux
types d’associations de médicaments antipaludiques :
� Associations sans artémisinine (non CTA) :
Ce sont des associations dans lesquelles il n’y a pas de dérivés d’artémisinine. Elles sont
constituées de schizonticides sanguins agissant sur différentes cibles biochimiques du parasite.
Elles sont présentées sous forme des antipaludiques individuels pour administration conjointe ou
sous forme d’associations fixes. Les associations ont présenté des taux de guérison plus élevés
que les médicaments individuels, ces associations sont comme Sulfadoxine-Pyriméthamine
(Fansidar®), Sulfaméthoxazole-Triméthoprime (Bactrim®), Sulfadoxine-Pyriméthamine
Méfloquine (Fansimef®), Dapsone-Pyriméthamine (Maloprime®), Quinine-Tétracycline,
Quinine-Doxycycline, Quinine-Clindamycine et proguanil-Atovaquone (Malarone®).
![Page 57: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/57.jpg)
56
� Associations artémisinine (Combinaisons Thérapeutiques à base d’Artémisinine
(CTA) :
Plusieurs dérivés d’artémisinine ont été utilisés dans différentes formulations contre le paludisme
depuis le début des années 1980. Les CTA sont assez neufs et possèdent de nombreux avantages
par rapport aux originaux. L’Artémisinine (quinghaosu), l’artésunate, l’artéméther et la
dihydroartémisinine ont tous été utilisés en combinaison avec d’autres antipaludiques pour le
traitement du paludisme. Les CTA sont comme Artésunate-Chloroquine, Artésunate-
Amodiaquine, Artésunate-Sulfadoxine-pyriméthamine, Artésunate-méfloquine, Artéméther-
Luméfantrine (Riamet®, Coartem®) dihydroartémisinine-piperaquine (Eurartesim®) et
artésunate - pyronaridine (Pyramax®).
Les avantages de l’introduction des combinaisons à base d’artémisinine selon l’OMS sont :
1-absence de résistance
2-bonne tolérance
3- négativité rapide de la parasitémie
4-activité contre les souches multirésistantes de P. falciparum
5- éliminer rapide de symptômes
6-réduction rapide de la biomasse plasmodiale
7- Possibilité de réduire la transmission, en raison de l’activité des dérivés de l’artémisinine sur
le taux de portage gamétocytaire.
IIII.. 22.. 55.. LLee mmooddee dd’’aaccttiioonn ddeess aannttiippaalluuddiiqquueess
IIII.. 22.. 55.. 11.. LLeess iinnhhiibbiitteeuurrss ddee ddééttooxxiiffiiccaattiioonn ddee ll''hhèèmmee
IIII.. 22.. 55.. 11.. aa)) LLyyssoossoommoottrrooppeess
Lysosomotrope qualifie une drogue produisant un disfonctionnement des lysosomes. Les
lysosomes sont des vésicules issues d’un appareil de Golgi atypique ; ils transfèrent les enzymes
nécessaires à la dégradation de l’hémoglobine.
![Page 58: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/58.jpg)
57
La caractéristique principale des lysosomotopes est de se concentrer à des degrés divers
dans la vacuole digestive, d’où leur toxicité sélective pour le parasite : ils bloquent la
dégradation enzymatique de l’hémoglobine dans la vacuole nutritive du plasmodium, source
principale des acides aminés du parasite intra-érythrocytaire.
���� En se liant avec l’hème libre, il y a formation des complexes toxiques : (hème-CQ, hème-
quinine) puis blocage de la formation de l’hémozaïne.
���� L’accumulation des lysosomotropes augmente le pH dans la vacuole digestive qui inhibe
l’hémopolymérase (pas de détoxification de l’hème en hèmozoïne (Surolia et Padmanban,
1991 ; Slater, 1993 ; Steele et al., 2000)
Les lysosomotropes comprennent deux groupes : les amino-4-quinoléines (chloroquines,
amodiaquine, pipéraquine) et les amino-alcools (quinine, méfloquine, halofantrine,
luméfantrine).
IIII.. 22.. 55.. 11.. bb)) LLeess aallkkyyllaannttss
Alkylation des métabolites de l’hémoglobine:
���� Endopéroxydes : la réaction de péroxyde d’artémisinine avec le fer héminique
parasitaire produit par protéolyse de l’hémoglobine de l’hôte libère des radicaux
actifs de l’oxygène.
���� Alkylation : formation d’actions covalentes avec l’hème, hème-polymérase.
���� La libération d’oxygène et de radicaux libres qui provoque un blocage de la
réplication de l’ADN et de la synthèse protéique, ainsi qu’une perturbation des
membranes par alkylation des protéines. (WHO, 2000; Robert, 2003; Wiesner,
2003).
IIII.. 22.. 55.. 22.. LLeess iinnhhiibbiitteeuurrss dduu mmééttaabboolliissmmee ddeess aacciiddeess
nnuuccllééiiqquueess ((aannttiimmééttaabboolliitteess))
Ils inhibent la division du noyau de parasite. Ce groupe est réparti en trois groupes,
antifolates, naphtoquinones et antibiotiques.
![Page 59: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/59.jpg)
58
IIII.. 22.. 55.. 22.. aa)) LLeess aannttiiffoollaatteess
Les antifolates bloquent la division du noyau du Plasmodium aux stades schizontes (phases
érythrocytaire et hépatocytaire). Les antifolates comprennent deux familles, les antifoliques et les
antifoliniques. Ils inhibent les enzymes dans la voie de synthèse de l’acide folique nécessaire aux
plasmodies (Figure 8).
Les antifoliques : inhibition de la DHPS (sulfadoxine, dapsone)
Ils agissent comme inhibiteurs compétitifs de la dihydroptéroate synthétase (DHPS) au
niveau de son site actif. La DHPS catalyse la transformation de l’hydroxyméthyldihydroptérine
en dihydroptéroate au cours du métabolisme des folates.(Winkler, et al., 1994)
Les antifoliniques : inhibition de la DHFR (pyriméthamine, cycloguanil)
Ils inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR), qui intervient dans la réduction du
dihydrofolate en tétrahydrofolate. Ce dernier est un cofacteur nécessaire dans la biosynthèse de
la thymidylate, des nucléotides puriques et de certains acides aminés. (Olliaro, et Trigg, 1995).
IIII.. 22.. 55.. 22.. bb)) LLeess nnaapphhttooqquuiinnoonneess :: ccyyttoocchhrroommee bbcc AATTPP
((aattoovvaaqquuoonnee))
L’atovaquone, en bloquant la chaîne de transfert d’électrons au niveau de son enzyme-
clé, la dihydroorotate deshydrogénase (DHOdase) : est un inhibiteur puissant des fonctions
mitochondriales (Touze, et al., 2002 ; Pradines et al., 2003).
IIII.. 22.. 55.. 22.. cc)) LLeess aannttiibbiioottiiqquueess ::
Ils peuvent inhiber la synthèse protéique par inhibition de certaines fonctions de l’apicoplaste, un
reliquat d’un ancien chloroplaste identifié chez P. falciparum. Par exemple :
- Inhibiteurs de l'ARN polymérase : ansamycines.
- Inhibiteurs de l'ADN-gyrase et de la topoisomérases IV : quinolones et
fluoroquinolones.
- Inhibiteurs de la synthèse de l'acide folique : sulfamides et diaminopyridines. (Touze, et
al., 2002 ; Pradines et al., 2003).
-
![Page 60: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/60.jpg)
59
Figure 8. Mode d’action des antifoliques et antifoliniques (d’après Charmot, 1993)
IIII.. 22.. 66.. CChhiimmiioorrééssiissttaannccee
La chimiorésistance concerne exclusivement P. falciparum et les schizontocides sanguins.
L’OMS, en 1973, définit la pharmaco-résistance ou la résistance comme étant l'aptitude d'une
souche parasitaire à survivre ou à se reproduire malgré l'administration et l'absorption d'un
![Page 61: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/61.jpg)
60
médicament aux doses égales ou supérieures à celles recommandées mais comprises dans les
limites de tolérance du sujet. (Basco et Ringwald, 2000). Une résistance a déjà mis en évidence
pour toutes les classes des médicaments antipaludiques. Elle augmente le niveau de transmission
çdu paludisme et, par conséquent, le nombre d’accès augmente.
Cette résistance a d’abord été définie :
in vivo
1- - Test de chimiorésistance parasitologique, OMS, 1965 :
On mesure le temps de diminution et de disparition de la parasitémie par des contrôles
quotidiens pendant 7 jours et on recherche son éventuelle réapparition par des contrôles
hebdomadaires pendant 28 jours, après avoir administré une dose thérapeutique standard. On
peut distinguer, en fonction de leur sensibilité, 3 types de résistance (Tableau 3) :
� Sensibilité : disparition des stades sanguins asexués avant le septième jour de traitement.
� une résistance de type RI marquée par une disparition des stades asexués en moins de 7
jours, suivie d'une recrudescence avant 4 semaines.
� une résistance de type RII marquée par une baisse de la parasitémie inférieure à 25% de
la parasitémie initiale pendant la première semaine, sans disparition totale, suivie d’une
ré-augmentation de la parasitémie.
� une résistance de type RIII caractérisée par une persistance de la parasitémie à plus de
25% de la parasitémie initiale.
2- - Test d’efficacité thérapeutique (clinique et parasitologique) OMS 1996, modifié 2001 :
La résistance aux antipaludiques est exprimé en réponse clinique adéquate (adequate
clinical response « ACR ») ou en échec thérapeutique précoce (early treatment failure « ETF »)
ou tardif (late treatment failure « LTF ») en fonction de la disparition, de l’aggravation, de la
persistance ou de la réapparition des signes cliniques, en particulier la fièvre, et en fonction de
l’évolution de la parasitémie.
in vitro, on évalue quantitativement la réponse aux traitements des souches plasmodiales ; on fait
dans le même temps un dosage de la chloroquinémie, pour caractériser une souche résistante.
� Test de Rieckmann de maturation des trophozoïtes de P. falciparum dans un milieu de
culture.
![Page 62: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/62.jpg)
61
Réponse Symbole
recommandé Signes observés
Sensibilités S
Disparition des formes érythrocytaires asexuées dans les
7 jours suivants de début du traitement, sans
recrudescence ultérieure.
Résistance R I Disparition des formes érythrocytaires asexuées comme
en S, mais suivie de recrudescence
R II Diminution marquée du nombre des formes
érythrocytaires asexuées, mais non disparition complète.
R III Pas de diminution marquée des formes érythrocytaires
asexuées
Tableau 3. Classification des différents types de résistance parasitaire et des réponses thérapeutiques en zone de faible transmission
� Test phénotypique : culture de souches plasmodiales dans un milieu spécial, en présence
de concentrations variables d’antipaludiques pendant un période de 24 à 48 heures
(WHO, 1984).
IIII.. 22.. 66.. 11.. MMééccaanniissmmeess ddee rrééssiissttaannccee aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess
Les mécanismes de la résistance sont dépendants des mécanismes d’action des
antipaludiques.
L’efficacité des lysosomotropes est due à leur concentration sélective dans les hématies
infectées, alors que chez les hématies saines la résistance aux lysosomotropes est liée à leur
moindre accumulation dans la vacuole digestive du parasite (Le bras et al., 1993), le déficit de
concentration dans cette vacuole est en rapport avec une sortie rapide de la chloroquine hors de
la vacuole.
Cet efflux est celui d’une liaison de la chloroquine avec une protéine située dans la membrane de
la vacuole digestive (Krogstad et al., 1987 ). Cette molécule est le gène pfcrt « Plasmodium
falciparum chloroquine résistance transporter » et la mutation K76T du gène pfcrt confère une
résistance à la chloroquine (Fidock et al., 2000).
La résistance à la pyriméthamine et au proguanil est due à des mutations ponctuelles dans
le gène codant la DHFR (di-hydrofolate-réductase). La résistance aux antifoliques est également
![Page 63: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/63.jpg)
62
due à des mutations portant sur les gènes codant la DHPS (di-hydro-ptérote-synthétase) (Le Bras
et al., 1993). Lors que les antifolates sont utilisées en monothérapie les résistances se
développent très rapidement, par mutation de l’enzyme-cible. Des combinaisons ont donc été
mises au point, c’est le cas par exemple du Fansidar® (pyriméthamine-sulfadoxine) et du
Lapdap® (chlorproguanil-dapsone) (Warhurst, 1999).
IIII.. 22.. 66.. 22.. ÉÉvvoolluuttiioonn ddee llaa rrééssiissttaannccee aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess ddaannss llee mmoonnddee
La résistance est un phénomène qui augmente en quantité et qualité. En cas Afrique,
depuis 1980, on peut noter plusieurs niveaux :
o extension géographique, à partir de l’Amérique du Sud et du Sud-est Asiatique,
o augmentation continue des pourcentages de souches résistantes,
o augmentation du niveau de résistance des souches, par exemple la
chloroquinerésistance s’est propagée plus rapidement en Afrique et atteint de
résistance RII ou RIII plus vite que prévu (Tableau 4),
o poly-chimiorésistance. (Basco et Le Bras; 1994),
o l’apparition de la résistance àl’ artémisinine en 2009 (Dondorp et al., 2009).
On peut distinguer trois causes de résistance :
� Les mutations génétiques
� L’expulsion du médicament hors de l’hématie (révèle un phénotype d’efflux rapide du
médicament, comme dans la résistance à la chloroquine) (Le Bras et al., 1993)
� L’usage abusif du médicament (pression médicamenteuse).
IIII.. 22.. 66.. 33.. RRôôllee ddeess vveecctteeuurrss ddaannss lleess rrééssiissttaanncceess aauuxx aannttiippaalluuddiiqquueess dduu
PPllaassmmooddiiuumm
La rapidité avec laquelle les souches résistantes se disséminent dans la population humaine laisse
entrevoir une responsabilité partielle du vecteur dans l'avantage apparent qu'ont les souches
résistantes par rapport aux souches sensibles. Au Burkina Faso, Coz et al., (1970) ont montré que
les isolats pyriméthaminorésistants sont expérimentalement transmis par A. gambiae mais avec
un cycle extrinsèque légèrement allongé par rapport aux souches sensibles.
![Page 64: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/64.jpg)
63
Antimalariques Première utilisation
(commercialisées)
Date et lieu d’émergence des premières
résistances
Quinine
Chloroquine
Pyriméthamine
Proguanil
Méfloquine
Halofantrine
Artémisinine
1830
1947
1948
1950
1980
1983
1979
1910 : Amazonie
1958-1960 : Péninsule indochinoise, Colombie
1950 : Afrique, Asie du Sud-Est
1950 : Afrique, Asie du Sud-Est
1990 : Thaïlande
1991 : Afrique de l’Ouest, Thaïlande
2009
Tableau 4. Dates de première utilisation des antimalariques et d’apparition de la résistance.
(adapté Le Bras et al., 1993)
![Page 65: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/65.jpg)
64
IIIIII.. PPrréésseennttaattiioonn dduu ttrraavvaaiill ddee tthhèèssee
Les thérapeutiques actives sur les formes hépatiques de réserve et les formes sexuées
assurant la transmission, sont peu étudiés.
Or, la phase d’impaludation apparaît comme une prophylaxie de choix puisque la
suppression du stade exo-érythrocytaire empêcherait le développement du parasite dans la
circulation sanguine, ceci amenant à supprimer l’état pathologique et de surcroît la transmission
du parasite. De plus, la mise en évidence d’une action totale sur les formes intrahépatiques
limiterait à quelques jours la poursuite d’une prophylaxie contre l’accès grave à P. falciparum
chez les voyageurs.
Dans cette thèse, nous avons travaillé sur deux stades parasitaires différents :
� Premier stade : il concerne la première partie du cycle parasitaire, correspondant à
l’impaludation c’est la phase hépatique exo-érythrocytaire
� Le deuxième stade concerne la transmission par l’intermédiaire des formes
érythrocytaires sexuées (gamétocytes).
Notre travail a pour but d’évaluer les effets des antipaludiques seuls ou en association qui
sont sur le marché actuellement en phase de développement ou déjà sur le marché et qui sont
amenés a être testés, sur les formes extra-érythrocytaires hépatiques et les formes sexuées, les
gamétocytes et leur développement chez le moustique :
���� Le stade hépatique : l’objectif principal de cette partie, est de mesurer l’efficacité des
antipaludiques seuls ou association sur la forme exo-érythrocytaire du P. yoelii yoelii, en
testant différents paramètres de mesure :
o L’évolution de la parasitémie préjugeant de l'efficacité des thérapeutiques sur les
formes hépatiques mais d'interprétation difficile du fait de la pharmacocinétique des
produits testés dont l'efficacité conjointe éventuelle sur les formes hépatiques et
sanguines ne permet pas d'en différencier les niveaux d'action.
o Le comptage des corps bleus par observation de coupes de foie colorées en
microscopie optique, dont l’inconvénient majeurs est d’être peu sensible et
difficilement quantifiable.
L’objectif secondaire de cette partie, est la mise au point et l’utilisation d’une technique
quantitative de mesure de l’efficacité sur les formes hépatiques par la biologie moléculaire PCR
![Page 66: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/66.jpg)
65
quantitative en temps réel, technique palliant les inconvénients des précédentes. Elle permet la
détection d’éventuels développements parasitaires dans le foie après l’administration des
antipaludiques en étude.
���� Le stade sexué : l’objectif principal est de mesurer les effets des doses infracuratives de
deux antipaludiques sur la gamétocytogénèse et la transmission du paludisme au moyen
d’un modèle expérimental murin.
Cette partie de notre thèse, a deux objectifs secondaires :
o objectif quantitatif : étude des effets des thérapeutiques sur la gamétocytogénèse
(gamétocytes circulants dans le sang)
o objectif qualitatif : étude d’un point de vue morphologique, la qualité des gamétocytes
qui arrivent à se développer jusqu’au stade d’oocystes chez le moustique :
� En évaluant l’action qualitative thérapeutique sur les gamétocytes à la suite
d’observations morphologiques des gamétocytes en microscope optique et
électronique.
� En testant l’infectivité des gamétocytes chez le moustique par :
a. le comptage des oocystes sur le feuillet externe de l’estomac
b. le pourcentage des moustiques infects
![Page 67: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/67.jpg)
Deuxième partie :
Matériel et Méthode
![Page 68: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/68.jpg)
67
II.. MMaattéérriieell bbiioollooggiiqquuee
La spécificité hôte-parasite du plasmodium humain représente une contrainte majeure dans
l’étude du paludisme chez l’homme, car l’agent responsable ne peut être maintenu
expérimentalement chez un animal de laboratoire pratique et de petite taille. Le besoin d’un
modèle animal, dans les années cinquante, a conduit à l’utilisation de parasites aviaires ou
simiens. En 1948, Vincke et Lips ont découvert et ont isolé un parasite capable d’infecter les
rongeurs de laboratoire (Peters, 1965). L’intérêt de l’infestation d’un modèle expérimental
rongeur est que son cycle parasitaire et sa sensibilité aux thérapeutiques sont proches de ceux
observés chez l’homme. Ce modèle bien connu, peu coûteux, reste incontournable dans les
évaluations thérapeutiques à leur début.
Le modèle expérimental choisi pour cette étude est le modèle :
«Souris Swiss - P. yoelii yoelii- Anophèles stephensi»
II.. 11.. LLee ppaarraassiittee
La souche 17X du parasite de rongeur utilisé est P. yoelii yoelii (Landau et Killick-
Kendrick, 1966), qui provient d’un muridé africain (Thamnomys rutilans) et a été clonée (clone
1.1) en 1969. P. yoelii yoelii envahit préférentiellement les réticulocytes, même s’il est
également capable d’envahir les hématies matures. Cette espèce peut provoquer des infections
virulentes souvent mortelles, ou au contraire avirulentes et suivies d’une totale guérison. De plus,
comparativement aux autres espèces plasmodiales murins, P. yoelii yoelii produit un grand
nombre de gamétocytes ce qui facilite notre étude quantitative et qualitative des différents stades
gamétocytaires. De plus, le développement du cycle est totalement asynchrone : toutes les
formes parasitaires sanguines sont présentes en permanence.
II.. 22.. LL’’hhôôttee vveerrttéébbrréé ((iinntteerrmmééddiiaaiirree))
Les souris utilisées sont des souris Swiss femelles dont le poids varie de 20 à 30 grammes.
Elles proviennent de l’élevage Janvier (Le Genest Saint Isle, France) et sont ensuite entretenues
en animalerie.
![Page 69: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/69.jpg)
68
II.. 33.. LL’’hhôôttee iinnvveerrttéébbrréé ((llee vveecctteeuurr))
L’hôte définitif est l’espèce Anopheles stephensi Liston (1901), c’est l’espèce naturelle la
plus utilisée en laboratoire. La souche originaire d’Inde est maintenue à l’insectarium du
Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris. Elle provient d’un élevage initialement stabilisé
par Shute et Maryon en 1966 à Londres. Le cycle complet du moustique y est entretenu à 23°C et
avec un taux d’humidité relative de 70% à 80%. Les imagos sont maintenus dans des cages
autoclavables de 50x50x50 cm et de l’eau glucosée (5%) est disponible en permanence. Une fois
par semaine, les imagos femelles prennent un repas sanguin sur un lapin anesthésie avec un
mélange de Vetranquil® à 1% et d’Imagène® 500 à 0.25% (1 ml/kg par voie intramusculaire).
Les pontes sont récoltées le 3e jour suivant le repas sanguin et les œufs sont transférés dans une
cuvette d’eau. Les larves sont nourries quotidiennement avec des biscuits canins réduits en
poudre (sans poisson dans leur composition) supplémentés en Superlevure-Gayelord Hauser®
(8%) jusqu’à l’apparition des nymphes. Une fois la mue effectuée, les imagos sont collectés soit
dans des cages de « pondeurs », soit dans des cages d’expérience.
IIII.. TThhéérraappeeuuttiiqquueess tteessttééeess
Les thérapeutiques utilisées feront l’objet de deux études d’efficacité :
� sur les stades intra-hépatiques par la technique de PCR quantitative pour la
primaquine, l’amodiaquine (FLAVOQUINE®), le proguanil, l’atovaquone, la
ferroquine, l’artésunate (ARSUMAX®), l’association atovaquone + proguanil
(MALARONE®), l’association artésunate + amodiaquine (ARSUCAM®) et
l’association artésunate + ferroquine.
� sur les stades sexués chez l’hôte (gamétocytes) et leur développement chez le
moustique (oocystes) : pour la ferroquine et l’artésunate.
![Page 70: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/70.jpg)
69
IIIIII.. MMéétthhooddeess
IIIIII.. 11.. MMéétthhooddeess ppoorrttaanntt ssuurr llee ssttaaddee hhééppaattiiqquuee
Méthodes de mesure de l’efficacité des thérapeutiques sur les stades intra-hépatiques
Le stade hépatique du cycle plasmodial a déjà fait l’objet d’études au sein même du
laboratoire de Parasitologie de la faculté de Médecine de Tours. Ces études consistent à tester
une technique permettant l’analyse fine du développement, l’efficacité des antipaludiques sur les
formes intracellulaire (hépatocytes et hématies). Les méthodes testées pour mesurer l’efficacité
des thérapeutiques sur les stades intra-hépatiques ont été multipliées avant de s’arrêter à la
technique de PCR quantitative.
1. Le suivi de la parasitémie
Une étude en 1994 (Lanotte et Sidiboumedine, 1995) avait pour objectif d’étudier
l’évolution temporelle de la parasitémie, reflétant indirectement l’activité intra-hépatique
supposée des molécules. Le suivi de la parasitémie est rendu possible par la réalisation régulière
de frottis sanguins colorés au May Grünwald par la technique rapide, sur toute la durée de
l’étude. L’observation au microscope optique (x100, à l’immersion) permet le comptage des
parasites présents au niveau sanguin. Cette technique présente l’avantage d’être peu coûteuse et
facile à mettre en œuvre. Elle permet d’étudier l’efficacité des thérapeutiques sur le stade intra-
hépatique grâce à l’analyse de plusieurs paramètres : le retard à l’apparition des parasites, leur
densité dans le sang et leur qualité en terme de schizogonie. Cependant, il n’est pas possible de
conclure quant à la spécificité d’action sur la cible hépatique des molécules testées en raison de
la superposition de deux cinétiques : l’une parasitaire et l’autre pharmacocinétique, des
molécules employées. En effet, certaines molécules possèdent une demi-vie telle qu’elles
persistent dans la circulation sanguine à des taux suffisants pour être actives. De ce fait, la baisse
de la parasitémie, si elle est détectable, ne peut être attribuée de façon certaine à l’activité intra-
hépatique seule de ces molécules, mais essentiellement à leur efficacité connue sur les formes
parasitaires schizogoniques intra-érythrocytaires. Les caractéristiques biologiques de cette espèce
sont détaillées dans le tableau 5.
![Page 71: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/71.jpg)
70
Sporogonie Schizogonie
hépatique
Schizogonie érythrocytaire
(durée du cycle érythrocytaire) Gamétocytes
9 à 15 jours
à 23° C ≥ 45 heures 18 heures / asynchrone
Production constante
au cours de l’infection
Tableau 5. Les caractéristiques biologiques chez la souris infestée avec P. yoelii en conditions de laboratoire (adapté de Landau et Gautret, 1998)
2. L’observation de marqueurs anatomo-pathologiques
En 1998, une nouvelle approche plus spécifique du stade intra-hépatique est abordée
(Baruteau et Girard, 1999) : il s’agit d’évaluer l’efficacité sur les stades intra-hépatiques des
molécules administrées par observation directe en microscopique classique et en microscopie
électronique, de préparations anatomo-pathologiques de parenchyme hépatique de souris
infectées et traitées. Cette technique permet à la fois une approche quantitative reposant sur
l’analyse de plusieurs critères (densité et taille des corps bleus, densité et taille des granulomes
inflammatoires) et une approche qualitative se basant sur l’étude morphologique des corps bleus
et de l’environnement hépatocytaire par les deux techniques de microscopie. Elle permet aussi
d’analyser de façon spécifique l’activité hépatocytaire des molécules étudiées et de s’affranchir
du conflit entre la cinétique parasitaire et la pharmacocinétique, principal obstacle de la
technique précédente. De plus, cette méthode, fondée sur la numération des corps bleus et leurs
diamètres, permet une approche quantitative de l’activité médicamenteuse. Mais, cette technique
impose un sacrifice systématique des souris afin de réaliser les coupes histologiques de foie, ce
qui induit une augmentation du coût de l’étude et empêche surtout un suivi a posteriori de la
parasitémie. Deuxièmement, la réalisation des coupes permet l’étude d’une partie seulement du
foie de chaque souris sacrifiée, rendant difficile l’interprétation d’un résultat négatif. Enfin, cette
technique repose sur la qualité de la lecture, délicate, des coupes histologiques. Par ailleurs, la
faible quantité de corps bleus attendus à la suite de l’infestation rend difficile toute interprétation
statistique comparative.
3. Les techniques de sub-inoculation
Dans la continuité des travaux précédents, et dans le souci de perfectionner l’analyse de
l’efficacité intra-hépatique des antipaludiques, une technique reposant sur l’inoculation de
broyats de foie de souris « donneuses », infestées et traitées, à des souris « receveuses » a été
développés (Savoie, 2004). L’objectif est d’étudier la vitalité d’éventuels corps bleus, même non
![Page 72: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/72.jpg)
71
détectés par la méthode d’observation de marqueurs anatomo-pathologiques, tout en évitant un
effet résiduel de la thérapeutique chez les souris receveuses, puisque celles-ci ne reçoivent pas de
traitement.
Cette dernière particularité est un avantage majeur de la technique de sub-inoculations.
Cependant, au cours de cette expérience, l’infestation des souris a été faite par voie intra-
abdominale ce qui n’est pas la voie naturelle d’infestation. Ceci peut être à l’origine d’un biais
dans les résultats puisque le péritoine peut jouer ici un rôle de barrière limitant plus ou moins le
passage du parasite dans le sang de la souris receveuse. De plus, cette technique ne permet
qu’une approche qualitative, les résultats correspondant au développement ou non d’une
parasitémie chez la souris receveuse.
4. La technique de PCR quantitative en temps réel
Les techniques précédentes de détection des stades hépatiques, comme la technique
microscopique (Levine et al., 1989) etc., les techniques moléculaires (Barker et al., 1994), la
détection antigénique (Pieroni et al., 1998), manquent toutes de sensibilité en cas de faible
parasitémie, d’où la nécessité d’une nouvelle technique plus adaptée ayant une limite de
sensibilité de 10 parasites/mL : la PCR quantitative en temps réel. La PCR (Polymerase Chain
Reaction) est un outil de biologie moléculaire essentiel, découvert par Karry Mulis en 1983, et
contrairement au clonage moléculaire, qui consiste à faire produire l'ADN cloné par des
bactéries, la PCR est l'amplification d'ADN in vitro. Cette technique qualitative est basée sur
l’utilisation d’ADN polymérase résistante à de hautes températures, isolé d’organismes
hyperthermophiles comme Thermus aquaticus. L’amplification est sensible et spécifique du
fragment d’ADN cible (un site sur chaque brin). Elle comprend deux phases : une phase
exponentielle correspondant à une amplification exponentielle pendant les 20 à 25 premiers
cycles, puis une phase plateau correspondant à un ralentissement de l’amplification dû à
l’inactivation thermique partielle de l’ADN polymérase ainsi qu’à l’épuisement des différents
réactifs de la PCR (Figure 9) ; (Tse et Capeau, 2003). La PCR quantitative en temps réel
constitue une avancée technologique importante de la PCR classique, car elle s’effectue en
milieu fermé, contrairement à la PCR classique, ce qui réduit considérablement les risques de
contamination extérieure de l’échantillon. A travers l’utilisation de stratégies de détection par
fluorescence, la quantité initiale d’acide nucléique présente dans le mélange réactionnel peut être
déterminée. La quantification est réalisée par mesure de l’augmentation de la fluorescence durant
la phase exponentielle de la PCR. En effet, au début de la réaction (au cours des premiers
cycles), l’intensité de fluorescence émise est très faible et définit le bruit de fond.
![Page 73: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/73.jpg)
72
Figure 9. Cinétique de la PCR, courbe exprimant l’intensité de la fluorescence émise en fonction du nombre de cycles de PCR effectués par le thermocycleur.
(d’après Tse et Capeau, 2003)
Après un certain nombre de cycles, le signal dépasse significativement le bruit de fond et le
nombre de cycles correspondant à ce point est appelé cycle seuil ou Ct (Threshold Cycle).
Le système de détection des molécules d’amplicons utilisé ici est un agent intercalant, le SYBR®
Green I. (Higuchi et al., 1992) ; il est capable de se fixer préférentiellement sur l’ADN double
brin néo-synthétisé. En s’intercalant entre les bases nucléotidiques, le SYBR® Green I émet un
signal fluorescent après excitation par les UV, 250 fois plus élevé lorsqu’il est fixé sur l’ADN
double brin (Figure 10).
Malgré sa sensibilité et sa simplicité, le système manque de spécificité puisque cet agent
marque toutes les molécules d’ADN double brin, qu’elles soient spécifiques ou non de la
séquence à amplifier. Pour pallier ce problème, l’automate réalise une courbe de fusion qui va
caractériser chaque produit PCR par une température de fusion. Le produit détecté est spécifique
lorsque sa température de fusion est identique à celle des échantillons de la gamme étalon.
IIIIII.. 11.. 11.. IInnffeessttaattiioonn eett ttrraaiitteemmeenntt ddeess ssoouurriiss
On dissèque les anophèles femelles infectants au Muséum d’ Histoire Naturelle de Paris,
au moment où les sporozoïtes sont déjà dans les glandes salivaires. La dissection se fait à l’œil
nue, à l’aide d’une aiguille ; la tête et l’abdomen sont retirés et le thorax est mis de côté.
![Page 74: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/74.jpg)
73
Figure 10. Etapes de la PCR quantitative en temps réel utilisant le SYBR® Green.
(Source : http://www.gfrup.com/gfrup_journee_urgence05/diagnostic_infection_virale.pdf)
Les thorax disséqués sont placés dans un sérum physiologique maintenu dans de la glace
et y sont broyés à l’aide d’un potter (Figure 11) ; la solution est centrifugée à 500 rpm (rotations
par minute) pendant une minute afin de séparer les sporozoïtes des différents débris constitués
notamment par les ailes et l’enveloppe extérieure du thorax
Si le surnageant, dans le quel sont contenus les sporozoïtes, n’est pas assez clair, la
centrifugation peut être réitérée dans les mêmes conditions. Afin de déterminer la quantité de
sporozoïtes inoculés aux souris dans les différents protocoles, la densité de sporozoïtes est
évaluée sur cellule de Mallassez.
Etant donné la courte durée de vie des sporozoïtes hors des glandes salivaires, les souris
sont infestées dans l’heure qui suit la dissection des moustiques.
3- Pendant l'étape d'élongation, le nombre de molécules de fluorophorelié à l'ADN synthétisé augmente ce qui se traduit par une augmentation de la fluorescence. La fluorescence est mesurée à la fin de l'étape d'élongation de chaque cycle
2- Après le couplage des amorces, le fluorophorescence lie au double brin. La liaison à l’ADN se traduit par une augmentation de la fluorescence
1- Au début de l'amplification, le mélange réactionnel contient de l'ADN dénaturé, les amorces et le fluorophorenon lié
![Page 75: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/75.jpg)
74
Figure 11. Anatomie schématique d’un moustique femelle.
L’infestation se fait par voie intraveineuse au niveau de la veine de la queue de la souris.
Le moment de l’infestation correspond, dans chaque protocole, au temps J0.
Les souris sont réparties de façon aléatoire dans les cages à raison de 5 souris minimum par
cage, la thérapeutique est administrée par voie orale juste après l’infestation, à l’aide d’une
seringue munie d’une canule. Les thérapeutiques sont administrées en dose unique (sauf
![Page 76: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/76.jpg)
75
protocole IV) par voie orale. Quarante trois heures après l’infestation, les souris sont sacrifiées et
leur foie est prélevé et découpé en plusieurs morceaux :
- deux morceaux d’environ 5 x 3 mm sont placés chacun dans un tube Eppendorf et
conservés à -80 °C en vue de servir à la PCR quantitative en temps réel.
- un morceau est placé dans une solution de formol acétique en vue d’une étude anatomo-
pathologique.
- le reste est conservé dans un tube Eppendorf à -80°C et constitue ainsi une réserve
utilisable si nécessaire.
dans chaque cage, et une souris est laissée vivante et suivi quotidiennement par frottis
sanguin (pendant quatre jours après le traitement), afin de vérifier qu’il y a bien eu infestation.
IIIIII.. 11.. 22.. PPCCRR qquuaannttiittaattiivvee eenn tteemmppss rrééeell
IIIIII.. 11.. 22.. 11.. MMéétthhooddeess dd’’eexxttrraaccttiioonn ddee ll’’AADDNN ddeess ffoorrmmeess ppaarraassiittaaiirreess
iinnttrraa--hhééppaattiiqquueess
Après ajout de 180 µL de tampon de lyse ATL, les morceaux de foie sont broyés à l’aide
d’un piston. Ensuite, 20µL de protéinase K sont ajouté afin d’éliminer ceux qui pourraient
interférer dans la réaction de PCR. Cette étape a lieu pendant la nuit, au bain-marie à 55°C. Pour
digérer l’ARN, on a ajouté 4µL de RNase A à 100mg/mL. Après incubation de 2 minutes à
température ambiante, 200 µL de tampon de lyse AL sont ajoutés et les échantillons sont laissés
à incuber pendant 10 minutes, l’incubation s’effectuant à 70°C. Puis 200 µL d’éthanol sont
ajoutés et le contenu de chaque tube est transféré sur une colonne d’extraction elle-même placée
dans un tube collecteur. Après une centrifugation de 2 minutes à 8000 rpm, l’ADN des
échantillons fixés sur les colonnes est lavé par le tampon de lavage AW1 et centrifugé pendant 1
minute à 8000 rpm. Un deuxième lavage est effectué à l’aide du tampon AW2 suivi d’une
minute à 14000 rpm. Finalement, 150 µL de tampon d’élution AE sont ajoutés. Après 5 minutes,
d’incubation à température, les échantillons sont centrifugés 2 minutes à 8000 rpm, et l’ADN
purifié est ainsi récupéré dans des tubes Eppendorf. Les extraits peuvent être conservés à +4°C
ou à -20°C.
La quantité d’ADN contenue dans les extraits est déterminée par spectrophotométrie. En
effet, une quantité définie de chaque échantillon extrait est diluée au 1/5e dans de l’eau pour
préparation injectable (eau PPI dépourvue d’ADN). La densité optique de ces préparations est
![Page 77: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/77.jpg)
76
mesurée à 260 nm, ce qui permet de déterminer la quantité d’ADN dans chaque extrait selon la
formule suivante :
CADN (µg/mL) =Absorbance x Facteur de dilution x 50
Cette étape permet alors la détermination du volume d’extrait pour réaliser le dénombrement des
formes parasitaires par PCR quantitative, laquelle nécessite environ 1 µg d’ADN par échantillon.
IIIIII.. 11.. 22.. 22.. PPCCRR qquuaannttiittaattiivvee eenn tteemmppss rrééeell
Milieu réactionnel :
Chaque réaction se fait dans un volume de 25 µL. Les conditions du milieu réactionnel
sont conformes à celles décrites par Bruna-Romero et al., 2001.
Un mix provenant d’INVITROGEN® (Platinium ® SYBR® Green qPCR Super Mix UDG) est
utilisé dilué au ½. Ainsi, le milieu réactionnel comprend :
o SYBR® Green I,
o Platinium ® Taq DNA polymerase, 30 U/mL
o Tri-HCI (pH 8.4), 20 mM
o KCI, 50mM
o MgCl2, 3 mM
o dNTP, 200 µM chacun
o Uracil-DNA Glycosylase (UDG), 20 U/mL
o Amorces NyU3 et NyU5, 500 mM chacune
o ADN, environ 1 µg par réaction
o Eau PPI (qsq 25 µL)
Amorces :
Deux amorces spécifiques ont été utilisées pour amplifier une région du génome du
parasite codant pour le gène de l’ARN ribosomal 18S de P. yoelii (Bruna-Romer et al., 2001).
Les séquences de ces amorces sont :
-pour l’opéron NyU3 (forward primer) :
5’-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG -3
![Page 78: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/78.jpg)
77
-pour l’opéront NyU5 (reverse primer) :
5’- AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3’.
Gamme étalon :
Une gamme d’échantillons de charge parasitaire connue sert de référence pour chaque
PCR. Cette gamme est préparée à partir d’ADN génomique. La parasitémie d’une souris infestée
par P. yoelii yoelii est régulièrement surveillée par frottis sanguins. Lorsqu’elle atteint 10 à 15%,
la souris est sacrifiée et son sang est prélevé. Un frottis sanguin est alors réalisé, sur lequel est
déterminé le nombre de noyaux parasitaires rapporté au volume de sang prélevé. L’ADN de 105
parasites/µL est ensuite extrait selon le même procédé que décrit précédemment et une gamme
étalon allant de 105 à 10 parasites/µL est obtenue après dilutions successives.
Programme :
La PCR quantitative en temps réel est réalisée sur l’iCycler de BIORAD®. Cet appareil a la
particularité d’analyser les échantillons sur plaque de 96 puits.
La programmation du thermocycleur est effectuée en trois étapes :
o La première, consiste à activer l’enzyme (de type « hot start ») du milieu réactionnel par
un cycle de 10 minutes à 95°C.
o La seconde étape est la PCR en temps réel proprement dite. Elle comporte 50 cycles de
trois phases chacun :
1. la phase de dénaturation à 95°C,
2. la phase d’hybridation à 60°C
3. la phase d’élongation à 72 °C. Chaque phase dure 10 secondes.
o La dernière étape débute à 72°C et permet la réalisation de la courbe de fusion qui
nécessite 45 cycles de 10 secondes, au cours desquels la température augmente de 0.5°C
par cycle.
Echantillons analysés
Pour les trois premiers protocoles, les échantillons analysés correspondent, pour chaque
souris, aux extraits de deux morceaux différents du même foie. Pour ces protocoles, chaque lot
(un lot correspondant à une thérapeutique) est donc composé de 10 échantillons (2 extraits
équivalents par souris, à raison de 5 souris par lot destinées à être disséquées, les autres souris
étant maintenues en vie afin de suivre l’évolution de l’infestation jusqu’à J8).
![Page 79: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/79.jpg)
78
Le dernier protocole présente la particularité d’analyser tous les extraits en duplicate (soit
cette fois des lots constitués de 20 échantillons chacun).
Cependant, en raison de la limite du nombre d’échantillons analysables en une fois (taille
des plaques) , et en vue de travailler sur l’analyse rigoureuse et cohérente des résultats
comparatifs, le lot de souris traitées par la MALARONE®, pour ce dernier protocole, ne contient
que 5 échantillons ; cette pratique étant autorisée du fait de la grande homogénéité des résultats
obtenus avec cette spécialité pharmaceutique dans les trois premiers protocoles.
IIIIII.. 11.. 22.. 33.. MMéétthhooddee dd’’aannaallyyssee ddeess rrééssuullttaattss
1) Aspect des résultats fournir
Le thermocycleur, au terme du programme, condense les résultats numériques
correspondant aux échantillons étudiés sous forme graphique (Figure 12). Chaque courbe
correspondant à l’analyse d’un puits de la plaque PCR.
2) Courbe de fusion
Cette courbe permet de vérifier la spécificité du produit PCR amplifié et détecté par le
SYBR® Green I. Ce produit est spécifique lorsque sa température de fusion est égale à celle des
échantillons de la gamme étalon. La PCR quantitative réalisée sur les échantillons de la gamme
étalon résulte en un seul et unique pic sur la courbe de fusion (Figure 13).
La température à laquelle ce pic apparaît correspond à la température de fusion Tm du
produit spécifique, soit 80,5°C. Le nombre de cycles d’amplification de PCR quantitative en
temps réel et le manque de spécificité de détection du SYBR ® Green font que des produits de
PCR non spécifiques sont détectés dans certains protocoles, en plus de l’absence du génome de
P. yoelii, de par la richesse des échantillons en ADN murins.
Seuls les produits amplifiés ayant une température de fusion de 80,5°C et qui
correspondent à la séquence du génome de P. yoelii signent leur présence dans l’échantillon et
rendent le dénombrement du parasite possible.
![Page 80: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/80.jpg)
79
Figure 12. Courbe de fusion représentant la spécificité du produit PCR amplifié et détecté par le SYBR® Green I.
Figure 13. Courbe représentant l’intensité de fluorescence du SYBR ® Green I en fonction du nombre de cycles de PCR.
![Page 81: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/81.jpg)
80
3) Courbe standard
Pour chaque protocole, les charges parasitaires caractérisant les échantillons de foies traités
ou non, sont déterminées à partir de la courbe standard réalisée grâce aux échantillons de la
gamme étalon. La droite obtenue possède un coefficient de corrélation (Figure 14) proche de 1,
soit 0.995.
La limite inférieure de détection correspond au nombre de cycles seuil caractérisant la
détection de la dernière dilution de la gamme, soit 10 parasites/mL ; en dessous de ce chiffre,
l’échantillon est considéré comme non détectable. Ainsi, bien que l’i Cycler® puisse encore
détecter des produit amplifiés au-delà de ce nombre de cycles seuil, seront considérés, dans les
analyses, comme indétectables.
4) analyse graphique et statistique
L’analyse des résultats fournis par la PCR quantitative est exprimée en logarithme des
charges parasitaires afin de diminuer la déviation standard.
Les histogrammes sont réalisés à partir des moyennes des valeurs logarithmiques des
nombres de parasites des stades hépatiques mesurées pour chaque échantillon issu de souris
ayant reçu une même thérapeutique. Pour chaque protocole, l’étude s’effectue sur des
échantillons de petite taille, inférieure à 30.
IIIIII.. 11.. 33.. PPrroottooccoolleess
Quatre protocoles différents (tableau 6) visant à tester l’efficacité des antipaludiques seuls et des
associations sur le stade intra-hépatique du parasite ont été mis au point :
���� Protocole 1 : analyse de deux spécialités (et de leurs principes actifs dans le cas de la
MALARONE® qui est une association) dont l’activité en thérapeutique humaine sur les
stades intra-hépatiques par inhibition de la synthèse des pyrimidines du parasite a été
largement démontrée. Cette analyse permettra ainsi la détermination d’une référence en
termes d’activité thérapeutique pour les autres protocoles.
Cinq lots de cinq souris sont infestés (10 000 sporozoïtes injectés/souris) : lot 1 traité à la
Malarone® (2 cp/60kg ; 0.1 mL/souris), lot 2 à la primaquine (20mg/kg ; 0.1 mL/souris),
lot 3 à l’atovaquone (500mg/kg, 0.1mL/souris), lot 4 au proguanil (20mg/kg,
![Page 82: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/82.jpg)
81
Droite de régression: Gamme étalon
y = -3,75x + 39,29
R2 = 0,995
0
10
20
30
40
1 2 3 4 5
Logarithme de la charge parasitaire
Nom
bre de cycles seuil
Figure 14. Droite de régression (linéaire) de la gamme étalon obtenue à partir des résultats apportés par la figure Courbe d’amplification d’une réaction PCR (Valeur logarithmique)
0.1mL/souris) et lot 5 témoin (souris infestées non traitées). Le lot de souris traitées par la
Malarone® et pris comme témoin est traité à la même dose pour les quatre protocoles.
� Protocole 2 : il correspond à l’étude de plusieurs principes actifs : artésunate (AX
10mg/kg, 0.1mL/souris), ferroquine (FQ 10mg/kg, 0.1mL/souris) et amodiaquine (AQ 30
mg/kg, 0.1mL/souris) et la primaquine (20mg/kg ; 0.1 mL/souris) ; les associations
artésunate- ferroquine et artésunate- amodiaquine. Cinq lots de 6 souris sont infestés (45
000 sporozoïtes/souris).
� Protocole 3 : étude des associations médicamenteuses en développement : artésunate +
amodiaquine (AX 10 mg /kg + AQ 10mg/kg, 0.15mL/souris) et ferroquine + artésunate
(FQ 10mg/kg + AX 10mg/kg, 0.15mL/souris) les souris sont infestés avec 20 000
sporozoïtes injectés/souris ensuite sont réparties en quatre lots de 6 souris.
� Protocole 4 : étude de ces associations dans des conditions d’administration modifiées :
en effet, l’artésunate ayant une demi-vie très courte (20 à 25 minutes, et 45 minutes pour
son métabolite), il a été étudié dans ce protocole l’effet d’une seconde administration de
thérapeutique (7 heures) pour les traitements contenant ce principe actif : (AX 10 mg /kg
+ AQ 10mg/kg, 0.15mL/souris) et (FQ 10mg/kg + AX 10mg/kg, 0.15mL/souris) et (AX
10 mg/kg , 0.1mL), les souris infestés avec 80 000 sporozoïtes/souris, sont reparties en
cinq lots de 6 souris.
![Page 83: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/83.jpg)
82
Protocoles Protocole I :
choix d’un
antipaludique référent
Protocole II :
étude de principes
actifs pris isolément
Protocole III :
étude d’associations
thérapeutiques
Protocole IV :
étude d’associations
thérapeutiques avec
une dose d’artésunate
supplémentaire
Nombre de
sporozoïtes
injectés par
souris
10 000 45 000 20 000 80 000
Constitution
des lots :
Traitements
administrés
(voie orale
doses)
Malarone® (2cp/60kg)
PQ = 20mg/kg
ATVQ = 500mg/60kg
PG = 200mg/60kg
Malarone® (2cp/60kg)
PQ = 20mg/kg
FQ = 10mg/kg
AX = 10mg/kg
AQ = 30mg/kg
Malarone® (2cp/60kg)
(AX 10 mg/kg + AQ
30mg/kg)
(AX 10mg + FQ
10mg/kg)
Malarone® (2cp/60kg)
AX = 10mg/kg
(AX10mg/kg + AQ 30
mg/kg)
(AX 10mg/kg + FQ 10
mg/kg)
(AX 10mg/kg 7 h plus
tard pour les
associations)
Nombre de
souris par lot 5 6 6 6
Tableau 6. Les protocoles du stade hépatique en détail.
(1 lot T+ / protocole, ; 1 souris de chaque lot maintenue en vie (protocoles II, III, IV) = suivi de la parasitémie). En rouge : lot traité par la Malarone® ; en bleu : lot traité par un seul médicament ; en vert : lot traité par association thérapeutique, en violet = deuxième dose d’artésunate.
![Page 84: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/84.jpg)
83
IIIIII.. 22.. MMéétthhooddeess ppoorrttaanntt ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee,, lleess ggaammééttooccyytteess
cciirrccuullaannttss eett llaa ttrraannssmmiissssiioonn dduu ppaalluuddiissmmee
IIIIII.. 22.. 11.. CCoonnssttiittuuttiioonn ddeess ssttoocckkss ddee ssaanngg ppaarraassiittéé eett ccoonnsseerrvvaattiioonn
Un stock de sang congelé répertorié au Muséum d’Histoire Naturelle de Paris conservé au
congélateur à -70°C, a été constitué.
Ce procédé permet d’effectuer plusieurs expériences à partir du même stock de sang
congelé. La mise en congélation est effectuée sans palier de température. De la même façon, le
sang sera décongelé brutalement (placé directement à température ambiante). Le taux de
mérozoïtes infectants est estimé à 5 % .
IIIIII.. 22.. 22.. IInnffeessttaattiioonn ddeess ssoouurriiss
Les souris sont infestées par voie intrapéritonéale à partir d’un même sang congelé
contenant 106 hématies parasitées par millilitre. L’observation des parasites se fait sur frottis
sanguin en prélevant une goutte de sang à la queue des souris (la parasitémie est évaluée sur
2000 hématies).
IIIIII.. 22.. 33.. SSuuiivvii ddeess iinnffeeccttiioonnss cchheezz llaa ssoouurriiss
Le suivi reste le même pour tous les protocoles. Les frottis sanguins sont réalisés aux
temps H0 (à jour3 post-infection et juste avant traitement), H1h30, H5, H24 et H48 (après
traitement). Les parasites sont observés sur des frottis sanguins minces monoérythrocytaires
réalisés par prélèvement d’une goutte de sang à la queue de la souris. Les lames ainsi obtenues
sont fixées au méthanol 5 minutes, puis on les dépose dans une cuve contenant une solution de
GIEMSA 10% diluée avec du tampon phosphate (5g NaHPO4, 7H2O, 2g KH2PO4 pour un litre
d’eau déminéralisée ; pH 7.2). Après coloration pendant 45 minutes, les lames sont rincées sous
l’eau et séchées à l’air libre. Les noyaux des parasites sont colorés en rouge, le cytoplasme en
bleu et les pigments malariques en brun (Annexe 1).
![Page 85: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/85.jpg)
84
IIIIII.. 22.. 44.. EEttuuddee qquuaannttiittaattiivvee ddeess eeffffeettss ddeess ttrraaiitteemmeennttss ssuurr llaa
ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee
Les trois paramètres de mesure sont les suivants :
- L’indice parasitaire mesure la parasitémie, c'est-à-dire le nombre de parasites intracellulaires
(quelqu’en soit le stade) pour 100 hématies
- L’indice gamétocytaire ou gamétocytémie dénombre les gamétocytes pour 100 hématies
parasitées.
- L’indice de gamétocytogénèse est le ratio de la gamétocytémie à la parasitémie.
� Protocole 1 : comparer l’effet d’une dose unique et de 2 doses subcuratives sur la
gamétocytogénèse.15 souris sont infectées par voie intrapéritonéale (IP) avec un volume
de 150 µL de sang stocké, soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en trois
lots de 5 souris chacun. A jour 3, le lot 2 est traité par une cure unique de ferroquine (à la
dose infracurative de 5 mg /kg, « Delhaes et al., 2001 » ) et le lot 3 est traité avec deux
doses identiques de ferroquine ; les souris du lot 1 sont les souris témoins ; ayant reçu de
l’eau distillée, elles développent normalement la maladie.
� Protocole 2 : effets comparatifs de la ferroquine et de l’artésunate. Quinze souris sont
infectées par un volume de 150 µL du stock de sang par voie intrapéritonéale (IP). Elles
sont réparties en trois lots de 5 souris. A jour 3, le lot 2 et le lot 3 sont traités par la
ferroquine (à la dose infracurative de 5 mg /kg) et le lot 3 par l’artésunate à la même
dose ; les souris du lot 1 sont témoins.
� Protocole 3 : effet de l’association des artésunate-ferroquine sur la gamétocytogenèse.
Dix souris sont infectées par un volume de 150 µL par voie intrapéritonéale (IP), soit 106
hématies parasitées. Les souris sont réparties en deux lots de 5 souris. A jour 3, le lot 2
est traité par l’association artésunate-ferroquine (à la dose infracurative de 5 mg /kg pour
chaque traitement, soit 90 µL de chaque un) ; les souris témoins parasitées n’ont rien
reçu.
� Protocole 4 : comparaison de trois doses d’artésunate (5mg /kg, 10mg/kg et 50mg/kg)
sur la gamétocytogénèse ; 20 souris sont infectées par un volume de 150 µL de stock de
sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties
en 4 lots de 5 souris chacun. A jours 4, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec l’artésunate aux
![Page 86: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/86.jpg)
85
doses respectives de 5 mg /kg (60 µL), 10 mg/kg (120 µL) et 50mg/kg (200 µL) ; et le lot
4 joue le rôle de témoin positif parasité non traité.
� Protocole 5 : comparaison des deux doses infracuratives de 5mg /kg et de 10mg/kg pour
l’artésunate et la ferroquine ; 36 souris sont infectées par un volume de 200 µL de stock
de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont
réparties en quatre lots de 7 souris chacun, le cinquième lot étant de 8 souris (T+). À jour
4 les lots 1 et 2 sont traités avec la ferroquine (à la dose infracuratives de 5 mg /kg
(100 µL) et de 10 mg/kg (200 µL) ; les lots 3 et 4 avec l’artésunate à la mêmes dose, le
lot 5 étant témoin.
IIIIII.. 22.. 55.. EEttuuddee qquuaalliittaattiivvee ddeess eeffffeettss ddeess ttrraaiitteemmeennttss ssuurr ::
IIIIII.. 22.. 55.. 11.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess ((aallttéérraattiioonnss
mmoorrpphhoollooggiiqquueess eett ccoolloorriimmééttrriiqquueess)) eett llee ppoouurrcceennttaaggee
ddeess ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss
IIIIII.. 22.. 55.. 11.. aa)) OObbsseerrvvaattiioonn mmiiccrroossccooppiiqquuee ddeess ggaammééttooccyytteess
Au cours de ces protocoles, une partie des échantillons a été utilisée pour observer en
microscopie l’aspect morphologique des gamétocytes.
1. Microscopie Photonique
La lame est installée sur le portoir du microscope, avec une goutte d’huile à immersion et
examinée à l’objectif 100. Toute la lame a été lue, on a apprécié les gamétocytes altérés à l’aide
des critères morphologiques et colorimétriques, taille, pigmentation, coloration du noyau et du
cytoplasme.
2. Microscopie Electronique
Deux gouttes de sang on été prélevées au niveau de la queue de la souris et sont mêlées à
0.5 mL de fixateur TRUMP (constitué de paraformaldéhyde à 4% et de glutaraldéhyde à 1%).
Les échantillons sont ensuite lavés par une série de 5 à 10 centrifugations successives, le
surnageant étant éliminé entre chaque opération et remplacé par une solution de rinçage de
même pH que le fixateur Trump. Les lipoprotéines des membranes biologiques sont ensuite
fixées par un ajout de tétraoxyde d’osmium OsO4. Les échantillons sont alors rincés puis
déshydratés progressivement dans des bains d’éthanol de plus en plus concentrés (500 à 100°)
![Page 87: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/87.jpg)
86
pendant 5 à 20 minutes, puis dans deux bains d’oxyde de propylène pendant 30 minutes. Par la
suite, les échantillons sont plongés dans un bain de propylène et d’Epon durant 2 heures. Les
pièces sont incluses dans le milieu à l’Epon pendant une nuit à 4°C. Elles sont ensuite déposées
dans une gélule incolore contenant la résine propre. La polymérisation de celle-ci dure 48 heures
à 60°C. Les gélules sont alors suffisamment solides pour être coupées à l’ultramicrotome. Des
coupes semi-fines (0.5 microns) sont d’abord réalisées, puis des coupes ultrafines (70 à 90nm)
qui sont alors recueillies sur des grilles de cuivre de 3 mm de diamètre. Les coupes ultrafines
sont contrastées à l’acétate d’uranyle, dans l’alcool méthylique, puis dans le citrate de plomb.
Elles sont ensuite observées après quelques heures de séchage.
IIIIII.. 22.. 55.. 11.. bb)) PPrroottooccoolleess
� Protocole I : L’effet de 3 doses d’artésunate sur la morphologie et le pourcentage des
gamétocytes : 12 souris sont infectées par un volume de 200 µL de solution stock de sang par
voie intrapéritonéale (IP) soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en quatre lots
de 3 souris chacun. A jour 3, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec l’artésunate aux doses de 5
mg /kg, 10 mg/kg et 50mg/kg, soit respectivement 60, 120 et 220 µL. Le lot 4 est celui des
souris témoins parasitées non traitées.
� Protocole II : L’effet de 3 doses de ferroquine sur la morphologie et le pourcentage des
gamétocytes : 9 souris sont infectées avec 200 µL de solution stock de sang par voie
intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en 3 lots de 3
souris chacun. A jour 3, les lots 1, 2 et 3 sont traités avec la ferroquine aux doses de 5, 10 et
50 mg/kg.
� Protocole III : L’effet des doses 5 et 10mg/kg de la ferroquine et de l’artésunate sur la
morphologie et le pourcentage des gamétocytes : 36 souris sont infectées par un volume de
200 µL de solution stock de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées.
Les souris sont réparties en quatre lots de 7 souris chacun et le cinquième lot est de 8 souris
(T+). À jour 4, les lots 1 et 2 sont traités pae la ferroquine aux doses infracuratives de 5
mg /kg (100 µL), de 10 mg/kg (200 µL) ; les lots 3 et 4 : 5mg/kg (100 µL) et 10mg/kg (200
µL) d’artésunate. Le lot 5 est le lot témoin parasité non traité.
� Protocole IV : L’effet des doses 5, 10 et 50 mg/kg de la ferroquine et de l’artésunate sur la
morphologie et le pourcentage des gamétocytes : 21 souris sont infectées par un volume de
200 µL de solution stock de sang par voie intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées.
Les souris sont réparties en 7 lots de 3 souris chacun. A jour 4 les lots 1, 2 et 3 sont traités
par la ferroqine à la dose 5 mg /kg (60 µL) 10 mg/kg (120 µL) et 50mg/kg (220 µL) et les
![Page 88: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/88.jpg)
87
lots 4, 5 et 6 par l’artésunate (mêmes doses) ; et le lot 10 est un témoin positive parasité non
traité.
IIIIII.. 22.. 55.. 22.. LL’’iinnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee
IIIIII.. 22.. 55.. 22.. aa)) ÉÉlleevvaaggee ddeess mmoouussttiiqquueess
La méthode d’élevage d’A. stephensi a été adaptée de la méthode de Shute et Marion
(1966). La température et l’humidité relative de l’insectarium sont de 25-26 °C et de 80%
respectivement. Les stades larvaires sont nourris avec des croquettes pour chien ou des biscuits
canins réduits en poudre (sans poisson dans leur composition) et maintenus dans des cuvettes
contenant de l’eau déchlorurée, jusqu’à l’apparition des nymphes. Une fois la mue effectuée et
après émergence, les adultes sont transférés, à l’aide d’un aspirateur, dans une cage où ils sont
nourris avec une solution de saccharose à 5% et gorgés sur un lapin anesthésié une fois par
semaine. Les femelles pondent sur des supports de papier buvard humide environ trois jours
après l’émergence et les pontes sont collectées, puis transférées dans une nouvelle cuvette d’eau.
On conserve les adultes dans des cages autoclavables de 50x50x50 cm et il existe dans chaque
cage des expériences vers 30 femelles âgées de 5à 7 jours.
IIIIII.. 22.. 55.. 22.. bb)) LLee ggoorrggeemmeenntt ddeess mmoouussttiiqquueess
Les souris sont anesthésiées avec une solution de kétamine, afin qu’elles restent
immobiles, puis elles sont déposées sur une cage contenant environ 30 moustiques femelles. Ces
derniers viennent se gorger sur les souris pendant 45 minutes. L’expérience est réitérée une heure
et 30 minutes après le traitement, ce qui correspond à la concentration plasmatique maximale de
la thérapeutique. Les souris sont de nouveau mises collectivement ou individuellement en
contact avec une trentaine de moustiques. De nouveaux moustiques sont mis à gorger, de la
même façon, sur les mêmes souris 5 heures après le traitement. Les frottis sanguins sont réalisés
avant chaque repas sanguin. Les frottis sanguins et le gorgement réalisé à H0 serviront de
témoins.
Les cages contenant les moustiques gorgés sont conservées dans l’insectarium du MNHN
pendant 7 à 9 jours pour laisser le temps aux oocystes de se développer (les oocystes éclatant au
bout de 10 jours pour libérer les sporozoïtes infectant qui gagneront les glandes salivaires).
![Page 89: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/89.jpg)
88
IIIIII.. 22.. 55.. 22.. cc)) DDiisssseeccttiioonn ddeess mmoouussttiiqquueess ggoorrggééss
Elle a lieu huit jours après avoir gorgé les moustiques femelles sur des souris anesthésiées
L’extraction du tube digestif des moustiques femelles est réalisée en étirant les deux extrémités
de l’abdomen à l’aide de deux pinces fines sous loupe binoculaire (Figure 15). Pour l’évaluation
de l’infestation des femelles après gorgement, les tubes digestifs sont disséqués dans une
solution de mercurochrome dilué à 3% dans du tampon « Phosphate Buffer Saline » (PBS), on
observe et compte immédiatement les oocystes sur la paroi du tube digestif par examen
microscopique (X40). Deux paramètres d’évaluation de l’infection sont établis :
� Le pourcentage de moustiques infectés dans chaque lot,
� Le comptage des oocystes sur le tube digestif pour chaque moustique.
IIIIII.. 22.. 55.. 22.. dd)) PPrroottooccoolleess
� Protocoles I, II, III : Etude de l’effet de la thérapeutique à la dose infracurative sur le
développement des gamétocytes chez le moustique. Les souris sont infectées par un
volume de 100 µL de stock de sang contaminé par voie intrapéritonéale (IP), soit 106
hématies parasitées. A jour 3, elles sont traitées avec l’antipaludique par voie orale. Les
souris sont ensuite anesthésiées de façon à ce que les moustiques puissent se gorger
complètement. Le gorgement a lieu pendant une demi-heure dans une cage contenant une
quarantaine de moustiques. La thérapeutique est administrée, puis l’expérience est
réitérée 1h30 après le traitement, ce qui correspond à la concentration plasmatique
maximale de la thérapeutique. Les souris sont de nouveau mises en contact avec une
quarantaine de moustiques qui se gorgent pendant une demi-heure. 5 heures après
administration de la thérapeutique, de nouveaux moustiques sont mis à gorger sur les
mêmes souris pendant une demi-heure. Dans chaque case, on retire les moustiques mâles
à l’aide d’un captateur.
o Protocole I : 5 souris traitées à la ferroquine 5 mg/kg
o Protocole II : 10 souris, dont 5 traitées à la ferroquine 5 mg/kg et, 5 témoins.
o Protocole III : 5 souris traitées à l’artésunate 5 mg/kg
o Protocole IV : Étude de l’effet de la ferroquine et de l’artésunate (10 mg/kg) sur la
transmission. 14 souris sont infectées par un volume de 200 µL par voie
intrapéritonéale (IP), soit 106 hématies parasitées. Les souris sont réparties en 2 lots
de 7 souris chacun pour chaque thérapeutique. Les 14 souris sont traitées comme
précédemment.
![Page 90: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/90.jpg)
89
Figure 15. Schéma de l’extraction du tube digestif du moustique. (d’après P.F. Russell et al, 1963, Practical malariology, avec la permission d’Oxford Univ. Press).
o Protocole V : Étude de l’effet de l’artésunate, de la ferroquine et de leur association
(une dose ou trois doses) sur le développement des gamétocytes chez le moustique.
12 souris infectées par 100 µL de stock de sang contaminé par voie intrapéritonéale
(IP), soit 106 hématies parasitées, sont réparties en 4 lots. Le lot1 est traité. Les jours
1 et 2 avec une dose de l’association artésunate-ferroquine. Comme dans les
protocoles précédents, à jour 3, toutes les souris sont anesthésiées puis mises à
gorger pour les moustiques. Une souris de chaque lot non traité (H0) est au préalable
choisie comme témoin. Les lots 2, 3 et 4 reçoivent respectivement chacun une dose
d’AX, de FQ et de l’association AX+FQ pendant que le lot1 reçoit sa troisième dose
d’AX+FQ. Les doses de thérapeutique injectées sont de 5mg/kg pour chaque
traitement. Les gorgements ont été effectués à H0 (3 souris témoins) et à H3 pour les
4 lots où les souris sont mises en contact avec une quarantaine de moustiques qui se
gorgent pendant une demi-heure.
![Page 91: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/91.jpg)
90
Troisième partie :
Résultats
![Page 92: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/92.jpg)
91
Les résultats de ce travail se rapportent aux deux parties du cycle de Plasmodium :
I. le stade hépatique,
II. le stade sexué.
Cette étude a amené deux équipes, l’une parisienne et l’autre tourangelle, à travailler côte à
côte. Les résultats rapportés sont le fruit de mon intégration successive à ces équipes de
recherche :
le Service de Parasitologie-Mycologie-Médecine Tropicale de Tours, responsable du
sujet et de l’élaboration de ma thèse
le Muséum National d’Histoire Naturelle de Paris, où j’ai pu profiter de stages sur
l’approche entomologique (disséquer les moustiques, pour extraire leurs estomacs et
compter après identification les oocytes qui s’y fixent et les glandes salivaires pour
étudier les sporozoïtes prêts à infecter) et où, par ailleurs, j’ai pu mener à bien le travail
sur le cycle parasite-souris pour suivre le développement du stade hépatique et du stade
sexué érythrocytaire.
L’ensemble des résultats sera donc présenté en deux parties :
� I- La première partie montre l’efficacité des différents antipaludiques, seuls ou en
association, sur la forme intra-hépatique des parasites à l’aide de la technique de PCR
quantitative en temps réel (QT - PCR). Cette technique de biologie moléculaire permet la
détection d’éventuels développements parasitaires dans le foie de souris après
administration des antipaludiques étudiés.
� II- La deuxième partie analyse la gamétocytogénèse et la transmission de l’hôte au
moustique. Elle se présente en deux sous-chapitres :
1. le premier sous-chapitre est consacré à l’étude des effets quantitatifs des deux
antipaludiques, ferroquine et artésunate, sur la gamétocytogénèse. On mesure la
gametocytémie et la gamétocytogénèse deux jours avant et après avoir administré les
deux antipaludiques en doses uniques ou doubles, seuls ou associés,
2. le deuxième sous-chapitre est consacré à l’étude qualitative des effets des deux
antipaludiques : en dose unique ou multiple, sur l’infectivité des gamétocytes traités
chez le moustique. On observa avec précision l’altération qualitative des gamétocytes
dans le sang circulant chez l’hôte, ainsi que et leurs altération morphologique après
administration des antipaludiques et leur développement en oocystes dans l’estomac
de moustique.
![Page 93: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/93.jpg)
92
CChhaappii ttrree 11 -- LLee ssttaaddee hhééppaattiiqquuee
L’ensemble des résultats de cette partie vise une meilleure connaissance de l’activité des
antipaludiques, seuls et associés, sur le stade parasitaire hépatique, par l'étude de de divers
antipaludiques utilisés seuls et en association : Malarone®, primaquine, amodiaquine, ferroquine,
et artésunate. Son but est de mesurer la réduction du développement parasitaire dans le foie de
l’hôte. Cette étude est basée sur l’utilisation de la technique de PCR quantitative en temps réel.
Les premiers protocoles ont été menés pour fixer une référence et préciser les différentes actions
possibles des molécules choisies. L’analyse des résultats obtenus sera faite en fonction des
protocoles réalisés.
.
PPrroottooccoollee II :: ddéétteerrmmiinnaattiioonn dd’’uunnee rrééfféérreennccee
Le but du premier protocole est de déterminer le produit qui pourrait être considéré comme
référent en terme d’activité sur le stade intra-hépatique.
Dans ce protocole, chaque souris est infestée par 10 000 sporozoïtes. L’infestation est
considérée efficace quand les souris contrôles présentent une charge parasitaire détectable en
PCR (> 10 parasites/µL).
Au cours de la réaction QT-PCR, dans les échantillons correspondant aux foies provenant
des souris traitées par la Malarone® (association d’atovaquone et de proguanil), il n’a pas été
permis de détecter de formes intrahépatiques dans les limites de sensibilité de la technique, à la
suite des 50 cycles d’amplification (Figures 16, 17). On a eu des résultats comparables avec les
composants de la Malarone® : atovaquone et proguanil. La Malarone® comme ses deux
composants aurait un effet sur le développement des stades intra-hépatiques (corps bleus).
Les échantillons venant de foies de souris traitées ont des charges parasitaires plus faibles
que celles des souris contrôle, avec une grande significativité pour les souris traitées par la
Malarone® ou ses composants. En revanche, aucune différence significative (au risque 5%), n’a
été notée entre les stades hépatiques des souris traitées avec la Malarone® ou ses composants et
ceux des souris traitées avec la primaquine.
Dans les protocoles qui suivent, la Malarone® sera utilisée comme thérapeutique de
référence.
![Page 94: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/94.jpg)
93
Figure 16. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles
Figure 17. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (PQ = Pimaquine ; MAL = Malarone© ; ATVQ = Atovaquone ; PG = Proguanil ; Contrôle = souris infestées non traitées ; ▬ = seuil de détection : log (10 parasite/*L)
![Page 95: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/95.jpg)
94
PPrroottooccoollee IIII :: ééttuuddee ddee pprriinncciippeess aaccttiiffss pprriiss iissoolléémmeenntt
Ce second protocole a pour but de déterminer l’activité sur les formes parasitaires
hépatiques de différents principes actifs, la ferroquine (FQ), l’artésunate (AX) et l’amodiaquine
(AQ) qui pourraient dans l'avenir être associées selon les normes conseillées par l’OMS (ACT).
45000 sporozoïtes sont injectés pour chaque souris. Le développement parasitaire dans le
globule rouge est suivi par l’étude des frottis sanguins quotidiennement pendant une semaine,
afin de confirmer que l’infestation a bien pu avoir lieu. Seules les souris traitées par la
Malarone® restent négatives (après recherche de formes parasitaires intraérythrocytaires au
microscope optique sur 50 champs à l’objectif x100, à l’immersion).
Les résultats obtenus pour la Malarone®, prise comme référence, confirment ceux du
premier protocole (Figures 18, 19). Une différence significative a été notée entre les stades
hépatiques des souris contrôles et ceux des souris traitées (au risque 5%).
Contrairement au premier protocole, les résultats obtenus avec la primaquine montrent une
différence significative avec le développement des stades hépatiques des souris contrôles, mais la
lecture de frottis sanguins et le suivi de la parasitémie ont été positifs chez les souris traitées.
Significativement, les stades hépatiques restent plus nombreux chez les souris traitées avec
l’artésunate que chez les souris contrôle.
Aucune différence significative n’a été trouvée, par contre, entre les stades hépatiques des
souris traitées par les deux thérapeutiques, ferroquine et amodiaquine, et ceux des souris de
contrôle.
La Malarone® reste le produit le plus efficace et totalement efficace, comparé aux autres
produits actifs : artésunate, amodiaquine et ferroquine qui, testés seuls, ne présentent pas
d’efficacité décelable par la technique de PCR quantitative en temps réel.
.
![Page 96: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/96.jpg)
95
Figure 18. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles
Figure 19. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (PQ = Pimaquine ; MAL = Malarone© ; AQ = Amodiaquine ; AX = Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées).
Protocole II
0
1
2
3
4
FQ AX MAL PQ AQ Contrôle
Drogues
Sta
des
hépa
tique
s
(loga
rithm
e de
la c
harg
e
para
sita
ire)
![Page 97: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/97.jpg)
96
PPrroottooccoollee IIIIII :: ééttuuddee ddeess aassssoocciiaattiioonnss tthhéérraappeeuuttiiqquueess
Dans ce protocole préliminaire, 20000 sporozoïtes sont injectés pour chaque souris. La
réussite de l’infestation est confirmée par les frottis sanguins des souris maintenues en vie dans
chaque lot.
Conformément aux deux protocoles précédents, l’activité de la Malarone® sur les formes
hépatiques est confirmée.
Par contre, l’administration des associations artésunate + amodiaquine (AX+AQ) et
ferroquine + artésunate (FQ+AX) ne montre pas d’efficacité suffisante sur les stades hépatiques
de P. y. yoelii (Figures 20, 21). Il n’existe pas de différence significative entre les stades
hépatiques des souris contrôles et ceux des traitées avec les associations (AX+AQ) ou
(FQ+AX).
PPrroottooccoollee IIVV :: ééttuuddee ddeess aassssoocciiaattiioonnss tthhéérraappeeuuttiiqquueess eenn ccuurreess mmuullttiipplleess
À la suite des résultats des expériences précédentes, on a été conduit à réaliser un
quatrième protocole pour étudier à nouveau les mêmes associations à des doses différentes et
répétées. 80 000 sporozoïtes ont été injectés à chaque souris.
Les souris des lots traités avec artésunate, association artésunate + amodiaquine (AX+AQ)
et association ferroquine + artésunate (FQ+AX), ont reçu deux doses (même dose et même voie),
la deuxième dose étant administrée sept heures après la première.
L’analyse graphique (Figures 22, 23) et statistique des résultats obtenus a confirmé a
nouveau l’activité de la Malarone®.
Aucune différence significative n’a été notée (au risque 5%) entre la quantification des
stades hépatiques des souris contrôles et celle des souris traitées par l’association (AX+AQ).
En revanche, on a retrouvé des différences significatives entre l’artésunate (AX) et
l’association (FQ+AX).
![Page 98: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/98.jpg)
97
Figure 20. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles.
Figure 21. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques. (MAL = Malarone© ; AX =Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées)
P ro toco le III
0
1
2
3
4
MAL AX+AQ F Q +AX Contrô le
Drogues
stad
es h
épat
ique
s
(loga
rithm
e de
la c
harg
e
para
sita
ire)
![Page 99: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/99.jpg)
98
Figure 22. Intensité de fluorescence du SYBR® Green en fonction du nombre de cycles
P ro toco le IV
0
1
2
3
4
A X+A Q A X FQ+A X M A L Contrôle
Drogues
Sta
des
hépa
tique
s
(loga
rithm
e de
la c
harg
e
para
sita
ire)
Figure 23. Stades hépatiques détectés par PCR quantitative en temps réel après traitement avec différents antipaludiques.
![Page 100: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/100.jpg)
99
Avec 2 ème dose d’AX pour (AX+AQ, AX et FQ+AX) à 7 h d’intervalle. (MAL = Malarone ; AX =Artésunate ; FQ = Ferroquine ; Contrôle = souris infestées non traitées).
L’analyse comparative effectuée entre l’artésunate et FQ+AX face à la Malarone® sur les
stades intra-hépatiques est toujours en faveur de la Malarone®.
Le test Student n’a pas permis de montrer de différences significatives entre les souris
ayant reçu double dose d’artésunate et celles n’en ayant reçu qu’une dose.
L’addition d'une deuxième dose n’expliquerait pas la différence des résultats trouvés avec
les souris traitées par l’artésunate et celles par l’association ferroquine + artésunate, dans les
protocoles III et IV.
Enfin, l'étude des extraits en duplicate ne met pas en évidence une différence significative
entre les stades hépatiques de deux prélèvements différents sur un foie. La répartition des corps
bleus parait donc globalement homogène.
Conclusions générales sur les résultats obtenus
sur le stade hépatique :
� La MALARONE® (atovaquone et proguanil) présente une efficacité totale
sur le stade hépatique dans la limite de sensibilité de la technique (seuil : 9
parasite/µL).
� L’efficacité de la primaquine à la dose 20mg/kg sur le stade hépatique est
partielle.
� L’amodiaquine, l’artésunate, la ferroquine et leurs associations manquent
d’efficacité.
![Page 101: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/101.jpg)
100
CChhaappii ttrree 22 -- LLee ssttaaddee sseexxuuéé :: llaa
ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee eett llaa ttrraannssmmiissssiioonn dduu
ppaalluuddiissmmee
AA// ETUDE QUANTITATIVE DES EFFETS DES TRAITEMENTS SUR LA GAMETOCYTOGENESE
Cette partie a pour but d’étudier l’efficacité des antipaludiques sur la gamétocytogénèse et
les gamétocytes circulants. Les différents protocoles précisent l’effet qualitatif de la ferroquine et
de l’artésunate ou de leur association, à différentes doses, unique et double, sur la
gamétocytogénèse et la gamétocytémie.
PPrroottooccoollee II :: ééttuuddee ddee ll’’eeffffeett dd’’uunnee ddoossee uunniiqquuee eett ddee ddeeuuxx ddoosseess
ssuucccceessssiivvee «« ssuubbccuurraattiivveess »» ddee ffeerrrrooqquuiinnee ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee
A. Au troisième jour, dès l’apparition d’une parasitémie, on injecte le traitement (H0). La
figure 24 résume les résultats.
Les résultats des 3 lots (lot1 témoin, lot2 traité par dose unique de ferroquine 5mg/kg et
lot3 traité par deux doses de ferroquine 5mg/kg) comparent les différents indices, avant et après
traitement.
Les indices parasitaires des trois lots à 1 heure (H1) post-traitement (lot1 = 3.15,
lot2 = 2.68 et lot3 = 2.76), ont diminué de près de 15% dans les deux lots traités par rapport au
lot témoin. Cette diminution s’amplifie à 3 heures après traitement (H3), elle est de 15% pour le
lot traité avec une seule dose à 5mg/kg et de 20% pour le lot traité avec deux doses, comparé au
lot témoin (lot1 = 3.87, lot2 = 3.28 et lot3 = 3.07). Cinq heures après les traitements (H5), la
réduction de la parasitémie était de 5% pour les souris traitées avec une dose et d'environ 30%
pour les souris traitées avec deux doses, par rapport aux souris de contrôle (lot1 = 3.67,
lot2 = 3.47 et lot3 = 2.61).
![Page 102: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/102.jpg)
101
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H0 H1 H3 H5 H8 H22 H24 H48
Temps
% d
e p
ara
sité
mie
T+
FQ (1 CURE)
FQ (2 CURES)
Figure 24. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine)
À H8, les résultats par lot : lot1 = 3.78, lot2 = 3.56 et lot3 = 2.32, montraient une réduction
par rapport au lot témoin, réduction de 5% pour le lot traité avec dose unique et de 40% pour le
lot traité avec double dose. La réduction est significative dans le cas du lot traité par double cure
de ferroquine (P<0.01).
À partir de H22 (lot1 = 4.57, lot2 = 5.25 et lot3 = 3.4), H24 (lot1 = 4.57, lot2 = 6.08 et
lot3 = 4.32) et jusqu’à H48 (lot1 = 4.33, lot2 = 4.73 et lot3 = 3.23), la parasitémie des lots traités
avec une seule dose, a augmenté par rapport au témoin : 15%, 30% et 10% respectivement. La
parasitémie des lots traités avec double dose, reste toujours moins importante que celle du lot
témoin : à H22, H24 et H48, la réduction y était d'environ 25%, 5% et 25%.
B. Pour ce qui concerne la gamétocytémie (Figure 25), les traitements infracuratifs
expliquent ces premiers résultats attendus. Cet indice a augmenté à H1 post-traitement pour les
deux lots traités par rapport au lot témoin (lot1 =7.31, lot2 =9.58 et lot3 = 7.27) ; cette
augmentation était notable pour le lot traité avec une dose (30%), alors que l’augmentation pour
le lot traité avec double dose, était très faible (1%).
![Page 103: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/103.jpg)
102
0
5
10
15
20
25
H0 H1 H3 H5 H8 H22 H24 H48
Temps
% d
e g
am
éto
cyté
mie
T+
FQ (1 CURE)
FQ( 2 CURES)
Figure 25. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine)
À H3 (lot1 = 6.17, lot2 = 9.75 et lot3 = 8.76), l’augmentation pour les deux lots traités, par
rapport au lot témoin, était inférieure à 60% pour le lot traité à dose unique et de 40% pour le lot
traité à double dose.
À H5, concernant la gamétocytémie des lots traités, par rapport au lot témoin (lot1 =6.54,
lot2 =7.03 et lot3 = 11.65), et jusqu’à H8 (lot1 = 12.07, lot2 = 13.39 et lot3 = 14.1), on note une
augmentation pour le lot traité à dose unique : 20% à H5 et 10% à H8, alors que pour le lot traité
à double dose, on avait une augmentation de 80% à H5 de 15% à H8.
À H22 (lot1 = 8.85, lot2 = 6.41 et lot3 = 10.08) et H24 (lot1 = 6.29, lot2 = 4.53 et
lot3 = 9.39), la gamétocytémie du lot3 reste supérieure à celle des lots 1 et 2.
À H48 (lot1 = 2.92, lot2 = 2.38 et lot3 = 4.52), les gamétocytémies (dose unique)
diminuent, la gamétocytémie pour le lot traité à deux doses de ferroquine se maintient jusqu’à la
fin (55%).
C. L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse (Tableau 7) à H1 post-traitement était
d'environ 50% pour le lot2, 15% pour le lot3, par rapport au lot1. A H3 post-traitement, cet index
a fortement augmenté, d'environ 80% pour les lots 2 et 3 par rapport au lot1.
![Page 104: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/104.jpg)
103
Index de gamétocytogénèse (gamétocytèmie/parasitémie)
Témoin ferroquine 5mg/kg Heures- post
traitement 1 cure 2 cures
H0 1.62 ± 0.37 3.00 ± 1.11 2.02 ± 2
H1 2.32 ±0.24 3.57 ± 2.55 2.69 ± 1.69
H3 1.60 ±1.35 2.96 ± 1.90 2.85 ± 1.59
H5 1.78 ± 0.70 2.32 ± 0.88 4.47 ± 3.97
H8 3.19 ± 2.28 3.78 ± 3.01 6.10 ± 3.55
H22 1.93 ± 1.86 1.22 ± 1.23 2.96 ± 1.12
H24 1.38 ± 1.05 0.75 ± 0.61 2.18 ± 4.22
H48 0.67 ± 1.31 0.50 ± 1.42 1.40 ± 1.86
Tableau 7. Étude de l’effet de la dose unique et de 2 doses subcuratives successives de ferroquine sur la gamétocytogénèse
A H5, l’index de gamétocytogénèse augmentait d'environ 30% pour le lot2 et de 150%
pour le au lot3 par rapport au lot1. Son augmentation à H8 était d’environ 20% pour le lot2 et de
90% pour le lot3 par rapport au lot1. Mais pour le lot2, l’index a diminué à H22 et jusqu’à H48,
de manière plus franche que pour le lot3.
L’index de gamétocytogénèse a donc fortement augmenté pour le lot2 à H3 (80%), alors
qu’il était de 150% pour le lot3 à H5.
Ce protocole permet une heureuse conclusion :
La double dose subcurative de ferroquine (5m/kg) a un effet plus important sur
l’index de gamétocytogénèse qu’à dose unique.
D’autre part, le pic d’augmentation de l’index de gamétocytogénèse est observé
8 heures (H8) après le traitement.
![Page 105: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/105.jpg)
104
PPrroottooccoollee IIII :: ééttuuddee ccoommppaarraattiivveess ddeess eeffffeettss ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee
ll’’aarrttééssuunnaattee eenn ddoosseess ssuubbccuurraattiivveess
A. La parasitémie (Figure 26) au troisième jour à H1 post-traitement a diminué pour les
deux lots traités (avec la ferroquine 5mg/kg (lot2=2.49) et l’artésunate 5mg/kg (lot3=2.47)) de
près de 30% (27%) par rapport au lot témoin (lot1= 3.43).
Trois heures (H3) plus tard, la parasitémie, pour le lot traité par la ferroquine, a diminué de
15%, et, pour le lot traité par l’artésunate, de 20% (lot1 =3.49, lot2 = 2.90 et lot3 = 2.76).
A H5, la diminution de la parasitémie du lot traité par la ferroquine, par rapport au lot
contrôle, était d’environ 20%, alors que la parasitémie du lot traité par l’artésunate
(significativité, P<0.01), était de 40% par rapport au lot témoin (lot1=4.93, lot2= 3.85 et
lot3=6.87).
À H24 (lot1=2.27, lot2= 3.17 et lot3 =2.44), on observe une augmentation de la
parasitémie des deux lots traités par rapport au lot témoin : 40% pour le lot traité par la
ferroquine et 10% pour le lot traité par l’artésunate.
B. La gamétocytémie (Figure 27) à la première heure (H1) post-traitement a augmenté
parallèlement dans les deux lots traités par rapport au lot témoin, soit de 95% (lot1=2.87, lot2=
5.68 et lot3=9.76).
A H3 (lot1=14.26, lot2= 13.39 et lot3=18.93), on note une légère baisse de la
gamétocytémie du lot traité par la ferroquine par rapport au lot témoin, alors que celle du lot
traité par l’artésunate a augmenté de près de 30%.
Cinq heures (H5) après le traitement, la gamétocytémie (lot1=2.77, lot2= 13.77 et
lot3=5.37) a augmenté fortement pour les deux lots traités, d’environ 400% pour celui traité par
la ferroquine (significative< 0.02) et de 95% pour celui traité avec l’artésunate.
Une chute de la gamétocytémie est remarquée dès H 24 post-traitement (lot1=5.46, lot2=
2.61 et lot3=4.81) pour les deux lots traités par rapport au lot témoin (près de 50% pour le lot
traité par la ferroquine et de 10% pour la chute le lot traité par l’artésunate).
C. L’index de gamétocytogénèse (Tableau 8) à H1 post-traitement a augmenté, pour les
deux lots des souris traitées avec la ferroquine et l’artésunate (lot1 et 2), de presque 200%
(170%) par rapport au lot témoin.
![Page 106: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/106.jpg)
105
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
H0 H1 H3 H5 H24
Temps
% d
e p
ara
sité
mie
T+
FQ
AX
Figure 26. Évolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine ; AX = artésunate)
0
5
10
15
20
25
30
H0 H1 H3 H5 H24
Temps
% d
e g
am
éto
cyté
mie
T+
FQ
AX
Figure 27. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; FQ = ferroquine ; AX = artésunate)
![Page 107: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/107.jpg)
106
Index de gamétocytogénèse
(gamétocytèmie/parasitémie)
T+ FQ 5mg/kg AX 5mg/kg
H0 1.18 ± 0.90 3.29 ± 2.76 4.98 ± 4.84
H1 2.39 ± 2.10 6.42 ± 8.85 6.48 ± 8.82
H3 4.09 ± 2.70 4.52 ± 2.30 6.86 ± 1.92
H5 0.56 ± 0.35 3.58 ± 4.11 0.78 ± 0.96
H24 2.41 ± 1.36 0.82 ± 1.10 1.97 ± 2.18
Tableau 8. Étude de l’effet de doses subcuratives de ferroquine et d’artésunate sur la gamétocytogénèse
A H3, l’index de gamétocytogénèse pour les lots 2 et 3 est toujours en augmentation par
rapport au lot témoin (10% pour le lot2 et 65% pour le lot3 (significative P<0.02).
L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse est la plus importante à H5, soit 500%
pour le lot2 (significative P<0.04) et 40% pour le lot3 par rapport au lot témoin. A H24, l’index
de gamétocytogénèse du lot1 est plus important que pour le lot 2 (190%), et de 20% supérieur au
lot3.
Conclusion de ce protocole :
La dose subcurative (5m/kg) de ferroquine et d’artésunate a un effet sur la
gamétocytogénèse dès la première heure post traitement. Cet effet continue jusqu'à H3
pour l’artésunate.
PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee ll’’aassssoocciiaattiioonn aarrttééssuunnaattee--ffeerrrrooqqiinnee ssuurr llaa
ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee
A. La parasitémie (Figure 28) du lot traité par association de ferroquine et d’artésunate à
doses infracuratives a augmenté de H1 (témoin : lot1= 6.05 / lot2=5.04) jusqu’à H24 (lot1 =3.32
![Page 108: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/108.jpg)
107
0
2
4
6
8
10
12
14
H0 H1 H3 H5 H8 H24 H48
Temps
% d
e p
aras
itém
ieT+
AXFQ
Figure 28. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; AX FQ = artésunate + ferroquine)
et lot2 = 4.26) par rapport à celle du lot témoin, mais à H48, la parasitémie du lot traité est plus
faible (3%) que celle du lot témoin.
B. La gamétocytémie (Figure 29) du lot traité par association de ferroquine et d’artésunate
a très peu augmenté par rapport au lot témoin (lot1=2.46 et lot2= 3.08), et elle diminue à H3
(lot1=4.8 et lot2= 4.66) et H5 (lot1=4.55 et lot2= 3.72).
Par contre, à H8 (lot1=2.38 et lot2= 7.03) et H24 (lot1=1.05 et lot2= 3.87), elle augmente à
nouveau (d’environ 200% et 300% respectivement) comparativement au témoin.
C. L’index de gamétocytogénèse (Tableau 9), en général est faible dans les deux lots (traité
et non traité) ; l’index de gamétocytogénèse du lot2 a augmenté à H1 de 17% et a diminué à H3
et à H5 d’environ 3% et 42% respectivement, bien que l’index du lot2 par rapport au lot1 ait
augmenté jusqu’à 110% à H8. Mais à partir de H24 et H48, l’index de gamétocytogénèse était de
moins 1% pour les deux lots.
On en conclut que l’association ferroquine-artésunate (5mg/kg de chaque molécule)
diminue la gamétocytogénèse à partir de la huitième heure suivant la thérapeutique.
![Page 109: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/109.jpg)
108
0
2
4
6
8
10
12
14
H0 H1 H3 H5 H8 H24 H48
Temps
% d
e ga
mét
ocy
tém
ieT+
AXFQ
Figure 29. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps (T+ = témoin positif ; AX FQ = artésunate + ferroquine)
Index de gamétocytogénèse
(gamétocytèmie/parasitémie)
T+ AXFQ
H0 0.28 ± 0.30 0.58 ± 0.21
H1 0.41 ± 0.43 0.48 ± 0.92
H3 0.96 ± 0.90 0.93 ± 0.89
H5 1.16 ± 0.76 0.67 ± 0.81
H8 0.56 ± 0.45 1.19 ± 2.42
H24 0.32 ± 0.50 0.84 ± 1.39
H48 0.21 ± 0.19 0.12 ± 0.17
Tableau 9. Effet de l’association ferroquine–artésunate sur la gamétocytogénèse.
(dose de 5mg/kg pour chaque traitement)
![Page 110: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/110.jpg)
109
PPrroottooccoollee IIVV :: EEttuuddee ccoommppaarraattiivvee ddee ttrrooiiss ddoossaaggeess dd’’aarrttééssuunnaattee ((55mmgg //kkgg,,
1100mmgg//kkgg eett 5500mmgg//kkgg)) ssuurr llaa ggaammééttooccyyttooggéénnèèssee
A. A H1h30 post-traitement, la parasitémie (Figure 30) des lots traités avec deux dosages
d’artésunate : 5 mg/kg (lot2= 0.99) et 10 mg/kg (lot3=1.10), a augmenté par rapport au lot
témoin (lot1=0.97), alors qu’elle a diminué pour le lot dosé à 50mg/kg (lot4=0.91), qui est une
dose curative.
A H5, la parasitémie des 3 lots traités : 2, 3 et 4 (lot1= 1.22, lot2 =1.01, lot3 = 1.04 et lot4
= 1.06) a diminué de près de 15% par rapport au lot1.
A H24 post-traitement (lot1= 3.02, lot2 =2.18, lot3 = 2.11 et lot4 = 1.31), la réduction de la
parasitémie est importante : près de 30% pour les lots 2 et 3, et de 60% pour le lot 4
(significative P<0.0005). A la fin de l’expérience, à H48 (lot1= 3.94, lot2 =2.60, lot3 = 1.93 et
lot4 = 1.97), la réduction de la parasitémie reste importante.
B. La gamétocytémie (Figure 31) à H1h30 post-traitement (lot1= 2.33, lot2 =2.74, lot3 =
3.55 et lot4 = 3.56) a augmenté, pour les 3 lots traités, de 20% pour le lot2, de 55% pour les ots 3
et 4. Cinq heures plus tard (à H5) (lot1= 3.77, lot2 =4.35, lot3 = 6.89 et lot4 = 3.59), on note un
pic de la gamétocytémie des lots traités, notamment du lot 3 (10 mg/kg) dont la gamétocytémie a
augmenté de 80 %. À H24, l’augmentation de la parasitémie des lots 2 et 3 est d’environ 30% et
20% respectivement (lot1= 3.60, lot2 =4.69, lot3 = 4.27 et lot4 = 3.59). À la fin de l’expérience,
à H48 (lot1= 3.33, lot2 =5.62, lot3 = 2.64 et lot4 = 4.38), l’augmentation était d’environ 70%
pour le lot2 et de 30% pour le lot 4 par rapport au lot témoin.
C. A H1h30 post-traitement l’augmentation de l’index gamétocytogénèse (Tableau 10) des
trois lots traité avec les doses 5, 10 et 50mg/kg par rapport au lot témoin était de 15%, 35% et
65% respectivement. L’index de gamétocytogénèse a augmenté pour les trois lots traités quelle
que soit la dose jusqu’ à H48
Conclusion :
L’artésunate (5, 10 et 50mg/kg) a un effet majeur sur la gamétocytogénèse à H5 post
traitement surtout à la dose 5mg/kg.
![Page 111: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/111.jpg)
110
0
1
2
3
4
5
6
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
e p
ara
sité
mie
AX5mg
AX10mg
AX50mg
T+
Figure 30. Evolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps
(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; 3 dosages 5, 10 et 50mg/kg)
0
2
4
6
8
10
12
14
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
e g
am
éto
cyté
mie
AX5mg
AX10mg
AX50mg
T+
Figure 31. Evolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps.
(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; 3 dosages 5, 10 et 50mg/kg)
![Page 112: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/112.jpg)
111
Index de gamétocytogénèse
(gamétocytèmie/parasitémie)
AX5mg AX10mg AX50mg T+
H0 2.53 ± 3.37 5.2 ± 3.56 2.98 ± 3.73 5.17 ± 10.31
H1h30 2.77 ± 4.47 3.23 ± 4.44 3.91 ± 2.50 2.4 ± 5.11
H5 4.32 ± 12.24 6.64 ± 11.63 4.03 ± 4.59 3.08 ± 3.10
H24 2.15 ± 1.73 2.03 ± 7.20 2.74 ± 2.11 1.19 ± 1.11
H48 2.16 ± 3 1.37 ± 0.96 2.22 ± 2.24 0.84 ± 1.28
Tableau 10. Effet de 3 dosages (5, 10, 50 mg/kg) d’artésunate sur la gamétocytogénèse
PPrroottooccoollee VV :: CCoommppaarraaiissoonn ddeess ddeeuuxx ddoossaaggeess iinnffrraaccuurraattiivveess 55mmgg //kkgg eett
1100mmgg//kkgg dd’’aarrttééssuunnaattee eett ddee ffeerrrrooqquuiinnee
A. H1h30 après le traitement, la parasitémie (Figure 32) des deux lots d’artésunate à
5mg /kg 5 (lot2= 2.40) et 10 mg/kg (lot3= 2.33) a diminué de près de 30% par rapport au lot
témoin (lot1 = 3.35) ; pour les lots traités avec la ferroquine à 5mg/kg (lot4= 2.95)
l’augmentation est discrète. A H5 post-traitement, la parasitémie des lots 2 (2.42) et 4 (2.51) a
diminué de 30% par rapport au lot témoin. La parasitémie des lots 3 (2.05) et 5 (2.99) a diminué
de 43% et 20% respectivement, par rapport au lot1 (3.61) ; la diminution est significative avec le
lot2 (P=0.02). Vingt quatre heures après les traitements, la parasitémie a diminué mais pas avec
la ferroquine à 5mg/kg.
B. La gamétocytémie à H1h30 post-traitement (lot1= 5.42, lot2= 7.88, lot3= 3.6, lot4=
9.24 et lot5= 7.01) (Figure 33) a augmenté dans les lots 2, 4 et 5 (45%, 70% et 30%) par rapport
aux souris témoins ; la différence est significative avec le lot4 traité par la ferroquine à 5mg/kg
(P=0.05), alors que le nombre de gamétocytes chez les souris traitées avec l’artésunate à
10mg/kg a diminué. A H5 post-traitement (lot1= 7.14, lot2= 7.26, lot3= 7.40, lot4= 9.36 et lot5=
7.49), la gamétocytémie des lots 2, 3 et 4 est proche de celle des souris témoins du lot1. À partir
de H24 (lot1= 2.17, lot2= 5.17, lot3= 5.19, lot4= 3.11 et lot5= 6.08), le nombre de gamétocytes a
augmenté dans les lots 2, 3 et 5 de près de 140%, et l’on note une augmentation importante du
nombre de gamétocytes du lot4, par rapport au lot1.
![Page 113: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/113.jpg)
112
0
1
2
3
4
5
6
7
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
e p
ara
sité
mie
AX 5mg
AX10mg
FQ5mg
FQ10 mg
T+
Figure 32. Évolution de la parasitémie après traitement en fonction du temps.
(T+ = témoin positif ; AX = artésunate; FQ = ferroquine ; 2 dosages 5 et 10 mg/kg pour chaque traitement)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
e g
am
éto
cyé
mie
AX 5 mg
AX 10mg
FQ 5mg
FQ10mg
T+
Figure 33. Évolution de la gamétocytémie après traitement en fonction du temps.
(T+ = témoin positif ; AX = artésunate ; FQ = ferroquine ; 2 dosages 5 et 10 mg/kg pour chaque traitement)
![Page 114: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/114.jpg)
113
C. L’augmentation de l’index de gamétocytogénèse (Tableau 11) est notée dès H1h30
post-traitement, pour tous les lots traités, sauf pour le lot 3 qui, lui, a diminué de 15% par rapport
au lot1.
On peut remarquer à H5 post-traitement, une augmentation générale de tous les lots traités
par rapport au lot témoin. L’index de gamétocytogénèse de tous les lots diminue à H24 bien que
celui des lots traités soit toujours supérieur aux témoins. Celui du lot 4 est un peu supérieur à
celui du lot témoin.
Conclusions de ce protocole :
La ferroquine et l’artésunate (5, 10 mg/kg) ont un effet sur la gamétocytogénèse,
surtout à H5 post thérapeutique.
Conclusions générales sur l’étude quantitative des effets des traitements sur la
gamétocytogénèse :
� La ferroquine (5, 10 mg/kg) et l’artésunate (5, 10 et 50mg/kg), ont un effet quantitatif
sur l’index de gamétocytogénèse à partir de la première heure post traitement et
jusqu’à H24. La gamétocytogénèse est à son maximum 5 heures après la prise de
traitements.
� L’index de gamétocytogénèse est supérieur chez les souris traitées par deux et trois
dosages subcuratives de ferroquine successive, à celui mesurés chez les souris
traitées avec une dose unique.
� L’association ferroquine-artésunate a un effet quantitatif léger sur l’index de
gamétocytogénèse à partir de la huitième heure post thérapeutique
![Page 115: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/115.jpg)
114
Index de gamétocytogénèse
(gamétocytèmie/parasitémie)
ferroquine (mg/kg) artésunate (mg/kg)
Temps post-
traitement 5 10 5 10
control
H0 2.63 ± 2. 38 1.72 ± 0. 98 1.07 ± 1.1 2.64 ± 2.07 2.52 ± 2.04
H1h30 3.13 ± 2. 56 2.68 ± 2.72 3.28 ± 2.93 1.55 ± 2. 28 1.62 ± 1.07
H5 3.73 ± 7.37 2.51 ± 1.89 3 ± 2.52 3.61 ± 4.75 1.98 ± 2.9
H24 0.99 ± 3.17 1.98 ± 5.66 2.78 ± 3.14 3.05 ± 4.15 0.92 ± 0.94
H48 0.81 ± 0.93 0.22 ± 0.32 0. 31 ± 0.39 0.86 ± 1.67 0.62 ± 1.17
Tableau 11. Étude de l’effet de 2 dosages différentes d’artésunate et de ferroquine (5, 10mg/kg) sur la gamétocytogénèse
![Page 116: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/116.jpg)
115
BB// ETUDE QUALITATIVE DES EFFETS DES TRAITEMENTS SUR LES GAMETOCYTES
Qualitativement, l’effet des traitements sur les gamétocytes circulants, a été étudié dans deux
directions :
� L’étude des changements morphologiques des gamétocytes altérés par microscopie
optique et électronique.
� L’étude de l’infectivité des gamétocytes passés chez le moustique vecteur gorgé de sang
de souris traitées et non traitées.
II.. LLaa mmoorrpphhoollooggiiee ddeess ggaammééttooccyytteess cciirrccuullaannttss
L’analyse en microscopie par des techniques classiques d’étude des globules rouges a
permis de reconnaître les types d’altérations liés à l’agression des antipaludiques, principalement
la ferroquine et l’artésunate :
� En microscopie optique
L’examen des frottis sanguins révèle une dégénérescence rapide des gamétocytes
commençant 1heure après l’administration de traitement. On observe alors un regroupement des
grains de pigment en mottes ou amas, et un cytoplasme dont la coloration est très pâle par
rapport aux différents stades normaux des gamétocytes (Figure 34).
� En microscopique électronique
Le parasite semble s’extérioriser du globule rouge, on note des protrusions vers l’extérieur
dans la majorité des cas. L’analyse fine des structures parasitaires internes montre l’altération
des mitochondries et un aspect feuilleté et enroulé des membranes parasitaires (Figure 35).
![Page 117: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/117.jpg)
116
A)
B)
Figure 34. Gamétocytes altérés : femelles (A), mâles (B)
Figure 35. Gamétocytes de Plasmodium yoelii yoelii altérés dans l'hématie, 1h30 après traitement à la ferroquine 5mg/kg
![Page 118: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/118.jpg)
117
IIII.. LLee ppoouurrcceennttaaggee ddeess ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss
Plusieurs protocoles ont été menés pour estimer les pourcentages de gamétocytes altérés
(changements morphologiques et colorimétriques) avant et après le traitement par la ferroquine
et l’artésunate à doses différentes.
PPrroottooccoollee II :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee 33 ddoossaaggeess ((55,, 1100,, 5500 mmgg//kkgg)) dd’’aarrttééssuunnaattee
ssuurr llee ppoouurrcceennttaaggee ddee ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss
Le pourcentage d’altération (Figure 36) des gamétocytes pour le lot témoin est nul. Au
contraire, pour les lots ayant été traités, le pourcentage d’altération de gamétocytes a
globalement augmenté. Après H1h30, post-traitement, le pourcentage d’altération des
gamétocytes entre les 3 lots traités a été proche de 15% ; à H5 ce pourcentage par rapport à
H1h30 a diminué pour les deux doses 5 et 50mg /kg, mais a été supérieur avec le lot traité à la
dose de 10mg/kg. Le pourcentage d’altération des gamétocytes, vingt-quatre et quarante-huit
heures après le traitement, a été de 15% avec la dose de 10mg/kg et de 10% avec la dose de
5mg/kg.
PPrroottooccoollee IIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee 33 ddoossaaggeess ddee ffeerrrrooqquuiinnee ssuurr llee
ppoouurrcceennttaaggee ddee ggaammééttooccyytteess aallttéérrééss
On note que le pourcentage des gamétocytes altérés a augmenté quelle que soit l’heure
d’examen post-traitement et la dose (Figure 37). Le pourcentage augmente avec la dose ;à H5
post-traitement, le pourcentage, nul à la dose 5mg/kg, est de 5% à 10mg/kg et 10% à 50mg/kg ; à
H24 post-traitement le pourcentage est de10% à la dose 5mg/kg, 20% à la dose 10mg/kg et un
pourcentage des gamétocytes altérés 3 fois supérieur à la dose 50mg/Kg par rapport à celle de
5mg/kg .
![Page 119: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/119.jpg)
118
0
5
10
15
20
25
HO H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
es
ga
mé
tocy
tes
alt
éré
s
AX 5 mg/kg
AX 10 mg/kg
AX 50 mg/kg
T +
Figure 36. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages d'artésunate en fonction du temps
0
5
10
15
20
25
30
35
H0 H1h30 H5 H24
Temps
% d
es
ga
mé
tocy
tes
alt
éré
s
FQ 5 mg/kg
FQ 10 mg/kg
FQ 50 mg/kg
Figure 37. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages de ferroquine en fonction du temps
![Page 120: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/120.jpg)
119
PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ccoommppaarrééee ddee ll’’aallttéérraattiioonn ddeess ggaammééttooccyytteess àà ppaarrttiirr ddee 22
ddoossaaggeess ((55,, 1100mmgg//kkgg)) ddee ffeerrrrooqquuiinnee eett dd’’aarrttééssuunnaattee
Le pourcentage d’altération des gamétocytes pour le lot témoin reste faible et constant
(Figure 38). Au contraire, pour les lots ayant été traités, le pourcentage d’altération a
globalement augmenté.
Après H1h30, le pourcentage d’altération des gamétocytes est semblable entre les 5 lots
différent tout en restant nettement supérieur aux quelques altérations visibles sur les frottis des
souris témoins non traitées. Le pourcentage d’altération a été légèrement plus important à la dose
de 5mg/kg qu’à la dose de 10mg/kg pour les deux traitements. Comme pour les protocoles I et II,
le pourcentage des gamétocytes altérés a eu tendance à diminuer légèrement à H5 post-
traitement. Les pourcentages sont proches pour les 4 lots traités à H24 et H48. L’augmentation
des altérations parait peu importante avec la ferroquine, comparée à l’artésunate.
PPrroottooccoollee IIVV :: eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee ((55,, 1100 eett 5500 mmgg//kkgg))
ssuurr ll’’aallttéérraattiioonn ddeess ggaammééttooccyytteess
Comme précédemment, le pourcentage d’altération des gamétocytes pour le lot témoin
reste faible et constant (Figure 39), contrairement aux lots traités par la ferroquine, quelle que
soit la dose, et le moment post thérapeutique. Dans le cas de l’artésunate, l’altération des
gamétocytes était moindre que celle des lots traités par la ferroquine.
En conclusion des 4 protocoles précédents, on constate l’apparition de gamétocytes
altérés une heure après le traitement. De plus, la dose subcurative de ferroquine parait
entraîner davantage d’altérations des gamétocytes que l’artésunate.
![Page 121: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/121.jpg)
120
0
5
10
15
20
25
30
35
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
es
ga
mé
tocy
tes
alt
éré
s
FQ 5 mg/kg
FQ 10 mg/k!g
AX 5 mg/kg
AX 10 mg/kg
T +
Figure 38. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 2 dosages différents de ferroquine et d’artésunate en fonction du temps
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
H0 H1h30 H5 H24 H48
Temps
% d
es
ga
mé
tocy
tes
alt
éré
s
FQ 5 mg/kg
FQ 10 mg/kg
FQ 50 mg/kg
AX 5 mg/kg
AX 10 mg/kg
AX 50 mg/kg
T +
Figure 39. Évolution du nombre de gamétocytes après traitement à 3 dosages différents de ferroquine et d’artésunate en fonction du temps
![Page 122: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/122.jpg)
121
IIIIII.. IInnffeeccttiivviittéé ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee
La transmission du paludisme dépend d’un certain nombre de facteurs, sur lesquels
peuvent jouer les antipaludiques : ils peuvent avoir un effet sur l’infectivité des gamétocytes. Les
protocoles suivants cherchent à mesurer l’effet de la ferroquine et de l’artésunate à doses
subcuratives différentes sur l’infectivité des gamétocytes chez le moustique. Les effets éventuels
sont mesurés une heure et demie (H1h30) et cinq heures (H5) après le traitement.
PPrroottooccoollee II eett IIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee ((55mmgg//kkgg)) ssuurr llee
ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee
Ce protocole a fait l’objet de deux expérimentations : dans la première expérimentation, les
souris sont leurs propres témoins, dans la deuxième, les moustiques sont gorgés sur des souris
traitées et des souris témoins, à H1h30 et H5.
Expérimentation 1
Les paramètres de mesure de l’infectivité des gamétocytes chez le moustique sont la
présence et la quantité d’oocystes observés après dissection de l’appareil digestif du moustique.
Tout au long de ce protocole, les souris infestées sont leur propre témoin dans la comparaison
pré et post- thérapeutique.
On observe l’effet des thérapeutiques sur la gamétocytémie entre H1h30 et H5 après
administration. L’augmentation d’environ 50% et 5% respectivement.
Comme déjà démontré, le nombre de gamétocytes est supérieur après traitement par la
ferroquine ; néanmoins, cette augmentation n’est pas statistiquement significative, quelle que soit
la durée d’action de la thérapeutique : on ne peut parler que de tendance.
Le nombre d’oocystes mesuré après dissection des moustiques diminue (Figure 40) de
manière importante et significative, après administration de la ferroquine. La réduction est de
presque 70%, que ce soit à H1h30 ou à H5 et par rapport aux résultats avant le traitement (H0).
Avant administration de ferroquine, le pourcentage des anophèles femelles gorgés et
infestés est supérieur à 60% ; après H1h30 d’action de la ferroquine, le pourcentage de
moustiques infectés tombe à 50% (48% après H5 de traitement).
![Page 123: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/123.jpg)
122
Figure 40. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine (5mg/kg)
Expérimentation 2
La parasitémie des souris traitées a diminué après le traitement de près de 10% à H1h30 et
de 15% à H5 ; le nombre de gamétocytes est proche de celui du lot témoin et du lot traité par la
ferroquine.
La quantité d’oocystes a diminué entre H1h30 et H5, que ce soit chez les moustiques
nourris sur des souris traitées ou non (Figure 41). La diminution des oocystes chez les
moustiques nourris sur des souris traitées est de 60% à H1h30 et 80% à H5. Cette diminution
est statistiquement significative entre le nombre d’oocystes avant traitement à H0 et le nombre
d’oocystes après traitement à H1h30 (P< 0.04), et à H5 (P< 0.005).
Le pourcentage d’anophèles gorgés et infestés à H0 avant traitement est de 90%. À H1h30
post-traitement à la ferroquine, il est de près de 80%, alors que ce pourcentage atteint 95% dans
le lot témoin non traité. À H5, le nombre d’anophèles infectées et gorgées sur des souris traitées
et des souris témoins représente, respectivement, environ 70% et 85% mais ces réduction en
pourcentages d’anophèles gorgés et infestés ne sont pas significatives.
![Page 124: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/124.jpg)
123
Figure 41. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine
(5mg/kg) comparé avec des témoins
PPrroottooccoollee IIIIII :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee ((55mmgg//kkgg)) ssuurr llee
ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee
La parasitémie a diminué légèrement à partir de H1h30, alors que la gamétocytémie a
diminué d’environ 40% à H1h30 et d’environ 60% à H5 post-traitement.
La moyenne d’oocystes comptés chez les moustiques a diminué fortement (plus de 80 %) à
H1h30 post-traitement par l’artésunate (Figure 42). Cette diminution est de près de 90% (93%) à
H5 post-traitement par rapport à H0 avant traitement ; la diminution est donc statistiquement
significative à H5 (P<0.001).
A H0, les anophèles gorgés sont infectés à plus de 80% (83%), mais ce pourcentage
diminue régulièrement en fonction du temps : 52% à H1h30 48% à H5.
![Page 125: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/125.jpg)
124
Figure 42. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate (5mg/kg)
PPrroottooccoollee IIVV :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee eett ddee ll’’aarrttééssuunnaattee àà 1100 mmgg//kkgg
ssuurr llee ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz llee mmoouussttiiqquuee
Le nombre moyen d’oocystes par moustique gorgé sur les souris traitées à la ferroquine et
à l’artésunate 10mg/kg diminue régulièrement en fonction du temps.
A H1h30 post-traitement à la ferroquine et à l’artésunate, la réduction est de l’ordre de
65% (P<0.001) et 80% (83%) (P<0.0001) respectivement.
A H5 post-traitement, la réduction était forte : de l’ordre de 90% (93%) (P<0.0001) et
100% (98%) (P< 0.001) chez les moustiques gorgés sur les souris traitées à la ferroquine et à
l’artésunate.
Avant administration du traitement, le pourcentage de femelles gorgées et infectées est
supérieur à 85%, alors qu’il diminue après 1h30 de traitement à la ferroquine (Figure 43) et à
l’artésunate (Figure 44) (53% et 57%), la diminution s’accentuant jusqu’à 33% et 30% à H5.
![Page 126: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/126.jpg)
125
Figure 43. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à la ferroquine (10mg/kg)
Figure 44. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate (10mg/kg)
![Page 127: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/127.jpg)
126
PPrroottooccoollee VV :: EEttuuddee ddee ll’’eeffffeett ddee llaa ffeerrrrooqquuiinnee,, ddee ll’’aarrttééssuunnaattee eett ddee lleeuurr
aassssoocciiaattiioonn ((11 eett 33 ddoossaaggeess)) ssuurr llee ddéévveellooppppeemmeenntt ddeess ggaammééttooccyytteess cchheezz
llee mmoouussttiiqquuee
La parasitémie des souris traitées avec la ferroquine, l’artésunate et leur association à dose
unique a diminué à H3 post-traitement. Alors que celle des souris traitées avec l’association
ferroquine-artésunate 3 doses est restée comparable à celle des témoins.
La gamétocytémie des souris traitées avec l’association ferroquine-artésunate 3 doses a
diminué d’environ 55%, tandis que la quantité de gamétocytes sur les souris traitées avec
l’association ferroquine-artésunate 1 dose et avec l’artésunate a augmenté d’environ 400% et
10% respectivement, par rapport aux témoins.
A H3 post-traitement, on constate que le nombre d’oocystes présents dans l’estomac des
moustiques gorgés sur toutes les souris traitées a diminué (Figure 45).
Cette baisse du nombre d’oocystes à H3 post-traitement est de l'ordre de 60% chez les
moustiques gorgés sur les souris traitées à l’artésunate et de 70% (66%) chez les moustiques
gorgés sur les souris traitées par la ferroquine, ceci par rapport aux résultats à H0 avant
traitement.
La réduction d’oocystes chez les moustiques gorgés sur les souris traitées avec
l’association ferroquine-artésunate à une dose ou trois doses est de l'ordre 70% par rapport à H0.
Le pourcentage des moustiques gorgés et infectés est de l'ordre de 90% (92%) avant
administration du traitement. Après traitement à H3, le pourcentage dans les lots traités par
l’artésunate et la ferroquine est du même ordre, un peu plus faible pour l’association ferroquine-
artésunate (une dose 70% et 3 doses 85%).
![Page 128: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/128.jpg)
127
Figure 45. Nombre moyen d’oocystes par moustique après traitement à l’artésunate, la ferroquine l’association AXFQ 1 dose et AXFQ 3 doses (5mg/kg pour chaque dose)
Conclusion générale sur l’étude qualitative des effets des traitements sur les
gamétocytes :
Les doses subcuratives de ferroquine et d’artésunate et de leur association, diminuaient
l’infectivité des gamétocytes pour le moustique, en diminuant le nombre d’oocystes présents
dans l’estomac du moustique dans les cinq premières heures post-traitement
![Page 129: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/129.jpg)
128
Discussion
![Page 130: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/130.jpg)
129
Le stade hépatique Un des objectifs de notre travail était d’évaluer l’efficacité de divers antipaludiques sur le
stade intra-hépatique en utilisant comme outil de mesure la PCR quantitative en temps réel. Le
stade intra-hépatique précédant le stade intra-érythrocytaire semble être une cible de choix pour
les thérapeutiques prophylactiques destinées à d’empêcher le développement de la maladie, ainsi
que, secondairement, sa transmission.
Il y a plusieurs manières d’évaluer l’efficacité des antipaludiques sur le stade parasitaire :
l’une d’elles se fait en fonction des charges de sensibilité au parasitisme tissulaire surveillé en
microscopie classique ; elle est souvent laborieuse et source d’erreurs. La PCR classique
présente un risque de contaminations étrangères au protocole. Le besoin d’une nouvelle
technique était nécessaire, la PCR quantitative en temps réel paraissait un bon outil, ayant une
bonne sensibilité et sans risque excessif de contamination.
La quantification des effets thérapeutiques antiparasitaires sur les stades hépatiques n’est
que semi quantitative, mais avec une approximation technique suffisante, compte tenu de la
précision des charges de sporozoïtes infectants injectés dans la veine caudale des souris, de la
sensibilité individuelle des souris à l’infection, et du fait, en outre, que la répartition des « corps
bleus » (cellule hépatique gonflée de formes parasitaires) n’est pas homogène dans tous les foies
et que le parasitisme est souvent faible.
Gego et ses collaborateurs en 2006, ont développé une nouvelle approche pour le criblage
de l'activité du médicament sur les stades hépatiques de Plasmodium in vitro, basé sur un
système de balayage de fluorescence infrarouge. Cette méthode a permis de compter
automatiquement et rapidement Plasmodium hépatocytes infectés. Cette nouvelle technique
devrait faciliter l'identification de nouveaux antipaludiques actifs sur les stades hépatiques de
Plasmodium.
L’ensemble de nos résultats décrits précédemment confirme, de façon répétitive et
statistique, l’efficacité incontestable de la MALARONE® sur les stades hépatiques des souris,
quelle que soit la quantité de sporozoïtes injectée. Ceci, démontré clairement par la technique de
PCR quantitative en temps réel, est confirmé par le suivi des frottis sanguins des souris de
différents protocoles qui sont maintenues en vie une semaine après l’infestation. Des études
faites en Thaïlande et dirigées sur les formes sanguines, ont indiqué que la MALARONE® reste
très efficace contre les souches multi-résistantes de P. falciparum, que ce soit in vivo (Krudsood
![Page 131: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/131.jpg)
130
et al., 2007) ou bien in vitro (Khositnithikul et al., 2008). On a pu confirmer également l’effet
des deux composants de la MALARONE®, l’atovaquone et le proguanil, utilisés séparément, sur
le stade intra-hépatique. L’activité prophylactique d’atovaquone contre Plasmodium falciparum
a été déterminé et afin d’éviter l’apparition de résistance, l’atovaquone doit être administré
uniquement en combinaison avec le proguanil (Shapiro et al., 1999).
Pour la primaquine, l’activité thérapeutique déjà connue sur les formes parasitaires intra-
hépatiques déjà connue est confirmée mais son efficacité n’a jamais été complète. La primaquine
a été longtemps utilisée pour la gestion des rechutes du paludisme, mais dans la dernière
décennie, il a été réexaminé pour une utilisation dans la prévention du paludisme, son activité sur
le stade hépatique a été confirmée (Shanks et al., 2001). Mais là encore, jamais l’efficacité n’a
été jugée complète. L’utilisation de la primaquine, comme gamétocytocide dans la République
d'Azerbaïdjan et la République populaire démocratique de Corée, a réduit considérablement les
cas de paludisme dans des régions épidémiques où l’on manque de moyens de lutte contre la
malaria à P. vivax (Kondrashin et al., 2010). On a trouvé des différences significatives entre
l’activité de la MALARONE® et celle de la primaquine, surtout dans le protocole I. Mais il est
possible que ce résultat global soit le fait d’échantillons indétectables par le thermocycleur en
deçà d’une charge seuil limite de 9 parasites/µL. Il est possible que pour des foies issus de souris
traitées par la MALARONE®, l’ADN ne soit jamais détecté, alors qu’au contraire il existe une
détection d’ADN parasitaire dans certains cas pour des souris traitées par la primaquine, mais
cette détection a lieu au-delà du seuil de sensibilité et n’est pas prise en compte dans cette étude.
Il faut ajouter que le suivi des frottis sanguins des souris traitées par la primaquine révèle une
parasitémie qui prouve au moins l’efficacité partielle de la primaquine sur les stades intra-
hépatiques, contrairement à la MALARONE®, et ceci quelle que soit la charge sporozoïtique de
départ. Une étude a trouvé la même efficacité de la primaquine sur le stade hépatique de P.
berghei chez des souris injectées avec 85 000 sporozoïtes ou sur des souris injectées avec 2 000
sporozoïtes. (Baruteau et Girard, 1999). Par ailleurs, Chattopadhyay et al., (2010) ont démontré
une activité inhibitrice in vitro sur les cellules d'hépatome infectées avec P. vivax.
Des chercheurs ont démontré in vitro l’activité de trois médicaments de quinolones et
fluoroquinolones (grépafloxacine, l'acide piromidic, et la trovafloxacine) contre les stades
hépatiques de Plasmodium yoelii yoelii et P. falciparum. (Mahamoudi et al., 2003). Cinq ans
plus tard des nouveaux médicaments actifs contre les stades hépatiques de Plasmodium ont été
prédits par topologie moléculaire. Ces médicaments antirétroviraux (4), antifongique (1), et
cardiotonique (1) ont été jugées hautement actif (nanomolaires 50% des valeurs de concentration
![Page 132: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/132.jpg)
131
inhibitrice), et deux ionophores complètement inhibé le développement du parasite. (Mahamoudi
et al., 2008).
L’amodiaquine et la ferroquine ont une activité sur les stades érythrocytaires des plasmodies,
mais leur efficacité n’est pas suffisante ni décelable par la technique de PCR quantitative sur le
stade hépatique. Les dérivés appartenant à la base de Mannich, comme l’amodiaquine, (4-
quinoléines) et la pyronaridine (amino-9-acridines), n'ont pas aucun effet sur les stades
hépatiques des parasites du paludisme (Basco et al., 1999).
L’artésunate a une activité décelable sur le stade intra-hépatique, mais peu comparable à celle de
la MALARONE® ou de la primaquine.
Strychnopsis thouarsii est une plante traditionnellement utilisée contre le paludisme à
Madagascar. Tazopsine, qui est un roman morphinane alcaloïde, isolé à partir de cette plante.
Ce composé et ses dérivés semi-synthétiques facilement obtenus, ont montré une activité
inhibitrice contre le développement au stade hépatique in vitro avec P. falciparum et P. yoelii et
in vivo avec P. yoelii. (Carraz et al., 2006)
Les tests visant à examiner plusieurs associations de ces principes actifs entre eux
(ferroquine et artésunate, artésunate et amodiaquine), n'atteignent pas les résultats souhaités et
des études ultérieures devraient comporter des dosages différents. On a observé des charges
parasitaires très élevées chez les souris traitées avec l’association de l’artésunate plus la
ferroquine et l’artésunate plus l’amodiaquine, et proches de celles des souris témoins non
traitées. Les modifications apportées au cours d’un quatrième protocole (deux associations
contenant de l’artésunate) améliorent faiblement nos résultats souhaités, en termes d’efficacité.
L’activité de l’association artésunate plus amodiaquine paraissait nulle, tandis que l’association
artésunate plus ferroquine a montré une activité modeste sur le stade hépatique. En effet, d’un
côté, l’efficacité de l’association artésunate plus ferroquine était significativement différente de
celle de la MALARONE®, mais d’un autre coté aussi, cette activité sur le stade intra-hépatique
est significativement supérieure à celle sur le stade hépatique chez les souris de contrôle.
Il pourrait être intéressant d’établir un protocole dans lequel l’efficacité de la ferroquine, en
association avec l’artésunate, serait étudiée en faisant varier uniquement la dose de ferroquine
administrée et en augmentant la taille des échantillons.
![Page 133: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/133.jpg)
132
Le fait d’administrer une deuxième dose d’artésunate n’a entraîné aucune amélioration de
son activité sur le stade hépatique, comparé avec celle obtenue avec une dose unique. La
deuxième dose d’artésunate administrée en plus de l‘association artésunate plus amodiaquine a
diminué les stades hépatiques significativement, comparé aux résultats obtenus avec une seule
dose d’artésunate.
L’étude réalisée permet d’établir la validité de la PCR quantitative en temps réel pour ce
type de recherches. Cette technique présente l’intérêt majeur de permettre une approche à la fois
qualitative et quantitative. Son utilisation permet de compléter les résultats d’études
précédemment réalisées sur le même sujet. Rosanas-Urgell et al. (2010), ont confirmé que cette
technique est sensible et spécifique dans la détection des quatre espèces de Plasmodium humain.
Les résultats obtenus de la technique qPCR en temps réel s’accordent bien avec les autres
techniques moléculaires, telles que la nPCR (Nested PCR) et la PCR_LDR_FMA (mutiplex
PCR-ligase detection reaction-fluorescent microsphere assay).
En conclusion, l’efficacité de la MALARONE® sur le stade intra-hépatique est totale. Elle
est plus efficace à celle de la primaquine et sans commune mesure avec les résultats faibles
obtenus avec les autres molécules prises isolément ou associées :
- L’action de l’artésunate et de la primaquine sur le stade intra-hépatique existe et
constatée, elle n’est pas totale et ne saurait entraver complètement les développements
sanguins parasitaires en rapport avec les signes cliniques du paludisme. Leur efficacité
sur ce stade apparaît donc partielle.
- Associer les antipaludiques a amélioré légèrement leur efficacité sur le stade intra-
hépatique, comme l’association de l’artésunate plus la ferroquine.
- En fait, une deuxième dose d’artésunate a un effet sur le stade intra-hépatique, soit en
antipaludique seul, soit en association artésunate avec l’amodiaquine.
- Une étude révèle une nouvelle approche pour designer et évaluer les antipaludiques
basées sur la combinaison covalente de molécules (l’hybride de primaquine-artémisinine)
agissant sur différents stades de cycle de vie (Capela et al., 2011)
![Page 134: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/134.jpg)
133
Le stade sexué
Le paludisme est sans doute l’une des infections parasitaires la plus étudiée. On pensait
pouvoir l’éradiquer par épandage d’insecticides actifs contre un vecteur qui apparaît de plus en
plus résistant aux nouveaux pesticides qu’on lui oppose. Une autre voie incontournable consiste
à assurer un traitement rapide des malades et impaludés porteurs sains de parasites, afin de les
protéger et d’assurer autant que possible un arrêt de la chaîne épidémiologique assurant la
transmission vers des sujets sains. Mais moustiques et souches de Plasmodium développent des
résistances aux différentes armes qu’on leur oppose. Des cibles thérapeutiques complémentaires
peuvent être envisagées : la stérilisation du réservoir de parasites dans le foie avant son
expression dans le sang circulant, et l’arrêt de la transmission en agissant en amont sur la
gamétocytogénèse, les gamétocytes et la transmission vectorielle.
Si l’on admet que la transmission du paludisme se divise en quatre phases cycliques :
1) le développement chez l'hôte, incluant la gamétocytogénèse,
2) le passage de l'hôte vers le moustique,
3) le développement du parasite chez le moustique,
4) le passage du moustique vers l'hôte (Robert et al.,, 2003),
nous dirons que notre étude aborde les trois premières phases.
Deux études ont été réalisées, l’une quantitative et l’autre qualitative, selon deux objectifs :
� étudier quantitativement l’action des antipaludiques (artésunate, ferroquine) sur la
gamétocytogénèse et sur le nombre de gamétocytes dans le sang circulant (le
développement du parasite chez l'hôte).
� étudier qualitativement :
1. l’action des antipaludiques sur la qualité de gamétocytes à la suite d’observations
morphologiques et colorimétriques en microscopie optique et électronique,
2. l’action des antipaludiques sur l’infectivité des gamétocytes se développant en
oocystes dans l’estomac du moustique.
![Page 135: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/135.jpg)
134
���� Etude quantitative des effets des traitements sur la
gamétocytogénèse
Le dosage des médicaments actifs étudiés doit être suffisamment faible pour permettre le
développement à bas bruit des parasites asexués et suffisant pour juger d’une éventuelle activité
sur la gamétocytogénèse, les gamétocytes circulants de l’impact sur la transmission (en agissant
sur la transformation chez le moustique des gamètes en sporozoïtes infectants).
La parasitémie
Quel que soit le protocole, nous constatons une légère baisse de la parasitémie des souris
traitées (à doses infra curatives) à partir d’H1 post-traitement, avec une décroissance plus
franche attendue chez les souris traitées par deux doses, cela sans disparition complète des
parasites sanguins. Par contre, les effets des thérapeutiques diminuent dès la huitième heure pour
pratiquement disparaître 24 à 48 heures plus tard. .
Des études à doses curatives pourraient être poursuivies mais la quantité de gamétocytes
serait sans doute faible, malgré le fait que la souche de Plasmodium yoelii utilisée soit
asynchrone et forte productrice de gamétocytes, et les analyses seraient plus complexes.
Une étude (Dupin et Vildeuil, 2001), est en accord avec certains de nos résultats
concernant l’efficacité de l’artésunate à la dose de 50mg/kg : elle a montré que l’artésunate
administré en trois cures semble ralentir le passage des formes mérozoïtes hépatiques vers le
secteur sanguin, mais en montrant un net ralentissement dans le développement parasitaire.
Il semble donc que les deux antipaludiques, ferroquine et artésunate, contrôlent la
parasitémie dans les premières heures post-traitement, quelle que soit la dose subcurative.
24 heures plus tard, l’effet est presque absent, ceci s’expliquant par la demi-vie courte des
deux antipaludiques qui perdent leur efficacité précocement. En effet, la demi-vie de l’artésunate
est de vingt minutes. Par ailleurs, on ne peut éliminer le fait que les souris puissent
individuellement réagir différemment aux thérapeutiques, ce qui expliquerait en partie des
résultats apparemment discordants selon les protocoles.
La gamétocytémie
Une augmentation du nombre des gamétocytes a été remarquée chez les souris traitées
avec une ou deux doses de ferroquine, en comparaison avec les souris témoins. Cette
augmentation était maximale (d’environ 60%) à H3 pour le lot traité par dose unique de
![Page 136: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/136.jpg)
135
ferroquine. Tandis que l’augmentation maximale pour le lot traité avec deux doses (80%) a eu
lieu à H5.
La gamétocytémie a augmenté, une heure après les deux traitements (ferroquine et
artésunate), de presque 100% par rapport au lot témoin. La gamétocytémie de la ferroquine est
restée presque stable pendant les 5 premières heures post-traitement comparé au témoin, mais
celle de l’artésunate a diminué à H5 post-traitement.
Dans le cas de l’association ferroquine-artésunate, le nombre de gamétocytes a augmenté
dès la première heure, ce nombre étant deux fois plus important à H8 et 3 fois plus à H24 par
rapport à celui du témoin non traité.
En accord avec ces résultats, l’effet des 3 doses d’artésunate : 5, 10, 50mg/kg, augmente la
gamétocytémie dès H1h30 et H5 ; le nombre maximum de gamétocytes à H5 post-traitement est
atteint avec la dose de 5mg/kg.
On peut dire que les deux antipaludiques, ferroquine et artésunate, ainsi que leur
association, ont des effets stimulant sur la production de gamétocytes dans les premières heures
post-traitement.
L’index de gamétocytogénèse
L’index de gamétocytogénèse est le rapport de la gamétocytémie sur la parasitémie.
Plusieurs études cliniques sur des patients infectés avec P. falciparum ont étudié les
antipaludiques qui induisent une augmentation de la gamétocytogénèse (Buckling et al., 1997),
mais pour des raisons éthiques, il est difficile de prolonger les activités comparées
d’antipaludiques prescrits chez l'homme, et dans ces études, les antipaludiques ont été utilisés à
doses curatives qui bloquaient très rapidement la gamétocytogénèse. Dans notre étude
expérimentale, nous avons utilisé des doses subcuratives pour nous permettre de mieux suivre les
antipaludiques et leurs effets sur la gamétocytogénèse et les gamétocytes circulants.
Quantitativement, l’index de gamétocytogénèse a permis, dans le cas de prescription de
ferroquine ou d’artésunate, de noter une augmentation de 2 à 5 fois plus importante que dans le
cas des souris témoins non traitées (à H5, l’index de gamétocytogénèse de la ferroquine a atteint
cinq fois celui du témoin).
.
A la suite de l’analyse des différents protocoles où interviennent des molécules différentes
à des doses uniques ou multiples, on peut en déduire que deux antipaludiques, ferroquine,
![Page 137: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/137.jpg)
136
artésunate et leur association, prescrite à doses subcuratives, ont un effet stimulant sur la
gamétocytogénèse. Price et al., (1996) ont montré l’action de l’artésunate sur la
gamétocytogénèse chez P. falciparum. Ces résultats corroborent le fait que toute forme de stress
envers le parasite, sans le supprimer, comme l’administration de doses subcuratives
d’antipaludiques (Taylor et Read, 1997), provoque une réaction du parasite qui se traduit par une
activation de sa gamétocytogénèse. La ferroquine est une molécule de chloroquine à laquelle un
noyau ferrocène a été ajouté. On peut comparer les actions de ces deux antipaludiques pour
déterminer si la présence du noyau ferrocénique renforce l’action de la molécule de chloroquine.
L’administration de chloroquine provoque une stimulation de la gamétocytogénèse chez les
souches résistantes de P. falciparum (Strickland et al., 1986) comme pour chez les souches
sensibles (Sokhna et al.,, 2001). Des résultats comparables ont également été obtenus chez P.
vinckei petteri (Gautret et al.,, 2001).
Buckling et al.,, (1997 et 1999) ont démontré, après avoir traité par la chloroquine, que la
gamétocytogénèse in vivo avait augmenté 5 fois plus que dans les cultures non traitées, et in
vitro, 2,5 fois plus que chez les témoins. La gamétocytogénèse obtenue avec la ferroquine était 5
fois (protocole II) et 3 fois (protocole III) plus importante que chez le témoin. En désaccord avec
nos résultats, Gautret et al.,, 2000 n’ont montré aucun effet sur la gamétocytogénèse dans le cas
de P. c. petteri, pendant les 3 jours suivant les traitements.
Nos résultats sur l'effet de l'artésunate sur la gamétocytogénèse sont différents de ceux de
Pukrittayakamee et al., 2004, qui indiquent que l'artésunate a un effet inhibiteur de la
gamétocytogénèse de P. falciparum en utilisant des doses subcuratives plusieurs fois par jour
(3,3 mg/kg le premier jour, puis 1,65 mg/kg pendant 6 jours). Leurs conditions expérimentales
« in vivo » et « in vitro » sont elles les mêmes que celles que nous avons suivies ?
���� Etude qualitative des effets des traitements
La morphologie des gamétocytes dans le sang circulant
Ces premiers résultats ne sont donnés qu’à titre indicatif, des expériences complémentaires
étant en cours, en particulier sur l’analyse en microscopie électronique des différentes formes de
gamétocytes à différents temps post thérapeutiques.
Dans nos lots traités avec la ferroquine et l’artésunate, on a remarqué que le pourcentage
de gamétocytes altérés a globalement augmenté dans les premières heures post-traitement
comparé aux pourcentages très faibles de gamétocytes altérés dans les lots témoins. Il existe
![Page 138: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/138.jpg)
137
cependant une altération des gamétocytes même chez les témoins non traités. Landau et al., 1979
ont indiqué qu’une parasitémie très élevée altérait les gamétocytes quel que soit leur stade et
diminuait leur pouvoir infestant pour le moustique. Dans nos protocoles, la parasitémie ne
dépasse pas 3% et ce facteur ne parait pas influer. Smalley 1977, a remarqué in vitro que le
pourcentage de gamétocytes altérés de P. falciparum était important lorsqu’ils sont exposés à la
chloroquine dans les deux jours suivant le traitement. Kombila et al., 1997, a observé in vivo que
tous les stades de P. falciparum (trophozoïtes, schizontes et gamétocytes) sont altérés dans les 20
heures suivant un traitement par l’artéméther, dérivé de l’artémisinine.
L’infectivité des gamétocytes chez le moustique
L’étude qui aurait pu être poussée jusqu’au décompte des sporozoïtes dans les glandes
salivaires des moustiques gorgés s’est contentée, pour des raisons techniques, d’une première
approche posant comme préambule que le décompte des oocystes sur les feuillets externes de
l’estomac des moustiques est considéré comme parallèle à la concentration définitive des
sporozoïtes dans les glandes salivaires et que leur infectivité est conservée.
Pour l'estimation de l’infectivité des gamétocytes chez les moustiques, nous remarquons
que pour toutes les expériences, le nombre d’oocystes par moustique diminue dès H1h30 après le
traitement à la ferroquine et à l’artésunate et que cet effet se prolonge également cinq heures plus
tard. Cette baisse en nombre d’oocystes a démontré que les deux antipaludiques et leur
association, quelle que soit la dose, avaient diminué l’infectivité des gamétocytes pour le
moustique. Dans le même temps, nous remarquons que le nombre absolu de gamétocytes chez
ces souris a diminué dans quelques expériences et a augmenté dans d’autres, sans pour autant
que l’on puisse corréler les deux paramètres : gamétocytes circulants et infectivité. La variation
du nombre de gamétocytes ne peut pas être directement liée à une variation parallèle de
l’infectivité. L’infectivité n’est pas systématiquement et uniquement liée à la quantité de
gamétocytes circulants. Il serait intéressant de connaître la quantité et la biodisponibilité des
gamétocytes pompés par le moustique au niveau des capillaires superficiels, et en particulier de
préciser plus exactement les stades de développement des gamétocytes atteints par les
thérapeutiques et leur rapport avec leur infectivité et leur rôle dans la transmission. Des études
ont noté que le maximum d’infectivité des gamétocytes de P. gallinaceum chez le moustique
Aêdes aegypti ne coïncide pas toujours avec le maximum de production de gamétocytes
(Lumsden et Bertram, 1940 ; Cantrell et Jordan, 1946).
Nos résultats ont montré une réduction de l'infectivité, quels que soit le médicament et la
dose. Des résultats comparables ont été observés, in vitro chez P. falciparum par Chotivanich et
![Page 139: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/139.jpg)
138
al., 2006, qui ont noté que l'artésunate a un puissant effet sur l'infectivité des gamétocytes dans
A. dirus, l’artésunate à faible concentration (1,5 mg/ml) a inhibé environ 90% de l'infectivité.
In vivo, l'artésunate à la dose totale de 100 mg en 6 jours inhibe l'infectivité des gamétocytes de
P falciparum (Chen et al., 2008).
Chen et al., (1994) et Price et al., (1996) ont indiqué que les dérivés de l'artémisinine
peuvent réellement influencer l'infectivité des gamétocytes de P. falciparum ; ils ont trouvé que
les dérivés de l'artémisinine sont plus efficaces que la méfloquine pour bloquer la transmission
du paludisme à P. falciparum. Puri et Dutta (2005) ont constaté une réduction drastique de
l'infectivité des gamétocytes de P. cynomolgi chez des singes rhésus, en terme de
développement des oocystes en post-traitement avec l’elubaquine à doses subcuratives : 0,63,
1,25, 1,87, 2,5 mg / kg. L'inhibition complète a été obtenue avec des doses de 3,75 à 5 mg / kg.
À H5 post-traitement, les gamétocytes matures perdent leur infectivité pour les moustiques.
La réduction de l'infectivité des gamétocytes de P. c. petteri est obtenue à H1 et H12 post-
traitement par la chloroquine (5 mg/kg), avec une baisse de 40% (41%) et 60% (61%)
respectivement, alors qu'il n'y avait pas d'effet significatif sur la transmission post-traitement par
la chloroquine à H12 après une prescription de 1 mg / kg (Gautret et al., 2000). Des résultats
comparables ont été observés par Klein et al., (1991), qui ont noté une inhibition temporaire de
la transmission de gamétocytes de P. vivax par Anopheles darlingi à H4 post-traitement avec 600
mg de chloroquine/kg. Gautret et al., (2000) sur P.vinckei petteri et P. chabaudi, et Bulking et
al., (1997) n’ont observé aucun effet de la chloroquine sur l’infectivité chez le moustique, alors
que Ichimori et al., (1990) sur P. yoelii nigeriensis et Gautret et al., (2001) sur
P. chabaudi,montrent une augmentation de l'infectivité des gamétocytes pour les moustiques
après traitement par la chloroquine.
Nos résultats montrent que les doses subcuratives de ferroquine et d'artésunate et leur
association ont un effet inhibiteur sur l'infectivité des gamétocytes de P. yoelii yoelii à H1h30 et
H5 post-traitement (la réduction de l'infectivité à H1h30 est de 60-70% et de 70-80% à H5 post-
traitement avec une dose de ferroquine de 5 mg/kg. Cette réduction de l’infectivité est d'environ
70% à H1h30, 90% à H5 post-traitement si la ferroquine est prescrite à raison de 10mg/kg. Pour
l’artésunate, le nombre d'oocystes est réduit d'environ 80% à H1h30 et 90% à H5 post-traitement
à la dose de 5 mg/kg. À la dose de 10 mg/kg d’artésunate, la réduction est d’environ 80% à
H1h30 et 100% à H5 post traitement. Nos résultats sont en accord avec ceux d’autres travaux
(Chotivanich et al., 2006;. Puri et Dutta, 2005).
![Page 140: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/140.jpg)
139
Conclusions et perspectives
![Page 141: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/141.jpg)
140
I. Le stade parasitaire hépatique
La MALARONE® (atovaquone + proguanil) présente une efficacité totale sur le stade
hépatique, alors que l’efficacité de la primaquine à la dose 20mg/kg semble partielle.
L’efficacité de l’amodiaquine, de l’artésunate, de la ferroquine et de leur association est nulle
ou plus modeste.
L’utilisation de la technique de PCR quantitative en temps réel ne se limite pas au
secteur de la recherche : elle est également transposable à la médecine humaine (Rougemont
et al, 2004). Cette technique permet une détection plus spécifique et plus sensible des
plasmodies humaines. L’application de cette technique sur les patients sous traitement
antipaludique semble intéressante
Une etude a trouvé que la techniqe de l’amplification en temps basée sur la séquence
d’acides nucléiques QT-NASBA, est plus performante que la PCR quantitive en temps réel
sur la détection de P. falciparum (Schneider et al., 2005).
II. Le stade parasitaire sexué
Dans notre étude, on a pu interrompre le cycle parasitaire en utilisant des doses
subcuratives de ferroquine et d’artésunate ; on a pu noter un effet notable sur la
gamétocytogénèse et la morphologie des gamétocytes (altération), et sur l’infectivité des
gamétocytes chez le moustique.
On en conclut :
1- la production d’un grand nombre de gamétocytes sous la pression des antipaludiques
2- l’apparition d’altérations morphologues sur les gamétocytes
3- l’augmentation du pourcentage des gamétocytes altérés
4- la diminution de l’infectivité des gamétocytes pour le moustique
![Page 142: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/142.jpg)
141
.
Marfurt et ses collaborateurs 2011 ont montrè que l'activité puissante de ferroquine contre des
isolats résistants à la fois de P. falciparum et P. vivax, met en évidence un rôle prometteur pour
la ferroquine comme un antipaludique plomb contre CQ-résistance de Plasmodium et un
médicament partenaire utile pour la thérapie à base d'artémisinine.
� L’application de la technique de PCR quantitative en temps réel sur les stades hépatiques
semble intéressante.
� Sa comparaison à une nouvelle technique QT-NASBA, est souhaitable
(Schneider et al., 2005).
� Une étude colorimétrique et morphologique sur différents stades des gamétocytes serait
intéressante à poursuivre
� Il serait intéressant de différencier l’action des thérapeutiques sur les différents stades des
gamétocytes afin de définir précisément la cible de la ferroquine et de l’artésunate.
� Une étude comparant l’effet de la ferroquine et de l’artésunate sur la gamétocytogénèse et
sur l’infectivité des gamétocytes à des doses différentes, avec des souches résistantes
et/ou sensibles et sur de plus longues périodes, serait utile pour compléter nos recherches.
���� Une relation entre les modes d’actions connus de la ferroquine et de l’artésunate sur les
formes asexuées serait à rapprocher des altérations observées sur les gamétocytes
![Page 143: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/143.jpg)
142
Bibliographie
![Page 144: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/144.jpg)
143
Alano, P. and R. Carter (1990). "Sexual differentiation in malaria parasites." Annu Rev Microbiol 44: 429-49. Al-Olayan, E. M., G. T. Williams and H. Hurd (2002). "Apoptosis in the malaria protozoan, Plasmodium berghei: a possible mechanism for limiting intensity of infection in the mosquito." Int J Parasitol 32(9): 1133-43. Arnot, D. E. and K. Gull (1998). "The Plasmodium cell-cycle: facts and questions." Ann Trop Med Parasitol 92(4): 361-5. Barber, M. A., W. H. W. Komp and B. M. and Newman (1929). "The effect of small doses of plasmochin on the viability of gametocytes of malaria as measured by mosquito infections" Public Health Reports 44: 1409-1421. Barker, R. H., Jr., T. Banchongaksorn, J. M. Courval, W. Suwonkerd, K. Rimwungtragoon and D. F. Wirth (1994). "Plasmodium falciparum and P. vivax: factors affecting sensitivity and specificity of PCR-based diagnosis of malaria." Exp Parasitol 79(1): 41-9. Baruteau, C. and N. Girard (1999). Modification morphologiques des formes intra-hépatique de plasmodium berghei sous thérapeutiques. Tours, Université François Rabelais C2 de parasitologie. Basco, L. and P. Ringwald (2000). "[Drug-resistant malaria: problems with its definition and technical approaches]." Sante 10(1): 47-50. Basco, L. K. and J. Le Bras (1994). "In vitro susceptibility of Cambodian isolates of Plasmodium falciparum to halofantrine, pyronaridine and artemisinin derivatives." Ann Trop Med Parasitol 88(2): 137-44. Basco, L. K., P. Ringwald, J. F. Franetich and D. Mazier (1999). "Assessment of pyronaridine activity in vivo and in vitro against the hepatic stages of malaria in laboratory mice." Trans R Soc Trop Med Hyg 93(6): 651-2. Bastien, P., I. Landau and D. Baccam (1987). "[Inhibition of the infectivity of Plasmodium gametocytes by the serum of the parasite host. Perfecting an experimental model]." Ann Parasitol Hum Comp 62(3): 195-208. Bhasin, V. K. and W. Trager (1984). "Gametocyte-forming and non-gametocyte-forming clones of Plasmodium falciparum." Am J Trop Med Hyg 33(4): 534-7. Bhattacharyya, M. K. and N. Kumar (2001). "Effect of xanthurenic acid on infectivity of Plasmodium falciparum to Anopheles stephensi." Int J Parasitol 31(10): 1129-33. Biagini, G. A., P. M. O'Neill, A. Nzila, S. A. Ward and P. G. Bray (2003). "Antimalarial chemotherapy: young guns or back to the future?" Trends Parasitol 19(11): 479-87. Billker, O., V. Lindo, M. Panico, A. E. Etienne, T. Paxton, A. Dell, M. Rogers, R. E. Sinden and H. R. Morris (1998). "Identification of xanthurenic acid as the putative inducer of malaria development in the mosquito." Nature 392(6673): 289-92.
![Page 145: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/145.jpg)
144
Billker, O., M. K. Shaw, G. Margos and R. E. Sinden (1997). "The roles of temperature, pH and mosquito factors as triggers of male and female gametogenesis of Plasmodium berghei in vitro." Parasitology 115 ( Pt 1): 1-7. Biot, C., G. Glorian, L. A. Maciejewski and J. S. Brocard (1997). "Synthesis and antimalarial activity in vitro and in vivo of a new ferrocene-chloroquine analogue." J Med Chem 40(23): 3715-8. Birago, C., A. Bucci, E. Dore, C. Frontali and P. Zenobi (1982). "Mosquito infectivity is directly related to the proportion of repetitive DNA in Plasmodium berghei." Mol Biochem Parasitol 6(1): 1-12. Bosch, F. H., J. M.Werre, B. Roerdinkholoder-Stoelwinder, T. H. Huls, S. G. L. VD. Vegt, F. L. A. Willekens, M. Bins and, M. R. Hale (1993). "Young red blood cells; observations about the cytometric and morphologic alterations in the beginning of their life." Clinical & Laboratory Haematology 15: 265-274. Boudin, C., J. Lyannaz, M. F. Bosseno, J. Chaize and P. Carnevale (1989). "[Production of sporozoites of human Plasmodium in Bobo-Dioulasso (Burkina Faso)]." Ann Soc Belg Med Trop 69(1): 3-23. Brockelman, C. R. (1982). "Conditions favoring gametocytogenesis in the continuous culture of Plasmodium falciparum." J Protozool 29(3): 454-8. Bruna-Romero, O., J. C. Hafalla, G. Gonzalez-Aseguinolaza, G. Sano, M. Tsuji and F. Zavala (2001). "Detection of malaria liver-stages in mice infected through the bite of a single Anopheles mosquito using a highly sensitive real-time PCR." Int J Parasitol 31(13): 1499-502. Buckling, A., L. C. Ranford-Cartwright, A. Miles and A. F. Read (1999). "Chloroquine increases Plasmodium falciparum gametocytogenesis in vitro." Parasitology 118 (Pt 4): 339-46. Buckling, A. G., L. H. Taylor, J. M. Carlton and A. F. Read (1997). "Adaptive changes in Plasmodium transmission strategies following chloroquine chemotherapy" Proc Biol Sci 268(1483): 2325-30. Cantrell, W. and H. B. Jordan (1946). "Changes in the infectiousness of gametocytes during the course of Plasmodium gallinaceum infections." J Infect Dis 78: 153-9. Capela, R., G. G. Cabal, P. J. Rosenthal, J. Gut, M. M. Mota, R. Moreira, F. Lopes and M. Prudencio (2011). "Design and evaluation of primaquine-artemisinin hybrids as a multistage antimalarial strategy." Antimicrob Agents Chemother 55(10): 4698-706. Carraz, M., A. Jossang, J. F. Franetich, A. Siau, L. Ciceron, L. Hannoun, R. Sauerwein, F. Frappier, P. Rasoanaivo, G. Snounou and D. Mazier (2006). "A plant-derived morphinan as a novel lead compound active against malaria liver stages." PLoS Med 3(12): e513. Carter, R., Graves, P. M., (1988). Gametocytes. Malaria Principles and Practice of Malariology. S. I. M. Walter H. Wernsdorfer. London, Churchill Livingstone. Volume 1: 253-305.
![Page 146: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/146.jpg)
145
Carter, R., R. W. Gwadz and I. Green (1979). "Plasmodium gallinaceum: Transmission-blocking immunity in chickens. II. The effect of antigamete antibodies in vitro and in vivo and their elaboration during infection." Exp Parasitol 47(2): 194-208. Carter, R., N. Kumar, I. Quakyi, M. Good, K. Mendis, P. Graves and L. Miller (1988). "Immunity to sexual stages of malaria parasites." Prog Allergy 41: 193-214. Carter, R. and L. H. Miller (1979). "Evidence for environmental modulation of gametocytogenesis in Plasmodium falciparum in continuous culture." Bull World Health Organ 57 Suppl 1: 37-52. Charmot, G. (1993). Mode d'action des médicaments anti-plasmodium. Séminaire fondamental de microbiologie Paris. Chattopadhyay, R., S. Velmurugan, C. Chakiath, L. Andrews Donkor, W. Milhous, J. W. Barnwell, W. E. Collins and S. L. Hoffman (2010). "Establishment of an in vitro assay for assessing the effects of drugs on the liver stages of Plasmodium vivax malaria." PLoS One 5(12): e14275. Chen, P. Q., G. Q. Li, X. B. Guo, K. R. He, Y. X. Fu, L. C. Fu and Y. Z. Song (1994). "The infectivity of gametocytes of Plasmodium falciparum from patients treated with artemisinin " Chin Med J (Engl) 107(9): 709-11. Chen, P. Q., Y. Xu, D. Chen, K. R. He, F. Z. Ou, C. W. Fu, L. C. Fu and G. Q. Li (2008). "[Artesunate in interrupting the transmission of Plasmodium falciparum] " Zhongguo Ji Sheng Chong Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi 26(5): 349-52. Chin, W., P. G. Contacos, G. R. Coatney and H. R. Kimball (1965). "A Naturally Acquited Quotidian-Type Malaria In Man Transferable To Monkeys." Science 149: 865. Chotivanich, K., J. Sattabongkot, R. Udomsangpetch, S. Looareesuwan, N. P. Day, R. E. Coleman and N. J. White (2006). "Transmission-blocking activities of quinine, primaquine, and artesunate " Antimicrob Agents Chemother 50(6): 1927-30. Coz, J. and J. J. Picq (1972). "[Laboratory study of the receptivity of Anopheles gambiae A and Anopheles gambiae B to Laverania falcipara]." Bull Soc Pathol Exot Filiales 65(5): 668-75. Coz, J., J. J. Picq and J. H. Ricosse (1970). "[Sporogony in Anopheles gambiae "A" of pyrimethamine-resistant Plasmodium falciparum strains]." Bull Soc Pathol Exot Filiales 63(2): 201-8. Dearsly, A. L., R. E. Sinden and I. A. Self (1990). "Sexual development in malarial parasites: gametocyte production, fertility and infectivity to the mosquito vector." Parasitology 100 Pt 3: 359-68. Dondorp, A. M., F. Nosten, P. Yi, D. Das, A. P. Phyo, J. Tarning, K. M. Lwin, F. Ariey, W. Hanpithakpong, S. J. Lee, P. Ringwald, K. Silamut, M. Imwong, K. Chotivanich, P. Lim, T. Herdman, S. S. An, S. Yeung, P. Singhasivanon, N. P. Day, N. Lindegardh, D. Socheat and N. J. White (2009). "Artemisinin resistance in Plasmodium falciparum malaria." N Engl J Med 361(5): 455-67.
![Page 147: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/147.jpg)
146
Dupin, R. and O. Vildeuil (2001). Efficacité de l’artésunate sur les formes asexuées intra-hépatique de Plasmodies de rongeurs (étude expérimentale) Tours Université François Rabelais. M1 de parasitologie. Dyer, M. and K. P. Day (2000). "Commitment to gametocytogenesis in Plasmodium falciparum." Parasitol Today 16(3): 102-7. Eichner, M., H. H. Diebner, L. Molineaux, W. E. Collins, G. M. Jeffery and K. Dietz (2001). "Genesis, sequestration and survival of Plasmodium falciparum gametocytes: parameter estimates from fitting a model to malariatherapy data." Trans R Soc Trop Med Hyg 95(5): 497-501. Feng, Z., R. N. Hoffmann, R. S. Nussenzweig, M. Tsuji, H. Fujioka, M. Aikawa, T. H. Lensen, T. Ponnudurai and L. G. Pologe (1993). "Pfs2400 can mediate antibody-dependent malaria transmission inhibition and may be the Plasmodium falciparum 11.1 gene product." J Exp Med 177(2): 273-81. Fidock, D. A., T. Nomura, A. K. Talley, R. A. Cooper, S. M. Dzekunov, M. T. Ferdig, L. M. Ursos, A. B. Sidhu, B. Naude, K. W. Deitsch, X. Z. Su, J. C. Wootton, P. D. Roepe and T. E. Wellems (2000). "Mutations in the P. falciparum digestive vacuole transmembrane protein PfCRT and evidence for their role in chloroquine resistance." Mol Cell 6(4): 861-71. Field, J. W. and P. G. Shutes (1956). The microscopic diagnosis of human malaria. II. A morphological study of the erythrocytic parasites Institute for Medical Research Fontenille, D. and L. Lochouarn (1999). "The complexity of the malaria vectorial system in Africa " Parassitologia 41(1-3): 267-71. Garnham, P. C. C. (1966). Malaria parasites and other haemosporisia Blackwell Scientific. Gautret, P., A. G. Chabaud and I. Landau (1997). "Effet de la phénylhydrazine sur le développement des gamétocytes des Plasmodium murins" Bulletin de la Société française de parasitologie 15: 3-10. Gautret, P., J. C. Gantier, D. Baccam, F. Miltgen, M. Saulai, A. G. Chabaud and I. Landau (1996). "The gametocytes of Plasmodium vinckei petteri, their morphological stages, periodicity and infectivity" Int J Parasitol 26(10): 1095-101. Gautret, P., I. Landau, L. Tailhardat, F. Miltgen, F. Coquelin, T. Voza, A. G. Chabaud and J. L. Jacquemin (2000). "The effects of subcurative doses of chloroquine on Plasmodium vinckei petteri gametocytes and on their infectivity to mosquitoes" Int J Parasitol 30(11): 1193-8. Gautret, P., F. Miltgen, A. G. Chabaud and I. Landau (1996). "Synchronized Plasmodium yoelii yoelii: pattern of gametocyte production, sequestration and infectivity" Parassitologia 38(3): 575-7. Gautret, P., T. Voza, A. G. Chabaud and I. Landau (2001). "Short-term effect of chloroquine on the infectivity of Plasmodium chabaudi gametocytes " Parasite 8(4): 363-7. Gego, A., O. Silvie, J. F. Franetich, K. Farhati, L. Hannoun, A. J. Luty, R. W. Sauerwein, C. Boucheix, E. Rubinstein and D. Mazier (2006). "New approach for high-throughput screening of drug activity on Plasmodium liver stages." Antimicrob Agents Chemother 50(4): 1586-9.
![Page 148: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/148.jpg)
147
Graves, P. M., R. Carter, T. R. Burkot, I. A. Quakyi and N. Kumar (1988). "Antibodies to Plasmodium falciparum gamete surface antigens in Papua New Guinea sera." Parasite Immunol 10(2): 209-18. Graves, P. M., R. Carter and K. M. McNeill (1984). "Gametocyte production in cloned lines of Plasmodium falciparum." Am J Trop Med Hyg 33(6): 1045-50. Graves, P. M., A. Doubrovsky, J. Sattabongkot and D. Battistutta (1992). "Human antibody responses to epitopes on the Plasmodium falciparum gametocyte antigen PFS 48/45 and their relationship to infectivity of gametocyte carriers " Am J Trop Med Hyg 46(6): 711-9. Grotendorst, C. A., N. Kumar, R. Carter and D. C. Kaushal (1984). "A surface protein expressed during the transformation of zygotes of Plasmodium gallinaceum is a target of transmission-blocking antibodies " Infect Immun 45(3): 775-7. Gwadz, R. W. and I. Green (1978). "Malaria immunization in Rhesus monkeys. A vaccine effective against both the sexual and asexual stages of Plasmodium knowlesi" J Exp Med 148(5): 1311-23. Harbach, R. E. (2004). "The classification of genus Anopheles (Diptera: Culicidae): a working hypothesis of phylogenetic relationships" Bull Entomol Res 94(6): 537-53. Harte, P. G., N. C. Rogers and G. A. Targett (1985). "Monoclonal anti-gamete antibodies prevent transmission of murine malaria." Parasite Immunol 7(6): 607-15. Hawking, F., M. J. Worms and K. Gammage (1968). "24- and 48-hour cycles of malaria parasites in the blood; their purpose, production and control." Trans R Soc Trop Med Hyg 62(6): 731-65. Higuchi, R., G. Dollinger, P. S. Walsh and R. Griffith (1992). "Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences." Biotechnology (N Y) 10(4): 413-7. Hogh, B., R. Thompson, C. Hetzel, S. L. Fleck, N. A. Kruse, I. Jones, M. Dgedge, J. Barreto and R. E. Sinden (1995). "Specific and nonspecific responses to Plasmodium falciparum blood-stage parasites and observations on the gametocytemia in schoolchildren living in a malaria-endemic area of Mozambique " Am J Trop Med Hyg 52(1): 50-9. Hostettmann, K. (1997). Tout savoir sur le pouvoir des plantes, sources de médicaments. Lausanne ; Paris, Favre, 240p. Ichimori, K., C. F. Curtis and G. A. Targett (1990). "The effects of chloroquine on the infectivity of chloroquine-sensitive and -resistant populations of Plasmodium yoelii nigeriensis to mosquitoes." Parasitology 100 Pt 3: 377-81. Jeffery, G. M. and D. E. Eyles (1955). "Infectivity to mosquitoes of Plasmodium falciparum as related to gametocyte density and duration of infection" Am J Trop Med Hyg 4(5): 781-9. Karbwang, J., K. Na-Bangchang, A. Thanavibul, D. Bunnag, T. Chongsuphajaisiddhi and T. Harinasuta (1994). "Comparison of oral artesunate and quinine plus tetracycline in acute uncomplicated falciparum malaria" Bull World Health Organ 72(2): 233-8.
![Page 149: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/149.jpg)
148
Kaushal, D. C., R. Carter, J. Rener, C. A. Grotendorst, L. H. Miller and R. J. Howard (1983). "Monoclonal antibodies against surface determinants on gametes of Plasmodium gallinaceum block transmission of malaria parasites to mosquitoes " J Immunol 131(5): 2557-62. Khositnithikul, R., P. Tan-Ariya and M. Mungthin (2008). "In vitro atovaquone/proguanil susceptibility and characterization of the cytochrome b gene of Plasmodium falciparum from different endemic regions of Thailand." Malar J 7: 23. Klein, T. A., M. S. Tada, J. B. Lima and T. H. Katsuragawa (1991). "Infection of Anopheles darlingi fed on patients infected with Plasmodium vivax before and during treatment with chloroquine in Costa Marques, Rondonia, Brazil." Am J Trop Med Hyg 45(4): 471-8. Kombila, M., T. H. Duong, D. Dufillot, J. Koko, V. Guiyedi, C. Guiguen, A. Ferrer and D. Richard-Lenoble (1997). "Light microscopic changes in Plasmodium falciparum from Gabonese children treated with artemether" Am J Trop Med Hyg 57(6): 643-5. Kondrashin, A. V., A. M. Baranova and V. P. Sergiev (2010)."[Widespread use of primaquine for control of Plasmodium vivax epidemics in a population with varying degrees of G6PD deficiency]." Med Parazitol (Mosk)(4): 24-8. Krogstad, D. J., I. Y. Gluzman, D. E. Kyle, A. M. Oduola, S. K. Martin, W. K. Milhous and P. H. Schlesinger (1987). "Efflux of chloroquine from Plasmodium falciparum: mechanism of chloroquine resistance" Science 238(4831): 1283-5. Krotoski, W. A. (1989). "The hypnozoite and malarial relapse." Prog Clin Parasitol 1: 1-19. Krudsood, S., S. N. Patel, N. Tangpukdee, W. Thanachartwet, W. Leowattana, K. Pornpininworakij, A. K. Boggild, S. Looareesuwan and K. C. Kain (2007). "Efficacy of atovaquone-proguanil for treatment of acute multidrug-resistant Plasmodium falciparum malaria in Thailand." Am J Trop Med Hyg 76(4): 655-8. Landau, I. and R. Killick-Kendrick (1966). "Rodent plasmodia of the Republique Centrafricaine: the sporogony and tissue stages of Plasmodium chabaudi and P. berghei yoelii." Trans R Soc Trop Med Hyg 60(5): 633-49. Landau, I., F. Miltgen, Y. Boulard, A. G. Chabaud and D. Baccam (1979). "[Study of gametocytes from the Plasmodium "vivax" group: morphology, development in Anopheles and infectivity of Plasmodium yoelii microgametocytes]" Ann Parasitol Hum Comp 54(2): 145-61. Lanotte, P. and S. Siboumedine (1995). Etude de l’activité des molecules antibiotiques sur les formes intra-hépatique de Plasmodium berghei. Tours Université de François Rabelais C2 de parasitologie Le Bras, J., L. Basco and G. Charmot (1993). "Mechanisms of chemoresistance in Plasmodium falciparum and its different profiles." Cahiers Santé 3: 293-301. Le Bras, J., P. Ringwald, C. Monserie and L. K. Basco (1991). "[Mefloquine and halofantrine, new therapeutic drugs of malaria]." Rev Med Interne 12(1): 68-74.
![Page 150: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/150.jpg)
149
Lensen, A., L. Mulder, T. Tchuinkam, L. Willemsen, W. Eling and R. Sauerwein (1998). "Mechanisms that reduce transmission of Plasmodium falciparum malaria in semiimmune and nonimmune persons" J Infect Dis 177(5). Lensen, A. H. (1996). "Infectivity of malarial parasites to mosquitoes: 'the interdependent roles of parasite vector and host." Ann Trop Med Parasitol 90(4): 359-65. Lensen, A. H., M. Bolmer-Van de Vegte, G. J. van Gemert, W. M. Eling and R. W. Sauerwein (1997). "Leukocytes in a Plasmodium falciparum-infected blood meal reduce transmission of malaria to Anopheles mosquitoes. " Infect Immun 65(9): 3834-7. Levine, R. A., S. C. Wardlaw and C. L. Patton (1989). "Detection of haematoparasites using quantitative buffy coat analysis tubes." Parasitol Today 5(4): 132-4. Lingnau, A., G. Margos, W. A. Maier and H. M. Seitz (1993). "The effects of hormones on the gametocytogenesis of Plasmodium falciparum in vitro" Appl Parasitol 34(3): 153-60. Lumsden, W. H. R. and D. S. Bertram (1940). "Observations on the biology of Plasmodium gallinaceunm Brumpt 1935, in the domestic fowl, with special reference to the production of gametocytes and their development in Aedes aegypti (L). " Ann Trop Med Parasitol 34: 135-160. MacDonald, G. (1957). The epidemoloy and control of malaria Oxford University Press. Mahmoudi, N., L. Ciceron, J. F. Franetich, K. Farhati, O. Silvie, W. Eling, R. Sauerwein, M. Danis, D. Mazier and F. Derouin (2003). "In vitro activities of 25 quinolones and fluoroquinolones against liver and blood stage Plasmodium spp." Antimicrob Agents Chemother 47(8): 2636-9. Mahmoudi, N., R. Garcia-Domenech, J. Galvez, K. Farhati, J. F. Franetich, R. Sauerwein, L. Hannoun, F. Derouin, M. Danis and D. Mazier (2008). "New active drugs against liver stages of Plasmodium predicted by molecular topology." Antimicrob Agents Chemother 52(4): 1215-20. Marfurt, J., F. Chalfein, P. Prayoga, F. Wabiser, E. Kenangalem, K. A. Piera, B. Machunter, E. Tjitra, N. M. Anstey and R. N. Price (2011). "Ex vivo drug susceptibility of ferroquine against chloroquine-resistant isolates of Plasmodium falciparum and P. vivax." Antimicrob Agents Chemother 55(9): 4461-4. Maswoswe, S. M., W. Peters and D. C. Warhurst (1985). "Corticosteroid stimulation of the growth of Plasmodium falciparum gametocytes in vitro " Ann Trop Med Parasitol 79(6): 607-16. McCarthy, V. C., D. F. Clyde and W. E. Woodward (1978). "Plasmodium falciparum: responses of a semi-immune individual to homologous and heterologous challenges, and non-infectivity of gametocytes in Anopheles stephensi " Am J Trop Med Hyg 27(1 Pt 1): 6-8. Mendis, K. N., Y. D. Munesinghe, Y. N. de Silva, I. Keragalla and R. Carter (1987). "Malaria transmission-blocking immunity induced by natural infections of Plasmodium vivax in humans " Infect Immun 55(2): 369-72. Mendis, K. N. and G. A. Targett (1979). "Immunisation against gametes and asexual erythrocytic stages of a rodent malaria parasite." Nature 277(5695): 389-91.
![Page 151: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/151.jpg)
150
Molineaux, L. and G. Gramiccia (1980). Le projet Graki : recherché sur l’épidémiologie du paludisme et la lutte antipaludique dans la savane soudanienne de l’Afrique Occidentale Genève, OMS 197-242. Motard, A., M. Marussig, L. Renia, D. Baccam, I. Landau, D. Mattei, G. Targett and D. Mazier (1995). "Immunization with the malaria heat shock like protein hsp70-1 enhances transmission to the mosquito." Int Immunol 7(1): 147-50. Mouchet, J., P. Carnevale and S. Manguin (2004). Biodiversity of Malaria in the World Paris, John Libbey Eurotext, 427p. Nacher, M., P. Singhasivanon, U. Silachamroon, S. Treeprasertsuk, T. Tosukhowong, S. Vannaphan, F. Gay, D. Mazier and S. Looareesuwan (2002). "Decreased hemoglobin concentrations, hyperparasitemia, and severe malaria are associated with increased Plasmodium falciparum gametocyte carriage " J Parasitol 88(1): 97-101. Naotunne, T., Rathnayake KD, Jayasinghe A, Carter R and M. KN (1990). "Plasmodium cynomolgi: serum-mediated blocking and enhancement of infectivity to mosquitoes during infections in the natural host, Macaca sinica." Exp Parasitol 71(3): 305-13. Naotunne, T. S., N. D. Karunaweera, G. Del Giudice, M. U. Kularatne, G. E. Grau, R. Carter and K. N. Mendis (1991). "Cytokines kill malaria parasites during infection crisis: extracellular complementary factors are essential." J Exp Med 173(3): 523-9. Naotunne, T. S., N. D. Karunaweera, K. N. Mendis and R. Carter (1993). "Cytokine-mediated inactivation of malarial gametocytes is dependent on the presence of white blood cells and involves reactive nitrogen intermediates " Immunology 78(4): 555-62. Noden, B. H., P. S. Beadle, J. A. Vaughan, C. B. Pumpuni, M. D. Kent and J. C. Beier (1994). "Plasmodium falciparum: the population structure of mature gametocyte cultures has little effect on their innate fertility " Acta Trop 58(1): 13-9. Nussenzweig, R. S., J. P. Vanderberg, H. Most and C. Orton (1969). "Specificity of protective immunity produced by x-irradiated Plasmodium berghei sporozoites." Nature 222(5192): 488-9. Olliaro, P. L. and P. I. Trigg (1995). "Status of antimalarial drugs under development " Bull World Health Organ 73(5): 565-71. Ono, T., T. Nakai and T. Nakabayashi (1986). "Induction of gametocytogenesis in Plasmodium falciparum by the culture supernatant of hybridoma cells producing anti-P. falciparum antibody." Biken J 29(3-4): 77-81. Paul, R. E., P. T. Brey and V. Robert (2002). "Plasmodium sex determination and transmission to mosquitoes." Trends Parasitol 18(1): 32-8. Peters, W. (1965). "Drug resistance in Plasmodium berghei Vincke and Lips, 1948. 3. Multiple drug resistance." Exp Parasitol 17(1): 97-102. Petit, G., D. Camus, E. Dei-Cas and I. Landau (1982). "[Immediate inhibition of the infectivity of gametocytes of Plasmodium yoelii nigeriensis by serum from rodents infected for 5 days]." Ann Parasitol Hum Comp 57(5): 507-8.
![Page 152: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/152.jpg)
151
Pichon, G., H. P. Awono-Ambene and V. Robert (2000). "High heterogeneity in the number of Plasmodium falciparum gametocytes in the bloodmeal of mosquitoes fed on the same host." Parasitology 121 ( Pt 2): 115-20. Pieroni, P., C. D. Mills, C. Ohrt, M. A. Harrington and K. C. Kain (1998). "Comparison of the ParaSight-F test and the ICT Malaria Pf test with the polymerase chain reaction for the diagnosis of Plasmodium falciparum malaria in travellers." Trans R Soc Trop Med Hyg 92(2): 166-9. Piper, K. P., R. E. Hayward, M. J. Cox and K. P. Day (1999). "Malaria transmission and naturally acquired immunity to PfEMP-1." Infect Immun 67(12): 6369-74. Pradines, B., H. Vial and P. Olliaro (2003). "[Malaria prophylaxis and treatment: problems, recent developments and perspectives]." Med Trop (Mars) 63(1): 79-98. Price, R. N., F. Nosten, C. Luxemburger, F. O. ter Kuile, L. Paiphun, T. Chongsuphajaisiddhi and N. J. White (1996). "Effects of artemisinin derivatives on malaria transmissibility." Lancet 347(9016): 1654-8. Pukrittayakamee, S., K. Chotivanich, A. Chantra, R. Clemens, S. Looareesuwan and N. J. White (2004). "Activities of artesunate and primaquine against asexual- and sexual-stage parasites in falciparum malaria." Antimicrob Agents Chemother 48(4): 1329-34. Puri, S. K. and G. P. Dutta (2005). "Plasmodium cynomolgi: gametocytocidal activity of the anti-malarial compound CDRI 80/53 (elubaquine) in rhesus monkeys." Exp Parasitol 111(1): 8-13. Quakyi, I. A., R. Carter, J. Rener, N. Kumar, M. F. Good and L. H. Miller (1987). "The 230-kDa gamete surface protein of Plasmodium falciparum is also a target for transmission-blocking antibodies." J Immunol 139(12): 4213-7. Ramkaran, A. E. and W. Peters (1969). "Infectivity of chloroquine resistant Plasmodium berghei to Anopheles stephensi enhanced by chloroquine." Nature 223(5206): 635-6. Read, A. F., A. Narara, S. Nee, A. E. Keymer and K. P. Day (1992). "Gametocyte sex ratios as indirect measures of outcrossing rates in malaria." Parasitology 104 ( Pt 3): 387-95. Rener, J., R. Carter, Y. Rosenberg and L. H. Miller (1980). "Anti-gamete monoclonal antibodies synergistically block transmission of malaria by preventing fertilization in the mosquito." Proc Natl Acad Sci U S A 77(11): 6797-9. Robert, V. and C. Boudin (2003). "[Biology of man-mosquito Plasmodium transmission]." Bull Soc Pathol Exot 96(1): 6-20. Robert, V., J. F. Molez and J. F. Trape (1996). "Short report: gametocytes, chloroquine pressure, and the relative parasite survival advantage of resistant strains of falciparum malaria in west Africa." Am J Trop Med Hyg 55(3): 350-1. Robert, V., A. F. Read, J. Essong, T. Tchuinkam, B. Mulder, J. P. Verhave and P. Carnevale (1996). "Effect of gametocyte sex ratio on infectivity of Plasmodium falciparum to Anopheles gambiae." Trans R Soc Trop Med Hyg 90(6): 621-4.
![Page 153: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/153.jpg)
152
Rosanas-Urgell, A., D. Mueller, I. Betuela, C. Barnadas, J. Iga, P. A. Zimmerman, H. A. del Portillo, P. Siba, I. Mueller and I. Felger (2010). "Comparison of diagnostic methods for the detection and quantification of the four sympatric Plasmodium species in field samples from Papua New Guinea." Malar J 9: 361. Rosenberg, R., L. C. Koontz, K. Alston and F. K. Friedman (1984). "Plasmodium gallinaceum: erythrocyte factor essential for zygote infection of Aedes aegypti." Exp Parasitol 57(2): 158-64. Rosenthal, P. J. (2003). "Antimalarial drug discovery: old and new approaches." J Exp Biol 206(Pt 21): 3735-44. Rougemont, M., M. Van Saanen, R. Sahli, H. P. Hinrikson, J. Bille and K. Jaton (2004). "Detection of four Plasmodium species in blood from humans by 18S rRNA gene subunit-based and species-specific real-time PCR assays." J Clin Microbiol 42(12): 5636-43. Rutledge, L. C., D. J. Gould and B. Tantichareon (1969). "Factors affecting the infection of anophelines with human malaria in Thailand." Trans R Soc Trop Med Hyg 63(5): 613-9. Savoie, A. (2004). Injection de broyats de foie parasite : méthode d’étude de l’efficacité thérapeutique sur les formes hépatique de plasmodies de rongeurs Tours Université François Rabelais C2 de parasitologie Schneweis, S., W. A. Maier and H. M. Seitz (1991). "Haemolysis of infected erythrocytes--a trigger for formation of Plasmodium falciparum gametocytes?" Parasitol Res 77(5): 458-60. Shanks, G. D., K. C. Kain and J. S. Keystone (2001). "Malaria chemoprophylaxis in the age of drug resistance. II. Drugs that may be available in the future." Clin Infect Dis 33(3): 381-5. Shapiro, T. A., C. D. Ranasinha, N. Kumar and P. Barditch-Crovo (1999). "Prophylactic activity of atovaquone against Plasmodium falciparum in humans." Am J Trop Med Hyg 60(5): 831-6. Sidjanski, S. and J. P. Vanderberg (1997). "Delayed migration of Plasmodium sporozoites from the mosquito bite site to the blood." Am J Trop Med Hyg 57(4): 426-9. Simpson, J. A., L. Aarons, W. E. Collins, G. M. Jeffery and N. J. White (2002). "Population dynamics of untreated Plasmodium falciparum malaria within the adult human host during the expansion phase of the infection." Parasitology 124(Pt 3): 247-63. Sinden, R. E. (1998). Gametocyogenesis and sexual development. Malaria : parasite biology, pathogenesis and protection. I. W. Sherman. Washington D.C., American Society for Microbiology Press: 25-48. Sinden, R. E., G. A. Butcher, O. Billker and S. L. Fleck (1996). "Regulation of infectivity of Plasmodium to the mosquito vector." Adv Parasitol 38: 53-117. Sinden, R. E. and M. E. Smalley (1976). "Gametocytes of Plasmodium falciparum: phagocytosis by leucocytes in vivo and in vitro." Trans R Soc Trop Med Hyg 70(4): 344-5.
![Page 154: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/154.jpg)
153
Singh, B., L. Kim Sung, A. Matusop, A. Radhakrishnan, S. S. Shamsul, J. Cox-Singh, A. Thomas and D. J. Conway (2004). "A large focus of naturally acquired Plasmodium knowlesi infections in human beings." Lancet 363(9414): 1017-24. Slater, A. F. (1993). "Chloroquine: mechanism of drug action and resistance in Plasmodium falciparum." Pharmacol Ther 57(2-3): 203-35. Smalley, M. E. (1977). "Plasmodium falciparum gametocytes: The effect of chloroquine on their development." Trans R Soc Trop Med Hyg 71(6): 526-9. Smalley, M. E. and J. Brown (1981). "Plasmodium falciparum gametocytogenesis stimulated by lymphocytes and serum from infected Gambian children." Trans R Soc Trop Med Hyg 75(2): 316-7. Snow, R. W., J. F. Trape and K. Marsh (2001). "The past, present and future of childhood malaria mortality in Africa." Trends Parasitol 17(12): 593-7. Sokhna, C. S., J. F. Trape and V. Robert (2001). "Gametocytaemia in Senegalese children with uncomplicated falciparum malaria treated with chloroquine, amodiaquine or sulfadoxine + pyrimethamine." Parasite 8(3): 243-50. Steele, J. C., R. J. Phelps, M. S. Simmonds, D. C. Warhurst and D. J. Meyer (2002). "Two novel assays for the detection of haemin-binding properties of antimalarials evaluated with compounds isolated from medicinal plants." J Antimicrob Chemother 50(1): 25-31. Strickland, G. T., E. Fox, M. Sarwar, A. A. Khaliq and M. Macdonald (1986). "Effects of chloroquine, amodiaquine and pyrimethamine-sulfadoxine on Plasmodium falciparum gametocytemia." Am J Trop Med Hyg 35(2): 259-62. Sucharit, S., K. Surathin, W. Tumrasvin and P. Sucharit (1977). "Chloroquine resistant Plasmodium falciparum in Thailand: Susceptibility of Anopheles." J Med Assoc Thai 60(12): 648-54. Surolia, N. and G. Padmanaban (1991). "Chloroquine inhibits heme-dependent protein synthesis in Plasmodium falciparum." Proc Natl Acad Sci U S A 88(11): 4786-90. Targett, G., C. Drakeley, M. Jawara, L. von Seidlein, R. Coleman, J. Deen, M. Pinder, T. Doherty, C. Sutherland, G. Walraven and P. Milligan (2001). "Artesunate reduces but does not prevent posttreatment transmission of Plasmodium falciparum to Anopheles gambiae." J Infect Dis 183(8): 1254-9. Taylor, L. H. and A. F. Read (1997). "Why so few transmission stages? Reproductive restraint by malaria parasites." Parasitol Today 13(4): 135-40. Taylor, L. H., D. Walliker and A. F. Read (1997). "Mixed-genotype infections of malaria parasites: within-host dynamics and transmission success of competing clones." Proc Biol Sci 264(1383): 927-35. Touze, J. E., L. Fourcade, B. Pradines, P. Hovette, P. Paule and P. Heno (2002). "[Mechanism of action of antimalarials. Value of combined atovaquone/proguanil]." Med Trop (Mars) 62(3): 219-24.
![Page 155: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/155.jpg)
154
Trager, W. (2005). "What triggers the gametocyte pathway in Plasmodium falciparum?" Trends Parasitol 21(6): 262-4. Trager, W. and G. S. Gill (1992). "Enhanced gametocyte formation in young erythrocytes by Plasmodium falciparum in vitro." J Protozool 39(3): 429-32. Trager, W., G. S. Gill, C. Lawrence and R. L. Nagel (1999). "Plasmodium falciparum: enhanced gametocyte formation in vitro in reticulocyte-rich blood." Exp Parasitol 91(2): 115-8. Tse, C. and J. Capeau (2003). "[Real time PCR methodology for quantification of nucleic acids]." Ann Biol Clin (Paris) 61(3): 279-93. Vermeulen, A. N., W. F. Roeffen, J. B. Henderik, T. Ponnudurai, P. J. Beckers and J. H. Meuwissen (1985). "Plasmodium falciparum transmission blocking monoclonal antibodies recognize monovalently expressed epitopes." Dev Biol Stand 62: 91-7. Voller, A. and R. S. Bray (1962). "Fluorescent antibody staining as a measure of malarial antibody." Proc Soc Exp Biol Med 110: 907-10. Warhurst, D. C. (1999). "Drug resistance in Plasmodium falciparum malaria." Infection 27 Suppl 2: S55-8. WHO (1984). Advances in malaria cheotherapy. Report scientific group. Geneva. WHO (2000). The african summit on roll back malaria. Abuja, Nigeria. WHO (2003). Malaria entomology and vector control-Learner's Guide Geneva. WHO (2011). World malaria report 2011. Geneva 259p. Wiesner, J., R. Ortmann, H. Jomaa and M. Schlitzer (2003). "New antimalarial drugs." Angew Chem Int Ed Engl 42(43): 5274-93. Winger, L. A., N. Tirawanchai, J. Nicholas, H. E. Carter, J. E. Smith and R. E. Sinden (1988). "Ookinete antigens of Plasmodium berghei. Appearance on the zygote surface of an Mr 21 kD determinant identified by transmission-blocking monoclonal antibodies." Parasite Immunol 10(2): 193-207. Winkler, S., C. Brandts, W. H. Wernsdorfer, W. Graninger, U. Bienzle and P. G. Kremsner (1994). "Drug sensitivity of Plasmodium falciparum in Gabon. Activity correlations between various antimalarials." Trop Med Parasitol 45(3): 214-8.
![Page 156: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/156.jpg)
155
Annexes
![Page 157: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/157.jpg)
156
Annexe 1 Technique de coloration des lames
FFrr oott tt iiss ssaanngguuiinn ddee ssoouurr iiss
Technique : le manipulateur attrape tout d’abord la souris par la queue, il fait remonter par
frottement le sang au bout de celle-ci puis, coupe l’extrémité de la queue avec des ciseaux. La
première goutte de sang sortant de la queue est éliminée afin de pouvoir déposer la deuxième
goutte sur une lame. Avec le biseau d’une autre lame, la goutte est étirée pour qu’il y ait du sang
sur toute la lame. Enfin, le frottis est séché en agitant la lame.
CCoolloorr aatt iioonn aauu GGiieemmssaa
Technique : On fixe les frottis au méthanol pendant 5 minutes, puis, une fois sèches, on dépose
les lames dans une cuve contenant une solution de Giemsa 10% diluée avec du tampon
phosphate. Après 45 minutes, on vide la cuve, on récupère les lames que l’on rince sous l’eau
distillée et on les laisse sécher à l’air libre.
Composition du Giemsa 10% dilué pour un volume de 100mL :
• 10mL de Giemsa
• 9mL de Tampon phosphate
• 81mL d’eau distillée
Figure 46. Frottis sanguin de souris après coloration au Giemsa
![Page 158: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/158.jpg)
157
PPrr ééppaarr aatt iioonn ddee ll ’’ aanneesstthhééssiiqquuee
Préparation pour 4mL :
• 2 mL de Kétamine (Imalgène®, Merial, Lyon, France)
• 0,5 mL de Xylazine (Rompun® 2%, Bayer santé, Puteaux, France)
• 1,5 mL de sérum physiologique
EEvvaalluuaatt iioonn ddee llaa ppaarr aassii ttéémmiiee
Technique : la lame est installée sur le portoir du microscope, avec une goutte d’huile à
immersion et l’objectif 100 est réglé. Le champ observé dans l’oculaire est divisé en quatre
quart. Sur un quart, toutes les hématies parasitées et saines sont dénombrées. La somme obtenue
est multiplié par 4 afin de connaître le nombre d’hématies par champ. Cette opération est répétée
sur d’autres champs de la même lame, puis pour estimer la parasitémie, il suffit de diviser la
somme des hématies parasitées par la somme totale d’hématies. Les valeurs obtenues sont
traduites ensuite en pourcentage.
![Page 159: ÉCOLE DOCTORALE « Santé, Sciences, Technologies · 2012-02-28 · MATHIEU, MARWAN et ABDALLAH pour leur soutien de chaque instant. Enfin, je tiens à remercier toute la communauté](https://reader035.vdocuments.mx/reader035/viewer/2022063000/5f0cd84b7e708231d4376a04/html5/thumbnails/159.jpg)
158
Résumé
Les objectifs de ce travail étaient d’évaluer qualitativement et quantitativement l’effet d’antipaludiques
« classiques » (primaquine, Malarone®, amino-4-quinoléines) et « d’avenir» (artésunate, ferroquine,
seuls ou associés) sur les formes hépatiques et les stades sexués du parasite responsable de la
transmission du paludisme. Le modèle expérimental comprend des souris swiss femelle infestées par
Plasmodium yœlii et Anopheles stephensi comme moustique vecteur. L’action de la Malarone®
(proguanil-atovaquuone) sur les stades hépatiques est quasi totale et plus importante que celle,
incomplète, de la primaquine, de la ferroquine ou de l’artésunate. Si les molécules précédentes
(ferroquine, artésunate), prescrites à doses subcuratives, entraînent souvent une augmentation de la
gamétocytogénèse, elles altèrent certains stades de gamétocytes et inhibent statistiquement chez le
moustique la formation d’oocystes et leur nombre et, par là même, interviennent négativement dans la
transmission du parasite.
Mots clés : paludisme, stade intra-hépatique, antipaludiques, gamétocytogénèse, transmission
Résumé en anglais
The objective of this study is to evaluate qualitatively and quantitatively the effect of "classic"
(primaquine, Malarone®, amino-4-quinoline) and "future" (artesunate, ferroquine, alone or associated)
antimalarials on the liver forms and sexual stages of the parasite responsible for malaria transmission.
The experimental model was: swiss mouse female infected with Plasmodium yoelii and Anopheles
stephensi as the vector. The action of Malarone® (proguanil-atovaquuone) on liver stages is almost
complete and more than that, incomplete, primaquine, the ferroquine or artesunate. If the previous
molecules (ferroquine, artesunate), prescribed at subcurative doses, often lead to an increase in
gametocytogenesis, they alter certain stages of gametocytes and statistically inhibit the formation of
oocysts in the mosquito; hence, their number involve negatively in the transmission of the parasite.
Key words: malaria, intra-hepatic stage, antimalarial, gametocytogenesis, transmission
Kamla MUSTFA EFFETS DES ANTIPALUDIQUES SUR LES STADES HEPATIQUES
ET LES STADES SEXUES (TRANSMISSION) D’UNE
PLASMODIE MURINE PLASMODIUM YOELII