cinétique enzymatique equation de michaelis et menten
TRANSCRIPT
Cinétique enzymatique
Equation de Michaelis et Menten
Les trois phases d’une réaction enzymatique:
• ≤ msec: « phase initiale »
(formation du complexe ES)
• quelques minutes (heures):
« état stationnaire » ( [ES]
constant, vitesse constante )
• Après quelques heures:
« approche de l’équilibre »
(disparition progressive du
substrat, vitesse diminue)
Incubation longue (généralement quelques heures):
)(
][
t
P
Etat Stationnaire:
Incubation moyenne (généralement quelques minutes):
Pro
duit
Temps
On parle d’état stationnaire tant que la vitesse de la réaction reste constante.
[S]=1 mM
[S]=3 mM
[S]=10 mM
[S]=30 mM
A l’état stationnaire: lorsque la concentration du substrat, [S], augmente, la vitesse initiale de la réaction, v, augmente
hyperboliquement.
0 50 1000
50
100
[Substrat]
vit
esse
Interprétation???
Observations:
• Quelque soit la concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [E].
• A faible concentration de S, la vitesse est proportionnelle à [S] . La loi d’action des masses nous apprend que si v=[E][S] c’est que la réaction passe par une étape:
E+S-- >P
• A forte concentration de S, la vitesse ne dépend plus de [S] mais reste proportionnelle à E
Hypothèse:
• La vitesse est en fait proportionnelle à [ES] ?
[E]+[S] [ES] [E]+[P]
E S ES E Pk cat
k 1
k 1
( )
d Pd t
k ES vcat
( )( )
[ ]
La loi d’action des masses prédit que:
Tant que [ES] reste constant, le produit apparaît à une vitesse constante: on parle alors “d’état stationnaire”
Méthode traditionnelle de calcul:
• On pose: 1. état stationnaire,
• 2. Conservation des masses:
( )[ ][ ] [ ] [ ]
( )
( )[ ]
( )
cat
cat
d ESk E S k ES k ES
d t
d Pk ES v
d t
-= - - =
= =
1 1 0
[ ] [ ] [ ]totE ES E+ =
]][[)][]([ 111 SEkkkSkES totcat
0][][])[]]([[)(
)(11 ESkESkESESk
td
ESdcattot
( )[ ][ ] [ ] [ ]
( ) cat
d ESk S E k ES k ES
d t -= - - =1 1 0
0][][]][[]][[ 111 ESkESkSESkSEk cattot
1
1
1
1
k
k
kkSk
SEkES
cat
tot
)][(
]][[][
11
1
11][
]][[][
kkkS
SEES
cat
tot
11][
]][[][
kkkS
SEkESkv
cat
totcatcat
1][
][
][
][ maxmax
M
M
M KS
KSV
KS
SV
[ ]catv k ES=
Méthode alternative:
[ ] [ ] [ ]{ }
[ ][ ] [ ]{ }max
totE E ES
SV
Ev
E
ES
= +
+=
[ ][ ]
[ ] cat tot
tot
k EE
ESv=
[ ][ ]
max
tot
ES
Ev
V=
[ ] [ ]Quelles sont les valeurs
relatives de et ?E ES
[ ]max
lorsque tout l'enzyme est occupé:
cat totV k E=
≤1
max
max
max
devient:
1
M
M
M
M
v VE
E S Kv V
E E S K
S
ES
ES
Kv V
S K
A l'état stationnaire,
donc
M
M
ES
E
S
S
EK
E S K
A l'équilibre: D
E SK
ES
(mais l'équilibre n'est pas atteint:
à l'état stationnaire, ES est consommé pour donner E+P!)
[ ][ ][ ] [ ] [ ]
[ ][ ] ( )[ ]
[ ][ ][ ]
( )
Reste à définir . A l'état stationnaire:M
M
k
k
k
k k
k
K
E S ES E P
d ESE S ES ES
dt
E S ES
k
k
k
E S
k
Kk
S
k
E
-
-
-
-
¾¾®+ ¾¾® +¬¾¾
= =
+
=+
- -
=
=
2
1
1
1 2
1 2
1
1
1
2
1
0
MKS
SVv
max
Représentation de Michaelis-Menten
Une autre façon de voir les choses:
Traditionnellement, on étudie les enzymes purs,
agissant sur des substrats purs, dans un tube à
essai.
On s’intéresse de plus en plus aux enzymes tels
qu’ils fonctionnent en cascade, « in vivo », et
non pas isolés dans un tube à essai.
On parle alors de « flux enzymatique »:
Le moindre étranglement entre deux « bassins » peut provoquer le débordementdes bassins en amont, l’interruption du flux en aval… Quelles sont les conséquences d’une modification de KM, d’une diminution de Vmax?
Imaginons la voie métabolique comme unCanal dont le flux est régulé par une série d’écluses:
Forme de l’ouverture de l’écluse?
Nous allons calculer la forme de l’écluse, tel que le flux de l’eau s’écoulant du bassin précédent se comporte comme le « flux enzymatique » à travers une réaction Michaelienne:
[ ]( )
[ ]( )
[ ]( )[ ]
La surface sous une fonction est donnée par son intégrale.
Si " " représente la forme de l' "écluse" qui permet
l'écoulement:
=
donc =
fct S
fct S v
vfct S
Sdd
ò
[ ][ ]
[ ][ ]( ) [ ]( )
[ ]( )
[ ]( ) [ ]( ) [ ]
[ ]( )
[ ]( )
[ ]( )
M
M
M
M
M
M
M
donc v
v
K S
K S
K S
K S
V
K S
K
K
S
V V S
V V V S
S
S
vS
VvS
dd
dd
dd
=
-=
-
+
+
+
=
=
+
+
+
2
max
max max
max max max
ma
2
2x
: si
1
[ ][ ]M
V SK S De o
mn
Num+
max est une équation de la forme
Num Num Denom DenomDenom
Numm
dDeno
æ ö -÷ç =÷ç ÷è ø 2
' '
u u v uvdv v
-æö÷ç =÷çè ø 2
' '
0 2 4 60
50
100
[Substrate] / KM
v (in
% o
f V
max
)
[Substrate] / KM
d (v
) /
d ([
S])
in %
of
(Vm
ax /
KM)
Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
[ ]
La surface de l'ouverture représente la vitesse
de la réaction.
L'orifice devrait être plus large à la base puisque
la vitesse augmente (proportionnellement)
plus lorsque S est faible.
L'orifice devrai
[ ]max
t se "resserer" vers le haut:
lorsque S augmente, .v V®
• Surface = vitesse – Plus large en bas
(v ↑ si [S]↑)
– Étroit en haut (vVmax)
– Largeur maximale: en [S]0, dv/dSVmax/KM
– Largeur minimale:– en [S]∞, dv/dS0
Représentation de la “porte d’écluse”
[Substrate] / KM
d (v
) /
d ([
S])
in %
of
(Vm
ax /
KM)
“Enzyme lock” gate
[Sub
stra
te ]
Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
[ ]
La surface de l'ouverture représente la vitesse
de la réaction.
L'orifice devrait être plus large à la base puisque
la vitesse augmente (proportionnellement)
plus lorsque S est faible.
L'orifice devrai
[ ]max
t se "resserer" vers le haut:
lorsque S augmente, .v V®
• Surface = vitesse – Plus large en bas
(v ↑ si [S]↑)
– Étroit en haut (vVmax)
– Largeur maximale: en [S]0, dv/dSVmax/KM
– Largeur minimale:– en [S]∞, dv/dS0
Représentons chaque enzyme par une écluse, permettant l’écoulement de l’eau:
(Vmax/KM)
[S]↑
[ ]
v
S
**************
a2
m x
Surface sous la courbe = Flux
si courbe : M
M
v
S
V K
K S
[ ] ( )MM
vS
S KV
Kdd
= = maxen [ 4
] ,
maxen [ ] 0, ;
M
v
S
VS
K
Réactions en présence d’un mélange de plusieurs substrats
possibles:
Spécificité et KS
0 200 400 600 800 10000
200
400
600
800
1000
Vmax 100, Km 10, Ks 10Vmax 1000, Km 1000, Ks 1
Substrat
Vite
sse
S1 et S2 séparés:
P1
P2
Spécificité:
Supposons une enzyme capable d’agir sur deux substrats, S1 et S2: comment savoir quel est sur quel substrat elle agira « de préférence » si ils sont présents simultanément dans la cellule ou mélange réactionnel étudié?
1 enzyme, 2 substrats mélangés:
S1 ES1 + P1 E + E S2 ES2 + P2
([
?
]
]
?
)
([
?
)
ca
c
t
at
v k E
v k ES
v
S
v
=
=
=
1 11
1
2 22
2
KS:mesure de la spécificité d’une enzyme
KS=kcat/KM permet de quantifier la vitesse relative de la réaction d’intérêt lorsque l’enzyme est en présence de plusieurs substrats (« spécificité):
[ ]
[ ]Alors,
cat
SM
cat S
M
k E S
kv K SE SK
K SKvé ù é ùê úë û
é ùé ù ê úë=
û
ê ú
ê
=
ú
ë
ë û
û22 2 2
22
11
1 111
[ ][ ]et: cat cat S
M
E Sv k ES k K E S
K
é ùê úë ûé ù é ù= = =ê ú ê úë û ë û
2
2 2 2 2 2 22
[ ][ ]
Si cat cat S
M
E Sv k ES k K E S
K
é ùê úë ûé ù é ù= = =ê ú ê úë û ë û
1
1 1 1 1 1 11
1 1
2 2
v Sv S[
est constant si reste cons]
]
[tant!
« KS » et vitesse d’association E●S
[ ][ ]
[ ] [ ][ ] [ ][ ] [ ] [ ]
[ ][ ]
M
cattot S tot
M M
ass
ass S
V Sv
K S
V kv S E S K E S E E
K K
v k E S
k K
®
= ®+
= = » »
=
max
max
vitesse de réaction: en [S] 0,
( )
vitesse d'association E-S:
Donc, la constante apparente d'association, , est équivalente à
catass S
M
kk K
K= =
Autre signification de KS:
1
1
1 1 1
1
1 11
1
1
cat
cat c
cat cat catS
M cat cat
k kc
at
cat cat
at
S
k k kkK
K k k k k k
k k E S ES E P
k kK k
k
k
k kk k
- -
-
= = =+ +
+ ¾¾® ¾¾¾® +
= » =+
° °
-
( ) / ( )
enzyme "parfait" ( <<< ) :
( ) ( )
mesure le nombre de rencontres E-S :
à T normale (20-37 C), " 9 1 11
5 7 1 11
1 11
10
10 10
S
k M
k à M
K k M
- -
- -
- -
£
»
£ £ 9
petits substrats": sec
"Grands substrats" (protéines) : habituellement, sec
est donc toujours 10 sec
Limite maximum de KS ?
Modification de l’équilibre?
[ ][ ]
Les enzymes ne modifient pas l'équilibre entre [S] libre et [P] libre.
On peut donc écrire: à l'équilibre,
et eq
PK v v
S= =
r s
Equilibre: relations de Briggs-Haldane
[ ][ ]
Supposons la réaction
l'enzyme catalyse la transformation de A B,
et catalyse également la réaction inverse B A
Il se trouve devant deux "substrats": A et B; donc
A l'équilibre,
ASBS
A B
K Avv K B
v
®
®
=
ƒ
rs
r [ ][ ]
[ ][ ]
donc: ASBS
AS
eqBS
K Av
K B
B KK
A K
= =
= =
1s
L’équilibre ne peut être modifié par les enzymes.
La catalyse est donc toujours « aussi efficace » dans un sens que dans
l’autre?
Réactions à « sens unique »:
max maxPour que ,
alors que :
il suffit que
PS
eq SS
S PM M
V V
KK
K
K K
>>
= »
>>
1
uuuur suuuu
Exemple: SAM synthase
2 + puis
Le produit est inhibiteur:
lorsque SAM 0.03mM : voir graph
i iMet ATP H O PP P SAM
max
max
max max
,
à l'équilibre: 1
Pour que 10
Il faut que 10
M
M
SSSP PS
Met ATP SAMM M
K
V KKK
K V K
V V
K K
**************
<
*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<*<0 200 400 600 800 1000
0
5000
1 104
[ATP] (µM)
vite
sse
0 200 400 600 800 10000
5000
1 104
[Met] (µM)
vite
sse
Enzyme « idéale »?
k1 grand, k-1 petit, kcat grand :
Spécificité, efficacité?
Comment varie la vitesse de la réaction lorsque x augmente de …%?
Δ[S]
v
Δv
[S]
?
][][
SS
vv
Si [S] grand, v augmente moins vite que [S]. Pour exprimer cette relation: écrire
F Num x Denom xF xx Num Denomx
d d d d dd
æ ö÷ç= - ÷ç ÷çè ø
F x F NumF Fx F x Denomx
d dd d
= = =? avec
2
NumNum Denom NumDenomDenom
x Denom
d
d
æ öæ ö÷÷ç ç ÷÷ç ç ÷ç ÷ æ ö-è øç ÷ ÷ç ç=÷ ÷ç ç÷ ÷çè øç ÷ç ÷÷ç ÷çè ø
' '
2
Num DenomNumx F Denom x xxF x Num Denom Denom
d dd d dd
æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷ç ÷÷çè ø
[ ][ ]
[ ][ ]
[ ][ ]
[ ][ ]
( )
( / )( / )
/ /
( )
( )
cat
cat
cat
cat cat
cat
kk Sv
k k k S
N Dv N Dvk kk k
N k D kk
N D
k S Sk
kk S k k k S
k S
k k k S
dd
d d
d d d d
-
-
-
=+ +
=
æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø
æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø
= -+ +
1
1 1
1 1
1 1
1 11
11 1 1
1
1 1
1
Si k1 augmente de …%?
[ ]( )
( )cat
cat
v k kvk k k k Sk
d
d-
-
+=
+ +1
1 1 1
1
Evolution de la vitesse quand k1 augmente:
Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec k1,
d’autant plus que k1 petit.
0 50 1001
0
1
1
1k
kv
v
k1
[ ][ ]
[ ]
[ ]
( )
( / )( / )
/ /
( )
cat
cat
cat
cat
kk Sv
k k k S
N Dv N Dvk k
k k
N k D kk
N D
kk k k S
kk k k S
dd
d d
d d d d
-
- -
- -
- --
--
-
-
=+ +
=
æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø
æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø
=-+ +
1
1 1
1 1
1 1
1 11
11 1
1
1 1
10
Conclusion: la vitesse de la réaction diminue lorsque k-1 augmente, d’autant plus que k-1 grand.
lorsque k-1 augmente de …%?
vv
kk
d
d -
-
1
1
0 50 1001
0
1
[k-1]
[ ][ ]
[ ][ ] [ ]
[ ][ ]
[ ]
( )
( / )( / )
/ /
( )
( ) ( )
cat
cat
cat cat
cat cat
cat catcat
catcat cat
cat
cat cat
kk Sv
k k k S
N Dv N Dvk k
k k
N k D kk
N D
k Sk
kk S k k k S
k k Skk k k S k k k S
dd
d d
d d d d
-
-
-
- -
=+ +
=
æ ö÷ç= - ÷ç ÷÷çè ø
æ ö÷ç ÷ç= - ÷ç ÷÷ç + +è ø
+= - =
+ + + +
1
1 1
1
1 1 1
1 1
1 1 1 1
1
1
Conclusion: la vitesse de la réaction augmente avec kcat,
d’autant plus que kcatest petit.
lorsque kcat augmente de …%?
cat
catk
kv
v
0 50 1001
0
1
[kcat]
Pour résumer:
• La réaction sera d’autant plus rapide (à 1 concentration de substrat donnée) que:– k1, (reconnaissance enzyme-substrat), est
grand;
– kcat, (transformation de ES en E+P) est grand,
– k-1, (dissociation du substrat avant transformation), est faible.
Comment augmenter la spécificité de l’enzyme?
1. Vaut-il mieux que le ‘bon’ substrat ait un grand KS? Que le ‘mauvais’ substrat ait un faible KS? Ou les deux?
2. Comment faire? (Comment varie KS en fonction de k1, k-1 et kcat?)
Suffit-il d’augmenter KS pour le « bon » substrat?
Une enzyme sera considérée comme « spécifique » si elle agit sur un seul substrat, même en présence de nombreux autres composés très semblables.
Pour atteindre ce but, il ne suffit pas que la valeur du KS du « bon » substrat soit élevée:
Il faut que: [ ] [ ] pour tous les substrats
alternatifs présents dans le milieu réactionnel!
S SK S K S>>1 1 2 2
Comment varie KS lorsque k1 augmente de …%?
1
0
11
1
1
1
1
1
catcat
catS
S
cat
cat
M
catS
kkkk
kk
kk
KK
kk
kk
K
kK
La constante de spécificité augmente proportionnellement à k1.
k1 reflète le nombre de collisions « productives » entre enzyme et substrat: varie peu d’un composé à l’autre (sauf si ‘guidage’ par interactions ioniques)
S
S
cat
cat
KK
kk
k1
lorsque k-1 augmente de …%?
1
1
11 1 1
1
1
1
0 1
cat catS
M cat
S
S
cat cat
cat
k k kK
K k k
KK
kk k k k k
k
k
k k
KS diminue lorsque k-1 augmente, d’autant plus que k-1 est
grand.les substrats qui dissocient lentement du site actif avant transformation seront transformés de préférence. Importance d’interactions à courte distance.
0 50 1001
0
1
k-1 ou kcat
1
1
S
S
KK
kk
1
1
1
1 1
1
1
1
1
1
cat catS
M cat
S
Scat
cat cat cat
cat
cat
cat
cat
k k kK
K k k
KK k
kk k k k k
k
k
k k
k
k k
0 50 100
1
0
1
S
S
cat
cat
KK
kk
kcatKS augmente avec kcat, surtout si kcat faible
lorsque kcat augmente de …%?
Résumé: variation de KS
• KS est toujours proportionnel à k1.
• KS diminue si k-1 augmente, surtout si k-1 grand.
• KS augmente avec kcat surtout si kcat petit
Spécificité ou efficacité? En résumé:
•Si l’enzyme peut utiliser deux (ou plusieurs) substrats: pour
qu’il soit spécifique, il faut que KS = kcat/KM diffère le plus
possible d’un substrat à l’autre.
•La vitesse de la réaction et KS augmentent lorsque k1 augmente,
lorsque kcataugmente et lorsque k-1 diminue : le guidage
électronique et la rétention du substrat dans le site actif peuvent
augmenter à la fois la vitesse de réaction et sa spécificité.
Analyse cinétique: linéarisation
• Lineweaver-Burke,• Hanes ou Woolf,• Eadie - Hofstee,• Linéaire direct
Avantage: statistiquement correct (y varie, x constant)Inconvénient: non linéaire! Analyse difficile.
Michaelis Menten:
Double réciproque : Lineweaver-Burk (1934)
SV
K
Vv
m 111
maxmax
Très populaire: diminue souvent l’impression de dispersion des résultats.Problème: erreurs amplifiées à petit substrat donc grand 1/S (à droite du graphe).
Hanes, ou Woolf
[ ][ ]
[ ]
[ ][ ]
max max
max max
M
M
KS S
v V S V
S KS
v V V
æ öæö ÷ç÷ç ÷ç= +÷ ÷ç ç÷ç ÷è ø ÷çè ø
= +
1 1
1
Avantage: les erreurs sont « normalisées » et ≈ constantes.Inconvénient: toute erreur sur KM est reportée sur Vmax.
Eadie-Hofstee:
v
v/[S]
Vmax
Vmax/KM
Pente: -KM
[ ]max M
vv V K
S= -
Rare. Les erreurs sont « obliques », et amplifiées à haut [S]!Avantage: très sensible à toute déviation de «Michaelis-Menten ».
Graphique direct linéaire(Eisenthal et Cornish-Bowden)
Principe: Chaque paire de valeurs v et [S] est
compatible avec une infinité de valeurs de KM
et Vmax, distribués sur une droite d’équation:
équivalente à: [ ]
[ ]
max
max avec ,
en
en ;
M
M
vV v K
S
y a bx y V x K
ay x S
b
x y a v
= +
= + = =
= =- =-
= = =
0
0
Application: tracer chacune de ces droites: leur intersection correspond à la seule valeur de KM et Vmax qui soit compatible avec tous les résultats.
v1v2
v3
S1 S2 S3
[S]
v
KM
Vmax
En réalité, pas intersection « unique » (erreurs exp.). Il faut chercher le centre de gravité de toutes les intersections…
Pas pour publication, (pas « joli »), mais pratique pour estimer Vmax, KM sur un coin de table de labo…
v
[S]
v1v2
v3
S1 S2 S3
v4
S4
Constantes:
Définitions et dimensions
KM
( )
APPROXIMATION GROSSIERE: l'équilibre n'est pas atteint! L'affinité
du substrat est surévaluée:
et
Donc:
D M
D M
kkK K
k k
K K
k--+
= =1
211
1
=
Parfois, pas toujours : inutile pour identifier le « vrai » substrat!
"La constante est une mesure de l'affinité (ou plutôt de la constante
de dissociation) de l'enzyme pour son substrat." : Vrai ou faux ?
MK
[ ]" " Vrai ou faux?MK S»
• KM = (k-1 + kcat )/ k1 :
– k1 : M-1sec-1
– k-1 : sec-1
– kcat : sec-1
• KM : (sec-1)/(M-1sec-1) = 1/M-1 = M
KM est une concentration (M ou mol/l)
Dimensions:
Vmax
• La vitesse maximum ou Vmax est une limite théorique,
jamais atteinte en pratique! (Il est impossible d’obtenir une concentration infinie en substrat!)
• On peut néanmoins utiliser cette limite pour estimer le nombre de molécules de substrat transformées par le complexe enzyme substrat en une seconde, minute, etc.
• Ce « turnover number » (débit) donne une idée de l’efficacité de la catalyse, surtout quand on le compare avec la réaction non catalysée…
v et Vmax : mol/sec ou mol/min
Quantité d’enzyme: vitesse, exprimée en « Unités » (µmol/min), ou en « katals » (mol/sec)
Quantité d’enzyme : dimensions
Quantité d’enzyme:Unités courantes
• Unité (U): quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 µmole de substrat
par minute dans les conditions standard (généralement à 25°C, dans les conditions
optimales de pH, et de force ionique, en présence des cofacteurs et coenzymes
nécessaires en quantité suffisante…).
Typiquement, de l’ordre de 0.1 – 100 μg d’enzyme pur, ou de l’ordre de 0.1 - 100 mg
pour les préparations industrielles d’enzyme.
Remarque: les conditions de mesure de l’activité doivent être clairement définies
par le fournisseur!
Unités « CGS » (internationales)
• katal (kat), quantité d’enzyme catalysant la transformation de 1 mole de substrat
par seconde dans les conditions standard.
(1 kat = 60 000 000 U ou quelques kilos d’enzyme pur; 60 U = 1µkat).
• (Problème: une mole = 180 g de glucose, quelques kilos de protéine…!)
KS
( )
La constante est une mesure de la constante apparente de
vitesse d'association du complexe enzyme-substrat:
S
catS
cat
K
kkK k
k k-
= £+1
11
• KS = k1kcat / (k-1 + kcat ) :
– k1 : M-1sec-1
– k-1 : sec-1
– kcat : sec-1
• KS : (M-1sec-1) (sec-1) / (sec-1) = M-1 sec-1
KS a les dimensions d’une constante de
vitesse d’association
Dimensions:
Un flux minimum peut être indispensable pour permettre la survie:
• Plutôt que de calculer la vitesse imposée par la [S], on devrait calculer la [S] nécessaire pour maintenir une certaine vitesse.
Survie impossible
Vitesse deproduction
[Substrat] nécessaire
1
][
:
][1
][][
][][
][
][
max
max
max
max
max
v
V
KS
donc
Sv
VK
SSv
VK
Sv
VSK
SK
SVv
M
M
M
M
M
Nécessité d’autres modèles:
• Enzymes allostériques: – Enzymes régulées par des composés ne ressemblant ni au
substrat, ni au produit de la réactionExemples: inhibition de la phosphofructokinase par l’ATP, …
• Enzymes coopératives:– Courbe cinétique de forme « sigmoïde » (vitesse de réaction
proportionnelle à [S]n lorsque [S] est faible)
Remarque: la majorité des enzymes coopératives sont également régulées allostériquement, et beaucoup d’enzymes allostériques sont également coopératives vis-à-vis d’au moins un substrat!
Exemple d’enzyme coopérative : Aspartate transcarbamoylase bactérienne
0 20 400
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
0 5 100
0.5
1
[SUBSTRAT] (mM)
VIT
ES
SE
ZOOM:
+ATP
+CTP
Controle +ATP
+CTP
Controle
Début de la synthèse des bases puriques: (d)CTP, UTP, dTTP; Inhibé lorsque les purines sont disponibles;activé lorsque les pyrimidines ( (d)ATP, (d)GTP ) sont disponibles
Aspartate Transcarbamoylase bactérienne
INACTIVE (T) ACTIVE (R)
Vue du haut: C
C
C
C
CR
R
RR
Vue de profil:
R
C
C
Forme de la courbe: justification?
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Conformation RConformation TEnzyme allostérique (2sites)
L’enzyme coopérative existe en 2 conformations: R et T. A faibles [S], T prédomine; les courbes v et T sont confondues à très petit [S]. Lorsque [S] augmente, le % R augmente: la vitesse se rapproche de la courbe R
0 0.2 0.4 0.6 0.8 10
0.5
1
[S]
[S]
vitesse
vitesse
T
R
T
R
AMP
Sucres (glycogène)
Enzyme allostérique de type « V »:la glycogène phosphorylase
Ser-PO4
Sites actifs
Enzyme Michaelienne versus coopérative: apparement pas grande différence au niveau des vitesses?
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)
Mais…pas du tout le même effet sur le « Flux » à travers la voie métabolique:
{orifice large à la base, de plus en plus étroit car la vitesse augmente moins que [S] à toutes [S]}
{orifice étroit à la base, s’élargit (la vitesse augmente plus que [S] lorsque [S] est très faible), puis redevient très étroit (la vitesse augmente moins que [S] lorsque [S] est grand)}
0 0.1 0.2 0.30
0.1
0.2
0.3
Enzyme "Michaelienne"Enzyme allostérique (2 sites)
[Substrat]
vite
sse
Pourquoi? Zoom sur les petites concentrations de Substrat:
Enzyme Michaelienne:v varie moins que S,pente max en [S]0
Enzyme coopérative:v varie plus que S
pente ≈ 0 en [S]0
Enzymes coopératives:
Modèle de Monod, Jacob et Changeux
Modèle de Koshland, Nemethy et Filmer
Monod, Jacob et Changeux:TR
SS
S S
SS
S S
nn
nn
n
n
T
R
cL
cLY
R
TL
K
Sc
K
S Si
)1()1(
)1()1( 11
Koshland, Nemethy et Filmer:
S
S
SS
S S
Equation encore plus complexe
(2 complexes ES2 différents)
La réalité: un mélange de ces deux modèles?
SS S
SS S
SS S
SS S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R TTTTT
Régulation d’une enzyme coopérative par des régulateurs allostériques:
0 2 4 6 8 100
0.5
1
Enzyme allostérique, 2 sites (T/R = 100)Enzyme allostérique activé (T/R = 10)Enzyme allostérique inhibé (T/R = 1000)
Inhibiteur stabilisant T
Activateur, stabilisant R
Régulation d’une enzyme coopérative et allostérique:
Inhibiteur stabilisant la conformation « T »