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Charakterisierung der lokalanästhesierenden Verbindungen im chinesischen Gewürz

Zanthoxylum schinifolium

Diplomarbeit von Vera Iseli Täuffelen BE und Bern BG

Durchgeführt am Institut für Pharmazeutische Biologie

Leitung: Prof. Dr. Matthias Hamburger

Betreuung: Dr. Olivier Potterat 14. Februar bis 8. Juli 2005

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Inhaltsverzeichnis I Tabellenverzeichnis ..............................................................3

II Abbildungsverzeichnis .........................................................4

III Abkürzungen .........................................................................5

IV Zusammenfassung................................................................6

1 Einleitung...............................................................................7 1.1 Traditionelle Chinesische Medizin........................................................ 7 1.1.1 Die pflanzlichen Arzneimittel der TCM ..................................................... 7 1.1.2 Zanthoxyli Pericarpium als Chinesische Droge „Huajiao“ [1] ................... 8 1.2 Zanthoxyli Pericarpium als Gewürz...................................................... 9 1.3 Familie der Rutaceae ............................................................................. 9 1.3.1 Systematik ............................................................................................... 9 1.3.2 Chemische Charakteristik ...................................................................... 10 1.3.3 Verbreitung ............................................................................................ 10 1.4 Gattung Zanthoxylum.......................................................................... 10 1.4.1 Systematik ............................................................................................. 10 1.4.2 Traditionelle Anwendung von Zanthoxylum ssp..................................... 11 1.4.3 Zanthoxylum bungeanum MAXIM.......................................................... 12 1.4.4 Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc. ................................................ 13 1.5 Alkylamide ............................................................................................ 14 1.5.1 Vorkommen............................................................................................ 14 1.5.2 Biosynthese ........................................................................................... 15 1.5.3 Alkylamide der Gattung Zanthoxylum .................................................... 15 1.5.4 Pharmakologische Wirkung und Verwendung ....................................... 16

2 Ziel der Diplomarbeit...........................................................18

3 Material und Methoden .......................................................19 3.1 Drogenmaterial..................................................................................... 19 3.2 Lösungsmittel und Chemikalien......................................................... 19 3.3 Laborgeräte .......................................................................................... 22 3.4 Probenaufbereitung............................................................................. 24 3.5 Extraktionsmethoden .......................................................................... 24 3.5.1 Wasserdampfdestillation ........................................................................ 24 3.5.2 Superkritische Fluidextraktion (SFE)...................................................... 25 3.5.3 Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE™).................................... 25 3.6 Organoleptische Prüfung .................................................................... 26 3.7 Aufreinigung der Extrakte ................................................................... 26 3.7.1 Präparative Dünnschichtchromatographie (DC)..................................... 26 3.7.2 Säulenchromatographie ......................................................................... 27 3.8 Analysemethoden ................................................................................ 28 3.8.1 Vergleich der Extrakte mittels Dünnschichtchromatographie ................. 28 3.8.2 Gaschromatographie (GC)..................................................................... 30 3.8.3 Gaschromatographie mit Massenspektrometrie (GC-MS) ..................... 31 3.8.4 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion (SFE)....................... 31 3.8.5 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) .................................... 31 3.8.6 Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie (LC-MS) ................. 32 3.8.7 Flüssigchromatographie mit Kernspinresonanz-Spektroskopie ............. 32

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4 Resultate ..............................................................................34 4.1 Extrakte................................................................................................. 34 4.2 Organoleptische Prüfung .................................................................... 35 4.3 Resultate der Aufreinigung der Extrakte ........................................... 35 4.4 Ergebnisse der Dünnschichtchromatographien ............................... 36 4.5 Ergebnisse der Gaschromatographie ................................................ 38 4.6 GC-MS................................................................................................... 41 4.7 HPLC-DAD-MS...................................................................................... 43 4.8 HPLC-NMR Analyse ............................................................................. 46

5 Diskussion ...........................................................................48

6 Danksagung.........................................................................53

7 Literaturverzeichnis ............................................................54

8 Anhang.................................................................................57

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I Tabellenverzeichnis Tabelle 3.1 Vergleich der Pflanzen ZB und ZS – Applikation der Proben................. 29 Tabelle 3.2 Vergleich der ASE Extrakte – Applikation der Proben ........................... 29 Tabelle 3.3 Vergleich der Pflanzen ZS, ZB und ZBG – Applikation der Proben ....... 29 Tabelle 3.4 Vergleich verschiedener HPLC-Proben – Applikation der Proben ......... 30 Tabelle 4.1 Extrakte aus Zanthoxylum bungeanum.................................................. 34 Tabelle 4.2 Extrakte aus Zanthoxylum schinifolium .................................................. 34 Tabelle 4.3 Extrakte aus Zanthoxylum bungeanum Gansu ...................................... 35 Tabelle 4.4 Resultate der Organoleptischen Prüfung ............................................... 35 Tabelle 4.5 Die Hauptkomponenten von ZB............................................................. 38 Tabelle 4.6 Die Hauptkomponenten von ZBG .......................................................... 39 Tabelle 4.7 Die Hauptkomponenten von ZS............................................................. 39 Tabelle 4.8 Die Anteile im ätherischen Öl der drei Pflanzen im Vergleich, ausgehend

von Zanthoxylum schinifolium ........................................................................... 40 Tabelle 4.9 NMR-Werte für Hydroxy-α-Sanshool (Hauptpeak, RT 16.89min) .......... 46 Tabelle 4.10 NMR-Werte für Hydroxy-β-Sanshool (RT 17.70min)............................ 47

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II Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1 Makroskopisches und Mikroskopisches Erscheinungsbild von

Zanthoxyli Pericarpium. ....................................................................................... 8 Abbildung 1.2 Zanthoxylum bungeanum .................................................................. 12 Abbildung 1.3 Zanthoxylum bungeanum Perikarp .................................................... 12 Abbildung 1.4 Zanthoxylum schinifolium................................................................... 13 Abbildung 1.5 Zanthoxylum schinifolium Perikarp .................................................... 13 Abbildung 1.6 Strukturen von ungesättigten Fettsäuren........................................... 15 Abbildung 1.7 Sanshoole und Bungeanoole aus Zanthoxylum bungeanum Perikarp

[19] ................................................................................................... 17 Abbildung 3.1 Destillationsapparatur wie sie gemäss Pharmakopöe verwendet wird24 Abbildung 4.1 DC mit LM A, LM B und LM C zum Vergleich von ZB und ZS bei VIS36 Abbildung 4.2 DC mit Laufmittel B bei UV und bei VIS............................................. 37 Abbildung 4.3 DC in Laufmittel C und B, die beiden Banden in der Mitte sind die ASE

Extrakte ............................................................................................................. 37 Abbildung 4.4 DC mit Laufmittel A und B im VIS, Vergleich ätherische Öle mit S1

Extrakten ........................................................................................................... 38 Abbildung 4.5 GC-MS Chromatogramm von S1 (A) und SÖl (B) ............................. 41 Abbildung 4.6 HPLC-Chromatogramm der drei Pflanzen ......................................... 43 Abbildung 4.7 UV-Spektren der drei Hauptpeaks aus dem HPLC-Chromatogramm

von Z. schinifolium............................................................................................. 44 Abbildung 4.8 Chromatogramm mit Massenspektren der drei Hauptpeaks.............. 45

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III Abkürzungen Abb. Abbildung ASE Accelerated Solvent Extraction / Beschleunigte

Lösungsmittelextraktion d Doublett DAD Diode Array Detector DC Dünnschichtchromatogramm oder Dünnschichtchromatographie ESI Electro Spray Ionisation et al. et alii / und andere EtOAc Ethylacetat EtOH Ethanol F254 Fluoreszenzindikator FID Flammenionisations Detektor GC Gaschromatographie GC-MS Gaschromatographie-Massenspektrometrie HPLC High Performance Liquid Chromatography k.A. keine Angaben LC Liquid Chromatography = HPLC LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry coupled LC-NMR Liquid Chromatography- Nuclear Magnetic Resonance coupled LM Laufmittel mAU milli Absorption Units m Multiplett MeCN Acetonitril MeOH Methanol NIST National Institute of Standards and Technology NMR Nuclear Magnetic Resonance pulv. pulverisiert q Quadruplett Rf Retentionsfaktor RP Reversed Phase RT Retentionszeit s Singulett SFE Supercritical Fluid Extraction / Superkritische Flüssigextraktion SPE Solid Phase Extraction / Festphasen Extraktion t Triplett Tab. Tabelle TCM Traditionelle Chinesische Medizin TFA Trifluor Essigsäure UV Ultraviolett Vis Sichtbarer Bereich (Licht) ZB Zanthoxylum bungeanum aus Beijng ZBG Zanthoxylum bungeanum aus Gansu ZS Zanthoxylum schinifolium

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IV Zusammenfassung In China wird Zanthoxyli Pericarpium als pflanzliches Heilmittel und als Gewürz verwendet. Die Schärfe von diesem Gewürz ist unverkennbar, denn sie ist prickelnd bis schmerzhaft und hat einen lokalanästhetischen Effekt auf Zunge und Mundschleimhaut. Aus Zanthoxylum bungeanum wurden Alkylamide isoliert, die für diese Wirkung verantwortlich sind. Alkylamide sind Fettsäurereste die über eine Säureamidbindung mit einem Isobutylrest verknüpft sind. Sie kommen im Pflanzenreich nur in wenigen Familien vor und haben vielseitige Anwendungen und Wirkungen. Unter Anderem wurde dem Hydroxy-α-Sanshool die lokalanästhesierende Wirkung durch Reizung des Trigeminusnervs nachgewiesen. Es stellte sich nun die Frage ob auch in Z. schinifolium Alkylamide nachgewiesen werden können. Alle Methoden wurden mit Extrakten aus Z. bungeanum und Z. schinfolium durchgeführt. Zur Charakterisierung der Inhaltsstoffe wurden verschiedene untoxische Extrakte hergestellt, sowie das ätherische Öl gewonnen. Durch eine organoleptische Prüfung wurden diese Extrakte mit dem stärksten lokalanästhesierenden Effekt ausgewählt. Die SF-CO2-Extrakte wurden genauer mittels HPLC-DAD-MS untersucht. Die Struktur der zwei Hauptpeaks konnten mittels LC-NMR aufgeklärt werden. Weiter wurde das ätherische Öl mittels GC und GC-MS untersucht. Mit Hilfe der NIST Datenbank konnten die Inhaltsstoffe des Öls identifiziert werden. So konnten die Öle der beiden Pflanzen miteinander verglichen werden. Die beiden Hauptkomponenten in Zanthoxylum schinifolium konnten als Hydroxy-α-Sanshool und als Hydroxy-β-Sanshool identifiziert werden. Von Nebenpeaks konnte die Masse und das UV-Spektrum aufgenommen werden, was Hinweise zur Struktur gab. Es könnten Sanshoole und Bungeanoole sein, die in Z. bungeanum bereits nachgewiesen wurden. Unabhängig davon wurden die ätherischen Öle untersucht. Die ätherischen Öle wiesen als Hauptkomponente Limonen auf. Das Öl von Z. schinifolium unterschied sich in einigen Komponenten vom Öl von Z. bungeanum. Beim Vergleich der Öle mit den CO2-Extrakt konnten einige Unterschiede festgestellt werden. Die Identifikation der Nebenpeaks wurde aufgrund der Masse und des UV-Spektrums durchgeführt. Um Gewissheit zu haben, müsste eine Strukturaufklärung per NMR erfolgen, wie es bei den Hauptpeak durchgeführt werden konnte. Vor allem um die genaue Lage der E-/Z-Doppelbindungen festzustellen, wäre eine NMR- Spektroskopie unabdingbar. Das Vorkommen von Hydroxy-α-Sanshool und Hydroxy-β-Sanshool in Z. schinifolium ist jedoch bestätigt. Bei der Ölanalyse konnte festgestellt werden, dass während der Wasserdampfdestillation eine Hydrolisierung von gewissen Substanzen vorkommt. Somit kann der lokalanästhesierende Effekt von Z. schinifolium ebenfalls auf Alkylamide zurückgeführt werden. Hydroxy-α- und Hydroxy-β-Sanshool kommen auch in Z. schinifolium vor. Auch scheint das Vorkommen von Bungeanoolen nicht auf Z. bungeanum beschränkt zu sein.

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1 Einleitung

1.1 Traditionelle Chinesische Medizin „Um eine Krankheit zu behandelt bedarf es keines grossen Arztes, um die Gesundheit zu erhalten aber eines wahren Meisters.“

(Chinesisches Sprichwort) Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist ein traditionelles, sehr altes Heilsystem. Krankheit und Gesundheit werden unter ganzheitlichen und energetischen Gesichtspunkten betrachtet und behandelt. Für den gesunden Organismus ist ein ungestörter Fluss des Qi entlang den Meridianen Voraussetzung. Qi bedeutet Energie, Atem, Lebenskraft. Es gibt keine zutreffende Übersetzung die Qi abschliessend beschreiben kann. Ist der Fluss des Qi gewährleistet, differenzieren sich die Lebenskräfte in die polaren Bewegungen Yin und Yang. Yin und Yang sind gegengerichtete Bewegungen, die sich gegenseitig ergänzen und erzeugen. Neben der Polarität von Yin und Yang tragen die fünf Wandlungsphasen zur präzisen Beschreibung der Regulationsvorgänge bei. Den fünf Wandlungsphasen entsprechen fünf Funktionsbereiche, die nach Organnamen benannt sind, die jedoch übergeordneten, psychosomatischen Funktionen entsprechen und nicht denen der Organe selber. Störungen können sich innerhalb eines Funktionsbereiches aber auch zwischen ihnen ergeben. Durch die genauere Betrachtung der einzelnen Funktionskreise wird die ganzheitliche, psychosomatische Sicht der TCM verdeutlicht:

• Die Mitte (orbis lienalis); Aufnahme, Interaktion mit Aussenwelt • Die Leber (orbis hepaticus); Mobilisierung von Aktivität • Das Herz (orbis cardialis); Koordination des Menschen • Die Lunge (orbis pulmonalis); Rhythmus; Atmung, Herzschlag; Modulations-

fähigkeit • Die Niere (orbis renalis); Konstitution, Struktivität, Ordnungssystem

Gesundheit ist ein harmonischer Zustand zwischen Yin und Yang, Krankheit ein Ungleichgewicht. Durch genaue Befindlichkeitsanalysen mit Einbezug all ihrer Aspekte und durch klinische Beobachtung wird die Diagnose gestellt. Durch die Therapie wird versucht den Organismus in seinen Bemühungen zu unterstützen das Gleichgewicht wieder in Ordnung zu bringen. Hauptsächlich wird die Ableitung der Krankheit gefördert, um das Einschliessen, sprich die Chronifizierung der Krankheit zu verhindern. Jede Behandlung ist individuell zusammengestellt nach den Bedürfnissen des Patienten. Dieser Prozess ähnelt in Bezug auf Zeitaufwand und Vorgehensweise der homöopathischen Mittelfindung [1].

1.1.1 Die pflanzlichen Arzneimittel der TCM Pflanzen und Kräuter werden nach Geschmack, thermischer Eigenschaft, Organbezug, spezieller Wirkung und Indikation klassifiziert. Nur eine korrekte Diagnose unter Einbezug all dieser Aspekte ermöglicht eine präzise Rezeptur. Der Verlauf der Genesung wird durch neue Diagnose stets überprüft. Neuere Enzyklopädien beschreiben rund 6000 verschiedene Arzneimittel pflanzlicher, tierischer oder mineralischer Herkunft. Ungefähr 90% aller Erkrankungen werden mit Kräutern behandelt. Eine individuelle Rezeptur besteht aus sechs bis zehn Arzneipflanzen. Ein chinesischer Arzt arbeitet durchschnittlich mit

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hundert Arzneipflanzen. Dies ergibt bereits eine gewaltige Zahl an Kombinationsmöglichkeiten. Verwendet werden stets ganze Pflanzen oder Pflanzenteile, niemals isolierte Einzelstoffe. Die ursprüngliche Einnahmeform ist das Dekokt. Die Rezeptur wird in entsprechender Flüssigkeitsmenge eingeweicht, erhitzt und während durchschnittlich 20min gekocht. Das Dekokt wird abgekühlt, abgefiltert und sofort eingenommen oder äusserlich angewendet [1].

1.1.2 Zanthoxyli Pericarpium als Chinesische Droge „Huajiao“ [1]

Abbildung 1.1 Makroskopisches und Mikroskopisches Erscheinungsbild von Zanthoxyli Pericarpium.

A1: Zanthoxylum bungeanum, A2: Zanthoxylum schinifolium. 1. Exokarp; 2. Mesokarp; 3. Ölraum; 4. Öltropfen; 5. Calciumoxalat-Drusen; 6. Endokarp (siehe auch Kapitel 1.4.3 und 1.4.4)

Definition nach Arzneibuch der Chinesischen Medizin: Das getrocknete Perikarp der reifen Früchte von Zanthoxylum schinifolium Sieb. & Zucc. oder Zanthoxylum bungeanum MAXIM. Die Früchte werden zur Reifezeit im Herbst gesammelt, an der Sonne getrocknet und von den Samen und fremden Beimengen befreit. Geschmacksrichtung, Temperaturverhalten und Orbisbezug Scharf, warm, orbis lienalis, orbis stomachi, orbis renalis. Wirkung und Indikation Die Mitte erwärmend und analgetisch, antihelminthisch und Juckreiz lindernd. Verwendet bei Kältegefühl und Schmerzen in der Magengrube und im Unterleib, Erbrechen und Durchfällen, Unterleibsschmerzen aufgrund von Parasitenbefall, Erkrankungen durch Spulwürmer, äusserlich bei nässenden Exanthemen und Pruritus. Applikation und Dosis 3-6g äusserlich in ausreichender Menge für Waschungen und Dampfbehandlungen mit dem Dekokt [1].

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Ein innerlich angewendeter Dekokt der Rinde von Z. schinifolium hat anthelmitische Eigenschaften und tötet Spulwürmer sowie die Eier von Fadenwürmern ab. Das Kraut zeigt Aktivität gegen Malaria und hat antikoagulative Eigenschaften [2].

1.2 Zanthoxyli Pericarpium als Gewürz Huajiao dient in China sowohl als Heilpflanze wie auch als Gewürz. Unter dem im Westen verwendeten Namen „Szechuanpfeffer“, lässt sich eine Gruppe von Gewürzen zusammenfassen, die alle der Gattung Zanthoxylum angehören. Je nach Region werden andere Arten verwendet. Zanthoxyli Pericarpium sind in den asiatischen Ländern unabdingbare Gewürze. In China wird Zanthoxyli Pericarpium vor allem in der Szechuan Küche verwendet, die bekannt für ihre Schärfe ist. Auch zum Würzen von Süssspeisen und Konditoreiwaren wird es eingesetzt. Oft werden die Perikarpe geröstet, bis ein aromatischer Geruch auftritt, um die ätherischen Öle zu entfernen. Die so behandelte Rohdroge wird „Chaohuajiao“ genannt. Die Droge wird auch zur Geschmacksverbesserung von Grünem Tee eingesetzt. Frische Blätter werden ebenfalls zum Würzen verwendet, während Zweige als Garnitur Verwendung finden [3].

1.3 Familie der Rutaceae

1.3.1 Systematik Die Rutaceae (Rautengewächse) gehören botanisch zur Ordnung der Rutales und somit zur Unterklasse der Rosidae, Klasse Rosopsida, Dikotyledonen [4]. Die Rutaceae sind vorwiegend tropische bis subtropische Holzpflanzen. Oft krautige Pflanzen, Sträucher, Stauden und auch Bäume. Die Blätter sind wechselständig, drei- oder mehrzählig gefiedert. Die radiären Blüten bestehen aus 3-5 Kronblättern und 3-5 Blütenblättern und mehreren Staubblättern. Der Fruchtkonten ist oberständig und die Blütenachese bildet einen Wulst (Diskus). Ein wichtiges Merkmal aller Rutaceae sind die ätherischen Öle, die in lysigenen Exkretbehälter gespeichert werden. Die Familie beinhaltet die wirtschaftlich wichtigen Zitruspflanzen (Citrus, Fortunella, Poncirus) als Lieferanten der Agrumen. Die Zitrusfrüchte sind Beeren. Das Fruchtinnere besteht aus Safthaaren, die vom Endocarp ausgehen [5-7]. Einige wichtige Vertreter der Familie Rutaceae nach Gattung geordnet (Nutzpflanzen, Drogen) [8]:

• Citrus: C. aurantium, C. limon, C. sinensis, Lieferanten der Zitrusfrüchte • Dictamnus: D. albus, Diptam, brennender Busch • Fortunella: Fortunella ssp., Lieferanten der Cumquat (Frucht) • Pilocarpus: P. jaborandi, liefert Pilocarpin • Phellodendron: Phellodendron ssp., Korkbäume • Poncirus: P. trifoliata, Bitterorange • Ruta: R. graveolens, eine alte Heilpflanze, liefert Rutin • Skimmia: S. japonica und S. Reevesiana, Lederstrauch • Zanthoxylum: Z. flavum, liefert das sogenannte Gelbholz,

Z. piperitum, Szechuanpfeffer

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1.3.2 Chemische Charakteristik Rutaceae gelten als Pflanzen mit vielfältigem Sekundärstoffwechsel. Sie sind besonders reich an ätherischen Ölen, die in schizolysigenen Exkretbehältern gebildet und gespeichert werden. Diese Ölräume sind in Blättern als durchscheinende Punkte und auf dem Perikarp als erhobene Punkte erkennbar. Alkaloide sind in der Familie sehr verbreitet. Charakteristisch sind die Benzylisochinolinalkaloide, wie die bisher nur hier gefundenen, gelbgefärbten Acridonalkaloide. Weiter kommen Furanochinolinbasen, Carbazol- und Imidazolalkaloide vor. Zu den letzteren gehört das Pilocarpin. Ein weiteres Familienmerkmal ist das Vorkommen von einfacheren Cumarinen, sowie Furano- und Pyranocumarinen. Ein typischer Vertreter ist das Bergapten [4].

1.3.3 Verbreitung Die etwa 1600 Arten sind über die gesamte Welt verteilt, konzentrieren sich aber weitgehend auf die tropischen und gemässigten Gebiete der südlichen Hemisphäre. Zitrusfrüchte für den Handel werden in den tropischen und warmgemässigten Agrumenzonen angebaut, insbesondere in der Mittelmeerregion, den Südstaaten der USA, in Mexiko, Südafrika und Australien [8]. In Europa gibt es etwa 20 ursprüngliche Vertreter so zum Beispiel die Ruta graveolens, Lieferantin für Rutin und traditionelle Heilpflanze.

1.4 Gattung Zanthoxylum

1.4.1 Systematik „Gelbholz“ aus dem Griechischen: Xanthós: gelb, xýlon: Holz; nach der goldgelben Farbe des Kernholzes; engl: prickly ash [9]. Der Gattung Zanthoxylum gehören ca. 700 Arten an. Sie kommen in Afrika, Asien, Australien und Amerika vor. Die Sträucher und Bäume der Gattung Zanthoxylum sind, wie der Name schon sagt, durch ihr gelbes Holz charakterisiert. Zanthoxylum ist eine schwierige Gattung mit zahlreichen, ähnlichen und noch nicht gut erforschten Arten. Oft hat dieselbe Pflanze mehrere Namen. Man findet auch die Gattung Fagara, die zum Teil nicht eindeutig von Zanthoxylum abgegrenzt ist oder als Untergattung von Zanthoxylum aufgeführt wird. Die in den Tropen verbreitete Gattung gilt für die Rutaceae als ursprünglich, weil sie neben eindeutigen (auch chemischen) Rutaceae-Charakteristika interessanterweise auch solche Merkmale besitzt, die man eher bei magnoliiden Vertretern suchen würde:

• Unspezialisierte Blütenmorphologie • Chorikarpe Gynoeceen • Breites Benzylisochinolinalkaloid Spektrum sowie Alkylamide [4]

Typisch sind auch die Früchte, die Beeren sind und die in Sekreträumen aromatisches ätherisches Öl enthalten. Die bedeutendsten asiatischen Arten sind:

• Z. piperitum DC = Z. sansho (Zentral- und Ostchina, Japan) • Z. simulans Hance = Z. bungei (China, Taiwan) • Z. bungeanum Max. (China) • Z. schinifolium Sieb. & Zucc. (China, Korea) • Z. nitidum Roxb. (DC) (China, Festland-Südostasien)

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• Z. rhetsa Pierre var. budranga Pier. = Z. limonella (Dennst.) Alston (westliches Nordindien, Festland-Südostasien)

• Z. armatum DC = Z. alatum Roxb. (Himalaya, Festland-Südostasien, Ostasien)

• Z. avicennae (Lamk) DC = Z. tidorense (China, Festland-Südostasien, Indonesien)

• Z. acanthopodium DC (östlicher Himalaya, China, Festland-Südostasien, Sumatra)

• Z. ailanthoides Sieb. & Zucc. Alle diese Pflanzen werden in den jeweiligen Lokalküchen genutzt und können einander zum größten Teil ersetzen (außer Z. schinifolium). Oft finden sie auch als traditionelle Heilmittel Anwendung [10]. In Nordamerika sind folgende Arten zu nennen:

• Z. clava herculis Sieb. & Zucc. (southern prickly ash) • Z. americanum Mill. (northern prickly ash)

In Südamerika gibt es ebenfalls etliche Zanthoxylum-Arten, die von indigenen Völkern auch traditionell genutzt werden:

• Z. elephantiasis Macfad. • Z. belizense Lundell • Z. monophyllum P. Wilson

Eine Vertreter aus Afrika: • Z. rubescens Planch ex Hooc aus Nigeria

Es gibt etliche Arten, die mehrere Namen tragen, was den Überblick erschwert.

1.4.2 Traditionelle Anwendung von Zanthoxylum ssp. Viele Zanthoxylum-Arten wurden bereits in verschiedenen Kulturen und Ethnien als traditionelle Heilmittel und Gewürze verwendet. Allgemein bekannt ist die schmerzstillende Wirkung, die wahrscheinlich in den meisten Arten auf Alkylamide zurückzuführen ist. So verwenden Indianer in Amerika Rindentee und Tinktur von Z. americanum bei chronischem Rheuma, dyspeptischen Beschwerden, Nierenproblemen, Herzproblemen, Erkältungen, Husten, Lungeproblemen, Uteruskrämpfen und Nervenschwäche. Beim Kauen der Äste wird Salivation induziert und stimuliert so die Galle und die Pankreasaktivität. Das Kauen der Äste hilft auch bei Zahnschmerzen was dem Baum den Namen „Toothache Tree“ eingebracht hat. Gegen ähnliche Beschwerden wird in Amerika auch Z. clava-herculis eingesetzt [11]. Durch den Tod von Weidetieren nach dem Verzehr von Rinde dieser Bäume testeten Bowen et al. [12] verschiedene Extrakte. Die Komponenten zeigen einen Effekt auf neuromuskuläre Transmission, der entweder durch die Blockade von postjunctionalen Endplattenrezeptoren oder durch verstärkte Freisetzung von Neurotransmittern ausgelöst wird [12]. Auch asiatische Zanthoxylum-Arten finden breite Anwendung, wie wir für „Huajiao“ bereits gesehen haben. In Afrika spielen die verschiedenen Zanthoxylum-Arten vor allem als Gewürze eine Rolle. [10]

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1.4.3 Zanthoxylum bungeanum MAXIM

Abbildung 1.2 Zanthoxylum bungeanum

Abbildung 1.3 Zanthoxylum bungeanum Perikarp

Botanik und Vorkommen Die Pflanze ist im asiatischen Raum vor allem in China verbreitet. Zanthoxylum bungeanum Perikarp: Zumeist einzelständige Balgfrüchte mit Durchmessern von 4-5mm. Die Aussenseite ist violettbraun bis braunrot gefärbt, auf der Oberfläche sind zahlreiche warzenförmige erhabene Ölräume mit Durchmessern von 0.5-1mm sichtbar, gegen das Licht betrachtet erscheinen diese durchscheinend; die Oberfläche der Innenseite ist blassgelb gefärbt. Stark aromatischer Geruch, scharf narkotisierender Geschmack; die narkotisierende Wirkung hält lange an [1]. Ätherisches Öl Wie alle Rutaceae besitzt auch Z. bungeanum ätherisches Öl als typisches Familienmerkmal. In den Blättern, den Früchten und dem Perikarp wird es in Sekreträumen gespeichert und macht das Aroma des Gewürzes aus. Das Öl ist reichhaltig und enthält eine ganze Palette von Mono- und Sesquiterpenen, sowie Phenylpropanderivaten. Die Zusammensetzung des ätherischen Öls von Z. bungeanum wurde mehrere Male mittels GC analysiert und publiziert [13-16]. Die Resultate unterscheiden sich quantitativ, jedoch kaum qualitativ voneinander. Der Gehalt an ätherischem Öl im Perikarp wird mit 3.66% und 3.77% angegeben [15]. Als Hauptkomponente der Öle vom Perikarp und von den Früchten wird Limonen angegeben [14, 15]. Aktive Inhaltsstoffe Die Pflanze hat einen reichen Sekundärstoffmetabolismus. Viele aktive Komponenten sind in den verschiedenen Pflanzenteilen bereits nachgewiesen worden. Es gibt etliche Studien, die neue Substanzen präsentieren. Ein paar Beispiele als Überblick:

• Das Xanthoxylin wirkt als Insektizid und Molluskizid [17]. • Xiong et al. [18] konnten Flavonolglycoside im Perikarp von Z. bungeanum

nachweisen. • Zwei Jahre später konnten Xiong et al. [19] neue Alkylamide aus dem Perikarp

von Z. bungeanum isolieren, die als Bungeanoole bezeichnet wurden.

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• Tezuka et al. [20] konnten die 4-O-β-D-Glucopyranoxyldihydroferulasäure nachweisen und zeigten, dass sie einen hemmenden Einfluss auf die NO Produktion bei unterschiedlich stimulierten Makrophagen hat.

Die Pflanze ist auch reich an Alkaloiden, sowie Terpenen und Cumarinen, was dem Bild der Rutaceae entspricht.

1.4.4 Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc.

Abbildung 1.4 Zanthoxylum schinifolium

Abbildung 1.5 Zanthoxylum schinifolium Perikarp

Botanik und Vorkommen Die Pflanze ist im asiatischen Raum vor allem in China, Korea, Japan und den mittleren Höhen von Taiwan verbreitet. Es ist ein zweihäusiger Strauch mit stacheligen Ästen und glänzenden, wechselständigen, gefiederten Blättern. Die etwas unscheinbaren Blüten sind grünlich [21]. Zanthoxylum schinifolium Perikarp: 2-3 im oberen Teil schizogene kleine Balgfrüchte, die auf einem kleinen Fruchtstiel sitzen, die Balgfrüchte sind kugelig gebaut, entlang der Bauchnaht geöffnet, die Durchmesser betragen 3-4mm. Die Oberfläche der Aussenseite ist graugrün bis dunkelgrün gefärbt, zahlreiche Ölräume und fein netzartig erhabene Runzeln sind darauf sichtbar; die Oberfläche der Innenseite ist weisslich gefärbt und glatt. Das Endokarp ist häufig an der Basis vom Exokarp getrennt. Noch verbliebene Samen sind oval, 3-4mm lang und 2-3mm im Durchmesser und weisen eine schwarze, glänzende Oberfläche auf. Aromatischer Geruch, schwach süsser, scharfer Geschmack [1]. Ätherisches Öl Z. schinifolium besitzt auch ätherisches Öl, jedoch in geringeren Mengen als Z. bungeanum. Der Anteil des ätherischen Öls des Perikarps liegt bei 1.65% [15]. Das Öl wurde nicht so oft untersucht und eine Publikation gibt Estragol mit einem Anteil von 95.02% als Hauptkomponente an [15]. Eine weitere Arbeit von Paik et al. [22] zeigt, dass ätherisches Öl von Z. schinifolium bei humanen Leberkrebs-Zellen Apoptosis auslöst. In der Arbeit von Paik werden als Hauptkomponenten Sabinen 15.4%, Citronellal 15.75% und Geranylacetat 29.8% angegeben. Dies scheint auch eher wahrscheinlich, weil das Aroma von Z. schinifolium recht stark an Zitronen erinnert.

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Aktive Inhaltstoffe Z. schinifolium ist nahe mit Z. bungeanum verwandt. Beide werden in der TCM als Huajiao verwendet. Daher sollte man annehmen, dass auch ihr Wirkstoffspektrum ähnlich ist. Auch Z. schinifolium hat einen reichen Sekundärstoffmetabolismus. Und es werden laufend neue aktive Komponenten entdeckt. Auch hier gibt es einige Publikationen, die immer neue Substanzen präsentieren. Im Anhang A zeigt eine Liste die Inhaltsstoffe von Z. schinifolium, die bis heute nachgewiesen werden konnten. Da fortlaufen neue hinzukommen, besteht kein Anspruch auf Vollständigkeit Ein grober Überblick über einige Inhaltsstoffe mit spezifischen Wirkungen:

• Viele Hydroxy-, Furano- und Pyranocumarine wie zum Beispiel Bergapten, Scopoletin und Scoparon [23].

• Quinolonalkaloide wie zum Beispiel Schinifolin und N-Methylschinifolin konnten in den Wurzeln von Z. schinifolium nachgewiesen werden [24].

• Die Arbeit von Cheng et al. [21] zeigt das gesamte Spektrum der Blätter auf. Diese Publikation berichtet vor allem von einem neu entdeckten Alkaloid, dem Z-Fagaramid und gibt einen Überblick über alle bis 2002 aus den Blättern isolierten Substanzen.

• Die Cumarine aus der Rinde von Z. schinifolium haben antikoagulierende Eigenschaften. Chen et al. [25] konnten sieben Cumarine mit plättchenaggregationshemmenden Fähigkeiten präsentieren. Tsai et al. [26] konnten später Cumarine mit plättchenaggregationshemmenden Eigenschaften auch in der Wurzelrinde nachweisen.

• 1997 konnte Chang [27] für gewisse Terpenylcumarine aus Z. schinifolium eine Wirkung gegen Hepatitis B Viren nachweisen.

• Jo et al. [28] konnten für einige Cumarine in Z. schinifolium eine Inhibition der Monoaminooxyidase nachweisen.

Die Inhaltsstoffe der beiden Pflanzenarten wurden bereits genauer untersucht. Es fällt auf, dass bei Z. schinifolium vor allem die Cumarine untersucht und auf ihre Wirkungen getestet wurden. Es ist keine Publikation bekannt, in der Alkylamide in Z. schinifolium nachgewiesen wurden. Yasuda et al. [29] erwähnten, dass weder im Perikarp, noch in der Wurzel von Z. schinifolium und Z. faurei (ein Hybrid von Z. ailanthoides und Z. schinifolium) ungesättigte aliphatische Säureamide detektiert werden konnten [29].

1.5 Alkylamide

1.5.1 Vorkommen In der Pflanzenwelt ist das Vorkommen von Alkylamiden auf wenige Familien beschränkt. Alkylamide wurden in Piperaceae, Aristolochiaceae, Rutaceae und Asteraceae nachgewiesen. Bis 1984 waren bereits 70 verschiedene Alkylamide isoliert und identifiziert worden. Die meisten stammen aus Asteraceen aus denen olefinische und acetylenische Alkylamide isoliert werden konnten. In den anderen alkylamidproduzierenden Familien kommen nur olefinische Alkylamide vor [30]. Heute sind über 150 Alkylamide bekannt [31].

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1.5.2 Biosynthese Alkylamide bilden eine Klasse von Substanzen, in der verschiedene Amine über eine Säureamidbindung mit verschiedenen ungesättigten Fettsäuren verknüpft sind. Der Säureanteil der Alkylamide stammt von der Ölsäure ab und besteht aus einer unverzweigten Alkylkette von neun bis 18 Kohlenstoffatomen mit einer oder mehreren Doppelbindungen [30].

OH

O

OH

O

OH

O

Ölsäure:

Linolsäure:

Linolensäure

Abbildung 1.6 Strukturen von ungesättigten Fettsäuren

Die Aminogruppe entsteht durch Decarboxylierung von Aminosäuren. Durch verschiedene chemische Umwandlungen wie Dehydrierung, Dehydratation und Isomerisierung kommt es zur Einführung verschiedener olefinischer und acetylenischer Bindungen. Oxidative Kettenverkürzungen führen zu einer grossen Vielfalt an Alkylamiden unterschiedlicher Kettenlängen [30].

1.5.3 Alkylamide der Gattung Zanthoxylum Alkylamide aus Rutaceae sind charakterisiert durch reine olefinische Säureteile mit C10 - bis C14 - Ketten, die an ein Isobutylamid oder an das korrespondierende Hydroxyderivat gebunden sind [30]. Die Amide aus der Rinde konnten auch in den Blättern und Blüten nachgewiesen werden, während die hydroxylierten Formen in den Perikarps, jedoch kaum in den Blüten aufgefunden wurden. Die Hydroxylierung des Isobutylamides scheint auf das Perikarp beschränkt zu sein. So kommt α-Sanshool in der Rinde von Zanthoxylum piperitum vor, während Hydroxy-α-Sanshool nur im Perikarp vorkommt. [29, 32] Sanshoole und Bungeanoole Sanshoole und Bungeanoole sind langkettige Polyenamide, die in Pflanzen der Gattungen Achillea, Echinacea und Zanthoxylum vorkommen. α-Sanshool, dass auch unter den Namen Echinacein und Neoherculin bekannt ist, wurde 1954 zuerst aus Echinacea angustifolia und Zanthoxylum clava-herculis isoliert [33]. Bungeanoole wurden erst 1997 in Zanthoxylum bungeanum nachgewiesen [19]. Der Unterschied zwischen Sanshoolen und Bungeanoolen beruht auf dem Vorkommen drei konjugierter Doppelbindungen am Ende der Amidkette bei Sanshoolen, während Bungeanoole nur zwei oder weniger unkonjugierte

1 Einleitung

16

Doppelbindungen aufweisen. Da α-Sanshool als erstes nachgewiesenes Alkylamid keine Hydroxygruppe besass, gilt die Bezeichnung Sanshoole für eine reine N-Alkyl-Gruppe, während die Bezeichnung Bungeanool eine hydroxylierte N-Alkyl-Gruppe beinhaltet [34]. In Abbildung 1.7 sind Sanshoole und Bungeanoole, die in Zanthoxylum bungeanum Perikarp nachgewiesen wurden, abgebildet [19].

1.5.4 Pharmakologische Wirkung und Verwendung Es wurden bereits zahlreiche verschiedene Wirkungen der Alkylamide beschrieben. Bereits 1954 wies Jacobson für ein Alkylamid aus Echinacea angustifolia eine insektizide und beim Menschen Speichelfluss produzierende Wirkung nach [35]. Der lokalanästhesierende Effekt ist von vielen Pflanzen bekannt die Alkylamide enthalten, so dass ihre Wurzeln und Äste oft bei Zahnschmerzen gekaut wurden. Alkylamide sind oft starke Scharfstoffe, die auf der Zunge ein intensives Brennen und einen paralysierenden Effekt aufweisen. Bryant und Mezine [36] untersuchten die Wirkung von Alkylamiden auf Nervenzellen. Aktive, als scharf empfundene Alkylamide erregen andere Gruppen von sensorischen Neuronen als übliche Scharfstoffe wie zum Beispiel Capsaicin. Probanden stellten nicht eine thermale Empfindung fest, sondern verglichen den Effekt eher mit einem milden elektrischen Schock. In hohen Konzentrationen war die Wirkung sogar schmerzhaft. Tests an Rattenzellen ergaben eine Aktivierung sämtlicher Neuronen des Trigeminus. Durch Hydroxy-α-Sanshool fand eine explosive Aktivierung eines tast- und zweier kälteempfindlicher Rezeptoren statt. Übliche Scharfstoffe erzeugen ihre Wirkung durch Effekte auf die neuronalen Membranen in dem sie die Lipiddoppelschicht irritieren. Alkylamide bewirken einen völlig anderen Effekt, der bis heute noch nicht genau aufgeklärt ist. Auf jeden Fall reagieren kälte- und tastempfindliche Nervenfasern des Trigeminus auf Hydroxy-α-Sanshool. Bei der Erforschung von neuronalen Pathways in Bezug auf Parästhesien könnte Hydroxy-α-Sanshool hilfreich sein [36]. Bryant und Mezine [36] stellten auch eine Struktur-Wirkungsbeziehung fest. Hydroxy-α- wie auch Hydroxy-ε-Sanshool erzeugen eine Wirkung sowohl in Studien mit Menschen als auch in vitro. Hydroxy-β-Sanshool zeigte bis zu einer Konzentration von 100µg keine Wirkung bei Probanden. Bryant und Mezine vermuteten daher eine minimale Konfiguration von Z-Doppelbindungen als Voraussetzung für die prickelnde Wirkung. Galopin et al. [34] bestätigten diese Vermutung 2004. Sie synthetisierten eine Reihe von Sanshoolen, Bungeanoolen und Derivaten und testete sie auf ihre Schärfewirkung, um die Struktur-Wirkungsbeziehung nachzuweisen. Sie konnten aufzeigen, dass die Z-Doppelbindung in der Fettsäurekette ein Schlüsselelement für die Wirkung darstellt, dass es aber nicht das Einzige ist. Das Motiv (CH-Z-CH-CH2-CH2-CH-E-CH) in Addition mit der Amidfunktion scheint unabdingbar für die scharfe, parästhesierende Wirkung. Jedoch kommt es nicht darauf an, ob die N-Alkyl Gruppe hydroxyliert ist oder nicht [34]. Acetylenische Alkylamide weisen Antibiotika ähnliche Eigenschaften auf, indem sie die RNA-Synthese hemmen. Auch immunmodulatorische und entzündungs-hemmende Wirkungen konnten für Alkylamide aus Echinaceae nachgewiesen werden [37].

1 Einleitung

17

NH

O

OH

NH

OOH

NH

O

OH

NH

OH

O

NH

OH

O

NH

O

NH

O

NH

OH

O

NH

OH

O

NH

OH

O

Hydroxy-gamma-sanshool

Hydroxy-beta-sanshool

Hydroxy-alpha-sanshool

Hydroxy-gamma-isosanshool

Gamma-dehydrosanshool

Gamma-sanshool

Bungeanool

Isobungeanool

Dihydrobungeanool

Tetrahydrobungeanool

Abbildung 1.7 Sanshoole und Bungeanoole aus Zanthoxylum bungeanum Perikarp [19]

18

2 Ziel der Diplomarbeit In dieser Diplomarbeit ging es darum die Inhaltsstoffe der Pflanze Zanthoxylum schinifolium genauer zu untersuchen. Insbesondere sollten die lokalanästhe-sierenden Substanzen charakterisiert werden. Von dem in China verwendeten Gewürz Zanthoxyli pericarpium (Z. bungeanum und Z. schinifolium) ist bekannt, dass es beim Verzehr ein kribbelnd-brennendes Gefühl auf der Zunge bewirkt, das bis zur Anästhesie der Zunge und der Mundschleimhaut führt. In Z. bungeanum wurden bereits Alkylamide nachgewiesen, die diesen Effekt bewirken [19, 36]. Aufgrund dieser Resultate wurde vermutet, dass auch in Z. schinifolium diese oder ähnliche Substanzen für die Wirkung verantwortlich sind. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Extrakte von Z. schinifolium und Z. bungeanum organoleptisch und analytisch untersucht. Weiter wurde das ätherische Öl von Z. schinifolium und Z. bungeanum gewonnen und gaschromatographisch untersucht. Zusätzlich wurde das Öl mit den mittels Superkritischer Flüssigextraktion gewonnenen Extrakten verglichen.

19

3 Material und Methoden

3.1 Drogenmaterial Zanthoxylum bungeanum (ZB) Getrocknetes Perikarp von Zanthoxylum bungeanum MAXIM wurde auf einem Markt in Beijing gekauft und identifiziert durch Prof. Yicun Huang, Chinese Academy of Science, Institute of Microbiology, Beijing, China. Das Perikarp hat eine rot-violette Farbe und einen starken, würzigen Geruch der an Zitrone und Pfeffer erinnert. Gemahlen hat die Droge eine beige Farbe und ist heller als Z. bungeanum Gansu Zanthoxylum bungeanum aus Gansu (ZBG) Getrocknetes Perikarp von Zanthoxylum bungeanum MAXIM geerntet in Wen County, Gansu Province, China. Bezogen bei der Firma Chuanzhen Industrial Lid. of Qinchuan, County Sichuan Province. Das Perikarp hat eine rot-violette Farbe und einen starken würzigen Geruch der an Zitrone und Pfeffer erinnert. Gemahlen hat die Droge eine hellbraune Farbe und ist dunkler als ZB Zanthoxylum schinifolium (ZS) Getrocknetes Perikarp von Zanthoxylum schinifolium Sieb. et Zucc. wurde auf einem Markt in Beijing gekauft und identifiziert durch Prof. Yicun Huang, Chinese Academy of Science, Institute of Microbiology, Beijing, China. Das Perikarp hat eine grün-beige Farbe und einen starken, frisch aromatischen Geruch der an Zitrone erinnert. Gemahlen hat die Droge eine hellgrün-beige Farbe.

3.2 Lösungsmittel und Chemikalien

Lösungsmittel

Produkt Hersteller/Lieferant

Artikel Qualität Verwendung

Acetonitril Biosolve (Valkenswaard, NL)

Batch33614

HPLC-SGradient grade

HPLC

Acetonitril

Multisolvent®Scharlau EGT Chemie AG, Tägerig

AC 0333 HPLCReagent grade

HPLC

Chloroform Scharlau EGT Chemie AG, Tägerig

CL0198 stabilisiert mit EtOHp.s.

DC, SC

Chloroform Reuss-Chemie AGTägerig

2.5-RC-CHLFE

stabilisiert mit EtOHHPLC Qualität

DC, SC


20

Ethanol absolut


ET 0015 HPLCReagent grade

DC, SFX

Ethylacetat Scharlau EGT Chemie AG, Tägerig

AC 0140 p.s. DC

Hexan-n 96%


HE 0234 HPLCReagent grade

Wasserdampf-destillation,GC

Methanol Scharlau EGT Chemie AG, Tägerig

ME 0316 p.a. DC

Methanol


ME 0315 HPLCReagent grade

DC, HPLC,

Methanol

CHROMASOLV®Sigma-Aldrich(Basel)

34860 HPLC Qualität DC, SC, HPLC

THF Rotipuran® Roth (Karlsruhe) 6788.1 > 99.5% puriss. p.a.

Lösungsmittel

Toluene


TO 0085 HPLCReagent grade

DC

Gase



Helium Alphagaz™ He 2

Carbagas Liebefeld-Bern

A07FY24 Qualität 60 GC, GC-MS

Kohlendioxid Carbagas Liebefeld-Bern

A06U24N Flasche mitTauchrohr Qualität 38

SFE

Stickstoff Carbagas Liebefeld-Bern

A03CF3E Qualität 50 ASE

Wasserstoff Carbagas Liebefeld-Bern

A0E7300 Qualität 45 GC


21

Chemikalien



Ameisensäure Fluka (Buchs) 6440 puriss. p.a. 98% HPLC

Kieselgur Riedel-de Häen; Sigma-AldrichSeelze D

18514 SFE, ASE

Schwefelsäure 95-97%

Scharlau EGT Chemie AG, Tägerig

AC2069 ISO, Ph.Eur, p.a. DC

Schwefelsäure 95-97%

Fluka (Buchs) 84720 Reag. Ph. Eur DC

Silicagel 60 Fluka (Buchs) 89943 0.04 - 0.063mm SC

Vanillin Fluka (Buchs) 94750 > 98% (HPLC) DC


Artikel Qualität

(-)-α-Bisabolol Roth 9055.1 Rotichrom® GC

(-)-α-Pinen Fluka 80606 puriss. p.a.

(+)-Terpinen-4-ol Fluka 86477 puriss. p.a.

(+)-α-Pinen Fluka 80605 puriss. p.a.

(+)-α-Terpinylacetat

Fluka 86487 pract. ~95%

(+)-β-Pinen Fluka 80607 puriss.

Anethol Merck 59607 Reag. Ph. Eur

Cineol M. Hamburger, Jena ca. 99%

Geraniol Fluka 48799 purum

Linalool Roth 5201.1 Rotichrom® GC

Linolensäure Roth 7232.1 Rotichrom® GC

Linolsäure Roth 5315.1 Rotichrom® GC

Myrcen Roth 9429.1 Rotichrom® GC

Piperin M. Hamburger, Jena

R-(+)-Limonen Fluka 62118 puriss. p.a.

α-Terpinen Fluka 86473 purum

α-Terpineol Roth 5152.1 Rotichrom® GC

α-Thujon Roth 5919.1 Rotichrom® GC

β-Caryophyllen Roth 7232.1 Rotichrom® GC

Referenzssubstanzen für GC


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3.3 Laborgeräte

Gerät Bezeichnung Hersteller / Lieferant

Analysenwaage sartorius Analytic AC 210S Instrumenten Gesellschaft AG Zürich, Schweiz

Heizpilz Tyco Thermal Controls Wirz, Zürich, Schweiz

Kühlschrank ERC 3200 Electrolux, Schweiz

Microlitersprizen Microliter™ Syringes Hamilton, Bonaduz, Schweiz

Pipetten Finnpipette® Labsystems 4500

RotationsverdampferWasserbadMembran-VakuumpumpeKühler

Rotavapor Re 111Water Bath 461MZ 2C

polystat cc1

Büchi, Flawil, SchweizBüchi, Flawil, Schweizvacuubrand, Wertheim, DeutschlandHuber, Reinach, Schweiz

Stickstoff Flow meter Typ V 100 Vögtlin, Aesch, Schweiz

Stoppuhr Timer Count Down

Ultraschallbad Sonorex super RK 106 Bandelin, Berlin, Deutschland

Ultrazentrifugenmühle Retsch ZM 1 Haan, Deutschland

Vakuumkammer Visiprep™ No 5-7030 Supelco®, Buchs, Schweiz

Waage sartorius handy Instrumenten Gesellschaft AG Zürich, Schweiz

Wasserdampf-destillation

Apparatur nach Pharmakopöe

Winzer, Deutschland

Zentrifuge DW-41-230-NEW Eppendorf, Schönenbuch, Schweiz

Allgemeine Laborgeräte

Auftragegerät Linomat IV Camag, Muttenz, Schweiz

DC-Analyse Reprostar 3 Camag, Muttenz, Schweiz

DC-Kamera Hitachi Camag, Muttenz, Schweiz

Heizplatte TLC Plate Heater III Camag, Muttenz, Schweiz

Kammer Doppeltrogkammer Camag, Muttenz, Schweiz

Spritze Linomat Syringe 695.0014 Camag, Muttenz, Schweiz

Taucheinrichtung Chormatogramm immersiondevice III

Camag, Muttenz, Schweiz

Dünnschichtchromatographie


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Extraktionsgeräte

Gerät Bezeichnung Hersteller / Lieferant

Accelerated SolventExtractor

ASE 200 Solvent Controller

Dionex, Sunnyvale, USA

Supercritical fluidextractor Syringe PumpZweikanal RestrictorController

SFX 220 Model 100DXRestrictor Temperatur Cont.SFX 200 Controller

ISCO, Lincoln, USA

HPLC Präparativ

Injektor Liquid handler 215 Gilson, Mettmenstetten, SchweizDegasser Agilent 1100 Series Agilent, Genf, SchweizPump Quat Pump AgilentOven Colcom AgilentDetector DAD Agilent

LC-MS Analytisch

Injektor Liquid handler 215 Gilson, Mettmenstetten, SchweizDegasser Agilent 1100 Series Agilent, Genf, SchweizPump Bin Pump AgilentOven Colcom AgilentDetector DAD Agilent

MS ESI Bruker, Fällanden, Schweiz

LC-NMR

Anlage VARIAN INOVA 600MHz Varian AG, Zug, Schweiz

GC und GC-MS

GC Gas Chromatographie 3600 Varian AG, Zug, Schweiz

GC-MS GC-17A Gas Chromatogrph

QP-5000 Mass Spectrometer

Shimadzu, Reinach, Schweiz

Wasseraufbereitung

UV ultrapure water system

EASYpure II Skan AG, Allschwil, Schweiz

HPLC, LC-MS und LC-NMR


24

3.4 Probenaufbereitung Die Drogen wurden in der Mühle (Siebeinsatz 0.5) unter Kühlung mit flüssigem Stickstoff gemahlen. Aus den gepulverten Drogen wurden alle Extrakte und die ätherischen Öle gewonnen.

3.5 Extraktionsmethoden

3.5.1 Wasserdampfdestillation Prinzip Die Wasserdampfdestillation dient zur Gewinnung ätherischer Öle. Die Droge (Pulver) wird mit Wasser erhitzt, so dass die flüchtigen Komponenten in die Gasphase (Wasserdampf) übergehen. Durch Kühlung kondensieren die Substanzen aus und das Destillat wird im Messrohr gesammelt, das Hexan oder Xylol zur Aufnahme des ätherischen Öls enthalten kann. Das Wasser gelangt automatisch in den Destillationskolben zurück [38]. Bei der Wasserdampfdestillation kann eine thermische Artefaktbildung oder Zersetzung der Substanzen nicht ausgeschlossen werden, da die Proben während längerer Zeit auf 100°C erhitzt werden. Apparatur Es wurde eine Destillationsapparatur gemäss Pharmacopöe Europea verwendet. Die Probe wurde in einen 500ml oder 1000ml Kurzhals-Rundkolben eingefüllt. Als Heizquelle diente ein Heizpilz passender Grösse. Die Apparatur wurde an einem Stativ senkrecht fixiert.

Ansatz 10g (ZS, ZB, ZBG) oder 30g (ZB) gepulverte Droge wurde mit 100ml oder 300ml H2O HPLC-Qualität in den Rundkolben gefüllt. Mit ZS und ZB wurde je ein Ansatz mit Hexan und ein Ansatz ohne organische Phase für die organoleptische Prüfung durch-geführt, während von ZBG nur ein Destillat mit Hexan als organische Phase gewonnen wurde. Die organische Phase wurde zuerst während 30min gesättigt, worauf das Öl während 2h bei einer Destillationsgeschwindigkeit von 2-3ml/min gewonnen wurde.

Abbildung 3.1 Destillationsapparatur wie sie gemäss Pharmakopöe verwendet wird


25

3.5.2 Superkritische Fluidextraktion (SFE) Prinzip Bei der Superkritschen Flüssigextraktion werden die Vorteile von überkritischem CO2 ausgenutzt. Superkritisches CO2 besitzt Eigenschaften, die denjenigen von Gasen und von Flüssigkeiten ähnlich sind. Zudem wird die Löslichkeit durch die Erhöhung des Drucks respektive der Dichte und der Temperatur verbessert. Gegenüber konventionellen Lösungsmittelextraktionen sind die steuerbare Löslichkeit, Zeitgewinn und vereinfachte Extraktionsgewinnung von Vorteil. Zudem ist CO2 toxikologisch unbedenklich und umweltverträglich [39]. Die Superkritische Flüssigextraktion von Naturstoffen dient heute zur Gewinnung verschiedener qualitativ hochstehender Extrakte wie ätherischen Ölen, Gewürzextrakten, Aromen und natürlichen Farbstoffen für die Parfüm- und Lebensmittelindustrie. Im grosstechnischen Stil wird sie zur Entkoffeinisierung von Kaffee und Schwarztee und zur Gewinnung von Hopfenextrakten für die Bierproduktion eingesetzt [40]. Die geringe Löslichkeit polarer Pflanzeninhaltsstoffe in überkritischem CO2 kann durch Zusatz von polaren Lösungsmittel als Modifier verbessert werden. Die SFE hat ein grosses Potential für die Extraktion von Arzneipflanzen. Zum Beispiel können thermolabile Naturstoffe, die durch Wasserdampfdestillation zerstört werden, extrahiert werden [39]. Ansatz Für die Extraktion wurden 2.5-3g einer 1:1 Mischung der gepulverten Droge mit Kieselgur in eine Isco Polymer-Kartusche gefüllt. Die Kartusche sowie das Extraktionsmodul wurden vor der Extraktion angewärmt. Eine Kartusche wurde dreimal während je 2h extrahiert: Mit reinem CO2, mit CO2 + 5% und CO2 + 10% (v/v) EtOH als Modifier. Für die erste Extraktion wurden die folgenden Einstellungen von Hamburger et al. [41] übernommen: Die Extraktionstemperatur war 50°C, die Restriktortemperatur 150°C, der Druck 300bar. Der Fluss wurde manuell auf 0.6ml/min eingestellt. Die Extrakte wurden am Restriktor-Auslass in 15ml EtOH in einem Isco-Reagenzglas gesammelt. Die Restriktor-Temperatur wurde für weitere Extraktionen auf 70-100°C eingestellt, da bei 150°C zuviel EtOH verdunstete. Mit dieser Methode wurden aus Z. bungeanum die Extrakte B1 (CO2), B2 (5% EtOH), B3 (10% EtOH) und aus Z. schinifolium S1 (CO2), S2 (5% EtOH), S3 (10% EtOH) gewonnen.

3.5.3 Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE™) Prinzip Accelerated Solvent Extraction (ASE™) beruht auf dem Prinzip der statischen Extraktion mit bis auf 200°C erhitzten Fluiden. Als Extraktionsmittel dienen konventionelle Lösungsmittel unter hohem Druck, um sie oberhalb des Siedepunktes als Flüssigkeit erhalten zu können. Durch die hohen Temperaturen wird die Extraktionskinetik stark beschleunigt und die Ausbeute potentiell erhöht [42]. Ursprünglich wurde die ASE™ zur Umwelt- und Spurenanalytik als Alternative zu herkömmlichen Extraktionsmethoden entwickelt. Das Potential der ASE™ für die Arzneipflanzenextraktion wurde erst in den letzten Jahren zum Beispiel von Benthin et al. [43] genauer untersucht. ASE™ ist auch da


26

eine gute Alternative zu herkömmlichen Extraktionsmethoden wie Soxhlet, Mazeration, Perkolation und Reflux. Senkung der Extraktionszeit sowie des Lösungsmittelverbrauchs und Erhöhung der Ausbeute und der Reproduzierbarkeit machen diese Methode für die Arzneipflanzenanalytik interessant [43, 44]. Ansatz 3.2g einer Mischung von ZB pulv. mit Kieselgur 1:1 wurden in eine 11ml Dionex Kartusche gefüllt. Als Lösungsmittel diente EtOH. Die zwei Extraktionszyklen mit einem Volumen von je 20ml wurde bei einem Druck von 140bar und einer Temperatur von 80°C durchgeführt. Die Extrakte vereint ergaben den Extrakt mit der Bezeichnug B ASE. 2.6g einer 1:1 Mischung von ZS pulv. und Kieselgur wurden nach der gleichen Methode extrahiert. Dieser Extrakt wurde mit S ASE bezeichnet.

3.6 Organoleptische Prüfung Die gewonnenen Extrakte wurden einer organoleptischen Prüfung unterzogen um sie auf die lokalanästhesierende Wirkung zu testen. Dies diente einer Vorselektion, denn nur die Extrakte mit gewünschten Eigenschaften wurden weiter untersucht. Methode Auf Löschpapierstücke von 1cm2 Grösse wurden 3-5µl der gewonnen Extrakte aufgetragen. Nachdem das Lösungsmittel verdampft war, wurde das Papierchen auf die Zunge gelegt und die Reaktion der Testperson beobachtet. Drei Personen testeten insgesamt acht Extrakte und zwei ätherische Öle mit dieser Methode. Zwischen zwei Versuchen wurde eine Regenerationszeit von mindestens 30min eingehalten.

3.7 Aufreinigung der Extrakte

3.7.1 Präparative Dünnschichtchromatographie (DC) Prinzip Mit der präparativen DC ist es möglich, aus einer entwickelten DC-Platte bestimmte Banden zu extrahieren. Diese Methode ist relativ unpräzis und dient mehr dazu einen qualitativen Eindruck der Bande zu bekommen. Die gewünschte Bande wird aus dem Chromatogramm ausgeschnitten und extrahiert. Methode DC-Entwicklung: Stationäre Phase: DC-Platte 10x10cm; Kieselgel 60 F254

Vorreinigung der Platte: CHCl3: MeOH in HPLC Qualität (7:3)

Applikation: 50µl Extrakt B1 in einer Bande von 8cm mit Linomat auf vorgereinigte Platte


27

Mobile Phase: CHCl3 - MeOH (9:1) Kammersättigung: 20min mit Fliesspapier Trocknen: 5-10min an der Luft Detektion: Bei UV 254nm ist eine breite Bande im

mittleren Bereich sichtbar Die Bande bei Rf 0.45 wurde ausgeschnitten und im Ultraschallbad während 30min in CHCl3-MeOH (9:1) extrahiert. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand in 1ml MeOH aufgenommen. Im Eppendorfröhrchen wurden die Kieselgel-Rückstände abzentrifugiert. Der flüssige Überstand wurde durch einen Mikroporfilter (Porengrösse: 5µm) filtriert und mit MeOH nachgespült. Dieser Extrakt wird erneut auf ungefähr 1ml eingeengt und per HPLC analysiert.

3.7.2 Säulenchromatographie Prinzip Bei der Säulenchromatographie (SC) wird die stationäre Phase in eine Glassäule gepackt und von der flüssigen mobilen Phase durchströmt [45]. Die zu trennende Mischung wird auf die Säule aufgetragen und die Komponenten werden über die Wechselwirkungen zum Kieselgel unterschiedlich schnell transportiert. Die austretende mobile Phase wird in Fraktionen gesammelt. Die verschiedenen Fraktionen werden mittels DC auf den Gehalt und die Reinheit der gewünschten Komponenten überprüft. Durch die Einengung der Fraktionen, welche die gewünschte Komponente enthalten, wird die Mischung in einzelne, aufkonzentrierte Proben aufgetrennt. Methode Die Trennung erfolgte in einer Säule mit der Höhe von 28cm und einem Durchmesser von 2.5cm an Kieselgel 60 (0.04-0.063mm). Das Säulenmaterial wurde im Laufmittel aufgeschwemmt und vorsichtig in die Säule eingefüllt. Die eingeengten, getrockneten Extrakte B1d, B1c und B1f (total 0.28g), wurden in 1ml Laufmittel gelöst und auf die Säule appliziert. Laufmittel: CHCl3 – MeOH 99:1 250ml CHCl3 – MeOH 98:2 100ml Fluss: 0.8ml/min, gegen Ende: 1.5ml/min Das austretende Lösungsmittel wurde in Fraktionen (5-8ml) gesammelt und mit Hilfe von DC im UV 254 überprüft. Die gesuchte Substanz konnte in den Fraktionen 24 bis 34 nachgewiesen werden. In den Fraktionen 25-34 war sie relativ rein. Diese wurden daher vereint und eingeengt. Das Konzentrat war eine ölige, gelbliche Flüssigkeit, die nach der Lagerung im Kühlschrank bei 5°C aushärtete und eine hellgelbe, fettige Substanz ergab. Der Geruch der Substanz erinnerte an Lebertran.


28

3.8 Analysemethoden

3.8.1 Vergleich der Extrakte mittels Dünnschichtchromatographie Prinzip Bei der Dünnschichtchromatographie (DC) besteht die stationäre Phase aus einer dünnen Schicht Kieselgel, die auf einer Aluminiumfolie aufgebracht ist. Die chromatographische Trennung beruht auf dem unterschiedlichen Verhalten der einzelnen Probekomponenten gegenüber mobiler und stationärer Phase. Die DC spielt in der qualitativen und quantitativen Analyse von Substanzen eine wichtige Rolle. Hier wurde die DC eingesetzt um die verschiedenen Pflanzenextrakte und Gattungen miteinander zu vergleichen. Durch Sprühreagenzien können gewisse Substanzen durch spezifische Derivatisierung nachgewiesen werden. So für die ätherischen Öle, die je nach Substanz und Sprühreagenz sehr unterschiedliche Färbungen annehmen [45]. Methode Die Normalphasen DC erfolgte auf Kieselgel 60 F254 auf Aluminiumfertigplatten der Grösse 10x10cm von Merck, Darmstadt. Um die verschiedenen Extrakte und Öle mit all ihren Komponenten zu Vergleichen wurden vier Laufmittel mit unterschiedlicher Polarität verwendet: Laufmittel A: Zur Auftrennung von ätherischen Ölen (Terpenoide)

Toluol-EtOAc (93:7) [46] Laufmittel B: Zur Auftrennung der lipophilen Komponenten (Alkylamide)

CHCl3-MeOH (90:10) Laufmittel C: Zur Auftrennung der polaren Komponenten wie Glykosiden

CHCl3-MeOH-H2O (65:30:5) Laufmittel D: Zur Auftrennung von polaren Komponenten wie Flavonol-

glykosiden EtOAc-Ethylmethylketon-Ameisensäure-H2O (50:30:10:10)

Die Proben wurden mit einem Auftragegerät appliziert. Entwickelt wurden die DC- Platten in einer Doppeltrogkammer, die zuvor während 15-20min mit dem Laufmittel mit Hilfe von Fliesspapier gesättigt wurde. Nach Verdunsten des Laufmittels fand die Bewertung der Chromatogramme unter UV 254 und durch Besprühen oder Tauchen im Vanillin-Schwefelsäurereagenz nach Wagner [46] statt. Nach Erhitzen auf der Heizplatte bei 100-110°C für 2-5min wurden die Färbungen sichtbar.


29

Vergleich der Extrakte von ZB und ZS Ansatz: Drei DC-Platten in verschiedenen Laufmitteln

Tabelle 3.1 Vergleich der Pflanzen ZB und ZS – Applikation der Proben

Extrakt B1 B2 B3 B Öl S1 S2 S3 SÖl Menge (µl) 3 10 10 1 3 10 10 1 Geschwindigkeit (sec/µl)

10 5 5 15 10 5 5 15

Probenvorbereitung: Die Extrakte und das Öl wurden unverdünnt aufgetragen Applikation: 10mm Abstand vom Rand, 4mm Abstand zwischen den

Banden, Bandenbreite 6mm Mobile Phase: je eine Platte in Laufmittel A, B und C Vergleich der ASE Extrakte von ZB und ZS Ansatz: Drei DC Platten in verschiedenen Laufmitteln

Tabelle 3.2 Vergleich der ASE Extrakte – Applikation der Proben

Extrakt S3 S2 ASES ASEB B2 B3 Menge (µl) 15 15 20 20 15 15 Geschwindigkeit (sec/µl)

10 5 5 15 10 5

Probenvorbereitung: 2ml ASE Extrakt wurde mit 1ml MeOH und 2ml EtOH verdünnt bis er klar war; die anderen Proben unverdünnt

Applikation: 10mm Abstand vom Rand, 4mm Abstand zwischen den Banden, Bandenbreite 10mm

Mobile Phase: je eine Platte in Laufmittel B, C und D Vergleich der Pflanzen ZS, ZB und ZBG Ansatz: Zwei DC Platten in verschiedenen Laufmitteln

Tabelle 3.3 Vergleich der Pflanzen ZS, ZB und ZBG – Applikation der Proben

Extrakt SÖl BÖl ZBGÖl S1 B1 BG1 Menge (µl) 1 1 1 4 4 4 Geschwindigkeit (sec/µl)

15 15 15 15 15 15

Probenvorbereitung: Die Extrakte und das Öl wurden unverdünnt aufgetragen Applikation: 10mm Abstand vom Rand, 4mm Abstand zwischen den

Banden, Bandenbreite 10mm Mobile Phase: je eine Platte in Laufmittel A und B


30

Vergleich verschiedener HPLC- Proben auf DC Ansatz: Eine DC Platte

Tabelle 3.4 Vergleich verschiedener HPLC-Proben – Applikation der Proben

Proben B1 B1 in EtOH

B1 in MeOH

Probe v. 13.4.05

Präp. DC f. HPLC

B1

Menge (µl) 4 20 20 20 20 2 Geschwindigkeit (sec/µl)

15 15 15 15 15 15

Applikation: 10mm Abstand vom Rand, 4mm Abstand zwischen den Banden, Bandenbreite 10mm

Mobile Phase: Laufmittel B

3.8.2 Gaschromatographie (GC) Prinzip Bei der Gaschromatographie (GC) werden Substanzen in gasförmigem Zustand unter Verwendung einer gasförmigen mobilen Phase (dem Trägergas) und einer flüssigen oder festen stationären Phase getrennt. Voraussetzung für die gaschromatographische Bestimmung einer Substanz ist, dass diese unter den chromatographischen Bedingungen in gasförmigem Zustand vorliegt. Daher eignet sich die Gaschromatographie besonders gut für die Trennung ätherischer Öle mit ihren leichtflüchtigen Komponenten. Als Trägergas wird Helium verwendet. Für die Trennung spielen Adsorptionsvorgänge zwischen den Phasen und ferner die Flüchtigkeit einer Probenkomponente eine Rolle. Die GC mit einem Flammenionisationsdetektor (FID) eignet sich zur quantitativen Analyse, denn das Signal des FID ist zur Stoffmenge proportional. Daher eignet sich die GC-FID zur Gehaltsbestimmung in ätherischen Ölen [45]. Methode Die drei ätherischen Öle konnten mit folgender Methode am besten aufgetrennt werden: Temperaturgradient von 75°C-210°C mit einer Steigung von 10°C pro Minute. Bei 75°C wurde die Temperatur während 2min gehalten und bei 210°C während 4.5min. Danach wurde die Säule auf 300°C mit einer Steigung von 40°C pro Minute aufgeheizt und die Temperatur bei 300°C während 1.75min gehalten, um die Säule zu reinigen. Die ätherischen Öle wurden mit Hexan 1:100 verdünnt. Von dieser Lösung wurden 1µl (ZBG) oder 5µl (ZS, ZB) manuell injiziert. Jedes Öl wurde mindestens dreimal unter gleichen Bedingungen injiziert. Als stationäre Phase diente eine Optima® 5-MS-Kapillarsäule (5% Diphenyl- 95% Dimethylpolysiloxan), 30m x 0.25mm; Partikelgrösse 0.25µm von Marcherey-Nagel. Als Trenngas wurde Helium verwendet. Die Injektor-Temperatur war 220°C. Der Fluss war zwischen 15-30ml/min. Die Peaks wurden mithilfe der durch die NIST Datenbank identifizierten GC-MS Spektren zugeordnet. Da bei beiden Geräten mit der gleichen Säule gearbeitet wurde, war die Reihenfolge der Peaks gleich. Die Zuordnung wurde mit Standards überprüft und kann daher nur für diese Substanzen als sicher betrachtet werden.


31

3.8.3 Gaschromatographie mit Massenspektrometrie (GC-MS) Prinzip Bei der GC-MS ist ein Gaschromatograph mit einem Massenspektrometer (MS) gekoppelt. Diese Methode verbindet Vorteile einer chromatographischen Methode mit dem selektiven und empfindlichen Nachweis von Substanzen durch die Massenspektroskopie. Das Ende der Chromatographiesäule mündet direkt in das MS. Zusätzlich zur Retentionszeit kann das Massenspektrum zum qualitativen Nachweis herangezogen werden [45]. Über die NIST Datenbank können die Substanzen anhand ihres MS-Spektrums identifiziert werden. In dieser Datenbank sind Massenspektren vieler Substanzen gespeichert. Die gemessenen Spektren werden mit den gespeicherten verglichen und zugeordnet. Die Genauigkeit der Zuordnung kann über den Match beurteilt werden. Methode Die drei ätherischen Öle konnten mit folgender Methode am besten aufgetrennt werden: Temperaturgradient von 50°C-210°C mit einer Steigung von 6°C pro Minute. Bei 50°C wurde die Temperatur während 2min gehalten und bei 210°C während 1.34min. Es wurde jeweils zwischen 0.1-5µl ätherisches Öl in Hexan injiziert. Zum Vergleich der ätherischen Öle mit den CO2 SF-Extrakte wurden auch die CO2-Extrakte B1, G1 und S1 mit dieser Methode untersucht. Es wurden jeweils zwischen 0.5-5µl manuell injiziert. Als stationäre Phase diente eine Optima® 5-MS-Kapillarsäule (5% Diphenyl – 95% Dimethylpolysiloxan), 30m x 0.25mm; Partikelgrösse 0.25µm von Marcherey-Nagel. Als Trenngas wurde Helium verwendet. Die Injektor Temperatur war 160°C, die Interface Temperatur 230°C. Der Fluss war auf 1.7ml/min eingestellt. Ein Split Ratio von 4:1 wurde verwendet. Es wurde ein quadrupol Massenspektrometer verwendet. Die Detector Spannung war 1.4kV, Massen von m/z 50-300 wurden erfasst.

3.8.4 Probenvorbereitung mittels Festphasenextraktion (SFE) Prinzip und Methode Die Proben für die HPLC, LC-MS und LC- NMR Messungen wurden mit Hilfe der Festphasenextraktion (SFE) vorbereitet. Die SFE diente hier hauptsächlich zur Vorreinigung der Probe. Komponenten die zu einer Verunreinigung und Qualitätsminderung der HPLC Säule führen würden, wurden indem sie in der C18 Kartusche zurückgehalten werden, aus der Probe entfernt. 0.5ml des jeweiligen Extraktes wurden mit Hilfe einer Vakuumkammer durch eine mit MeOH vorgespülte C18 Kartusche gefiltert und mit 1.5-2ml MeOH nachgespült. Das Probevolumen wurde auf 2ml aufgefüllt.

3.8.5 Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Prinzip Die High performance liquid chromatography (HPLC) ist eine Form der Säulenchromatographie. Die Trennleistung einer Säule hängt vom Teilchendurch-


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messer und von der Porengrösse der Teilchen ab. Die Säulen sind sehr dicht gepackt. Das Fliessmittel wird deshalb mit Hilfe spezieller HPLC-Pumpen durch das Säulenbett gepresst. Durch die effizientere stationäre Phase können die Trennungen stark verbessert werden [45]. Nach der Auftrennung können die Komponenten mit verschiedenen weiteren Methoden identifiziert werden. Im Normalfall wird ein UV-Spektrum gemessen. Methode Die Trennung erfolgte an einer Nucleodur® 100-5, RP C18, encapped, 4mm x 125mm Säule mit Partikelgrösse 5µm von Marcherey-Nagel. Der Fluss war 0.5ml/min, als mobile Phase wurde ein linearer Gradient von MeCN 35-75% in H2O während 40min gewählt. Da die Säule nicht geheizt wurde, fand die Trennung bei Raumtemperatur statt. Die Methode wurde in Anlehnung an Xiong et al [19], die mit einem Gradienten von 35-70% MeCN in H2O in 40min arbeiteten, entwickelt. Von den Substanzen konnte mit dem Dioden Array Detector (DAD) ein UV Spektrum aufgenommen werden.

3.8.6 Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie (LC-MS) Prinzip Bei der HPLC-MS Kopplung wird eine HPLC-Anlage an ein Massenspektrometer über eine spezielle Kopplungseinrichtung (Interface) verbunden. Die mittels HPLC aufgetrennten Substanzen werden über das Interface in den Massenspektrometer eingebracht und anschliessend analysiert. Das Interface hat die Aufgabe, das Fliessmittel vor dem Eintritt der Probe in das MS zu entfernen und die Analyte gleichzeitig zu ionisieren [45]. Methode Massenspektrometrie – ESI Electro Spray Ionisation Mit den sogenannt „weichen“ Ionisationsmethoden können Moleküle sanft ionisiert werden, so dass die Moleküle nicht weiter zerfallen und Molekularionen registriert werden können [45]. Die Massenspektroskopie wurde im positiven Modus durchgeführt. Die Kapillarspannung war - 4500V, die Spannung beim Kapillarende 112.8V und jene des Skimmers 40.0V. Gute Signale konnten bei Einstellungen des Nebulizers bei 30psi, das Dry Gas bei 10l/min und die Dry Temperatur bei 350°C erreicht werden. Molekülmassen von m/z 50-1500 (Range) wurden detektiert.

3.8.7 Flüssigchromatographie mit Kernspinresonanz-Spektroskopie

Prinzip Grundlage der Kernspinresonanz-Spektroskopie ist das Verhalten von gewissen Atomkernen in einem Magnetfeld. Zur Messung wird eine Probe in einem starken Magnetfeld elektromagnetischer Strahlung ausgesetzt. Das registrierte NMR Spektrum gibt Aufschluss über die Zahl der Atome in einem Molekül sowie über deren Verknüpfung und Abstände. Die NMR ist heute mit Abstand die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung unbekannter Substanzen [45].


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Die Verbindung von HPLC mit NMR ist ein grosser Gewinn für beide Analyse-methoden. Durch die HPLC kann ein Substanzgemisch aufgetrennt werden und mit der NMR kann die Struktur der Peaks aufgeklärt werden. Grundsätzlich können die chromatographischen Bedingung vom HPLC übernommen werden. Die Lösungsmittel, v.a. Wasser werden durch deuterierte Lösungsmittel ersetzt. Die Lösungsmittelsignale im NMR müssen unterdrückt werden. Ein Problem ist auch die Reinheit der Lösungsmittel. Die meisten HPLC Lösungsmittel enthalten Spuren von Verunreinigungen, die im UV Detektor nicht sichtbar sind, die aber im NMR detektiert werden [47]. Methode Für die HPLC-Trennung wurde ein Gradient von D2O (0.07%TFA):MeCN 62.38-42.58% in 25min gewählt. Die NMR-Messung wurde bei der Elution von 54% D2O für den Hauptpeak und bei 55% D2O für den zweiten Peak durchgeführt. Die HPLC Trennung erfolgte an einer Nucleosil® 120-5, RP C18, 4.6mm x 150mm Säule mit Partikelgrösse 5µm von Marcherey-Nagel. Der Fluss war 1.0ml/min.

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4 Resultate

4.1 Extrakte Alle hergestellten Extrakte sind in den Tabellen zusammengefasst. Bei den getrockneten Extrakten wurde jeweils die Ausbeute bestimmt. Die Konzentration der Extrakte wurde aufgrund der Ausbeute der getrockneten Extrakte abgeschätzt. Die Konzentration der SFE-CO2 Extrakte ist etwa 15-20mg/ml

Tabelle 4.1 Extrakte aus Zanthoxylum bungeanum

Name Extraktions- methode

Einwaage Dauer Farbe des Extrakts

Ausbeute

B Öl Wasserdampf-destillation ohne Vorlage

30g 2h Hellgelb – klar später destilliertes Öl gelb

0.51ml entspricht 1.7%

B Öl H Wasserdampf-destillation mit Hexan

10g 2h Hellgelb 0.55ml Öl in Hexan

B1 SFE CO2 2.42g* 2h Orange-rot-braun k.A. B1b SFE CO2 3.00g* 2h k.A 0.0906g B1c SFE CO2 2.79g* 2h Goldgelb 0.0921g B1d SFE CO2 2.20g* 2h Goldgelb k.A. B1e SFE CO2 2.81g* 2h Goldgelb k.A. B1f SFE CO2 2.81g* 2h Goldgelb k.A. B2 SFE CO2 + 5%

EtOH 2.42g* 2h Hellgelb k.A.

B3 SFE CO2 + 10% EtOH

2.42g* 2h Goldgelb k.A.

B ASE ASE mit EtOH 3.20g* k.A. Goldgelb-orange k.A. * Gewicht der Mischung Droge-Kieselgur (1:1)

Tabelle 4.2 Extrakte aus Zanthoxylum schinifolium


Einwaage Dauer Farbe des Extraktes

Ausbeute

S Öl Wasserdampf-destillation ohne Vorlage

10g 2h Hellgelb 0.07ml entspricht 0.7%

S Öl H Wasserdampf- destillation mit Hexan


S1 SFE CO2 2.81g* 2h Hellgelb-grünlich k.A. S2 SFE CO2 + 5%

EtOH 2.81g* 2h Gelb-grünlich k.A.

S3 SFE CO2 + 10% EtOH

2.81g* 2h Gelb-grünlich k.A.

S ASE ASE 2.60g* k.A. Gelb-grünlich k.A. * Gewicht der Mischung Droge-Kieselgur (1:1)

4 Resultate ___________________________________________________________________

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Tabelle 4.3 Extrakte aus Zanthoxylum bungeanum Gansu


Einwaage Dauer Farbe des Extraktes

Ausbeute

G Öl H Wasserdampf- destillation mit Hexan


G1 SFE CO2 3.01g* 2h gelb k.A. *Gewicht der Mischung Droge-Kieselgur (1:1)

4.2 Organoleptische Prüfung In allen Extrakten konnte ab einer bestimmten Konzentration ein gewisser Effekt festgestellt werden. Jedoch wurden eindeutig die Extrakte S1 und B1 am stärksten empfunden, wobei der Effekt von B1 stärker ist als von S1. Die HPLC Analysen wurden demnach mit den Extrakten B1 und S1 durchgeführt.

Tabelle 4.4 Resultate der Organoleptischen Prüfung

Extrakt Person 1 Person 2 Person 3 B1 positiv positiv positiv B2 unsicher unsicher negativ B3 negativ negativ negativ B Öl unsicher aromatisch aromatisch B ASE positiv unsicher unsicher S1 positiv positiv positiv S2 unsicher negativ negativ S3 negativ negativ negativ S Öl aromatisch aromatisch aromatisch S ASE unsicher positiv unsicher Die in diesem Rahmen durchgeführte organoleptische Prüfung diente zur Auswahl der Extrakte, die weiter untersucht werden sollten. Die individuellen Empfindungen der Testpersonen müssen berücksichtigt werden.

4.3 Resultate der Aufreinigung der Extrakte Die Probe, die durch die präparative DC gewonnen wurde, erwies sich als ziemlich unrein. Eine mit diesem Extrakt durchgeführte DC zeigte mehrere Banden unterhalb der ursprünglich extrahierten, und die gewünschte Bande hat stark an Konzentration verloren. Mit der Säulenchromatographie konnte eine Auftrennung des Extraktes erreicht werden. Die Fraktionen 25-34 zeigten nur einen Fleck auf der DC und ergaben eine ölige, gelbliche Flüssigkeit. Diese Probe erwies sich aber als nicht stabil. Nach dem Einengen im Rotationsverdampfer wurde eine Zersetzung mittels DC festgestellt.

4 Resultate ___________________________________________________________________

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B1 B2 B3 Öl S1 S2 S3 Öl B1 B2 B3 Öl S1 S2 S3 Öl B1 B2 B3 Öl S1 S2 S3 Öl

4.4 Ergebnisse der Dünnschichtchromatographien Vergleich der Extrakte von ZB und ZS In Abbildung 4.1 ist klar ersichtlich, dass sich die beiden Pflanzen ZB und ZS kaum in ihrem Sekundärstoffmetabolismus voneinander unterscheiden. Sowohl bei den Ölen wie auch bei den SFE-Extrakten sind die gleichen Banden erkennbar, unterscheiden sich manchmal nur in ihrer Intensität. LM A LM B LM C

Abbildung 4.1 DC mit LM A, LM B und LM C zum Vergleich von ZB und ZS bei VIS

Das Öl wurde gut in mehrere intensiv gefärbte Banden unterteilt. Die vorherrschenden Farben sind Violett, Blau und Graublau. Die blauvioletten Banden sind unter anderem Cineol, die violetten Banden sind Phenylpropanderivate und die graublauen sind Monoterpenalkohole [46]. Der lipophile CO2 SF-Extrakt wird auch gut in mehrere Banden aufgetrennt. Jedoch unterscheidet sich das Muster deutlich von dem der Öle. Die polaren SF-Extrakte konnten mit diesem Laufmittel nicht entwickelt werden. Bei der DC mit Laufmittel C sind wiederum die braunen Flecken im oberen Drittel ersichtlich. Die Extrakte B3 und S3 werden hier besser getrennt und zeigen einige schwächere Banden in der unteren Hälfte der DC, die wahrscheinlich von Glykosiden stammen. In Abbildung 4.2 fallen zuerst die braunen, kräftigen Flecken im Mittelfeld der DC auf. Die Terpene und übrigen apolaren Bestandteile der Öle sind nahe der Lösungsmittelfront erkennbar, und werden auch nicht mehr gut aufgetrennt. Dafür werden die Extrakte B1 und S1 besser getrennt. Bezüglich Grösse und Intensität der braunen Flecken kann festgestellt werden, dass der grösste Teil dieser Substanz in den Extrakten S1 und B1 vorhanden ist, wobei in B1 deutlich die höchste Konzentration vorliegt und auch B2 eine ähnlich hohe Konzentration wie S1 aufweist. Im UV Licht ist ersichtlich, dass die Banden stark fluoreszenzmindernd sind.

4 Resultate ___________________________________________________________________

37

Abbildung 4.2 DC mit Laufmittel B bei UV und bei VIS

Vergleich der ASE Extrakte von ZB und ZS

Abbildung 4.3 DC in Laufmittel C und B, die beiden Banden in der Mitte sind die ASE Extrakte

Bei Abbildung 4.3 ist klar zu erkennen (rote Banden), dass im ASE-Extrakt sehr polare Substanzen enthalten sind, die in den anderen Extrakten weniger vorkommen. Diese Substanzen sind wahrscheinlich Glykoside unter anderem Flavonolglykoside. Auch in den ASE-Extrakten sind die braunen Flecken im mittleren Bereich bei LM B gut erkennbar. Die Unterschiede in der Intensität der Banden ist auf unterschiedliche Verdünnungen der Extrakte zurückzuführen und lässt keine quantitative Aussage zu.

S1 S2 S3 Öl B1 B2 B3 Öl Öl S3 S1 B3 S2 B2 B1 Öl

B1 S3 S2 S B B2 B3 ASE ASE

S3 S2 S B B2 B3 ASE ASE

4 Resultate ___________________________________________________________________

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ZS ZB ZBG ZS ZB ZBG

Vergleich der Pflanzen ZS, ZB und ZBG

Abbildung 4.4 DC mit Laufmittel A und B im VIS, Vergleich ätherische Öle mit S1 Extrakten

Bei den DC’s in Abbildung 4.4 fällt auf, dass sich die drei Pflanzen kaum unter-scheiden. In allen drei sind wieder die braunen Flecken deutlich erkennbar.

4.5 Ergebnisse der Gaschromatographie Aus drei Runs wurden die Flächen von ungefähr 50 Peaks pro Öl integriert und so ihr relativer Anteil am Öl berechnet (Daten und Berechnung siehe Anhang). Die Peaks wurden mit Hilfe der NIST Datenbank zugeordnet. Bei chiralen Molekülen konnte die Chiralität nicht festgestellt werden. Für die drei untersuchten Öle ergaben sich folgende Anteile:

Tabelle 4.5 Die Hauptkomponenten von ZB

Substanz tR Anteil% Substanz tR Anteil% Limonen* 5.781 28.16% β-Caryophyllen 11.696 1.11% 4-Terpineol 8.079 12.52% β-Z Ocimen 5.924 0.95% β-Pinen 5.083 9.16% α-Terpinen 5.505 0.87% p-Cymen 5.662 5.24% α-Cadinol 14.462 0.72% Sabinen 4.885 4.71% Germacren 12.493 0.63% α -Terpineolacetat 10.540 4.13% Z-Geraniol 8.688 0.53% β-Linalool 6.727 3.95% β -Terpineol 6.271 0.51% α-Terpineol 8.226 3.09% Anethol 9.584 0.50% γ-Terpinen 6.153 2.68% β-Elemen 11.224 0.50% α-Pinen 4.395 2.66% Caryophyllenepoxid 13.825 0.50% Piperiton 9.158 1.84% Farnesylacetat 16.639 0.27% Naphtalen 12.972 1.19% übrige 13.58%

kursiv: die Substanz wurde nicht eindeutig erkannt * in Limonen sind noch Cineol und β-E-Ocimen enthalten

ZS ZB ZBG ZS ZB ZBG Öl

4 Resultate ___________________________________________________________________

39

Tabelle 4.6 Die Hauptkomponenten von ZBG

Substanz RT Anteil% Substanz RT Anteil% Limonen* 5.761 47.96% Geraniolacetat 10.91 0.61% β-Pinen 5.069 10.41% Nerolacetat 10.651 0.51% Linalylanthranilat 9.125 7.99% α-Phellandren 5.340 0.48% β-Linalool 6.746 6.62% Caryophyllen 11.725 0.46% 4-Terpineol 8.057 5.27% β-Z-Terpineol 6.297 0.41% Sabinen 4.878 2.30% α-Eudesmol 14.663 0.39% γ-Terpinen 6.167 2.01% α-Cadinol 14.493 0.33% α-Terpineol 8.229 1.66% E-Piperitol 8.323 0.27% β-Z-Ocimen 5.940 1.45% α-Caryophyllen 12.180 0.26% Germacren 12.526 1.25% Farnesylacetat 16.678 0.24% Terpineolacetat 10.548 1.16% Z-Geraniol 8.756 0.22% α-Terpinen 5.527 1.00% γ-Elemen 13.539 0.19% δ-Cadinen 12.996 0.74% α-Thujen 4.208 0.17% α-Terpinolen 6.645 0.73% übrige 4.16% α-Pinen 4.336 0.73% kursiv: die Substanz wurde nicht eindeutig erkannt * in Limonen sind noch Cineol und β-E-Ocimen enthalten

Tabelle 4.7 Die Hauptkomponenten von ZS

Substanz RT Anteil% Substanz RT Anteil% Limonen* 5.773 21.31% α-Cadinol 14.65 1.29% 4-Terpineol 8.084 14.46% β-Z Ocimen 5.935 1.26% γ-Terpinen 6.174 5.93% α-Cadinol 14.481 1.12% Terpinylacetat 10.552 5.16% Elemen 11.246 1.10% β-Pinen 5.084 5.06% α-Pinen 4.364 1.00% β-Linalool 6.740 4.45% Germacren 12.514 0.82% α-Terpineol 8.237 4.02% Geraniolacetat 10.894 0.61% α-Terpinen 5.528 2.67% Z-Geraniol 8.715 0.56% p-Cimen 5.624 2.30% Caryophyllenepoxid 13.847 0.53% Sabinen 4.893 1.98% α-Phellandren 5.340 0.53% Piperiton 9.168 1.98% E-Piperitol 8.467 0.43% Cadinol 12.991 1.96% Farnesylacetat 16.658 0.40% Anethol 9.603 1.85% α-Thujen 4.236 0.32% β-Caryophyllen 11.715 1.83% übrige 15.06% kursiv: die Substanz wurde nicht eindeutig erkannt * in Limonen sind noch Cineol und β-E-Ocimen enthalten

4 Resultate ___________________________________________________________________

40

Tabelle 4.8 Die Anteile im ätherischen Öl der drei Pflanzen im Vergleich, ausgehend von Zanthoxylum schinifolium

Substanzen ZS% ZBG% ZB% Substanzen ZS% ZBG% ZB% Limonen 21.31% 47.96% 28.16% β -Caryophyllen 1.83% 0.46% 1.11% 4-Terpineol 14.46% 5.27% 12.52% β-Z-Ocimen 1.26% 1.45% 0.95% Terpineolacetat 5.16% 1.16% 4.13% α-Cadinol 1.12% 0.33% 0.72% β-Pinen 5.06% 10.41% 9.16% γ-Elemen 1.10% 0.19%

β-Linalool 4.45% 6.62% 3.95% α-Pinen 1.00% 0.73% 2.66% α-Terpineol 4.02% 1.66% 3.09% Germacren 0.82% 1.25% 0.63% α-Terpinen 2.67% 1.00% 0.87% Geraniolacetat 0.61% 0.61% p-Cymen 2.30% 5.24% Z-Geraniol 0.56% 0.22% 0.53% Sabinen 1.98% 2.30% 4.71% Caryophyllen-

epoxid 0.53% 0.50%

Piperiton 1.98% 1.84% α-Phellandren 0.53% 0.48% Linalylanthranilat 1.96% 7.99% Farnesylacetat 0.40% 0.24% 0.27% Anethol 1.85% 0.50%

Die Zuordnung der Peaks von den GC-MS-Chromatogrammen auf die GC-Chromatogramme wurde mit den folgenden Standardlösungen überprüft:

• Standardlösung 1: (-) α-Pinen, (+)-β-Pinen, R(+)-Limonen, (+)-Terpinen-4-ol, Linolensäure, Piperin, (-) α-Bisabolol; 1mg/ml pro Substanz in Hexan

• Standardlösung 2: (+)-α-Pinen, Myrcen, α-Terpineol, Anethol, Geraniol, Cineol 1mg/ml pro Substanz in Hexan

• Standardlösung 3: α-Thujon, α-Terpinen, Linalool, (+)-α-Terpinylacetat, β-Caryophyllen, Linolsäure; 1mg/ml pro Substanz in Hexan

Mit Hilfe der Retentionszeiten (siehe Tabelle im Anhang) konnten diese Substanzen eindeutig zugeordnet werden. Folgende Substanzen wurden im ätherischen Öl nicht nachgewiesen: Linolensäure, Piperin und Linolsäure. Immerhin konnten 85-95% des Öls charakterisiert werden. Weitere Substanzen sind nur in kleinen relativen Anteilen enthalten.

4 Resultate ___________________________________________________________________

41

4.6 GC-MS

Abbildung 4.5 GC-MS Chromatogramm von S1 (A) und SÖl (B)

Inhaltsstoffe: 1 α-Pinen*, 2 Sabinen*, 3 β-Pinen*, 4 β-Myrcen*, 5 α-Phellandren, 6 α-Terpinen*, 7 p-Cymene*, 8 Limonen*, 9 Cineol*, 10 β-E-Ocimen, 11 β-Z-Ocimen, 12 γ-Terpinen*, 13 β-Z-Terpineol, 14 4-Carene, 15 β-Linalool*, 16 4-Terpineol*, 17 α-Terpineol*, 18 4-Terpineol acetate*, 19 Piperiton, 20 Anethol*, 21 α-Terpineol acetate*, 22 Geraniol acetate, 23 β-Elemen, 24 β-Caryophyllen*, 25 α-Cadinene * Identifikation bestätigt durch Vergleich mit Standard

1

2

3 6

7

8

9

10

12

5

A

B

4

8

9

13

16

17

19 20

21

18

2224 25

19

20

2116

17

15

111

14

23

2

13

15

4 Resultate ___________________________________________________________________

42

Sowohl die ätherischen Öle als auch die CO2-Extrakte wurden mit der gleichen Methode analysiert. Somit konnten die Chromatogramme durch Übereinanderlegen einfach verglichen werden und siginifikante Unterschiede rasch festgestellt werden. In Abbildung 4.5 sieht man das Chromatogramm von ZS Öl in blau und das Chromatogramm von S1 in grün. In Tabelle 4.9 sind die Substanzen der jeweiligen Peaks angegeben. Die Nummern 1-15 sind Substanzen aus dem CO2-Extrakt, die Substanzen 16-34 aus dem ätherischen Öl von Z. schinifolium Im Anhang sind alle Substanzen aufgeführt, die mit Hilfe der NIST Datenbank in den CO2-Extrakten der drei Pflanzen identifiziert werden konnten. In den CO2-Extrakten war es schwieriger die Substanzen zu identifizieren. Wenn Substanzen nicht aufgeführt sind, kann es sein, dass sie aufgrund zu kleiner Menge oder unvollständiger Trennung nicht genügend genau nachgewiesen werden konnten. Es fällt auf, dass im CO2-Extrakt viel weniger leichtflüchtige Terpene, wie zum Beispiel Pinen, vorhanden sind. Ausserdem enthält das Öl viel mehr 4-Terpineol, während der CO2-Extrakt mehr 4-Terpineolacetat enthält. Durch die Hydroxylierung von 4-Terpineolacetat konnte sich im Öl 4-Terpineol bilden.

4 Resultate ___________________________________________________________________

43

4.7 HPLC-DAD-MS In Abbildung 4.6 sind die Chromatogramme von den Extrakten S1, B1 und G1 bei gleichen Bedingungen ersichtlich. Man sieht deutlich die drei Hauptpeaks und die kleineren Nebenpeaks. Die Chromatogramme unterscheiden sich nicht allzu sehr. Auffällig ist, dass die Nebenpeaks in ZBG intensiver sind als in den beiden anderen Chromatogrammen. Die Hauptpeaks haben vergleichbare Intensität.

Abbildung 4.6 HPLC-Chromatogramm der drei Pflanzen

4 Resultate ___________________________________________________________________

44

In Abbildung 4.7 sind die UV Spektren der drei Hauptpeaks Die UV-Spektren der Nebenpeaks sind im Anhang ersichtlich. Diese Form mit mehreren Maxima oder mit Maximum und zwei Schultern ist typisch für Substanzen die konjugierte C=C Doppelbindungen enthalten.

220 240 260 280 300 UV [nm]

0

50

100

150

200

250

Intens.[mAU]

RT: 16.27min UVmax: 272; 285 Schulter: 265 Max. Signalstärke: 270mAU

220 300

RT: 16.89min UVmax: 270; 281 Schulter: 262 Max. Signalstärke: 2500mAU

220 300

RT: 17.70min UVmax: 265; 278; 258 Max. Signalstärke: 1200mAU

Abbildung 4.7 UV-Spektren der drei Hauptpeaks aus dem HPLC-Chromatogramm von Z. schinifolium

220 300

220 240 260 280 300 UV [nm]

220 240 260 280 300 UV [nm]

4 Resultate ___________________________________________________________________

45

Abbildung 4.8 Chromatogramm mit Massenspektren der drei Hauptpeaks

In Abbildung 4.8 ist das Chromatogramm von S1 mit den Massenzahlen des jeweiligen Peaks ersichtlich. Die Masse der drei Hauptkomponenten ist gleich m/z 263. Im Massenspektrum sind als Hauptpeaks [M+Na+] = 286 und [M+H+] = 264 ersichtlich. Weiter ist der Peak [2M+Na+] erkennbar. Alle drei Massenspektren geben genau die gleichen Massen an und auch die gleichen Fragmente (m/z 246, 147, 72).

ZSMS_13.6.05_1_01_246.d: UV Chromatogram, 200-700 nm, Smoothed (9.5,1, SG)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

5x10

Intens.mAU

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time [min]

72.5 147.2

246.2

264.2

286.1

414.7

533.2

549.1

581.2 611.2

+MS, 16.0-16.5min #(1397-1441)

72.5 147.2

246.2

264.2

286.2

414.7

549.1

581.2

+MS, 16.6-17.2min #(1451-1516)

246.2

264.2 286.2

344.2 422.7

549.1

581.2 611.3

+MS, 17.4-18.0min #(1535-1598)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

7x10Intens.

0

2

4

6

7x10

0

2

4

6

7x10

100 200 300 400 500 600 700 m/z

4 Resultate ___________________________________________________________________

46

4.8 HPLC-NMR Analyse Hauptpeak Das NMR ergab für die Protonen folgende Werte: In Tabelle 4.10 sind die 1H-NMR-Daten für den Peak mit RT 16.89min ersichtlich. Die Elution des Peaks erfolgte bei 55% D2O.

Tabelle 4.9 NMR-Werte für Hydroxy-α-Sanshool (Hauptpeak, RT 16.89min)

NMR File: 301495 (Zanthoxylum schinifolium extract), cis-trans-trans compound Chem.

Verschiebung Zuordnung

6.73 dt, Jd=15.7, Jt=7, 1H H-C(3) 6.41 dd, J=14, 12, 1H H-C(10) 6.21 dd, J=14.0, 11, 1H H-C(8) 6.14 dd, J=ca.14, 12, 1H H-C(9) 6.03 dd, J=11, 10, 1H H-C(7) 5.97 d, J=15.7, 1H H-C(2) 5.76 dq, Jd=14.5, Jq=ca.7, 1H H-C(11) 5.41 dt, Jd=10, Jt=8, 1H H-C(6) 3.19 s, 2H NCH2 2.32 q, J=7, 2H H2C(5 or 4) 2.26 q, J=7, 2H H2C(4 or 5) 1.74 d, J=7.0, 3H H3C(12) 1.12 s, 6H HO-C(CH3)2

Die Zuordnung der zur Amidcarbonylgruppe konjugierten Doppelbindung ist durch die chemischen Verschiebungen und die E-Kopplung eindeutig möglich. Ausgehend von der endständigen Methylgruppe an der Doppelbindung können die Doppelbindungsprotonen aufgrund der Kopplungen eindeutig zugewiesen werden. Die vom Ende her gezählt dritte Doppelbindung des Triensystems ist eindeutig Z (J=10 Hz), im Gegensatz zu den beiden E-Doppelbindungen mit J=14-15 Hz. Die beiden Methylengruppen passen durch die beobachteten Kopplungen bei den benachbarten Doppelbindungsprotonen gut in die Positionen 4 bzw. 5 der Fettsäurekette. Der Alkylamid-Teil ist durch die Massendifferenz im MS und die NMR-Signale eindeutig. Die beiden austauschbaren Protonen (OH und NH) können im D2O-haltigen Elutionsmittel nicht beobachtet werden. Diese Substanz entspricht dem bereits bekannten Hydroxy-α-Sanshool.

4 Resultate ___________________________________________________________________

47

Zweiter Peak In Tabelle 4.11 sind die 1H-NMR-Daten für den Peak bei RT 17.70min ersichtlich. Die Elution des Peaks erfolgte bei 54% D2O

Tabelle 4.10 NMR-Werte für Hydroxy-β-Sanshool (RT 17.70min)

NMR File: 301496 (Zanthoxylum schinifolium extract), all-trans compound Chem.

Verschiebung Zuordnung 6.72 dt, Jd=15.5, Jt=6.5, 1H H-C(3)

6.15 – 6.05 br.m, 4H H-C(7,8,9,10) 5.96 d, J=15.5, 1H H-C(2)

5.74 – 5.65 dq, Jd=ca.14.5, Jq=ca.7, 2H H-C(11), H-C(6), overlapping 3.19 s, 2H NCH2 2.26 m, 2H H2C(4 or 5) 2.23 m, 2H H2C(5 or 4) 1.72 d, J=6.7, 3H H3C(12) 1.11 s, 6H HO-C(CH3)2

Die Amidcarbonylgruppe ist ebenfalls konjugiert mit einer E-Doppelbindung, gefolgt von den beiden Methylengruppen. Die endständige Methylgruppe sitzt ebenfalls an einer E-Doppelbindung. Alle restlichen Doppelbindungsprotonen liegen unter einem Haufen, es sind keine Kopplungen ablesbar. Aufgrund der sterischen ähnlichen Nachbarschaften dieser Protonen in einer all-E-Anordnung liegt die Annahme nahe, dass ein all-E-Triensystem vorliegt. Der Alkylamid-Teil ist identisch mit dem oben aufgeführten Molekülteil. Die beiden beschriebenen Verbindungen sind auch die Hauptkomponenten von Zanthoxylum bungeanum. Die Struktur des Hauptpeaks konnte eindeutig als Hydroxy-α-Sanshool identifiziert werden und die Struktur des zweiten Peaks als Hydroxy-β-Sanshool. Der dritte Peak konnte nicht identifiziert werden. Die Menge war zu gering und die unvollständige Trennung vom Hauptpeak erschwert die Identifizierung. Für den dritten Peak konnte auch eine Masse von 263 ermittelt werden.

48

5 Diskussion Das Ziel der Diplomarbeit war die Charakterisierung der Substanzen in Zanthoxylum schinifolium Perikarp, die zu einer lokalanästhesierenden Wirkung führen. Aufgrund der bereits in Zanthoxylum bungeanum nachgewiesenen Alkylamide wurde angenommen, dass auch in Zanthoxylum schinifolium diese oder ähnliche Substanzen für die Wirkung verantwortlich sein könnten. Dazu wurden alle Versuche parallel mit Z. schinifolium und Z. bungeanum Perikarp durchgeführt und die Resultate verglichen. Das ätherische Öl wurde ebenfalls untersucht. Die Dünnschichtchromatographie zeigte bereits ein sehr ähnliches Sekundärstoffmuster der beiden Pflanzen Z. bungeanum und Z. schinifolium. Sowohl die ätherischen Öle als auch die SF-Extrakte ergaben praktisch identische Bandenmuster. Einzig die braunen Flecken der SF-Extrakte waren in Z. bungeanum deutlich stärker als in Z. schinifolium. Die Flecken waren im UV 254 stark fluoreszenzmindernd, was auf konjugierte Doppelbindungen hinwies. Im Verlauf der Untersuchungen wurde bestätigt, dass es sich bei diesen Flecken um Alkylamide handelte. Die Konzentration war in Z. bungeanum auch grösser als in Z. schinifolium was auch den stärkeren Effekt der ZB Extrakte bei der organoleptischen Prüfung erklärte. Da die beiden Hauptkomponenten, Hydroxy-α-Sanshool und Hydroxy-β-Sanshool sich nur durch eine E/Z-Doppelbindung unterscheiden, wurden sie auf dem DC-Chromatogramm nicht getrennt und ergaben einen einzigen grossen Flecken. Die DC zeigte auch, dass Z. bungeanum aus Gansu (ZBG) vom Sekundärstoffmuster her praktisch identisch mit Z. bunganum (ZB) und Z. schinifolium (ZS) war. Die Drogen unterschieden sich daher praktisch nur aufgrund ihrer äusserlichen Erscheinung. Dieser erste Eindruck wurde bestätigt, wenn man die Anwendung der Droge in der Traditionellen Chinesischen Medizin berücksichtigte. Es gelten sowohl Z. schinifolium Perikarp wie auch Z. bungeanum Perikarp als Zanthoxyli Pericarpium, „Huajiao“, und sind somit austauschbar. Die HPLC Analyse der Extrakte zeigte deutlich die drei Hauptpeaks bei allen drei Pflanzen. Die Trennung der Peaks erwies sich als schwierig. Da die Peaks nicht vollständig getrennt werden konnten, wurde eine hohe Strukturähnlichkeit vermutet. Die Masse und die UV-Spektren deuteten klar auf Hydroxy-α-Sanshool und Hydroxy-β-Sanshool hin. Durch die LC-NMR Analyse konnte diese Vermutung eindeutig bestätigt werden und die Strukturen konnten den zwei Hauptpeaks zugeordnet werden. In Z. schinifolium sind also die gleichen Substanzen wie in Z. bungeanum enthalten. Bryant und Mezine [36] konnten nachweisen, dass Hydroxy-β-sanshool keinen Effekt auf die menschlichen Nervenzellen hat. So wird es wohl hauptsächlich Hydroxy-α-sanshool sein, das auch in Z. schinifolium für diese Wirkung verantwortlich ist. Galopin et al. [34] konnten in ihrer Arbeit Struktur- Wirkungsbeziehungen bestätigen. Die Z-Bindung in Verbindung mit der Amidstruktur scheint ein Schlüsselelement für die Schärfewirkung zu sein. (siehe Kapitel 1.4.4) Durch eine präparative Auftrennung der Extrakte könnten einzelne Fraktionen organoleptisch überprüft werden, jedoch müsste dazu die Trennung der Peaks verbessert werden und die präparative Trennung müsste mit toxikologisch unbedenklichen Lösungsmitteln durchgeführt werden.

5 Diskussion ___________________________________________________________________

49

Es stellte sich die Frage, ob die anderen Alkylamide die Xiong et al. [19] publizierten, ebenfalls in Z. schinifolium nachgewiesen werden könnten. In den HPLC-Chromatogrammen von B1 und S1 gab es etliche Nebenpeaks mit gleichen Retentionszeiten. Durch die Zuordnung der Massenzahlen zu diesen Peaks und der Beachtung der typischen UV-Spektren wurde die Vermutung bekräftigt, dass auch weitere in der Arbeit von Xiong et al. publizierte Alkylamide in Z. schinifolium enthalten sind. Die Massenzahlen von 289 und 291 wurden für je zwei Peaks festgestellt. Diese entsprechen ziemlich sicher den Substanzen Hydroxy-γ-Sanshool (m/z 289), Hydroxy-γ-isosanshool (m/z 289) Bungeanool und Isobungeanool (m/z 291). Interessant war ebenfalls, dass die UV-Spektren der beiden Sanshoole die charakteristische Schulter-Maxima Form aufwiesen, während die der Bungeanoole nur ein Maximum zeigten. Die drei konjugierten Doppelbindungen am Fettsäureende der Sanshoole scheinen für diese charakteristischen UV-Spektren erforderlich zu sein. Die Vermutung, dass die Nebenpeaks mit den Massen 289 und 291 den oben erwähnten γ-Sanshoolen und Bungeanoolen entsprachen ist nachvollziebar. Man konnte nicht sagen welcher Peak von jeweils zwei mit derselben Masse welcher Substanz entsprach. Es konnte jedoch angenommen werden, dass das Vorkommen von Bungeanoolen nicht nur auf Z. bungeanum begrenzt ist. Die Konzentrationen der Alkylamide in Z. schinifolium waren geringer als in Z. bungeanum was bereits bei der DC und der organoleptischen Prüfung festgestellt wurde. Leider konnte aufgrund der kleinen Mengen keine Identifizierung der Nebenpeaks durch LC-NMR erfolgen. Durch die konjugierten Doppelbindungen waren die UV-Signale relativ stark und täuschten eine zu hohe Konzentration vor. Bereits mit den Mengen der Hauptkomponenten eine Strukturaufklärung mit NMR durchzuführen, war eine Herausforderung. Die Struktur des dritten Peaks konnte, auch aufgrund der unvollständigen Abtrennung vom Hauptpeak nicht aufgeklärt werden. Somit blieb die Struktur der dritten Hauptkomponente mit der Masse von 263 m/z unklar. Es könnte theoretisch ein weiteres Isomer von Hydroxy-α- und Hydroxy-β-Sanshool sein. Es wäre denkbar, dass es ein weiteres Konfigurationsisomer mit zwei Z-Bindungen (Z-E-Z) gibt. Bei genauerer Betrachtung könnten auch weitere Nebenpeaks Alkylamide sein. Die UV-Spektren der Peaks zeigten ebenfalls die charakteristischen Formen. Jedoch stimmten die Massen nicht mit den bereits in der Arbeit von Xiong et al. [19] publizierten Alkylamiden überein. In der Literatur wurden eine Vielzahl von strukturell unterschiedlichen Alkylamiden beschrieben. Auch wenn davon ausgegangen werden konnte, dass in Zanthoxylum ssp. nur olefinische Alkylamide vorkommen, gäbe es noch einige Strukturen die in Frage kämen. Die Massenspektren müssten zu diesem Zweck genauer analysiert werden. Insbesondere durch genaue Identifizierung gewisser Fragmente, wäre es möglich Strukturannahmen zu treffen. Da die Hydroxylierung von α-Sanshool und β-Sanshool auf das Perikarp beschränkt ist, scheint es logisch, dass auch im Perikarp α- und β-Sanshoole vorhanden sind. Denn die Ausgangssubstanz zur Hydroxylierung müsste vorhanden sein, damit die Reaktion stattfinden kann. Die Masse von α-Sanshool ist 247. Die Masse von 247 konnte auch detektiert werden (siehe Anhang). Bei den Nebenpeaks mit den Massen

5 Diskussion ___________________________________________________________________

50

247 konnte man vermuten, dass es sich um α- und β-Sanshool handelte. Die UV-Spektren dieser Peaks wiesen ebenfalls die typische Form auf. Um weitere Informationen zur Struktur zu bekommen, müssten die Komponenten mit NMR-Spektroskopie untersucht werden, was in Anbetracht der geringen Mengen praktisch unmöglich ist. Daher müsste man die Substanzen zum Beispiel mit Hilfe von präparativer HPLC reinigen und aufkonzentrieren, um sie dann mittels NMR untersuchen zu können. Mit Hilfe der MS könnte die Masse bestimmt werden und eine Vermutung bezüglich der Struktur gemacht werden. Da sich Alkylamide oft nur durch die Z oder E Konfiguration einer Doppelbindung unterscheiden, ist eine NMR-Strukturaufklärung unabdingbar. Denn die Positionen der Z- und E-Bindungen sind mit anderen Methoden nicht festzulegen. Ebenfalls wurde bestätigt, dass einige Alkylamide nicht sehr stabil sind. Insbesondere sobald sie isoliert wurden. Diese Annahme wurde durch den Vergleich der Chromatogramme von B1 und G1 Extrakt bestätigt. Der G1 Extrakt war zur Zeit der Analyse frisch. Der B1 Extrakt war bereits zwei bis drei Monate im Kühlschrank gelagert worden. Die Hauptpeaks waren nach wie vor ersichtlich, jedoch die Nebenpeaks waren bei B1 deutlich schlechter erkennbar (siehe Abb. 4.6). Hydroxy-α- und Hydroxy-β-Sanshool schienen stabiler zu sein. Es schien, dass im frischen Extrakt höhere Mengen weiterer Alkylamide enthalten waren. Ein weiterer Aspekt der Arbeit war die Untersuchung des ätherischen Öls. Das ätherische Öl der Drogen wurde mittels Wasserdampfdestillation gewonnen und gaschromatographisch untersucht. Es ging darum sowohl die Öle der Pflanzen untereinander, sowie die ätherischen Öle mit den CO2-Extrakten zu vergleichen. Bei der Wasserdampfdestillation findet oft eine thermische Zersetzung der Naturstoffe statt, die durch diesen Vergleich festgestellt werden könnte. Eine Hydrolysierung gewisser Substanzen ist nicht auszuschliessen. Die Öle wurden auf zwei verschiedenen Geräten (GC und GC-MS) mit verschiedenen Methoden untersucht. Daher unterschieden sich die Retentionszeiten. Da jedoch bei beiden Geräten die gleiche Säule verwendet wurde, stimmte die Reihenfolge der Peaks überein. Bei den auf dem GC-MS gemessenen Chromatogrammen war eine Identifizierung der Peaks mit Hilfe des Massenspektrums über die NIST Datenbank möglich. Die Identifizierung gilt bei einem Match von über 900 als sicher. Viele Terpene sind sich strukturell sehr ähnlich, daher war die Zuordnung sofort erschwert, wenn zwei Peaks nicht vollständig voneinander getrennt waren, oder wenn die Menge des Peaks zu klein war. Bei den Chromatogrammen vom GC-FID wurden die relativen Anteile am Öl berechnet. Um die Substanzen den Anteilen zuordnen zu können, war es nötig die Peaks mit Hilfe der GC-MS Chromatogramme zu identifizieren. Die Zuordnung wurde mit Referenzsubstanzen überprüft und konnte nur für diese Substanzen als sicher betrachtet werden. Eine eindeutige Zuordnung könnte mit Hilfe der Kovats Indizien erfolgen. Die Kovats Indizien würden einen genauen Vergleich zweier Chromatogramme erlauben, die mit unterschiedlichen Bedingungen auf unterschiedlichen Geräten aufgenommen wurden. In der Arbeit von Chyau et al. [48], die das Öl der Früchte von Z. simulans untersuchten, wurden die Peaks verschiedener Chromatogramme mit Hilfe der Kovats Indizien zugeordnet. Die Zuordnung weiterer Peaks könnte aber auch mit weiteren Referenzsubstanzen erfolgen.

5 Diskussion ___________________________________________________________________

51

Die ätherischen Öle der beiden Pflanzen unterschieden sich in ihrer Zusammensetzung vor allem quantitativ, jedoch kaum qualitativ. Bei beiden Pflanzen wurde Limonen als Hauptkomponente ermittelt. Jedoch war dieser Peak beim GC nicht sauber vom Cineol Peak abgetrennt, was die genaue Detektion der Menge erschwerte. In Z. schinifolium war der Gehalt an Limonen geringer als in Z. bungeanum. In der Literatur wurde der Gehalt an Limonen für die Früchte von Z. bungeanum mit 2.24%[13] und 26.98%[15] und für das Perikarp mit 13.29% [14] angegeben. Der Gehalt ist sicher abhängig von der Region, in der die Pflanze wächst und von der Lagerung der Droge und des Öls. Jedoch schien der Wert von 2.24% [13] für Limonen sehr tief. Es musste berücksichtigt werden, dass im hier ermittelten Limonen-Peak noch Cineol und β-Z-Ocimen enthalten war. Der Gehalt an Cineol wird für Z. bungeanum in der Literatur mit 1.51% (Früchte) [14] und 7.42% (Perikarp) [15] der von β-Z-Ocimen mit 4.02% (Frucht) [14]. Wenn der Gehalt von Limonen mit Hilfe dieser Angaben abgeschätzt wurde, kam man auf 18% (ZB) bis 35% (ZBG) Limonen. Diese Unterschiede können auch mit der Lagerdauer erklärt werden. Das ZBG Öl wurde kurz nach der Destillation untersucht, das ZB Öl war zwei bis drei Monate alt. Es fiel auf, dass das frisch destillierte Öl wesentlich mehr Peaks enthielt als das ältere Öl. Obwohl die Öle im Kühlschrank und gut verschlossen gelagert wurden, veränderte sich die Zusammensetzung relativ rasch. Die Inhaltsstoffe sind leichtflüchtig und verdunsten schnell. Dies wurde auch bei den CO2-Extrakten festgestellt. Die gewonnenen ätherischen Öle wurden ebenfalls mit den apolaren SF-Extrakten verglichen. Im Allgemeinen zeigten beide Chromatogramme jeweils ähnliche Profile mit Ausnahme einiger quantitativer Differenzen. Die relativen Anteile wurden nicht gemessen. Die Hauptkomponente war sowohl im Öl wie im CO2-Extrakt Limonen. Im ätherischen Öl war jedoch 4-Terpineol mit 5-12% reichlich vorhanden, während im CO2-Extrakt viel mehr Terpinylacetat enthalten war. Der Grund für die quantitativen Differenzen zwischen Öl und Extrakt, könnte die Hydrolyse von Substanzen während der Wasserdampfdestillation gewesen sein. 4-Terpinylacetat und 4-Terpineol sind ein gutes Beispiel hierfür. Eine Hydrolysierung von Linalylacetat zu Linalool konnte in geringeren Mengen beobachtet werden. Linalool und Terpineol werden demnach im ätherischen Öl durch Hydrolyse gebildet und kommen nativ in den Pflanzen in kleineren Mengen vor, dagegen wird im Öl fast kein 4-Terpineolacetat nachgewiesen. Ähnliche Beobachtungen machten auch Chya et al. [48] beim Vergleich des Öls und des CO2 -Extraktes von Zanthoxylum simulans Früchten. Einige Nebenkomponenten, die im Öl vorhanden waren, jedoch nicht im CO2-Extrakt, könnten während der Wasserdampfdestillation gebildet worden sein. Einige leichtflüchtige Terpene waren im CO2-Extrakt nur in geringen Mengen nachweisbar. Es ist möglich, dass sie während dem Extraktionsprozess verdunsteten. Das EtOH im Sammelvial wurde durch die Hitze der Restrictor Nadel erwärmt. Nahe der geheizten Restrictor-Nadel wurden wahrscheinlich Temperaturen von über 78°C erreicht. Ein weiterer auffälliger Unterschied war das Vorkommen von Crypton im CO2-Extrakt. In allen drei untersuchten Extrakten war diese Substanz vorhanden aber im Öl wurde sie nicht gefunden. Jedoch konnte diese Erscheinung nicht erklärt werden. Im Extrakt waren weitere, nichtflüchtige Substanzen enthalten, die spät von der

5 Diskussion ___________________________________________________________________

52

Säule kamen. Die NIST Datenbank gab langkettige Alkane an. Dies sind vermutlich die Alkylamide oder ungesättigte Fettsäuren und Bruchstücke davon. Li et al. [49] haben ebenfalls den CO2-Extrakt mittels GC-MS untersucht. Sie konnten β-Pinen (10.3%) als Hauptkomponente in einem CO2-Extrakt nachweisen. Sie wiesen auch eine recht hohe Menge an 4-Terpineol von 4.37%, aber kein Terpenylacetat nach. Diese Feststellung lässt sich aufgrund der hier gewonnenen Resultate nicht genau nachvollziehen. Im CO2-Extrakt waren, rein durch den Extraktionsprozess, noch Substanzen enthalten, die nicht leichtflüchtig sind. Zum Beispiel fette Öle oder Alkylamide. In der Arbeit von Li et al. [49] wurden auch Palm- und Ölsäure gefunden. Abschliessend ist zu sagen, dass die ätherischen Öle dieser Zanthoxylum Arten sehr komplex sind und viele verschiedene Inhaltsstoffe aufweisen. Daher kann die Zusammensetzung und der Gehalt der jeweiligen Komponenten von Pflanze zu Pflanze stark variieren. Bereits zwischen ZB und ZBG sind diesbezüglich Unterschiede feststellbar. Es ist bekannt, dass die Zusammensetzung der ätherischen Öle auch vom Standort der Pflanze abhängt. Einige Komponenten werden erst durch die Trocknung und Lagerung der Droge gebildet. Dazu gibt es eine interessante Arbeit von Jiang und Kubota [50]. Sie haben die Früchte von Z. piperitum in verschiedenen Reifestadien untersucht. Diese Arbeit zeigt ebenfalls, dass auch in Z. piperitum zum grössten Teil die gleichen Inhaltsstoffe nachgewiesen werden konnten wie in Z. schinifolium und Z. bungeanum. Das ätherische Öl dieser Gewürzpflanzen macht das unverkennbare, vielschichtige Aroma aus, während die Alkylamide, insbesondere Hydroxy-α-Sanshool für die lokalanästhesierende Wirkung verantwortlich sind.

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6 Danksagung Ganz besonders möchte ich Herrn Prof. Dr. Matthias Hamburger danken. Er bot mir die Gelegenheit, dieses interessante Thema im Rahmen einer Diplomarbeit am Institut für Pharmazeutische Biologie an der Universität Basel zu bearbeiten. Ich schätzte seine vielen Inputs und die Möglichkeit des selbständigen Arbeitens. Herr Hamburger nahm sich immer Zeit, erklärte mir sämtliche Sachverhalte und gab mir praktische Ratschläge, wodurch ich sehr viel lernen konnte. Ich möchte mich auch bei Herrn Dr. Olivier Potterat für sein Engagement und die kompetente Betreuung bedanken. Er half mir bei der Klärung vieler Fragen und Probleme und war immer hilfsbereit und positiv Eingestellt. Dank der Unterstützung durch Herrn Dr. Leonhard Hagmann wurde die Strukturaufklärung mittels LC-NMR erst möglich. Ich danke ihm für die interessanten Gespräche und die Zeit, die er sich für dieses Projekt genommen hat. Durch diese Möglichkeit der Strukturaufklärung mit LC-NMR wurde mir bewusst, wie gross der Nutzen dieser Methode in der Naturstoffforschung ist. Besonderer Dank gilt Sabine Kiefer und Jeannette Egli für die Unterstützung während der Durchführung meiner Arbeit und die vielen praktischen Tipps. Sie hatten immer ein offenes Ohr für meine Anliegen. Auch bei den übrigen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts möchte ich mich für die angenehme, offene Atmosphäre bedanken. Ich konnte immer auf ihre Unterstützung zählen. Meinen Eltern möchte ich für ihre Unterstützung und ihr Verständnis danken. Ohne sie wäre es für mich nicht möglich, dieses Studium durchzuführen. Während der letzten Monate haben mich viele Freundinnen und Freunde unterstützt. Mein Freund Mike hat mir bei sämtlichen Computer- und Grafikproblemen geholfen und die Arbeit gegengelesen. Ich danke ihm dafür von Herzen.

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charakterisierung der lokalanästhesierenden verbindungen ... · charakterisierung der...

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