Cleaning up your sample prep processes

Julia C. Drees, Ph.D., DABCC

Scientific Director—Chemistry

Kaiser Permanente Regional Laboratories

Berkeley and Richmond, CA 

Financial disclosures

Nothing to disclose

Learning Objectives

After this presentation you will be able to: List strengths and weaknesses of common sample 

preparation techniques used for clinical LC‐MS/MS

Develop a plan to select the best sample prep automation for your lab

Describe pitfalls and solutions encountered when using automated liquid handlers for clinical LC‐MS/MS sample preparation

Common Sample Prep Options

Dilution

Protein Crash or Ultrafiltration (PPT)

Liquid‐Liquid extraction (LLE)

Solid Phase extraction (SPE) – can be offline or online

Dilution

Usually for urine drug confirmations

Typically 10‐20x dilution

Add a filtration step for added robustness

Protein precipitation (PPT)

Avoid adding internal standard (IS) to precipitation solvent

Ideally a ratio of 3:1 precipitant:sample

Options to include phospholipid removal for improved clean‐up and robustness

Must optimize time and parameters for:

Mixing (vigorous; vortex or wide‐bore tip)

Centrifuging (need tight pellet) or vacuum/positive pressure (robust enough?)

Liquid‐Liquid Extraction (LLE)

Best for neutral analytes

Ideally 10:1 solvent:sample

Mixture of polar and nonpolar solvents

More polar → more junk

Phase separation with freeze/pour (manual)

Challenging to automate

Use round deep well 96‐well plates 

Aggressively stress test for cross‐contamination

Supported liquid extraction (SLE) is easier to automate

Solid Phase Extraction (SPE)

Most chances for using scientific approach for optimization

Ion exchange SPE is most selective (charged analytes)

Wash aggressively

Ideally twice, 2D, using pH changes and organic solvents

Sacrificing recovery in favor of clean samples is OK

Elute with small volume for more concentrated samples and/or quicker dry times Adapted from Russell Grant, Ph.D. – MSACL Quant. MS Development

& Validation short course, with permission

Comparing extraction modes

Rank ordered 1=best, 4 = worst.                   

* = Ion exchange SPE mode etc.

Table from Russell Grant, Ph.D. – MSACL Quant. MS Development & Validation short course, with permission

Nature of analyte is 

major decision 

point

Extraction methods’ relative simplicity/robustness  

SPE PPT LLE

Simpler More Robust

Best

Worst

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

Regardless of extraction mode, do this: Add internal standard (IS) as FIRST step in extraction

Evaluate for ion suppression:

Qualitative (post‐column infusion with injection of multiple patient extracts) (Annesley, Clin Chem 2003; 49:1041‐4.)

Quantitative (no matrix & pre‐ & post‐ extraction spikes with matrix) 

Getting pre‐ & post‐spikes correct is tricky!

Challenge with numerous patient samples EARLY in development 

Don’t ignore outliers  1 failure in 10 samples translates to 10 repeats/day with a batch of 100 and 

250 repeats/day with batches of 2,500!  

How will you resolve MRM ratio failures, IS low recovery failures, interfering peaks, etc.?

Do precision first and don’t accept a 10‐15% CV as final

Understand that easier extractions (dilution, basic PPT) may look good in development but cause problems down the road

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

Quantitative characterization of your extraction: recovery, efficiency, matrix effects Sample A: Neat sample (exhibits 100% recovery, no matrix effects)

Sample B: Unspiked patient/matrix sample, extracted then spiked during reconstitution (exhibits only matrix effects)

Sample C: Spiked patient/matrix sample, extracted (reduced recovery, exhibits matrix effects)

% Recovery = C/B * 100

% Matrix Effect = B/A * 100

% Process Efficiency = C/A * 100

Sample A can be averaged replicates; split patients to make samples B & C and do for multiple patients

Reproducibility between patients is more important than approaching 100%

Better: all patients exhibit 70‐80% matrix effect and 50‐60% recovery

Worse: some patients exhibit 90% recovery & matrix effect, others 60%

Matuszewski, Anal Chem 2003; 75(13):3019‐30.

Automation

Online extraction

Automated liquid handlers

Case histories in automation

Online SPE skips evaporation and reconstitution steps

Symbiosis product literature, Spark‐Holland

Online extraction ‐mechanics

Schebb, Anal.Methods 2011; 3: 420

6‐port switching valve

Considerations for feasibility of online extraction

Evaluate cycle times of extraction & LC run with care: Is throughput adequate? Are two extraction lines “multiplexed” to one LC? 

Are more than one extraction + LC lines “multiplexed” to one MSMS?

Compatible with all MS vendors (customers in production)?

Vendor support for method development?

In‐house troubleshooting, repair?

Can’t start with primary patient sample tube  Sample and IS still have to be mixed before the sample is 

put onto the LC‐MSMS

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

Considerations for Online Extraction‐ Analytical Issues

# of solvents, solvent types for wash & regeneration of SPE column (solvent select valves, miscibility, carryover)?

How to elute (strong solvent) from the extraction column and retain downstream on the analytical column (weaker solvent)?

How to do LC gradient development, SST, validate recovery & ion suppression (can you inject with bypass of the extraction column)?

Many labs do a protein crash before online extraction 

Judy Stone, Ph.D., Mass Spec in the Clinical Lab 2013

Automated Liquid Handling

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

Automated Liquid Handling

1, 2, 4, 8, &/or 96 pipetting channels

Tubes and 96 well plates

Can do tube to plate (starting with patient sample tube) AND extraction

Many accessories for extraction (shaker, heater, cooler, vacuum module, positive pressure, evaporator)

Barcode reading

Considerations for best value from ALH Disposable tips vs. washable (consumable cost vs. 

carryover risk, speed of each?)

# of pipette channels (>$ = >throughput) 8 channel good for tube to plate transfer

96 channel good for “plate stamping”

Barcode reading Write files for worklist; interface to LIS/middleware?

Deck space—room for accessories? Gripper to move items around deck (stacking/unstacking)

Off‐deck storage with auto‐transfer to deck

Nearby service support

Application support/programming? Software is generally either user‐friendly OR powerful

Considerations for Automated Liquid Handling – Analytical Issues

Minimum and maximum pipettable volumes (and with what precision)?

Working with difficult liquids 

Precise for organics? (Anti‐dripping solutions?)

Will acids damage components?

Can instrument be vented?

Liquid level sense & clot detection

Reagent delivery channel(s) ‐ how many solvents?

Effective on‐deck mixing is challenging

Cross‐contamination must be aggressively stress‐tested if using 96 well plates

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

Automation choices Online extraction

Vendor “complete” solutions

Thermo‐Scientific/Cohesive Technologies

TLX Turbo‐Flow online SPE extraction

Spark‐Holland/Symbiosis – dual channel cartridge online SPE

Gerstel MPS Workstation with in‐tip dispersive SPE

User‐developed online SPE

Most LC‐MSMS vendors have packages/software ‐extraction pump(s), switching valves, installation, application notes

Automated Liquid Handling (ALH) 

Many vendors and style options

Useful even just for tube to plate before online or off‐the‐deck extraction (e.g., positive pressure SPE)

*Most affordable option

Online Extraction vs. Automated Liquid Handling (ALH)Parameter Online ALH

Tech hands on time/sample Less More

LC sophistication required More Less

Flexibility Less More

Suited to many assays Less More

Suited to 1 high‐volume assay More Less

Sensitivity per L starting sampleǂ More  Less

Risk of carryover More Less

Risk of cross contamination (96‐well plates) Less More

Throughput Less* More 

Adapted from Judy Stone, Ph.D.

ǂIf limited sample available (e.g., pediatrics), online is better. ALH requires dead volume both in sample tube and after reconstitution*Multiplexed online extraction increases throughput

Automated Liquid Handling –Case Histories

Sample prep for 25‐OH Vitamin D analysis by LC‐MSMS

Thanks to my colleagues who helped troubleshoot these cases

Judy Stone, Ph.D.—Center for Advanced Laboratory Medicine, UCSD

Bret Martin – Applications Programmer, Hamilton Robotics

1. Transfer 50 µL IS from reservoir to plate (8 tips, pick up & dispense 12 times)

IS reservoir

2. Transfer serum from tubes to plate (8x12 tips) & mix w tips

Tube to Plate

3. Move plate to 2nd ALH (96 channel head)

4. Transfer serum + IS to PPT/phospholipid removal plate

5. Transfer precipitating reagent to extraction plate and mix with tips

7. Sealed plate on LC-MSMS

Plate Stamping

6. Vacuum to elute into collection plate below

Case 1 –The Touch‐OffTask 

Pipet serum and internal standard (IS) to a 96‐well plate 

Desired intra‐assay precision (within plate) = <5% CV

Development History

Original Protocol:

50 µL IS dispensed into plate

50 µL serum added, mix with tips

Intra‐assay precision 4‐6%         

Revised Protocol:

2 precipitation reagents instead of 1 (more robust)

Total volume had to stay the same

IS volume must be decreased to 25 µL

Problem: %CV ↑ to 6‐9% when IS volume ↓  from 50 µL to 25 µL

Re‐measure bottom of plate dimensions w calipers & adjust height of dispense – not fixed

Lower height of dispense (with only 25 µL not touching off on bottom of plate?) – not fixed

Slow speed of dispense – not fixed

Pause after dispense – not fixed

Blow out of residual volume in tips – not fixed

Solution

Dispense serum 1st

Dispense IS 2nd ‐ touch off to serum (liquid) instead of questionable touch off to (dry) plate

Intra‐assay % CV decreased to 2‐4%

Trade offs 

Touch off to serum requires new tip each well

Increased tip cost (from 8 to 96 tips)

Tube to plate time increased ~5 min/plate

Lesson learned – small changes can make a big difference in liquid handling precision

2. Transfer 50 25 µL IS from reservoir to plate (8 tips, pick up & dispense 12 times) (8x12 tips & mix)

IS reservoir

1. Transfer serum from tubes to plate (8x12 tips) & mix w tips

Switched order of tube to plate. Increased time and tip usage but superior precision.

Case 2 – Missing filtratesTask

Precipitate serum + IS in a hybrid (protein & phospholipid removal) filtration plate –transfer filtrate to collection plate (vacuum)

Major constraint

Don’t move plates off deck during the process to maintain viable work flow for 25 plates/day

Problem

First few plates look good

Then a few wells in every plate –no filtrate transferred to collection plate

All other wells in those plates have expected recovery

?

Investigation

Change of plate lot? – not fixed

Break through of filtration membrane or quick flow through in surrounding wells causing inadequate vacuum for problem wells? – unable to prove or disprove

Clogged membrane in problem wells –why OK before & not now?

Eureka!

Initial studies used frozen aliquots of pooled serum

Had recently switched to fresh patient samples

Vendor validated with frozen rat serum

Hypothesis 

Frozen serum precipitate ≠ fresh serum precipitate

Difference size of particulate clogging filter?

Solution: crash, wait, then “sip” & transferCrash in plain, conical bottom, 1 mL, plate INSTEAD of crashing INSIDE hybrid filtration plate

Wait 4 min for heavier clumps to settle

“Sip” upper layer of milky white precipitate (avoid heavy clumps at bottom) with 96 head and transfer to hybrid filtration plate (apply vacuum)

Plate could stay on deck – no off deck centrifugation required

Recovery was acceptable

3. Move plate to 2nd ALH (96 channel head)

5. Wait 4 min for ppt to settle. Transfer supernatant to extraction plate

4. Transfer precipitating reagent to sample plate and mix with tips

6. Vacuum to elute into collection plate below

7. Sealed plate on LC-MSMS

Plate Stamping: do crash in

separate plate

Lessons learned

Give the low tech solution a try

Extraction automation is about surface chemistry: 

Characteristics of different plastics 

Surface tension, flow & density of liquids

Micro/macro‐architecture of particulates, media, filters

Positive pressure is more reliable than vacuum

Mixing can be a challenge

Pay attention to the millimeters (teaching the robot)

Don’t give up & be creative – the details matter!

Judy Stone, Ph.D., Mass Spec in the Clinical Lab 2013

Case 3 – static cling of tips to pipette head (tips not shucked)

Solution

Purchase tips without plastic film wrapping of individual tip boxes

Only re‐use reagent tips a few times (static builds up with re‐use)

Static seemed to vary with humidity

Anti‐static devices were not too helpful

In conclusion

Attention to trivial detail & persistence was the key to success

Automation made possible extraction of 2,500 samples/day by two techs in 4‐5 hrs (LC‐MSMS ran for 20 hrs)

Long term (18 mos) precision across 3 instruments (6 streams): 4‐6% CV

Thanks for your attention