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Chapter 14

Regulation of Bacterial

Gene Transcription

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14.1 Messenger RNA Characteristic of Bacterial mRNA;

1. monocistronic or polycistronic

박테리아에서는 전사가 끝나기 전에 해독이 일어나 nascent RNA를 변화 시킬 수 있는

기회가 없으나 진핵 세포 에서는 초기 전사체를 핵 내에서 성숙된 mRNA로 변화 시켜

세포질로 보내 해독이 일어난다.

해독틀과 단백질 합성의 start와 stop signal에 해당하는 지역을 cistron 이라고 하며

하나의 polypeptide를 암호화하는 mRNA를 monocistronic mRNA라고 함.

두개나 세개의 cistron을 포함하는 mRNA를 polycistronic mRNA이라고 한다.

박테리아에서는 mono보다는 poly가 더 보편적이며 대부분 single metabolic pathway를

위해 필요한 단백질들을 암호화한다.

coding region이외의 지역 중 앞 부위를 5’ untranslated region (5’-UTR) 이라고 하며

아래 부위를 3’ untranslated region (3’-UTR) 이라고 함.

2. Bacterial mRNA는 다른 RNA에 비하여 short-life time을 갖고 있다.

mRNA의 수명은 단지 수분에 불과하여 낭비적으로 보일지 모르지만 조절에 중요한

역할을 한다.

3. mRNA의 합성을 조절함으로 유전정보의 흐름을 조절 할 수 있다.

4. mRNA의 합성은 negative 그리고 positive regulation에 의하여 조절된다.

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Negative versus positive regulation Figure 14.1

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14.2 Lactose operon

Figure 14.3

lactose의 metabolism에는 그림처럼 lactose를 galactose와

glucose로 분해하는 β-galactosidase와 세포 내로 lactose를

들어가게 하는 lactose permease가 필요하다.

lacZ 유전자는 β-galactosidase의 구조 유전자이며 그림 14.3

에서 보듯이 o-nitrophenyl- β-galactoside (lactose analog)를

분해하여 노란색을 띄는 o-nitrophenoxide를 만든다.

lacY는 lactose permease의 구조 유전자임

lacA 유전자는 β-galactoside transacetylase를 암호와 하며

acetyl-CoA로 부터 acetyl group을 lactose analog로 옮기는

역할을 하나 lactose metabolism에는 필요가 없다.

정확한 역할은 연구 중이다.

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The lac structural genes are regulated

Figure 14.5

E. coli (lac+ genotype)를 lactose-free 배지에서 키우면

세포내의 β-galactosidase, permease, tranacetylase의

농도가 매우 낮다 (세포당 1-2개의 분자).

그러나 배지에 lactose를 가해주면 이들 단백질의 농도는

세포당 105까지 증가한다.

그림처럼 다시 제거 하였을때 lac mRNA는 감소하나

단백질은 당장 감소하지 않는다.

Inducible enzymes; 위의 경우처럼 배지에 특정 분자 (lactose)를 가했을때 합성이 증가

하는 단백질을 의미함.

Repressible enzyme; 특정 분자 (예; tryptophan)를 가하면 tryptophan을

합성하는데 필요한 단백질이 감소하는 것처럼 감소하는 단백질.

Constitutive enzymes; 항상 일정한 농도로 합성되는 단백질.

lactose를 가해서 생산된 β-galactosidase는 lactose를 분해하기 때문에

농도가 계속 감소하여 lactose를 실험에 거의 사용하지 않는다.

대신에 TMG와 IPTG 같은 analog를 사용하며 이들은 β-galactosidase의

기질이 되지 않고 반응을 계속 유도한다.

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Genetic studies provide information about the regulation of lac mRNA

1950년대 Monad와 Jacob은 lac system의 기작을 조사하기 위하여mutant를 분리하여

실험을 함 (lacI와 lacO에돌연변이가 생긴것을 이용함).

lacI에 돌연변이가 생긴것을 lacI-

lacO에 돌연변이가 생긴것을 lacOC라고함.

(a) lacI+에서 만들어지는 repressor protein이

trans로 작용하며 박테리아 염색체의 operator에

결합하여 효소의 생산을 막음. 그러나 lactose가

첨가되면 inducible synthesis가 된다.

plasmid는 lacZ-라서 효소가 생산이 안된다.

(b) lacs는 super repressor를 생산하여 박테리아

염색체의 operator에 결합하고 lactose가

첨가 되어도 반응을 하지 않아 효소의 생산이

induce되지 않는다. (non-inducible synthesis)

(c) lacOc는 operator 돌연변이라서 repressor가

결합하지 않는다. 그러므로 constitutive

synthesis를 한다.

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The lac operon model

Figure 14.7

Monad와 Jacob는 1961년 operon 모델을 창안함.

1. single polycistronic lac mRNA 분자에서 lacZ, lacY, lacA 유전자의 product가 나온다.

2. promotor 지역은 lacO의 바로 옆에 위치하며 lacI와 lacO의 중간에 위치.

3. operator는 repressor 단백질이 결합하는 염기서열이다.

4. repressor protein이 operator에 결합하면 lac mRNA가 생산되지 않는다.

5. inducer는 repressor에 결합하여 lac mRNA의 합성을 증가시킨다. 이때 operator는

비워있고 mRNA 합성은 시작된다. 이를 depression이라고 한다.

이는 negative regulation이나 positive regulation을 받는다는 것도 후에 배운다.

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Allolactose; true inducer of the lactose operon.

operon model에는 두가지 문제점이 존재

1. lactose (inducer)는 repressor와 결합하기 위하여 세포내로

들어가야 하는데 이때 permease가 필요하다.

2. 분리된 lac repressor는 lactose와 결합하지 않고 isomer인

allolactose와 결합한다. 그림처럼 lactose에서

β-galactosidase에 의하여 만들어진다.이는 초기에 basal

synthesis에 의하여 소량의 β-galactosidase와 permease가

합성되어 존재하기 때문이다.

Lac repressor 와 inducer의 결합

Gilbert와 동료들이 repressor를 1966년 분리함.

그림에서 보는 것처럼 repressor (붉은색)을 bag 에 넣고

radioactive IPTG (푸른 십자가)를 가함.

repressor가 없으면 IPTG의 농도는 항상 일정하나

repressor가 있으면 bag안의 IPTG 농도가 높다.

lac repressor는 154 kDa의 homotetramer이며 각각은

360개의 아미노산으로 되고 한 분자의 IPTG가 결합한다.

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Lac repressor와 operator의 결합

이들간의 결합을 보기 위하여 filter-binding assay를 시행함.

위의 표에서 보는 것처럼 lac DNA와 repressor를 같이 넣어준 것이 필터에 남게 된다.

repressor는 -7에서 +28까지 35base에 결합한다. 그러므로 operator는 전사 시작부위

(+1)와 promoter의 -10box 일부를 포함한다. 또한 operator는 two-fold axis symmetry이나

(11번을 중심으로) 완전한 palindrome은 아니다.

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The lac operon has three operators for repressor binding

operon은 3개의 operator를 갖고 있음. 앞에서 배운 +11의 operator는 lacO1이며 +412에

lacO2 가 있고 -82에 lacO3가 존재함.

이들이 lac operon의 조절에 어떠한 영향을 미치는가?

하나 혹은 그 이상의 opeator에 돌연변이를 야기 시킨 후에 결과를 관찰함.

lacO1에 point mutation이 생기면 repression이 5-50배 감소. lacO2나 lacO3에 문제가

생기면 repression이 2배 감소. 둘 다 파괴되면 70배가 감소된다. lacO1과 다른 어느 하나에

문제가 생기면 repress system이 완전히 파괴된다. 그러므로 lacO1이 주된 역할을 하고

다른 것은 보조적인 역할을 한다. 이제 lac repressor의 구조를 배우며 어떻게 operator와

작용하는가를 배운다.

우측그림; repressor monomer 분자의 구조

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The Lac repressor의 구조

Figure 14.15 Figure 14.14 Figure 14.16

1. N-terminal domain (headpiece, residue 1-45); headpiece 내의 helix-turn-helix motif가

operator에 결합. (그림 14.14) 특히 recognition helix 부위가 DNA major groove에 자리

잡고 다른 부위인 stabilization helix는 결합을 안정화 시킨다.

2. Repressor dimer의 두 개의 hinge region (residues 46-62)은 연결되어 lac operator의

minor groove의 결합하여 DNA를 휘게한다. (그림 14.15)

3. ligand binding 혹은 core domain (residue 62-340)은 N-terminal subdomain과

C-terminal subdomain으로 나뉜다. lac repressor dimer 형성에 중요한 역할을 하며

IPTG가 두 subdomain간의 pocket에 결합하게 된다. (그림 14.16)

repressor와 IPTG가 결합하였을 때의 구조를 오랜지색으로 나타내고 repressor와 DNA

가 결합하였을 때를 붉은색으로 표시하여 구조가 바뀜을 알 수 있다. 그러므로 IPTG가

결합하면 구조에 변화가 생겨 더 이상 DNA에 결합하지 못한다.

4. tetramerization helix (residue 341-357)는tetramer를 만드는데 중요한 역할을 함.

(그림 14.17)

Figure 14.17

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Figure 14.18

repressor dimer가 DNA에 결합한 model.

IPTG (초록색)가 결합하여 구조의 변화가

생겨 DNA와의 결합이 분리된다.

repressor가 tetramer로 존재하는 이유를 그림으로

나타냄. DNA looping에 의하여 lac repressor가 두개의

operator 지역에 결합을 하게됨.

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14.3 Catabolite repression 박테리아를 glucose와 lactose가 동시에 존재하는

배지에서 키우면 glucose를 다 사용 할 때까지는

lac operon이 작동이 안된다. glucose (혹은 다른

쉽게 사용 될 수 있는 carbon source)에 의하여

lactose나 다른 inducible enzyme등의 발현이 저해

되는 것을 catabolite repression 이라고 한다.

그림에서 화살표는 glucose가 다 쓰인 시기 이며

이때부터 β-galactosidase가 만들어진다.

610nm에서는 세포의 양을 측정한다.

The inhibitory effect of glucose on expression of the lac operon is a complicated

process 1965년 E. coli 배양에 glucose를 가하면 cAMP (3’5’-cyclic

adenylate) 농도가 급감하는 것을 발견하였으며. cAMP는

adenylate cyclase에 의하여 ATP로부터 만들어진다.

cAMP의 역할을 보기 위하여 glucose가 없고 lactose만 있어도

lac enzyme를 합성하지 못하는 두 가지 돌연변이체를 조사함.

Class I mutants; adenylate cyclase에 결함이 있어 ATP를

cAMP로 만들지 못한다.

Class II mutants; cAMP에 결합하는 단백질에 결함이 있으며

이들을 cAMP receptor protein (CRP) 혹은 catabolite activator

protein (CAP)이라고 한다. 즉 cAMP•CRP 는 positive regulator

로 작용을 한다.

14 CRP-cAMP에 의한 lac operon의 positive regulation

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Figure 14.23

PTS – phosphoenolpyruvate (PEP) phosphotransferase system

adenylate cyclase는 phosphorylation이 되어야 활성화되어 cAMP를 만드는데 glucose는

adenylate cyclase의 phosphorylation을 막아 cAMP를 합성 못하게 한다.

PEP에서 나온 P는 glucose가

존재하면 glucose를

phosphorylation 시키는데

사용된다

Catabolite repression by cAMP modulation and inducer exclusion

cAMP modulated mechanism;

glucose가 존재하지 않으면 EIIA의 P가 AC

(adenylate cyclae)를 phospholylation 시키

는데 사용되어 cAMP가 만들어진다.

inducer exclusion mechanism;

dephosphorylated 된 EIIA는 lactose

permease에 결합하여 permease를 불활성화

시킨다. 즉 Glucose가 많으면

dephosphorylated 된 EIIA가 많아 lactose가

세포내로 들어오지 못한다.

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Figure 14.25

The cAMP•CRP complex binds an activator site (AS) upstream from the lac promoter

and activates lac operon transcription

cAMP•CRP가 DNA에 결합한 구조를 연구함.

그림처럼 CRP는 209 아미노산으로 된 두개의 동일한

polypeptide로 이루어짐. 각각에 두개의 cAMP가 결합.

cAMP가 없으면 CRP•DNA 결합은 아주 약하나 cAMP•CRP

complex는 activator site (AS)라는 특정 DNA 서열에

결합을 한다. lac operon의 AS 중앙은 61.5bp upstream이다.

AS는 5’-AAATGTGATCTAGATCACATTT-3’

3’-TTTACACTAGATCTAGTGTAAA-5’

cAMP•CRP complex는 또한 RNA polymerase holoenzyme

과도 결합을 한다.

CRP의 156-164 residue에는 AR1

(activating region)이라는 RNA 중합

효소의 α factor와 결합하는 부위존재.

그림처럼 다양한 CRP와 돌연변이된

AR1을 만들어 실험한 결과 promoter

proximal subuint에 존재하는 AR1이

필수적이고 promoter distal subunit에

존재하는 AR1은 필요치 않은 것이

밝혀짐

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14.4 galactose operon Figure 14.28 galactose operon은 repressor와 cAMP•CRP에 의하여 조절된다.

gal operon은 그림처럼 4개의 구조 유전자를 갖고 있으며 galactose를 glucose-1-

phosphate로 전환 시킨다.

gal operon은 repressor와 cAMP•CRP에 의하여 영향을 받는다. repressor 구조 유전자인

galR은 다른 유전자보다 훨씬 위쪽에 위치하며 두 개의 operator인 galOE와 galOI를 갖고

있다. 두개의 promotor 지역 (P1과 P2가 존재하나 중복됨)과 하나의 cAMP•CRP AS 부위를

갖고 있다. galOE는 promoter의 윗쪽에 존재하며 galOI는 galE내에 존재한다.

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gal repressor는 dimer를 이루지만 lac repressor처럼

tetramer를 만들지 않는다. lac repressor는 tetramer

를 만들어 DNA looping이 일어나나 gal operon

에서는 HU라는 histone-like protein이 promoter

지역에 결합하여 DNA looping을 만든다.

classII cAMP-dependent promoters; gal operon에서는 activator site (AS)가 -41.5위치에

존재하며 (lac operon에서는 -61.5) lac promotor와는 다른 결합을 한다.

그림처럼 CRP는 3개의 activating region을 갖고 있으며 AR1은 CRP dimer의 upstream

subunit에 AR2와 AR3는 down stream subunit에 존재하며 αCTD, αNTD와 동시에

결합한다. 또한 σ subunit과도 결합을 한다. lac operon과는 완전히 다른 결합을 한다.

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14.5 The araBAD Operon

Figure 14.32

L-arbinose는 carbon source로 이용되며 그림처럼 대사 작용을 한다. arabinose가 존재

할 때만 작동하기 때문에 inducible하며 arabinose 자체가 inducer이다.

araBAD operon; araC 유전자는 regulatory 단백질을 만들고 이곳에 arabinose가 결합하여

전사를 촉진시킨다. arabinose가 없어서 regulatory protein에 결합하지 못하면 전사가 일어

나지 않는다. araB, araA, araD는 arabinose degradation에 필요한 효소를 만든다.

PC는 araC에 대한 promoter이고 PBAD는 araBAD에 대한 promoter이다. 서로 전사의

방향은 반대임. 또한 ara operon의 전사는 cAMP•CRP가 필요하며 cAMP•CRP AS 부위가

존재함

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AraC undergoes a conformation change after binding arabinose

CRP provides further activation of araBAD after activation by AraC

AraC는 homodimer로 각각 N-terminal과 C-

terminal을 linker가 연결해준다. C-terminal은

DNA와 결합하고 N-terminal은 dimerization을

이루고 arabinose binding pocket이 존재한다.

arabinose가 없으면 N-terminal arm은 C-terminal

에 붙어서 linker와 함께 구조를 강하게 만든다.

그러나 arabinose가 첨가되면 N-terminal arm이

N-terminal domain 쪽으로 이동하여 DNA의 결합 에 영향을 준다. 그리고 I1,I2에

결합을 하여 전사가 개시됨.

하나의 α subunit의 c-terminal 지역이

araC protein과 CRP와 결합을 하고

NTD가 σ와 결합. 다른 α subunit의

c-terminal 지역이 CRP와 결합하고

NTD가 β와 결합. 이러한 결합에 의하여

RNA polymerase가 전사를 개시함.