CHIMICA ANALITICA è

“ una disciplina scientifica in fase di continua evoluzione,che sviluppa e applica metodi,

strumenti e strategie per ottenere informazioni sulla composizione e la struttura

della materia nello spazio e nel tempo”.

DROGHE

SANITA’

RICERCA ARTE

AGRICOLTURA

AMBIENTE

ALIMENTI

Settori coinvolti

ANALISI• Qualitativa •. Quantitativa

Identificazionedi uno o più costituentidel campione

Determinazionedella “quantità” di una particolarespecie nel campione

macroanalisielevateconcentrazioni

microanalisi(trace analysis)0.1 ppb-100 ppm

ultra-traceanalysis< 0.1 ppb

ANALISIDistruttiva(es. dissoluzione di un campione didolomite in ambiente acido)

Non Distruttiva(es. analisi spettrofotometrica)

• Campione:porzione di materia da analizzare. Deve essere rappresentativo dell’intera massa

• Analita: componente del campione che deve essere analizzato

• Matrice:insieme di tutti i componenti di un campione. Può essere importante per decidere il metodo di analisi dell’analita di interesse, per cui è importante tenere conto della presenza di interferenti.

• Campione = Analita + matrice

CLASSIFICAZIONE e PRINCIPI DEIMETODI ANALITICI

Analisi Classica•Gravimetria: metodi basati sulla misura del peso

Volumetria (titolazioni): metodi basati sulla misura del volume

Campione Risposta Concentrazione analita

Analisi Strumentale

Spettroscopia : metodi basati sull’interazionedell’analita con la radiazione elettromagnetica.Cromatografia: separazione dei componenti di una miscela grazie alla loro diversa interazione con due fasi diverse.

Elettrochimica: basata sulla misure di proprietàelettriche del sistema (es:potenziale, corrente,conducibilità, resistenza, carica, …)

Campione Segnale Concentrazione analita

Gravimetrici:-uso di attrezzatura semplice e economica-lunghi tempi di analisi-piuttosto laboriosi e noiosi-soggetti ad interferenzeTitrimetrici: -metodi rapidi e accurati- uso di attrezzatura semplice e economica- utili per la misura diretta di proprietà inbulk del campione (es. acidità, durezza)-applicabili solo per livelli di C > 1 mg/L-laboriosi

Metodi classici

•Adatti per basse concentrazioni• Generalmente rapidi e automatizzabili• Preparazione del campione e calibrazione dello strumento più o meno lunghe• Costo variabile

Metodi strumentali

• Metodi classici • Metodi strumentali

Misura assoluta Misura comparativa,Impiego di soluzioni standard

Calibrazione: Si utilizza una proprietà fisica (es. assorbimento luce) o chimica (es. ossidabilità) che dipende dalla NATURA (an. qualitativa) e della CONCENTRAZIONE (an. quantitativa).

Si basa sulla relazione tra il parametro misurato (segnale) e la concentrazione dell’analita

Y= f(C)

•Gravimetria:pesata

Volumetria:

p. di equivalenza

Reazioni:

• neutralizzazione

•Redox

•Complessazione

•precipitazione

• Principi delll’analisi gravimetrica: • Si trasforma un analita in un suo derivato insolubile, prevalentemente

tramite reazione chimica, o elettrochimica (reazione redox), e quindi si pesa il prodotto formato. Lo strumento richiesto è quindi una bilancia.

• Principi per l’analisi volumetrica• Si fa reagire l’analita con un reattivo in soluzione, che si chiama titolante,

utilizzando una qualsiasi reazione chimica, per la quale sia possibile individuare il punto finale, cioè il volume di reattivo necessario a far reagire completamente l’analita.

• Si aggiungono porzioni di reagente (o titolante) all’analita (in quantitàfissa), fino a che questo ha reagito completamente. Il titolante deve essere a concentrazione esattamente nota.

• La reazione deve avvenire completamente e rapidamente.

• Reazioni utilizzabili: • 1) neutralizzazione 2) redox 3) complessazione 4) precipitazione

METODI Strumentali: CALIBRAZIONE

• Standard esterni• Sono analizzati separatamente

dal campione. Si preparano diverse soluzioni dell’analita a diverse e note concentrazioni e si misurano i corrispondenti segnali..

• Si costruisce la curva di calibrazione e per comparazione si det la concentrazione nel campione.

• Standard aggiunti• Lo standard è aggiunto al

campione:1. Standard interno2. Metodo dell’aggiunta

standard

Metodo con standard esternoPuò essere utilizzato quando:• i componenti della matrice del campione, inclusi tutti i reagenti necessari

per la preparazione del campione, non causano interferenza,• si conosce la composizione della matrice; in questo caso si possono

preparare le soluzioni standard in matrici del tutto simili a quelle da analizzare.

y = 0.26xR2 = 0.99

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

ppm

Esempio: determinazione del Cu in un campione mediante assorbimento atomico. Si preparano 4 soluzioni standard di Cu ((0.5 ppm, 1.0 ppm, 2.0 ppm , 3.0 ppm). Si legge l’assorbanza (segnale strumentale) per ogni standard e si ottiene la retta di calibrazione.Si effettua la misura sul campione pari a A = 0.120.Dall’equazione della retta si ricava [Cu] =0.120/0.26 = 0.45 ppm

• Se si ottiene un diagramma di calibrazione del tipo figura , necessita operare solo nell’intervallo lineare.

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 5 10 15 20 25

concentrazione standard

segn

ale•STANDARD primario

•:materiale a composizione definita•Stabile•Facilmente pesabile

•STANDARD secondario: •soluzione la cui conc viene det conmetodo affidabile (titolazione)

Quando la matrice solida o liquida del campione èincognita o molto complessa è utile ricorrere ai metodi che sfruttano standard aggiunti.

• Metodo dell’aggiunta

• Procedimento:• Si preparano n aliquote uguali dello

stesso campione INCOGNITO• Alle aliquote dalla 2 in poi si

aggiungono quantità note di analitapuro, mentre non si fa alcuna gggiunta a 1

• Portare tutte le aliquote allo stesso volume. Si ottengono n standard contenenti una certa quantitàaggiunta.

• Costruire il grafico• Effettuare estrapolazione in modo

da deteminare il valore incognito [X]

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

C aggiunta (ppm)

Segn

ale

-[X]

Retta: y=a+bx

[X]=a/b

Si utilizza quando si ha interferenza della matrice sul segnale.

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

C aggiunta (ppm)

Segn

ale

1321== retta aggiunte standard

2= retta ottenuta con metstandard esterno in caso di assenza di effetto matrice

3=retta ottenuta con metstandard esterno in caso di presenza di effetto matrice

Metodo dello Standard Interno

Si utilizza per migliorare la precisione del metodo

-0.02

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

X (ppm)

Sx/S

si

Procedimento:•Si preparano vari campioni contenenti quantità note e crescenti di analita e la stessa quantità di standard interno (SI)

•Si effettua la misura sperimentale di ogni singola campione e si riporta in grafico Sx/Ssi in funzione della concentrazione di analita.

•Si sottopone il campione incognito alla misura strumentale dopo avergli aggiunto la stessa quantità di standard interno. Si ottiene il valore della concper interpolazione

Retta:

Sx/Ssi=a+bx

METODO DELLO STANDARD INTERNO

Caratteristiche Standard Interno

Deve essere disponibile puroNon deve essere presente nel campioneDeve dare un segnale distinguibile da quello dell’analitaDeve essere presente ad un livello di concentrazione simile a quello dell’analita e dare un segnale paragonabile a questo

Es. Cromatografia

Applicazione in GAS-cromatografia

A. Preparare miscele standard di analita (a) e standard interno (IS)B. Analizzare le miscele preparateC. Misurare le aree e calcolare il rapporto Aa/AISD. Riportare su un grafico il rapporto tra le aree vs. il rapporto tra i pesi o la

conc dell’analita

FASI DI UNA TIPICA ANALISI• scelta del metodo d’analisi• criteri: - concentrazione aspettata dell’analita nel campione• - numero di campioni da analizzare

- tempo e costo dell’analisi• - disponibilità di strumentazione e materiale• ¨ campionamento prelievo di un campione rappresentativo dei parametri da misurare• ¨ preparazione e trattamento preliminare del campione• -per convertire il campione e l’analita in una forma adatta all’analisi• -per eliminare le sostanze interferenti• -per preconcentrare il campione ( es: dissoluzione di un campione solido in• soluzione acida) • -filtrazione (eliminazione solidi sospesi da un campione acquoso)• - estrazione con solvente, precipitazione, essicazione, etc• ¨ misura e calibrazione: correlazione nota e riproducibile tra misura X di una proprietà

dell’analita (responso della tecnica) e la concentrazione CA dell’analita• CA =f(X)• ¨ calcolo dei risultati• ¨ valutazione statistica dei dati e stima della loro attendibilità

M

E

T

O

D

O

Parametri che caratterizzano un metodo analitico

•Specificità-selettività analitica• sensibilità• limite di rivelabilità e di quantificazione• range dinamico e lineare• accuratezza intesa come esattezza più

precisione (quest’ultima a sua volta distinta in ripetibilità, precisione intermedia e riproducibilità)

• incertezza di misurazione• robustezza.

Specificità-Selettività analitica

• Specificità: Si riferisce ad un metodo che produce una singola risposta

• Selettività: si riferisce ad un metodo che produce più risposte (metodo separativo)

• ABILITÀ DI MISURARE ACCURATAMENTE L’ANALITA IN PRESENZA DI INTERFERENTI

Sensibilità• La sensibilità è definita come:• variazione di segnale, dS (assorbanza, corrente, etc.) in funzione della concentrazione, C

• Sensibilità

• Nel caso di tecniche analitiche basate sull'uso di curve di calibrazione, la sensibilità è la pendenza della funzionelineare di calibrazione.

• La sensibilità analitica è il rapporto tra la sensibilità sopra definita e la deviazione standard del segnale alla concentrazione di interesse:

•••• Sensibilità analitica

•• La sensibilità analitica può variare al variare della concentrazione anche nel caso in cui la

pendenza è costante (cioè nel caso di un diagramma di calibrazione lineare) in quanto ladeviazione standard (s) puà variare con la concentrazione.

mdCdS

==

sm

=

Limite di rivelabilità

Zona di Incertezza

Segnale del Bianco

Segnale

Quale è il segnale dell’analita distinguibile da quello del bianco?Quale è il segnale dell’analita distinguibile da quello del bianco?

SegnaleSegnale distinguibile dal Bianco

Segnale del Bianco

Limite di rivelazione

Bianco=soluzione che contiene tutti i componenti presente nel campione eccetto l’analita

definito come la somma del segnale medio del bianco Sbpiù un multiplo k (2 o 3) della deviazione standard del bianco (sb):

SLR = Sb + k sb0 LR (3 sb) LQ (10 sb)

Il limite di rivelabilità (LOD)è la più piccola concentrazione di analita che ha un segnale significativamente distinguibile dal segnale del bianco

Analita non rivelabile

Regione di rivelabilità

Regione di quantificazione

Il LDD espresso in unit à di concentrazione si ricava da Sstramite la curva di calibrazione.

Il limite di quantificazione (LOQ)

• È il limite oltre il quale è legittimo eseguire misure quantitative.

SLQ = Sb + k sb •(K=10)

Un’analisi si può definire quantitativa solo se il segnale è maggiore di 10 volte la deviazione standard del bianco.

Procedura per la valutazione del LOD e del LOQ è dettagliata qui di seguito:

• analizzare 10 campioni indipendenti di bianco o, alternativamente, 10 campioni indipendenti di bianco fortificato con la minima concentrazione accettabile (che produce un segnale misurabile, ma diverso da zero,

• determinata in base a prove preliminari);• • valutare la deviazione standard dei campioni

analizzati;• • se non è già stata valutata, stimare la pendenza della

curva di calibrazione analizzando almeno 4¸6 soluzioni standard;

• • calcolare il LOD e il LOQ.

Linearità• Deve essere verificata attraverso il calcolo del coefficiente di

correlazione della curva di taratura eseguita, quando possibile, con aggiunte standard alla matrice da analizzare. Curve di taratura su matrici diverse o in soluzioni standard (contenenti soltanto il solvente e l'analita) possono essere utilizzate previa specificazione delle motivazioni nel metodo di prova. Sono generalmente accettati coefficienti di correlazione (r secondo il metodo dei minimi quadrati) pari almeno a 0,99.

• Una non-linearità significativa dovrebbe essere corretta mediante l'utilizzo dì funzioni di taratura non lineari o eliminata restringendo l’intervallo di concentrazioni in cui si opera.

Esattezza• Grado di concordanza tra il valore medio

ottenuto a partire da un grande insieme dìrisultati di prova, e un valore dì riferimento accettato

• Questo parametro è influenzato dagli errori sistematici dovuti all’operatore, errori strumentali e metodologici.

Per la valutazione dell’esattezza:

• Confronto con un metodo analitico di ordine metrologico superiore

• Analisi di idonei materiali di riferimento certificati a diversi livelli di concentrazione

• Confronto con i valori attesi in studi collaborativi (circuiti interlaboratorio)

• Analisi di idonei campioni costruiti aggiungendo alla matrice quantitàcertificate di analita (Spike) a diversi livelli di concentrazione

Precisione

• Rappresenta la vicinanza di misure ripetute al medesimo valore

• E’ influenzata dagli errori casuali dovuti a irriproducibilità dell’operatore, cause strumentali e metodologiche. Non sono ELIMINABILI possono essere quantificati mediante stima della deviazione standard.

Ripetibilità

• concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenutì con lo stesso metodo su materiali ídentici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo brevi (stessa serie analitica)

Precisione intermedia• Concordanza tra risultati di prova

indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su material identici, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, usando la stessa apparecchiatura e in intervalli di tempo lunghi (diverse serie analitiche con possibilità di cambiamento del lotto dei reattivi e dei materiali di consumo).

Riproducibilità

• concordanza tra risultati di prova indipendenti ottenuti con lo stesso metodo su materiali identici, in laboratori diversi, da operatori diversi, usando apparecchiature diverse e in intervalli di tempo diversi

Per valutare la Precisione si possono usare:

• Campioni reali• Materiali di riferimento certificati nella

stessa matrice• Materiali di riferimento in matrice ottenuti

per aggiunta alla matrice stessa di soluzioni della sostanza pura

Esempio: {94, 90, 93, 86, 96, 98, 88, 90, 93}(valore vero=θ)

stima dell'inaccuratezza:

= (94+90+ ... 93)/9 = 828/9 = 92

= - θ = 92 - 90 = 2 mg/dl

% = / θ = 2 / 90 = 2.22%

x

xd

dd

stima dell'imprecisione:D = (94-92)2 + (90-92)2 + ... +(93-92)2 = 118s2 = 118/(9-1) = 14.75s = = 3.841 ( )

11

2

−

−∑=

n

yyn

ii14.75

S=CV% = s / θ = 3.841/90 = 4.27%

Accuratezza e precisione

Accurato e preciso

Accurato ma poco preciso

Valore vero Valore vero

Inaccurato ma molto preciso

Inaccurato e poco preciso

Valore veroValore vero Valore vero

Robustezza

• Insensibilità a piccole variazioni dei parametri sperimentali

• Variazioni deliberate

% solventi organici

pH

temperatura

Flusso

La cromatografia é una tecnica di separazioneseparazionedi vari componenti di una miscela

Fu ideata nel 1906 dal russo Tswett...la sua tecnica sperimentale, su una soluzione di clorofille, evidenziò la separazione dei vari pigmenti utilizzando una colonna di vetro riempita con carbonato di calcio diede luogo alla formazione di strati di diverso colore (da cui il nome: 'cromos'-colore).

METODI CROMATOGRAFICIMETODI CROMATOGRAFICI

Le tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantifiLe tecniche cromatografiche permettono la separazione e quantificazione cazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissidei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime me applicazioni.applicazioni.

Nei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separanNei metodi cromatografici i componenti di una miscela si separanoodistribuendosi tra due fasi:distribuendosi tra due fasi:

•• una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido una fase stazionaria (un solido o un liquido su supporto solido inerte)inerte) ‏‏

•• una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su una fase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella quella stazionaria.stazionaria.

La separazione La separazione èè dovuta principalmente alle relative affinitdovuta principalmente alle relative affinitàà per la fase per la fase stazionaria.stazionaria.

Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile Nella cromatografia liquida (LC) la fase mobile èè un liquido, nella gas un liquido, nella gas cromatografia (GC) la fase mobile cromatografia (GC) la fase mobile èè un gas.un gas.

37

Indicando con Cm e Cs le sue concentrazioni nella fase mobile e nella fase

stazionaria rispettivamente, e supponendo che le condizioni sperimentali

siano tali da conseguire il raggiungimento di equilibri successivi del tipo:

Cm ↔ CS

possiamo rappresentare con K la corrispondente costante di equilibrio:

K = Cs / CmK prende il nome di coefficiente di distribuzione.

E’ dal valore di K che dipende il tempo di ritenzione, cioè il tempo che occorre

per percorrere l’intera fase stazionaria. Infatti il tempo che una sostanza

trascorre nella colonna dipende dal valore di Cs rispetto a Cm: così,

un’elevata concentrazione nella fase stazionaria, rispetto a quella nella fase

mobile, indica una maggiore affinità per la prima.

Il principio: la distribuzione delle sostanze tra due fasiConsideriamo un sistema formato da due fasi in cui viene introdotta una sostanza: la sostanza si distribuirà fra le due fasi a seconda delle sue particolari proprietà chimico-fisiche.

In altre parole, l’eluente (fase mobile) incontrerà una certa difficoltà nel

trascinare con sé alcune sostanze, mentre altre, relativamente più affini ad

esso e meno verso la fase stazionaria, verranno più facilmente dislocate dalle

posizioni che occupano e trasportate così verso la fine della colonna,

separandosi sempre di più dalle sostanze maggiormente trattenute.

L'esperimento fondamentale della cromatografia

Supponiamo di avere una colonna riempita uniformemente di un materiale solido in granuli di dimensioni omogenee (la cosiddetta fase stazionaria, o fase fissa).

All'inizio della colonna si deposita la miscela contenente le sostanze da separare.

Si fa scorrere poi un solvente (la fase mobile, detta eluente): la fase mobile trascinerà in modo diverso le diverse sostanze lungo la colonna, a seconda della loro affinità verso le due fasi.

Tale effetto può essere ricostruito, anche numericamente, immaginando che nei vari strati della colonna si effettui una serie di estrazioni successive in cui si raggiunge l'equilibrio corrispondente al coefficiente di distribuzione.

Effettuando infatti una simulazione numerica di tale successione di “micro-equilibri” si ottengono facilmente grafici che mostrano il procedere della separazione, con la distribuzione di ogni sostanza secondo i picchi di concentrazione (di forma 'gaussiana') tipica dei cromatogrammi:

K=1

Rappresentazione schematica del processo di distribuzione di una sostanza tra la fase stazionaria S e la fase mobile M.

Visualizzazione della separazioneVisualizzazione della separazione

Ponendo allPonendo all’’uscita della colonna uscita della colonna un rivelatore che misuri la un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto concentrazione del soluto nellnell’’eluitoeluito (cio(cioèè la fase mobile che la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo si segnale in funzione del tempo si può ottenere un può ottenere un

cromatogrammacromatogramma

La posizione dei picchi sullLa posizione dei picchi sull’’asse asse dei tempi, o dei tempi, o tempo di ritenzionetempo di ritenzione, , serve per identificare i componenti serve per identificare i componenti del campionedel campione

LL’’area sottesa dai picchi area sottesa dai picchi èèproporzionale alla quantitproporzionale alla quantitàà di ogni di ogni singolo componente e può essere singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativoutilizzata a scopo quantitativo

Il tracciato completo che si ottiene per ciascuna sostanza eluita è detto picco cromatografico. In condizioni cromatografiche ideali il picco cromatografico ha la forma di una curva gaussiana. Da un punto di vista matematico una curva gaussiana viene descritta dal punto di massimo e dalla distanza tra i punti di flesso (tale distanza diviso 2 è la deviazione std. (σ)

• Altezza del picco: distanza tra il punto massimo e la tangente alla linea di base• Larghezza della base del picco (W): lunghezza del segmento interpolato all’intersezione fra le tangenti ai flessi della

gaussiana e la linea di base (Wb = 4 σ)• Larghezza a metà altezza: larghezza misurata a metà altezza del picco (WH = 2.354σ)• Distanza fra i punti di flesso: segmento interpolato fra i due punti di flesso (corrsipondente al 60.7% altezza picco) (Wi = 2 σ)• Area totale sottesa: proporzionale alla concentrazione

Tempo di ritenzione

Il tempo di ritenzione tIl tempo di ritenzione tRR èè il tempo che impiega un componente della il tempo che impiega un componente della miscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad esmiscela iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere sere rivelato come picco dal detector. rivelato come picco dal detector.

Un tipico Un tipico cromatogrammacromatogramma per una miscela a due componenti ha due per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse:situazioni diverse:il picco il picco a sinistraa sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, tmorto, tMM

il picco il picco a destraa destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo tcon la fase stazionaria ed esce al tempo tRR > t> tMM

•• Tenenco conto del flusso della fase mobile Tenenco conto del flusso della fase mobile (F) si possono considerare anche i volumi (F) si possono considerare anche i volumi esattamente e si avresattamente e si avràà;:;:

•• Vr = F trVr = F tr•• Vm = F tmVm = F tm

•• La relazione tra la costante e i parametri La relazione tra la costante e i parametri del picco del picco èè espressa dallespressa dall’’equazione equazione fondamentale della cromatografiafondamentale della cromatografia

VVRR== VVMM+ K+ Kdd⋅⋅VVSS dove dove VVRR== volume di ritenzione di una data sostanzavolume di ritenzione di una data sostanzaVVMM= volume morto (o volume della fase mobile) = volume morto (o volume della fase mobile) VVSS = volume della fase stazionaria= volume della fase stazionaria

QuestQuest’’ultima variabile, a ultima variabile, a differenza di Vdifferenza di VR R e Ve VM M , non , non èè misurabile facilmente per misurabile facilmente per cui rende difficile il calcolo cui rende difficile il calcolo di Kdi Kdd a partire dal a partire dal cromatogrammacromatogramma

•• Si preferisce allora, invece di KSi preferisce allora, invece di Kdd, far riferimento al , far riferimento al fattore di fattore di ritenzioneritenzione, espresso come le , espresso come le molimoli distribuite tra le due fasidistribuite tra le due fasi

k = nk = nss/n/nMM•• Si può dimostrare che questo parametro Si può dimostrare che questo parametro èè determinabile da determinabile da

valori del cromatogramma secondo la relazionevalori del cromatogramma secondo la relazionek = tk = t’’RR / t/ tMM

AnchAnch’’esso dipende dalla temperatura e dalla coppia delle fasi esso dipende dalla temperatura e dalla coppia delle fasi in uso ma anche dalle caratteristiche dellin uso ma anche dalle caratteristiche dell’’impaccamento, dalla impaccamento, dalla granulometria e dallo spessore della fase stazionaria.granulometria e dallo spessore della fase stazionaria.

•• Buone separazioni si hanno se la prima sostanza eluita ha k Buone separazioni si hanno se la prima sostanza eluita ha k superiore a 1. Quelle successive devono comunque avere k superiore a 1. Quelle successive devono comunque avere k non superiori a 10non superiori a 10--15 onde evitare tempi lunghi per le analisi ed 15 onde evitare tempi lunghi per le analisi ed eccessiva dispersione (i picchi si appiattiscono troppo)eccessiva dispersione (i picchi si appiattiscono troppo)

•• La La selettivitselettivitàà indica la capacitindica la capacitàà di un sistema cromatografico di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse con velocitdi eluire specie chimiche diverse con velocitàà tali che escano tali che escano separate dalla colonna. separate dalla colonna.

La selettivitLa selettivitàà verso due verso due sostanze di un sistema sostanze di un sistema cromatografico viene cromatografico viene espressa dal cosiddetto espressa dal cosiddetto fattore di separazionefattore di separazione

αα = = tt’’’’R2R2//tt’’’’R1R1espresso anche comeespresso anche come

αα = k= k22/k/k11 = K= Kd2d2/K/Kd1d1La selettivitLa selettivitàà dipende dal dipende dal meccanismo della meccanismo della separazione cromatograficaseparazione cromatograficae deve essere maggiore di e deve essere maggiore di 1,2. 1,2.

DIVERSA SELETTIVITA’

ALLARGAMENTO BANDAALLARGAMENTO BANDA• Ogni picco è caratterizzato da una ampiezza (w).

W = Larghezza della base del piccoW1/2 = Larghezza a metà altezza di un piccocromatografico

L’allargamento della banda che si riflette in un allargamento delpicco è funzione del tempo che il soluto passa nella colonna.Maggiore è il tR maggiore èl’allargamento della banda.

FATTORI CHE CAUSANOL’ALLARGAMENTO DEL PICCO

• 1) DIFFUSIONE LONGITUDINALE

• 2)TRASFERIMENTO DI MASSA IN FASEMOBILE (LENTO RAGGIUNGIMENTO

• 3)IRREGOLARITÀ NEL CAMMINO DELLA FASE MOBILE (PERCORSI MULTIPLI)

Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con laLe molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con lastessa velocitstessa velocitàà: la loro dispersione ha generalmente un profilo : la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresentGaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la a la velocitvelocitàà media.media.

I I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono:fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono:

•• percorsi multiplipercorsi multipli;;

Due sono le soluzioni teoricamente possibili: •utilizzare particelle molto piccole, in modo che i vari cammini risultino poco differenti• utilizzare particelle con granulometria costante

Particelle di silicediametro medio di10 µm

Particelle di silicediametro medio di 5 µm

2) 2) Diffusione longitudinaleDiffusione longitudinale (diffusione delle (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela allin direzione parallela all’’asse della colonnaasse della colonnaQuesto EFFETTO è tanto MENOPRONUNCIATO QUANTO PIÙ ELEVATA È LAVELOCITÀ DELLA FASE MOBILE (l’analita passameno tempo all’interno della colonna).

Diffusione molecolare longitudinale: Le molecole della sostanza si muovono spontaneamente in direzione longitudinale, sia nel senso di scorrimento della fase mobile sia in quello opposto. L’allargamento della banda per effetto della diffusione molecolare dipende dal tempo di permanenza dell’analita nella fase mobile e dalla diffusitività del soluto.

Per minimizzare la diffusione molecolare longitudinale si può aumentare il flusso della fase mobile e agire sulla viscosità dell’eleuente

3)trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria.

Questo effetto,dovuto al fatto che il soluto richiede un po’ di tempo per equilibrarsi tra FM e FS, è tanto maggiore quanto più è veloce la fase mobile.

Fase mobile

Fase stazionaria

Fase mobile

Fase stazionaria

Fase mobile

Fase stazionaria

Il trasferimento di massa è un processo che aumenta all’aumentare della velocità della fase mobile.

L’ALLARGAMENTO DEL ALLARGAMENTO PICCO HA UN RUOLO

FONDAMENTALE SULLA SEPARAZIONE DEIDIVERSI COMPONENTI

Se due picchi adiacenti sono entrambi larghi, si sovrappongono,con il risultato di una separazione incompleta. La probabilità di sovrapposizione sarà tanto minore quanto piùstretti saranno i picchi. In questo caso, infatti, anche con piccole differenze nei tempi di ritenzione le separazioni saranno complete.

EFFICIENZAEFFICIENZA

• LA CAPACITÀ DI PRODURRE PICCHI STRETTI È UNA CARATTERISTICA DI OGNI COLONNA

È correlata alla forma del picco cromatografico.E’ inversamente proporzionale all’ampiezza del picco

UNA COLONNA SARÀ TANTO PIÙ EFFICIENTE QUANTO PIÙ SONO STRETTE LE BANDE DEI SOLUTI

UNA COLONNA SARÀ TANTO PIÙ SELETTIVA QUANTO MAGGIORE è LA DIFFERENZA DEI tR DI 2 PICCHI

EFFICIENZA: Piatti teorici• I termini numero di piatti teorici (N) e altezza del piatto

(HETP, Height Equivalent to Theoric Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici ed in particolare l’efficienza

N = 16 (tR/w)2

HETP = L /NHETP = L /N

••Il sistema cromatografico Il sistema cromatografico èè immaginato come una colonna immaginato come una colonna composta da una serie di strati sottili chiamati composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teoricipiatti teorici; ; ••in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza ll’’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna fase mobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna èèdovuto alldovuto all’’azione dinamica della fase mobileazione dinamica della fase mobile••EE’’ importante precisare che N importante precisare che N nonnon èè un parametro un parametro caratteristico per una data colonna, poichcaratteristico per una data colonna, poichéé dipende anche dipende anche dalla sostanza eluita.dalla sostanza eluita.Ciò significa che una stessa colonna attraversata da due Ciò significa che una stessa colonna attraversata da due sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.sostanze mostra due diversi valori di piatti teorici.

•• Il numero di piatti dà informazioni sul potere di separazione della colonna. Per esempio, una colonna di 12000 piatti ha un potere di separazione molto piùgrande di una che ne ha solo 3000.

• Per sistemi impaccati si possono avere valori tra 1000 e 10000.

• Le colonne capillari (in GC) possono fornire tra 10000 e 500000 piatti teorici.

•• Colonne capillari (GC) sono più efficienti di quelle

impaccate per HPLC

i picchi sono piùstretti

si hanno migliori

separazioni

Aumentando i piatti

Il modo piIl modo piùù semplice per aumentare il numero dei piatti semplice per aumentare il numero dei piatti consiste nellconsiste nell’’aumentare la lunghezza della colonna ma ciò aumentare la lunghezza della colonna ma ciò comporta un comporta un notevole aumentonotevole aumento dei tempi di ritenzione.dei tempi di ritenzione.In alternativa si deve trovare un modo di diminuire le In alternativa si deve trovare un modo di diminuire le dimensioni di un singolo piatto. A paritdimensioni di un singolo piatto. A paritàà di lunghezza una di lunghezza una colonna sarcolonna saràà pipiùù efficiente quando viene minimizzata efficiente quando viene minimizzata ll’’altezza equivalente al piatto teorico altezza equivalente al piatto teorico

H = L/N H = L/N dove L dove L èè la lunghezza della colonna. la lunghezza della colonna.

Equazione di van Deemter

• Il sistema cromatografico grafico ètanto più efficiente quanto più è basso il valore di HEPT (ideale HEPT 0)

H= A+B/u+Cu:

U = velocità lineare della fase mobile =L/tm con L= lunghezza colonna e tm= tempo morto

A= 2λdp B= 2γDM

L’equazione di Van Deemter

La funzione H= f(ū) può essere descritta da una equazione del tipo:

y = a+ b/x + cx

e può essere considerata la combinazione lineare di tre equazioni più semplici:

y = a

y= b/x (iperbole equilatera)

y= cx y = a+ b/x + cx

y= cx

y = a

y= b/x

Variabili che influenzano l’efficienza di una colonna:

La principale variabile che influenza lLa principale variabile che influenza l’’efficienza di una colonna efficienza di una colonna èè la velocitla velocitàà di flusso di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il telineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di contatto tra fase mpo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria.mobile e fase stazionaria.

LL’’altezza equivalente del piatto teorico, H, il altezza equivalente del piatto teorico, H, il parametro che descrive lparametro che descrive l’’efficienza della efficienza della colonna, dipende proprio dalla velocitcolonna, dipende proprio dalla velocitàà di di flusso della fase mobile (vedere Figura a flusso della fase mobile (vedere Figura a lato).lato).

Sia in LC che in GC la velocitSia in LC che in GC la velocitàà di flusso di flusso ottimale ottimale èè piuttosto bassa.piuttosto bassa.

Quella ottimale della LC Quella ottimale della LC èè inferiore a quella inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocittroppo elevati, in LC si usano velocitàà un poun po’’maggiori di quella ottimale.maggiori di quella ottimale.

La LC La LC èè caratterizzata da valori di H inferiori caratterizzata da valori di H inferiori alla GCalla GC..

In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC:In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50 m; LC: < 50 cm), la GC < 50 cm), la GC èècomunque caratterizzata da valori picomunque caratterizzata da valori piùù elevati di N, e quindi da migliore efficienza.elevati di N, e quindi da migliore efficienza.

H=L/N

RISOLUZIONE

• L’obiettivo della cromatografia è la separazione dei componenti di una miscela.

• La RISOLUZIONE descrive quantitativamente il• risultato ottenuto.• È, quindi, una misura quantitativa della sua

capacità di separare gli analiti A e B.• SI HA RISOLUZIONE QUANDO SULLA LINEA

DI BASE VI È UNA SOVRAPPOSIZIONE NON SIGNIFICATIVA DI DUE PICCHI ADIACENTI.

La risoluzione permette di caratterizzare

la bontà di separazione tra due picchi

tR2 – tR1w1 + w2

2Rs=

La risoluzione, quindi, dipende sia dalla bontà di separazione tra i massimi dei picchi (selettività al numeratore) che dall’ampiezza dei picchi (efficienza al denominatore)

RISOLUZIONE E SEPARAZIONERISOLUZIONE E SEPARAZIONE

La risoluzione fra due picchi può anche essere posta in relazione con il numero di piatti teorici

(N), con la selettività (α) e con il fattore di ritenzione (k).

Rs =1

4

N2

α - 1

α

k2

1+k2

( () )

Ove N2 e k2 si riferiscono al secondo picco (più lento

CRITERI DI SCELTA DELLECONDIZIONI DI SEPARAZIONE

Effetto della variazione per unadata separazione cromatografica didue componenti dipendente da:

a) Variazione fattore dicapacità K’

b) Aumento del n° di piattiteorici (aumento efficienza)

c) Aumento fattore diselettività

VARIAZIONI DI K’

• K’ è funzione del soluto e del solvente.• Variando preferibilmente la composizionedella fase mobile (non quella fissa che èdeterminata al momento della preparazionedella colonna) varia il valore di K’

I tR sono legati alle Kd fra fase mobile e fasestazionaria; variando, quindi, una delle due fasi (o entrambe) cambiano i tR di ogni soluto.Scegliendo ad es selettivamente una fase stazionaria in modo che questa interagisca preferenzialmente con uno dei soluti, se ne aumenta il tR.

VARIAZIONI DI N(EFFICIENZA)

Se si aumenta N, si ottiene un restringimento dei picchi

lasciando, però, inalterato il valore di tR. Ciò determina,comunque, un miglioramento della risoluzione.

N dipende da parametri quali:1. lunghezza della colonna,2. impaccamento della

colonna,3. velocità del flusso.

VARIAZIONI DI α(SELETTIVITÀ)

• significa variare selettivamente il tempo di ritenzionedi un soluto, cambiando le condizioni in modo tale da influenzare la ripartizione tra fase stazionaria e fasemobile di un solo componente e non dell’altro.• si sfruttano interazioni selettive che coinvolgono soltanto uno dei due soluti:(es. miscela di R-COOH + RCHO, si fa variare il pH)

CROMATOGRAFIA

COLONNA PLANARE

TLC Carta

Adsorbimento Ripartizione

GCLC

Esclusione

Fase Normale(fase stazionaria polare fase mobile non-polare)

Fase inversa(fase stazionaria non-polare

fase mobile polare)

Scambio ionico

Meccanismi della separazioneMeccanismi della separazione

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividIn base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i ere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:

adsorbimentoadsorbimentoripartizioneripartizionescambio ionicoscambio ionicoesclusioneesclusioneaffinitaffinitàà

1) AdsorbimentoLa fase stazionaria é un solido sulla cui superficie si trovano dei siti attivi in grado di stabilire legami secondari (dipolo-dipolo, ponte di idrogeno, Van der Waals) con le diverse molecole della miscela da risolvere (separare). Se la fase mobile éun liquidoliquido si parla di cromatografia liquido-solido (LSC), se invece é un gasgas, di cromatografia gas-solido (GSC).In genere, le molecole che più facilmente vengono fissate sono quelle che presentano gruppi polari, anche se la natura dell’adsorbente influisce sul fenomeno. L’aumento di temperatura agisce negativamente sull’adsorbimento in quanto provoca una maggior agitazione termica.

Gruppi silanolici liberi: mediamente acidi: a pH 2-3 sono completamente protonati; a pH > 3 si dissociano a gruppi Si-O-. I gruppi Si-O- trattengono fortemente i composti basici possono (effetto di scodatura)Silanoli geminiali: non acidiSilanoli vicinali: non acidi

Le particelle di gel di silice possono costituire la fase stazionaria per la cromatografia a fase normale di adsorbimento oppure la base per le fasi legate

Adsorbimento: picchi Adsorbimento: picchi scodati`scodati`

2) RipartizioneLa fase stazionaria é un liquido, in cui si verifica una vera e propria solubilizzazione delle sostanze da analizzare. Esse pertanto si ripartiscono fra le due fasi (immiscibili tra loro)).).

liq-liq: fase stazionaria è adsorbita fisicamente al supportofasi legate: f. stazionaria è legata chimicamente Supporti: gel di silice, polvere di cellulosa, amido.

Isoterme sono lineari e quindi i picchi sono simmetricifasi legate (le più diffuse)

FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP)FASI SILICEE CHIMICAMENTE LEGATE (BP)

La fase stazionaria liquida viene legata ai silanoli della silice per reazione con un silano contenente un gruppo reattivo (es. cloro).

L’atomo di silicio è legato alla molecola della fase desiderata (qui mostrata come C18 o octadecil) e a due piccoli gruppi laterali come il metile.

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

Si

OH

SiH3C

Cl CH3

SUPPORTO SILICEO

FASE STAZIONARIA LIQUIDA

DERIVATIZZAZIONE DELLA SILICEDERIVATIZZAZIONE DELLA SILICE

Molti dei silanoli superficiali non reagiscono a causa dell’ingombro sterico. I silanoliche non reagiscono sono spesso chiamati “silanoliliberi”. Questo fenomeno ètanto più rilevante quanto maggiore è l’ingombro del legante(es. C18).

Il grado di ricopertura, espresso in µmol/m2, è una misura della densità di fase sulla superficie della particella.

SiH3C

CH3

SiH3C

CH3

SiH3C

CH3

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

I silanoli liberi sono disponibili per altre interazioni con le molecole di soluto, spesso indesiderate (sono causa dei picchi scodati). Viene quindi spesso effettuato un processo di end-cappingutilizzando un silano di piccole dimensioni che si lega ai silanoli liberi. Piccoli silanicome il trimetilclorosilano sono in grado di accedere a molti dei silanoli liberi rimasti dopo il legame della fase stazionaria. Il processo di end-capping rende i silanoli inaccessibili alle molecole di soluto.

SiH3C

CH3Si

H3C

CH3

SiH3C

CH3

Si

O

Si

OH

Si

OH

Si

O

Si

OH

Si

O

SiCH3 CH3

CH3Cl

• Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria èpolare (ad es. silice, R= NH2,….), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari.

• Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile èpolare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari.

• Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

La fase stazionaria é costituita da molecole contenenti gruppi attivi, dotati di cariche gruppi attivi, dotati di cariche elettricheelettriche (positive o negative), i quali sono in grado di scambiare i propri controioni con la soluzione da cui vengono lambiti, attraverso un meccanismo di competizione tra gli ioni della fase stazionaria e quelli con la stessa carica contenuti nella fase mobile. Anche in questo caso la separazione avviene secondo un criterio di affinità per la fase stazionaria, criterio dettato dalla maggiore o minore competitività

I principali meccanismi chimico-fisici della separazione cromatografica si basano su:

SCAMBIO IONICO

Il meccanismo di scambio Il meccanismo di scambio ionicoionico

•• 1)Diffusione dello ione alla superficie della resina.1)Diffusione dello ione alla superficie della resina.•• 2)Diffusione dello ione attraverso la matrice della resina verso2)Diffusione dello ione attraverso la matrice della resina verso il sito di il sito di scambioscambio..•• 3)Spiazzamento dello ione al sito di 3)Spiazzamento dello ione al sito di scambioscambio..•••• 4)Diffusione del 4)Diffusione del controionecontroione attraverso la resina. attraverso la resina. •• 5)Distacco selettivo, a opera di un eluente, e diffusione della 5)Distacco selettivo, a opera di un eluente, e diffusione della molecola nella soluzione molecola nella soluzione

esterna. L'eluizione selettiva delle molecole legate alla resinaesterna. L'eluizione selettiva delle molecole legate alla resina si ottiene variando il pH o la si ottiene variando il pH o la forza ionica o entrambi, oppure mediante l'eluizione di affinitforza ionica o entrambi, oppure mediante l'eluizione di affinitàà. In quest'ultimo caso viene . In quest'ultimo caso viene introdotto nel sistema uno ione dotato di maggiore affinitintrodotto nel sistema uno ione dotato di maggiore affinitàà per lo scambiatore di quella della per lo scambiatore di quella della molecola legata. molecola legata.

Caratteristiche:Caratteristiche:• •Capacità di scambio: n meq. di ioni scambiabili per g di resina secca

(meq/g)• • Capacità di scambio in volume: (meq/cm3)• • Grado di reticolazione: n di monomeri di reticolante (DVB) per 100 moli di

polimerizzante (stirene)• • Selettività: possibilità di trattenere più o meno fortemente alcuni ioni rispetto ad

altri. Dipende dal grado di reticolazione dalla cost di eq. di scambio, dal pH, dal raggio e dalla carica dello ione.

• APPLICAZIONI:• Desalinizzazione : si fa passare la soluz. Salina in resina cationica in forma

idrogenionica e su resina anionica in forma ossidrilica• Addolcimento di un’ acqua dura: Si fa passare l’acqua su resina cationica• Separazione di amminoacidi: si usa resina cationica e f. mobile tamponi a pH

diversi• separazione di molecole organiche cariche• separazione di ioni metallici (es. Ca2+ e Mg2+)• separazione di proteine e polisaccaridi ricorrendo a matrici di cellulosa,

• La scelta dello scambiatore dipende dalla stabilità del campione, dal peso molecolare dei suoi componenti e dalle esigenze che la separazione presenta.

• Molti composti d'interesse biologico, soprattutto le proteine, sono stabili solamente in uno stretto intervallo di pH, per cui lo scambiatore dovràfunzionare entro i limiti di questo intervallo.

• Se il campione è più stabile a valori di pH inferiori al suo punto isoionico, cioè quando ha una carica netta positiva, si dovrà usare uno scambiatore di cationi, mentre sé è più stabile a valori di pH superiori al suo punto isoionico, cioè quando ha una carica netta negativa, si dovrà usare uno scambiatore di anioni.

• Se è stabile in un ampio intervallo di pH, si potranno usare entrambi i tipi di scambiatore.

• Anche nella scelta tra uno scambiatore forte e uno debole occorre valutare la stabilità del campione e l'effetto del pH sulla carica del campione.

• Gli scambiatori deboli vanno bene per separare elettroliti forti.

Generalmente, nel caso di uno scambiatore di anioni, il pH del gradiente diminuisce e la forza ionica aumenta, mentre, nel caso di uno scambiatore di cationi, aumentano sia il pH che la forza ionica.

pH < PI prevalgono + La proteina si usa colonna a scambio cationico

pH > PI prevalgono - La proteina si usa colonna a scambio anionico

Colonna a scambio cationico

L’amminoacido si lega ad un valore di pH diverso dal suo PI e viene eluita avvicinando il pH al PI e/o aumentando la forza ionica.1.Se la proteina ha PI acido (Asp,..) eluira’a bassi pH2.Se la proteina ha PI alcalino (Lys) eluira’ a pH maggiori

Effetto forza ionica

• La forza ionica del mezzo viene• aumentata aggiungendo NaCl o• KCl o aumentando la• concentrazione del tampone

Nessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proNessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proteineteine

Le particelle di resina fungono da setacci molecolariLe particelle di resina fungono da setacci molecolari

SI DISTRIBUIRANNO TRA LA FASE MOBILE ALL’INTERNO ED ALL’ESTERNO DEL SETACCIO MOLECOLARE E TRANSITERANNO IN COLONNA

CON UNA VELOCITA’ INFERIORE

SARANNO COMPLETAMENTE ESCLUSE DAI PORI E QUINDI PASSERANNO ATTRAVERSO

GLI SPAZI INTERSTIZIALI E COMPARIRANNO PER PRIME NELL’ELUATO

Gel filtrazioneGel filtrazione•• Vantaggi Vantaggi

–– SempliceSemplice–– PrevedibilePrevedibile

•• SvantaggiSvantaggi–– Bassa capacitBassa capacitàà (piccoli volumi)(piccoli volumi)–– Soluzioni non viscoseSoluzioni non viscose

Ciò rende possibile Ciò rende possibile la separazione su un la separazione su un determinato gel di determinato gel di analitianaliti in un intervallo in un intervallo di dimensioni di dimensioni estremamente ristrettoestremamente ristretto

NN°° della frazionedella frazione(o volume dell(o volume dell’’eluato)eluato)

Con

cent

razi

one

prot

eica

tota

leC

once

ntra

zion

e pr

otei

ca to

tale

Inconvenienti:

1)Non può essere applicata a campioni aventi stresso PM (es. isomeri)

2)Si può avere solo un numero limitato di picchi perché la scala dei tempi del cromatogramma èlimitata

logP

Mlo

gPM

Volume di eluizioneVolume di eluizione

Intervallo di Intervallo di frazionamento (frazionamento (kDakDa)

Sephadex G-10 Destrano 0.05 - 0.7G-25 Destrano 1 - 5G-50 Destrano 1 - 30G-100 Destrano 4 - 150G-200 Destrano 5 - 600

Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 0.1 - 1.8P-6 Poliacrilammide 1 - 6P-10 Poliacrilammide 1.5 - 20P-30 Poliacrilammide 2.4 - 40P-100 Poliacrilammide 5 - 100P-300 Poliacrilammide 60 - 400

Sepharose 6B Agarosio 10 - 40004B Agarosio 60 - 200002B Agarosio 70 - 40000

Nome commercialeNome commerciale PolimeroPolimero)

SCELTA DELLA FASE MOBILE IN LC

La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia:

• nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante;

• nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica;

• nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile.

Non tutti i solventi possono essere utilizzati in LC.

Devono infatti possedere queste caratteristiche:

• devono essere miscelabili in diverse proporzioni

• non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi

• non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV)

•devono essere poco tossici e poco infiammabili

• devono essere non troppo costosi

La fase mobile più comune in LC a fase inversa (RP-HPLC) ècostituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

SERIE ELUOTROPICA E CUTOFF UV DI SOLVENTI PER FASI MOBILI

Eluizione isocratica e a gradiente

Variazione continua della composizione del solvente per aumentare la forza eluente. Una forza eluente crescente ènecessaria per eluire i soluti più fortemente trattenuti e per migliorare le separazioni.

Con 1 solo solvente o con una miscela di solventi di composizione costante.

ELUIZIONI ISOCRATICHE

ELUIZIONE A GRADIENTE

Gradiente di fase mobile

1. Alcol benzilico2. Fenolo3. 3’-4’dimetossiacetofenone4. Benzoino5. Benzoato di etile6. Toluene7. 2,6-dimetossitoluene8. o-metossibifenile

Tecniche cromatografiche

Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana. Le tecniche principali sono la cromatografia su strato sottile (Thin Layer Chormagraphy, TLC) e la cromatografia su carta (paper chromatography)

Cromatografia su colonna a bassa pressione : ampiamente utilizzata per separazione di miscele e non per analisi quantitativa

HPLCHPLC

HPLC

SOLVENTE

POMPA INIETTORE

COLONNA

DETECTOR

High Performance High Performance LiquidLiquidChromatographyChromatography (HPLC)(HPLC)

•• Elevato numero di piatti teoriciElevato numero di piatti teorici

•• Ridotta dimensione delle particelle di Ridotta dimensione delle particelle di matricematrice

•• Elevata pressione della colonnaElevata pressione della colonna

Fase mobile

detector

iniezione

pompe

HPLC = CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA

Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori.

A BC

A. crom.classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 µm, D = 20-50 mm, L = 50-200 cm)

B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40-70 µm, D = 1-3 mm, L = 50-100 cm)C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 µm, D = 2-6 mm, L = 10-50 cm)

d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna

118

LC classica: dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC; velocità di flusso molto basse;tempi di analisi lunghi.

Bassa efficienza e risoluzione

HPLC: impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; contropressioni maggiori;tempi d’ analisi contenuti.

Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di 10-100 e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile).

119

Colonne per HPLCColonne per HPLC

Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)

L’interfaccia universalmente utilizzata per introdurre il campione è la valvola a 6 (o 7) vie.

Iniezione e rivelazione in HPLC: Pompe e valvole di iniezione

A seconda del loop montato varia il volume del campione iniettato in colonna

• Sensibilità adeguata al problema

• Buona stabilità e riproducibilità

• Risposta lineare al soluto, possibilmente per parecchi ordini di grandezza

• Tempi di risposta rapidi

• Risposta verso tutti i soluti, oppure risposta selettiva verso una o più classi di soluti

Rivelatori

RivelatoreRivelatore LOD LOD (ng)(ng) SelettivitSelettivitàà Utilizzabile in gradiente?Utilizzabile in gradiente?

Assorbimento UVAssorbimento UV 0.10.1--11 selettivoselettivo SISI

Indice di rifrazioneIndice di rifrazione 100100--10001000 generalegenerale NONO

FluorescenzaFluorescenza 0.0010.001--0.010.01 selettivoselettivo SISI

ElettrochimicoElettrochimico 0.010.01--11 selettivoselettivo NONO

ConduttimetricoConduttimetrico 0.50.5--11 selettivoselettivo NONO

Assorbimento IRAssorbimento IR 10001000 selettivoselettivo SISI

Spettrometro di massaSpettrometro di massa 0.10.1--11 generalegenerale SISI

Rivelatore UV a λvariabile Il rivelatore UV a λ variabile è

sicuramente quello maggiormente utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla lampada a D2 e scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensità della luce trasmessa èmisurata attraverso un fotodiodo ed è proporzionale alla concentrazione dell’analita

Vantaggi

- Versatilità: possibilità di selezionare λ da 190 a 800 nm.

- Elevata sensibilità: potendo scegliere la λ ottimale (max assorbanza) per un analita.

- Selettività: quando si hanno sovrapposizioni di picchi si può variare la l in modo tale da minimizzare l’assorbimento degli interferenti.

- Possibilità di utilizzare gradiente di eluizione, scegliendo una λ alla quale la miscela solvente non assorbe.

Rivelatore UV a diodearray

Il rivelatore UV a λ diode array èquello che attualmente viene sempre più utilizzato in HPLC.

La luce UV proveniente dalla lampada a D2 passa attraverso una cella a flusso prima che venga scissa nelle sue componenti attraverso un monocromatore a gradini. L’intensitàdella luce trasmessa ad ogni λ èmisurata simultaneamente attraverso un array di alcune centinaia di fotodiodi. Un pc può processare, registrare e mostrare gli spettri in continuo durante l’analisi. Inoltre si possono registrare i crmatogrammi a ciascuna λ.

Vantaggi e svantaggi

Presenta gli stessi vantaggi in termini di versatilità, sensibilità e selettività del rivelatore a λ variabile. Fornendo anche gli spettri degli analiti, permette di effettuare anche il riconoscimento dei composti analizzati.

Svantaggio: è più costoso rispetto al rivelatore a λ variabile.