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Cellules souches et cellules proliférantes.
Régulation de la différenciation cellulaire
Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre 2010 L.Mauvieux
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Concept de la cellule souche
• Cellule à longue durée de vie• Capable d’auto-renouvellement (duplication sans perte des
capacités de développement)• Pouvant donner naissance à de multiples types cellulaires
(différenciation)• Dans les conditions adéquates, peuvent se différencier en
cellules originaires normalement des 3 couches embryonnaires: endoderme, mésoderme ectodermes
• Capables de Prolifération• De régénérer des tissus après blessure• De plasticité dans ces différentes options
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Hierarchie des cellules souches
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Epiderme
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Jargon des cellules souches
Potence définit la capacité à se différencier en différents types cellulaires
Pluripotent pouvant donner naissance à tous les types cellulaires adultes Les cellules souches embryonnaires sont pluri-potentes
Multipotent pouvant se différencier en de multiples types de cellules spécialisées, mais pas toutes
les cellules souches tissulaires (adultes) sont multipotentes
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Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique dans
un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4
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Dérivation des cellules souches embryonnaires humaines
J0 J1 J2
J3J4J5
compactionblastocyste
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Feeder de fibroblastes murins
Colonie de cellules ES
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Critères pour caractériser le caractère de cellule souche
(« stemness ») • Auto-renouvellement:
– Potentiel de renouvellement illimité in vitro– Expression de facteurs de transcription
caractérisant la cellule souche (nanoG, oct4, SOX2, TERT…)
• Pluripotence in vitro:– Formation de tératomes dans la souris
imunocompétente (potentiel tumoral)– Pluripotence in vitro
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Formation de Tératome
• Tumeur hétérogène composée de cellules issues des trois feuillets embryonnaires– Ectoderme (peau, poils, dents…)– Mésoderme (os, cartilage, muscle…)– Endoderme (épithélium gastro-intestinal, bronchique…)
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Pluripotence des cellules ES in vitro
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Cellules souches embryonnaires:
– 1) Cellules ES• Dérivées du blastocyste en culture• Par transfert nucléaire d’une cellule somatique
dans un œuf énucléé
– 2) Cellules somatiques « reprogrammées »• « induced pluripotent stem cells » (iPS)
– TFs, Oct4, Sox2, cMyc and Klf4– Sox2 et Hox4
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Chez l’homme
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Cellules souches « adultes »
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Tissus à renouvellement rapide=cellules souches
cheveux Épithélium digestif
Moelle osseuse
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Cellules souches adultes• Les cellules souches adultes sont cruciales pour le
renouvellement tissulaire• Ces cellules sont capables d’auto-renouvellement
et de différenciation• L’homéostasie d’un organisme adulte résulte de
l’équilibre entre:– l’état quiescent de ces cellules souches (pool de réserve) – et leur mise en cycle (amplification cellulaire pour le
renouvellement tissulaire)• Modèle des cellules souches hématopoïétiques
(CSH)
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Modèle CSH
• Durent toute la vie…
• Hématopoïèse
• À la base des greffes de moelle allogéniques: thérapie cellulaire de loin la plus utilisée
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Expérience princeps: Till et Mc Culloch, 1961
Irradiation sub-léthale1000Gy
+ Greffe de moelle (IV)
CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUESTRANSFERT ADOPTIF=>GREFFE DE MOELLE
J10: colonies de cellules hématopoïétiques clonales, multi-linéales, dans la rate (CFU-S)
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CARACTERISATION DES CSH : reconstitution de l’hématopoïèse à long terme
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Suda et coll, Trends in immunology Vol.26 August 2005
Traitement par le 5-fluoro-uracileAnti-métabolite incorporé dans l’ADN et l’ARN
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Tri des cellules par cytomètre en flux
• Identification d’une fraction cellulaire capable de reconstituer l’hématopoïèse : contient les cellules souches
– Cellules quiescentes
– Très rares: ~1/10.000 cellules
– Indifférenciées: « lineage negatives » (Lin-)
– Capables d’effluer des colorants (Rhodamine, Hoechst)
par des transporteurs ABC: ABSG2 et MDR1
– Expriment (CD34+), CD133, c-kit
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Caractéristiques des CSH• Dans la M.O , le nombre de CSH reste relativement constant en l’absence de perte de sang ou d’autres traumatismes
• L’état de quiescence corrèle avec leur caractère multipotent
• 2 modèles pour expliquer l’homéostasie de l’hématopoïèse
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Modèle A:• Dans des conditions normales, ces CSH sont
quiescentes (G0 du cycle cellulaire), mais se divisent régulièrement,– pour assurer la maintenance du pool de CSH– Permet d’éviter d’acquérir des mutations conduisant à
leur transformation maligne– Division asymétrique:
• 1CSH => 1CSH + 1 cellule qui va s’engager dans la différencation
Linheng
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– 1 pool de CSH
« dormantes », qui gardent
la capacité de d’activité de
cellule souche
multipotentes
– réagissant aux besoins
suscités par l’organisme
– revenant à l’état dormant
une fois les lésions
réparées
Linheng
Modèle B:
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Wilson cell 2008
Population capable de reconstituer l’hématopoïèse: Différents sous types, plus ou moins en cycle
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Wilson, Cell décembre 2008
-Injection de BrdU dans les souris à un instant donné-Le BrdU s’intercale dans l’ADN qui devient fluorescent-Suivi du contenu en BrdU par cytométrie en flux
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Modèle B: synthèse
Linheng
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Organisation de la moelle hématopoïétique
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À l’interface os/moelle: Les ostéoblastes:
-fabriquent la trame osseuse
-supportent le développement des CSH:
*Un déficit ostéoblastique entraîne une
diminution importante de l’hématopoïèse (Visnjic, 2004)
*La co-transplantation de d’ostéoblastes avec les cellules souches augmente la prise de greffe (Tachman, Hematology 2000)
Cellules souches Lin- :-marquées à la fluorescéine- Injectée à une souris témoin-analyse 15h après
Localisation des cellules souches au niveau de l’endostéum, au contact des ostéoblastes=> Interactions préférentielles
Nilsson, S. K. et al. Blood 2001
Niche ostéoblastique
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La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-
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La niche hématopoiétique « adulte »-contacts physiques-
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La niche hématopoiétique « adulte »
Ang1
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La niche hématopoiétique « adulte »
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La niche hématopoiétique « adulte »
![Page 43: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/43.jpg)
La niche hématopoiétique « adulte »
CXCL12
CXCL12
SYSTEME NERVEUX SYMPATHIQUE
Noradrénaline
pleraxifor
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« Synapse » ostéoblaste - CSH
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Synthèse• Les CSH intègrent des signaux qui
proviennent de l’interaction avec:– les ostéoblastes, les cellules réticulaires
(mésenchymateuses)– mais aussi du micro-environnement médullaire
qui est ouvert notamment en raison de la riche vascularisation de la moelle osseuse
– Les cellules en cours de différenciation
• comment peut s’opérer la différenciation et l’expansion des cellules hématopoïétiques?
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Etapes de la régulation de l’hématopoïèse
CSH indifférenciéemultipotente
QuiescenceAuto-renouvellement
Engagement
DifférenciationMaturation
Cellules hématopoïétiques différenciées
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Hierarchie de l’hématopoïèse
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Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
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Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
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Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
![Page 51: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/51.jpg)
Cultures à long termeCultures à long terme
(5 semaines)
Formation de coloniesFormation de colonies
(10-21 jours)
in vitroin vitro
in vivoin vivo
Reconstitution lympho-myéloïde.Reconstitution lympho-myéloïde.Cellules souchesCellules souches
Progéniteurs déterminésProgéniteurs déterminés
ProgéniteursProgéniteursimmaturesimmatures
MyéloïdesMyéloïdes LymphoïdesLymphoïdes
in vitroin vitro
Le système hématopoïétique
≥ (4 mois)
CD
34C
D34
++
Cellules identifiables Cellules identifiables morphologiquementmorphologiquement
99%99%
0,5 à 1%0,5 à 1%
0,01%0,01%
0,0001%0,0001%
*: Facteurs decroissance
*
*
SCID-RC
LTC-IC
CFC
![Page 52: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/52.jpg)
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Comment ces mécanismes se mettent-ils en place?
• Régulation simultanée:– Auto-renouvellement de la CSH– Engagement dans la différenciation– Spécification de la lignée– Homéostasie
• Mécanismes:– Machinerie transcriptionnelle (intrinsèque)– Signaux extrinsèques: cytokines, facteurs de
croissance
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INDUCTION ET MISE EN ROUTE DU PROGRAMME
DE DIFFERENTIATION
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microRNAs
Engagement cellulaire
Contrôle intra-cellulaire: facteurs de transcriptionContrôle extra-cellulaire: facteurs de croissance, cytokines
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CSH
CLPCMP
NOTCH-1, Bmi-1 GATA-2, HOX-B4
PU-1, GATA-1
Régulation transcriptionnelle au cours des premiers stades de l’hématopoïèse.
Progéniteur myéloidecommun
Progéniteur lymphoïdecommun
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Facteurs de transcription et cytokines
• PU.1: facteur de transcription myéloïde
• PU.1 réprimé par MafB
• La fixation de M-CSF induit l’expression de PU-1, sous l’influence de nombreux événements:– Intinsèques
– Épigénétiques
– externesSarrazin et al., Cell, 2009
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Rôle prépondérant de certains facteurs de transcription
De la cellule souche à la cellule différenciée
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Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45
De la cellules souche
De la cellule souche
à la cellule différenciée
Rôle prépondérant de certains facteurs de croissance
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Facteurs de croissance hématopoïétiques• glycoprotéines monomères (sauf IL-5 et M-CSF, dimères)
• synthèse par un grand nombre de cellules (sauf l'érythropoïétine ou EPO, qui n'est élaborée que par le rein): Lymphocytes, fibroblastes, monocytes, cellules endothéliales, lymphocytes T et B, d' ou leur nom « cytokines »
• Redondance
• Synergies : – Nécessité de plusieurs signaux différents pour la mise en cycle des
progéniteurs
– Réponses prolifératives additives
– Effets distincts et multiples d'une cytokines sur des cibles cellulaires différentes.
• action locale ( hormone): endocrine, paracrine, autocrine.
• Agissent sur un récepteur spécifique: – Niveau d'expression des récepteurs régulé (+ ou -).
– dimérisation du récepteur
– transduction d ’un signal via la phosphorylation du récepteur et des protéines associées vers le noyau
– activation de la transcription de gènes donnés
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![Page 62: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/62.jpg)
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• Facteurs de promotion et de survie cellulaire, ex:– Stem cell factor (SCF) = kit ligand:
– Viabilité des progéniteurs immatures et myéloïdes– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et erythroblastiques avec d’autres cytokines– Indispensable à l’erythropoièse fœtale (foie)
– FLT-3 ligand:– Croissance des progéniteurs immatures myéloides
et mégacaryocytaires
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (1)
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• Facteurs de prolifération et de différenciation, ex:– Non spécifiques de lignée:
– Interleukine -3 (IL-3) : action sur toute la myélopoïèse– Interleukine 6 sur tous les progéniteurs
– Spécifiques de lignée:– Granuleux/macrophagiques: GM-CSF, G-CSF, M-CSF– lignée éosinophile : IL-5– lignée érythroïde : érythropoïétine (Epo)– lignée méga : thrombopoïétine (Tpo)– lignée lymphocytaire :
– maturation : IL-2, IL-4,– croissance : IL-7 – différenciation plasmocytaire : IL-6
Facteurs de croissance Hématopoïétiques (2)
![Page 65: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/65.jpg)
Kaushansky, NEJM, 2006, 2034-45
Modèle de l’hématopoïèse
De la cellules souche
De la cellule souche
à la cellule différenciée
![Page 66: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/66.jpg)
Régulation négative de l’hématopoièse
• TGF b (Transforming Growth Factor b ): un inhibiteur de l'entrée en cycle cellulaire des progéniteurs primitifs
• TNF a (Tumour Necrosis Factor a ) agit en fait de manière différente (action inhibitrice ou stimulante) suivant les facteurs de croissance
• MIP 1a (Macrophage-Inflammatory Protein 1a ) ne limite pas son action au tissu hématopoïétique et se trouve impliqué dans de nombreux processus inflammatoires.
• Protéines SOCS (Suppressors Of Cytokine Signaling: SOCS 1-3, CIS)– La synthèse des SOCS est induite très rapidement in vivo et in vitro
(apparition de mRNA) en réponse à la stimulation des cellules cibles par les cytokines comme IL2, IL-3, IL-4, IL-6, interferon-, EPO, G-CSF, GM-CSF, Prolactine, Hormone de croissance.
![Page 67: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/67.jpg)
Mode d’action des protéines SOCS
![Page 68: Cellules souches et cellules proliférantes. Régulation de la différenciation cellulaire Master Physiopathologie cellulaire et moléculaire 29 septembre](https://reader036.vdocuments.mx/reader036/viewer/2022062404/551d9d8e497959293b8c3795/html5/thumbnails/68.jpg)
Synthèse de la différenciation des CSH
• CSPH médullaires qui vont se différentier vers– polynucléaires PNN ou PNE ou PNB,– Globules rouges (GR)– Mégacaryocytes (plaquettes)– Lymphocytes (B,T, NK)
• action intriquée de nombreux facteurs– Facteurs de croissance, interleukines– Molécules d’adhésion– Facteurs de transcription
• 2 modèles d’étude:– Par les gènes spécifiques de la lignée– Par les déficits
• Pathologies• Souris KO