CH 210

Chromatography

By Supaporn Sangsrichan

2

ประวต

1906 Michael Tswett แยกสารทสในพชดวยผงชอลค และวตถอนๆ เชน แปง น าตาล polysacharides, sucrose, Indulin

https://en.wikipedia.org/wiki/Mikhail_Tsvet

1930s Lederer และกลมวจยอนๆ ไดท าการวเคราะห carotenoids, xanthophylls

1937 มหนงสอ Chromatography เลมแรก เขยนโดย ZechMeister

มการพฒนา Paper

& column chromatography

3

1960s พฒนาการใชงานของเทคนคโครมาโทกราฟ ในดาน เคม ชวเคม การแพทย เภสช ฯลฯ

1969 มเครอง HPLC ขายเปนครงแรก

มการพฒนาปม ชนดของอนภาคบรรจ และตวตรวจวดชนดตางๆ ท าให เทคนคนเปนทนยมใชงานไดกวางขวางกวา เทคนค GC

Tiselius (Sweden) ไดรบรางวล Nobel Prize จากงานดาน Electrophoresis

1940s Ion exchange partition and column chro. และ เรมตนเทคนค gas chromatography

1950s มผลงานของ gas adsorption chr. และ gas liquid Chr. (partition)

partitioning of chromatography โดย Martin and Syngeแหง the Wool Industries Research Association, Leeds, England ท าใหไดรบรางวล Nobel Prize สาขา Chemistry ในป 1952

4

ความหมายของโครมาโทกราฟ

Chromatography = Chroma + Graphein

ส การเขยน

chromatography ตามค าจ ากดความของ IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)

A method used primarily for the separation of

components of a sample, in which the

components are distributed between two

phases, one of which is stationary phase, while

the other moves in a definite direction

5

ความหมายของศพททางโครมาโทกราฟ

Stationary phase = เฟสคงท

Mobile phase = เฟสเคลอนท

Elution = ขบวนการชะ พาสารออกจากคอลมน

Eluate = สารทถกชะ พาสารออกจากคอลมน

Eluent = สารทชะ พาสารออกจากคอลมน

Solid support = อนภาคของแขงทชวยยดเฟสคงททเปนของเหลว

Packings = อนภาคของแขงทบรรจในคอลมน

Retention time = เวลาทสารใชในคอลมน

6

การแบงชนดของโครมาโทกราฟ

chromatography

7Figure 1 Family tree of chromatographic methods.

Chromatography

Mobile

phase

gas Super

critical fluidLiquid

Stationary

phaseSolid

(GSC)

Liquid

(GLC)Solid

(SFC)

Liquid

(SFC)

Solid

(LC)Liquid

(LLC)

Micelles

(MEKC)

Mechanism AdsorptionSize exclusion

Adsorptionpartition

Adsorption Adsorptionpartition

Adsorption

(LSC)

Size

Exclusion

(LSC)

Ion

Exchange

(IEC)

Affinity

(AC)

Bonded

phase

(BPC)

8

Figure 2 Applications of bonded phases in LC.

Bonded

phase

(BPC)

Liquid-Solid(LSC)

Size exclusion(SEC)

Reversed Phase(RPC)

Ion exchange(IEC)

Capillary Electrochromatography

(CEC)

Ion Suppression(ISC)

Ion Pair(IPC)

MetalComplexation

(MCC)

Micelles(LSC)

HydrophobicInteraction

(HIC)

9

ทฤษฎโครมาโทกราฟ(Chromatographic Theory)

โครมาโทกราฟ เปนวธแยกองคประกอบของสารผสมโดยอาศยความแตกตางของการกระจายขององคประกอบระหวาง 2 วฏภาค คอ วฏภาคคงท (stationary phase )และวฏภาคเคลอนท (mobile phase )

Distribution Coefficient (Kd), Kd = คาคงทของการกระจายตว

โมเลกลของสารทถกแยกจะกระจายตวในระหวางเฟส 2 เฟส การกระจายตวนข นกบคา สมประสทธของการกระจายตว (Kd)

เฟสคงท เฟสเคลอนทKd

10

Liquid Chromatography

1. Paper chromatography

2. Thin layer chromatography

3. Open column chromatography

1. Chromatography

Liquid chromatography

Gas Chromatography

11

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ

1. Liquid liquid chromatography (LLC)(partition chromatography)

2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)

3. Ion-exchange chromatography

4. Exclusion chromatography

12

กข

ค

โครมาโทกราฟแบบ (ก) กระดาษ (ข) คอลมน (ค) โครมาโทแกรม

13

Paper Chromatograpgy

–แบงตามสถานะของเฟสทงสองเปนโครมาโท

กราฟแบบ Liquid-liquid chromatography

–แบงตามกลไกการแยกคอ partition chromatography

•แบงไดอก 2 ชนด

–Normal phase chromatography

–Reversed phase chromatography

14

Normal phase chromatography

Stationary phase มความมขวมากกวา mobile phase

Stationary phase : น า ยดเกาะบนเยอกระดาษ (6-12%)

Mobile phase: Solvent ทม polarity < น า

Reversed phase chromatography

Stationary phase มความมขวนอยกวา mobile phase

Stationary phase :น ากระดาษมาอบไลน าแลวชบดวยตวท าละลายอนๆ

Mobile phase: Solvent ทม polarity สงกวา st.ph.

http://www.intechopen.com/books/liquid-gaseous-and-solid-biofuels-conversion-techniques/hydrotreating-catalytic-processes-for-oxygen-removal-in-the-upgrading-of-bio-oils-and-bio-chemicals

วธท า

1. การ spot สาร น ากระดาษโครมาโทกราฟมาวดระยะหางจากขอบประมาณ 1.5-2.0 ซม. หยดสารละลายเปนจดเลกๆ และเขมขน

2. การ Developing น ากระดาษกรอง หรอ แผนTLC ทมสาร

อย น ามาใสลงในโถ Chamber ทมตวอลททอ มตวของไอสารอย

– Ascending development

– Descending development

• 1-dimension

• 2-dimension 15

ฝาปดภาชนะ

กระดาษ

ตวท าละลายทเคลอนท

ตวท าละลาย

16

16

2-dimension PC, TLC

หมน 90 °S1

S2

S1

17

3 Detection หลงจากการระเหยตวท าละลายใหแหงแลว สามารถตรวจวดต าแหนงของสารทถกแยกโดย

ดวยตาเปลา กรณทสารมส

ฉายดวยรงส UV

ฉายดวยรงส IR

ฉายดวยรงส Fluorescent เกดสารเรองแสงขน

ตรวจหาสาร Radio active

ท าปฏกรยากบสารอนๆทใหส

อบดวยไอของไอโอดน

พน ninhydrin เพอตรวจหากรด amino

สาร AgNO3 เพอตรวจหา sugar

4 น าคาทไดมาหาคา Rf

สารทเกดการแยกจะมคา Kd ทแตกตางกนสงผลให ความสามารถในการเคลอนทตางกน คา Rf ตางกนดวย

Kd= Cs/Cm

18

การท าคณภาพวเคราะห

โดยการเปรยบเทยบคา Rf หรอ คา (Rf)r ของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน

(Rf)r : Relative retardation factor คาการหนวงสมพทธ

Rfr= ระยะทางทสารเคลอนทได

ระยะทางทสารมาตรฐานเคลอนท

Rf = ระยะทางทสารเคลอนทได ระยะทางทตวท าละลายเคลอนท

Rf : Retardation factorX

Z

ba

Y =X

Y

a=สารตวอยาง

b=สารมาตรฐาน

X= ระยะทางทตวท าละลายเคลอนท

Y= ระยะทางทสารตวอยางเคลอนท

Z= ระยะทางทสารมาตรฐานเคลอนท

Z

Y

19

สารทมคา Rf มาก แสดงวาสารมคณสมบต

• สารเคลอนทไดเรวหรอมาก

• สารถกดดซบไดนอย

• สารละลายไดด

สารมคา Rf นอย แสดงวาสารมคณสมบต

• สารเคลอนไดชาหรอนอย

• สารถกดดซบไดมาก

• สารละลายไดนอยสาร 2 ชนดมคา Rf

ตางกน < 0.05 จะไมเกดการแยกขนสมบตของคา Rf

• ไมมหนวย มคาไมเกน 1• หาไดจากการทดลองเทานน • ขนอยกบชนดของสารและชนดของตวท าละลาย• เปนคาเฉพาะคาคงทของแตละสาร การวเคราะหสารเปนสารชนดเดยวกน มหลกการดงน• มสเดยวกน • มคา Rf เทากน ในระบบการทดลองเดยวกน

20

A B C D E FM

A,B,C,D, E, F = สารมาตรฐานทมปรมาณตางกนM= สารผสม

การท าปรมาณวเคราะห

21

ความเขมขน พนท

0 0

5 0.027

10 0.063

20 0.121

40 0.254

??? 0.096

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Peak

area

ความเขมขน (ppm)

y = 0.0064x - 0.0025R² = 0.9992

-0.05

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Abso

rban

ce

ความเขมขน (ppm)

ขอมลจากการทดลอง

สรางกราฟระหวางความเขมขนและ พนท

เพมเสนแนวโนม สมการเสนตรง และคาความเปนเสนตรง

15 ppmอานความเขมขนจากกราฟมาตรฐาน

22

ประโยชนของ PC

• ใชแยกสารทมปรมาณนอยๆ ได ซงวธอนแยกไมได

• ใชแยกไดทงสารมสและไมมส สารไมมสใช

วเคราะหชนดของสารและหาปรมาณของสารผสม

• ใชทดลองความบรสทธของสาร

• ใชทดลองหาเฟสเคลอนททเหมาะสมกอนการท า HPLC

• ใชกบตวอยางมากๆได ในขนตอน screening

23

Thin layer chromatography (TLC)

• มหลกการและเทคนคคลาย Paper chromatography ทกประการ ตางกนตรง ชนดของเฟสคงท

• เปนรปแบบหนงของ plane chromatography

• เปนจดเรมตนของการท า column chromatography เนองจากการแยกเกดขนเรว ระบบไมยงยาก สามารถท าไดบอยครง

24

เฟสคงท Stationary phase

เฟสคงทสามารถเลอกไดหลายชนด เชน ท าให เกดการแยกโดย

adsorption, partition (normal phase, reversed phase), ion exchange

size exclusion

Plate มขนาด 5x10, 10x20, 20x20cm

ความหนาของสารเคลอบ 200-250µm ส าหรบอนภาคขนาด 20µm (หรอ

หนากวาส าหรบ Conventional plates)

เกดการแยก ~200 จด ในเวลา 25 min ระยะทาง 12 cm

สารอนทรย เชน cellulose powders, starch, sephadex, polyamides และ

ion exchange resin

สารอนนทรย เชน silica gel, alumina, glass powder และ diatomaceous

earth

25Thin layer chromatography

26

1. ใช capillary tube จด (spot) สารเขมขน 0.01-0.1%

2. หางจากขอบ 1-2cm

3. ขนาดจดสาร 5mm ใชท าคณภาพวเคราะห

4. ขนาดจดสาร <5mm ใชท าปรมาณวเคราะห

5. ใช Pt-iridium capillary tube ในการจด (spot)

6. ใช automatic dispenser system ทควบคมปรมาตรได

แมนย า

1. การจดสาร

วธการวเคราะหดวยเทคนค TLC

27

การเตรยม Chromatoplates

28

การจดสาร

29http://www.camag.com/media/5I131C8Y/Linomat_5.png

การจดสารดวยเครอง Camag Linomat 5

30

Automatic TLC Sampler

http://www.camag.com/media/804Y7G56/dc_probenautomat_ATS_4.png

31

1. ตองท าการระเหยตวท าละลายกอนท าการแยกสาร

2. น าเพลตไปใสในภาชนะปด ภายในบรรจ mobile phase ท

อมตวดวยไอสาร mobile phase (spot สารหามจมใน mobile

phase)

3. mobile phase จะเคลอนทผานเพลตดวยแรง capillary force

(ในอตราไมคงท, hyperbolic function) การเคลอนทลดลงเมอ

ระยะทางเพมขน

4. หลงจากตวท าละลายเคลอนทไดประมาณ 2/3 เพลต หยดการ

develop ตองท าการระเหยตวท าละลายกอนท าการตรวจวดสาร

2 Plate development

32

Chamber types used for conventional PPC. (A) Unsaturated N-chamber (1,

rectangular chamber; 2, chromatographic plate; 3, mobile phase). (B) Saturated N-

chamber (4, filter paper soaked with the mobile phase). (C) Unsaturated S-

chamber (5, glass cover plate; 6, spacer). (D) Saturated S-chamber (7, facing

chromatographic plate, soaked with the mobile phase; 8, second part of the

mobile phase). (E) Ultra-micro chamber, a special variety of S-chamber (5, glass

cover plate; 9, elastic inert material).

33

1. ถาสารมสมบต luminescence (สารอนทรยfluorescence, สารอนนทรย;phosphorescencephenomena) สามารถตรวจหาการเรองแสงของสารได

2. ใหเตมสาร fluorescence indicator ลงในสารเคลอบ เมอสารทถกตรวจวดทเปน nonfluorescence จะเกดเปนจดจางๆ สารทใชเคลอบไดแก pyrene derivatives, fulorescein, morin,rhodamine B

3. พน strong oxidant เชน HNO3, KMnO4, H2SO4

จะเกดเปนจดสด า ส าหรบสารอนทรย

3. Detection การตรวจหาต าแหนงของสารบนเพลต

34

4. พนสาร reagent ทท าปฏกรยาจ าเพาะตอสาร เชน-NH2 ท าปฏกรยากบ ninhydrin-Phenol Fe(III)Cl3-reducing sugar Aniline phthalate-metal complex forming reagent

C

C

O

O

C

OH

OH

RNH2C

C

O

O

C N

O

O

ninhydrin Blue reaction product

http://www.camag.com

/media/M2156CBI/laborsprueher_small.png

35

densitometer

Light path diagram of the TLC

scanner. Key: 1, lamp selector;

2, entrance lens system;

3, monochromator entry slit;

4, monochromator grating;

5, mirror; 6, slit aperture disc;

7, lens system; 8, mirror;

9, beam splitter; 10, reference

photomultiplier;

11, scanning object;

12, measuring photomultiplier;

13, photodiode (transmission).

36

Separation of pesticides in tap water on an HPTLC silica gel 60 plate

by AMD. Multi- wavelength ( six wavelengths) evaluation permits

resolution by optical means of fractions insufficiently separated. (Reprinted from Camag literature, CAMAG, Muttenz, Switzerland.)

37

Open column chromatography

38https://en.wikipedia.org/wiki/Column_chromatography#/media/File:FDA_History_-_Column_Chromatography.jpg

An FDA chemist in the mid-1950s is shown using a column chromatographic apparatus to separate the constituents in a coal tar chemical analysis.

39

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )

โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ1. Liquid liquid chromatography (LLC)

(partition chromatography)

2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)

3. Ion-exchange chromatography

4. Exclusion chromatography

40Column chromatography

41

ตวตรวจวด Signalข

สญญาณ

คอลมน

เวลา

สญญาณ

เวลา ค

ก

ข

ค

การแยก (ก) ดวยคอลมน (ข)โครมาโทแกรมของผสมสารตวอยาง 2 ชนด ทมการกระจายตวตามปกต และ (ค) ทมความประพฤตเปนอดมคต (Ideal behavior)

(ดดแปลงจาก Skoog Holler & Nieman 1998 p. 676)

42

Mobile and Stationary phase

Mobile and Stationary phase

43

• ค.ศ. 1960• ตวบรรจเปนของแขงทไมมรพรนเปนแกน เชน glassbead ~ 40 µm และเคลอบดวยแผนฟลมบางๆ(หนา 1-3 µm)• ของแขงมลกษณะเปนรพรน silica gel, alumina,resin หรอ polyamide

อนภาคบรรจ

• ค.ศ.1980•อนภาคทใชบรรจอยในคอลมน คอmicroparticulate ซงเปนทนยมใชกนมากในปจจบน•เปนวสดทบรรจใน guard column เพอใหท าหนาทกรองสงเจอปนออกจากสารละลายตวอยางและเฟสเคลอนททจะผานเขาไปยงคอลมน ท าใหอายการใช

งานของคอลมนยาวขน

44

กลไกในการแยก (• = solute)(a) adsorption chromatography, (b) partition chromatography, (c) ion-exchange chromatography, (d) size exclusion chromatography, and (e) electrophoresis.

(a) (b) (c) (d)

(e)

45

การแลกเปลยนไอออน

การแลกเปลยนไอออน

46

วธการวเคราะหดวยคอลมนโครมาโทกราฟ

1. การเตรยมคอลมน• แพคคอลมนโดยท าเฟสคงทใหเปนสารแขวนลอย

• เทลงในคอลมนทปดปลายดวยส าล หรอใยแกว• รอใหเฟสคงทเรยงตวในคอลมนใหมความสงตามตองการ• ระวง ตองใหมน าบนผวหนาเฟสคงทเลกนอยตลอดเวลา

ตวดดซบทเปนเฟสคงทในคอลมนโครมาโทกราฟม 2 แบบ

1. แบบ รเวอรสเฟสหรอวฏภาคกลบ•เปนการใชของแขงทมโพลารตต า เชน ผงยาง•ใชของแขงซบพอรททมของเหลวทไมมโพลารตเคลอบ

47

2. ตวดดซบทเปนเฟสคงทในคอลมนโครมาโทกราฟแบบ นอรมลเฟสหรอวฏภาคปกต

AluminaMagnesiumCharcoalSilica gelCalcium oxideMagnesium carbonateCalcium carbonatePotassium carbonateSodium carbonateStarchCellulose

High polarity

Low polarity

Greatest adsorption

Least adsorption

48

Partial structure of alumina

Silica gel matrix structure

Si

OO

O

O

H

SiSi

O

O

H

O

49

2. ใสสารตวอยาง

โดยใชปเปตดดสารตวอยางแลวปลอยใกล เฟสคงทมากทสดโดยไมท าลายผวหนาคอลมนและไมตดขางคอลมน

สารตวอยางทใชมโพลารตตางกน ถาเปนนอรมลเฟสโครมาโทกราฟ สารทมโพลารตสงจะอยในคอลมนไดนานทสด

50

สารทมฟงกชนนอลกรพตางๆมโพลารตตามล าดบน

Organic acids (RCOOH), base (NH3, OH-)Alcohols (ROH), Thiol (RSH)Amines (RNH2) Nitro groups (RNO2)Aldehydes (RCHO), Ketones (RCOR)Esters (RCOOR’)Halides (RF, RCl, RBr, RI)Unsaturated hydrocarbons (R-C=C-R’)Saturated hydrocarbons (RCH2-CH2-R’)Perfluorocarbons (CnF2n+2)

High polarity

Low polarity

Longest retention time

Shortest retention time

51

3. ท าการอลท

เปนการเตมสารละลายทมโพลารตทเหมาะสมในการชะสารออกจากคอลมนในการชะสารตวอยางทมโพลารตสงตองใชตวท าละลายทมโพลารตสงดวย

สารผสมทมโพลารตแตกตางกนกอาจใชสารชะหลายตวโดยทเรมจากตวทมโพลารตต ากอน

52

Eluting solvent

53

4. เกบสารตวอยาง

• เกบแบบ manual โดยเกบทละ 1-10 mL

• ใชเครองเกบ fraction collector

สามารถเกบตวอยางแบบถได โดยไมตองเฝา

5. การวดปรมาณสารทออกจากคอลมน• วดโดย Optical method; UV, IR,

Fluorescence

• Electrochemical method; Voltametry,

conductivity etc.

54

Fraction Collector

55

56

ขอเสยของ Open column chromatography

• การบรรจอนภาคบรรจ (packing particle)ท าได ชาและเสยเวลา

• ประสทธภาพการแยกต า

• ตองเกบสารเปนสวนๆ ท าใหใชเวลานาน

ขอเสยของ Thin layer chromatography

• ท าเปนระบบอตโนมตไมได

• การท าซ าไดผลไมคงท (low reproducibility)

• ท าปรมาณวเคราะหไดไมด

• เหมาะกบการวเคราะห เตรยมสารเบองตน

57

Modern Liquid Chromatography

• มการพฒนาชนด วสดของอนภาคบรรจ

• มการพฒนาปมหลายแบบ

• มการพฒนาตวตรวจวดหลายชนดขน

ป คศ 1967 มการประดษฐ HPLC มาใชงานดานการวเคราะหนวคลโอไทด โดย Horvath

58

ขอดของ Modern Liquid

Chromatography

• คอลมนทใชแยกมประสทธภาพมากขน โดยสามารถเลอกชนดของเฟสคงทและระบบของเฟสเคลอนททเหมาะสมได

• ตวตรวจวดเปนแบบ non-destructive คอไมท าลายสาร

• คอลมนสามารถใชไดใหมได re-usable

• การวเคราะหเปนแบบอตโนมตได โดยเฉพาะขนตอนน าสารเขาเครองวเคราะห

• มความถกตอง แมนย าสง

59

แกสโครมาโทกราฟ(Gas Chromatography)

60

Gas Chromatography (GC)

เปนเทคนคการแยกสารพวกทม polarity ต า สารตวอยาง

ตองระเหยเปนแกสหรอไอ ณ จดฉดสาร แกสเฉอยท าหนาทพาสารเขาสคอลมนซ งมเฟสคงททเปนของเหลวหรอของแขงท าหนาทแยกสารและถกตรวจวดในสวนของดเทคเตอรตอไป

1. ถา stationary phase เปน active solid เรยกเทคนคนวา Gas Solid Chromatography (GSC) กลไกการแยกแบบดดซบ (adsorption)

2. ถา stationary phase เปน liquid ทเคลอบบางๆ บนผวของ inert granular solid support เทคนคนเรยกวา Gas Liquid Chromatography (GLC) กลไกการแยกแบบแบงแยก (partition)

61

1. Gas Solid Chromatography (GSC)

• ใชหลกการ adsorption โดย stationary phase เปนของแขง ท

สามารถดดซบสารทเปนแกสหรอไอทตองการแยกได ใชแยกสารทมโมเลกลเลกๆ ทสามารถเปลยนเปนแกสหรอไอ โดยม active

solids (adsorptive particles) ทบรรจอยในคอลมนเปนmolecular sieves หรอ porous polymers, silica gel, alumina

และ activated carbon

2. Gas Liquid Chromatography (GLC)

• ใชหลกการ partition สารผสมทตองการแยกอยในสภาพทเปนแกส หรอไอ เมอผานเขาสคอลมนจะแยกออกจากกนโดยความแตกตางในการกระจายตวอยใน mobile phase (carrier gas)และ stationary phase ทเปนของเหลวทเคลอบอยบนผวของinert solid support ทมพนทผวสง ขนาดสม าเสมอ นยมใช

celite หรอ glass beads

62

สวนประกอบส าคญของเครองแกสโครมาโทกราฟ (GC)

1. สวนฉดสาร (Injector)

2. เตาอบ (Oven)

3. คอลมน (Column)

4. ตวตรวจวดสญญาณ (Detector)

5. ระบบบนทก และเกบขอมล (Recorder,

Integrator) ผลทไดจะแสดงในรปของ โครมาโทแกรม (Chromatogram)

63

องคประกอบพนฐานของเครอง GC

Fan assisted thermostatically controlled oven

Detector

Computer

Sample injection syringe

Injection port

By pass valve

Gas cylinder

64

Gas Chromatograph

65

A Scheme of gas chromatography.

www.cubic.uni-koeln.de/.../metabolom.html

B Typical chromatogram of a cell extract of C. glutamicum.

•Blood Alcohol Mix Resolution Control Standard was used: eight components, 100 mg/dL, water, 1 mL/ampule (Restek [Bellefonte, CA], cat. #36256).

แผนภาพแสดงหลกการพารทชนของ GC เมอ A,B และ C เปน

สวนประกอบของตวอยางทกระจายแบงตวตางขนาดกนในระหวางวฏภาคแกสกบวฏภาคของเหลว

66

Alkyl silicone

67

Si

R

R O

R

Si

R

R

O Si

R

R

R

n

Si

CH3

CH3

O

n

Dimethyl silicone

Non polar

Boiling point separation (เชน การแยกอลกอฮอล น ามน ยา

95% Dimethyl 5% phenyl silicone

Slightly polar

Boiling point separation (เชน aromatics, flavors, aromatic

HCs

Si

CH3

CH3

O

n

Si O

n

68

Packed GC column

Capillary GC column

69

ก) Packed column ข) Capillary column

ค) Porous Layer Open Tubular Column

(PLOT) Column

ชนดของคอลมน ก) แพค (Packed column) ข) พลอต(PLOT column) ค)แคพลลาร (Capillary column)

70

Carrier gas

• ท าหนาทพา volatile component ในคอลมน มคณสมบต inert ไมท าปฏกรยากบสารตวอยาง หรอ stationaryphase

• ท าหนาทพา separated component ไปยง detector

แกสพาทนยมโดยทวไปไดแก ไนโตรเจน ไฮโดรเจน และฮเลยม

71

คณสมบตของ Carrier gas

• inert ไมท าปฏกรยากบสารทตองการแยกหรอ stationary phase

• มการแพรนอยและมน าหนกโมเลกลต า

• หางาย ราคาถก

• และมความบรสทธสง

• เหมาะกบระบบตรวจวดทใช

แกสพาทออกจากทอแกสควรท าใหบรสทธ โดยผานทอทบรรจดวย molecular sieve เพอชวยขจดไอน าหรอไอน ามน

72

Sampling Systems

• Gas Samples

– gas-tight syringes

– loop valves (0.1 to 10 mL)

• Solid Samples

• Liquid Samples 0-1L or diluted

• Vaporizing Injector

– injector temperature > bp components และอณหภม สงกวาอณหภม oven สงสด 50C

– injector temperature < อณหภมสงสด stationary

phase ททนได

73

การฉด• sample; liquid, gas, solid (solution, pyrolysis)

• Micro syringe แบบ liquid หรอ gas tight syringe

• Sample valve (reproducibility > 0.5%)

• Head space analysis (solid, liquid sample)

• Auto injector

• Autosampler

74

แพค คอลมน• Syringes

– Plunger-in-barrel (5-1000 L)

– plunger-in-needle (0.5 or 1 L) ดดสารเทาไรกไดจนถง 1 L

– 5 L syringe จายสารไดครงละ 0.3 L ได

Capillary Columns

อตราเรวของแกส ส าหรบ 0.3 mm i.d. wall coatedopen-tubular (WCOT) ประมาณ <2 mL min-1

solvent 1 L มปรมาตร 0.5 mL ท 250C จะเกดปญหา band broadening ตองมวธการฉดทแตกตาง

75

1) Injector

คอ สวนทสารตวอยางจะถกฉดเขาสเครอง และระเหยเปน gas พรอมกบถกท าใหเปนเนอเดยวกน กอนทจะเขาส column อณหภมทเหมาะสมของ injector ควร

เปนอณหภมทสงพอทจะท าใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมถกท าใหสลายตว (decompose)

• Solvent ทใชละลายสารตวอยาง ไดแก ether,

heptane หรอ methanol

• อณหภมของ injection port ตองสงพอทจะท าใหสาร

ตวอยางเกดการกลายเปนไอไดอยางรวดเรว แตตองไมท าใหสารตวอยางสลายตวและสงกวาอณหภมของคอลมน

76

2) Oven

คอ สวนทใชส าหรบบรรจ column เอาไว และเปนสวนทควบคมอณหภมของ column ใหเปลยนไปตามความเหมาะสมกบสารทถกฉด ซงอณหภมของ oven นนจะสามารถปรบเปลยนได 2 แบบคอ

– isocratic temperature (isothermal)

– gradient temperature (program temperature)

ขอดของการท า gradient temperature คอสามารถใชกบสารตวอยางทมจดเดอดกวาง (wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห (analysis time ) ลงไดอกดวย

77

Temperature programming

Isothermal at 45C

Isothermal at 145C

Programmed temp. at 30-180C

78

20% ลควดเฟส 40°C

20% ลควดเฟส 30°C

20% ลควดเฟส 50°C

20% ลควดเฟส 60°C

ผลของอณหภมทมตอ retention time (แมน 2553 หนา 280)

3) Detector

คอ สวนทจะใชส าหรบตรวจวด องคประกอบทมอยในสารตวอยาง detector จะท าการเปลยนเปนสญญาณทาง electronic กอนสงไปยงตวประมวลผลเพอท าการ

เขยน เ ปนความสม พนธกบ เวลาไดออกมาเ ปน chromatogram

79

แบงได 2 ชนด general detector สามารถตรวจวดสารไดหลายๆ ประเภท

selective detector ซงจะสามารถเหนเฉพาะสารทมโครงสรางเฉพาะ, ม functional group หรอ atoms ทจ าเพาะเจาะจง

80

สมบตของ Detector

• ความไวเพยงพอ

• เสถยรภาพและแมนย าสง

• ใหสญญาณสมพนธกบความเขมขนสารทเปนเสนตรงในชวงกวาง

• อณหภมชวง RT - 400C อยางนอย

• เวลาตอบสนองเรว

• มความถกตอง นาเชอถอ

• มความจ าเพาะสง

• ไมท าลายสาร

81

Detector ตรวจวดสารทนยม

1. Flame Ionization Detector FID

2. Thermal Conductivity Detector TCD

3. Flame Thermionic Detector FTD

4. Flame Photometric Detector FPD

5. Electron Capture Detector ECD

6. Photoionization Detector PID

7. Electrolytic Conductivity Detector ElCD

8. Mass Spectrometer MS

82

1. Flame Ionization Detector (FID)

มคณลกษณะของ GC ดเทคเตอรในอดมคตแทบทกอยาง

หลกการ

การสนดาปไอของสารทออกมาจากคอลมนในเปลวไฟของไฮโดรเจนในอากาศหรอออกซเจนและวดไอออนทเกดขนจากองคประกอบของพคทออกจากคอลมนของ GC ปรมาณทสามารถตรวจวดต าสด (minimum detectable quantity; MDQ) เทากบ 10-11 กรม และชวงของกราฟมาตรฐานทเปน

เสนตรงถง 107

สารประกอบหลายอยางทไมสามารถตรวจวดโดย FID เชน

ไฮโดรเจน ไนโตรเจน น า ไฮโดรเจนซลไฟด ซลเฟอรไดออกไซด แอมโมเนยและคารบอนไดออกไซด

สารประกอบไฮโดรคารบอนทจะตรวจวดโดย FID ไดจะตองสามารถ

ผานกระบวนการออกซเดชนได

Schematic diagram of a flame ionization detector for gas chromatography (Harvey 2000 p 570)

83

Power supply

Collector

Air

H2

Column

Carriergas

CH· + O → CHO+ + e-

2. Electron Capture Detector (ECD)

Detector ชนดนเปน selective detector เฉพาะทใชวด Electrophilic compounds อยางเชน Halogens, Nitrates

และ conjugated corbonyls องคประกอบหลกของ detector นคอ 63Ni ซงจะให electrons เมอมกระแสไฟฟาคงท เมอสารทเปน electrophilic compounds เขาไปจบกบ electrons เปน

ผลใหมการเปลยนแปลงของกระแสในการวดสภาพไวสง แต linearity range แคบ

สมการทเกดขนในการวด Polychlorinated Biphenyls

(PCB) โดยใช Nitrogen gas เปน Make-up gas

84

85

Ni63

28 Ni63

29 01

ยกตวอยางการตรวจวดสาร Polychlorinated Biphenyls (PCB) โดยใชไนโตรเจน เปน make-up gas มปฏกรยาเกดขนดงน

N2 → N2+ + e- (low velocity)

PCB + e- → PCB- (electrophile molecule with captured electron)PCB- + N2

+ → Neutral compound

86

สารประกอบคาไปนใหคา relative ECD response ตาง ๆ กน (แมน 2553 หนา 296)สารประกอบไฮโดรคารบอน 1สารประกอบอเทอรและเอสเทอร 10สารประกอบอะลแฟตกแอลกอฮอล คโตน เอมนโมโนคลอไรด และฟลออไรด 100สารประกอบพวกโมโนโบรไมดไดคลอไรด และไดฟลออไรด 1,000สารประกอบพวกแอนไฮไดรด และไทรคลอไรด 10,000สารประกอบพวกโมโนไอโอไดต ไดโบรไมด พอลคลอไรดและพอลฟลออไรด 100,000สารประกอบไดไอโอไดด ไทรโบรไมด พอลคลอไรดและพอลฟลออไรด 1,000,000

Schematic diagram of an electron capture detector for gas chromatography

87

+ve Electrode

-ve Electrode -Emitter

Carrier

gas out

Carrier gas in

ลกษณะของอเลกตรอนแคพเจอรดเทคเตอร (Harvey 2000 p. 570)

3. Mass Spectrometer (MS)

Detector จะท าใหสารแตกตวเปน ions ดวยการใหสารทถก elute ออกมาถก bombard

ดวย electrons (Electron impact ionization;

EI) หรอ gas molecules (Chemical

ionization; CI) ซงจะท าใหสารแตกตวเปน fragment ทมประจและผานไปยง mass filter

กอนถกวดท electron multiplier สามารถวดสารทกประเภททสามารถแตกตวใน mass

range ทสามารถวดได

88

89

องคประกอบหลกของเครองแกสโครมาโทกราฟ-แมสสเปกโทรมเตอร http://orgchem.colorado.edu/Spectroscopy/MS/inletsys.html

90

ลกษณะเปรยบเทยบของ GC ดเทคเตอรทส าคญ

ดเทคเตอร หลกการ ความจ าเพาะความวองไว

ชวงเสนตรง

เฟลมไอออนไนเซชนดเทคเตอร (FID)

เผาสารประกอบในเปลวไฟ H2 / O2 ท

2000 องศาเซลเซยส

สนองตอบตอสารอนทรยทสามารถถกออกซ

ไดส

10-12 107

อเลกตรอนแคพเจอรดเทคเตอร(ECD)

วดการเปลยนแปลงของกระแสอเลกตรอนทเกดจากปฏกรยาจากสารประกอบอนทรยกบอเลกตรอน

ตอบสนองตอสารประกอบทกอยางทท าปฏกรยากบอเลกตรอน

10-14 103

(106

ส าหรบpulsed

operati

on)

Mass

spectrometry

สารแตกตวเปน ions

และแยกตามมวลตอ

ประจ m/z

สารเกอบทกชนด 10 pg -

10 ng

105

การท าคณภาพวเคราะห

เพอวเคราะหสารตวอยางวาเปนสารอะไร มกชนดและเปนสารใดบาง

1. ใชคารเทนชนไทมของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน แตสารตางชนดกนอาจ

ใหคารเทนชนไทมตรงกนกได อาจวเคราะหอกแตสภาวะการแยกตางกน เชน

คอลมน อณหภม อตราการไหล เปนตน

2. เทคนค spiking บอกวาพกไหนเปนของสารใดในสารผสมนน โดยเตมสารสาร

นนลงในสารตวอยาง ถาโครมาโทแกรมทไดมพกใดทมพนทใตพก หรอความ

สงเพมข นแสดงวา พกนนเปนของสารทเราเตมลงไป (known compound)

91

92

• พนทใตพค หรอความสงของพคในการท าคณภาพวเคราะห โดยเทยบกบสารมาตรฐาน

• External standard

• Standard addition

• Area normalisation

ใชในการวเคราะหทางสงแวดลอม ทางการแพทย

ชวเคม การ พสจนหลกฐาน อาหาร หองปฏบตการปโตรเคม

การท าปรมาณวเคราะห

การประยกตใชงาน

High Performance Liquid Chromatography

เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

94

การท างาน

HPLC เปนเทคนคแยกสารผสมโดยใชเครองสบแรงดนสง (high pressure pump) สบของเหลวหรอตวท าละลายซงท าหนาทเปนวฏภาคเคลอนท (mobile Phase) พาสารตวอยางทถกฉดเขาทางชองฉดสาร (injector) เคลอนทผานอนภาคทเปนวฏภาคคงท (stationary phase ) ซงบรรจอยในคอลมน (column)

สารผสมเคลอนทผานคอลมนแลวจะถกแยกออกมาในเวลาทตางกน ผานเขาสเครองตรวจวด (detector) สญญาณทตรวจวดไดซ งอยในรปสญญาณไฟฟาตามเวลาและปรมาณของสารแตละตวทตรวจวดได โดยสญญาณจะถกสงไปยงเครองบนทกสญญาณแสดงผลออกมาเปนโครมาโทแกรม (chromatogram) ประกอบดวยพค (peaks) ของสารทเปนองคประกอบของสารผสม

95

สวนประกอบตาง ๆ ของเครองมอ HPLC

Mobile phasereservior

Pump

Pressure gauge

Filter

Pressure sensor

Sample injector

Analytical column

Guard column

Detector

Waste

Data systemRecorder

96แผนภาพสวนประกอบตาง ๆ ของเครองมอ HPLC

97

การเตรยมโมบายเฟส

• เลอกใช ‘HPLC grade’ หรอคณภาพใกลเคยง

• อาจมการผสมดวยอตราสวนตางๆ หรอเตมบฟเฟอร หรอปรบพเอช

• ตองมการกรองกอนดวยเมมเบรนขนาด 0.5 or 0.8 m filter

• โมบายเฟสตองมการก าจดแกสกอน โดยเฉพาะตวท าละลายทมขวสง (น า สารละลายบฟเฟอร) เนองจากอากาศละลายไดงาย),

ภาชนะทบรรจเฟสเคลอนท (mobile phase reservoir)

• เปนขวดส าหรบใสตวท าละลายทใชเปนเฟสเคลอนท มขนาดประมาณ 1 ลตร

• อาจมอปกรณทใชในการไลอากาศทละลายอย เชน ออกซเจน (degasser)

98

การอลท

• Isocratic elution เปนการใชสารละลายท

เหมาะสมเพยงตวเดยวตลอดการชะ อาจจะใช

เวลานานในการแยก และหรอพกจะมหาง

• Gradient elution โดยท าการโปรแกรมตวท าละลาย คอ การผสมตวท าละลาย (>) 2 ชนด

99การชะ (ก) ระบบแกรเดยน จาก 10-100 % B และ (ข) ไอโซเครตก ((Mayer

2004, p. 237)

(ก)

(ข)

100

ผลของสดสวนผสมของวฏภาคเคลอนท เมทานอล น า แยกดวยวฏภาคกลบ พก 1–

methanol

2–benzene 3–chlorobenzene 4–o-

101

อปกรณส าหรบฉดสารตวอยาง

การผานสารตวอยางเขาไปยงคอลมนควรจะอยในลกษณะทเปน

แถบทแคบมากทสดเทาทจะเปนไปได

วธการนยมใช

microsampling valve

microsyringe ฉดสารตวอยางผาน septum

http://www.lcresources.com/resources/getstart/2c01.htm

102

ระบบของปม (pumping system)

ใน HPLC มความตานทานการไหลของเฟสเคลอนททจะไหลผาน

คอลมนซ งมอนภาคขนาดเลกบรรจอย ความตานทานจะมากเมอใช

อนภาคเลกๆ และคอลมนมขนาดเลกดวย จงจ าเปนทจะตองใชปมความดนทสงดนเฟสเคลอนทใหสามารถไหลได

• ปมและสวนประกอบท าดวยวสดททนทานตอการสกกรอนดวยตวท าละลายตางๆ ทงนรวมทงทอ fitting และ flow cell เชน ท าดวยเหลกไรสนมคณภาพสง inert polymers เชน polytetrafluoroethylene (PTFE)

• สามารถปมวฏภาคเคลอนททมปรมาณมาก ๆ ไดอยางตอเนองโดยไมมการขดของ

• ใหความดนไดถง 4,000 – 6,000 psi

• ควบคมอตราการไหลไดระดบต าจนถง 3 มลลลตรตอนาทเปนอยางนอยและคงท

• ความคลาดเคลอนของการควบคมการไหลตองไมเกน 1-2 %

• มปรมาตรภายในต าเพอความสะดวกและรวดเรวในการเปลยนวฏภาคเคลอนท

• ไมมพลส (pulse) หรอมตวทใชลดพลส (pulse damper)

103

ชนดของปม

• mechanical pump เปนปมทควบคมใหอตราการไหล

ของเฟสเคลอนทมคาคงท

• pneumatic pump เปนปมทควบคมใหความดนของ

เฟสเคลอนทมคาคงท

1. Syringe pump และ Constant displacement pump

ปมชนดนมลกษณะเปนกระบอกสบ (cylinder) ซงบรรจตวท าละลายไวแลว มกานสบ (plunger) ซงจะเคลอนทแบบสกร (screw) ผานกลองเกยร (gear box) โดยม step เปนตวควบคมอตราการไหลของวฏภาคเคลอนทโดยจะไปท าใหกานสบเคลอนทเรวหรอชาลง

104

2. ปมแบบชกลกสบ (reciprocating pumps)

ปมชนดนเปนทนยมใชกนมาก กานสบปมทจะเคลอนทเขาออกตลอดเวลาการท างาน เมอลกสบเคลอนทเขาจะเปนการดนวฏภาคเคลอนทใหเขาสคอลมน และเคลอนทออกนอกจะดงเอาวฏภาคเคลอนทจาก reservoir เขาสลกสบผาน check valve แสดงดงรปเปนการควบคมการเคลอนทกระท าไดโดยการปรบอตราเรวของการชกลกสบผานมอเตอร และคอมพวเตอร

105

reciprocating pumps

ขอด

• มปรมาตรภายในต า ท าใหการเปลยนแปลงตวท าละลายหรอวฏภาคเคลอนทไดงาย

• การสงวฏภาคเคลอนทจะอยในลกษณะตอเนอง

• อตราการไหลของวฏภาคเคลอนทคงทดโดยไมตองค านงถงback pressure ของคอลมน

ขอเสย

• เกดพลสขนท าใหความไวของดเทคเตอรบางชนดมขอจ ากด

• ตองม pulse damper

• ปรมาตรของระบบระหวางปมกบคอลมนเพมขน

• เกดความยงยากในการเปลยนตวท าละลาย

• ไมเหมาะในการท า gradient elution

106

เครองตรวจวด (detector)

107

สมบตของเครองตรวจวด (detector)

• มสภาพไวสง และใหสญญาณตอบรบ (response) ทคาดคะเนได

• ใหสญญาณตอบรบไดกบสารทกชนด

• ไมมผลตอการเปลยนแปลงของอณหภมและอตราเรวของการไหลของเฟสเคลอนท

• เชอถอไดและงายตอการใชงาน

• ความสมพนธของความเขมขนและสญญาณตอบรบของเครองตรวจวดควรมสภาพ

• เชงเสน (linearity) ในชวงกวาง

• ใหขอมลเกยวกบคณภาพวเคราะหส าหรบพคทตองการตรวจสอบ

108

ชนดของเครองตรวจวดในเครองโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง

• แบบ bulk property หรอ general detector

เปนการวดการเปลยนแปลงคณสมบตทางกายภาพของเฟสเคลอนทรวมกบของตวถกละลาย เชน refractive index เปนตน

• แบบ solute property หรอ selective

detectors เปนการวดการเปลยนแปลงของ

ตวถกละลายเพยงอยางเดยวเทานน เชน UV-Vis, fluorescence เปนตน

109

Noise

Detection Limit

110

Linear detector range

111

Cell Volume

• ปรมาตรของดเทคเตอรตองมคาต า เพอปองกน peak broadening ตองมคาต ากวา 10%

ปรมาตรทชะพคทแคบทสด ปรมาตรมาตรฐานคอ 8 l ถานอยกวานจะมผลตอ detection

limit

• ปรมาตร < 8 ส าหรบ micro-HPLC

112

Liquid

Light

Window Gasket

UV flow cell

113

Performance of LC detectors

LC detectortype LOD

(mass)

gradient Temp. sensitivity

Flow sens.

UV s 100 pg-1 ng Yes Low No

Fluorescence s 1-10 pg Yes Low No

Electrochemical s 10 pg-1 ng No 1.5%/C Yes

RI Gen. 100 ng-1 ug No 10-4/C No

Conductivity s 500 pg-1ngNo 2%/C

Yes

Mass Spect. s 100 pg-1 ng Yes None No

FT-IR s 1 ug Yes Low No

114

อลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (Ultraviolet detector)

• สามารถวดแสงไดในชวงความยาวคลน 190 - 800 nm

• มโมโนโครเมเตอรส าหรบเลอกความยาวคลน

• สามารถใชตรวจหาสารตวอยางไดทวไป

• เหมาะสมกบ gradient elution

• ตวท าละลายชนดตางๆ ทน ามาใชเปนเฟสเคลอนท (mobile phase) จะไมดดกลนแสงอลตราไวโอเลต

• วเคราะหหาสารทมปรมาณนอยๆได

• ขนาด 1-10 L เพอลด extra-column band broadening

115

สารทดดกลนแสงยว

• double bond adjacent to an atom with a lone electron pair, X=Y–Z (เชน vinyl ether);

• bromine, iodine or sulphur;

• a carbonyl group, C=O; a nitro group NO2;

• two conjugated double bonds, X=X-X=X;

• an aromatic ring;

• inorganic ions: Br-, I-, NO3-, NO2

-

116

UV detector

• ยว-วสเบล ดเทคเตอร 3 ชนดทนยมใช ไดแก– 1. Fixed-wavelength UV detector

– 2. Variable UV-Vis detector

– 3. Photodiode-array detector (PDA)

117

1. Fixed-wavelength UV detector

ประกอบดวย flow-through cell และแหลงก าเนดแสง

โดยท าเปนล าแสงดวยเลนสทท าดวยควอทซใหแสงผานเซลลของสารละลายมาตรฐานและสารตวอยาง แสงทผานออกมาจะผานการกรองดวยฟลเตอร จงผานไปยงโฟโตเซลล หรอโฟโตไดโอด 2 ตว

• ดเทคเตอรแบบ Fixed-wavelength แทบไมใชกนแลว หลอดก าเนดแสงใช mercury (254 nm), cadmium

(229 nm), และ zinc lamps (214 nm)

118

2. Variable UV-Vis detector

• แหลงก าเนดแสงประกอบดวย D2 และ W lamps

• Deuterium lamps ใหแสงแบบตอเนอง (-340 nm,

• Tungsten–halogen ใหแสงชวง near-UV และ visible (340–850 nm) มกใชรวมกบหลอดดวทเรยม

• มโมโนโครเมเตอร เพอใชส าหรบเลอกความยาวคลนตามทตองการได

119

3. Photodiode-array detector

(PDA) เปน solid state detector ประกอบดวยโฟโตไดโอดจ านวนมาก สามาถวดแสงไดหลายๆ ความยาวคลนได ในขณะเดยวกน

ระบบทางเดนของแสงจะเปนแบบยอนแสง “ Reverse Option” คอแสงจากแหลงก าเนดหรอจากหลอดยวจะผานไปยง flow-through cell กอนทจะน าไปยงโมโนโครเตอรหรอเกรตตง

เมอแสงทตกกระทบบนเกรตตงจะกระจายออกเปนความยาวคลนตางๆกอนตกกระทบบนแผงของโฟโตไดโอด

scan 1msec/spectrum

120

HPLC-UV ทวไป

121

Principle of a diode array detector.

122

ลกษณะของสเปกตรมทไดจากการเขยน 3 มต ระหวางการดดกลน ความยาวคลน และเวลา

123

124

Ion-Exchange Chromatography

By Supaporn Sangsrichan

125

Ion-Exchange Chromatography

• บทน า

• หลกการ

• สมบตของ ion exchangers

• ผลของ mobile phase

• การประยกตใชงาน

126

Ion-Exchange Chromatography

• Ion-exchange chromatography ถกใชในการแยกกรดอะมโน ตงแตป 1956.

• เทยบไดกบ classical column chromatography ทใช

silica หรอ alumina แตบรรจเรซน หรอ เจลทใชมขนาดใหญ ความดนต า การแยกสารทซบซอนใช

เวลานานหลายวน ดงนนจงมการพฒนาการแยกทให ความรวดเรว คอ HPLC และมการพฒนาเฟสคงทมากมาย รวมถง ion-exchange chromatography

127

IEC

• เทคนคทใชส าหรบแยกสารประกอบทมประจ สารประกอบทแตกตวเ ปนไอออนได เชน สารอนทรยทเปนกรดหรอเบส และสารประกอบทสามารถเกดอนตรกรยากบ ionic groups

128

หลกการ

Ion-Exchange Chromatography เฟสคงทจะม side-chain ทประกอบดวยฟงกชนนลกรปทมประจ เฟสเคลอนทสวนใหญจะประกอบดวย counter ion ซงกคอ ไอออนทมประจตรงขามกนกบ ionic group ทอยบนผวของอนภาคทใช

เปน ion-exchanger และ counter ion นจะอยในสภาวะทสมดลกบประจทอยบน resin ในลกษณะของ ion pair

129

สมดลทเกด

X+ + R-Y+ Y+ + R-X+

Cation exchange:

X- + R+Y- Y- + R+X-

Anion exchange:

X = ไอออนตวอยาง

Y = counter ion

R = exchanger

130

เฟสคงท

• สารอนนทรย เชน sodium aluminosilicate, montmorillonite

• สารสงเคราะห เชน Zirconium

• copolymerization

• เรซนทมรพรน ควบคมไดดวย %cross linking (1-12%, 8% นยมใช)

131

CH = CH2

X

styrene

+ Y

Para - Divinylbenzene

-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -

-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -

สารโพลเมอรทสงเคราะหไดจากการท าโพลเมอรไรซ ทนยมใชคอเรซนทเตรยมจากการโพลเมอรสารสไตรนกบไดไวนลเบนซน

CH = CH2

CH = CH2

132

สามารถแบงเรซนตามคณสมบตของหมธาตทใสเขาไปได 2 ชนด

1 ชนดแลกเปลยนแคทไอออน (cation exchange)

คอเรซนชนดทมหมธาตทเปนกรดอยในวงอะโรมาตก เตรยมไดโดยน ากรดซลฟรก + โพลเมอรของ styrene และ divinylbenzen หม SO3H ดงรป

-CH — CH2 — CH — CH2 -

-CH — CH2 — CH — CH -

SO3- H+

SO3- H+

SO3- H+

-CH — CH2 — CH — CH2 -

133

2 ชนดแลกเปลยนไอออนลบ (Anion Exchange)

คอเรซนชนดทมหมธาตทเปนเบสอยในวงอะโรมาตก เตรยมโดยท าปฏกรยาเคมระหวางหมของเบสกบโพลเมอรกบไดไวนลเบนซนทถกท าคลอโรเมทลเลตแลว

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

N(CH3)3+OH-

134

Cation exchanger

135

การหาสภาวะทเหมาะสม

• ชนดของ ion exchanger,

• pH ของ mobile phase,

• ionic strength (ความเขมขน) ของ mobile phase

• ชนดของ counter ions ใน mobile phase

136

สมบตของ ION EXCHANGERS

• ion exchangers ทมใชสวนใหญมชอยอ ตวแลกเปลยนประจทนยมใชแสดงดงตาราง

• 4 ชนดแรกเปนค ายอทบอกถงชนดของการแลกเปลยนประจ

• ชอยอสวนทเหลอสมพนธกบหมฟงกชนตางๆ

• หมฟงกชนจะเชอมตอกบเรซนทเปนสารอนทรย เชน styrene–divinylbenzene หรอ ผวซลกา

137

ค ายอทใชกบตวแลกเปลยนไอออน

Abbreviation Meaning Type

SAX Strong anion exchanger

WAX Weak anion exchanger

SCX Strong cation exchanger

WCX Weak cation exchanger

AE Aminoethyl –CH2–CH2–NH3+ WAX

CM Carboxymethyl –CH2–COO- WCX

DEA Diethylamine –NH(CH2–CH3)2+ WAX

DEAE Diethylaminoethyl –CH2–CH2–NH(CH2–CH3)2+ WAX

DMAE Dimethylaminoethanol –O–CH2–CH2–NH(CH3)2+ WAX

PEI Polyethyleneimine –(NH–CH2–CH2–)n–NH3+ WAX

QA Quaternary amine –NR3+ (R :CH3) SAX

QAE Quaternary aminoethyl –CH2–CH2–N(CH2–CH3)3+ SAX

SA Sulphonic acid –SO3- SCX

138

(a) cation exchanger ทไมแตกตวเปนไอออน(b) cation exchanger ทแตกตวเปนไอออนทงหมด(c) cation exchanger ทแตกตวเปนไอออนบางสวน

(a)

(b)

(c)

139

Exchange capacity of a weak cation exchanger with pKa 4.2 (left) and

of a weak anion exchanger with pKa 9.0 (right).

140

สงทมผลท าใหเรซนมความประพฤตตางกน

1. ขนาดของเรซน

2. Degree of cross – linking

3. Strength of functional group

4. Number of functional group

141

1. ขนาดของเรซน มผลตออตราเรวในการแลกเปลยนไอออนและการซมผานของสารละลายออกจากคอลมน

2. Degree of cross – linking จะมผลท าใหเรซนมความแขง มการพองตว และมขนาดรตางๆ กน

3. Strength of functional group มผลตอคาสมประสทธของการกระจายของไอออนระหวางเรซนกบสารละลาย

4. Number of functional group มผลท าใหเรซนมความจตางๆ กน

142

กฎการเลอก (Selectivity rules)

Ion Exchange Chromatography สามารถแยกไอออนหรอโมเลกลได เนองจากประจไอออนหรอโมเลกลทมประจตางกนจงใชเวลาอยในคอลมนตางกนทงนข นอยกบ

1. ชนดของเรซน

2. ชนดของหมฟงกชน

3. เฟสเคลอนทหรอตวอลท

143

ความสามารถดงดดระหวางเรซนกบไอออน สามารถค านวณไดจากกฎของคลอมบ

q(ion) คอ ประจของไอออน

q(resin) คอ ประจของไอออน

r คอ ระยะหางของประจทงสอง

2

sin

2

21

r

qq

r

qqF

reion

144

1. ในสารละลายน าทมความเขมขนของไอออนต าๆ ไอออนทมประจสงกวาจะแลกเปลยนไอออนกบเรซนไดดกวา

2. ไอออนทมประจเทากนในสารละลายน าทมความเขมขนต า ไอออนทถกน าไฮเดรทไดนอยกวาจะแลกเปลยนไอออนกบเรซนไดดกวา

3. เรซนทมองศาเชอมโยงตางกน จะท าใหเกดการเลอกได

4. ความเขมขนสงๆ ความแตกตางของการเลอกไอออนทมประจตางกนจะลดลง

สรปกฎเกณฑส าหรบควบคมการประพฤต

ของไอออนในการแลกเปลยนของเรซนดงน

145

5. ไอออนของสารอนทรยทมน าหนกโมเลกลสงๆ หรอสารประกอบเชงชอนของโลหะตางๆ ทเปนแอนไอออนสามารถแลกเปลยนไอออนไดด

6. ทอณหภมสงๆ ในสารละลายทไมใชน าหรอส า รล ะลายท มค ว าม เข มข น ส ง ๆ ก า รแลกเปลยนไอออนทมประจเหมอนกนไมเพมขนเมอเพมอะตอมมกนมเบอร

146แผนภาพแสดงเครองมอส าหรบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ

Mobile phase

reservoir

pump Injector

Separatingcolumn

Stripping column

ConductivitydetectorReadout

147

การประยกตใชงาน

148

Separation of lanthanides by cation exchange. (Reproduced bypermission of Vieweg Publishing from A. Mazzucotelli, A. Dadone, R. Frache and F. Baffi, Chromatographia, 15, 697 (1982).) Conditions: column, 25cm4mm i.d.; stationary phase, Partisil SCX, 10 mm; mobile phase, 1.2 ml min-1 2-hydroxyisobutyric acid in water, gradient from 0.03 to 0.07 M; visible-range detector, 520nm, after derivatization with 4-(pyridylazo)-resorcinol.

149

• Separation of nucleotides and related compounds by anion exchange. (Reproduced by permission of Vieweg Publishing from D. Perrett, Chromatographia,16, 211 (1982).)

• Conditions: stationary phase, APS-Hypersil, 5 mm; mobile phase, A=0.04M KH2PO4 (pH 2.9), B=0.5M KH2PO4 +0.8M KCl (pH 2.9), linear gradient from A to B in 13 min; UV detector, 254 nm

150

งาน วชา คม 210สงกอน วนท11 ตลาคม 2562 กอนเวลา 17.00 น.

สงต อ สภาพร หนาหอง 2310หวขอ1) Gas chromatography 2) High performance liquid chromatography (ระบ Normal

phase/Reversed phase)3) Ion exchange chromatography (Cation exchange/Anion

exchange)

(รายงานกลมแบงหวขอหลกใหแลวแตใหเลอกการประยกตใชงานตามความสนใจ เชน พช สมนไพร อาหาร น า ดน สงแวดลอม ยา เปนตน แตหามซ ากน)เขยนดวยปากกา มเอกสารอางองครบ เชน หนงสอ ผลงานวจยตพมพ 2 เรอง