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CISH

Julián Sanz Ortega

Índice

1. Concepto

2. Técnica

3. Optimización

4. Formas especiales de CISH

5. Aplicaciones

6. Casos prácticos

CISH: Chromogenic in situ hybridisation

• ADN: Amplificaciones, traslocaciones, deleciones…

– Riboprobes.

– cADN.

• ARN.

1.- Concepto

CISH/FISH

• CISH mejor correlación con morfología.

• Marcaje permanente.

• Menor número de sondas CISH disponibles.

1.- Concepto

Sondas

A.- Seleccionar sonda: BAC (bacterial artificial chromosomes) YAC (yeast artificial cromosomes), P1 u otros vectores

B.- Técnica de marcaje:

“NICK TRANSLATION”:

“RANDOM PRIMING”.

PCR

C.- Marcaje:

• Hapteno: BIOTINA o DIGOXIGENINA

• Fluorófobo (Fluoresceína, FITC, Cy3, Alexa488..)

2.- Técnica

Hibridación

• Desparafinado

• Digestión enzimática

• Hibridación

• Lavados

• Amplificación de la señal (inmunohistoquímica):

– Biotina: Avidina-Biotina

– Digoxigenina: Peroxidasa-antiperoxidasa,

fosfatasa alcalina

2.- Técnica

Detección de hibridación

.

Convertir sondas de FISH en CISH: inmunohistoquímica:

Determinantes antigénicos: molécula de fluorescencia (FITC, Cy3,

Alexa488 y otros).

Anticuerpos mono o policlonales

Sistemas de detección basados en peroxidasa o Fosfatasa Alkalina

2.- Técnica

Optimización

• Desparafinado (dewaxing): relación inversa

entre tiempo y temperatura (5, 10, 20, 30 ó

40 min)/ tª ambiente, 42ºC ó 58°C.

• Tiempo digestión, (over or under digestion)

entre 4 y 10 min.

• Concentración sonda (20 -100 ng/ l).

• Tampón hibridación y lavados post-hibridación.

Evans MF, Aliesky HA, Cooper K. Optimization of biotinyl-tyramide-based in situ hybridization for sensitive

background-free applications on formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens.

BMC Clin Pathol 2003;3:2.

3.-Optimización

Tiempo digestión

• Depende del tipo de tejido.

– <4 min ausencia total de señales,

– >10 min mala morfología o señales borrosas,

background, pérdida de sensibilidad

3.-Optimización

Desparafinado

• Pérdida de señal si desparafinado

insuficiente (<3 veces durante 5–10 min

en xilol a TªA)

• Recomendación: 55°C por 15 min (3

veces por 5 min) o 42°C por 15–30 min y

luego segunda incubación de 5 min con

xilol precalentado a 58°C.

3.-Optimización

Dual colour CISH

• Peroxidasa visualizada con tetramethyl benzidine (verde)

• Fosfatasa alcalina visualizada con New Fuchsin (rojo).

4.- Formas especiales de CISH

Enzymatic Metallography:


GOLDFISH


Las mismas que FISH

4.- Aplicaciones

Caso1

• Paciente varón de 67

años con nódulo latero-

cervical de 2-3 cm.

• Se realiza PAAF y

posterior biopsia. (PAAF: CD30+, CD15-,

linfoma anaplásico?)

6.- Ejemplos prácticos

CD30

Diagnóstico: Linfoma de Hodgkin

clásico, tipo celularidad mixta


Epstein Barr Virus

• 90% de la población

• Lesiones benignas: MI, leucoplasia vellosa oral..

• Cáncer con EBV en más de 95% de los casos: Linfoma Burkitt, Linfoma post-transplante, y carcinoma nasofaríngeo….

• Enfermedad de Hodgkin (CM 70%, DL50%, EN 20%, PL<5%). Linfoma No Hodgkin <5%.

Ver qué células expresan EBV!!

Cuidado con PCR +!!!


Caso 2

• Varón, 45 años.

• Antecedentes de anemia hemolítica

por anticuerpos calientes (2003) y

linfoma No Hodgkin B MALT pulmonar

y ganglionar (2004)

• Biopsia de ganglio hilio hepático de 2

cm. y cilindros hepáticos


KAPPA LAMBDA

LINFOMA B DIFUSO DE

CELULAS GRANDES CON

AFECTACION GANGLIONAR

Y HEPATICA


Caso 3

• Varón 65 años con

varias masas renales.

• Se realiza impronta y

biopsias.

LSI D7S486 Orange/CEP 7 green


Hereditary papillary renal

carcinoma (1994)

• 6ª década, bilateral, multifocal : carcinoma

papilar tipo 1.

• c-Met oncogene en cromosoma 7

(tyrosine kinase domain), tanto en formas

hereditarias como un subgrupo de

esporádicos.

• Trisomy 7 (FISH), asociada con

mal pronóstico


Amplificación de Her2/neu

• A.- Amplificación (>5-6 copias)

• B.- Normal

• C.- Baja amplificación (en recuadro sonda

centromérica)


http://jcp.bmj.com/content/vol60/issue9/images/large/cp43356.f1.jpeg

• HER2 testing y terapia con trastuzumab:

– “A recent cost-effectiveness analysis concluded that it is more cost-

effective to use FISH alone or as confirmation of all IHC 2+ and 3+ results, rather than the current

system”.

– Dual-colour FISH “gold standard” para HER2 análisis; CISH es tan sensible y específica. Concordancia (93.8–96%).

– HER2:CEP17 ratio >2 se considera amplificado por FISH; pero por CISH (Zymed) necesita score >5-6 HER2.

¿Hay consenso con Her2/neu?


FISH vs CISH: “Chromogenic in situ hybridisation for the

assessment of HER2 status in breast cancer: an international

validation ring study”

• Marc van de Vijver1 , M Bilous2 ,

W Hanna3 , M Hofmann4 , P

Kristel1 , F P-Llorca5 and J

Rüschoff4

• 1Netherlands Cancer Institute,

Amsterdam

• 2Westmead Hospital, New South

Wales, Australia

3Sunnybrook & Women's College,

Toronto, Canada

4Klinikum Kassel, Kassel, Germany

5Departement de Pathology,

Clermont-Ferrand, France

van de Vijver et al. Breast Cancer Research 2007


http://breast-cancer-research.com/registration/technical.asp?process=default&msg=ce







http://breast-cancer-research.com/content/9/5/R68/figure/F1?highres=y

Resultados comparación

• 211 invasive breast carcinoma cases were tested.

– HER2/CEP17 ratio >4.0 by FISH, 73/76 (96%) positive (≥ 6) by 'outside CISH'.

– FISH-negative cases (HER2/CEP17 <2.0), 94/ 100 cases (94%) no amplification by CISH

(score ≤ 5), and only 3 cases were positive by CISH; in the three remaining cases, no CISH

result could be obtained.

– Low-level amplification using FISH (HER2/CEP17 2.0–4.0), 20/ 35 had CISH gene

amplification.

• Inter-laboratory concordance was also very high:

– 95% for normal HER2 copy number (1–5 copies); and 92% for cases with HER2 copy

numbers ≥ 6.

– CISH intra-laboratory concordance with IHC: 92% for IHC-negative cases and 91% for IHC

3+ cases. Among IHC 2+ cases, CISH was 100% concordant with samples showing high

amplification by FISH, and 94% concordant with FISH-negative samples.

Conclusion:

“These results show that CISH inter- and intra-laboratory

concordance to FISH and IHC is very high, even in

equivocal IHC 2+ cases. Therefore, we conclude that CISH

is a methodology that is a viable alternative to FISH in the

HER2 testing algorithm”.


Conclusiones

• CISH como “puente” entre la Hibridación “in situ”

y la inmunohistoquímica.

• Similares aplicaciones que FISH con mejor

correlación morfológica. EBERS, CMV, KAPPA Y LAMBDA,

HER2/NEU…

• Gran correlación de sensibilidad y especificidad

entre FISH y CISH.

• Posibilidad de transformar FISH en CISH.

• Campo escasamente desarrollado.

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