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Centro de Biología Molecular y Celular
Estudios estructurales de los fragmentosamino terminal de los canales de potasio
tipo Shaker B nativo (ShB) y mutado (ShBL7E)
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Posible topología de los segmentos transmembrana de cada
una de las subunidades de un canal de K+ tipo Shaker.
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OBJETIVOS
1.- Explicar la diferente capacidad funcional de los péptidos ShB y ShBL7E en términos estructurales, confrontándolos con una diana modelo que contenga elementos que imiten los sitios de unión de la bola inactivante en el canal.
2.- Postular un modelo estructural del péptido inactivante ShB cuando se encuentra unido a la diana modelo.
3.- Explorar la posible regulación de la actividad de estos péptidos, y consecuentemente de los canales de potasio que los contienen, a través de modificaciones post-traduccionales que introduzcan cambios semejantes a los que diferencian al péptido ShB del péptido mutante ShBL7E.
4.- Sintetizar y caracterizar adecuadamente un análogo fotoactivable del péptido ShB, diseñado para marcar covalentemente por fotoafinidad el sitio de la proteína canal al que se une la “bola” inactivante.
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200 220 240200 220 240-20
-10
0
10
20
30
0 4 0 8 0
-12
-8
-4
0
Longitud de onda (nm)
1
7
1
7
% TFE
2
20
[] M
.R.M
. x 1
0-3 (g
rad
o. c
m2 .d
mo
l-1) A B
Fig. 1: Espectros de dicroismo circular de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) tomados en H2O (1), TFE (7) y en mezclas H2O/ TFE.
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1700 1650 1600 1700 1650 1600
Número de onda, cm-1
A B
Fig. 2: Espectros de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E tomados en distintos tampones acuosos: efecto de la fuerza iónica (A) y bandas componentes (B).
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Temperatura, ºCNúmero de onda, cm-1
1700 1650 1600
1700 1650 1600
30 45 60 7560
70
80
90
100
163
3/1
64
3 c
m-1
(%)
A
B
C
Fig. 4: Efecto del colato 5 mM (A) y 20 mM (B) sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB y ShBL7E. ShB presenta componentes de estructura , muy estables a la temperatura (C).
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- 38.
9
15
ShBL7E- 3
4
- 39
ShB
ShB + Tripsina
- 44
ShBL7E + Tripsina
Tiempo (min)30 45 60 750
Fig. 5: Cromatogramas de HPLC de los péptidos ShB y ShBL7E y los fragmentos resultantes de la hidrólisis con tripsina de estos.
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Fig. 6: Efecto de la tripsina sobre la banda amida I del espectro de FTIR de los péptidos ShB (A) y ShBL7E (B) en presencia de vesículas de PG: pérdida de los componentes de estructura .
Número de onda, cm-1
1760 1680 1600
A
1760 1680 1600
B
Control
Digestióntripsina
Fragmento1-14 purificado
por HPLC
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Fig. 7: Banda amida I del espectro de FTIR del péptido ShB en presencia de vesículas de PG en distintas situaciones experimentales: gran estabilidad de los componentes de estructura .
1700 1650 1600
Número de onda, cm-1
Control
100 mM EDTA
1 M NaCl
2 % n-octil--glucopiranósido
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1700 1650 1600 1700 1650 1600
pD=7.4 pD=8.9
PA/PC
PG/PC
PA/PC
PG/PC
ShB
ShBL7E
G)
E)
C)
A) B)
D)
F)
H)
100%90%50%30%
Número de onda, cm-1
Fig. 10: La adopción de estructura requiere una gran densidad de carga negativa superficial.
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Tabla I: Máximos de emisión de fluorescencia (max) y coeficiente de partición superficial que presentan los péptidos marcados con NBD en presencia de vesículas de fosfolípido.
max (nm) K p* x 10
-4 (M
-1)
Nombre del
péptidopH tampón PC PA PG PC PA PG
ShB -NBD
ShBL7E-NDB
ShB -NBD
ShBL7E-NBD
7 555 551 531 531 no unión 77.1±11.6 2.80±1.1
7 554 551 533 534 no unión 3.05±1.45 0.72±0.2
8.5 552 --- 530 536 --- 1.95±0.65 0.64±0.09
8.5 553 --- 536 552 --- 0.62±0.025 0.05
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Fig. 13: Ni el péptido ShB ni el ShBL7E se unen a vesículas de PC. Sin embargo, ambos péptidos se unen con gran eficiencia y de forma saturable a vesículas de PA y, en menor medida, de PG.
42
1
2
3
x 10 (M) 8fC *
Xb
* x
103
ShB
Fosfolípido/péptido (M/M)
Flu
ore
scen
cia
de
Em
isió
n a
530
nm
(un
idad
es a
rbit
rari
as)
0 2000 4000 6000
ShBL7E
PA
PA
PG
PG
PC
PC
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Fig. 14: El péptido ShB estabiliza la forma dianiónica del PA.
pKa = 7.66
5 6 7
20
40
100
8 9 10 11
0
60
80
pKa = 8.0
pKa = 7.45
PA
PA + ShBPA + ShBL7E
pH
Áre
a 98
0 cm
-1/1
180
cm-1 n
orm
aliz
ada
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Fig. 15: Inserción del péptido ShB en vesículas fosfolipídicas aniónicas.
2
4
6
2
4
6
0 .0 0 .1 0 .2 0 .30 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1.0
A
B
C
Razón molar (péptido/lípido)0.00 0.05 0.10 0.15
Razón molar (péptido/lípido)
ShBL7E
ShBL7E
ShB
ShB
H/
H0
H(K
ca
l/mo
l líp
ido
)
DMPG
DMPA
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Tabla II: Secuencia de aminoácidos de derivados del péptido ShB (con el extremo C-terminal amidado) y sus análogos marcados con una sonda fluorescente.
# nombre delpéptido
grado demarcaje
secuencia del péptido
1 5 10 15 20
1 ShB M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q
2 ShBL7E M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q
3 ShB-21C M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C
4 ShBL7E-21C M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C
5 ShB-21C-NBD 89 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD
6 ShBL7E-21C-NBD 88 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-NBD
7 ShB-21C-Rho 76 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho
8 ShBL7E-21C-Rho 73 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Rho
9 ShB-21C-Pyr 75 % M A A V A G L Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr
10 ShBL7E-21C-Pyr 94 % M A A V A G E Y G L G E D R Q H R K K Q C-Pyr
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Fig. 16: La inserción del péptido ShB en la bicapa aniónica es dependiente del pH.
1
2
3
4
5
6
7
pH
5.0 6.0 7.0 8.0
H(K
cal/
mo
l)DMPA
DMPA + ShB
DMPA + ShBL7E
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Fig. 22: Esquema de reacción entre el 1-(p-azidosalicilamido)-4-(iodoacetamido)butano (ASIB) y un péptido que contenga cisteina para dar lugar a un péptido derivatizado con ASIB.
Péptido-SH + 2 222I CH C N CH CH CH CH N C2
H O
O HHO
3N
ASIB
2 222 CH C N CH CH CH CH N C2H O
O HHO
3NPéptido-S+HI
ASIB-péptido
Longitud de onda (nm)
Ab
so
rban
cia
250 275 300 325 350 375 4000.0
1.0
1.5
0.5
péptido ShBL7E-21C-ASIBpéptido ShB-21C-ASIB
péptido ShBASIB
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Fig. 24: Ningún péptido alteró la velocidad de activación del canal Shaker4-46.
potencial de membrana (mV)
Canal ShB4-46 (5)+ péptido ShBL7E (6)+ péptido ShBL7E-ASIB (5)+ péptido ShB (5)+ péptido ShB-ASIB (5)
-20 -10 0 10 20 30 401
2
3
4
5
6
t 1/2 a
cti
vac
ión
(m
s)
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Fig. 25: El péptido ShB-ASIB es un análogo funcional del péptido ShB.
+ péptido ShBL7E
+ péptido ShBL7E-ASIB
+ péptido ShB + péptido ShB-ASIB
ShB4-46 ShB4-46
Inactivación tipo-N
Inactivación tipo-C50 ms
500 ms
ShB4-46+ péptido ShBL7E
+ péptido ShBL7E-ASIB
A B
C
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Fig. 30: El péptido ShBY8(P) se comporta estructuralmente como ShBL7E.
1700 1650 1600
PG
23 º C70 º C
23 º C
Número de onda, cm-11700 1650 1600
PA
23 º C
70 º C
23 º C
Número de onda, cm-1
PC
1700 1650 1600
23 º C70 º C
23 º C
Número de onda, cm-1
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Tabla III: Efecto de diferentes péptidos sobre el curso temporal de la activación e inactivación de corrientes de K+ en canales ShB6-46. La constante de activación (1/2) se mide como el tiempo necesario para alcanzar el 50 % de la amplitud máxima de la corriente a diferentes potenciales. El valor de la constante de inactivación () se estima ajustando el tramo de disminución de la corriente a una función exponencial de caida simple. Media desviación estándar (n).
t1/2 activación (ms) t1/2 inactivación (ms)
Péptido 0 mV Control (sin péptido) 5.631.12 (7) 3.280.43 (8) 2.320.21 (8) 1300160 (6)ShB 4.910.95 (5) 3.170.39 (7) 2.220.23 (6) 21548 (6)ShB-Y8(P) 5.871.03 (5) 3.390.47 (5) 2.380.36 (5) 76687 (6)ShB-Y8(P)(Quinasa Src)
5.650.89 (4) 3.350.32 (4) 2.170.29 (4) 63481 (5)
-20 mV +20 mV +20 mV
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Fig. 32: El péptido ShBY8(P) presenta componentes de estructura que dependen de la relación lípido-péptido.
1700 16001650
PA
1700 16001650
Razón molarShB-Y8(P)/fosfolípido
0.13
0.06
0.03
23 ºC
70 ºC
22 ºC
Número de onda, cm-1
PG
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Fig. 33: El péptido ShBY8(P) no se inserta en vesículas fosfolipídicas.
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
Razón molar (péptido/PLs)
H
(Kca
l/mol
lípi
do)
DMPC
DMPG DMPA
Razón molar (péptido/PLs)
0,00 0,04 0,08 0,122
3
4
5
6
7
PéptidoShB-Y8(P)
Razón molar (péptido/PLs)
PéptidoShB
PéptidoShB-Y8(P)
PéptidoShB
PéptidoShB-Y8(P)
PéptidoShB
H(K
cal/m
ol lí
pido
)
H
(Kca
l/mol
lípi
do)
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Fig. 34: Propuesta de dos modelos alternativos de estructura en “horquilla “ para el péptido ShB insertado en vesículas fosfolipídicas aniónicas. El giro necesario para que se forme esta estructura puede tener lugar a partir de dos secuencias de tetrapéptido: VAGL (panel A) y AGLY (panel B).
456
12
7
8 5
12
67
A
B
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Porcentajes de unión de los péptidos marcados con NBD a distintos fosfolípidos.
Po
rcen
taje
de
pép
tid
ou
nid
o a
PL
s
Relación molar PLs/péptido
pH 7.0 pH 8.5
100
80
60
40
20
0
0 1400 2800 4200 5600 0 1400 2800 4200 5600
100
80
60
40
20
0
PA/ShB
PG/ShBPA/ShBL7E
PG/ShBL7E
PA/ShB
PG/ShB
PA/ShBL7E