好熱性細菌の分離と系統分類およびゲノム解析 - japan …111 microbiol. cult....

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Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2012Microbiol. Cult. Coll. 28（2）：109 ─ 120, 2012

はじめに　Chloroflexi 門は現在少なくとも 6 つの綱Chloroflexi（Garrity & Holt, 2001），Caldilineae

（Yamada et al., 2006），Thermomicrobia（Hugenholtz & Stackebrandt, 2004），Anaerolineae（Yamada et al., 2006），Ktedonobacteria（Cavaletti et al., 2006）及び

‘Dehalococcoidetes’（Hugenholtz & Stackebrandt, 2004）に分類されており，未培養の clone cluster

（Morris et al., 2004）も綱レベルで区別される事が報告されている．　Ktedonobacteria 綱は，正式に提唱されている培養株は Ktedonobacter racemifer SOSP1-21T（Cavaletti et al., 2006）のみであり，系統分類学的知見が少ない系統である．Cavaletti らは，Ktedonobacteria 綱はChloroflexi 綱と系統が近いが，分子系統樹で高く支持されない事や，多くの性質の差異から新しい独立した門に位置する可能性について指摘している．しかし，Chloroflexi は多様な表現形質を持つ系統である事から，Ktedonobacteria 綱を新門として提唱するまでには至らなかった．後に筆者らが分離したKtedonobacteria 綱に属する細菌と併せて分子系統解析した結果，高い支持率で Chloroflexi 門に属する事

が明らかとなり，現在 Ktedonobacteria 綱はChloroflexi 門に帰属している（Fig. 1）（Yabe et al., 2010a）．この Chloroflexi 門，Ktedonobacteria 綱に属する K. racemifer SOSP1-21T は分岐した気菌糸に胞子を着生する典型的な放線菌様の形態を示す事が分かっており，Cavaletti らは土壌から新規化合物を生産する放線菌の獲得を目的に研究を行っていたところ，Ktedonobacter racemifer SOSP1-21T を放線菌と誤同定したと報告している程である（Cavaletti et al., 2006）．放線菌の属する Actinobacteria 門とは系統的に大きく離れている Chloroflexi 門に属する細菌がそのような形態分化を示す事は興味深いが，その形態学的特徴は K. racemifer SOSP1-21T の生育が遅いせいか，胞子着生や気菌糸の様子，培養ステージ毎の形態などについて判然とする観察結果が掲載されていない．このように複雑な形態分化を示すが，情報の乏しい珍しい系統からさらに培養株を分離し，その形態学的特徴や性質を明らかにする事は系統分類学や形態分化，進化学の観点からも重要であると考えられる．　一方，筆者らはコンポストや地熱地帯から新規好熱菌の分離を試みていたところ，この Ktedonobacteria綱に属する新規好熱菌の分離に至った．この系統の他にも新規好熱菌を分離・提唱したが（Table 1），本稿では，形態に大きな特徴を有した Ktedonobacteria に

好熱性細菌の分離と系統分類およびゲノム解析─ Chloroflexi 門に属する放線菌様細菌 Ktedonobacteria 綱の特徴─

（平成 24 年度日本微生物資源学会奨励賞受賞）

矢部修平

株式会社県南衛生工業ハザカプラント研究所　〒989-1311　宮城県柴田郡村田町大字足立字稲荷山 44 番地

Isolation, systematic classification and genome analysis of novel thermophilic bacteria

─ Characteristic of actinomycetes-like bacteria belonging to the class Ktedonobacteira within the phylum Chloroflexi ─

Shuhei YabeHazaka Plant Research Center, Kennan Eisei Kogyo, Co., Ltd.

44 Aza-Inariyama, Oaza-Ashitate, Murata-cho, Shibata-gun, Miyagi 989-1311, Japan

受賞総説

E-mail: [email protected]

矢部修平Ktedonobacteria の特徴

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着目し，その系統分類，胞子形成様式の観察，ゲノムの特徴に関しての研究成果を紹介したい．また，応用の可能性についても述べる．

Ktedonobacteria 綱に属する細菌の分離　Ktedonobacteria 綱に属する好熱菌の分離に至った経緯について紹介する．分離源としたコンポストは，牛糞を主原料としてハザカ式コンポスターを用いて生産されたものであり，発酵過程で微生物による有機物の分解熱によって 60-80℃程度の高温に曝された発酵生産物である（Yabe et al., 2009）．筆者らはカナマイ

シンなどの抗生物質を含む培地を用いて，このコンポストから 83 菌株の好熱菌を 60-80℃の高温域で純粋分離した．それらの菌株の 16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統解析の結果，28 菌株は既知種と 88-98%の相同性であり，これらは Firmicutes 門，Actinobacteria 門，Proteobacteria 門，Bacteroidetes 門，Chloroflexi 門の中で 8 つの独立した系統を形成した

（Table 1, Fig. 1）（矢部ら，2011a）．これら独立した系統を形成する 8 株の内，SK20-1T 株は Fig. 2 に示したような豊富な気菌糸を形成するコロニーを形成し，胞子が気菌糸上にクラスター状に着生していた．この

Uncultured bacterium SMG38 (AM930290)Bacteroidetes bacterium 37LGx-1 (AB375750)Sphingobacterium thermophilus CKTN2 (AB563783)Sphingobacterium composti T5-12 (AB244764)Niabella aurantiaca R2A15-11 (DQ457019)

Strain F1 (AB535716)Uncultured bacterium SMG38 (AM930290)

Escherichia coli ATCC 11775 (X80725)Burkholderia caryophylli ATCC 25418 (AB021423)

Phyllobacterium trifolii PETP02 (AY786080)Thermovum composti Nis3 (AB563785)Uncultured compost bacterium clone PS3384 (FN667469)Paenibacillus sp. MC-246 (FN293173)Uncultured compost bacterium clone FS862 (FN667102)Paenibacillus sp. AHK180-5 (AB306508)

Strain Nis2 (AB563784)Paenibacillus hodogayensis SG (AB179866)

Tuberibacillus calidus 607 (AB231786)Geobacillus thermodenitrificans BGSC 94A2 (AY608961)

Uncultured compost bacterium clone BO3153 (FN667439)Strain Mi-1 (AB563786)

Thermoactinomyces vulgaris KCTC 9076 (AF138739)Uncultured compost bacterium clone PS3377 (FN667463)Thermaerobacter subterraneus C21 (AF343566)Thermaerobacter composti Ni80 (AB454087)Streptomyces thermovulgaris DSM 40444 (Z68094)Saccharomonospora halophila DSM 44411 (AJ278497)Thermobifida fusca ATCC 27730 (AF028245)Actinopolymorpha singaporensis IM7744 (AF237815)Thermasporomyces composti I3 (AB535715)

Chloroflexus aurantiacus J-10-fl (D38365)Herpetosiphon geysericola ATCC23076 (AF039293)

Ktedonobacter racemifer SOSP1-21 (AM180156)Thermosporothrix hazakensis SK20-1 (AB500145)Thermogemmatispora onikobensis ONI-1 (AB547912)Thermogemmatispora foliorum ONI-5 (AB547913)

100

100

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100

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100

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74100

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79100

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92

91

92

76

100

79

0.02

Bacteroidetes

Proteobacteria

Firmicutes

Actinobacteria

Chloroflexi

Fig. 1　分離菌株の NJ法による 16S rRNA遺伝子配列に基づく系統樹太字で示したのが筆者らが分離した菌株．

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Microbiol. Cult. Coll. Dec. 2012 Vol. 28, No. 2

形態学的特徴は典型的な放線菌に属する細菌群と酷似していたため，当時，筆者らは Cavaletti らと同様，放線菌に属するのだろうと予測していた．しかし，16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統解析の結果，Fig. 1 の系統樹で示したとおり Chloroflexi 門の中の独立した系統を形成する事が明らかとなった．最も近縁の種は Ktedonobacteria 綱に属する Ktedonobacter racemi-fer SOSP1-21T であり，16S rRNA 遺伝子配列の相同性は 88.7% を示した（Table 1）．この SK20-1T 株は，後述する系統分類学的試験の結果，Ktedonobacteria綱に属する事が明らかとなった（Fig. 3）（Yabe et al., 2010a）．　その他の自然界からもこの系統に属する菌株の分離を試みるために，どのような環境に生息しているのかを greengene database（http://greengenes.lbl.gov/）を用いて調べた結果，Ktedonobacteria 綱の分岐群に含まれる未培養クローンの 16S rRNA 遺伝子配列は280 クローン以上登録されており，その検出源の多く

は土壌と地熱地帯の堆積物（土壌）などであった．そのほとんどが未培養であるが，2008 年には Stott らによってニュージーランドの地熱地帯からKtedonobacteria 綱のクラスターに入る 4 菌株の分離が報告された（Stott et al., 2008）．これら 4 菌株は未提唱である．筆者らはこれらの菌株が分離された培地である FS1V 培地を改変して，同じ地熱地帯から分離を試みる事とした．分離源は宮城県鬼頭温泉地獄谷遊歩道脇の，熱水が噴出している付近の土壌上に堆積した落ち葉をサンプリングした．その落ち葉を研究所で風乾させ，直接接種法にて 65℃で分離を行った．7 日間培養後，気菌糸を形成する放線菌様のコロニーがシャーレを覆った．このような高温で気菌糸を形成する放線菌は知られていないため，Ktedonobacteria 綱に属する好熱菌である事を期待して適当に 2 株（ONI-1T 株，ONI-5T 株）を純粋分離した．そして，この 2株の 16S rRNA 遺伝子配列に基づく系統解析を行った結果，Fig. 3 の系統樹が示すように Stott らが分離

Table 1　コンポストと地熱地帯に堆積した落ち葉から分離した細菌の一覧表Strain name

Proposed name Isolation source

Closest relatives(Accession no.)

16S rRNAgene sequence similarities

Phylum

Nis2 Not yet proposed Compost Paenibacillus hodogayensis SG

93.8% Firmicutes

Mi-1 Not yet proposed Compost Tuberibacillus calidus 607

91.2% Firmicutes

F1 Not yet proposed Compost Niabella aurantiaca R2A15-11

93.4% Bacteroidetes

Nis3 Thermovum composti (Yabe et al., 2012a)

Compost Phyllobacteriumtrifolii BIHB4156

94.9% Proteobacteria

CKTN2 Sphingobacterium thermophilum (Yabe et al., 2012b)

Compost Sphingobacterium composti T5-12

92.6% Bacteroidetes

Ni80 Thermaerobacter composti (Yabe et al., 2009)

Compost Thermaerobacter subterraneus C21

98.2% Firmicutes

I3 Thermasporomyces composti (Yabe et al., 2011b)

Compost Actinopolymorpha singaporensis IM744

95.5% Actinobacteria

SK20-1T Thermosporothrixhazakensis (Yabe et al., 2010a)

Compost Ktedonobacter racemifer SOSP-21

88.7% Chloroflexi

ONI-1T Thermogemmatispora onikobensis (Yabe et al., 2011c)

Fallen leaves on geothermal soils

Ktedonobacter racemifer SOSP-21

83.1% Chloroflexi

ONI-5T Thermogemmatispora foliorum (Yabe et al., 2011c)

Fallen leaves on geothermal soils

Ktedonobacter racemifer SOSP-21

83.0% Chloroflexi


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した 4 株と同じクラスターに入り，近縁の好熱菌である事が明らかとなった．この ONI-1T 及び ONI-5T 株は後述する系統分類学的研究により Ktedonobacteria綱に属する事が明らかとなった（Yabe et al., 2011c）．

Ktedonobacteria 綱に新規分類群の創設　コンポストから分離した SK20-1T 株と地熱地帯から分離した ONI-1T 及び ONI-5T 株を含む Chloroflexi門の分子系統樹（Fig. 3）が示すように，Ktedonobacteria 綱の分岐群は大きく 2 つのクラスターに分かれていた．K. racemifer SOSP1-21T 及びT. hazakensis SK20-1T 株を含むクラスターとのニュージーランドの地熱地帯からの分離株であるP359, P352, T81 及び T104 株と ONI-1T 及び ONI-5T

から成るクラスターである．これら 2 つの系統群は16S rRNA 遺伝子配列の相同性の低さなどから目レベルで隔たっており，また，K. racemifer SOSP1-21T とT. hazakensis SK20-1T 株は科レベルで区別される事が適当であると考え，Ktedonobacteria 綱に新たに新目 T h e r m o g e m m a t i s p o r a l e s , 新科Thermogemmatisporaceae を創設し，ONI-1T 株を新属・新種 Thermogemmatispora onikobensis としてONI-5T 株を新種 T. foliorum として提唱した（Yabe

et al., 2011c）．また，Ktedonobacterales 目に新科Thermosporotrichaceae を創設し，SK20-1T 株を新属・新種 Thermosporothrix hazakensis として提唱した

（Yabe et al., 2010a）．これらの提案によってKtedonobacteria 綱は 2 目，3 科，3 属，4 種で構成される事となった．

Ktedonobacteria の形態と性質　Ktedonobacteria 綱に属する K. racemifer SOSP1-21T， Thermosporothrix hazakensis SK20-1T 及びThermogemmatispora onikobensis ONI-1T の SEM 観察結果を Fig. 4 に示した．この 3 株は同じKtedonobacteria 綱には属するが，Ktedonobacter 及び Thermosporothrix と Thermogemmatispora は目レベルで，Ktedonobacter と Thermosporothrix は科レベルで系統が大きく異なるにも拘わらず，共通して分岐した気菌糸に胞子を着生する典型的な放線菌様の形態を示した．このような複雑な形態分化をKtedonobacteria の系統でまとまって示す事は大変興味深く，この事は，分子系統樹上では Chloroflexi 門は Actinobacteria 門より以前に進化したと考えられているため，放線菌様の形態の起源が Actinobacteria ではなくKtedonobacteriaである可能性を示唆している．　Thermosporothrix hazakensis SK20-1T 及びThermogemmatispora. onikobensis ONI-1T の成熟胞子の TEM 観察結果（Fig. 5）から胞子は細胞膜と厚い細胞壁で囲まれており，膜と細胞壁により菌糸と明確に仕切られていた． Bacillus 属やThermoactinomyces 属の内生胞子のような細胞膜の多層構造は確認できなかった．　生理学的，化学分類学的性質の特徴を Table 2 に示した．4 株ともにグラム陽性，好気性（K. racemifer SOSP1-21T は微好気性）であった．既報の Chloroflexi門に属する細菌はすべて胞子や分岐菌糸は非形成であり，多くは嫌気性でグラム陰性である．このようにKtedonobacteria は報告されている Chloroflexi の性質とは大きく異なっていた．また，T. hazakensis SK20-1T は 58℃，Thermogemmatispora 属は 74℃まで増殖可能な好熱菌であった（Yabe et al., 2010a, 2011c）．65℃以上で気菌糸を形成可能な微生物は糸状菌や放線菌などにも知られておらず，この属が微生物で初めての報告である． T. hazakensis SK20-1T とThermogemmatispora 属の 2 株は増殖が容易で早く，培養 2-3 日後には豊富な気菌糸を生じるコロニーを形成する一方で，K. racemifer SOSP1-21T は気菌糸形成

Fig. 2　 Thermosporothrix hazakensis SK20-1T のコロニーの様子

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まで 3 週間程度要した．Thermogemmatispora 属の細胞壁アミノ酸にはこれまで原核生物では報告のないヒスチジンが含まれ，脂肪酸には Unknown fatty acid (ECL19.032) が ONI-1T 株には 25.6％ , ONI-5T 株には 14.6％含まれていた（Yabe et al., 2011c）．2012年に Vyssotski らによって，同属の近縁菌株であるT81 株（Stott らによってニュージーランドの地熱地帯から分離された 4 株の内の 1 株，Fig. 3 参照）の脂肪酸の精密質量分析や構造解析から，この属が持つUnknown (ECL19.032) の脂肪酸は新規脂肪酸 12, 17-Dimethylocatadecanoic acid である事を明らかにしている（Vyssotski et al. , 2012）．このようにThermogemmatispora属は菌体構成成分が大変ユニークであり，その生合成経路の解明が待たれる．

ライフサイクルと胞子形成様式　放線菌様の複雑な形態分化を示す Ktedonobacteria

のライフサイクルと胞子形成過程を調べるため，培養が容易で生育の早い T. hazakensis SK20-1T をモデルとして，詳細な観察を行った．培養ステージ毎に光学顕微鏡や SEM, TEM で観察し，ライフサイクルを描いたものを Fig. 6 に示した．そのライフサイクルは，胞子からの出芽，培地への栄養菌糸の伸長，気菌糸の伸長，胞子形成，胞子成熟，胞子の遊離から成り，多くの放線菌のそれと類似していた．培養初期の菌糸は表面が滑らかで先端は丸みを帯びていており，栄養菌糸，気菌糸とも隔壁に囲まれた細胞が連なって形成されていた．胞子形成の様子を培養初期に SEM 及びTEM にて観察した結果を Fig. 7A に示した．胞子の発芽は，気菌糸の細胞壁の外に細胞膜が突き出る様な状態で開始された（Fig. 7A-a）．その後に若い胞子細胞が膨らみ，隔壁の形成によって気菌糸細胞と隔離されて初期の胞子細胞が形成された（Fig. 7A-b）．様々な方向に膨らんだ若い胞子は明らかに気菌糸の幅より

Ktedonobacter racemifer SOSP1-21Bacterium SOSP1-85Bacterium SOSP1-3Bacterium SOSP1-0Bacterium SOSP1-52Bacterium SOSP1-1Bacterium SOSP1-165Bacterium SOSP1-9

clone 1959-6clone 1959-1

Thermosporothrix hazakensis SK20-1Ktedonobacteria bacterium Hsw-67clone p25e24ok

clone p36f22okclone B424

clone B149clone 1921-4

clone FCPS679clone HSB OF53_F07clone CWT SM03_D12clone P8Chloroflexi bacterium P359Chloroflexi bacterium T81

Thermogemmatispora foliorum ONI-1Chloroflexi bacterium P352clone Wkt_02Chloroflexi bacterium T104

Caldilinea aerophila STL-6-O1Dehalococcoides ethenogenes 195

100

100998079

100

99

93

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79

100

100

100100

100

88100

100

99

81

100

83

75

79

82

79

0.02

Thermogemmatispora onikobensis ONI-5

Anaerolineae

Clone clusterChloroflexi

Thermomicrobia

Ktedonobacteria 綱

Ktedonobacteriales 目

Thermogemmati-sporales 目

Ktedono-bacteriaaceae 科

Thermosporo-trichaceae 科

Thermo-gemmati-sporaceae 科

Fig. 3　Chloroflexi門に属する種の 16S rRNA遺伝子配列に基づく NJ法を用いた系統樹


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Ktedonobacter racemifer SOSP2-11

Thermosporothrix hazakensis SK20-1

Thermogemmatispora onikobensis ONI-1

Fig. 4　 Ktedonobacter racemifer SOSP1-21T, Thermosporothrix hazakensis SK20-1T 及び Thermogemmatispora onikobensis ONI-1T の走査型電子顕微鏡写真

Thermosporothtix hazakensis SK20-1 Thermogemmatispora onikobensis ONI-1

Fig. 5　 T h e r m o s p o r o t h r i x hazakensis SK20-1T 及びThermogemmatispora onikobensis ONI-1T の胞子の透過型電子顕微鏡による超薄切片像

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も小さかったため，この胞子形成様式は出芽による外生胞子である事が明らかとなった．さらに，気菌糸内の隔壁で囲まれた 1 つの母細胞から 4 個かそれ以上の複数の胞子が出芽によって形成されている事が観察された（Fig. 7B）．その母細胞から出芽した胞子の大きさはそれぞれで異なっており（Fig. 7B），観察された中で最も若い隔壁で区切られた胞子細胞は長さ 0.4 mm, 幅 0.3 mm であった．この事は 1 つの母細胞か

ら出芽する時間とスピードが異なる事を示している．一方で栄養菌糸には胞子は観察されなかった（Yabe et al., 2010b）．　この気菌糸に胞子が着生する様子は放線菌のSaccharomonospora sp.（Edith et al., 1988; Hu et al., 1988）や Actinomadura formosensis（Hasegawa et al., 1986）に似ているが，根本的に異なっている．これらの胞子は分岐した菌糸の先端が分節する事で生じ

Fig. 6　 Thermosoporothrix hazakensis strain SK20-1T のライフサイクル

胞子からの発芽

基底菌糸の形成

気菌糸の伸長

出芽による発芽

胞子の成熟

胞子の遊離？

2-4 日

5-7 日

遊離胞子

Table 2　 Thermogemmatispora onikobensis ONI-1T, Thermogemmatispora foliorum ONI-5T, Thermosporothrix hazakensis SK20-1T 及びKtedonobacter racemifer SOSP1-21T の特徴

Characteristic T. gem. ONI-1T T. fol. ONI-5T T. haz. SK20-1T K. rac. SOSP1-21T

Gram stain Positive Positive Positive PositiveG+C content (mol %) 60.2 58.1 54.0 53.9Temperature for growth (℃)　Range 50-74 45-74 31-58 17-40　Otimum　 60-65 60-65 50 28-33Hydrolysis of: starch − − − +　　　　　　 Avicel + + + −　　　　　　 xylan + + + −　　　　　　 chitin + + + −Major quinone MK-9(H2) MK-9(H2) MK-9 (H2) MK-9 (H2)Major cellular fatty acids C17:0 iso

Unknown (ECL19.032)*

C17:0 isoUnknown (ECL19.032)*

C17:0 iso C16:1 2OH, C17:0 iso

Cell wall amino acid Glu, Ser, Gly, His, Ala, Orn

Glu, Ser, Gly,His, Ala, Orn

Glu, Ser, Gly, Ala, Orn

Glu, Ser, Gly,Ala, Orn

データは Yabe et al.（2010a, 2011c）及び Cavaletti et al.（2006）から引用した．Glu: glutamic acid，Orn: ornithine，Ser: serine，Gly: glycine，His: histidine，Ala: alanine．Unknown (ECL19.032)* は Vyssotski et al.（2012）によって12,17-dimethyloctadecanoic acid と同定された．


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る分節胞子である．原核生物において出芽によって栄養細胞を形成する細菌種は少ないながらいくつか報告されているが，出芽によって直接胞子を形成する細菌は確認されていない．しかし，出芽胞子を形成すると記載されている例は以下のようにいくつかある．放線菌の Pseudonocardia spinosa（Henssen at al., 1983）は出芽胞子と記載されているが，これは気菌糸を出芽によって形成し，その後，分化して結果として胞子を形成している．このため，直接出芽によって胞子を形

成したわけではない．放線菌の Micromonospora chalcea（George & Chrles, 1973）や Kineosporia sp.

（Pagani & Parenti, 1978）もまた出芽胞子と記載されているが，その TEM 写真からこれらの胞子は分岐した菌糸の先端が胞子に分化する事によって形成されており，Saccharomonospora や Actinomadura formo-sensis と同様に分節胞子である．また Planctomyces sp. （Hirsch, 1972）は当時出芽胞子を形成するとされていたが，これは胞子ではなく娘細胞である（Angert,

Fig. 7　Thermosporothrix hazakensis SK20-1T の培養ステージ毎の電子顕微鏡写真

A：培養初期に出芽によって若い胞子が形成された様子

a

b

c

d

B：培養中期において 1つの細胞から複数の胞子が形成された様子

e

C：成熟した胞子の様子

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2005）．いずれにせよ，これらの細菌は 1 つの細胞から 1 つの胞子を形成するため，本株のように１つの細胞から複数の胞子を形成する胞子形成様式とは大きく異なっている．１つの細胞から複数の胞子を形成する原核生物の例も少ないが，Metabacterium polyspora

（Angert & Losick, 1998）や Anaerobacter polyen-dosporus（Duda et al., 1987）が存在する．しかし，これらは内生胞子であるため，SK20-1T の出芽による外生胞子とは異なる．よって T. hazakensis SK20-1T

株の胞子形成様式は原核生物では報告例がない．このように１つの細胞から複数の胞子を形成するためには1 つの染色体 DNA が複数のコピーを作らなければならず，遺伝的メカニズムは高度に制御されているものと考えられる．このような多出芽外生胞子形成様式はむしろ真核生物である担子菌の Mixia osmundae

（Nishida et al., 1995) に似ている．　培養後期は，胞子が成熟してブドウの房のようなクラスターを形成した（Fig. 7C）．成熟胞子形成後の気菌糸内の細胞質は，胞子により栄養分を吸い取られてほとんど空であり (Fig. 7C-e），成熟胞子を支える事は困難であると考えられる．よって胞子は成熟後に遊離しているものと推察された．　以上，T. hazakensis SK20-1T 株は放線菌と同様に非常に複雑な分化を伴うライフサイクルを示し，胞子形成様式は１つの細胞から複数の外生胞子を出芽によって形成する多出芽外生胞子形成様式である事が明らかとなった．この様式は真菌類の胞子形成様式と類似しているため blastospore と呼ぶ事にした．K. racemifer SOSP1-21T 及び Thermogemmatispora 属の2 株も同様の胞子形成様式を示す事は SEM で確認しており Ktedonobacteria 共通の特徴である事が強く示唆された．また，このような特徴的な形態分化を示す新しい系統が近年になって所謂難培養微生物ではなく，簡単に培養可能であった事は驚きであり（K. racemifer は著しく培養速度が遅いため難培養であるかもしれない），放線菌や枯草菌，粘液細菌などと同様に細胞分化や進化の研究の新たな基礎材料となり，その分野で重要な知見を生み出す微生物資源となる可能性がある．

Thermosporothrix hazakensis SK20-1Tのゲノム解析　2011 年に Chang らによって Ktedonobacter racemi-fer SOSP1-21T のゲノムが解読され，そのゲノムサイズは 13,661,586 bp, タンパク質をコードする遺伝子の数が 11,453 個であり，ゲノム配列が報告されている

原核生物では最も大きい事が明らかとなった（Chang et al., 2011）．特徴として xylose isomerase 遺伝子や各種抗生物質耐性に関わる遺伝子の数が多い事を挙げている．筆者らは，同じ Ktedonobaceria 綱に属するT. hazakensis SK20-1T のゲノムをドラフト解析した．アノテーションのアルゴリズムは GeneRock を用いて，6 フレームスキャンを行い，34 アミノ酸以上のORF をカウントした．その結果，ゲノムサイズは約7.3 Mbp, ORF 数は 6,284 個であった（Table 3）．Ktedonobacter racemifer SOSP1-21T と比較するとゲノムサイズ，ORF 数ともに約半分である事が明らかとなった．COGs による機能分類の結果，特に大きな特徴はないが，遺伝子数の多さに起因するのか，COG により分類できない未知遺伝子の割合が多い事が分かった（Table 4）．また SK20-1T 株の遺伝子中には抗生物質生産に深く関与するとされるポリケタイド生合成酵素（PKS）や非リボゾーム型ペプチド合成酵素（NRPS）の遺伝子クラスターが複数存在し，その相同遺伝子のいくつかは粘液細菌や藍藻類と高い相同性（32-58%）を示した．粘液細菌は抗菌性や抗腫瘍性を示す難培養細菌として知られており，易培養性で後述するように抗菌性を示す T. hazakensis SK20-1T

から相同遺伝子が検出された事は興味深い．その他の特徴として多種多数の糖質加水分解酵素ファミリー

（GHs）が存在し，その中でセルラーゼ遺伝子は GH5, 6, 9, 12, 48 が検出された．既報の GH5, 6, 9, 12, 48 を併せ持つ微生物のほとんどが放線菌である．GH5, 9, 12 については大腸菌にて発現させ，それぞれが特徴のある性質を有する事を確認している（矢部ら，未発表）．

Ktedonoabceria の応用の可能性　放線菌の多くは分岐した基底菌糸が菌体外繊維質分解酵素を分泌して，土壌中のいろいろな腐植体の有機

Table 3　 Thermosporothrix hazakensis SK-20-1T とKtedonobacter racemifer SOSP1-21Tのゲノムの特徴

T.haz. K.rac.ゲノムサイズ（Mbp） 7.3 13.6G+C 含量 53.1% 53.8%RNA 遺伝子 59 87rRNA オペロン 10 8CDS 6,284 11,540COG で割り当てられない遺伝子

40.2 % 57.6 %


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物残査の中に伸長していくため繊維質分解能が高く，生産するセルラーゼなどは産業上利用されている．また放線菌は抗生物質などの二次代謝関連物質生産能に優れ，古くから発酵工業や医薬産業などで利用されている産業微生物でもある．現在報告されている抗生物質の多くが放線菌由来である．しかし，多くの研究者が放線菌をターゲットに有用物質を探索したため，現在では新しい構造や機能を有する抗生物質などの生理活性物質の発見は困難さを増してきている．　ところで，放線菌の二次代謝関連物質の生産と分岐した気菌糸へと分化する複雑な形態分化は深く相関性がある事が報告されており（Hara & Beppu, 1982），Ktedonobacteria は同様の形態分化を示す．実際に T. hazakensis SK20-1T のゲノム中には上述のとおり多種のセルラーゼ遺伝子を有し，T. hazakensis SK20-1T

と T. onikobensis ONI-1T 及び T. foliorum ONI-5T は微結晶性セルロースや CM セルロース，キシラン，粉末キチンなど対して強い分解性を示す事が明らかとなっている（Table 2）．またゲノム中の PKS や NRPS遺伝子クラスターとの関連性は明らかとなっていないが，T. hazakensis SK20-1T はある手法で抗菌試験を行うと広く細菌に対して活性を示す事も分かっている

（矢部ら，未発表）．これらの事は，Ktedonobacteriaは放線菌に代わる微生物資源に成り得る事を強く示唆している．

おわりに　1 種（K. racemifer）しか正式に提唱されていなかった Chloroflexi 門，Ktedonobacteria 綱に新たに 1 つの目と 2 つの科を創設し，3 属，4 種となった．これらの菌株は目，科レベルで系統が離れているにも拘わらず，共通して分岐した気菌糸に胞子を着生する典型的な放線菌様の形態を示し，さらにその胞子形成様式は気菌糸内の隔壁で囲まれた 1 つの細胞から複数の胞子を出芽によって形成する原核生物ではこれまで知られていなかった blastospore である事も明らかとなった．これらの発見は微生物の生態，進化，分類の基礎分野において重要な基礎的知見になると考えられ，さらゲノム配列を利用して，放線菌と比較する事により，形態分化に関わる遺伝子を解析するなどして，深く研究される事が期待される．また，放線菌に次ぐ様々な有用酵素や生理活性物質の探索源としての微生物資源と成り得る可能性があるため，筆者らはこの系統に属する細菌を今後も分離・提唱し，系統の多様性を明らか

Table 4　 Thermosporothrix hazakensis SK20-1TとKtedonobacter racemifer OSP1-21T のゲノムの COGによる機能分類の比較

コード T.haz. K.rac. Bacteria 機能J 2.74 1.96 4.34 Translation, ribosomal structure and biogenesisK 5.67 7.80 5.96 TranscriptionL 3.52 8.51 4.94 DNA replication, recombination and repairB 0.05 0.03 0.03 Chromatin structure and dynamicsD 0.48 0.30 0.76 Cell division and chromosome partitioningV 1.85 1.88 1.25 Defense mechanismsT 3.45 5.39 3.95 Signal transduction mechanismsM 2.63 2.24 4.35 Cell envelope biogenesis, outer membraneN 2.63 0.17 1.41 Cell motility and secretionU 0.22 0.47 1.76 Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transportO 2.01 1.70 2.95 Posttranslational modification, protein turnover, chaperonesC 3.98 3.63 4.80 Energy production and conversionG 5.67 5.34 4.86 Carbohydrate transport and metabolismE 5.30 4.14 7.25 Amino acid transport and metabolismF 1.27 1.18 1.78 Nucleotide transport and metabolismH 2.28 2.31 2.99 Coenzyme metabolismI 2.59 2.06 2.93 Lipid metabolismP 2.34 2.23 4.56 Inorganic ion transport and metabolismQ 1.96 1.89 2.33 Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolismR 8.02 9.59 10.43 General function prediction onlyS 3.68 4.53 6.14 Function unknown− 40.20 42.66 20.16 Not in COG

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にしたいと考えている．

謝　辞　本研究は，昨年，東京大学・分子細胞生物学研究所・バイオリソーシス分野を定年により御引退されました横田　明先生から全般に関してご指導頂き，大変充実した成果を上げる事ができました．心から感謝申し上げます．また，National Institute of Technology and Evaluation（NITE）/Biological Resource Center

（NBRC）の宮道慎二先生，田村朋彦先生，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology（AIST）の花田　智先生，また元東京大学バイオリスーシス分野の研究室の皆さまに御礼申し上げます．共同研究者の相羽由詞氏，弊社研究員の酒井康輝氏にも厚く御礼申し上げます．　民間企業であるにも拘わらず，直接利益と結びつかない基礎研究を理解して頂き，資金面でも精神面でも応援して頂きました株式会社県南衛生工業代表取締役葉坂　勝氏に深く感謝申し上げます．

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