CENTRO UNIVERSITÁRIO CHRISTUS

CURSO DE ODONTOLOGIA

MESTRADO EM CIÊNCIAS ODONTOLÓGICAS

TAIRA ENDI DE FLAVIANO ALBUQUERQUE

EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DA PIPERINA PROVENIENTE DA

PIPER NIGRUN.

FORTALEZA

2020

TAIRA ENDI DE FLAVIANO ALBUQUERQUE

EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DA PIPERINA PROVENIENTE DA

PIPER NIGRUN.

Dissertação apresentada ao Curso de

Mestrado Acadêmico em Ciências

Odontológicas do Centro

Universitário Christus, como um dos

requisitos exigidos para a obtenção

do título de mestre.

Orientador: Prof. Dr. Jiovanne

Rabelo Neri

Coorientadora: Profa. Dra. Bruna

Marjorie Dias Frota de Carvalho

FORTALEZA

2020

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Centro Universitário Christus - Unichristus

Gerada automaticamente pelo Sistema de Elaboração de Ficha Catalográfica doCentro Universitário Christus - Unichristus, com dados fornecidos pelo(a) autor(a)

A345 Albuquerque, Taira Endi de Flaviano. Extração, caracterização e avaliação do potencial antimicrobiano eantioxidante da piperina proveniente da Piper Nigrun / Taira Endi deFlaviano Albuquerque. - 2020. 53 f. : il. color.

Dissertação (Mestrado) - Centro Universitário Christus - Unichristus,Mestrado em Ciências Odontológicas, Fortaleza, 2020. Orientação: Prof. Dr. Jiovanne Rabelo Neri. Coorientação: Profa. Dra. Bruna Marjorie Dias Frota de Carvalho.

1. Clareamento dental. 2. Antioxidantes. 3. Piper nigrun. 4.Antibacterianos. 5. Antifúngicos. I. Título. CDD 617.6

TAIRA ENDI DE FLAVIANO ALBUQUERQUE

EXTRAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO E ANTIOXIDANTE DA PIPERINA PROVENIENTE DA

PIPER NIGRUN.

Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Odontológicas

do Centro Universitário Christus, como requisito para a obtenção do título de mestre em

Odontologia.

Aprovada em: ___/___/___

BANCA EXAMINADORA

________________________________________

Prof. Dr. Jioavanne Rabelo Neri (orientador)

Centro Universitário Christus (Unichristus)

_________________________________________

Profa. Dra. Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa

Universidade de Fortaleza (UNIFOR)

_________________________________________

Profa. Dra. Lívia de Oliveira Barros

Centro Universitário Christus (Unichristus)

Dedico este trabalho ao meu pai, Carlos

Flaviano (in memoriam) e a todos os meus

familiares, que sempre me apoiaram, dando-me o

suporte necessário para concluir a realização de

mais um sonho. Amo vocês.

AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

A Deus, sempre presente e enchendo de bênçãos minha vida. Sem Ele, nada seria

possível.

Aos meus pais, Flaviano e Núbia, minha gratidão por todo amor, apoio, dedicação,

ensinamentos e incentivos na minha vida. Vocês são minha base e maiores exemplos.

Ao meu marido, Diego, pela parceria, por entender minhas dificuldades e me dar todo o

apoio necessário para superá-las, me enconrajando e cuidando da nossa família.

Ao meu filho, Murilo, por todos os sorrisos e abraços dados quando precisei, por me

presentear com o mais puro amor e por ser a razão de tudo na minha vida.

Às minha irmãs, Uaira e Raíra, maiores presentes que eu poderia ganhar na vida.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Jiovanne Rabelo Neri, por todo o aprendizado, por

compartilhar de forma tão generosa seus ensinamentos, pela confiança e oportunidade,

pela paciência e palavras de apoio, por ser um exemplo de profissional e inspiração, não

só para mim, mas para todos com quem convive. Sempre serei grata.

À minha coorientadora, Profa. Dra. Bruna Marjorie Dias Frota de Carvalho, pela

amizade, disponibilidade e por todo o empenho e colaboração para engrandecer este

trabalho.

Aos meus colegas de mestrado, turma querida, por suas risadas e brincadeiras que fez

com que tudo ficasse mais leve. Os levarei sempre comigo.

À todos os professores do curso de Mestrado em Ciências Odontológicas do Centro

Universitário Christus, obrigada pela dedicação e pela contribuição na minha formação

acadêmica.

À Universidade Federal do Ceará (UFC) e ao Programa de Pós-Graduação em

Odontologia (PPGO) pelas oportunidades adquiridas durante essa pós-graduação, em

especial por me permitir usar seu laboratório, local imprescindível para a realização

desse projeto.

“Sem sonhos, a vida não tem brilho. Sem metas, os sonhos não têm alicerces. Sem

prioridades, os sonhos não se tornam reais.”

(Augusto Cury)

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi realizar a extração da piperina, proveniente da Piper

nigrun, avaliar sua atividade antimicrobiana e seu efeito antioxidante quando usado como

pré-tratamento de cimento resinoso auto-adesivo unido ao esmalte clareado. A extração

da piperina foi realizada através do sistema de refluxo de água e confirmada por

espectrofotometria UV-Vis. Doze fragmentos de esmalte foram divididos em 6 grupos

(n=2), de acordo com o tratamento do esmalte e tempo de cimentação: Sem peróxido de

hidrogêgio 35% (PH) (grupo controle); PH + cimentação imediata; PH + cimentação após

7 dias; PH + piperina 0,001%; PH + piperina 0,002% e PH + piperina 0,004%. Com

exceção do grupo sem PH, todos os outros fragmentos foram submetidos ao clareamento.

Os fragmentos foram reumidecidos com a solução de piperina destinada para cada grupo

e posterior cimentação de blocos confeccionados de resina composta, utilizando cimento

auto-adesivo. Após a cimentação, os blocos foram imediatamente seccionados em fatias.

Para a determinação do grau de conversão, foi realizada 1 leitura em cada espécime

através de um espectrômetro micro Raman. Para determinação da ação antifúngica

(Candida albicans) e antibacteriana (Streptococcus mutans) foi utilizada a técnica de

microdiluição em caldo preconizada pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards

Institute) (documento M27-A2). As concentrações das soluções dos extratos diluídos

foram: 0,004%, 0,002%, 0,001%, 0,0005% e 0,00025% de piperina, que foram

comparadas com os grupos controles. O rendimento da extração da piperina foi de 92,86%

e sua pureza foi de 99,9%. O PH + cimentação imediata apresentou o menor grau de

conversão quando comparado aos demais grupos (p<0,05). Não houve diferença

estatística entre os grupos Sem PH, PH + cimentação após 7 dias; PH + 0,001% piperina,

PH + 0,002% piperina; PH + 0,004% piperina (p>0,05). A concentração bactericida

mínima (CBM) comprovou ação antimicrobiana (p<0.05) na concentração de 0,004%

(08±0.2 UFC/mL) em relação ao controle negativo, sem tratamento, (321±2.5 UFC/mL),

e ao controle positivo com uso de clorexidina 0,12% (3.2±0.1 UFC/mL). A concentração

fungicida mínima (CFM) comprovou redução de colônias na concentração de 0,004%,

quando comparado aos demais grupos e controles. É possível concluir que a piperina

apresentou capacidade antifúngica e antibacteriana e evitou a redução do grau de

conversão de um cimento resinoso auto-adesivo aplicado em esmalte clareado com

peróxido de hidrogênio a 35%.

Palavras-Chave: Clareamento dental. Antioxidantes. Piper nigrun. Antibacterianos.

Antifúngicos.

ABSTRACT

The aim of the present study was to perform the extraction and characterization of

piperine, from Piper nigrun, to evaluate its antimicrobial activity and its antioxidant

effect in a self-adhesive resin cement joined to the bleached enamel. The extraction of

piperine was performed through the water reflux system and confirmed by UV-Vis

spectrophotometry. Eighteen enamel fragments were divided into 6 groups, according to

the antioxidant solution used: Without hydrogen peroxide (PH), control group; PH +

immediate cementation; PH + cementation after 7 days; PH + piperine 0.001%; PH +

piperine 0.002% and PH + piperine 0.004%. With the exception of the group without

PH, all other fragments were subjected to whitening. The fragments were re-moistened

with the piperine solution destined for each group and later cemented blocks made of

composite resin, using self-adhesive cement. After cementation, the blocks were cut into

slices. To determine the degree of conversion, 1 reading was performed on each

specimen using a micro Raman spectrometer. To determine the antifungal (Candida

albicans) and antibacterial (Streptococcus mutans) action, the broth microdilution

technique recommended by the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute),

document M27-A2, was used. The concentrations of the solutions of the diluted extracts

were: 0.004%, 0.002%, 0.001%, 0.0005% and 0.00025% of piperine, which were

compared with the control groups. The yield of piperine extraction was 92.86% and its

purity was 99.9%. PH + immediate cementation showed the lowest degree of conversion

when compared to the other groups (p <0.05). There was no statistical difference between

the groups without PH, PH + cementation after 7 days; PH + 0.001% piperine, PH +

0.002% piperine; PH + 0.004% piperine (p> 0.05). The minimum bactericidal

concentration (CBM) proved antimicrobial action (p <0.05) in the concentration of

0.004% (08 ± 0.2 UFC / mL) in relation to the negative control, without treatment (321

± 2.5 UFC / mL), and the positive control using 0.12% chlorhexidine (3.2 ± 0.1 CFU /

mL). The minimum fungicidal concentration (CFM) showed a reduction of colonies in

the concentration of 0.004%, when compared to the other groups and controls. It is

possible to conclude that the piperine showed antifungal and antibacterial capacity and

avoided the reduction of the degree of conversion of a self-adhesive resin cement applied

in a clear enamel with 35% hydrogen peroxide.

Keywords: Piper nigrun. Tooth Bleaching. Anti-Bacterial Agents. Antioxidants.

Antifungal Agents.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Frutos frescos (a) e moídos (b) da Piper nigrun. Estrutura química da

Piperina (c). Cristais de piperina após extração e caracterização (d) ......................... 15

Figura 2 – Espectro UV-Vis da piperina .................................................................... 32

Figura 3 – Espectro de RMN da piperina .................................................................... 33

Figura 4 - Protocolos terapêuticos realizados no experimento de MIC e os dados

numéricos obtidos pelo Teste ELISA. ....................................................................... 34

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Desenho experimental ................................................................................ 28

Tabela 2 - Valores de grau de conversão in situ (média ± desvio padrão), de acordo com

tratamento usado. ........................................................................................................ 33

SUMÁRIO

1. Introdução geral ................................................................................... 14

2. Objetivos ................................................................................................ 19

a. Objetivo geral ............................................................................ 19

b. Objetivos específicos ................................................................. 19

3. Capítulo .................................................................................................. 20

4. Conclusão geral ..................................................................................... 46

5. Referências ............................................................................................. 47

6. Anexos .................................................................................................... 52

14

1. INTRODUÇÃO GERAL

O surgimento dos antibióticos, produzidos através da fermentação microbiana e

os de origem sintética, causaram um declínio no interesse da indústria farmacêutica pela

pesquisa de plantas medicinais (MONTARANI, BOLZANI, 2001). Contudo, nas últimas

décadas, devido a uma mudança nos paradigmas da sociedade moderna, os produtos de

origem vegetal voltaram a ocupar um papel de destaque nas pesquisas. (MONTARANI,

BOLZANI, 2001)

O reino vegetal tem contribuído de forma significativa para o fornecimento de

moléculas úteis ao tratamento de doenças que acometem os seres humanos (QUIJIA,

CHORILLI, 2020; PHILLIPSON, ANDERSON, 1989). Detentores de um mercado

extremamente lucrativo, os fitofármacos, redirecionaram o foco da indústria farmacêutica

para produtos de origem vegetal (MONTARANI, BOLZANI, 2001; SHARAFEDDIN,

FARSHAD, 2015).

A pimenta do reino (Piper nigrum) é uma das espécies de arbustos e ervas da

família Piperaceae que possui vários usos medicinais e tem despertado interesse

científico há quase duzentos anos (MARQUES et al., 2010; PARTHASARATHY;

CHEMPAKAM; JOHN ZACHARIAH, 2008). Nativa da região costeira da Índia e,

amplamente, distribuída em regiões tropicais, a Piper nigrum é uma planta de grande

valor econômico, pois é considerada um dos condimentos mais valorizados no mundo

(BUTT et al. 2013; LOURINHO et al. 2014). A grande atenção científica destinada a

pimenta do reino é devido a sua composição química, onde estão presentes substâncias

com elevado potencial para o desenvolvimento de fármacos, como por exemplo, agentes

antimicrobianos e antioxidantes (QUIJIA, CHORILLI, 2020).

A piperina (N-[5(1,3-benzodioxola-4-il-1-oxo-penta-2E,4E-dienil)]piperidina) é

um alcalóide nitrogenado derivado da piperidina, e é principal componente ativo presente

15

na Piper nigrun (PARMAR et al. 1997; SRINISAVAN, 2007; FERREIRA et al. 2012). A

estrutura química da piperina é composta por três subunidades: 1) um grupo 1,3-

benzodioxola, também chamado núcleo piperonal (subunidade A); 2) uma cadeia de ácido

pentadienóico (subunidade B) e um grupamento amina constituída de um anel de

piperidina (subunidade C) (Figura 1) (FERREIRA et al., 2012). A maior ocorrência da

piperina se dá nos frutos secos, e o rendimento da extração pode chegar à 7%, tornando a

pimenta do reino uma fonte renovável desta substância (IKAN, 1991; FERREIRA et al.,

2012).

Figura 1. Frutos frescos (a) e moídos (b) da Piper nigrun. Estrutura química da Piperina

(c). Cristais de piperina após extração e caracterização (d). (FERREIRA et al., 2012)

Pesquisas indicaram que a piperina possui vários efeitos farmacológicos e

excelentes propriedades terapêuticas já comprovadas, incluindo atividade antiparasitária

(KAPIL, 1993), antipirética e analgésica (PARMAR et al. 1997), antinflamatória (BAE

et al. 2010), contraceptiva e antiespermatogênica (MALINI et al. 1999), inseticida

(SRINIVASAN, 2007), imunomoduladora e anticarcinogênica (SUNILA, KUTTAN,

2004; ABOUAITAH et al., 2020).

16

Os produtos naturais parecem repesentar, também, novos caminhos para o

tratamento de doenças infecciosas (Saleem et al., 2010). Neste sentido, a piperina tem

demonstrado atividade antimicrobiana frente a diversos tipos de agentes patógenos

(ZARAI et al., 2012; MIRZA et al., 2011; CHAUDHRY, TARIQ, 2006; SHARMA et

al., 2014). Este alcaloide mostrou considerável poder antibacteriano contra bactérias

Gram-positivas (Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus xylosus,

Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis) e Gram-negativos (Escherichia

coli, Klebsiella pneumoniae e Salmonella enterica) (ZARAI et al., 2012). Segundo

Chaudhry e Tariq (2006), o extrato obtido da Piper nigrun mostrou eficácia contra 176

espécies de bactérias isoladas na cavidade bucal, pertencentes a 12 gêneros distintos,

como o Staphylococcus aureus, Bacillus cereus e Bacillus subtilis (CHAUDHRY,

TARIQ, 2006). Adicionalmente, durante a bioprospecção de compostos antifúngicos de

espécies da família Piperaceae, a piperina apresentou atividade significativa contra

Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum (MARQUES et al.,

2010). Embora, a piperina seja muito estudada, o conhecimento sobre a ação deste

alcaloide contra Streptococcus mutans e a Candida albincans ainda pode ser considerado

escasso, daí a importância de mais pesquisas na área.

Além da ação antimicrobiana, a piperina possui outras atividades biológicas e

farmacológicas que podem ser de interesse na área médica (QUIJIA, CHORILLI, 2020).

A atividade antioxidante da piperina foi demonstrada, em experimentos, ao impedir

danos celulares provenientes do estresse oxidativos, através da inativação de radicais

livres e formas reativas de oxigênio (MITTAL e GUPTA, 2000; SELVENDIRAN et al.,

2004; VERMA et al., 2020). O uso da piperina pode ser uma alternativa para reduzir os

danos causados pelo estresse oxidativos em patologias como o câncer e o diabetes

17

(SRINIVASAN, 2007; ZADOROZHNA, TATARANNI, MANGIERI, 2019; KAUR,

INVALLY, CHINTAMANENI, 2016).

Por outro lado, o efeito antioxidante da piperina ainda não foi avaliado no

contexto da Odontologia, onde um dos problemas frequentemente encarados é o

impedimento da confecção de restaurações estéticas imediatamente após ao

procedimento de clareamento dentário (SOUZA-GABRIEL et al., 2020). As substâncias

comumente usadas no clareamento dental são à base de peróxido de hidrogênio, um forte

agente oxidante, que ao entrar em contato com os tecidos orais, se dissocia em água e

oxigênio (O2) (NARI-RATIH; WIDYASTUTI, 2019). Os radicais livres (oxigênio e

hidrogênio) gerados nessas reações químicas de oxidação e redução quebram as

macromoléculas de pigmentos em moléculas cada vez menores e opticamente mais

claras (CHEN; XU; SHING, 1993). Entretanto, o oxigênio oriundo do clareamento inibe

a polimerização de materiais resinosos, através da formação de radicais superóxidos que

impedem a propagação da cadeia poliméricas destes materiais (PEGORARO et al. 2011).

Estudos apontam que um intervalo seguro para realização dos procedimentos

adesivos após clareamento seria entre uma a três semanas (NAIR et al. 2019;

ARUMUGAM et al. 2014). Contudo, em alguns casos, o paciente não pode esperar todo

esse tempo para realizar os ajustes estéticos, como a troca de restaurações, diretas e

indiretas, reanatomizações dentárias, fechamento de diastemas, cimentação de

laminados cerâmicos, dentre outros. Portanto, a fim de evitar o atraso no tratamento

restaurador, vários pesquisas têm proposto o uso de agentes antioxidantes após o

procedimento clareador (COPPLA et al. 2019; NAIR et al. 2019; NARI-

RATIH; WIDYASTUTI, 2019).

A aplicação de antioxidantes em substratos clareados tem o potencial de remover

os radicais livres de oxigênio oriundo do clareamento, e evitar a redução do grau de

18

conversão dos monômeros de materiais poliméricos, como sistemas adesivos ou

cimentos resinosos. Desta forma, o procedimento reabilitador poderia ser executado

imediatamente após o clareamento (COPPLA et al. 2019; NAIR et al. 2019; NARI-

RATIH; WIDYASTUTI, 2019).

Portanto, mais pesquisas com a piperina extraída da Piper nigrun são necessárias

devido ao seu grande potencial de uso na Odontologia e em outras áreas das ciências

médicas. Resultados promissores deste agente em testes laboratoriais podem, no futuro,

sugerir ou influenciar o desenvolvimento de novos fármacos, produtos médicos,

protocolos restauradores e condutas clínicas.

19

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Extrair e avaliar o potencial antimicrobiano e antioxidante da piperina

proveniente da Piper nigrun

2.2 Objetivos específicos

Realizar a extração da piperina a partir de sementes de pimenta do reino (Piper

nigrun) através de uma coluna de HPLC e teste de infravermelho.

Avaliar o potencial antimicrobiano da piperina frente às cepas de Candida

albicans e Streptococcus mutans, através de teste de concentração inibitória

mínima, concentração fungicida mínima e concentração bactericida mínima.

Avaliar o efeito antioxidante do pré-tratamento com a piperina extraída na Piper

nigrun e em diferentes concentrações (0,001%, 0,002% e 0,004%) no grau de

conversão de um cimento resinoso auto-adesivo aplicado em esmalte clareado.

20

3 CAPÍTULO

Esta dissertação está baseada no regimento interno do Curso de Mestrado

Acadêmico em Ciências Odontológicas do Centro Universitário Christus, que

regulamenta o formato alternativo para dissertação de mestrado e permite a inserção de

artigos científicos de autoria ou co-autoria do candidato. O projeto de pesquisa deste

trabalho foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais

(CEUA) da Unichristus, tendo sido aprovado sob o protocolo nº 003/18 (Anexo A).

Assim sendo, esta dissertação é composta de um capítulo contendo um artigo científico

que será submetido para publicação no periódico “Journal of Functional Biomaterials”

conforme descrito abaixo:

Extração, caracterização e avaliação do potencial antimicrobiano e antioxidante da

piperina proveniente da Piper nigrun.

Albuquerque, TEF; Carvalho, BMDF; Lemos, MVS; Silva, WMB; Santiago, SL; Rolim,

JPML; Neri, JR

21

Extração, caracterização e avaliação do potencial antimicrobiano e antioxidante da

piperina proveniente da Piper nigrun.

Autores:

Taira Endi de Flaviano Albuquerquea

Bruna Marjorie Dias Frota de Carvalhob

Marcelo Victor Sidou Lemosc

Wildson Max Barbosa da Silvad

Sérgio Lima Santiagoe

Juliana Paiva Marques Lima Rolimf

Jiovanne Rabelo Nerig*

Filiações:

a Aluna de mestrado, Curso de graduação em Odontologia, Centro Universitário Christus

(Unichristus), Fortaleza, Ceará, Brasil.

b Professora, Curso de graduação em Odontologia, Centro Universitário Christus

(Unichristus), Fortaleza, Ceará, Brasil.

c Professor, Curso de graduação em Odontologia, Universidade de Fortaleza (Unifor),

Fortaleza, Ceará, Brasil; Aluno de doutorado, Faculdade de Farmácia Odontologia e

Enfermagem, Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza, Ceará, Brasil.

d Professor, Curso de graduação em Biomedicina, Centro Universitário Christus

(Unichristus), Fortaleza, Ceará, Brasil.

e Professor, Faculdade de Farmácia Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal

do Ceará (UFC), Fortaleza, Ceará, Brasil.

22

f Professora, Curso de graduação em Odontologia, Centro Universitário Christus

(Unichristus), Fortaleza, Ceará, Brasil

g Professor, Curso de graduação em Odontologia, Centro Universitário Christus

(Unichristus), Fortaleza, Ceará, Brasil; Professor, Curso de graduação em Odontologia,

Universidade de Fortaleza (Unifor), Fortaleza, Ceará, Brasil;

*Autor de correspondência:

Jiovanne Rabelo Neri

Rua João Adolfo Gurgel, 133 – Cocó

60190-060

Fortaleza, CE - Brasil

E-mail: jiovanne@hotmail.com

Fax: +55853265-8100

23

RESUMO

Objetivo: Realizar a extração da piperina, proveniente da Piper nigrun, avaliar sua

atividade antimicrobiana e seu efeito antioxidante em um cimento resinoso auto-adesivo

unido ao esmalte clareado. Métodos: A extração da piperina foi feita através de um

sistema de refluxo e confirmada por meio de espectrofotometria UV-Vis. Para testar seu

efeito antioxidante, foram utilizados 12 fragmentos de esmalte (6 grupos, n=2) e feito o

teste do grau de conversão com o espectrômetro micro Ramam. Para avaliação das

atividades antifúngica (C. anbicans) e antibacteriana (S. mutans), in vitro, foi utilizada a

técnica de microdiluição em caldo preconizada pelo CLSI (Clinical and Laboratory

Standards Institute), documento M27-A2. Resultados: O rendimento da extração da

piperina foi de 92,86% e sua pureza foi de 99,9%. O grupo peróxido de hidrogênio 35%

(PH) + cimentação imediata apresentou o menor grau de conversão quando comparado

aos demais grupos (p<0,05). Não houve diferença estatística entre os grupos Sem PH, PH

+ cimentação após 7 dias; PH + 0,001% piperina, PH + 0,002% piperina; PH + 0,004%

piperina (p>0,05). A concentração bactericida mínima (CBM) comprovou ação

antimicrobiana (p<0,05) na concentração de 0,004% (8±0,2 UFC/mL) em relação ao

controle negativo, sem tratamento, (321±2,5 UFC/mL), e ao controle positivo com uso

de clorexidina 0,12% (3,2±0,1 UFC/mL). A concentração fungicida mínima (CFM)

comprovou redução de colônias na concentração de 0,004%, quando comparado aos

demais grupos e controles. Conclusão: a piperina apresentou capacidade antifúngica e

antibacteriana e evitou a redução do grau de conversão de um cimento resinoso auto-

adesivo aplicado em esmalte clareado.

Palavras-Chave: Clareamento dental. Antioxidantes. Piper nigrun. Antibacterianos.

Antifúngicos.

24

ABSTRACT

Objective: Perform the extraction and characterization of piperine from Piper nigrun,

evaluate its antimicrobial activity and its antioxidant effect in a self-adhesive resin cement

bonded to bleached enamel. Methods: to test its antioxidant effect, 9 third molars cut into

18 fragments were used and the degree of conversion test was performed with the micro

Ramam spectrometer. For the evaluation of antimicrobian activity (Candida anbicans and

Streptococcus mutans), in vitro, the broth microdilution technique recommended by CLSI

(Clinical and Laboratory Standards Institute), document M27-A2, was used. Results: The

yield of piperine extraction was 92.86% and its purity was 99.9%. The group hydrogen

peroxide (HP) + immediate cementation showed the lowest degree of conversion when

compared to the other groups (p <0.05). There was no statistical difference between the

groups Without HP, HP + cementation after 7 days; HP + 0.001% piperine, HP + 0.002%

piperine; HP + 0.004% piperine (p> 0.05). The minimum bactericidal concentration

(MBC) proved antimicrobial action (p <0.05) in the concentration of 0.004% (08 ± 0.2

UFC / mL) in relation to the negative control, without treatment, (321 ± 2.5 UFC / mL),

and the positive control using 0.12% chlorhexidine (3.2 ± 0.1 CFU / mL). The minimum

fungicidal concentration (MFC) showed a reduction of colonies in the concentration of

0.004%, when compared to the other groups and controls. Conclusion: the piperine

showed antifungal and antibacterial properties and avoided the reduction in the degree of

conversion of a self-adhesive resin cement applied in a bleached enamel.

Keywords: Piper nigrun. Tooth Bleaching. Anti-Bacterial Agents. Antioxidants.

Antifungal Agents.

25

INTRODUÇÃO

A pesquisa e o uso de novos medicamentos, suplementos alimentares e produtos

sanitários derivados de plantas aumentaram consideravelmente nos últimos anos [1,2]. A

piperina é um alcaloide nitrogenado, derivado da piperidina, e é principal componente

ativo presente na pimenta do reino (Piper nigrun) [3-5]. Pesquisas indicaram que este

composto possui vários efeitos farmacológicos e excelentes propriedades terapêuticas,

incluindo atividade antiomicrobiana e antioxidante [6,7], que o configuram como uma

substância de grande potencial nas pesquisas em ciências médicas.

A piperina mostrou notável poder antibacteriano contra bactérias Gram-positivas

(Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus

aureus e Staphylococcus epidermidis) e Gram-negativos (Escherichia coli, Klebsiella

pneumoniae e Salmonella enterica) [6]. Adicionalmente, a piperina apresentou atividade

antifúngica contra Cladosporium cladosporioides e Cladosporium sphaerospermum [8].

Embora, a piperina seja muito estudada, o conhecimento sobre a ação deste alcaloide

contra Streptococcus mutans e Candida albincans ainda é escasso.

Além da ação antimicrobiana, a piperina possui atividade antioxidante que evita

a ocorrência de danos celulares oxidativos através da inativação de radicais livres e

formas reativas de oxigênio [7,9,10]. O uso da piperina pode ser uma alternativa para

reduzir os danos causados pelo estresse oxidativos em patologias como o câncer e o

diabetes [11-13].

Por outro lado, o efeito antioxidante da piperina ainda não foi avaliado no

contexto da Odontologia, onde um dos problemas frequentemente encarados é o

impedimento da confecção de restaurações estéticas imediatamente após ao

procedimento de clareamento dentário [14], o que em muitos casos se faz necessário já

que o tratamento clareador, por vezes, é apenas uma etapa da reabilitação estética oral

do paciente. Troca de restaurações antigas, as quais ficam mais destacadas devido à

diferença de cor com os dentes clareados, reanatomizações dentárias, fechamento de

diastemas e cimentação de laminados cerâmicos são procedimentos rotineiramente feitos

após o clareamento dentário. Este último configura uma demanda cada vez maior no

mercado atual, por isso a importância do estudo dos cimentos resinosos auto-adesivos.

Este material tem sido bastante indicado para cimentação de restaurações indiretas

devido à simplificação da técnica e diminuição de chance de erros pelo cirurgião-dentista

26

[15]. O oxigênio oriundo da dissociação do peróxido de hidrogênio inibe a polimerização

de materiais resinosos, através de formação de radicais superóxidos que impedem a

propagação da cadeia poliméricas destes materiais [16].

Estudos apontam que um intervalo seguro para realização dos procedimentos

adesivos após clareamento seria entre uma a três semanas [17, 18]. Com o objetivo de

para evitar atraso no tratamento restaurador, tem sido proposto o uso de agentes

antioxidantes após o procedimento clareador a fim de realizar o procedimento

reabilitador imediatamente após o clareamento [17, 19, 20].

Pesquisas com a piperina extraída da Piper nigrun são necessárias devido ao seu

grande potencial de uso na Odontologia e em outras áreas das ciências médicas.

Resultados promissores deste agente em testes in vitro podem influenciar o

desenvolvimento de novos fármacos, produtos médicos e condutas clínicas. Desta forma,

o objetivo do presente estudo foi extrair, caracterizar, e avaliar o efeito antimicrobiano e

antioxidante da piperina proveniente da Piper nigrun. A hipóteses nulas testadas foram:

1) Não haverá diferença estatística entre os grupos quanto ao grau de conversão; 2) Não

haverá diferença estatística entre os grupos quanto a concentração inibitória mínima e

concentração fungicida mínima; 3) Não haverá diferença estatística entre os grupos

quanto a concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima.

MATERIAL E MÉTODOS

Extração da Piperina

50g de pimenta do reino (Piper nigrum) em pó foram misturadas com 150 ml de

acetato de etila (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA) em um balão com fundo redondo

com capacidade total de 250 ml. A mistura reacional foi mantida em um sistema de

refluxo de água a temperatura de 70º C durante 5 horas. Posteriormente, o solvente foi

completamente removido com o auxílio de evaporador rotativo (Buchi Rotavapor R-200;

Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suíça) a 50º C. Foi acrescentado ao resíduo 30 ml de

uma mistura contendo álcool e solução aquosa de hidróxido de potássio (KOH), na

proporção de 1:1, e deixou-se em repouso por 1 hora. Após este período, a mistura foi

filtrada a frio com um funil de Büchner e lavada com a solução de KOH. O resíduo

coletado foi seco em estufa (TE-394/1-MP; Tecnal, Piracicaba, SP, Brasil) a 40ºC por

24h. [21]

27

O isolamento da piperina foi confirmado, inicialmente, através do ensaio de ponto

de fusão, onde a substância foi aquecida até o seu ponto de fusão. Em seguida, o material

foi submetido a espectrofotometria UV-Vis (DU-730; Beckman Coulter, Fullerton, CA,

EUA) e a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) com 600 MHz

(Agilent DD; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).

O rendimento da produção de piperina foi determinado de acordo com a razão

entre a massa de piperina obtida durante a extração e a massa teórica de piperina contida

no pó de pimenta do reino. A pureza da piperina foi obtida pela técnica de cromatografia

em camada delgada em placa de sílica, onde a amostra foi diluída e eluída em solução

acetato/hexano, na proporção de 1:1. Em seguida, a placa de sílica foi exposta a luz

ultravioleta e a uma solução de iodo (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EUA).

Preparo das soluções aquosas de piperina

A piperina foi pesada em balança digital analítica (AUX-220, Shimadzu, Tóquio,

Japão) e, em seguida, foi diluída em água destilada com o auxílio de vórtex (QL-901,

Biomixer, São Paulo, SP, Brasil), para obter soluções aquosas de piperina a 0,001%,

0,002% e 0,004% peso/volume.

Ensaio de atividade antioxidante - Grau de Conversão in situ

O teste de atividade antioxidante foi realizado através da análise do grau de

conversão in situ, para a realização do presente estudo foi obtida a aprovação no Comitê

de Ética de Pesquisa em Humanos sob o protocolo Nº 3.666.589. Nove terceiros molares

humanos hígidos foram selecionados, limpos e armazenados em água destilada a 4°C.

Os dentes foram fixados com cera pegajosa (Kota Ind. e Com. Ltda., São Paulo) em

placas de acrílico e foram acopladas em uma máquina de corte (Extec, Enfield, CT,

EUA). Os dentes foram cortados com o auxílio de um disco diamantado (ExtecCorp,

Enfield, CT, EUA) e obteve-se 12 fragmentos, exclusivamente, de esmalte

quadrangulares de 4 x 4 mm.

Os fragmentos foram aleatoriamente divididos pelo software Excel (Excel

2018, Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA) em 6 grupos (n=2), de acordo com

o tratamento do esmalte e tempo de cimentação (Tabela 1).

28

Tabela 1. Desenho experimental.

Grupo (n=2) Descrição

Sem peróxido de

hidrogênio 35% (PH)

(controle)

Sem clareamento, sem aplicação de agente antioxidante (aplicação

de água destilada) e cimentação imediata.

PH + cimentação

imediata

Clareamento com peróxido de hidrogênio a 35%, sem aplicação de

agente antioxidante (aplicação de água destilada) e cimentação

imediata.

PH + cimentação

após 7 dias

Clareamento com peróxido de hidrogênio a 35%, sem aplicação de

agente antioxidante (aplicação de água destilada) e cimentação

após 7 dias.

PH + 0,001%

piperina

Clareamento com peróxido de hidrogênio a 35%, aplicação de

solução aquosa de piperina a 0,001% p/v (durante 60 s) e

cimentação imediata.

PH + 0,002%

piperina

Clareamento com peróxido de hidrogênio a 35%, aplicação de

solução aquosa de piperina a 0,002% p/v (durante 60 s) e

cimentação imediata.

PH + 0,004%

piperina

Clareamento com peróxido de hidrogênio a 35%, aplicação de

solução aquosa de piperina a 0,004% p/v (durante 60 s) e

cimentação imediata.

Todos os dentes, exceto do grupo sem PH, foram submetidos ao clareamento

com peróxido de hidrogênio a 35% (Whiteness HP Maxx, FGM Produtos Odontológicos,

Ltda., Joinville, SC, Brasil- Lote #270316), que foi aplicado sobre o esmalte da

superfície coronal, em uma camada de aproximadamente 1,0 mm de espessura (0,06

mL). O produto permaneceu em contato com a superfície de esmalte dos fragmentos por

15 minutos, em seguida, lavados com jatos de água durante 60 segundos e secos com

jatos de ar, por 10 segundos. O procedimento clareador foi realizado 3 vezes, totalizando

45 minutos de aplicação do gel clareador.

Os fragmentos foram reumidecidos com a solução destinada para o grupo (Tabela

1). As soluções permaneceram em contato com as superfícies de esmalte durante 60

segundos sob agitação com auxílio de um microbrush. Foi feita secagem com jatos de ar

por 10 segundos e a aplicação de um cimento resinoso auto-adesivo (U200; 3M ESPE,

St. Paul, MN, EUA - Lote #1910000745) de acordo com as orientações do fabricante.

29

12 blocos de resina composta (Vittra, FGM, Joinville, Brasil), cada um contendo

4 mm de comprimento x 4 mm de largura x 3 mm de altura, previavente fabricados,

foram jateados com óxido de alumínio (50 µm) por 10 segundos com posterior aplicação

do silano (Prosil, FGM Produtos Odontológicos, Ltda., Joinville, SC, Brasil – Lote

#270617) de acordo com as instruções do fabricante.

Os blocos de resina composta foram cimentados sobre os fragmentos de esmalte

e fotoativados em 5 faces diferentes, por 40 segundos cada, com uma fonte de luz

halógena (Optilux 501, SDS Kerr, Orange, EUA) a intensidade de 1000mW / cm2.

Após a cimentação, os blocos foram seccionados longitudinalmente com auxílio

da máquina de corte Isomet (Buehler, Lake Bluff, IL, EUA) e de disco diamantado

(ExtecCorp, Enfield, CT, EUA), sob irrigação abundante, a fim de se obter 2 espécimes

em forma de fatia, com aproximadamente, 2 mm de espessura.

Para a determinação do grau de conversão, foi realizada 1 leitura em cada

espécime através de um espectrômetro micro Raman (Xplora; Horiba Scientifc, Kyota,

Japão). O espectro foi excitado a partir do uso de um laser com comprimento de onda

em 532 nm através de uma objetiva (100 X). O espectro foi obtido, de acordo com as

seguintes condições: tempo de irradiação: 60 s; número de acumulações: 10 e grade:

1200 linhas/mm. O grau de conversão foi calculado com base na redução da intensidade

do pico correspondente aos grupos metacrilatos C=C em 1.636 cm-1 e 1.608 cm-1 no

espécime polimerizado (P) comparado com um espécime não polimerizado (U), de

acordo com a seguinte equação:

Grau de conversão = (1 − P/U)x100

Todos os procedimentos foram feitos por um único operador.

Ensaios de atividade antimicrobiana

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida

mínima (CFM)

Foram analisados, no estudo in vitro, a possível ação antifúngica da piperina e

suas concentrações inibitórias mínimas (CIM), por meio da técnica de microdiluição em

caldo preconizada pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), documento

M27-A2.

30

Foram transferidas leveduras (Candida albicans, ATCC 10231) cultivadas em

Ágar Sabouraud para meio de cultura líquida Sabouraud Dextrose, para a determinação

da susceptibilidade de leveduras aos componentes da piperina. Foram utilizadas

microplacas com 96 poços e cada poço recebeu o inóculo, o meio de cultura e as soluções

dos extratos diluídos (0,004%, 0,002%, 0,001%, 0,0005% e 0,00025% de piperina), de

tal forma que o volume final ficou de 210 µL. Para o controle da metodologia, foi utilizada

uma solução de nistatina 100.000 U.I (controle positivo). Também foram realizados os

seguintes controles: controle de esterilidade do caldo; controle do inóculo com ausência

do controle positivo, controles de esterilidade dos extratos de piperina.

A solução inicial contendo densidade óptica (DO) estabelecida de 0.38,

equivalente a 107 células/mL, foi diluída de 1/10 e 1/100 em solução de PBS e posterior

diluição de 1/20 em Sabouraud caldo, segundo os critérios modificados do CLSI,

obtendo-se uma quantidade final de inóculo de 5,0 x 103 a 2,5 x 103 UFC/mL.

Logo após a micropipetagem dos inóculos, do meio de cultura e dos controles, as

microplacas foram tampadas e incubadas a 35 ºC por 24 h, sem agitação. Desta forma,

foi possível determinar a menor concentração do extrato bruto capaz de inibir o

crescimento desse microrganismo, utilizando a análise visual e absorbância do Teste de

ELISA. Para determinação da CFM foram retirados 25 ul da diluição que representa a

CIM e semeados em placas de Sabouraud Dextrose ágar por 24 h em estufa. Experimento

foi realizado em três momentos diferentes, sendo caracterizado coo triplicata.

Determinação do concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida

mínima (CBM)

Foram analisados, no estudo in vitro, a possível ação antibacteriana da piperina e

suas concentrações inibitórias mínimas (CIM), por meio da técnica de microdiluição em

caldo preconizada pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), documento

M27-A2.

Foram transferidas cepas (Streptococcus mutans, ATCC UA159) cultivadas em

ágar BHI (Blood heart infusion) sangue para meio de cultura líquida BHI dextrose, para

a determinação da susceptibilidade de bactérias cariogênicas aos componentes da

piperina. Foram utilizadas microplacas com 96 poços e cada poço recebeu o inóculo, o

meio de cultura e as soluções dos extratos diluídos (0,004%, 0,002%, 0,001%, 0,0005%

e 0,00025% de piperina), de tal forma que o volume final ficou de 210 µL. Para o controle

31

da metodologia, foi utilizada uma solução de digluconato de clorexidina 0,12% (controle

positivo). Também foram realizados os seguintes controles: controle de esterilidade do

caldo; controle do inóculo com ausência do controle positivo, controles de esterilidade

dos extratos.

A solução inicial contendo equivalente a 108 células/mL, foi comparada com a

escala 0.5 Mc Farland, diluída 1/100 em solução de BHI caldo, obtendo-se uma

quantidade final de inóculo de 1 x 106 UFC/mL.

Logo após a micropipetagem dos inóculos, do meio de cultura e dos controles, as

microplacas foram tampadas e incubadas a 37 ºC por 24 h, sem agitação. Desta forma,

foi possível determinar a menor concentração do extrato bruto capaz de inibir o

crescimento desse microrganismo, utilizando a análise visual. Para determinação da CBM

(Concentração bactericida mínima) foram retirados 25 ul da diluição que representa a

CIM e semeados em placas de BHI sangue por 24h em estufa. Experimento foi realizado

em três momentos diferentes, sendo caracterizado como triplicata.

Análise Estatística

A análise estatística dos resultados de CFM e grau de conversão foram realizadas

com o programa SigmaStat 3.5 (Systat Software Inc., San Jose, CA, EUA). O teste de

Shapiro-Wilk e Brown-Forsythe foram aplicados em todos os grupos para analisar a

distribuição normal dos dados e a igualdade de variância, respectivamente. Os dados

referentes aos testes de concentração inibitória mínima, concentração fungicida mínima

e concentração bactericida mínima foram analisados com o teste de Kruskal-Wallis.

Enquanto, os dados de grau de conversão foram avaliados com o teste de Análise de

Variância. Para as comparações post-roc foi utilizado o teste de Student-Newman-Keuls

e o nível de significância adotado foi de p<0,05.

RESULTADOS

Extração e caracterização da piperina

Através do processo de extração utilizando um sistema em refluxo foi obtido um

sólido cristalino e amarelado, cujo o ponto de fusão foi de 125ºC. A figura 2 representa

o gráfico gerado pela espectroscopia UV-vis e apresentou o comprimento de onda

32

(λmax) de 343nm, condizente com a piperina. Adicionalmente, a Figura 3 é referente aos

picos transmitância de RMN e caracterizam um composto derivado de alcaloide, classe

de substâncias comum no gênero Piper. A estrutura caracterizada foi estabelecida como

piperina.

Após a extração, foram obtidos 78mg de piperina, com um rendimento de 92,86%

e com a pureza de 99,9%.

Figura 2. Espectro UV-Vis da Piperina.

33

Figura 3. Espectro de RMN da piperina.

Teste de atividade antioxidante - Grau de Conversão in situ

Os dados de grau de conversão in situ estão apresentados na Tabela 2. Os valores

de grau de conversão foram influenciados pelo tratamento (p=0,002; F=5,177). O

peróxido de hidrogênio 35% (PH) + cimentação imediata apresentou o menor grau de

conversão quando comparado aos demais grupos (p<0,05). Não houve diferença

estatística entre os grupos sem PH, PH + cimentação após 7 dias; PH + 0,001% piperina,

PH + 0,002% piperina; PH + 0,004% piperina (p>0,05).

Tabela 2. Valores de grau de conversão in situ (média ± desvio padrão), de acordo com

tratamento usado.

Grupos (n=2) Grau de conversão in situ

Sem PH (controle) 66,64±2,60A

PH + cimentação imediata 61,01±1,98B

PH + cimentação após 7 dias 65,19±2,20A

PH + 0,001% piperina 64,80±1,36A

PH + 0,002% piperina 63,76±2,06A

PH + 0,004% piperina 64,67±1,76A

Letras sobrescritas similares indica que não houve diferença estatística entre os valores (p>0,05).

34

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração fungicida

mínima (CFM)

Através da análise visual foi verificada diminuição na turvação na concentração

de 0,004% , após realização do ELISA, verificou-se diferença estatística nas

concentrações 0,001%; 0,002% e 0,004% em relação ao controle negativo e positivo

(p<0.05), como visualizado na figura 4. A CFM comprovou redução de colônias na

concentração de 0,004%, quando comparado aos demais grupos e controles, através de

contagem de UFC/mL.

Figura 4. Protocolos terapêuticos realizados no experimento de CIM e os dados numéricos obtidos pelo

Teste ELISA. A altura das colunas e as barras de erros indicam, respectivamente, os dados numéricos

obtidos pelo Teste ELISA e o desvio padrão. Os grupos identificados com letras diferentes significam que

houve diferença estatística entre os valores (p<0,05).

35

Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida

mínima (CBM)

Através da análise visual, turvação do meio, foi verificada inibição na

concentração de 0,004%, comparada às concentrações 0,002% e 0,001% e também em

relação ao controle negativo e positivo, com aparente inibição somente na concentração

de 0,004%. O CBM comprovou ação antimicrobiana (p<0,05) na concentração de 0,004%

(8±0,2 UFC/mL) em relação ao controle negativo, sem tratamento, (321±2,5 UFC/mL),

e ao controle positivo com uso de clorexidina 0,12% (3,2±0,1 UFC/mL).

DISCUSSÃO

A discrepância de cor entre os dentes clareados e as restaurações antigas gera,

muitas vezes, desconforto para o paciente, que procura uma solução rápida para a sua

queixa. Para solucionar o problema, os profissionais podem lançar mão de procedimentos

restauradores diretos, como a troca de restaurações antigas, ou indiretos, como a

colocação de laminados cerâmicos [16, 22, 23].

Após o término do tratamento clareador, os radicais livres gerados continuam

presentes no interior dos túbulos dentinários, causando um efeito oxidativo que resulta

em alterações microestruturais no esmalte dentário, diminuição do número, tamanho e

qualidade dos tags resinosos e na inibição da polimerização dos materiais resinosos [24,

25]. Estes dados estão de acordo com os resultados do presente estudo, quando foi

observada uma redução significativa no grau de conversão de um cimento resinoso auto-

adesivo aplicado imediatamente em esmalte clareado quando comparado aos demais

grupos (Tabela 2). Desta forma, a primeira hipótese nula foi rejeitada.

Para que a união não seja comprometida, sugere-se um tempo de espera entre 7 a

21 dias entre o final do clareamento e a realização do procedimento adesivo, uma vez que

36

a atividade dos radicais livres oriundos do clareamento pode ser considerada temporária

[18, 25]. Entretanto, este intervalo de tempo não condiz com a expectativa do paciente

em relação à conclusão do tratamento estético, pois estes desejam uma solução rápida.

Desta forma, estudos vêm sendo realizados com o propósito de encontrar uma alternativa

que viabilize o tratamento restaurador imediatamente após o clareamento [17, 18, 19, 26,

27, 28]. Para tanto, diferentes técnicas têm sido propostas, dentre elas a remoção da

camada superficial de esmalte, o pré-tratamento com álcool, o uso de cimentos ou

adesivos contendo solventes orgânicos e o uso de antioxidantes [20, 27].

Entre as estratégias mencionadas acima, o tratamento com antioxidantes tem

demonstrado bons resultados nas pesquisas e várias substâncias com propriedades

antioxidantes vêm sendo testadas na Odontologia [17, 20, 27, 29]. Um agente

antioxidante pode ser definido como um composto químico que inibe ou diminui

significativamente o processo de oxidação durante reações químicas [26].

Dentre os antioxidantes testados na Odontologia, o ascorbato de sódio é o mais

estudado e é considerado por alguns autores como a melhor opção para reestabelecer a

resistência de união diminuída em dentes clareados [26, 30, 31], porém a literatura mostra

resultados conflitantes [17, 20, 27], daí a importância de se buscar outras opções, e dentre

elas está a piperina.

A extração de substâncias orgânicas por solventes, através de processo de

aquecimento e refluxo, é uma técnica tradicional que pode ser utilizada para o isolamento

da piperina [6, 21, 32]. Este método continua sendo adaptado e aprimorado, devido

principalmente à sua versatilidade, baixo custo e também visando a otimização de tempo

e rendimento [5]. No presente estudo, o rendimento de extração da piperina pelo método

do refluxo foi de 92,86%, um valor considerado alto.

37

A piperina apresenta uma grande variedade de atividades biológicas [6,7]. Sua

ação inseticida foi confirmada cientificamente em 1924 e a partir daí várias pesquisas

foram desenvolvidas com o objetivo de identificar outras atividades da P. Nigrun. Como

a piperina é a piperamida que ocorre em maior proporção na planta, essa se tornou o

principal alvo de avaliações biológicas [18].

De acordo com Mittal e Gupta (2000) [9], a piperina atua contra danos oxidativos

por inibição dos radicais livres e espécies reativas de oxigênio. A piperina mostrou-se um

antioxidante eficaz em um estudo feito por Naidu e Thippeswamy (2002) [33]. Prasad et

al (2014) [34], concluíram em seu estudo que a piperina da pimenta preta pode exercer

um papel antioxidante fisiológico através da modulação da via 5-LO, a enzima-chave

envolvida na biossíntese de leucotrienos. Khajuria et al (1998) [35] obtiveram resultados

promissores ao investigar o potencial antioxidante da piperina em um modelo intestinal

de rato.

Em nossa pesquisa, o grau de conversão de um cimento resinoso auto-adesivo

aplicado sobre espécimes de esmalte submetidos a clareamento e tratados com diferentes

concentrações de piperina foi semelhante aos espécimes não clareados e dos clareados e

cimentados após 7 dias (Tabela 2). Provavelmente, a piperina agiu inibindo as espécies

reativas de oxigênio oriundas do clareamento e evitou a redução do grau de conversão.

De Paula et al. (2017) [36] observaram que a aplicação de glutationa 5%, glutationa 10%

e ascorbato de sódio 10%, durante 5 minutos, sobre o esmalte clareado promoveu maior

grau de conversão de monômeros resinosos em polímeros do que no grupo não tratado

com os antioxidantes. Por outro lado, Harrison et al (2019) [37] observaram que a

aplicação de alfa-tocoferol a 20%, durante 5 minutos, não foi eficiente em dentina

clareada, ou seja, o grau de conversão foi semelhante ao grupo sem antioxidante.

38

No presente estudo, optou-se por testar a solução antioxidante de piperina por um

período de tempo viável clinicamente, que foi de 60 segundos, o que demonstra ainda

mais seu potencial, já que obtivemos bons resultados mesmo em baixas concentrações e

com um período de tempo de ação bem inferior ao adotado em pesquisas semelhantes

com outras substâncias antioxidantes, por exemplo, o tempo mínimo para que o ascorbato

de sódio faça seu efeito antioxidante é de 5 minutos [38, 39, 40].

No presente trabalho, a piperina foi eficiente em reduzir colônias de C. Albicans

no grupo com concentração da solução de Piperina de 0,004% (Figura 4), desta forma, a

segunda hipótese nula foi rejeitada. O estudo de agentes fungicidas na odontologia é de

extrema importância por esses microorganismos serem responsáveis por condições orais

bastante comuns, como candidíase oral em pacientes imunossuprimidos ou associada à

estomatite protética em pacientes portadores de prótese total. [41]

Buitimea-Cantúa et al (2018) [42] analisaram a atividade antifúngica

da Piper Nigrun e da piperina e os resultados mostraram atividade antifúngica

significativa dos extratos e dos compostos ativos puros contra A. parasiticus, o que sugere

que eles podem ser usados como antifúngicos naturais. Os autores encontraram que a

maior inibição do crescimento radial de A. parasiticus ocorreu na concentração de 200

mg / mL dos extratos etanólicos e dos compostos bioativos puros. Os valores de CIM50

(concentração mínima para inibir 50% do crescimento do fungo) foram de 68mg/ml para

o extrato de Piper Nigrun e 67mg/ml para Piperina. O extrato de P. nigrum foi o extrato

mais bioativo (78% de crescimento) a 200 mg / mL. Os valores de CIM50 revelaram que

capsaicina e piperina requeria menor concentração para inibir o crescimento de 50% do

A. parasiticus em comparação com os extratos de frutas. Moon et al (2016) [43] e seus

colaboradores também relataram que a piperina tem moderada ação antifúngica contra A.

flavus (WRRC 3-90-42).

39

Com relação à atividade antibacteriana, nossos resultados mostraram que a

solução de piperina com maior concentração (0,004%) inibiu completamente o

crescimento de S. Mutans, sendo assim, a terceira hipótese nula foi rejeitada. No estudo

feito por Deepak Dwivedi e Vinod Singh (2016) [44] em que analisaram o efeito da

Piperina contra S. Mutans, os resultados confirmam que a piperina apresentou ação

antimicrobiana e antibiofilme.

Jaya Maitra and Shilpi [45], em 2017, concluíram que o efeito antibacteriano da

piperina aumenta à medida que a concentração de piperina é aumentada. A piperina

demonstrou atividade antibacteriana contra bactérias gram-positivas e bactérias gram-

negativas com zona de inibição variarando de 2 mm a 7 mm. A zona máxima de inibição

contra bactérias gram-positivas Bacillus subtilis foi 7 mm e para bactérias gram-negativas

E. coli foi de 7 mm. O estudo ainda revelou que a combinação de piperina com o

ciprofloxacino amplia seu espectro antibacteriano.

D´Souza et al. (2017) [46], encontraram que os extratos brutos e etanólicos de

piperina da pimenta preta apresentaram atividade antibacteriana máxima contra bactérias

gram-positivas resistentes, Staphylococcus aureus e atividade antifúngica contra

Fusarium oxysporum, com zona de inibição bacteriana variando entre 15mm e 22mm. As

mesmas descobertas também foram relatadas por Palaksha et al (2013) [47], em que a

pimenta produziu atividade antibacteriana consideravelmente mais alta contra

Staphylococcus aureus em comparação com outras bactérias gram-negativas.

Dessa forma, mais estudos se fazem necessários a respeito do uso da piperina

na odontologia, pois esta planta tem demonstrado grande potencial nas pesquisas, apesar

da literatura ainda ser escassa.

40

CONCLUSÃO

A extração e a caracterização da piperina proveniente de sementes da Piper

nigrum foram eficientes. O alcaloide extraído apresentou um potencial antioxidante

promissor, uma vez que evitou a redução do grau de conversão de um cimento resinoso

auto-adesivo quando aplicado em esmalte clareado com peróxido de hidrogênio a 35%.

Adicionalmente, a piperina promoveu redução de colônias de C. albicans e atividade

bactericida contra S. mutans, na concentração de 0,004%.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflito de interesses.

41

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4 CONCLUSÃO GERAL

Através de nossos resultados, concluímos que a Piperina mostrou-se eficiente em

evitar a redução do grau de conversão de um cimento resinoso auto-adesivo aplicado em

esmalte clareado com peróxido de hidrogênio a 35% em todas as concentrações testadas.

A piperina também se mostrou um potencial antimicrobiano na concentração de 0,004%,

atuando na inibição das colônias de C. albicans e S. mutans.

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ANEXO A – Protocolo de aprovação do CEUA

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