clase 14- arn.pptx
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CLASE 14- ARN.pptxTRANSCRIPT
ARN -historia• 1954 Severo Ochoa
descubrió la polinucleótido fosforilasa, capaz de sintetizar in vitro RNA a partir de ribonucleotidotrifosfatos: RNA polimerasa.
Ese mismo año George Gamow funda el “RNA tie club”Se reunían 2 veces al año para discutir sobre la estructura del RNA y como esta contribuye a la formación de proteínas1955 F Crick propuso su "Adapter Hypothesis“ referida a la falta de una molécula que porte el aminoácido
Reunión del “RNA tie club”, Cambridge, Inglaterra. Francis Crick (fondo, izquierda), Leslie Orgel (fondo, derecha), Alexander Rich (frente,
izquierda), y James Watson (frente, derecha).1955
ARN -historia• 1961 Marshall Nirenberg inicia sus
trabajos para descifrar el código genetico (1961-1962 The coding race: entre el laboratorio de Ochoa y Nirenberg, el primero desistió al ver que tan avanzado estaban los trabajos de Nirenberg)
• 1965 Robert Holley descubre el ARNt la molécula faltante de Crick
• 1968 Francis Crick y Leslie Orgel propusieron al ARN como la primera molécula informativa
• 1986 Thomas Cech y Sidney Altman descubrieron el ARN catalitico (self-splicing) primera evidencia sólida de primera molécula informativa
• 1993 el laboratorio de Harry Noller evidencio la participación del ARNr en la síntesis de proteínas
Marshall Nirenberg y Heinrich Matthaei. Severo Ochoa
A Esquema de la estructura cristalográfica de una ribozima “martillo”B Modelo en cinta de ribozima “martillo”
ARN es un polimero de ribonucleotidos
Azucar ribosa Enlace fosfodiester Cadenas Direccionales (5’ to 3’) 4 Bases
purines: adenina & guanina
pirimidines: citosina & uracilo
pGCUAC
G
U
A
5’ end
3’ end
1’
2’3’
4’
5’
3’
OH
-O - P –O CH2
O
H2N-C
C
C
HN
N
N
CH
C
O
N
O
O
O P O CH2
O
O
C
N
N
CHC
CH
NH2
OH
O
O
O P O CH2
O
N
CHC
O
HN
CHCO
OH
NH2
C
CN
N
N
CH
C
NHC
O
O
O P O CH2
O
OH OH
O-
o
ARN estructura
ARN tipos:Principales ARN involucrados en los procesos de transcripción y traducción:
-ARNm-ARNt-ARNr-Otros ARN en eucariotes ARNsn (ARN pequeño nuclear, ARN de edición), ARNsc (ARN pequeño citoplasmatico, micro ARN)
ARNs en E. coli
Tipo Sed. Coef. Mol. Wt. Residuos % del total ARN
mRNA 6 - 25 25,000 - 1,000,000 75 -3000 ~2
tRNA ~4 23,000 - 30,000 73 - 94 16
rRNA 5 35,000 120
16 550,000 1,542 82
23 1,100,000 2,904
rRNA es el principal componente de los
ribosomas
mRNA eucariote
mRNA procariote
tRNA tRNA estructura primaria
Secuencia lineal de 60 a 95 nucleótidos de longitud ( Comúnmente 76).
tRNA estructura secundaria La estructura de hoja de
trébol muestra los brazos y los bucles o loops.
tRNA estructura terciaria Nueve enlaces de hidrogeno
entre las bases en los bucles de simple cadena y el plegamiento de la estructura secundaria en una estructura en forma de L con el anticodon y el brazo aceptor del aminoácido en los extremos opuestos de la molécula.
Caracteristicas del tRNA1. Brazo o tallo aceptor 7-bp apareadas del 5'-terminal con 3'-terminal. Puede contener apareamientos no tipo Watson-Crick. 2. CCA cola Secuencia 3' terminal. En procariotes el CCA es transcrita, y en eucariotes CCA es adicionada post transcripcional. 3. El brazo D tallo de 4 bp que termina en un bucle o loop que contiene dihidrouridina. 4. El Brazo del anticodon tallo de 5 bp apareadas y contiene el loop del anticodon. 5. El Brazo TΨC tallo de 5 bp apareadas que contiene la secuencia TΨC donde Ψ es una pseudouridina. 6. Un brazo variable, tRNAs de clase 1 contiene 3 a 5 bases y tRNA de clase 2 contiene 13 a 21 bases formando un tallo de 5 bases apareadas 7. Las bases que han sido modificadas por metilación se encuentran fuera del anticodon. La primera base del anticodon algunas veces es modificada a Inosina (derivado de adenina) o pseudouridina (derivado de uracilo)
• Nomenclatura de tRNA-sintetasas and charged tRNAs
Catalizan la unión aminoácido - tRNA.
Aminoacido: serinetRNA : tRNAser
aminoacyl-tRNA sintetasa: seryl-tRNA sintetasaAminoacyl-tRNA: seryl-tRNAser
Aminoacil-tRNA sintetasas
Existen dos tipos de Aminoacil tRNA sintetasas clasificadas en la forma inicial de la unión del aminoacido a la adenina del CCA terminal del tRNA:
CLASE I. Aminoacila inicialmente el 2 OH de la adenina, luego por una transesterificacion esta unión se traslada al 3 OH. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: Leu,Ile,Val,Cys,Met,Glu,Gln,Arg,Tyr,Trp.
CLASE II. Aminoacila el 3 OH de la adenina. Comprende las sintetasas para los tRNA de los aminoacidos: His,Pro,Ser,Thr,Asp,Asn,Lys,Gly,Ala,Phe
• Tipos de tRNA-sintetasas
La aminoacil tRNA sintetasa une una adenosina monofosfato AMP, al grupo –COOH para crear un aminoacil adenilato intermediario.
Luego el apropiado tRNA desplaza el AMP.
La aminoacil tRNA sintetasa puede realizar el proceso de relectura o proofreading valiendose de los determinantes de identidad del tRNA
Etapa de activación
Etapa de transferencia
TranscripciónLa información genética almacenada en el DNA es transcrita a una copia de RNA complementario a una de las hebras del DNA.
La hebra de ADN que ha servido como molde se denomina hebra antisentido y la otra hebra de ADN es denominada hebra codante o con sentido y la secuencia es identica a la del RNA sintetizado ( Excepto en las posicion de T que son cambiadas por U)
(5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3')(5')ATGCGCTATAGCTGTTT(3')
(3')TACGCGATATCGACAAA(5')(3')TACGCGATATCGACAAA(5')
(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3')(5')AUGCGCUAUAGCUGUUU(3')
Hebra de DNA no molde (+)codanteHebra de DNA no molde (+)codante
Hebra de DNA molde (-)antisentidoHebra de DNA molde (-)antisentido
Transcrito de RNATranscrito de RNA
Doble hebra de
DNA
Localización de transcritos
• Genoma de adenovirus, ambas hebras contienen codificación de proteínas. Muchos de los mensajeros se sintetizan inicialmente en forma de un transcrito largo que proviene de dos tercios de la
longitud del DNA. Este transcrito es modificado posteriormente.
Transcripción
• El transcripto puede ser :– RNA mensajero o mRNA; – RNA ribosomal o rRNA;– RNA de transferencia o tRNA; o – Otros RNA como ribozimas (act. Enzimatica),RNA de interferencia o
iRNA (actividades de regulación de la expresión genética), o participar en actividades postranscripcionales de edición de mRNA (gRNA).
Inicio de la transcripción• Los factores de transcripción se unen al promotor
Ka (M-1) Cualquier región DNA Promotor DNA
(no especifico) (especifico)
Core 2 X 1011
Holo 1 X 107 1013 to 1015
• La subunidad sigma de la RNA polimerasa es un Factor de iniciación que es especifico para la transcripcion de diferentes grupos de genes en E. coli
• Factor sigma mantiene estable la unión de la RNA polimerasa al promotor en el DNA
Inicio de la transcripción
La RNA polimerasa de E. coli es una proteína con múltiple subunidades:Subunidad Cantidad Rol α 2 desconocido β 1 forma el enlace fosfodiester β´ 1 se une al DNA molde σ 1 reconoce al promotor y
factores de iniciación
Sintesis de RNA: Elongación de la cadena
• La sintesis de RNA generalmente se inicia en una purina ATP or GTP (el primer nucleotido)• La cadena es sintetizada en dirección 5’ a 3’
A = T
U = A
A = T
U = A
RNA RNA
Terminación de la transcripción• Una vez que el proceso de transcripción ha comenzado
la burbuja de transcripción avanza a medida que el RNA es transcrito y se continúa hasta que la polimerasa encuentra una secuencia que induce la disociación del complejo DNA-RNA y la separación de la enzima.
• En eucariotes esta secuencia no ha sido bien estudiada, mientras que para los procariotes como E. coli se han reconocido dos tipos de señales de terminación que se diferencian por la ausencia o presencia de un factor proteico que parece reconocer dicha señal.
Terminación de la transcripción Rho independiente
• La primera de ellas, conocida como terminación independiente de rho (r), contiene una secuencia que induce a la formación de una horquilla en el transcrito de RNA de 10 a 15 nucleótidos antes del final, seguida por un tramo de poliA en la cadena molde que facilita la disociación de los elementos de la transcripción.
• En la terminación dependiente de r no se presenta el tramo de poliA, aunque sí se forma una horquilla en la que la RNA polimerasa hace una pausa y si se encuentra la proteína r presente se detiene la transcripción.
• No se conoce a detalle el mecanismo de disociación, pero en este se produce la hidrólisis de ATP por efecto de r.
Terminación Rho dependiente
• Transcripción en eucariotes
3 RNA Polimerasas en Eucariotes
RNA polimerasa I transcribe la mayoria de los genes de rRNA
RNA polimerasa II transcribe todos los genes que codifican proteinas y algunos RNA pequeños nucleares
RNA polimerasa III transcribe los genes de tRNA y genes de 5S rRNA y RNA pequeños nucleares
Reconocimiento del promotor
Varias secuencias regulatorias
Enhancer
Formación del complejo de iniciación
La fosforilación de la polimerasa II inicia y promueve la síntesis del RNA
Compuestos que inhiben el proceso de transcripción
Se une al surco menor del DNA
Se intercala entre G y C
EL TRANSCRIPTO DE mRNA EN EUCARIOTE SUFRE DIVERSOS PROCESOS POSTRANSCRIPCIONALES
Splicing Mecanismo de splicing mediado por el
splicesoma
Mecanismo
5 Capping
Proceso de
Poliadenilación
Regulación de la expresión por splicing alternativo según el tejido
Componentes requeridos para las 5 etapas principales de la síntesis de proteínas en E. coli
Fase Componente esencialActivación de aminoácidos 20 aa
20 aa-tRNA sintetasa20 o mas tRNAATPMg++
Iniciación mRNAN-formilmetionina-tRNACodon de inicio AUG30S y 50S subunidad ribosomalFactores de iniciación IF1,IF2, IF3GTPMg++
Elongación Funcional 70S ribosoma aa-tRNAs especificos por codonesFactores de elongacion EF-Tu, EF-Ts, EF-GGTPMg++
Terminación y liberación Codon de terminacion en mRNAFactores de liberacion polipeptidica RF1,RF2,RF3ATP
Plegamiento de proteína y Enzimas especificas, cofactores y otros componentes procesos postraduccionales para la remosion de residuos de iniciacion, secuencias señal
procesaciento proteolitico, modificacion de residuos terminal, unión de fosfatos,metilos, carbonilos, carbohidratos, o grupos prosteticos
El inicio de la traduccion involucra el apareamiento del mRNA y el rRNA
Shine-Delgarno (SD) es una secuencia que se presenta en muchos transcriptos
de procariotes que consta de 3-9 bases del mRNA los que se complementan con el
3’terminal del 16S rRNA
En transcriptos mRNA de eucariotes la secuencia que facilita la union inicial del
mRNA a la subunidad pequeña ribosomal es la secuencia Kozak ACCATGG o
(GCC)RCCATGG
La subunidad menor inicia la busqueda del sitio de iniciacion:
En ProcariotesIF1 previene el enlace prematuro del
aatRNA al sitio AIF2 facilita la unión del formilmetionina a la
posición P de la subunidad menor ribosomal
IF3 previene el enlace prematuro de la subunidad mayor
Eucariotes usan un complejo de multiples factores de iniciacion
eIF1 1 Reconocimiento de codon AUG codon, destabiliza complejos aberrantes
eIF1A 1 Promueve union del Met-tRNA al40S;
eIF2 3 GTPasa,
eIF2B 5 guanine nucleotide exchange factor for eIF2
eIF3 11 estabiliza la union 40S y Met-tRNA y previene
la asociación con 60S
eIF4A 1 RNA dependiente de ATPasa; esencial para
enlazar los ribosomas al mRNA
eIF4B 1 proteína de enlace al RNA; promueve la
actividad eIF4A
eIF4E 1 Se enlaza al m7G cap
eIF4F 3 cap complejo de enlace eIFs 4A, 4E, and 4G
eIF4G 1 enlaza mRNA, PABP, eIF4E, eIF4A, and eIF3
eIF4H 1 similar a eIF4B
eIF5 1 AUG reconoce y promueve actividad de
eIF2 GTPasa
eIF5B 1 GTPasa, ensambla el ribosoma
subunidades funcion
Activación del aminoacil-tRNA
Elongación
Elongación
Terminación
3’
5’
5’
3’
Transcripción y traducción ocurren simultaneamente en procariotes
Ribosome
Ribosome5’
mRNA
RNAPol.
DNA
Citoplasma
Nucleo
En Eucariotes los procesos de transcripcion y traducción ocurren en diversos compartimientos
ExportaciónG AAAAAA
RNA
Transcripción
Poros del Nucleo
G AAAAAA
Procesamiento de RNA
mRNA
Un gen de eucariote
Secuencia Terminador
Promotor/Región de Control
Sitio de iniciode transcripción
RNA Transcripto
5’ UTR Región no traducida
3’ UTRRegión no traducida
Exones
Intrones
3’5’ Exon 2 Exon 3Int. 2Exon 1 Int. 1
3’5’ Exon 2 Exon 3Exon 1 Int. 2Int. 1
3’5’ Exon 2 Exon 3Exon 1
Procesamiento del mRNA
Código genético.
El Codigo es un triplete. Un codon son 3 nucleotidos consecutivos de mRNA especifico
para 1 aminoacido.
Presenta un codon de inicio y otro de
termino. ATG para Met como codon de inicio. TAA, TAG, y TGA como codones
stop de la traduccion del
polipeptido.
El código es universal. En la evolución el código genético parece haberse congelado. La mayoría de codones tiene el mismo significado en distintos organismos. (Diferencia del
código de mitocondria en animales)
Variación de codones en mitocondriaCodonesAGA
UGA AUA AGG CUN CGGNORMAL Stop Ile Arg Leu ArgAnimales
Vertebrados Trp Met Stop + +Drosofila Trp Met Ser + +
Levaduras Saccharomyces cerevisiae Trp Met + Thr + Torulopsis glabrata Trp Met + Thr ? Schizosaccharomyces pombe Trp + + + +Hongos filamentosos Trp + + + +Tripanosomas Trp + + + +Plantas superiores + + + + TrpChlamydomonas reinhardtii ? + + + ?
? No ha sido observadoN es cualquier nucleotido+ mantiene el mismo significado
Numero de codones por aminoácido
El código es degenerado. Muchos aminoácidos tiene mas
de un codon a excepción de Met y Trp.
Codon-anticodon interacciones Degeneracion de la tercera base
Y la hipotesis del bamboleo• El apareamiento codon-anticodon es crucial en la lectura
del codigo genetico el apareamiento de bases es antiparalelo
• La hipotesis de Crick esta referida a la tercera posicion del codon, o primera posicion del anticodon (posicion de bamboleo)
• En la tercera posicion del codon pueden ocurrir apareamientos no canonicos, ocurre el bamboleo o alternacion del nucleotido sin alterar la secuencia del polipeptido
• Ventaja del bamboleo: disociación del tRNA del mRNA mas rapida
Regla del bamboleo:
1 Reconocimiento de un codon
Anticodon
Codon
2 Reconocimiento de 2 codones
Anticodon
Codon
3 Reconocimiento de 3 codones
Anticodon
Codon
Inosina = Citidina
Inosina = Uridina
Guanosina = Uridina
Inosina = Adenosina
5’ 3’
A U C
mRNA
5’ 3’
C U A G
G A U
3’ 5’ tRNAleu
mRNA
Base del bamboleo
• Un tRNAleu puede leer dos de Los codones de leucina
El codigo esta escrito en el
sentido 5’ a 3’ del mRNA
El codigo no se sobrelapa cada
nucleotido es leido una sola vez, de manera continua
en un MARCO DE LECTURA (ORF)
Marco de lectura ORF• Esta determinado por el codon de inicio AUG
• siempre el triplete siguiente es leído como un codon hasta el stop
...AGAGCGGA.AUG.GCA.GAG.UGG.CUA.AGC.AUG.UCG.UGA.UCGAAUAAA... MET.ALA.GLU.TRP.LEU.SER.MET.SER
INICIO FIN………………………………..
Inicio de un marco de lectura in procariotes and eucariotes• Puede ocurrir en codones internos AUG en mRNA procariote• En eucariotes solo puede ocurrir en el primer codon AUG
• El operon lac en E. coli se transcribe como un mRNA policistronico con multiple codones AUG
Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno
Codon de inicio antecedido del sitio Shine-Dalgarno
Codon interno de Met sin sitio
Shine-Dalgarno
5’ cap AUG
El codon de inicio AUG es unico posterior al 5’ cap
AUG
lac I P O lac Z lac Y lac A
AUG AUG AUGAUG
mRNA de eucariote
AUGSD AUGSDAUG5’
• TIPOS DE MUTACIONES GÉNICAS
• En el ADNSustitucion de bases
Transiciones Pu→Pu o Pi→PiTransversiones Pu→Pi o Pi→Pu
Inserciones DelecionesDuplicaciones, Inversiones, Transposiciones
• TIPOS DE MUTACIONES GÉNICASEn la proteínaMutaciones conservativas• Mutación silenciosa:Tripletes que codifican para el mismo aminoácido:
AAG(arg)→CGG(arg)• Mutación con sentido o neutra:Tripletes que codifican para aminoácidos
equivalentes distintos. AAA(lys)→AGA(arg). Ambos son aminoácidos básicosMutaciones no conservativas• Mutación cambio de sentido: aparece un nuevo triplete que codifica para un
aminoácido de distinto tipo. La proteína pierde su función si afecta su sitio catalitico• Mutación sin sentido: Aparece un triplete de terminación o stop:
CAG(gln)→UAG(stop)• Mutación con cambio de marco de lectura inserciones y deleciones cambian el
marco de lectura y la posición del codon stop)
Silenciosa Con Sentido Sin Sentido Readthrough