coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi multipla e ... · appendicectomia 20a 1.17...

Il long non-coding RNA MALAT1:

coinvolgimento nella patogenesi della sclerosi

multipla e regolazione del processo di splicing

alternativo e di backsplicing

Prof. Rosanna Asselta

Department of Biomedical Sciences

Humanitas University

&

Humanitas Clinical and Research Center

© Rosanna_Asselta Il metabolismo dell’RNA nelle malattie neurologiche – 6 Luglio 2018

La Sclerosi Multipla

La sclerosi multipla (SM) è una

malattia complessa

neurodegenerativa del SNC

caratterizzata da

• infiammazione cronica

• demielinazione

• danno assonale

I sintomi clinici includono parestesia,

paresi, atassia, e disfunzioni di

intestino, vescica, e apparato sessuale

L′età di insorgenza è compresa tra i

20-40 anni, e la malattia è 1,5-2 volte

più comune nelle donne


La SM è la causa primaria di invalidità tra i giovani adulti

In Europa

la prevalenza varia da 70 a 100 ogni 100.000 abitanti

l’ incidenza varia tra 2 e 4 ogni 100.000 abitanti

Esiste un gradiente nord-sud nella incidenza e prevalenza

della malattia



DISTRIBUZIONE

GLOBALE

DELLA MS

ALTO RISCHIO

PROBABILE ALTO RISCHIO

BASSO RISCHIO

PROBABILE BASSO RISCHIO

GRADIENTE NORD/SUD

ALTRO RISCHIO

La patogenesi della malattia non è ancora del tutto chiara, con

l’autoimmunità quale ipotesi più accreditata

Le cellule del sistema immunitario si attivano e attraversano la barriera

emato-encefalica, andando ad attaccare la mielina e gli assoni. Ciò

determina l’insorgenza delle lesioni cerebrali tipiche della SM

Cellule B

Cellule T attivate

CitochineChemochineMMP

Cellule T

NOMMPTNF-

macrophage



Anticorpi e complemento

Macrofagi

La Sclerosi Multipla – Quattro sottotipi

Evoluzione e sintomatologia sono eterogenee

Esistono quattro varianti cliniche della malattia

BENIGNA

INTERMITTENTE REMITTENTE (RR) PROGRESSIVA SECONDARIA (SP)

PROGRESSIVA PRIMARIA (PP)

D

I

S

A

B

I

L

I

T

Á

TEMPO

85%

5% 10%


La Sclerosi Multipla – Una malattia complessa

La sclerosi multipla è una malattia complessa, caratterizzata

dalla interazione tra…

Componente ambientale Predisposizione genetica





Analizzato 44 meta-analisi

416 studi




Associazioni supportate da prove convincenti

OR [95% CI] P value

Sieropositività all’antigene nucleare del virus

Epstein-Barr4.46 [3.26-6.09] 1.5 * 10-19

Fumo 1.52 [1.39-1.66] 7.0 * 10-18

Altre associazioni

Appendicectomia 20a 1.17 [1.02-1.34] 0.05

Tonsillectomia 20a 1.32 [1.09-1.61] 0.05

Vaccinazione contro difterite 0.60 [0.40-0.91] 0.05

Vaccinazione contro tetano 0.71 [0.57-0.88] 0.05

Ferite da trauma 1.41 [1.03-1.92] 0.05






In più…

Mancanza di vitamina D

Uso eccessivo di sale

Stress ossidativo

… sembrerebbero avere

un effetto predisponente






La predisposizione genetica spiegherebbe il 30% del rischio

di malattia

Di questo, solo un terzo è stato spiegato grazie a…

Studi di linkage estesi a tutto

il genoma in famiglie

Studi di associazione su gene

candidato

Studi di associazione estesi a

tutto il genoma (GWAS) su

grandi coorti caso-controllo






La predisposizione genetica spiegherebbe il 30% del rischio

di malattia

Di questo, solo un terzo è stato spiegato grazie a…

Aplotipo DRB1*15:01

nella regione HLA

+

˃200 geni associati alla SM

(molti con funzioni immunologiche)

Tra gli altri, IL7R, SP140, e

PRKCA





Studi di linkage estesi a tutto

il genoma in famiglie

Studi di associazione su gene

candidato

Studi di associazione estesi a

tutto il genoma (GWAS) su

grandi coorti caso-controllo


Solo in pochi casi la specifica variante funzionale è stata

identificata e caratterizzata






Solo in pochi casi la specifica variante funzionale è stata

identificata e caratterizzata

Se caratterizzata, la variante funzionale è stata molto

spesso associata ad un pattern di splicing aberrante del

gene corrispondente





Le varianti funzionali che hanno conseguenze sullo splicing

causano solitamente...

Splicing aberranti più comuni



1

2

3

Skipping dell’esone

Ritenzione dell’introne

Attivazione di siti criptici

… e i fattori coinvolti sono quelli responsabili della…

Splicing aberranti più comuni

1

2

Elementi in cis (i.e., sequenze

specifiche presenti sulla

molecola di RNA)

Elementi in-trans (i.e.,

proteine leganti sequenze

in-cis che aumentano o

diminuiscono l’efficienza

dello splicing)

Esempi:

proteine hnRNP e SRSF


Regolazione dello splicing


1

2

3

Skipping dell’esone

Ritenzione dell’introne

Attivazione di siti criptici

Sclerosi multipla & splicing?

C’è una

disregolazione

del processo di

splicing nella

SM?


Per rispondere a questa domanda…

Parole chiave

“Multiple sclerosis”

“Blood”

“Homo sapiens”

Analisi di dati di microarray

STEP 1 – Consultazione del database GEO

Criteri di selezione

Design Caso-Controllo

Su campioni di sangue

Min di 10 casi & 10 contolli

1.800 voci


7 dataset

Ulteriori criteri di selezione

Solo PAZIENTI RR

Solo pazienti LONTANI DA ULTIMO

TRATTAMENTO

190 pazienti RR

182 controlli sani

SM

Controlli

0

10

20

30

40

50

60

N in

div

idu

i

Distribuzione di casi SM e controlli nei 7 dataset



STEP 2 – Analisi dell’espressione genica

Software GEO2R

(basato su Bioconductor)

Recuperato i 3.000 geni più disregolati

per CIASCUN dataset

Indipendentemente dal fold change

Indipendentemente dal P value

Indipendentemente dalla direzione (UP / DOWN regulation)



STEP 3 – Ricerca di gruppi di geni

disregolati funzionalmente correlati

Software DAVID(The Database for Annotation,

Visualization and Integrated Discovery)



0

50

100

150

200

250

300N

ind

ivid

ui

GSE13732

GSE41848

GSE17048

GSE43592

GSE21942

GSE41849

I 5 pathway risultati arricchiti in geni disregolati

GSE41890



0

50

100

150

200

250

300N

ind

ivid

ui

GSE13732

GSE41848

GSE17048

GSE43592

GSE21942

Pathway più disregolato

Disregolazione significativa in 5 su

7 dataset

Meta-analisi: p value 7,7 * 10-23

Paraboschi et al., Int J Mol Sci. 16:23463-81, 2015



I 5 pathway risultati arricchiti in geni disregolati

STEP 4 – Identificazione di trascritti disregolati in

comune tra i dataset appartenenti alla categoria

"mRNA splicing"

CELF1

MBNL1

CSTF3

SRSF10

GEMIN6

HNRNPA2B1HNRNPH1

SRSF3 SCAF11

SRSF1

POLR2E

HNRNPH3

DDX39B

POLR2J

RPL36AP51

YTHDC1

mRNA

splicing

5/5 dataset

4/5 dataset

3/5 dataset



PCBP1



CELF1

MBNL1

CSTF3

SRSF10

GEMIN6

HNRNPA2B1HNRNPH1

SRSF3 SCAF11

SRSF1

POLR2E

HNRNPH3

DDX39B

POLR2J

RPL36AP51

YTHDC1

mRNA

splicing

CELF1

(CUGBP Elav-like family member 1)

Regolatore dello splicing di dozzine di

trascritti

Coinvolto nel processo di attivazione dei

linfociti T

Nei dataset analizzati, CELF1 è down-

regolato nei casi SM

(p = 4*10-5)



STEP 4 – Identificazione di trascritti disregolati in

comune tra i dataset appartenenti alla categoria

"mRNA splicing"

Misurazione di CELF1 in pazienti e controlli


30 casi SM 30 controlli

Estrazione di RNA da PBMC

Real-time RT-PCR

8

6

4

2

0

Liv

ell

i d

i e

sp

res

sio

ne

di C

EL

F1

Controlli

N=30

MS casi

N=30

P=0,0015

Confermata la down-regolazione

di CELF1 nei casi SM


Per ricapitolare brevemente…

CELF1

dysregulation


Varianti associate a SM spesso

alterano lo

splicing

Dati derivanti dalla letteratura e da analisi di dati

depositati in banche dati

CELF1

dysregulation


Disregolazione generale

dei geni dello splicing


Dati derivanti dalla letteratura e da analisi di dati

depositati in banche dati


alterano lo

splicing

CELF1

dysregulation

Disregolazione di

CELF1




alterano lo

splicing



Considerando che i geni regolatori dello splicing sono

disregolati nella SM…

Questi geni regolatori…

… hanno un effetto sullo splicing dei trascritti

«downstream»?

HNRNPFHNRNPH

Geni regolatori dello splicing

CELF1

Splicing pattern su trascritti a valle


Caratteristiche comuni:

Avere un pattern di splicing con isoforme “fisiologiche" alternative

Presenza di un polimorfismo in grado di influenzare il pattern di splicing

Scelta di potenziali geni target







Senza ipotesi a-priori

NFAT5

GSDMB

Senza ipotesi a-priori Associati alla SM

NFAT5

GSDMB

IL7R

SP140


PRKCA





NFAT5

NFAT5, Nuclear factor of activated T-cells 5




P=0,026

Controlli

P=0,96

Casi SM

% d

i is

ofo

rma

2

/ tr

ascritti to

tali

NFAT5

Splicing pattern

correlato a genotipo




P=0,026

Controlli

P=0,96

Casi SM

Perdita della correlazione tra

splicing e genotipo in SM

GSDMB

P=0,14

Casi SM

GSDMB, Gasdermin B


rs35104165

(G>A)

gagg[a/t]ttcca

4 85 6 75’ 3’ GSDMB

Cardamone et al., Int J Mol Sci. 18(3), 2017


P=8*10-5

Controlli

GSDMB

Splicing pattern





rs35104165

(G>A)

gagg[a/t]ttcca

4 85 6 75’ 3’ GSDMB

Cardamone et al., Int J Mol Sci. 18(3), 2017


P=0,14

Casi SM

P=8*10-5

Controlli

IL7R

Splicing pattern


? ? ?



? ? ?

rs6897932

(C/T)

Controlli

N=36

Casi SM

N=20

35

40

45

50

55

60

***

% (

5

6 +

6

)/ T

rascritti to

tali

La frequenza dell’allele

minore è bassa, non

abbiamo trovato un numero

sufficiente di soggetti per

poter stratificare sulla base

dei tre genotipi

IL7R, Interleukin 7 Receptor



SP140

Splicing pattern




Casi SM Controlli

6 7 8 SP1405’ 3’

rs28445040

(C>T)

N=4

P=0,23 P=0,0033

%

7/ T

rascritt

i to

tali


SP140, Nuclear Body Protein


Splicing pattern




% d

i in

clu

sio

ne

di esone

3*


PRKCA, Protein Kinase C Alpha Paraboschi et al., Hum Mol Genet. 23:6746-61, 2014

PRKCA 3 3* 4 PRKCA5’ 3’

rs35476409

(GGTG>GGTGGGTG)


P=0,48

Casi SM

P=2,9*10-14

Controlli


CELF1

dysregulation

Disregolazione di

CELF1

Perdita della

correlazione tra

splicing e genotipo

in SM

NFAT5

GSDMB

IL7R

SP140

PRKCA



alterano lo

splicing




CELF1

dysregulation

Disregolazione di

CELF1

NFAT5

GSDMB

IL7R

SP140

PRKCA

Esiste un

meccanismo

unificante che

spieghi tutte

queste

osservazioni?



alterano lo

splicing



Perdita della

correlazione tra

splicing e genotipo

in SM

Prima di rispondere a questa domanda…

IL7R

… facciamo un passo indietro!


Focus sui long non-coding RNA


7 dataset

Ulteriori analisi

Considerati i 250 geni più disregolati

Analisi manuale

Geni disregolati in più di un dataset

Solo 3 dataset con dati sui lncRNA

GSE13732 GSE21942

GSE43592

DHRS4-AS1

DLEU2

FUT8-AS1

GAS5

HCG18

MALAT1

KIAA0125

LINC01004

LINC01128

LINC01184

LINC01560

LINC01578

MEG3

PAXIP1-AS2

PPP3CB-AS1

RUSC1-AS1

PSMD6-AS2 SNHG1

SNHG12

NCK1-AS1 TPT1-AS1

UBXN7-AS1

22 114

10LncRNA maggiormente disregolato

MALAT1

P value meta-analisi: 1,33*10-8



Screenshot dal database GEO

Up-regulazione in casi SM




Real-time RT-PCR Confermata up-reglazione

di MALAT1 in casi SM

Casi SM Controlli


Misurazione di MALAT1 in pazienti e controlli

Livelli di espressione di MALAT1in una coorte Italiana

Liv

elli

di e

sp

ressio

ne

Casi RR-SM

N=23

Controlli

N=30


Real-time RT-PCR

Casi SM Controlli


Livelli di espressione di MALAT1in una coorte Statunitense

Liv

elli

di e

sp

ressio

ne

Confermata up-reglazione

di MALAT1 in casi SM

(accentuata in casi PP)

Casi

RR-SM

N=29

Controlli

N=20

Casi

PP-SM

N=7

Misurazione di MALAT1 in pazienti e controlli

MALAT1 - Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1

MALAT1 potrebbe essere il

responsabile della disregolazione

dello splicing?


MALAT1 - Metastasis-Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1


MALAT1 è un trascritto molto abbondante

E’ localizzato nelle speckle nucleari (corpuscoli arricchiti in fattori di splicing)

MALAT1

Over-espressioneHeLa, HEK293, SH-SY5Y

MALAT1

silenziamento

Liv

elli

di e

sp

ressio

ne

di M

AL

AT

1

MALAT1 – Livelli di espressione in linee cellulari

,


Abbiamo misurato l’effetto dell’over-espressione di MALAT1 sui geni correlati alla

regolazione dello splicing (HRNPF, HNRPH, CELF1 e SRSF1).

L’over-espressione di MALAT1 determina effetti opposti sui geni target a seconda

della linea cellulare

- Up-regolazione significativa in cellule HEK293 ed HeLa

- Down-regolazione significativa in cellule SY5Y

MALAT1 – Esperimenti di over-espressione


Liv

elli

di e

spre

ssio

ne

MALAT1 – Esperimenti di silencing

Abbiamo misurato l’effetto del silencing di MALAT1 sui geni correlati alla

regolazione dello splicing (HRNPF, HNRPH, CELF1 e SRSF1).

Il silenziamento di MALAT1 determina,

anche in questo caso, effetti opposti sui

geni target, e con risultati in direzione

opposta a quelli della over-espressione


Liv

elli

di e

spre

ssio

ne

Liv

elli

di e

spre

ssio

ne

Quindi, MALAT1 regola….

… i geni che regolano lo splicing

MALAT1

HNRNPFHNRNPH


CELF1


MALAT1 – E’ un «master gene»?

La disregolazione di MALAT1…

… influisce sui geni correlati alla SM?

MALAT1

HNRNPFHNRNPH


CELF1

Splicing pattern su trascritti a valle associati a SM

IL7R SP140


PRKCA

MALAT1 – E’ un «master gene»?

Effetto della modulazione di MALAT1 sui geni

associati alla SM

IL7R

La over-espressione e il

silenziamento di MALAT1

determinano effetti opposti

nelle diverse linee cellulari,

aumentando o diminuendo

significativamente i livelli di

skipping degli esoni 5 e 6


Liv

elli

di skip

pin

g e

so

ni 5

+6

MALAT1

over-espressione

mock MALAT1

silenziamento

mock

SP140

L’over-espressione di

MALAT1 determina un

incremento significativo

dello skipping dell’esone 7

SP140



associati alla SML

ive

lli d

i skip

pin

g e

so

ne

7

MALAT1

over-espressione

mock

HeLa

PRKCA

Il silenziamento di MALAT1

determina effetti opposto

nelle diverse linee cellulari,

con aumento o

decremento significativo

dei livelli di skipping

dell’esone 3*

HeLa SH-SY5Y



associati alla SM

Liv

elli

di skip

pin

g e

so

ne

3*

MALAT1

silenziamento

mock MALAT1

silenziamento

mock

Per confermare tutti questi dati…

Abbiamo adottato una strategia «omica», utilizzando un

sistema cellulare più rilevante per la SM

Cellule T Jurkat

3 controlli 3 knockdown

(siRNA)

High-coverage RNA-sequencing

1. Analisi di gene expression

80,5 milioni

read/campione

2. Profilo di splicing alternativo

3. Analisi degli RNA circolari

Software DCC


1 - Analisi di gene expression

107 geni differenzialmente espressi (FDR<0,1)

30 geni up-regolati

77 geni down-regolati

mock MALAT1

kd


100 gruppi arricchiti in geni funzionalmente correlati

(FDR<0,01)

Gene-set enrichment analysis (GSEA)

NES

Enri

chm

entscore

(E

S)

Adaptive immune systemNES=3.6

FDR=0.0

Respiratory electron transport

Enri

chm

entscore

(E

S) NES=5.0

FDR=0.0

Metabolism of mRNA

Enri

chm

entscore

(E

S) NES=4.0

FDR=0.0

Top gene set (FDR<0,001)


1 - Analisi di gene expression

2 - Profilo di splicing alternativo

Tipo di evento di splicing Numero di eventi

Esone skippato

5’ splice site alternativo


Esoni mutualmente esclusivi

Introni ritenuti

699

96

93

38

197

Eventi totali 1123

Identificati 1123 eventi di splicing disregolati (FDR<0,05)


Il silenziamento di MALAT1 diminuisce lo skipping dell’esone 6 di IL7R

Esone5 Esone 6 Esone 7


2 - Profilo di splicing alternativo

Numero di eventi

Esone skippato



Esoni mutualmente esclusivi

Introni ritenuti

699

96

93

38

197

Eventi totali 1123

Identificati 1123 eventi di splicing disregolati (FDR<0,05)

Tipo di evento di splicing

3 – Analisi degli RNA circolari

Validazione in real-time RT-PCR

mock

MALAT1 kd

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

RNF168

n=3

SLC45A4

n=3

** *

Liv

elli

di e

sp

ressio

ne

Log2FC

-log

10(p

-valu

e)

RNF168

SLC45A

4

Identificati 940 circRNA (di

cui 500 mai descritti prima)

49 circRNA

differenzialmente espressi

(P<0,05)

13 circRNA up-regolati

36 circRNA down-regolati

Prodotti dal processo di

backsplicing

La loro biogenesi compete con lo

splicing lineare

Possono agire come spugne

molecolari di miRNA e proteine

circRNA

L’analisi di RNA-seq ha

evidenziato un ruolo di

MALAT1 anche nel

processo di regolazione

del backsplicing




Disregolazione di

CELF1

NFAT5

GSDMB

IL7R

SP140

PRKCA

La disregolazione di MALAT1 ha

effetti

su altri

geni

MALAT1 regola

anche il backsplicing


alterano lo

splicing

Perdita della

correlazione tra

splicing e genotipo

in SM




Che cosa

regola

MALAT1?


Meccanismi molecolari responsabili della

up-regolazione di MALAT1

Sono note diverse condizioni di stress

in grado di up-regolare MALAT1

Ipossia (Lelli et al., 2015)

Stimolazione con LPS (Zhao et al., 2016)

Infezione con Flavivirus (Bhattacharyya and Vrati, 2015)

Trattamento con H2O2 (Yao et al., 2016)


Effetto del trattamento con H2O2 in cellule Jurkat

H2O2

Estrazione

di RNA

Espressione di MALAT1

Norm

aliz

ed

expre

ssio

nle

vel

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2

H2O2NT

*

Aumento di 1,5 volte nei livelli di

espressione di MALAT1

(IL7R

5

6 +

6)/

tota

l

transcripts

(rescale

dvalu

e)

0

0,4

0,8

1,2

1,6

2 *

NT H2O2

Livelli di skipping

dell’esone 6 di IL7R

Aumento di 1,6 volte nei livelli di

skipping dell’esone 6 di IL7R


In conclusione… Il nostro modello

Livelli di

MALAT1 aumentati

Membrana

plasmatica dei

macrofagi

Sistema

NADPH

ossidasi

Livelli di

ROS incrementati

up-/down-regolazione delle

proteine che

regolano lo splicing

Isoforme di proteine

aberranti

(possibili nuovi

antigeni?)

Traduzione

Splicing aberrante

Sclerosi

Multipla

Componentegenetica

Infezionivirali

Ridottaesposizione

solare(vitamina D)

Accumulo di linfociti e macrofagi

nel cervello

Ipossia &

Stress ossidativo

© Rosanna_Asselta

Backsplicing aberranteEffetto spugna sui miRNA deregolato

(espressione genica disregolata)


Grazie a…

Prof. Stefano Duga

Dr. Giulia Soldà

Elvezia Paraboschi (Elvis)

Giulia Cardamone (Momo)

Valeria Rimoldi

Letizia Straniero


Grazie a…


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