UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Sara I. Stanković

Citotoksični efekat zaslađivača na bazi stevije

na ćelije kostne srži pacova soja Wistar

Master rad

Niš, 2016.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Citotoksični efekat zaslađivača na bazi stevije

na ćelije kostne srži pacova soja Wistar

Master rad

Kandidat Mentor

Sara Stanković 147 prof. dr Perica Vasiljević

Niš,

Oktobar, 2016.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The cytotoxic effect of the Stevia sweeteners on

bone marrow cells of Wistar rats

Master thesis

Candidate Mentor

Sara Stanković 147 prof. dr Perica Vasiljević

Niš,

October, 2016.

BIOGRAFIJA KANDIDATA

Sara Stanković je rođena 22. 02. 1992. godine. Osnovnu školu „Radoje

Domanović“ je završila 2006. godine u Nišu. Gimnaziju „Bora Stanković“,

prirodno-matematički smer, završila je 2010. godine takođe u Nišu.

Iste godine upisala je osnovne-akademske studije Prirodno-matematičkog

fakulteta u Nišu, na departmanu za biologiju i ekologiju. Osnovne studije je

završila 2014. godine i upisala master studije na istom fakultetu, smer biologija.

Zvanje „master biolog“ dobija 2016. godine.

Niš,

Oktobar, 2016.

ZAHVALNICA

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, prof. dr Perici Vasiljević na

razumevanju, strpljenju, nesebičnoj pomoći i savetima koje mi je pružio tokom

izrade master rada.

Zahvaljujem se i stručnom-saradniku Andrei Žabar, kao i asistentu

Mileni Aleksić, koje su uložile veliki deo svog vremena i pružile mi pomoć u

toku izvođenja eksperimentalnog dela rada.

Na kraju, svoju neizmernu zahvanost dugujem dragim ljudima oko sebe,

bez kojih ne bih mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno mojoj majci koja

mi je omogućila školovanje i motivisala me tokom istog, i bratu bez čije ljubavi

i razumevanja ne bih istrajala do kraja...

Hvala...

Ovaj rad posvećujem svojim voljenima, s’ljubavlju

SAŽETAK

Stevia rebaudiana (Bertoni) je biljka koja potiče iz Južne Amerike, a pripada familiji

Asteraceae. Lišće ove biljke se koristi već stotinama godina kao zaslađivač. Aktivne

supstance u lišću su steviol-glikozidi (najzastupjeniji su steviozid i rebaudiozid (Reb A)),

koje su više od 200 puta slađe od šećera. Postupkom ekstrakcije navedeni se sastojci

izdvajaju i koriste za dobijanje različitih zaslađivača. Cilj ovog rada bilo je ispitivanje uticaja

različitih koncentracija rastvora zaslađivača na bazi stevije, na vijabilnost ćelija kostne srži i

osmotsku rezistenciju eritocita periferne krvi pacova soja Wistar. Finalne koncentracije

ispitivanog rastvora zaslađivača bile su 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100 mg/ml. Uticaj

na vijabilnost ćelija kostne srži rađena je Tripan plavim testom na temperaturi od 37 °C.

Procenat hemolize eritrocita utvrđen je merenjem absorbance na spektrofotometru, na

talasnoj dužini od 540 nm, posle inkubacije rastvora sa eritrocitima na temperaturi od 37 °C.

Dobijeni rezultati pokazuju da ispitivane koncentracije poseduju značajni citotoksični

potencijal. Najveća vijabilnost ćelija kostne srži je pri najmanjoj koncentraciji ispitivanog

rastvora zaslađivača, dok je pri najvećoj koncentraciji vijabilnost ćelija najmanja. Takođe,

povećana koncentracija ispitivanog rastvora zaslađivača veoma utiče na procenat hemolize,

pa koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 % hemolize.

Ključne reči: Stevia rebaudiana, citotoksična aktivnost, ćelije kostne srži, Tripan plavo test,

eritrociti, hemoliza

ABSTRACT

Stevia rebaudiana (Bertoni) is a plant that is native to South America and belongs to

the family Asteraceae. The leaves of this plant has been used for hundreds of years as a

sweetener. Active substances in the leaves are steviol glycosides (mainly stevioside and

rebaudioside (Reb A)), which are more than 200 times sweeter than sugar. Specified

ingredients can be extracted by extraction method and used to produce a variety of

sweeteners. The aim of this work was to investigate the effect of Stevia sweeteners on the

viability of bone marrow cells of Wistar rats. Final concentration of the test solution of the

sweetener were 25mg/ml, 50mg/ml, 75mg/ml and 100mg/ml. The impact on the viability of

the cells of the bone marrow was performed up the Trypan blue test at a temperature of 37°C.

The percentage of hemolysis of red blood cells was determined by measuring absorbance on

a spectrophotometer, at a wavelength of 540 nm, after incubation the solution with red blood

cells at a temperature of 37°C.

The results show that the tested concentrations have significant cytotoxic potential.

Maximum viability of bone marrow cells is at a minimum concentration of the test sweetener

solution, while at the highest concentration cell viability is the smallest. Also, the increased

concentration of the test sweetener solution greatly affects the percentage of hemolysis, so

concentrations greater than 75mg/ml caused 90% hemolysis.

Keywords: Stevia rebaudiana, cytotoxic activity, bone marrow cells, Trypan blue test,

erythrocytes, hemolysis

SADRŽAJ

1. UVOD ................................................................................................................................. 1

1.1. Stevia rebaudiana (Bert.) - biološke karakteristike .................................................... 1

1.2. Rasprostranjenje .......................................................................................................... 1

1.3. Stevija kroz istoriju ..................................................................................................... 2

1.4. Primena stevije ............................................................................................................ 3

1.5. Hemijski sastav ........................................................................................................... 3

1.5.1. Steviol-glikozidi ................................................................................................... 3

1.5.2. Sinteza steviol-glikozida ...................................................................................... 6

1.5.3. Ostala jedinjenja................................................................................................... 8

1.6. Fizičke i hemijske karakteristike stevije ................................................................... 12

1.7. Biološke aktivnosti stevije ........................................................................................ 13

2. CILJ RADA ...................................................................................................................... 16

3. MATERIJAL I METODE ................................................................................................ 17

3.1. MATERIJAL ............................................................................................................. 17

3.2. METODE .................................................................................................................. 17

3.2.1. Priprema štok i radnih rastvora .......................................................................... 17

3.2.2. Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova................................................. 18

3.2.3. Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži ...................................... 18

3.2.4. Protokol za podešavanje željene gustine ćelija .................................................. 19

3.2.5. Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja ............................................... 20

3.2.6. Postupak za dobijanje eritrocita ......................................................................... 21

3.2.7. Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda) .................................................. 21

3.3. Obrada rezultata ........................................................................................................ 22

4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 23

4.1. Uticaj zaslađivača na vijabilnost ćelija kostne srži ................................................... 23

4.2. Uticaj zaslađivača na osmotsku rezistentnost eritrocita ............................................ 24

5. ZAKLJUČAK ................................................................................................................... 26

6. LITERATURA ................................................................................................................. 27

1

1. UVOD

1.1. Stevia rebaudiana (Bert.) - biološke karakteristike

Rod Stevia (famiija

Asteraceae) čini oko 240 vrsta i među

njima najslađi ukus i najširu primenu

ima Stevia rebaudiana (Bertoni)

(Segura-Campos i sar., 2014). To je

višegodišnja, zeljasta, grmolika biljka

visine od 65-180 cm (Ahmed i sar.,

2011). Stevija ima razgranat koren i

jajolike do eliptične, sivozelene,

nazubljene listove, duge 3-4 cm

(Lemus-Mondaca i sar., 2012). To je

biljka kratkog dana koja cveta od

januara do marta na južnoj hemisferi, a cvetovi su joj beli i sitni (Gupta i sar., 2013). Steviji

pogoduju peskovite podloge i dobra osunčanost terena na kome raste (Ahmed i sar., 2011).

Rasprostranjena je u subtropskim regijama, na 200-500 m nadmorske visine, sa prosečnom

godišnjom temperaturom od oko 23 °C (Kobus-Moryson i Gramza-Michałowska, 2015).

1.2. Rasprostranjenje

Pretežno raste na planinskom lancu Amambay (Yadav i sar., 2010) i u dolini Rio

Monday, koji se nalaze u severo-istočnom Paragvaju i južnom Brazilu (Brandle i sar., 1998).

Tu su je još pre 1500 godina otkrili Guarani Indijanci, koji su je nazivali Ka’a He’e, što znači

“listovi slatki poput meda”, a koristili su je kao lekovitu biljku i kao zaslađivač gorkih

lekova, napitaka i tradicionalnog mate čaja (Ahmed i sar., 2011). U današnje vreme stevija se

komercijalno uzgaja i u Urugvaju, srednjoj Americi, Izraelu, Tajlandu, Australiji, Koreji i

Kini. (Gupta i sar., 2014).

Slika 1. Stevia rebaudiana (Bert.)

(http://www.stevia1.com)

2

1.3. Stevija kroz istoriju

Stevija je u Južnoj Americi poznata vekovima (Bhutia i Sharangi, 2016). Dolaskom

španskih konkvistadora, steviju po prvi put upoznaju ljudi van plemena Guarani. Biljka je

prvi out opisana u 16. veku od strane španskog botaničara i lekara Petrusa Jakoba Stevusa

(Pedro Jaime Esteve 1500–1556), od koga i potiče njen latinski naziv. Detaljnija naučna

istraživanja biljke prvi put se sprovode 1887. godine od strane švajcarskog botaničara

Moisesa Santijaga Bertona koji je emigrirao u Paragvaj (Giuffré i sar., 2013). Slatke

karakteristike listova stevije i mogućnosti za njenu primenu publikovao je u časopisu

‘’Revista de Agronomia’’ 1899. godine (Kobus-moryson I Gramza-michałowska, 2015).

Nakon toga, dr Rebaudi

1900. godine objavljuje kompletnu

studiju o listovima stevije. Pošto se

glas o njenoj primeni uspešno širio

od 1908. godine počeo je aktivan

uzgoj ove biljke u njenoj regiji

porekla. Nakon toga, francuski

hemičari, Bridel i La Vielle, 1931.

godine izolovali su komponentu

koja biljci daje sladak ukus.

Izolovani glikozidi su dobili naziv steviozid i rebaudiozid (Kumari i Chandra, 2014). Tokom

Drugog svetskog rata, za vreme obustave isporuke šećerne trske sa Kariba, Engleska počinje

da istražuje mogućnost eksploatacije stevije. Sedamdesetih godina 20. veka, Japanci počinju

sa kultivacijom stevije i ekstrahovanjem različitih oblika steviozida koji bi mogli da se

koriste umesto šećera (Lemus-Mondaca i sar., 2012). Status dozvoljenog zaslađivača u

Japanu stevija dobija 1977. godine. Danas je Japan najveći potrošač stevije na svetu, s

godišnjom potrošnjom od oko 50 tona. Američka administracija za hranu i lekove (FDA)

odobrila je 1995. godine upotrebu stevije i steviozida kao dijetetskog suplementa (Ahmed i

sar., 2011).

Slika 2. Listovi biljke stevije

(http://globalsteviainstitute.com/health-

professionals/food-science/)

3

1.4. Primena stevije

Stevija ima široki spektar primene, kako u industriji hrane tako i u medicinske svrhe.

Zbog prisustva aktivnih supstanci koje su i do 200 puta slađe od saharoze, lišće ove biljke se

već godinama koristi kao zaslađivač. Kako nema kalorije, ugljene hidrate, ni glikemijski

indeks pogodna je za dijabetičare. U Paragvaju su Guarani Indijanci koristili sok dobijen iz

stevije za brže zarastanje rana. Jedna od interesantnih osobina mu je da pomaže u

sprečavanju dobijanja ožiljaka, a koristi se još i protiv dermatitisa. Zbog uticaja na

regenraciju kože koristi se i u kozmetičke svrhe. Ima antioksidativna svojstva a sadrži i neke

minerale poput Mg, Cu, Mn, Fe i Zn, Ca ( Abou-arab i sar., 2010), kao i vitamine C, B2, B6,

folnu kiselinu, niacin i tiamin (Gupta i sar., 2013).

Dosadašnja istraživanja pokazala su da stevija ima anti-virusno, anti-mikrobno, anti-

fungalno, anti-hipertenzivno, anti-hiperglikemično i anti-inflamatorno dejstvo. Prema

toksikološkim istraživanjima njeni sekundarni metaboliti nemaju teratogeni, mutageni,

kancerogeni, ni alergijski efekat (Abou-Arab i sar., 2010). Pokazano je i da sprečava nastanak

zubnog karijesa (Singh i Rao, 2005) i da smanjuje dentalni plak (de Slavutzky, 2010).

Kontroliše nivo šećera u krvi, te pomaže u radu slezine i jetre, a kod ljudi obolelih od

dijabetesa 2 primećeno je i smanjenje zavisnosti od insulina i korigovanje njegovog nivoa u

organizmu. Takođe pomaže u regulisanju visokog krvnog pritiska. Čaj od stevije efektivno

reguliše varenje i pomaže kod stomačnih oboljenja (Gupta i sar., 2013).

1.5. Hemijski sastav

1.5.1. Steviol-glikozidi

Glikozidi su jedinjenja koja sadrže glukozu i ne-šećernu komponentu nazvanu

aglikon. Lišće stevije sadrži steviol-glikozide, koji su od 250-400 puta slađi od šećera.

Karbohidratne jedinice, ugavnom glukoza, vezani su za steviol u različitim konfiguracijama i

tako formiraju širok spektar ovih slatkih jedinjenja. (Bhutia i Sharangi, 2016). Steviol-

gikozidi prisutni u listu stevije su steviozid (5-10 %), steviobiozid, rebaudiozid A (2-4 %),

rebaudiozid B, rebaudiozid C (1-2 %), rebaudiozid D, rebaudiozid E i dulkozid A (0,4-0,7

%) (Ahmed i sar., 2011). Steviozida najviše ima u listovima, nešto manje u izdancima, zatim

korenu, a najmanje su zastupljeni u cvetovima biljke (Yadav i sar., 2011). Receptori za ukus,

4

na jeziku reaguju na glukozu u glikozidu, pa tako rebaudiozidi koji sadrže vise glukoze od

steviozida imaju slađi ukus. Receptori za gorak ukus sa druge strane reaguju na aglikone.

(Bhutia i Sharangi, 2016).

Steviol-glikozidi se slabo apsorbuju u organizmu i prolaze intaktni kroz digestivni

trakt. Kada stignu do kolona, bakterije hidrolizuju steviol-glikozide do steviola, odsecanjem

njihovih glukoznih jedinica. Steviol portnom venom stiže do jetre, koja ga metaboliše do

steviol-glukoronida, koji se urinom izlučuju iz organizma. Glukoza koja se oslobađa u ovom

procesu, se ne apsorbuje već je koriste bakterije kolona. Istraživanja pokazuju da ne dolazi do

akumulacije stevije u organizmu, prilikom njenog metabolizma. To je rezultat slabe

apsorpcije, što doprinosi činjenici da stevija nema kalorije i ne povećava nivo glukoze i

insulina prilikom konzumacije. U digestivnom traktu rebaudiozidi se metabolišu do steviozida,

koji se sekvencijalno razlažu na glukozu i steviol (Bhutia i Sharangi, 2016).

Slika 4. Metabolizam steviozida

(https://www.researchgate.net/publication/6597691_Metabolism_of_stevioside_by_health

y_subjects)

Slika 3. Strukturne formule, steviola, steviozida i rebaudiozida A (Ahmed i sar., 2011).

5

R1 R2

Steviol H H

Steviobiozid H β-Glc - β-Glc (2→1)

Steviozid β-Glc β-Glc - β-Glc (2→1)

Rebaudiozid A β-Glc

β-Glc - β-Glc (2→1)

|

β-Glc (3→1)

Rebaudiozid B H

β-Glc - β-Glc (2→1)

|

β-Glc (3→1)

Rebaudiozid C β-Glc

β-Glc - α-Rha (2→1)

|

β-Glc (3→1)

Rebaudiozid D β-Glc- β-Glc (2→1)

β-Glc - β-Glc (2→1)

|

β-Glc (3→1)

Rebaudiozid E β-Glc- β-Glc (2→1) β-Glc - β-Glc (2→1)

Rebaudiozid F β-Glc

β-Glc - β-Xyl (2→1)

|

β-Glc (3→1)

Dulkozid A β-Glc β-Glc - α-Rha (2→1)

Tabela 1. Struktura glavnih steviol-glikozida u listu S.rebaudiana (Bert). Glc, Xyl,

Rha su oznake za glukozu, ksilozu i ramnozu, respektivno (Lemus-Mondaca i sar.,

2012).

6

1.5.2. Sinteza steviol-glikozida

Steviol-glikozidi nastaju u mevalonat-zavisnom putu. To je fundamentalni

metabolički put, prisutan kod svih viših eukariota i mnogih bakterija, za dobijanje dimetilalil

pirofosfata (DMAPP) i izopentenil pirofosfata (IPP), koji služi kao biosintetička polazna

tačka za sintezu svih izoprenoidnih jedinjenja (terpenoida), sintezu hormona, proteinsku

prenilaciju, N-glikozidaciju, održavanje ćelijske membrane, a takođe je deo steroidne

biosinteze (Brandle i sar., 1998).

Biosinteza steviola je prvi put proučavana pre 30 godina. Pokazano je da su početni

koraci koji vode do sinteze steviol-glikozida od početnog jedinjenja, geranilgeranil

pirofosfata (GGPP), identični onima u biosintezi giberelina. (Brandle i sar., 1998).

Proces počinje konvertovanjem GGPP u ent-kopalil pirofosfat (CPP) pomoću ent-

kopalil pirofosfat sintaze (CPP-sintaza), a zatim se pomoću ent-kauren sintaze sintetiše ent-

kauren. Sledi sekvencijalna oksidacija ent-kaurena na C-19 poziciji pomoću enzima ent-

kauren 19-oksidaze, i preko ent-kaurenola, i ent-kaurenala, nastaje ent-kaurenoična kiselina.

Nakon toga putevi za sintezu stiviol-glikozida i giberelina divergiraju. Steviol nastaje

hidroksilacijom ent-kaurenoične kiseline na C-13 poziciji, pomoću enzima ent-kaurenoična

kiselina 13-hidroksilaze (KAH).

Kako steviol na C-13 atomu ima vezanu OH grupu, a na C-19 atomu karboksilnu

grupu, to omogućava vezivanje bočnih lanaca ugljenih hidrata, i sintezu razičitih glikozida.

Ovi bočni lanci obično sadrže glukozu kao rezidulanu jedinicu, ali mogu sadržati i ramnozu

ili ksilozu. Identifikovane su najmanje 3 zasebne aktivnosti glikozil-transferaze, a dve su i

opisane (Brandle i sar., 1998). Glikozidaciju aglikona steviola katalizuje nekoliko glikozil

transferaza u citoplazmi. Glikozidacija počinje na C-13 atomu pomoću UGT85C2 enzima,

što dovodi do nastanka steviolmonozida. Nakon toga njegovom glikozidacijom nastaje

steviolbiozid. UGT ovog koraka još uvek nije identifikovan. Na kraju glikozidacijom na C-19

atomu pomoću UGT74G1 nastaje steviozid. Glikozidacijom steviozida na C-13 poziciji,

UGT 76G1 enzimom nastaje rebaudiozid A (Kumari i Chandra, 2014).

7

Slika 5. Sinteza steviol-glikozida

(https://www.researchgate.net/publication/51036914_UDP-

dependent_glycosyltransferases_involved_in_the_biosynthesis_of_steviol_glycosides)

8

1.5.3. Ostala jedinjenja

List stevije sadrži i 80-85 % vode, ugljene hidrate, proteine i amino kiseline, lipide,

esencijalna ulja, β karoten, vitamin C, riboflavin, tiamin, giberelinsku kiselinu, indol-3-

acetonitril, izokvercetin, kampferol, stigmasterol, ksantofile, umbeliferon, hlorogenu kiselinu,

kofeinsku kiselinu, Cr, Co, Mg, Fe, K i P i elemente u tragovima (Gupta i sar., 2013).

Hemijskim analizama je utvrđeno da listovi stevije sušeni na suncu, na temepraturi od

25-30°C, tokom 24-48 h, sadrže u suvoj lisnoj masi 5,37 % vlage, 11,41 % proteina, 15,52 %

sirovih vlakana, 3,73 % masti, 7,4 % pepela i 61,93 % ugljenih hidrata. Takođe suva lisna

masa sadrži i 5,88 % redukujućih šećera, 9,77 % neredukujućih šećera i 16,65 % solubilnih

ugljenih hidrata (Abou-Arab i sar., 2010). Ovi podaci ukazuju na to da je lišće stevije dobar

izvor ugljenih hidrata, proteina i sirovih vlakana (Gasmalla i sar., 2014).

Stevija u svom sastavu sadrži 6 masnih kiselina (palmitinsku, pamitoleinsku,

stearinsku, oleinsku, linolnu i linoleinsku kiselinu) i ukupno 17 aminokiselina, esencijalnih i

ne-esencijalnih, koje su prikazane u tabeli. (Abou-Arab i sar., 2010).

Esencijalne amino kiseline Ne-esencijalne aminokiseline

Aminokiselina (g/100g suve lisne

mase) Aminokiselina (g/100g suve lisne

mase ) Arginin 0.45 Aspartat 0.37

Lizin 0.70 Serin 0.46

Histidin 1.13 Glutaminska kiselina 0.43

Fenil alanin 0.77 Prolin 0.17

Leucin 0.98 Glicin 0.25

Metionin 1.45 Alanin 0.56

Valin 0.64 Cistein 0.40

Treonin 1.13 Tirozin 1.08

Izoleucin 0.42

Ukupno 7.67 3.72

Tabela 2. Esencijalne i ne-esencijalne aminokiseline izolovane iz listova stevije

(Abou-Arab i sar., 2010).

9

Ugljeni hidrati imaju brojne esencijalne uloge u organizmu. Monosaharidi su glavni

izvori energije u metabolizmu, dok polisaharidi služe kao depoi energije i za izgradnju

strukturnih ćelijskih komponenti. Polimeri molekula fruktoze se nazivaju fruktani. Fruktani

sa kratkim lancima su poznati kao fruktooligosaharidi, dok se oni sa dugim lancima nazivaju

inulini (sastoje se pretežno od β fruktozil-

fruktozo veza). Koren i listovi stevije sadrže

inuline, nesvarljive ugljene hidrate koji imaju

važna probiotska svojstva jer utiču na

kompoziciju mikroflore kolona. Zbog

specifične hemijske strukture, β fruktozil-

fruktozo veze ne mogu biti hidrolizovane

humanim digestivnim enzimima, pa tako

prolazi koz digestivni trakt intaktan. Nakon

dospevanja u kolon metabolišu ga intestinalne

bakterije. Svoje dejstvo ostvaruju selektivnim

stimulisanjem rasta i aktivnosti nepatogenih

bakterija (bifidobakterija i laktobacila) (Sokić i

sar., 2009). Takođe ima ulogu u metabolizmu

lipida i kontroli dijabetesa. (Lemus-Mondaca i sar., 2012). Istraživanja su pokazala da inulini

mogu da modifikuju imuni odgovor domaćina i na taj način ga štite od infektivnih bolesti,

redukuju incidenciju karcinoma i povećavaju apsorpciju minerala (Ca, Mg i Fe). Stepen

polimerizacije inulina značajno utiče na njegova svojstva. Do skoro se smatralo da je inulin

linearni molekul, ali je utvrđeno da ipak postoji mali stepen grananja (Sokić i sar., 2009).

Od makroelemenata u suvoj lisnoj masi (u 100 g) najviše ima kalijuma (21,15 mg),

zatim kalcijuma (17,70 mg), natrijuma (14,93 mg) i magnezijuma (3,26 mg). Od

mikroelemenata prisutni su bakar (0,73 mg), mangan (2,89 mg), gvožđe (5,89 mg) i cink

(1,26 mg). Ovi podaci ukazuju na to da je stevija bogata mineralima koji regulišu veliki broj

metaboličkih procesa u organizmu. Cink i mangan se smatraju antioksidansima, njihovo

prisustvo ubrzava imuni sistem i deluju kao preventiva bolesti izazvanih slobodnim

radikalima. Gvožđe je neophodno za sintezu hemoglobina, pa tako stevija ima ulogu i u

regulisanju količine hemoglobina u krvi. Zbog ove osobine stevija se može koristiti za izradu

preparata za lečenje anemija. Iz svežih kao i suvih listova stevije izolovani su hlorofil A i B

kao i karotenoidi (Abou-Arab i sar., 2010).

Slika 6. Struktura inulina

(http://wildflowerfinder.org.uk/Flowers/E/El

ecampane/Elecampane.htm)

10

Terpenoidi su jedinjenja koja su izgrađena od izoprena (5 C atoma), i upravo zbog

toga se često nazivaju i izoprenoidi. Na osnovu broja izoprenskih jedinica, odnosno broja

ugljenikovih atoma koji ih izgrađuju, terpenoidi se mogu podeliti na monoterpenoide (10 C

atoma, dve izoprenske jedinice), seskviterpenoide (15 C atoma, tri izoprenske jedinice),

diterpenoide (20 C atoma, četiri izoprenske jedinice), triterpenoide (30 C atoma, šest

izoprenskih jedinica), tetraterpenoide (40 C atoma, osam izoprenskih jedinica) i

politerpenoide ( više od 40 C atoma i 8 izoprenskih jedinica). Terpenoidi su jedinjenja koja su

odgovorna za karakteristični miris biljka, pri čemu se u isparljive terpenoide svrstavaju

monoterpenoidi i seskviterpenoidi (Mahmoud i Croteau, 2002).

Monoterpenoidi su glavne komponente etarskih ulja velikog broja aromatičnih biljnih

vrsta (Buckinghman, 1994). Seskviterpenoidi su jedinjenja izgrađena od tri izoprenske

jedinice i predstavljaju veoma raznoliku grupu terpenoida. U biljkama imaju ulogu feromona

i juvenilnih hormona. Mogu biti aciklični, monocikični i biciklični (Graβmann, 2005).

Aciklični predstavnici seskviterpenoida se često nazivaju i farnezani, pošto nastaju od

farnesola. Na osnovu veličine prstena razlikujemo monociklične (bisaboleni, germakreni,

elemenini, humuleni i drugi) i policiklične seskviterpene (kariofileni, eudezmani, akorani,

kamferani, kedrani, drimani, kadinani, oplopani, gvajani) (Aharoni i sar., 2005). Diterpenoidi

su velika grupa strukturno veoma različitih jedinjenja, i u prirodi se najčešće javljaju kao

diciklična, triciklična i tetraciklična jedinjenja. Diterpenoidi u biljkama imaju važne ekološke

i fiziološke funkcije: fitol je strukturni segment hlorofila, a fitoaleksini predstavljaju prirodni

odbrambeni mehanizam biljaka u zaštiti od patogenih mikroorganizama i predatora (Dewick,

2002). Triterpenoidi se sastoje iz dve farnezanske jedinice povezane po principu glava-rep.

Glavne grupe ovih jedinjenja koje se javljaju u prirodi su saponini, glikozidi, fitosteroli,

steroidi (Sawai i Saito, 2011).

Osim slatkih diterpenoidnih glikozida, još nekoliko diterpena je izolovano iz stevije.

Prvo su okarakterisani jhanol, austroinulin i 6-O-acetilaustroinulin. Takođe, detektovani su i

neki triterpenoidi poput β-amirin acetata, 3 estra lupeola i sterol, stigmasterol i β-sitosterol.

Jhanol, austroinulin, 6-O-acetilaustroinulin i 7-O-acetilaustroinulin zajedno sa steviozidom i

rebaudiozidom A, su detektovani u cvetovima stevije. Dodatnih osam diterpenoida, nazvanih

sterebini A-H, izolovani su iz listova i identifikovani (Brandle i sar., 1998).

11

Iz esencijalnog ulja izolovani su seskviterpeni, i to β-kariofilen, trans-β-farnesen, α-

humulen, δ-kadinen, kariofilen oksid i nerolidol, kao i monoterpeni linalool, terpinen-4-ol, α-

terpineol (Brandle i sar., 1998).

Fenolna jedinjenja čine najrasprostranjeniju grupu sekundarnih metabolita. Zbog

svojih antioksidativnih osobina upotrebljavaju se u medicini, farmaceutskoj, kozmetičkoj i

prehrambenoj industriji (Martin i Appel, 2010). Fenolna jedinjenja u svom sastavu imaju bar

jedan aromatični prsten sa jednom ili više hidroksilnih grupa (Stalikas, 2007). Jedna od

najčešće pominjanih i najčešće ispitivanih osobina fenolnih jedinjenja je njihova

antioksidativna aktivnost (Zayova i sar., 2013). Smatra se da je izražena antioksidativna

aktivnost fenolnih jedinjenja rezultat sposobnosti fenolnih jedinjenja da budu donori

vodonikovih atoma i da pri tome uklanjaju slobodne radikale, uz formiranje manje reaktivnih

fenoksil radikala (Pietta, 2000). Pomoću svojih hidroksilnih grupa sakupljaju slobodne

radikale i vrše helaciju metalnih jona (Gaweł-Bęben i sar., 2015). Klasifikacija fenolnih

jedinjenja može se izvršiti na osnovu broja ugljenikovih atoma koji izgrađuju osnovni skelet

fenola. Prema ovoj podeli postoje: prosti fenoli, fenolne kiseline, cimetne kiseline,

naftohinoni, ksantoni, stilbeni, flavonoidi i lignini (Boros i sar., 2010).

Flavonoidi su sekundarni metaboliti biljaka, koji se uopšteno sastoje od ugljenikovog

skeleta koga čine dva pirolova prstena povezana preko pirana. Nekada su ih nazivali vitamin

P. Najveća im je koncentracija u fotosintetičkim delovima biljaka, a poznati su po svojim

antioksidativnim svojstvima koja omogućava hidroksilna grupa flavonoida. Slično

steviozidima, slabo se rastvaraju u vodi i apsorbuju, što otežava njihovu terapeutsku primenu.

(Nijveldt i sar., 2001). Ipak pokazana je njihova antibakterijska i antiviralna aktivnost a ima i

podataka o pozitivnom dejstvu u slučajevima kancera i kardiovaskularnih oboljenja

(Middleton, 1998).

U metanlono-vodenom ekstraktu lišća stevije je detektovano 7 flavonoidnih glikozida:

apigenin-4’-O glukozid, luteolin-7-O glukozid, kampferol-3-O ramnozid, kvircitrin,

kvercetin-3-O glukozid i kvercetin-3-O arabinozid i 5, 7, 3’-trihidroksi-3, 6, 4’-

trimetoksiflavon (Brandle i sar., 1998).

12

1.6. Fizičke i hemijske karakteristike stevije

Svaka komponenta stevije je slađa od saharoze: rebaudiozid A (250-400 puta),

rebaudiozid B (300-350 puta), rebaudiozid C (50-120 puta), rebaudiozid D (250-450 puta),

rebaudiozid E (150 do 300 puta), dulkozid A (50-120 puta) i steviobiozid (100-125 puta)

(Ahmed i sar., 2011). Ipak zbog prisustva seskviterpenskih laktona, nestabilnih aromatičnih i

esencijalnih ulja, tanina i flavonoida, pored slatkog, stevija ima i blago neprijatan gorak ukus

(Abou-Arab i sar., 2010).

Steviozidi su slabo rastvorljivi u vodi i imaju visoku tačku topljenja. Stabilnost

pokazuju na različitim vrednostima pH sredine i temperature. Inkubirani na povišenim

temperaturama 1h, pokazuju dobru stabilnost i do 120 °C. Na 140 °C počinje njihova

dekompozicija, a na 200 °C dekompozicija je potpuna. Izlaganje temperaturi od 60 °C u

rasponu pH od 1-10, tokom 2h gotovo da ne dovodi do degradacije, a pri temperaturi od 80

°C i pH 2 i 10, dolazi do 5 % degradacije. U jako kiselim sredinama (pH=1) i nakon

inkubacije 2 h na 80°C dolazi do dekompozicije steviozida (Abou-Arab i sar., 2010). Fizičke

i hemijske karakteristike steviozida, njihova stabilnost na različitim temperaturama i pH

vrednostima, kao i organoleptička svojstva ukazuju na to da se stevija može primenjivati kao

zamena za šećer (Abou-Arab i sar., 2010).

Komponenta Tačka topljenja

(°C)

Specifična

rotacija [α] D25

Molekulska

težina

Rastvorljivost u

vodi (%)

Steviozid 196-198 -39.3 804 0.13

Rebaudiozid A 242-244 -20.8 966 0.80

Rebaudiozid B 193-195 -45.4 804 0.10

Rebaudiozid C 215-217 -29.9 958 0.21

Rebaudiozid D 283-286 -22.7 1128 1.00

Rebaudiozid E 205-207 -34.2 966 1.70

Steviolbiozid 188-192 -34.5 642 0.03

Dulkozid A 193-195 -50.2 788 0.58

Tabela 3. Fizičke i hemijske karakteristike steviol-glikozida prisutnih u listu stevije

(Kinghorn, 2002).

).

13

1.7. Biološke aktivnosti stevije

Antihiperglikemična aktivnost

Neki metabolički poremećaji, poput dijabetesa, koji je uzrokovan nedovoljnim

stvaranjem insulina ili rezistencijom na insulin, kao i disfunkcijom β-ćelija pankreasa, su sve

češći problem u svetu. U Južnoj Americi ekstrakti stevije se uveliko koriste za lečenje

dijabetesa (Ahmed i sar., 2011). Ispitivanjem uticaja vodenog ekstrakta lista stevije na nivo

glukoze u krvi uočeno je da nakon ingestije vodenog ekstrakta dolazi do značajnog smanjenja

glukoze u plazmi (Curi i sar., 1986). Stevija ima revitalizujući efekat na β-ćelije pankreasa, a

takođe smanjuje rezistenciju na insulin i poboljšava njegovu produkciju. Chen i saradnici su

2005. otkrili da steviozidi mogu da regulišu nivo glukoze u krvi ne samo poboljšavajući

sekreciju insulina, već i njegovo iskorišćavanje kod pacova sa insulinskim deficijentom.

Takođe sprovedeno je nekoliko istraživanja na zdravim ljudima koji su konzumirali ekstrakte

lišća stevije, i uočeno je da dolazi do povećanja tolerancije na glukozu. (Chen i sar., 2005).

Potvrđeno je da ekstrakti stevije povećavaju toleranciju na glukozu i kod zečeva kojima je

izazvan dijabetes aloksanom (von Schmeling i sar., 1977).

Ekstrakti stevije koji sadrže 50 % steviozida davani su pacovima oralno 56 dana, 1g

dnevno, i osim bago smanjene aktivnosti jetrene laktat dehidrogenaze, nisu uočene druge

biohemijske ili patološke promene (Lee i sar., 1979). U drugom istraživanju ekstrakti stevije

sa 75 % steviozida i 16 % rebaudiozida A davani su pacovima 24 meseca u dozama 550

mg/kg/danu. Jedini uočen efekat je blagi poremećaj rasta (Yamada i sar., 1985).

Antihipertenzivno dejstvo

Fiziološki i farmakološki eksperimenti povrdili su da steviozidi imaju ulogu

sistemskih vazodilatatora. Ekstrakti stevije smanjuju broj otkucaja srca i krvni pritisak.

Vodeni ekstrakt davan pacovima od 40-60 dana, izazvao je hipotenziju, pad krvnog pritiska

sa 110 mm Hg na 90 mm Hg (Melis, 1995). Eksperimenti na ljudima ukazuju na pozitivne

uloge kod hipertenzivnih stanja. Potvrđeno je da 750-1500 mg dnevno steviozida smanjuje

sistolni pritisak za 10-11 mm Hg i dijastolni pritisak za 6-14 mm Hg, nakon jedne nedelje

tretmana. Steviozidi uzrokuju vazodilataciju inhibicijom ulaska Ca2+

jona u krvne sudove

(Bhutia i Sharangi, 2016).

14

Efekat na rad bubrega

Oralno davani ekstrakti stevije pacovima 40-60 dana, dva puta dnevno, izazivaju

pojačanu diurezu i izlučivanje natrijuma, kao i povećan renalni protok plazme što ukazuje na

vazodilataciju. Ipak glomerulna filtracija ostaje nepromenjena (Melis, 1995).

Antioksidativna svojstva

Antioksidansi detektovani u ekstraktima biljke Stevia rebaudiana su mnogi. Medju

njima ima opigenina, kampferola, kueritrina koji inhibiraju oštećenja DNK lanca. Izosteviol,

derivat steviozida inhibira angiotenzin II-indukovanu ćelijsku proliferaciju i sekreciju

endotelina i oslabljuje reaktivne vrste kiseonika (eng. Reactive oxygen species- ROS)

(Ghanta i sar., 2007 i Stoyanova i sar., 2011). Zato može biti koristan u lečenju raznih bolesti,

poput kancera, reproduktivnih problema i poremećaja u razvoju (Bhutia i Sharangi, 2016).

Anti-kancerogeni efekat

Iako ima malo dokaza, u svom radu iz 2006. Yukasava i saradnici tvrde da 4 izolata

steviol-gikozida (steviozid, rebaudiozid A i C i dulkozid A) iz stevije imaju jak inhibitorni

efekat na 12-0-tetradekanoilforbol-13-acetat (TPA)-indukovanu infalamaciju kod miševa što

ukazuje na njihova antikancerogena svojstva (Raskovic i sar., 2004 i Yasukawa, 2002).

Izosteviol inhibira DNK polimerazu i humanu DNK topoizomerazu II, ćelijske ‘’mete’’ u

terapiji kancera i upalnih oboljenja. Osim toga, izosteviol takođe inhibira rast 3 različita tipa

kancerskih ćelija i umanjuje TPA-indukovane inflamacije (Kumari i Chandra, 2014).

Antimikrobna aktivnost

Svojstvo stevije da inhibira rast i reprodukciju bakterija i drugih infektivnih

organizama je važna sa dva aspekta. Prvo, može smanjiti učestalost prehlada i gripa (Bhutia i

Sharangi, 2016). Sa druge strane pokazano je da Streptococcus mutans, Pseudomonas

aeruginsa i Proteus vulgaris i ostali mikrobi ne opstaju u prisustvu konstituenata stevije.

(Tadhani i sar., 2007). Ove činjenice, kao i sam sladak ukus biljke, čine je pogodnom za

izradu sredstava za ispiranje usta i zubnih pasti. Istraživanja su pokazala i to da stevija

smanjuje učestalost stvaranja zubnog karijesa. Takođe, postoje dokazi i o tome da derivati

15

dobijeni iz izolata stevije, koji uključuju okta-acetilombuozid, ombuin i retuzin, imaju

antimikrobnu aktivnost protiv G+ bakterija (Tomita i sar., 1997). Ova antimikrobna i

antitkancerogena svojstva različitih ekstakata lišća stevije čine je potencijalnim inovativnim

medikamentom (Bhutia i Sharangi, 2016). Ekstrakti stevije, koncentracije 100 μg/ml,

pokazuju antibakterijsku aktivnost kod bakterija Serratia marcescens, Klebsiella

pneumoniae, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Alcaligens denitificans i Salmonela

typhimurium. Najefektivnija zona inhibicije je pokazana kod Bacillus cereus i iznosi 12 mm.

Ekstrakti lišća stevije pokazuju i antifungalnu aktivnost kod patogenih gljiva Alternaria

solani, Heliminthosporium solani, Aspergillus niger i Penicillium chrysogenium, i kod nekih

patogenih bakterija Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis i

Staphylococcus aureus (Kumari i Chandra, 2014).

Anti-inflamatorni i imuno-modulatorni efekat

Anti-inflamatorni lekovi čine gotovo polovinu analgetika koji umanjuju bol

redukovanjem upalnog procesa, za razliku od opijata koji utiču na centralni nervni sistem.

Uočeno je da stevija umanjuje sintezu inflamatornih medijatora u lipopolisaharidno

stimulisanim THP 1 ćeijama, tako što interferira sa I kapa B kinazom (IKKB) i stoga kapa B

signani put ima anti-inflamatorni i imuno-modulatorni efekat. (Bookaewan i sar., 2006).

Letalna doza

Jedna studija je pokazala da je letalna doza (LD50) kod pacova, za vodeni etanolni rastvor

koji sadrži 50% steviozida, 3400 mg/kg (Lee i sar., 1979), a kod miševa 17 g/kg. (Akashi i

Yokoyama, 1975).

16

2. CILJ RADA

Cilj ovog rada bilo je ispitivanje uticaja različitih koncentracija rastvora zaslađivača

na bazi stevije, na vijabilnost ćelija kostne srži i osmotsku rezistenciju eritocita periferne krvi

pacova soja Wistar.

17

3. MATERIJAL I METODE

3.1. MATERIJAL

U eksperimentu je korišćen sledeći materijal:

- Eksperimentalne životinje, pacovi soja Wistar, težine oko 300g

- Kostna srž femura i tibije pacova Wistar

- Eritrociti pacova Wistar

- Zaslađivač na bazi stevije

3.2. METODE

- Priprema štok i radnih rastvora

- Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova

- Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži

- Protokol za podešavanje željene gustine ćelija

- Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja

- Postupak za dobijanje eritrocita

- Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda)

- Obrada rezultata

3.2.1. Priprema štok i radnih rastvora

PBS (eng. phosphate buffer solution – fosfatni pufer) se najčešće koristi u biološkim

istraživanjima za održavanje PH sredine. Nije toksičan za ćelije pa zbog toga ima mnogo

namena. U ovom radu, PBS je korišćen kao rastvarač pri pravljenju štok i radnih rastvora.

Koncentrovan rastvor koji se u različitim razblaženjima koristi u laboratoriji je štok

rastvor. Razblaženja štok rastvora su radni rastvori. Štok rastvor je dobijen rastvaranjem 10 g

zaslađivača na bazi stevije u 50 ml puferovanog fiziološkog rastvora (PBS). Na taj način je

dobijen štok koncentracije 200 mg/ml rastvora zaslađivača na bazi stevije. Pre izvođenja

eksperimenta napravljeni su radni rastvori koncentracija 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100

mg/ml. Radni rastvori dobijeni su razblaživanjem štoka u puferovanom fiziološkom rastvoru

18

(PBS-u), tako da su se konačne koncentracije radnog rastvora zaslađivača nalazile u 0,9%

PBS-u.

3.2.2. Izolovanje kostne srži iz femura i tibije pacova

Pacovi se žrtvuju, a potom se dezinfikuju 70 % etanolom. Femuri i tibije obe noge se

oštrim makazama i skalpelom izoluju i očiste od mukulature i vezivnog tkiva, a zatim im se

odseku epifize. U sterilni špric je uvučeno 2 ml PBS-a. Kratka gumena cevčica se jednim

krajem navuče na vrh šprica, a drugim na kost. Istiskivanjem fiziološkog rastvora iz šprica u

epruvetu, koja se nalazi na ledu, izduvana je kostna srž svake kosti, istovremenim

pridržavanjem cevčice kako ne bi spala zbog pritiska. Nakon toga se ćelije kostne srži

resuspenduju Pasterovom pipetom kako bi se razbili ćelijski agregati.

Slika 7. Šematski prikaz izolacije kostne srži iz femura i tibije pacova

(http://synapse.koreamed.org/DOIx.php?id=10.4111/kju.2008.49.5.432&vmode=PUBREAD

ER)

3.2.3. Postupak za dobijanje ćelijskih elemenata kostne srži

Resuspendovana ćelijska suspenzija centrifugira se 10 min., na 1100 obrtaja/min pri

temperaturi od 4 °C. Po završenom centrifugiranju, Pasterovom pipetom je izvučen

supernatant i talogu ćelija koji ostaje na dnu epruvete dodaje se 4 ml PBS-a. Ćelije su zatim

resuspendovane u PBS-u i na taj način je dobijen ćelijski štok.

19

3.2.4. Protokol za podešavanje željene gustine ćelija

Ovaj protokol se koristi za određivanje

vijabilnosti ćelija, prinosa vijabilnih ćelija i

podešavanje željene gustine ćelija (1.0 x 106

ćelija/ml). Najpre, u čistu ependorficu treba

dodati 350 µl PBS-a, 50 µl 0.4 % Tripan plavo

rastvora, a zatim i 100 µl ćelijskog štoka. Time se

pravi finalni rastvor ćelije:štok u odnosu 1:5. U

formuli koja sledi, ovo se odnosi na “faktor

razblaženja”.

Brojanje ćelija vrši se u hemocitometarskim

komoricama, od kojih je Neubauerova najčešće

korišćena. Neubauerova hemocitometarska komorica

predstavlja debelu predmetnu pločicu u koju su urezana

4 uzdužna žljeba. Između 2 unutrašnja žljeba, se nalazi

poprečni žljeb koji deli srednje polje na 2 jednaka dela.

U oba dela srednjeg polja su urezane mrežice za brojanje

ćelija. Površina mrežice je 9 mm2 i čini je 9 kvadrata

površine 1 mm2. Svaki od ovih kvadrata podejen je na

16 manjih, jednakih kvadrata čija je površina 1/16mm2.

Centralni kvadrat podeljen je na 25 manjih kvadrata, od

kojih je svaki podeljen na još 16 jednakih kvadratića čija

je površina 0.0025 mm2.

Pipetmanom iz ependorfice uzorkujemo 20 μl obojene ćelijske suspenzije i prenesemo

je u Neubauer-ovu hemocitometarsku komoricu. Ćelije su brojane u 4 periferna kvadrata

površine 1 mm2.

Ćelijsku vijabilnost određujemo koristeći formulu:

Broj živih ćelija / Ukupan broj ćelija = Vijabilnost (%)

Nakon toga ukupan prinos vijabilnih ćelija određujemo pomoću sledeće formule:

Broj vijabilnih ćelija / Prebrojani kvadranti x Faktor razblaženja x Hemocitometarski faktor

x Trenutni volumen (ml) = Prinos vijabilnih ćelija

Slika 8. Neubauer-ova komorica za

brojanje ćeija

(http://laboratoryinfo.com/manual-cell-

counting-neubauer-chamber/)

Slika 9. Mrežica

hemocitometarske komorice

(Louis i Siegel, 2011).

20

Koristeći naredne formule odredili smo volumen medijuma (PBS-a) koji treba dodati našem

trenutnom ćelijskom štoku da bi dobili željenu ćelijsku gustinu (1.0 x 106

ćelija/ml).

Prinos vijabilnih ćelija / Željena gustina ćelija = Ukupan potrebni volumen

Ukupan potrebni volumen - Trenutni volumen = Volumen koji se dodaje ćelijskom štoku

3.2.5. Tripan plavo (Trypan blue) metod isključivanja

Tripan plavo (eng. Trypan blue) je vitalna boja proizvedena iz toulidina, odnosno

nekoliko izomernih baza derivata toulena. Naziv boje potiče od njene sposodnosti da ubija

parazite koji izazivaju bolest spavanja, Tripanozome. Poznata je još i pod nazivima Nijagara

plavo i diamin plavo.

Tripan plavo metoda, kojom se određuje

vijabilnost ćelija, zasnovana je na negativnom

naelektrisanju boje, što joj omogućava da kroz

selektivno propustljivu membranu ćelija prolazi samo

u slučaju ako je došlo do oštećenja membrane. Žive

ćelije, čiji je integritet membrane očuvan, ne

propuštaju boju i posmatranjem pod mikroskopom se

vide kao svetlo-žute. Mrtve ćelije, kod kojih je došlo

do oštećenja membrane, primaju tripan plavo boju, pa

se pod mikroskopom vide kao plave. Ovom metodom

se ne mogu međusobno razlikovati mrtve i nekrotične

ćelije (Louis i Siegel, 2011).

Nakon podešavanja željene gustine ćelija, obeležene su nove, čiste epruvete u koje je

pipetmanom prebačeno po 500 μl ćelijske suspenzije i 500 μl radnog rastvora zaslađivača na

bazi stevije, triplet od svake koncentracije. U kontroli je, umesto radnog rastvora, dodato 500

μl PBS-a. Epruvete su inkubirane u vodenom kupatilu 1h, na temperaturi od 37 °C.

Nakon završetka inkubacije, sadržaj epruveta ponovo se centrifugira 10 min, na 1100

obraja/min na 4 °C kako bi se ćelije istaložile na dnu epruvete. Po završetku centrifugiranja,

pažljivo se pipetmanom izvuče 900 μl supernatanta i doda se ista količina tripsina. Tripsin

ima ulogu da odvoji ćelije međusobno, kao i od dna i zidova epruvete, za koje su adherirale u

toku centrifugiranja. Rastvor je stajao u frižideru 10 min. Nakon toga po 50 μl suspenzije iz

Slika 10. Vijabine i nevijabilne

ćelije (tripan plavo metoda)

(http://forum.cellprofiler.org/t/tryp

an-blue-exclusion-pipeline/1715)

21

svake epruvete je prebačeno u novu, obeleženu ependorficu, gde je dodato i 50 μl Tripan

plavo boje.

Iz svake ependorfice je uzeto po 20 μl obojene ćelijske suspenzije, i prebačeno na

Neubauer-ovu komoricu na kojoj su brojane žive i mrtve ćelije odvojeno. Na osnovu odnosa

živih i mrtvih ćelija za svaku koncentraciju je izračunat procenat vijabilnosti, srednja

vrednost svakog tripleta kao i standardna greška.

3.2.6. Postupak za dobijanje eritrocita

Eritrociti za ispitivanje osmotske otpornosti su dobijeni iz krvi pacova, koji je

anesteziran sa 0,4 ml ketamidora (Ketamidor 10%, Ritcher Pharma, Austrija). Eritrociti pune

krvi su dobijeni punkcijom leve komore srca špricem sa sterilnom iglom. Špric i igla su

prethodno heparinizovani kako bi se onemogućila koagulacija krvi. Zatim je izvučeno 10 ml

krvi sa povremenim zaustavljanjem kako bi se srce napunilo. Krv iz šprica je prebačena u

epruvetu laganim ispuštanjem niz zid epruvete, kako se ne bi oštetile ćelije.

3.2.7. Cijanmethemoglobinska metoda (CH metoda)

CH metoda se zasniva na tome da se hemoglobin krvi, tretirane kalijum cijanidom i

kalijum fericijanidom, pretvori u stabilni kompleks cijanmethemoglobin (HbCN).

Koncentracija oslobođenog hemoglobina iz eritrocita se određuje spektrofotometrijski na

talasnoj dužini od 540 nm. Drabkinov reagens se dobija mešanjem 1000 mg natrijum

bikarbonata, 50 mg kalijum cijanida, 200 mg kalijum fericijanida i vode do 1000 ml (Rusov,

1984).

Dobijena puna krv se centrifugira 3 puta. Posle svakog centrifugiranja se odliva

supernatant, a na talog eritrocita se dodaje 0,9 % PBS-a u istoj količini kolika je bila

zapremina krvi na početku. Nakon centrifugiranja talog eritrocita koji u ovom slučaju iznosi 5

ml se razblaži PBS-om, po sledećoj formuli:

5 ml:10% = x ml:90%

Od suspenzije eritrocita (50 ml) uzima se po 3 ml, u koji se dodaje po po 3 ml

radnog rastvora zaslađivača do željne finalne koncentracije. To se inkubira 3h na temperaturi

od 37 °C.

22

Po inkubaciji epruvete se centrifugiraju 5 min na 2000 obrtaja. U svaku epruvetu se

dodaje po 3 ml Drabkinovog reagesa i 200 μl cenrifugiranog ekstrakta i krvi. Kao negativna

kontrola u eksperimentu je korišćen je 0,9 % NaCl, a kao pozitivna kontrola (standard)

destiovana voda. Tako pripremljeni uzorci su odlivani u kivete spektrofotometra i merene su

absorbance na talasnoj dužini od 540 nm, kao nula korišćen je Drabkinov reagens. Na kraju

eksperimenta, određivanjem koncentracije hemoglobina spektrofotometrijski, utvrđen je

procent hemolize merenjem absorbance uzorka, kontrole i standarda na spektrofotometru.

Formula za izračunavanje procenta hemolize je sledeća:

Ab uzorka – Ab negativne kontrole / Ab dH2O x 100 %

Ispitivanje svake koncentracije rađeno je u triplikatu.

3.3. Obrada rezultata

Za statističku obradu dobijenih rezultata korišćen je program Microsoft Office Excel.

23

4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Uticaj zaslađivača na vijabilnost ćelija kostne srži

Ćelije kostne srži inkubirane su sa rastvorima zaslađivača na bazi stevije (Stevia

rebaudiana), koncentracija 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml i 100 mg/ml, 1 h u vodenom

kupatilu na temperaturi od 37 °C. Kontrola je inkubirana u PBS-u.

Rezultati inkubacije različitih koncetracija zaslađivača prikazani su na Grafiku 1. Vijabilnost

ćelija kostne srži je najveća u kontrolnoj grupi i iznosi 83,90 ± 2,62 %. Sa rastom finalne

koncentracije zaslađivača vijabilnost linearno opada pa tako pri koncentraciji od 25 mg/ml

ona iznosi 76,65 ± 5,14 %, koncentracija 50 mg/ml ima vijabilnost 61,94 ±1,89 %,

koncentracija 75mg/ml ima vijabilnost 55,95 ± 6.35 %, dok najveća ispitivana koncentracija

od 100 mg/ml ima vijabilnost ćelija 42,78 ± 2,98 %.

83,90

76,65

61,94

55,95

42,78

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% v

ijab

iln

ost

i će

lija

Koncentracije rastvora zaslađivača (mg/ml)

Vijabilnost ćelija

25 mg/ml 50 mg/ml 75 mg/ml 100 mg/ml kontrola

Grafik 1. Procenat vijabilnih ćelija kostne srži, nakon tretiranja ćelija razičitim

koncentracijama zaslađivača na bazi stevije i inkubacije na temperaturi od 37°C.

24

4.2. Uticaj zaslađivača na osmotsku rezistentnost eritrocita

U drugom eksperimentu je ispitivano u kom procentu različite koncentracije zaslađivača

izazivaju hemolizu eritrocita. Rezulati uticaja na osmotsku rezistencju eritocita periferne krvi

pacova prikazani su na Grafiku 2.

Grafik 2. Procenat hemolize eritocita tretiranih koncentracijama zaslađivača na bazi stevije

(25-100 mg/ml) posle inkubacije na temperaturi od 37 °C.

Na Grafiku 2. se jasno uočava da povećana koncentracija ispitivanog zaslađivača veoma

utiče na procenat hemolize, tako da koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 %

hemolize.

Naši rezulati ispitivanja potencijalne citoksičnosti zaslađivača na bazi stevije na ćelijama

kostne srži pokazuju da postoji linearna zavisnost između povećanja koncentracije i

smanjenja procenta vijabilnosti. Ovi rezulati se mogu tumačiti u svetlu do sada obajvljenih

rezulta pojedinih autora kao što su Gaweł-Bęben i saradnici (Gaweł-Bęben i sar., 2015).

Gaweł-Bęben i saradnici su ispitivali citotoksičnost 3 različita ekstrakta suvog lišća stevije

dobijena turbo-ekstrakcijom. Za dobijanje prvog ekstrakta je korišćena destilovana voda, za

60%

75%

91% 92%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

25 50 75 100

% h

emoli

ze

Koncentracije (mg/ml)

25

dobijanje drugog 96 % etanol, a za pripremu trećeg ekstrakta korišćen je rastvor propilen

glikol:voda u odnosu 4:1. Iako se vodeni i etanolni ekstrakt najčešće koriste, ovde je prvi put

upotrebljen rastvor propilen glikol:voda koji se često koristi u kozmetičkoj industriji.

Rezultati su pokazali da količina fenola i flavonoida najveća u ekstraktu dobijenom pomoću

rastvora propilen glikol:voda. Visoka koncentracija fenola ukazuje na postojanje

citotoksičnog potencijala ali istovremeno velika količina flavonoida utiče na značajne

antioksidativne sposobnosti ekstrakata stevije(Gaweł-Bęben i sar., 2015).

Akutna toksičnost steviozida i steviola (produkta enzimske hidrolize steviozida) je

ispitivana oralnim tretiranjem miševa, pacova i hrčaka. Broj uginulih životinja je zabeležen

14 dana nakon primanja doza. Doza steviozida od 15 g/kg telesne mase nije bila letalna ni za

jednu grupu životinja. Hrčci su bili osetljiviji na steviol od miševa. LD50 za steviol kod

hrčaka je bila 5,20 g/kg i 6,10 g/kg, za mužjake i ženke, respektivno. Za miševe i pacove,

LD50 vrednosti su bile veće od 15 g/kg, za oba pola. Histopatološki pregled bubrega hrčaka

koji su primali doze steviola pokazali su degeneraciju proksimalnih tubula. Ove strukturne

promene su u korelaciji sa povećanjem krvnog urea nitrata i kreatinina u serumu. To ukazuje

da je mogući uzrok smrti životinja, usled tretiranja steviolom, akutno otkazivanje bubrega

(Toskulkac i sar., 1997).

U istraživanjima Wasuntarawat-a i sarnika ispitivana je toksičnost steviola kod hrčaka.

Trudne ženke su intubirane dozama steviola od 0 g/kg, 0,25 g/kg, 0,5 g/kg, 0,75 g/kg i 1 g/kg

telesne mase dnevno, 6 do 10 dana. Doze steviola od 0,75 g/kg i 1 g/kg su pokazale veliku

toksičnosti i za ženke i za fetuse hrčaka. Na to ukazuju smanjena težina ženki tretiranih ovim

dozama, i povećan se broj uginulih, a takođe i smanjenje broja živih hrčaka po leglu kao i

smanjenje težine fetusa. Na fetusu jedne ženke, koja je primala dozu od 0,75 g/kg je uočena

kranijalna meningocela. Životinje tretirane dozom od 0,5 g/kg pokazuju manje znakova

toksičnosti. Doza od 0.25 g/kg nije pokazala toksični potencijal. Ove doze steviola su

izvedene iz doze steviozida od 625 mg/kg telesne mase dnevno, što je otprilike 80 puta veća

vrednost od dozvoljenog dnevnog unosa (koji iznosi 7.938 mg/kg telesne mase za čoveka)

(Wasuntarawat i sar., 1998).

26

5. ZAKLJUČAK

Postoji linearna zavisnost citoksičnog potencijala zaslađivača na bazi stevije i

smanjenja vijabilnosti ćelija kostne srži. Koncentracija od 100 mg/ml pokazuje

smanjenje na oko 50 % vijabilnosti ćelija.

Povećana koncentracija ispitivanog zaslađivača veoma utiče na procenat hemolize, pa

tako koncentracije veće od 75 mg/ml izazivaju preko 90 % hemolize eritrocita u

perifernoj krvi.

Dobijeni rezultati predstavjaju preliminana istraživanja i mogu biti dobra osnova za

buduća detaljnija ispitivanja efekata zaslađivača na bazi biljke Stevia rebaudiana

(Bert.)

27

6. LITERATURA

Abou-Arab, A.E., et al. 2010. Physico-chemical assessment of natural sweeteners steviosides

produced from Stevia rebaudiana Bertoni plant. African Journal of Food Science, 4(5),

pp.269- 281.

Aharoni, A., et al., 2005. Volatile science? Metabolic engineering of terpenoids in plants.

Trends in Plant Science, 10(12), pp.594-602.

Ahmed, B. et al., 2011. A review on natural sweetener plant – stevia having medicinal and

commercial importance. Agronomski glasnik, 1(2), pp.75–92.

Akashi, H. & Yokoyama, Y., 1975. Safety of dried-lief extracts of Stevia rebaudiana.

Shokuhin Kogyo, 18(20), pp.34-43.

Bhutia, P.H. & Sharangi, A.B., 2016. Stevia: Medicinal Miracles and Therapeutic Magic.

International Journal of Crop Science and Technology, 2(2), pp.45–59.

Bookaewan, C. et al., 2006. Anti inflammatory and immunomodulatory activities of

stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. Journal of Agricultural and Food

Chemistry, 54(3), pp.758-789.

Boros, B. et al., 2010. Determination of polyphenolic compounds by liquid chromatography-

mass spectrometry in Thymus species. Journal of chromatography A, 1217(51), pp.7972-

7980.

Brandle, J.E. et al., 1998. Stevia rebaudiana: Its agricultural, biological, and chemical

properties. Canadian Journal of Plant Science, 78(4), pp.527-536.

Buckinghman, J. (1994). Dictionary of natural products. Champan and Hall, London.

Chen, T. et al., 2005. Mechanism of the hypoglycemic effect of stevioside , a glycoside of

Stevia rebaudiana. Plant Medicine, 71(2), pp.108-213.

28

Curi, R. et al., 1986. Effect of Stevia rebaudianaon glucose tolerance in normal adult humans.

Brazilian Journal of Medical and Biological Research , 19(6), pp.771-774.

de Slavutzky, S.M.B., 2010. Stevia and sucrose effect on plaque formation. Journal für

Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 5(2), pp.213-216.

Dewick, P.M. (2002). Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. John Wiley &

Sons, England.

Gasmalla, M.A.A. et al., 2014. Nutritional Composition of Stevia rebaudiana Bertoni Leaf:

Effect of Drying Method. Tropica Journal of Pharmaceutical Research, 13(1), pp.61–65.

Gaweł-Bęben, K. et al., 2015. Stevia rebaudiana Bert. leaf extracts as a multifunctional

source of natural antioxidants. Molecules, 20(4), pp.5468–5486.

Ghanta, S. et al., 2007. Oxidative DNK damage preventive activity and antioxidant potential

of Stevia rebaudiana (Bertoni) Bertoni: A natural sweetener. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 55(26), pp.10962-10967.

Giuffré, L. et al., 2013. Stevia, ka’a he'e, wild sweet herb from South America - An

overview. Emirates Journal of Food and Agriculture, 25(10), pp.746-750.

Graβmann, J., 2005. Terpenoids as plant antioxidants. Vitamins and Hormones, 72: 505-535.

Gupta, E. et al., 2013. Nutritional and therapeutic values of Stevia rebaudiana: A review.

Journal of Medicinal Plants Research, 7(46), pp.3343–3353.

Gupta, R. et al., 2014. A rewiew on importance of natural sweetener, a zero calorie plant-

stevia- having medical and commercial importance. Internatonal Journal of Food and

Natural Sciences, 3(3), pp.90-94.

Kinghorn, A. 2002. Stevia: The genus Stevia. Taylor & Francis, London, UK, 2002.

Kobus-Moryson, M. & Gramza-michałowska, A., 2015. Directions on the use of stevia leaves

(Stevia rebauidana), Acta Sci. Pol. Technol. Aliment, 14(1), pp.5–13.

29

Kumari, M. & Chandra, S., 2014. Stevia rebaudiana: Beyond sweetness. Handbook of

Medicinal Plants and their Bioactive Compounds, 661(2), pp.11–26.

Lee, S.J. et al., 1979. A study on the safety of stevioside as a new sweetening source. Korean

Journal of Food Science and Technology, 11, pp.224-231.

Lemus-Mondaca, R. et al., 2012. Stevia rebaudiana Bertoni, source of a high-potency natural

sweetener: A comprehensive review on the biochemical, nutritional and functional aspects.

Food Chemistry, 132(3), pp.1121–1132.

Louis, K.S. & Siegel, A.C., 2011. Cell Viability Analysis Using Trypan Blue: Manual and

Automated Methods. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 740, pp.7-12.

Mahmoud, S.S. & Croteau, R.B., 2002. Strategies for transgenic manipulation of

monoterpene biosynthesis in plants. Trends in Plant Science, 7(8), pp.366-373.

Martin, K.R. & Appel, C.L., 2010. Polyphenols as dietary supplements: A double-edged

sword. Nutrition and Dietary Supplements, 2, pp.1-12.

Megeji, N.W. et al., 2002. Introducing Stevia rebaudiana, a natural zero-calorie sweetener.

Current science, 88(5), pp.801–804.

Melis, M.S., 1995. Chronic administration of aqueous extract of Stevia rebaudiana in rats:

rennal effects. Journal of Ethnopharmacology, 47(3), pp.129-134.

Middleton, E. & Kandaswami, C., 1998. Effect of Plant Flavonoids on Immune and

Inflammatory Cell Function. Biochemical Pharmacology, 43(6), pp.1167-1169.

Nijveldt, J.R. et al., 2001. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and

potential applications1,2,3. American Society for Clinical Nutrition,74(4), pp.418-425.

Pietta, P.G., 2000. Flavonoids as antioxidants. Journal of Natural Products, 63(7), pp.1035-

1042.

30

Raskovic, A. et al., 2004. Joint effect of commercial preparations of Stevia rebaudiana

Bertoni and sodium monoketocholate on glycemia on mice. European Journal of Drug

Metabolism and Pharmacokinetics, 29(2), pp.83-86.

Rusov Č. (1984). Osnovi hematologije životinja. Beograd: Naučna knjiga.

Sai, V. et al., 2011. Diterpene Glycosides from Stevia rebaudiana. Molecules, 16(5),

pp.3552-3562.

Sawai, S. & Saito, K., 2011. Triterpenoid biosynthesis and engineering in plants. Fronties in

Plant Science, 2(25), pp.1-8.

Segura-Campos, M. et al., 2014. Comparison of Chemical and Functional Properties of Stevia

rebaudiana (Bertoni) Varieties Cultivated in Mexican Southeast. American Journal of Plant

Sciences. 5(3), pp.286–293.

Singh, S.D. & Rao, G.P., 2005. Stevia: The herbal sugar of 21st century. Sugar Tech, 7(1),

pp.17-24.

Sokić, B.Z. et al., 2009. Inulin.potencijalni prebiotik.Med. pregl., 62(3-4), pp.153-156.

Stalikas, C.D., 2007. Extraction, separation, and detection methods for phenolic acids and

flavonoids. Journal of Separation Science. 30(18), pp.3268-3295.

Stoyanova, S. et al., 2011.The food additives inulin and stevioside counteract oxidative stress.

Internacional Journal of Food Science and Nutrition, 62(3), pp.207-214.

Tadhani, M.B. et al., 2007. In vitro antioxidant activity of Stevia rebaudiana leaves and

callus. Journal of Food Composition and Analysis. 20(3-4), pp.323–329.

Tomita, T. et al., 1997. Bactericidal activity of a fermented hot-water extract from Stevia

rebaudiana Bertoni towards enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 and other food-

borne pathogenic bacteria. Microbiology and Immunology. 41(12), pp.1005-1009.

31

Toskulkac, C. et al., 1997. Acute Toxicity of Stevioside, A Natural Sweetener, and its

Metabolite, Steviol, in Several Animal Species. Drug and Chemical Toxicology, 20(1-2),

pp.31-44.

von Schmeling, G.A. et al., 1977. Stevia rebaudiana Bertoni. Evaluation of the hypoglycemic

effect in alloxanized rabbits. Ciencia e Cultura (Sao Paolo). 29(5), 599-601.

Wasuntarawat, C. et al., 1998. Developmental Toxicity of Steviol, a Metabolite of Stevioside,

in the Hamster. Drug and Chemical Toxicology, 21(2), pp.207-222.

Yadav, A.K. et al., 2011. A review on the improvement of stevia [Stevia rebaudiana

(Bertoni)]. Canadian Journal of Plant Science. 91(1), pp.1-27.

Yamada, A. et al., 1985. Chronic toxicity study of dietary stevia extracts in F344 rats.

Journal of Food and Hygenic science of Japan. 26(2), pp.169-183.

Yasukawa, K. 2002. Inhibitory effectof stevioside on tumor promotion by 12-0-

tetradecanoilphorbol-13-acetate in two stage carcinogens in mouse skin. Biological &

Pharmaceutical Bulletin, 25(11), pp.1488-1490.

Zayova, E. et al., 2013. Antioxidant activity of in vitro propagated Stevia rebaudiana Bertoni

plants of different origins. Turkish Journal of Biology. 37(1), pp.106–113.

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO: Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: Master thesis

Author, AU: Sara Stanković

Mentor, MN: Perica Vasiljević

Title, TI: The cytotoxic effect of the Stevia sweeteners on bone marrow cells of Wistar rats

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Republic of Serbia

Publication year, PY: 2016

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)

6 chapters/ 31 pages/ 51 references/ 10 pictures/ 2 graphics

Scientific field, SF: Biology

Scientific discipline, SD: cell biology, cell physiology

Subject/Key words, S/KW: Stevia rebaudiana, cytotoxic activity, bone marrow cells, Trypan blue test, erythrocytes, hemolysis

UC 615.9:664.162.81]:599.323.45+616.71-018.46

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: Stevia rebaudiana (Bertoni) is a plant that is native to South America and belongs to the family Asteraceae. The leaves of this plant has been used for hundreds of years as a sweetener. Active substances in the leaves are steviol glycosides (mainly stevioside and rebaudioside (Reb A)), which are more than 200 times sweeter than sugar. Specified ingredients can be extracted by extraction method and used to produce a variety of sweeteners. The aim of this work was to investigate the effect of Stevia sweeteners on the viability of bone marrow cells of Wistar rats. Final concentration of the test solution of the sweetener were 25mg/ml, 50mg/ml, 75mg/ml and 100mg/ml. The impact on the viability of the cells of the bone marrow was performed up the Trypan blue test at a temperature of 37 °C. The percentage of hemolysis of red blood cells was determined by measuring absorbance on a spectrophotometer, at a wavelength of 540 nm, after incubation the solution with red blood cells at a temperature of 37 °C. The results show that the tested concentrations have significant cytotoxic potential. Maximum viability of bone marrow cells is at a minimum concentration of the test sweetener solution, while at the highest concentration cell viability is the smallest. Also, the increased concentration of the test sweetener solution greatly affects the percentage of hemolysis, so concentrations greater than 75 mg/ml caused 90 % hemolysis.

Accepted by the Scientific Board on, ASB:

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: prof. dr Ljubiša Đorđević

Member: prof. dr Marina Jušković

Member, Mentor: prof. dr Perica Vasiljević

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: Мастер рад

Аутор, АУ: Сара Станковић

Ментор, МН: Перица Васиљевић

Наслов рада, НР: Цитотоксични ефекат заслађивача на бази стевије на

ћелије костне сржи пацова соја Wistar

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2016.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/ цитата/табела/слика/графика/прилога)

6 поглавља/ 31 стр./ 51 citat/ 10 слика/ 2 графика

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: биологија ћелије, ћелијска физиологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: Stevia rebaudiana, цитотоксична активност, ћелије костне

сржи, Трипан плаво тест, еритроцити, хемолиза

УДК 615.9:664.162.81]:599.323.45+616.71-018.46

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: Stevia rebaudiana (Бертони) је биљка која потиче из Јужне Америке, а припада фамилији Asteraceae. Лишће

ове биљке се користи већ стотинама година као заслађивач. Активне супстанце у лишћу су стевиол-гликозиди

(најзаступјенији су стевиозид и ребаудиозид (Реб А)), које су више од 200 пута слађе од шећера. Поступком

екстракције наведени се састојци издвајају и користе за добијање различитих заслађивача. Циљ овог рада

било је испитивање утицаја различитих концентрација раствора заслађивача на бази стевије, на вијабилност

ћелија костне сржи и осмотску резистенцију еритоцита периферне крви пацова соја Њистар. Финалне

концентрације испитиваног раствора заслађивача биле су 25 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл и 100 мг/мл. Утицај на

вијабилност ћелија костне сржи рађена је Трипан плавим тестом на температури од 37 °Ц. Проценат

хемолизе еритроцита утврђен је мерењем абсорбанце на спектрофотометру, на таласној дужини од 540 нм,

после инкубације раствора са еритроцитима на температури од 37 °Ц. Добијени резултати показују да

испитиване концентрације поседују значајни цитотоксични потенцијал. Највећа вијабилност ћелија костне

сржи је при најмањој концентрацији испитиваног раствора заслађивача, док је при највећој концентрацији

вијабилност ћелија најмања. Такође, повећана концентрација испитиваног раствора заслађивача веома утиче

на проценат хемолизе, па концентрације веће од 75 мг/мл изазивају преко 90 % хемолизе.

Датум прихватања теме, ДП:

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: проф. др Љубиша Ђорђевић

Члан: проф. др Марина Јушковић

Члан, ментор: проф. др Перица Васиљевић