carolina luisa geldsetzer mendoza
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EFECTO DE DIFERENTES FUENTES DE LÍPIDOS EN DIETAS DE VACAS
LECHERAS SOBRE LA EXPRESIÓN DE GENES RELACIONADOS CON LA
SÍNTESIS Y SECRECIÓN DE GRASA LÁCTEA DE CÉLULAS SOMÁTICAS
EN LECHE
Tesis presentada como requisito para optar al grado de
Magíster en Sistemas de Producción Animal
por:
Carolina Luisa Geldsetzer Mendoza
Comité de Tesis
Profesor guía: Einar Vargas Bello Pérez (Pontificia Universidad Católica de Chile)
Profesores informantes: Jaime Romero (INTA, Universidad de Chile)
María Sol Morales (Universidad de Chile)
Proyecto Puente 2016
Diciembre, 2019
Santiago, Chile
PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATOLICA DE CHILE FACULTAD DE AGRONOMIA E INGENIERIA FORESTAL DIRECCION DE INVESTIGACION Y POSTGRADO MAGISTER EN SISTEMAS DE PRODUCCIÓN ANIMAL
2
AGRADECIMIENTOS
Este estudio fue realizado en parte gracias a FONDECYT 1170400 (Fondo Nacional de
Desarrollo Científico y Tecnológico, Chile) y la Vicerrectoría de Investigación of Pontificia
Universidad Católica de Chile (Proyecto Puente P1608).
Quisiera agradecer a la Fundación AgroUC y al laboratorio de alimentos del INTA de la
Universidad de Chile por permitirnos utilizar sus dependencias para llevar a cabo el
estudio realizado. Así como también a Hans A. Yoldi Harding (Comercial e Industrial
Soho S.A.), quien nos donó el aceite de oliva utilizado en el presente estudio.
A los docentes e investigadores Einar Vargas Bello, María Sol Morales y Jaime Romero,
por compartir sus conocimientos y ser guías en este proceso, que en más de una ocasión
se volvió más complejo de lo esperado.
También agradecer a todos aquellos que nos ayudaron durante las semanas que duró
el estudio en Pirque, a Nicolás Vera, Jonathan Becerra, Don Carlos, Don Luis, Don Juan
y Roberto por la paciencia y ayudarnos a buscar a las vacas cuando se nos olvidaba
cerrar alguna puerta y terminaban en los otros corrales. A quienes nos acompañaron en
los muestreos, ayudando a que fueran días menos cansadores y con más risas Lucas
Arze, Ricardo Gebauer, José María Godoy, Daniela Piña, y Stefanie Vyhmeister. Sobre
todo, a Nathaly Cancino y Pietro Sciarresi por ayudarme cada vez que corría en círculos
por no entender lo que hacíamos y en qué no estábamos metiendo. Gracias por dedica
su tiempo para enseñarme y tener momentos de discusión que llevaron a que este
trabajo finalmente pudiera ver la luz, gracias por ir juntos aprendiendo sobre la marcha.
Y, por último, y más importante de todos, a mi familia que desde un principio me permitió
continuar estudiando y apoyarme en este largo proceso.
¡Gracias!
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INDICE
ABREVIACIONES ____________________________________________________ 5
ABSTRACT _________________________________________________________ 6
INTRODUCCIÓN _____________________________________________________ 7
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ____________________________________________ 9
Definición de leche __________________________________________________ 9
Composición de la leche bovina ________________________________________ 9
Estructura de la glándula mamaria ______________________________________ 9
Síntesis y secreción de ácidos grasos lácteos en rumiantes __________________ 10
Producción y consumo de aceite de oliva ________________________________ 16
Efecto del aceite de oliva en la producción animal y composición láctea ________ 16
Producción de aceite de palma ________________________________________ 17
Efecto del aceite de palma en producción animal __________________________ 18
Estudios relacionados con la expresión de genes en la glándula mamaria _______ 18
Métodos para aislar las células somáticas de la glándula mamaria ____________ 20
HIPOTESIS ________________________________________________________ 22
OBJETIVO GENERAL ________________________________________________ 22
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ___________________________________________ 22
MATERIALES Y MÉTODOS ___________________________________________ 23
1. Animales y tratamientos ________________________________________ 23
2. Obtención de muestras _________________________________________ 24
2.1. Muestras de alimento __________________________________________ 24
2.1.1. Análisis químico __________________________________________ 24
2.1.2. Determinación del perfil de ácidos grasos de dietas y aceites ________ 25
2.2. Muestras de leche ____________________________________________ 26
2.2.1. Determinación del perfil de ácidos grasos de la leche ______________ 26
2.2.2. Aislamiento de células somáticas _____________________________ 27
4
3. Genes analizados ______________________________________________ 27
3.1. Preparación de ADN complementario (ADNc) _______________________ 29
3.2. Condiciones quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) ___________ 29
3.3 Evaluación de los amplicones ______________________________________ 30
3.3.1. Evaluación del tamaño de los amplicones _______________________ 30
3.3.2 Evaluación de secuencia de amplicones ________________________ 31
3.4 Evaluación expresión relativa mRNA ________________________________ 31
4. Análisis estadístico _____________________________________________ 33
RESULTADOS Y DISCUSIÓN__________________________________________ 34
1. Producción y composición láctea ___________________________________ 34
2. Perfil de ácidos grasos en la leche _________________________________ 36
3. Genes involucrados en el metabolismo de ácidos grasos ________________ 39
3.1 Efectos del grado de insaturación de la suplementación lipídica en la expresión
relativa de los genes analizados con relación al grupo Control ________________ 40
3.2 Evolución de la expresión relativa de los genes involucrados con el metabolismo
lipídico en glándula mamaria con relación al tiempo ________________________ 47
4. Limitantes y factores a considerar para la interpretación de los resultados ___ 50
CONCLUSIONES ___________________________________________________ 53
RESUMEN _________________________________________________________ 54
BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________________ 55
ANEXOS __________________________________________________________ 66
5
ABREVIACIONES
ACACA: Acetyl-coenzyme A carboxylase Alpha
ACSL1: Acyl-CoA synthetase long-chain family member 1
ACSS2: Acyl-CoA synthetase short-chain family member 2
PLIN2: Adipose differentiation related protein (adipophilin)
AGPAT6: 1-acylglycerol-3 phosphate O- acyltransferase 6
BTN1A1: Butyrophilin, subfamily 1, member A 1
CD36: thrombospondin receptor
DGAT1: Diacylglycerol acyltransferase 2
DGAT2: Diacylglycerol acyltransferase 2
FABP3: Fatty acid-binding protein 3
FABP4: Fatty acid-binding protein 4
FADS1: Fatty acid desaturase 1 (delta-5 desaturase)
FASN: Fatty acid synthase
GPAM: Glycerol-3-phosphate acyltransferase, mitochondrial
LPIN1: Lipin 1
LPL: Lipoprotein lipase
SCAP: SREBP cleavage activating protein
SCD: Stearoyl-CoA desaturase (delta-9-desaturase)
SLC27A: Soluble carrier protein 27 A very low-density lipoprotein receptor
SREBF1: Sterol regulatory element-binding transcription factor 1
XDH: Xanthine dehydrogenase
6
Efecto de diferentes fuentes de lípidos en dietas de vacas lecheras sobre la expresión
de genes relacionados con la síntesis y secreción de grasa láctea de células
somáticas.
ABSTRACT
Various genes participate regulating the content of milk fat, from the uptake of fatty acids
(AG) from the bloodstream to the secretion of the lipid droplet to the lumen of alveolus.
The objective was to determine the expression of genes related to the metabolism and
secretion of milk fat in the mammary gland in cows supplemented with AG of varying
degrees of saturation. For 63 days 15 multiparous cows (189 ± 28 days in lactation), were
divided into 3 groups according to body condition: Control without supplementation, olive
oil (OO) and hydrogenated palm oil (HVO; both 30 g of oil / kg of MS). Every 21 days, the
AG profile of the milk was analyzed by gas chromatography, and the relative expression
of 17 candidate genes was studied using qPCR. There were no differences in food intake,
weight or body condition. OO milk production was 9.7% higher and showed a decrease
in medium chain AGs and an increase of 18 carbon AGs. Supplementing with OO
produced an increase in the expression of PLIN2 and THRSP, while HVO generated a
downward regulation of the latter during day 63 as well as a decrease in FABP3 and
FABP4. In conclusion, supplementing with AG affects the activation of AG, intracellular
transport, fat globule formation and a transcription factor (SREBF1). The latter is
suppressed by the action of AGPI and is regulated upwards by the action of AGS,
therefore, HVO would have a greater lipogenic effect than OO.
Key words: gene expression, milk fatty acids, ruminants, somatic cells.
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INTRODUCCIÓN
La leche es un alimento de un alto valor nutricional, compuesto principalmente por agua,
proteína, grasa, azúcares, minerales, entre otros. Dentro de estos, la grasa no sólo tiene
importancia a nivel nutricional, sino que también otorga propiedades organolépticas,
físicas y contribuye con características para el procesamiento de la leche y productos
lácteos (Chilliard y Ferlay, 2004). A pesar de esto, la grasa láctea ha sido un punto a
considerar por los profesionales de la salud debido a que se relacionó durante mucho
tiempo con el aumento en el riesgo de aterosclerosis, enfermedades cardiovasculares e
hipertensión arterial (Ulbricht y Southgate, 1991), es por esto que se han realizado
variados estudios enfocados en mejorar el perfil de ácidos grasos, de manera de
aumentar sus beneficios nutricionales.
La composición de la grasa láctea puede variar según la genética animal, etapa de
lactancia y la alimentación (Kliem y Shingfield, 2016). Siendo esta última importante
debido a que la grasa tiene sus orígenes a partir de la alimentación, de la actividad del
microbiota presente en el rumen y de reservas corporales (McGuire y Bauman, 2002),
en el caso de ácidos grasos de cadena larga, y aquellos ácidos grasos de cadena corta
y media se sintetizan en la glándula mamaria en un proceso conocido como síntesis de
novo, en cuanto al ácido palmítico este tiene su origen en ambas vías metabólicas
(Leroux et al., 2016).
Diversos genes participan a lo largo de estas vías permitiendo la regulación de sus
procesos, entre los que se encuentran aquellos asociados con la captación de aquellos
ácidos grasos provenientes del torrente sanguíneo (LPL), transporte intracelular
(ACSSL1, FABP3), síntesis y desaturación de ácidos grasos (ACACA, FSN, SCD),
formación de la gota lipídica (PLIN2, BTN1A1) y secreción de ésta (XDH; Leroux et al.,
2016; Bionaz y Loor, 2008a)
Durante la última década se han realizado estudios de genómica funcional basados en
qRT-PCR describiendo los efectos de las dietas suplementadas con ácidos grasos
insaturados, principalmente oleico y linoleico, sobre diversos genes que se relacionan
con el metabolismo de lípidos en la glándula mamaria (Harvatine y Bauman, 2006;
Bionaz y Loor, 2008a, Kadegowda et al., 2009). Para poder realizar este tipo de estudios,
existen diversos métodos para aislar las células somáticas, tales como biopsia, a partir
de la cual se puede realizar microdisección con láser, o la obtención de células
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directamente de la leche mediante la ordeña, de la cual se puede aislar glóbulos de
grasa, aislamiento de células mediante anticuerpos, y, en el caso de este estudio,
aislamiento de células epiteliales. Este último tiene la ventaja de ser un método poco
invasivo, que puede ser repetido a lo largo del tiempo y que es tan representativo como
la biopsia del tejido mamario (Boutinaud, 2008). El conocimiento de los fenómenos que
ocurren en la glándula mamaria podría contribuir al desarrollo de nuevas tecnologías en
el manejo y crianza de los bovinos de leche.
Si bien son diversos los estudios que evalúan la expresión génica en células epiteliales
de la glándula mamaria, son escasos aquellos que utilizan como fuente de
suplementación aceite de oliva, y estos se han enfocado principalmente en la
suplementación en dietas de cabras y en los cambios que se producen a nivel de la leche
o quesos elaborados (Chiofalo et al., 2004; Gómez-Cortes et al., 2008). Debido a lo
anterior es que este trabajo se tiene por objetivo determinar la expresión de los genes
relacionados con el metabolismo y secreción de la grasa láctea en la glándula mamaria
de vacas alimentadas con fuentes de ácidos grasos de distintos grados de saturación,
por lo cual se evaluó el efecto de adicionar en la dieta un 3% de aceite de oliva y aceite
hidrogenada de palma en la dieta.
9
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Definición de leche
La leche es la secreción mamaria normal de animales lecheros obtenida mediante uno
o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción, destinada al consumo en forma
de leche líquida o a elaboración ulterior (CODEX STAN 206-1999).
Desde un punto de vista fisiológico, la leche es una emulsión de grasa y agua donde se
encuentran disueltos carbohidratos, proteínas, minerales y vitaminas, los cuales son
producidos o transportados a través de la glándula mamaria (Strucken et al., 2015).
Composición de la leche bovina
La leche bovina está compuesta aproximadamente por 87% agua, 4,6% lactosa, 3,4%
proteínas, 4,2% grasa, 0,8% minerales y 0,1% vitaminas. Estos valores pueden ir
modificándose según diversos factores tales como la raza, alimentación, manejos
productivos, etapa de lactancia, estación del año (Mansson, 2008) y ciclo estral
(McDonald et al., 1979; Toledo-Alvarado et al., 2018).
Estructura de la glándula mamaria
La glándula mamaria es un órgano exocrino, una glándula sudorípara o cutánea
modificada, característico de la clase Mammalia, utilizado para alimentar a sus crías con
el producto de su secreción. Es un órgano complejo formado por múltiples tipos de
células incluyendo células mioepiteliales, estroma y células del sistema inmune
(Cánovas et al., 2014).
El tejido secretor de la ubre son las estructuras denominadas alveolos, los cuales se
encuentran rodeados por células mioepiteliales que intervienen durante el proceso de la
eyección de la leche. A su vez, los alveolos son irrigados por arteriolas que son
ramificaciones de la arteria mamaria, la cual deriva de una rama de la arteria pudenda
externa. En cuanto al sistema nervioso, la glándula mamaria es inervada por nervios que
derivan de los nervios inguinales y del plexo mesentérico posterior del sistema simpático.
Las glándulas mamarias carecen de fibras parasimpáticas (Urroz, 1991).
Durante la lactancia la producción de leche es regulada principalmente por la lactosa
que se encuentra en el alveolo, debido a que influye en la presión osmótica entre la
10
sangre y el alveolo, y así la cantidad de agua extraída hacia el interior del alveolo (Zhao
y Keating, 2007). Ciertas sustancias como los minerales y vitaminas pasan a través de
la membrana celular directamente desde la sangre mediante proteínas de transporte, al
interior del alveolo el aparato de Golgi tiene un rol importante en el transporte intracelular
y secreción del calcio, ya que forma vesículas que lo transportan asociado a caseínas
(Neville y Watters, 1983; Figura 1).
Figura 1: Proceso síntesis de leche a nivel alveolar (Fuente: adaptado parcialmente de
Wattiaux, 1996).
Síntesis y secreción de ácidos grasos lácteos en rumiantes
La grasa láctea está compuesta por un 98% de triacilglicerol, 0,2% de AG no
esterificados (AGNEs) y esteres de retinol, y un 0,02% de monoacilglicerol y
diacilglicerol. La leche contiene más de 400 tipos de AG de los cuales, los más
abundantes son aquellos cuya conformación es de 4 a 18 carbonos (Lock y Bauman,
2004; Shingfield et al., 2012). Estos AG pueden ser incorporados en la leche de dos
formas, a través de la captación de AGNEs y de trialcilglicerol provenientes de la sangre
arterial y de la síntesis de novo en la glándula mamaria, que representan entre un 45 y
60% del total de ácidos grasos de la leche (Shingfield et al., 2012; McGuire y Bauman,
2002).
11
Como resultado de la síntesis de novo se obtiene el total de los AG de 4 a 12 carbonos,
el 95% de ácido mirístico (C14:0) y aproximadamente el 50% del ácido palmítico (C16:0),
mientras que los AG que contienen más de 18 carbonos en sus cadenas son originados
a partir de la absorción de AG desde intestino delgado y de las reservas de tejido adiposo
(Shingfield et al., 2012).
El proceso conocido como síntesis de novo, ocurre a partir de los AG acético y butírico,
así como también de cuerpos cetónicos, principalmente acetoacetato y β-hidroxibutirato
(Chilliard et al., 2001; Palmquist, 2006), los cuales se obtienen principalmente de la
digestión ruminal de la fibra dietaria (Lock y Bauman, 2004). Se estima que el 60% del
β-hidroxibutirato se utiliza en dicho proceso (Bionaz y Loor, 2008a). Estos componentes
mediante quilomicrones y lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL por su sigla en
inglés) son transportados hacia la glándula mamaria vía sanguínea, donde son captados
por las enzimas lipoproteína lipasa (LPL; Palmquist y Jenkins, 1980), y el receptor de
lipoproteínas de muy baja densidad (VLDLR), esta última, actúa sobre aquellos
quilomicrones y VLDL que contienen en su estructura la molécula Apo-B48 (Bionaz y
Loor, 2008a). Un porcentaje menor de AG ingresa a la célula mediante difusión pasiva,
ya que los principales 2 de ingreso son mediante traslocasas de ácidos grasos y
mediados por proteínas como es el caso del receptor FAT/CD36 el cual es una
glicoproteína que transporta ácidos grasos de cadena larga hacia el interior de diferentes
tejidos, principalmente tejido adiposo (Bionaz y Loor, 2008a).
Una vez al interior de la célula, para que los AG puedan utilizarse en la síntesis de
triacilglicerol y en la síntesis de novo previamente deben ser activados, lo cual ocurre vía
ACSL1 (Acil-CoA sintetasa cadena larga miembro de la familia 1), esto se refiere a que
los AG de cadena larga son esterificados con un CoA, mientras que la activación de AG
de cadena corta es mediante la acción de la Acil-CoA sintetasa cadena corta miembro
de la familia 2, ACSS2, el primero tiene una mayor afinidad con acetato, mientras que el
segundo tiene más afinidad con propionato (Bionaz y Loor, 2008a). Luego, gracias a la
acción de la enzima acetil-CoA carboxilasa alfa, ACACA, se producen ácidos grasos de
cadena corta y palmitato a partir de acetato, el cual es un punto crítico en la síntesis de
novo, por su parte la enzima FASN (sintasa de ácidos grasos) utiliza acetil-CoA y butiril-
CoA para producir estos AG (Bionaz y Loor, 2008a). Las células de la glándula mamaria
sólo tienen la capacidad de elongar las cadenas de AG a partir de la condensación de
12
acetil-CoA hasta los 16 carbonos, debido a la ausencia de enzimas que permitan una
mayor elongación de las cadenas (Chilliard et al., 2001).
Por su parte, aquellos AG de cadena larga, como se mencionó anteriormente, se
obtienen a partir de lípidos de origen alimentario, los cuales sufren dos procesos a nivel
del rumen, la lipólisis, que es la liberación de los ácidos grasos de los ésteres presentes
en los lípidos de los alimentos, y la biohidrogenación, lo que corresponde a la saturación
de los dobles enlaces de los ácidos grasos (Martínez et al., 2010). Este último proceso
ocurre por la acción reductora que tiene el rumen, gracias a la importante presencia de
protozoos y bacterias como Butyrivibrio fibrisolvens (Kim et al., 2000).
Hay que considerar que el rumen de una vaca lechera contiene 40 a 50 litros de fluido
ruminal, el cual a su vez contiene 1010 a 1011 bacterias y 105 a 106 protozoos por mililitro
de fluido (Lock y Bauman, 2004). Dicha presencia de microorganismos permite que un
gran porcentaje de los lípidos que ingresan al rumen sean metabolizados, sobre el 85%
de los triglicéridos, fosfolípidos y glicolípidos que están presentes en la dieta pasan por
el proceso de lipólisis (también descrito como hidrólisis) y se describe que un 70-95%
del ácido linoleico y 85-100% del ácido linolénico son hidrogenados (Beam et al., 2000).
Los rumiantes son capaces de obtener ácido linoleico conjugado y ácido vaccénico a
partir de la dieta, a pesar de que los granos y el forraje que son utilizados en la
alimentación de estos animales no los contienen, debido a la acción de las bacterias
ruminales, ambos ácidos grasos corresponden a intermediarios de la hidrogenación del
ácido linoléico y linolénico, cuyo producto final es el ácido esteárico (Figura 2; Chin et
al., 1994; Lock y Bauman, 2004). Tal como se aprecia en la figura 2, hay dos grupos de
bacterias que participan en la biohidrogenación, por un lado, están las bacterias
pertenecientes al “Grupo A” que hidrogenan los AGPI obteniendo AG 18:1 trans, cómo
es el ácido vaccénico, y luego se encuentran las bacterias del “Grupo B”, las cuales
metabolizan estos AG 18:1 trans obteniendo ácido esteárico (Palmquist et al., 2004). El
ácido linoleico también puede ser sintetizado a partir del ácido vaccénico por acción de
la enzima delta 9 desaturasa (SCD; Griinari et al., 2000).
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Figura 2: Proceso de biohidrogenación del ácido linoleico (Traducido de Bauman y
Griinari 2003).
Dichos AG de cadena larga, una vez que ingresan a la glándula mamaria, tienen un
movimiento intracelular muy lento, por lo que se requieren de transportadores
específicos como FABP (proteínas de unión de ácidos grasos), moléculas que tienen
diversas funciones asociadas al metabolismo lipídico, ya que participa en el proceso de
captación y exportación de AG, regula las concentraciones de sustratos y productos en
el citosol, permite el movimiento de vesículas que contienen AG a través del citosol en
la célula (Storch y Thumser, 2000), tienen gran afinidad con acil-CoA, en el caso de la
glándula mamaria (Bionaz y Loor, 2008a) y también regulan la expresión de genes
relacionados con el metabolismo lipídico, ya que actúa en la mantención pasiva de AG
en la célula e interactúa de forma directa con receptores de hormonas nucleares (Storch
y Thumser, 2000).
La familia FABPs está compuesta por 9 miembros, de los cuales las que más se
expresan son FABP3 y FABP4, las que, junto con participar como moléculas de
transporte, se postula que podrían amortiguar el efecto negativo de los AG activados,
previniendo así la inhibición de las enzimas ACACA y SCD (Bionaz y Loor, 2008a). Esta
última es de gran importancia debido a que solo un pequeño porcentaje de los AG
captados por la glándula mamaria han sido insaturados por acción de microorganismos
a nivel ruminal, por lo que genera AGMI al agregar un doble enlace en la posición 9 de
los AG de 14, 16 y 18 carbonos (Bionaz y Loor, 2008a), y una manera de estimar su
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acción es mediante el índice de desaturación, el cual se determina al calcular la relación
entre el AG insaturado cis-9 y la sumatoria entre AG insaturado cis-9 y el AG saturado
específico (Morales et al., 2000).
El proceso de secreción de la grasa láctea comienza en el retículo endoplásmico rugoso,
donde se sintetiza triacilglicerol mediante la acción de enzimas transferasas. Aún no es
claro cómo los recién sintetizados AG se van agregando a la gota lipídica, que hasta ese
momento tiene un diámetro menor a 0,5 µm de diámetro y que a medida que avanza por
el citoplasma se va recubriendo con proteínas y lípidos polares de la membrana reticular.
En algunos casos estas gotas lipídicas se van fusionando con otras mientras se van
transportando hacia el borde de la célula. Durante la expulsión de la gota lipídica en el
borde apical de la célula se van adquiriendo proteínas de membrana y fosfolípidos. Entre
las proteínas se encuentran mucinas, xantina deshidrogenasa (XDH), receptor
trombospondina (CD36), butirofilina (BTN1A1) y adipofilina (PLIN2; (Bauman et al.,
2006). BTN1A1 es una proteína integral presente en la membrana apical de la célula, la
cual se une a XDH promoviendo que la gota lipídica se envuelva con la membrana
plasmática (Figura 3; Bauman et al., 2006).
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Figura 3: Interrelación entre las vías que regulan la síntesis de grasa láctea en el tejido
de la glándula mamaria (Fuente: Bionaz y Loor, 2008a).
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Producción y consumo de aceite de oliva
Debido a que Chile tiene un clima mediterráneo gracias a la presencia de la cordillera de
los Andes y al océano Pacífico, es que la industria de la producción de olivos ha ido en
aumento en los últimos años, alcanzando un total de 25.000 hectáreas, concentrándose
las principales plantaciones entre la región de Atacama y el Maule. Durante el año 2017
la producción nacional fue de 20.000 toneladas de aceite de oliva, lo que representa un
0,7% de la producción mundial (Chile Oliva, 2017).
El año 2016 a nivel mundial se produjeron un total de 2,54 millones de toneladas de
aceite de oliva, un 19,6% menor a la temporada anterior, esto debido a las altas
temperaturas registradas en sectores secanos (ChileOliva, 2017). Los principales
productores son países de la Comunidad Europea tales como España (42% de la
producción mundial), Italia y Grecia, seguidos por Turquía, Marruecos, Siria y Túnez
(ChileOliva, 2015).
En cuanto al consumo de este tipo de aceite, a nivel mundial durante el período 2016-
2017 se consumieron en total 2,73 millones de toneladas, siendo Italia y España los
principales países consumidores, seguidos por EEUU, Turquía y Marruecos
(International Olive Oil Council, 2019). En el caso de nuestro país, los datos reportados
datan del año 2015, indicando que para ese momento se consumían 6.588 toneladas de
aceite, de los cuales sólo un 10% correspondía a aceites importados, esto debido a que
se reconoce las características nutritivas y la calidad del aceite nacional (ChileOliva,
2015).
Efecto del aceite de oliva en la producción animal y composición láctea
Si bien el aceite de oliva como tal en la alimentación del ganado no se ha masificado
tanto, si lo ha sido en el caso de la pomaza de oliva, la cual ha siendo ampliamente
utilizada debido a que reduce los costos de alimentación y así como también reducen
los desechos que se obtienen de la industria del aceite de oliva, lo que corresponde al
cuesco, piel y parte de la pulpa de la oliva, así como también aquel aceite residual que
no es utilizada para la producción de aceite destinada a consumo humano (Castellani et
al., 2017).
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Los principales ácidos grasos del aceite de oliva y de la pomaza de oliva, son los ácidos
oleico, palmítico y linoleico, mientras que el ácido esteárico y el linolénico se encuentran
en menores proporciones (Castellani et al., 2017).
Diversos estudios se han realizado evaluando la suplementación de ácido oleico en la
dieta de rumiantes, detectando que si bien no genera grandes cambios en la producción
láctea en vacas, si se produce una reducción en el porcentaje de grasa y cambios en el
perfil de AG de la leche reduciendo el porcentaje de AG de cadena corta (Selner y
Schultz, 1980; Castellani et al., 2017), lo cual también se ha evidenciado en el caso de
la leche ovina, en la cual al utilizar pomaza de oliva, junto con los cambios mencionados
se generó un incremento en la relación AGPI/AGS, disminución de los índices
aterogénico y trombogénico de la leche ovina y aumento el contenido de ácido oleico en
la leche (Chiofalo et al., 2004; Vargas-Bello et al., 2013).
A pesar de los beneficios que genera la suplementación con aceite de oliva, altas dosis
de AGMI en la dieta, tales como el ácido oleico, no se recomienda en rumiantes debido
a que inhibe los microorganismos del rumen lo cual puede afectar la producción y
composición de la leche (Jenkins, 1993).
Producción de aceite de palma
Entre los años 1995 y 2015 la producción mundial de aceite de palma ha aumentado de
15,2 a 62,6 millones de toneladas, siendo los principales países productores Indonesia
(53%) y Malasia (32%), también se ha visto un aumento en su producción en países de
Centro América, Tailandia y África Occidental (European Palm Oil Alliance, 2018). Lo
cual se debe en parte a la eficiencia de producción en comparación a otros tipos de
aceites, ya que por hectárea cultivada el aceite de palma produce 3,8 toneladas, muy
superior al girasol (0,7 ton/ha) o a la soya (0,5 ton/ha; European Palm Oil Alliance, 2018).
Las toneladas producidas de aceite de palma representan el 38,7% del total de grasas y
aceites que se generan a nivel mundial (World Oil, 2016 obtenido de European Palm Oil
Alliance, 2019).
Los principales países desde donde se importa este producto a nuestro país son
Colombia, Perú y Ecuador, alcanzando un total de 14,4 toneladas importadas durante el
año 2016 (FAOSTAT, 2019).
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Efecto del aceite de palma en producción animal
Durante la década de los años 90 el aceite de palma fue una alternativa de
suplementación muy utilizada debido a que incrementa la densidad energética de la dieta
de los rumiantes sin generar efectos negativos en la fermentación ruminal, tal como
ocurre con los AGPI (Jenkins, 1993).
Este tipo de aceite tiene la característica de presentar sobre un 50% de ácido palmítico,
1,9% ácido esteárico, 12,6% C18:1, 15,3% C18:2 y 1,2% C18:3 (Manso et al.,2009).
Según lo indicado por Kupczyński et al. (2012) suplementar a las vacas con aceite de
palma no genera cambios en la condición corporal, producción de leche ni en el
contenido de sólidos totales. En dicho estudio compararon el perfil de AG con vacas
suplementadas con aceite de pescado, y se evidenció que aquellas vacas que recibieron
el tratamiento de aceite de palma produjeron leche con un 71,2% de AGS, 25% AG
insaturados, un menor contenido de isómeros del ALC (menos del 1%), así como
también una disminución en aquellos AGPI ω-3 y ω-6.
Estudios relacionados con la expresión de genes en la glándula mamaria
Se han realizado variados estudios con relación a la expresión de genes en la glándula
mamaria de bovinos, siendo uno de los más citados el realizado por Bionaz y Loor
(2008a) el que ayuda a comprender la variación en la expresión relativa de genes a lo
largo de la lactancia, desde 15 días previos al parto hasta el día 240 postparto, sin la
influencia de la suplementación en la dieta. En ese estudio se puede apreciar que la
mayoría de los genes analizados se activan principalmente durante los primeros 60 días
de lactancia y que las relaciones que estos genes tienen entre ellos forman una compleja
red que permite coordinar las distintas funciones relacionadas con la síntesis y secreción
de ácidos grasos hacia la leche.
Similares estudios se han realizado en otras especies de la familia Bovidae, el año 2017
en China (Lee et al., 2017), se realizó la caracterización de la expresión de genes en
yaks (Bos grunniens), a diferencia de las vacas, los yaks producen un 10% menos de
leche con un contenido de grasa mayor, 5-7g /100 g. El comportamiento de los genes es
similar al de las vacas lecheras a lo largo de la lactancia, pero aquellos genes
coordinados por SREBF1, es decir aquellos encargados de síntesis de novo (ACSS2,
ACACA y FABP3) y síntesis de triglicéridos (GPAM, AGPAT6 y LPIN1) se activan en
19
mayores niveles que en vacas y aquellos coordinados por PPARG, se expresan en
menor medida, siendo estos involucrados en la formación de la gota lipídica (PLIN2, XDH
y BTN1A1).
Ambos estudios, de Bionaz y Loor (2008a) y Lee et al. (2017), permiten comprender
cómo es el metabolismo lipídico normal de la glándula mamaria a lo largo de la lactancia
de los bovinos, y son una herramienta útil para poder utilizarlos como base al momento
de realizar estudios donde se quiera evaluar el efecto de la suplementación de la dieta
en el metabolismo enzimático relacionado con la producción y secreción de grasa láctea.
Fougère y Bernard (2018) suplementaron la dieta de cabras y vacas con almidón de trigo
+ aceite de maíz, aceite hidrogenada de palma, y algas marinas, observando que, de los
21 genes estudiados, 14 presentaron diferencias en cuanto a la especie, siendo 5 más
abundantes en vacas (FADS3, ACSL1, PPARA. LXRA y PPARG), y 9 fueron más
abundantes en cabras (FASN, CD36, FABP3, LPL, GPAM, LPIN1, CSN2, MFGE8, e
INSIG1). En cuanto a la dieta, el aceite de maíz y las algas marinas generaron una
reducción en la producción y contenido de grasa láctea mientras que el aceite
hidrogenado de palma generó un aumento en el contenido de grasa láctea. En términos
de metabolismo de los ácidos grasos, se apreció que el primer tratamiento redujo la
abundancia de los factores de transcripción PPARG, INSIG1 y SP1, y la suplementación
con algas marinas también redujo la abundancia de INSIG1. Al realizar la interacción
dieta x especie, se observó que sólo LPL presentó una disminución en la abundancia en
cabras alimentadas con algas marinas, y que aumentó cuando eran alimentadas con
aceite hidrogenada de palma, en el caso de las vacas no presentó diferencias
estadísticas.
Previamente se han realizado otros utilizando variadas fuentes de alimentos que
generan cambios en la grasa láctea y del metabolismo lipídico a nivel de glándula
mamaria, entre los que se encuentran los realizados con vegetales y aceites altos en
AGPI, entre los que predominan el aceite de linaza, que presenta un alto contenido de
ácido alfa-linolénico (Angulo et al., 2012; Bernard et al., 2005b, Elis et al., 2016), aceite
o harinilla de cártamo o safflower en inglés, cuyo ácido graso predominante es el ácido
linoléico (Murrieta et al., 2006), aceite de pescado, caracterizado por contener AG de
cadena larga sobre 20 carbonos (Carreño et al., 2016., Bernard et al., 2017; Toral et al.,
20
2016), y dietas que inducen depresión de grasa láctea (Harvatine y Bauman, 2006;
Peterson et al., 2016; Piperova et al., 2000; Ticiani et al., 2016).
Métodos para aislar las células somáticas de la glándula mamaria
Se consideran células somáticas de la leche principalmente a leucocitos (glóbulos
blancos) y algunas provenientes del tejido secretorio mamario (células epiteliales), estas
últimas son eliminadas y renovadas de forma normal por la glándula mamaria (Cánovas
et al., 2014; Boutinaud et al., 2015). A partir de estas células se puede obtener
información para el estudio de la expresión de genes que regulan el metabolismo
relacionado con la secreción de leche y sus diversos componentes, es por esto que se
han desarrollado variados métodos para poder aislar las células somáticas de la glándula
mamaria (Boutinaud, 2008).
El método clásicamente utilizado para estudiar el tejido mamario es la biopsia, el cual
requiere de un procedimiento quirúrgico para poder llevarlo a cabo, es decir, se realiza
una incisión, la cual se debe ir rotando en cada muestreo, controlar la hemorragia y evitar
posibles infecciones, por lo que no es un procedimiento sencillo y puede generar daños
en el tejido (Boutinaud et al., 2015). A partir de tejido mamario congelado obtenido
mediante biopsia se puede realizar microdisección con láser, cuya calidad de ARN puede
verse afectado dependiendo del tiempo entre que se realiza la biopsia y la muestra es
congelada, así como también dependiendo del tiempo que se tarda en cortar en
secciones en el micrótomo (Cánovas et al, 2014), además de ser un procedimiento más
simple y económico (Toral et al., 2016).
Otros métodos se realizan al obtener leche mediante la ordeña, de la cual se pueden
aislar células epiteliales, glóbulos de grasa y aislar células mediante anticuerpos.
Realizar el aislamiento a partir de las células de la leche tiene la ventaja de ser menos
invasivo, permitiendo que se puedan tomar muestras de forma repetitiva en el tiempo,
con un menor riesgo que generar infección (Boutinaud, 2008).
De acuerdo al estudio realizado por Smith y Shultze (1967) la secreción de células en
la leche tiene un comportamiento cíclico durante el día (Figura 4), por lo que el mejor
momento para poder realizar la toma de muestras en la leche es 4 horas posterior a la
ordeña de la mañana debido a que se encuentra una mayor concentración de células,
mientras que inmediatamente previo a la ordeña de la mañana el recuento celular
21
disminuye drásticamente y posterior a la ordeña el recuento celular entre los cuartos
varía ampliamente.
La integridad del ARN (RIN) varía considerablemente dependiendo del tipo de método
utilizado. Al usar electroforesis tanto la microdisección como el aislamiento de células de
la leche presentaron perfiles similares, mientras que los glóbulos de grasa tenían un
peso molecular menor debido a la presencia de material citoplasmático, así como
también presentó un mayor contenido de genoma bacteriano ya que la membrana del
glóbulo tiene gran afinidad con las bacterias al contener fosfolípidos, proteínas y
glicofosfolípidos (Cánovas, 2014).
Figura 4: Recuento de células somáticas en leche a lo largo del día (Fuente: traducido
de Smith y Schultze, 1967).
22
HIPOTESIS
Suplementar con distintas fuentes de lípidos, con distintos grados de saturación de
ácidos grasos afecta la expresión de genes relacionados con la síntesis y secreción de
los ácidos grasos en la glándula mamaria de vacas lecheras, así como también en el
perfil de AG de la leche.
OBJETIVO GENERAL
Determinar los cambios en la expresión de genes relacionados con la síntesis de lípidos
presentes en la glándula mamaria al suplementar vacas en lactancia media con dos
fuentes de lípidos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Comparar la expresión de genes relacionados con el metabolismo y secreción de
ácidos grasos en la glándula mamaria de vacas lecheras al suplementar la dieta con
aceite de oliva y aceite hidrogenada de palma.
2) Determinar el efecto de la suplementación de lípidos sobre los genes
relacionados con el metabolismo y secreción de ácidos grasos a lo largo del tiempo.
3) Relacionar el efecto de la suplementación con ácidos grasos en la dieta en el
perfil de AG de la leche con la expresión de genes relacionados con el metabolismo y
secreción de ácidos grasos en la glándula mamaria en vacas lecheras durante la
lactancia media.
23
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Animales y tratamientos
Se trabajó con 15 vacas multíparas (hasta 3 partos), preñadas, con 189 ± 28 días en
lactancia, una producción promedio de 33,4 ± 8,3 kg de leche al día, las cuales fueron
divididas en 3 grupos según su condición corporal (CC), en una escala de 1 a 5, donde
1: emaciada y 5: obesa (Wildman et al., 1982), y en relación con su producción láctea.
La CC de los grupos al inicio del estudio fueron en promedio 2,8 ± 0,3; 3,0 ± 0,0 y 2,8 ±
0,3.
Este estudio se realizó durante 9 semanas en la estación experimental de Pirque de la
Pontificia Universidad Católica de Chile (33°38′28″S, 70°34′27″O), entre los meses de
septiembre y diciembre del año 2016. Los animales fueron estabulados en corrales
individuales de 2,4 x 6 mt con acceso continuo a agua.
En cuanto la alimentación, durante los primeros 7 días se alimentaron sólo con dieta
basal, mientras estaban en el proceso de adecuación al sistema de estabulación y luego
por 63 días se alimentaron con los respectivos tratamientos. La dieta basal contenía un
65% de forraje (ensilaje de maíz y de alfalfa) y un 35% de concentrado satisfaciendo las
necesidades de las vacas de 650 kg en lactancia media consumiendo 26,5 kg de materia
seca diaria (Tabla 1; NRC, 2001). Los tratamientos fueron grupo Control (N=5) al cual
no se le adicionaron lípidos; grupo OO suplementado con aceite de oliva (N=5; 30 g/kg
de materia seca) y un tercer grupo, HVO, el cual se suplementó con aceite hidrogenada
de palma (N=5; 30 g/kg de materia seca).
El alimento se entregaba una vez al día, posterior a la ordeña de la mañana, mediante
el uso de carro forrajero. Los tratamientos eran administrados de forma separada y
mezclados manualmente en la ración diaria que recibían las vacas (Anexos 1 y 2).
Las vacas eran ordeñadas 3 veces al día (7:00, 15:00 y 21:00 horas) en una sala de
ordeño tipo Tandem 2 x 6, con sistema de extracción automático de pezoneras, y
equipada con un sistema de gestión de rebaños DelProTM (DeLaval, Suecia).
Los procedimientos realizados fueron aprobados por el Comité de Ética de la Pontificia
Universidad Católica de Chile.
24
Tabla 1 Ingredientes de dietas Control, aceite de oliva (OO) y aceite hidrogenada de palma (HVO)
Dieta
Control OO HVO
Composición (% Materia seca)
Soiling de alfalfa 28,9 28,9 28,9
Ensilaje de maíz 27,0 27,0 27,0
Destilado de malta 23,1 23,1 23,1
Maíz grano 8,3 8,3 8,3
Salvado de trigo 6,2 6,2 6,2
Heno de alfalfa 2,6 2,6 2,6
Grano de soya 2,0 2,0 2,0
Harina de canola 1,5 1,5 1,5
premix vitaminas y mineralesa 0,4 0,4 0,4
Aceite de oliva 0 3,0 0
Aceite hidrogenado de palma 0 0 3,0 aContenido por kg: 25,000 mg de P; 80,000 mg de Ca; 25,000 mg de Mg; 1,612 mg de S; 300,000 UI de vitamina A; 50,000 UI de vitamina D3 y 1,600 UI de vitamina E, nd: no detectado.
2. Obtención de muestras
Los muestreos se realizaron cada 21 días (21, 42 y 63 d). En los cuales se realizó la
medición de condición corporal y estimación de peso mediante perímetro torácico,
obtención de muestras de alimento y leche (anexo 3), de la cual se analizó el perfil de
ácidos grasos y se aislaron células somáticas de la leche. La producción diaria de leche
era registrada diariamente de manera electrónica, mientras que el recuento de células
somáticas (RCS) se obtuvo del control lechero oficial, realizado por la empresa
Cooprinsem.
2.1. Muestras de alimento
2.1.1. Análisis químico
Se obtuvieron muestras de alimento directo del comedero de las vacas y almacenado a
-20°C hasta su posterior análisis, realizado en el laboratorio de Nutrición en la Facultad
de Agronomía de la Pontificia Universidad Católica de Chile, donde se midieron los
distintos componentes mediante procedimientos estándar (AOAC, 2001).
La materia seca se obtuvo utilizando 5 g de muestra en una estufa a 105°C por 30
minutos, para la obtención de cenizas se utilizan 2 g de muestra y se colocan en la mufla
25
a 600°C por 2 horas (AOAC, método oficial 942.05). La proteína cruda se midió mediante
el método de Kjeldahl, en el cual se requiere 1 g de muestra a la cual se le realiza
digestión en bloque con adición de ácido sulfúrico (H2SO4), un catalizador de cobre y
destilación con ácido bórico (método oficial 984.13). La fibra cruda se obtuvo mediante
digestión utilizando una solución con 1,25% de ácido sulfúrico y 1,25% de hidróxido de
sodio (método oficial 950.02). El procedimiento de obtención de extracto etéreo requiere
de 3 g de muestra de alimento, la cual se coloca inicialmente en la estufa a 105°C por
30 minutos, y luego se coloca en el extractor de solvente Velp Scientifica Ser148, el cual
utiliza 60 ml de éter de petróleo (AOAC, 1990; método oficial 920.39). En cuanto a la
fibra detergente neutro y fibra ácido detergente, se utiliza el equipo Ankom. Por último,
la lignina se obtiene utilizando ácido sulfúrico al 72%, luego de haber medido la fibra
ácido detergente.
2.1.2. Determinación del perfil de ácidos grasos de dietas y aceites
En el caso de las dietas y los aceites utilizados para cada tratamiento, se utilizó 1 g de
materia seca, se realizó la extracción de ácidos grasos mediante el protocolo de Blight y
Dyer (1959), en el cual se utilizó una mezcla de cloroformo y metanol en una proporción
2:1 y posteriormente fueron metilados siguiendo el protocolo de Christie (1982).
Los ácidos grasos metilados fueron analizados utilizando un cromatógrafo de gases
líquidos Shimadzu modelo GC-2010, el cual está equipado con una columna Rtx 100 m
x 0,32 mm x 0,2 µm. Las condiciones del equipo, para realizar el análisis fueron: una
temperatura inicial de 110°C por 4 min, que luego incrementó a 160°C, con un aumento
de 5°C/min, esta temperatura se mantuvo por 10 min, a continuación, aumentó a 225°C
a 3°C/min manteniéndose por 10 min y finalmente se incrementó a 240°C a 3°C/min. Las
temperaturas del detector de entrada y de ionización fueron de 260°C, la relación de
división fue de 15:1 y para la inyección se usó 2µl. El flujo de gas transportador
hidrógeno, para el detector, fue de 40 mL/min. El flujo de aire fue de 400 mL/min, y el
flujo de gas auxiliar nitrógeno fue de 40 mL/min. Los peaks de los ácidos grasos en el
cromatograma se identificaron mediante el uso de un estándar de ésteres metílicos de
ácidos grasos (FAME; Supelco 37 Component FAME mix, Bellefonte, PA, USA) y los
estándares de referencia para C18:1t11 (ácido vaccénico) y C18:1c9t11 (ácido linoleico
conjugado; CLA) (Nu-Chek-Prep Inc., Elysian, MN, USA).
26
2.2. Muestras de leche
Las muestras de leche se obtuvieron 3-4 horas después de la ordeña de la mañana, de
manera manual, con el objetivo de maximizar el recuento de células somáticas de la
leche (Smith y Schultze, 1967; Boutinaud y Jammes, 2002). Al momento de la toma de
muestra se inspeccionaba visual y físicamente cada cuarto, con el objetivo de detectar
aumento de tamaño, cambio de coloración o temperatura. Por su parte, la leche era
evaluada mediante el uso de fondo oscuro para comprobar ausencia de mastitis clínica,
y además se realizó california mastitis test (CMT) para descartar aquellos cuartos que
presentaban mastitis subclínica.
Se limpiaron los pezones con agua y jabón de clorhexidina, luego se aplicó pre dipping
(solución de povidona yodada) y finalmente RNaseZap (Ambion, Austin, TX, USA), en la
punta de los pezones con gasas estériles. Cabe señalar que después de la aplicación
de cada solución los pezones fueron secados con toallas de papel. Posterior a la
preparación, se recolectaron 400 ml de muestra de leche (100 ml de cada cuarto sano)
en frascos de cultivo celular y luego se almacenó a 4°C hasta su posterior
procesamiento, inmediatamente después de la obtención de la muestra.
2.2.1. Determinación del perfil de ácidos grasos de la leche
Para la obtención del perfil de ácidos grasos de la leche, se utilizó la capa cremosa de
la leche que era removida al momento de aislar el pellet de células somáticas. Para este
proceso se utilizaron 50 µl de EDTA y se centrifugó a 4°C a 2000 RPM por 15 min, se
separó mediante el uso de asas estériles y libres de RNAasa, y se almacenó en tubos
eppendorf de 1,5 ml a -10°C hasta su posterior procesamiento, el cual se llevó a cabo
en el laboratorio de Ciencias Animales en la Facultad de Agronomía de la Pontificia
Universidad Católica de Chile.
Para la separación de los ácidos grasos, cada muestra se centrifugó por 30 min a 12000
rpm, sin adicionar solventes, siguiendo el método de Feng et al. (2004), se obtuvo el
sobrenadante, y posteriormente se realizó el proceso de transesterificación de acuerdo
al protocolo de Christie (1982).
27
2.2.2. Aislamiento de células somáticas
El procedimiento utilizado en la extracción de células somáticas fue obtenido de
Wickramasinghe et al. (2012) y de Suárez-Vega et al. (2015), considerando sus
modificaciones. Una vez que se removió la capa cremosa y el sobrenadante, se lavó el
pellet con 10 ml de PBS (pH 7,4) y 0,5 µl de EDTA, se centrifugó a 2000 rpm por 15
minutos y se descartó el sobrenadante. Este procedimiento se realizó las veces
necesarias hasta obtener un sobrenadante transparente y libre de materia grasa, el cual
generalmente era necesario realizarlo en 3 oportunidades. Luego el pellet de células se
resuspendió en 750 µl de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), para estabilizar la
molécula de ARN y se transfirió a tubos eppendorf de 1,5 ml y almacenándolo en un
termo conservador de nitrógeno líquido a -80°C. Las muestras posteriormente se
trasladaron al laboratorio de Biotecnología de Alimentos del INTA, donde se realizó la
extracción de ARNm.
3. Genes analizados
Para este estudio se seleccionaron 3 genes de control interno o de referencia, UXT,
EIF3K y GADPH, los cuales fueron utilizados para normalizar los resultados obtenidos
en las muestras a partir de los genes de interés; 13 genes candidatos y 4 genes
reguladores de la transcripción. Los genes de referencia fueron seleccionados a partir
de las publicaciones realizadas por Kadewogda et al. (2009) y Bonnet et al. (2013). Estos
genes se relacionan con la síntesis de ácidos grasos y están agrupados según las
siguientes funciones: síntesis y desaturación de ácidos grasos (AG); síntesis de
triglicéridos; ingreso de AG a la célula; formación de glóbulo de grasa y, activación y
transporte intracelular de acetato y AG.
Las secuencias forward y reverse de los partidores, indicados en la tabla 2, se obtuvieron
desde la base de datos GenBank, las cuales se ingresaron al programa BioEdit para
poder determinar si se encontraban dentro de la secuencia del gen seleccionado. Los
partidores fueron sintetizados, a partir de estas secuencias, por la compañía IDT
(Integrated DNA Technologies; Coralville, IA, USA).
28
Tabla 2: Genes involucrados con la síntesis y secreción de AG en la leche bovina
Gen Acceso GenBank Secuencia Bp Ref.
Ingreso de ácidos grasos a la célula
LPL BC119091 F. 327 ACACAGCTGAGGACACTTGCC
101 Bionaz y
Loor, 2008a R. 427 GCCATGGATCACCACAAAGG
VLDLR AJ609502 F. 98 GCCCAGAACAGTGCCATATGA
103 Bionaz y
Loor, 2008a R. 200 TTTTCACCATCACACCGCC
Síntesis y desaturación de ácidos grasos
ACACA AJ132890 F. 3709 CATCTTGTCCGAAACGTCGAT
101 Bionaz y
Loor, 2008a R. 3809 CCCTTCGAACATACACCTCCA
FASN NM_001012669 F.6473 ACCTCGTGAAGGCTGTGACTCA
92 Bionaz y
Loor, 2008a R.6564 TGAGTCGAGGCCAAGGTCTGAA
SCD AY241933 F. 809 TCCTGTTGTTGTGCTTCATCC
101 Bionaz y
Loor, 2008a R. 909 GGCATAACGGAATAAGGTGGC
Activación y transporte intracelular de acetato y ácidos grasos
ACSL1 BC119914 F. 1929 GTGGGCTCCTTTGAAGAACTGT
120 Bionaz y
Loor, 2008b R. 2048 ATAGATGCCTTTGACCTGTTCAAAT
ACSS2 BC134532 F. 1871 GGCGAATGCCTCTACTGCTT
100 Bionaz y
Loor, 2008a R. 1970 GGCCAATCTTTTCTCTAATCTGCTT
FABP3 NM_174313 F. 458 GAACTCGACTCCCAGCTTGAA
102 Bionaz y
Loor, 2008b R. 559 AAGCCTACCACAATCATCGAA
FABP4 NM_174314 F: 401 TGGTGCTGGAATGTGTCATGA
101 Bionaz y
Loor, 2008b R: 501 TGGAGTTCGATGCAAACGTC
Síntesis de triglicéridos
DGAT1 NM_174693 F. 190 CCACTGGGACCTGAGGTGTC
101 Bionaz y
Loor, 2008a R. 290 GCATCACCACACACCAATTCA
DGAT2 BT030532.1 F: 389 CATGTACACATTCTGCACCGATT
100 Bionaz y
Loor, 2008a R: 488 TGACCTCCTGCCACCTTTCT
LPIN1 NM_001206156 F. 147 TGGCCACCAGAATAAAGCATG
101 Bionaz y
Loor, 2008b R. 247 GCTGACGCTGGACAACAGG
Formación de glóbulos de grasa
PLIN2 BC102211 F. 161 TGGTCTCCTCGGCTTACATCA
81 Bionaz y
Loor, 2008a R. 241 TCATGCCCTTCTCTGCCATC
Regulación de la transcripción
INSIG1 NM_001077909.1 F. 1188 CCATGTGCACTTCAAGGAGGA
108 Harvatine y Bauman,
2006 R. 1295 ATGTCGATCTTGCGTGTGGAG
SCAP NM_00101889 F. 1188 CCATGTGCACTTCAAGGAGGA
108 Harvatine y Bauman,
2006 R. 1295 ATGTCGATCTTGCGTGTGGAG
SREBF1 NM_001113302 F. 2824 TGTCCACAAAAGCAAATCGC
101 Bionaz y
Loor, 2008a R. 2990 TGTCGACCACCTCTGGCTTC
THRSP AY656814 F. 631 CTACCTTCCTCTGAGCACCAGTTC
151 Harvatine y Bauman,
2006 R. 781 ACACACTGACCAGGTGACAGACA
F: Forward; R: Reverse; Bp: Pares de bases.
29
3.1. Preparación de ADN complementario (ADNc)
El protocolo de preparación del ADNc está conformado por 3 pasos; degradación del
ADN contaminante, alineamiento de cebadores (o primers) y Transcripción Reversa.
Antes de llevar a cabo estos procedimientos fue necesario determinar la concentración
de ARN de las muestras de leche, con el objetivo de estandarizar la concentración dentro
de un rango de 50 y 150 ng/µl (estipulado por el fabricante). Además, para este protocolo
se utilizó una muestra control (sin ARN), para asegurar la ausencia de ADN durante la
síntesis de ADNc.
El primer paso es la degradación del ADN contaminante, el cual se realizó a través de la
incubación con enzima ADNsa y así evitar alteración de los resultados. Para ello se
utilizaron 3 µl de agua libre de nucleasas, Buffer de reacción 10X (RQ1 DNase) y ADNsa
(RQ1 libre de RNasa). Luego se agregaron 7 µl de templado o ARN (muestra), y 7 µl de
agua libre de nucleasas en el caso del control (-) de la reacción. Posteriormente las
muestras se incubaron a 37°C por 30 minutos en termociclador para favorecer la acción
de la enzima ADNasa. Una vez finalizada la reacción, se adicionó 1 µl de Stop solution,
con el propósito de cesar la función de la enzima.
El alineamiento de los cebadores busca sintetizar el ADNc a partir de la molécula de
ARN. En dicha reacción se utilizaron 6 µl de la muestra tratada con ADNsa y 1 µl de
cebador al azar. Para lograr el alineamiento de los cebadores y la síntesis de ADN, las
muestras fueron incubadas a 70°C por 5 minutos.
Durante el paso de Transcripción Reversa se elaboró una solución compuesta por: 4 µl
de agua libre nucleasa; 4 µl de buffer 5X Improm-II; 4,5 µl de MgCl2; 1 µl
oligonucleótidos; 0,5 µl de inhibidor de ARNasas (Rnasin) y 1 µl de enzima Transcriptasa
reversa (Improm-II). Las muestras se incubaron a 25°C por 5 minutos (Alineamiento),
luego a 42°C por 6 minutos (Extensión) y finalmente a 70°C por 15 minutos para inactivar
las enzimas.
3.2. Condiciones quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)
Cada reacción fue llevada a cabo en triplicado y con una solución de reacción compuesta
por 200 µl de LightCycler® 480 SYBR Green I Master, concentración 2x (Roche, Basilea,
Suiza), 140 µl de agua Roche y 10 µl de cada uno de los partidores. Las amplificaciones
fueron realizadas en el equipo AriaMx Real-Time PCR (Modelo G8830A, Agilent
30
Technologies) y bajo las siguientes condiciones; un primer ciclo (Hot start 1) a 50°C por
2 minutos, seguido de un segundo ciclo (Hot start 2) a 95°C por 10 min. La amplificación
constó de 40 ciclos, con denaturación a 95°C por 15 segundos, seguido por alineamiento
a 60°C por 1 minuto y finalmente un ciclo (melt) a 95°C por 30 segundos, 65°C por 30
segundos y 95°C por 30 segundos. Se utilizaron dos temperaturas de alineamiento, 60ºC
y 62°C (Tabla 3).
Tabla 3: Condiciones qPCR para los genes candidatos.
Gen Primer Programa Referencia
ACACA, FADS2, FASN, SCD, LPL, VLDLR, ACSS2, DGAT1, DGAT2, PLIN2, SREBF1
10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 60ºC (ann.+ext.)
Bionaz y Loor, 2008b
FATP 10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 62ºC (ann.+ext.)
Bionaz y Loor, 2008a
ACSL1 10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 60ºC (ann.+ext.)
Loor et al., 2005
FABP3, FABP4, LPIN1
10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 60ºC (ann.+ext.)
Bionaz y Loor, 2008a
INSIG1, SCAP, THRSP
10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 62ºC (ann.+ext.)
Harvatine y Bauman, 2006
GAPDH, UXT, EIF3K
10 uM 2 min x 50ºC 10 min X 95ºC
40* 15 s x 95ºC (den.) 1 min x 60ºC (ann.+ext.)
Genes de referencia
Ann: alineado; Ext: extensión; *: ciclos.
3.3 Evaluación de los amplicones
3.3.1. Evaluación del tamaño de los amplicones
Se evaluó el tamaño de los amplicones sintetizados mediante electroforesis en gel de
acrilamida. Para la elaboración del gel se utilizaron 3,25 mL de agua bidestilada, 6,6 mL
de acriba-bisacrila, 2,5 mL de TBE (Tris, Borato y EDTA) a una concentración 5X, 65 µL
de persulfato de amonio al 25% y 12,5 µL de tetrametiletilendiamina (TEMED). Para
31
realizar la reacción se utilizó TBE en una concentración de 1X como solución buffer y
para la migración de los amplicones se aplicaron 200 volts por 25 min. En cuanto a la
tinción y revelado de la reacción, primero se fijó el gel 50 mL de etanol-ácido acético a
concentración 1X, se calentó por 10 seg y luego se sumergió en 50 mL de AgNO3 a una
concentración 1X y se calentó nuevamente por 10 seg utilizando un horno microondas.
Posteriormente se lavó el gel mediante el uso de agua bidestilada. Luego, se sumergió
en una solución compuesta por 20 mL de NaOH al 7,5%, 30 mL de agua bidestilada y
0,5 mL de formaldehído al 37%, y se calentó en el horno microondas por 20 seg logrando
revelar las bandas de migración. Por último, se lavó nuevamente el gel con agua
bidestilada y se fijó usando etanol-ácido acético a una concentración 1X.
Se aceptaron en este estudio aquellos amplicones cuyo tamaño obtenido mediante
electroforesis fueran similares a los tamaños de los amplicones señalados en la literatura
y que se indican como “Bp” en la tabla 2.
3.3.2 Evaluación de secuencia de amplicones
Las secuencias de los amplicones sintetizados fueron evaluados por la empresa
Macrogen USA (Cambridge, MA, USA), a través de la cual se realizaron cromatogramas
de secuenciación los cuales posteriormente fueron analizados mediante el software
BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Este programa contiene una base de
datos con la que se compararon los cromatogramas obtenidos y se seleccionaron
aquellas secuencias que presentaban similitud con esta base de datos y cuyas
secuenciaciones contenían peaks con alta resolución, baja presencia de ruidos y clara
identificación de los nucleótidos que conforman las secuencias.
3.4 Evaluación expresión relativa mRNA
Para poder determinar la expresión relativa de mRNA se utilizó Pair Wise Fixed
Reallocation Randomizantion Test, elaborado por REST (2008), utilizando 2000
iteraciones, es decir, se realizan numerosas reasignaciones aleatorias entre las
muestras seleccionadas e indica el número de veces en que la expresión relativa del
grupo evaluado al azar el mayor que los datos de la muestra control (Pfaffl et al., 2002).
El programa utiliza un modelo matemático que considera las eficiencias del PCR, en este
estudio fueron entre 0,84 y 1 (tabla 4), y la desviación del punto de cruce medio (Ct)
32
entre la muestra y el control, considerando como procedimiento de normalización que la
diferencia entre los Cts de la muestra y el control era 0.
Tabla 4: Eficiencia de reacción PCR de genes analizados (TRG) y genes de control
interno (GCI)
Gen Tipo Eficiencia de reacción
ACACA TRG 0,9976
FADS2 TRG 0,9771
FASN TRG 1,0000
SCD TRG 0,9262
PLIN2 TRG 0,9407
INSIG1 TRG 0,9751
SCAP TRG 1,000
SREBF1 TRG 0,92
THRSP TRG 0,84
PPARG TRG 0,9983
DGAT1 TRG 0,9167
DGAT2 TRG 0,9754
LPIN1 TRG 0,9076
LPL TRG 0,9549
FATP TRG 0,9143
VLDLR TRG 0,8882
ACSL1 TRG 0,9588
ACSS2 TRG 0,9991
FABP3 TRG 0,9496
FABP4 TRG 0,9728
GAPDH GCI 0,8841
EIF3K GCI 0,9657
UXT GCI 0,966
En este estudio en primera instancia se evaluó la expresión relativa de los genes dentro
de cada grupo al día 42 y 63 con relación al día 21, que permitió determinar aquellos
genes que se mantenían estables a lo largo del tiempo o que presentaban variación. A
33
partir de esto se seleccionaron aquellos que se mantuvieron estables y se calculó su
expresión relativa en cada tratamiento en relación con el grupo Control, en cada uno de
los periodos (día 21, 42 y 63). Posteriormente para determinar si los tratamientos OO y
HVO generaban un efecto similar o distinto en los mismos grupos de genes que en el
grupo Control a lo largo del tiempo es que se hizo el cálculo de la expresión relativa a
los días 42 y 63 utilizando como control el día 21.
El cálculo utilizado se presenta a continuación, siendo E= eficiencia y su resultado se
entiende como la razón de la expresión relativa de los genes indicando las veces que
cambió debido al tratamiento ya sea en relación con el día 21 o en relación al grupo
Control en cada período:
𝐸𝑥𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑎: (𝐸 𝐺𝑒𝑛 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜)∆Ct gen blanco (día control− día a evaluar)
(𝐸 𝐺𝑒𝑛 𝑑𝑒 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎)∆𝐶𝑡 𝑔𝑒𝑛 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 (𝑑í𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙− 𝑑í𝑎 𝑎 𝑒𝑣𝑎𝑙𝑢𝑎𝑟)
4. Análisis estadístico
Se analizó la producción y composición de la leche, en cuanto a los litros producidos,
grasa láctea, proteína, y recuento de células totales. El perfil de ácidos grasos de la leche
se informa como g/100 g de ácidos grasos totales, a partir de dichos valores se realizó
un análisis de varianza (ANOVA), considerando como factor de variación el tipo de
suplementación (control, aceite de oliva y aceite hidrogenada de palma) y el tiempo. De
existir diferencias entre estos valores se realizó una prueba de diferencia entre medias
(Prueba de Tukey). Para determinar significancia estadística se utilizó una probabilidad
de P ≤0,05.
A partir del perfil de AG de la leche se calcularon los índices aterogénico (IA) y
trombogénico (IT). Se utilizaron las fórmulas propuestas por Ulbricht y Southgate (1991),
y se presentan a continuación:
𝐼𝐴: C12: 0 + 4 (C14: 0) + C16: 0
(n6 + n3)𝐴𝐺𝑃𝐼 + C18: 0 + ∑ 𝐴𝐺𝑀𝐼
𝐼𝑇:C14: 0 + C16: 0 + C18: 0
(0,5 ∗ C18: 0) + 0.5 ∗ ∑ AGMI + 0.5 ∗ n6 AGPI + 3 ∗ n3 AGPI + ( n3 AGPI/ n6 AGPI)
El análisis estadístico se realizó mediante el programa estadístico GenStat versión 12.1
(VSN International Ltd; 2009).
34
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Producción y composición láctea
Los datos productivos y perfil de ácidos grasos han sido reportados previamente
(Vargas-Bello-Pérez et al., 2018). Las vacas tuvieron una ingesta promedio diaria de
26,5 Kg de MS sin diferenciarse entre grupos (tabla 5). Tampoco presentaron diferencias
en el peso corporal ni en la condición corporal, ya que las dietas fueron formuladas de
manera que fueran isocalóricas (ENL=1,6 Mcal Kg-1 de materia seca).
El grupo suplementado con aceite de oliva (OO) produjo un 9,7% más de Kg de leche
que el grupo Control y aquel suplementado con aceite de palma (HVO), alcanzando un
promedio de 34,9 kg de leche diarios. No presentaron diferencias en producción de
proteína, pero sí en el contenido de grasa ya que produjeron un 9,28% menos que los
demás grupos.
El grupo OO presentó una reducción de un 18,14% de AG generados a partir de síntesis
de novo (C4:0 a C12:0), presentando 15,61 g/100 g de AG totales, comparados con los
19,07 g y 18,58 g de los grupos Control y HVO. A partir de lo anterior y considerando
que no hay cambios en la producción de proteína, se podría indicar que las vacas del
grupo OO presentaron síndrome de depresión de grasa láctea (SDGL; Baumgard et al.,
2000). Entre los factores de riesgo de SDLG (Jenkins y Harvatine, 2014) se encuentran
la adición de ionóforos, un contenido de FDN menor al 25% en la dieta y adición de AG
insaturados en la dieta, los primeros dos factores no ocurrieron en este estudio ya que
las dietas contenían entre 31 y 33% de FDN, sin embargo, en el caso de OO los AG
insaturados superan los 60 g/100 g de AG totales en la dieta (Tabla 6).
Estudios realizados con isómeros del ácido linoleico conjugado (ALC) observaron que
ALC trans-10, cis-12 reduce la concentración de grasa en la leche de manera
exponencial, llegando a una reducción de un 50% a una dosis de infusión de 7,5 g/d -1
(Baumgard et al., 2000; de Veth et al., 2004; Shingfield y Griinari, 2007), mientras que
ALC cis-9, trans-11 no genera efecto alguno (Baumgard et al., 2000), y en este estudio,
tanto en el grupo OO como HVO hubo un aumento en el contenido de C18:2 cis-9, trans-
11 en comparación al grupo Control, el cual sería producto de una biohidrogenación
incompleta de los AGPI de 18 carbonos presentes en la dieta así como también de una
producción endógena debido a la acción de Butirivibrio fibrisolvens, bacterias presentes
35
en el rumen, y por el efecto de la enzima SCD, la cual se encuentra en tejido adiposo y
la glándula mamaría (Kim et al., 2002), mientras que C18:2 trans-10, cis-12 no fue
detectado en la leche y su producción se debería de manera exclusiva a la
biohidrogenación ruminal (Griinari et al., 2000).
Tabla 5: Desempeño y análisis proximal de la leche de vacas alimentadas con dietas
control, aceite de oliva (OO) y aceite hidrogenado de palma (HVO)
Dieta
Control OO HVO EE Valor P
Producción
Ingesta diaria de MS (kg MS/día) 26,5 26,5 26,5 * *
Producción de leche, kg/d 31,1b 34,9a 31,8b 3,13 0,04
Grasa 1,02a 0,88b 1,04a 0,12 0,05
Proteína 1,05 0,97 1,08 0,25 0,58
Composición láctea, g/100g
Grasa 3,28a 2,83b 3,28a 0,31 0,04
Proteína 3,39 3,16 3,41 0,36 0,29
Recuento células somáticas, × 103/ml 358a 145c 254b 82,0 0,02
Peso corporal, kg 662 636 700 79,0 0,23
Condición corporal 2,97 2,77 2,98 0,33 0,34
EE: Error estándar de la media; Valor P representa la probabilidad del efecto del tratamiento. Las medias en la misma fila con diferentes superíndices (a, b, c) son diferentes (P <0,05). (Vargas-Bello-Pérez et al., 2018) En relación al recuento de células somáticas (RCS) el grupo OO presentó un 59,5%
menos en comparación a Control y 42,9% menos que HVO, promediando 145.000
células por ml de leche. Esto podría deberse a que la dieta OO, posee un alto contenido
de AGPI ω-3 (19,1% de ácido α-linolénico), los cuales tienen efecto antiinflamatorio,
debido a que los AGPI como ácido α-linolénico y linoleico una vez absorbidos se pueden
convertir en AGPI de cadena muy larga, como ácido araquidónico (AA),
eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico (DHA; Guillou et al., 2010), los que se
incorporan en los fosfolípidos de membrana de monocitos, macrófagos y células del
endotelio vascular, participando en la cadena de la inflamación (Arterburn et al., 2006;
Calder, 2006). Por otro lado, de los AGPI ω-3 derivan mediadores antinflamatorios tales
como resolvinas, protectinas y maresinas y también reducen la actividad proinflamatoria
de los eicosanoides (Leucotrienos, tromboxanos y prostaglandinas) derivados de AA,
producidos a partir de AGPI ω-6 (Serhan y Petasis, 2011).
36
Tabla 6: Composición química de dietas Control, aceite de oliva (OO) y aceite
hidrogenada de palma (HVO)
Dietas
Control OO HVO
Composición química (% MS)
Materia seca 38,4 38,9 38,4
Proteína cruda 14,4 13,4 14,3
Extracto etéreo 4,6 7,7 7,1
Fibra neutro detergente 33,5 31,1 33,4
Fibra ácido detergente 19,8 23,1 19,4
Lignina 4,2 4,5 4,5
Cenizas 6,2 5,0 6,0
Composición de ácidos grasos (g/100g AG) C6:0 0,9 0,1 nd C10:0 0,3 0,1 nd C12:0 1,1 0,2 nd C14:0 10,7 0,2 0,1 C15:0 5,1 1,9 1,2 C16:0 6,4 10,1 58,0 C18 :0 23,5 26,3 39,8 C18:1 cis-9 1,0 32,8 nd C18:2 cis-9, cis-12 33,8 9,0 nd C18:3 cis-6, cis-9, cis-12 7,7 nd 0,4 C18:3 cis-9, cis-12, cis-15 9,5 19,1 0,3
Nd: no detectado (Vargas-Bello-Pérez et al., 2018)
2. Perfil de ácidos grasos en la leche
En la tabla 7 se indica la composición de los AG de la leche de cada grupo tratado. En
los anexos 5, 6, y 7 se presentan en detalle los perfiles de AG de la leche de los distintos
grupos a través del tiempo. Los resultados fueron publicados en Vargas-Bello et al.
(2018).
No se evidenciaron diferencias en la sumatoria de los AGS, que fue cercana a 80 g /100
g de AG totales. Hubo diferencias significativas en la sumatoria de los AGMI y AGPI
siendo el grupo OO donde se presentan en una mayor proporción, con valores de 16,2
y 6,43 g/100 g respectivamente.
En el grupo OO se redujo el contenido de C8:0, C11:0 y C12:0, lo que podría explicarse
debido a que la suplementación con AG de cadena larga (OO tiene una alta proporción
de C18:1 cis-9), afecta negativamente la síntesis de novo en la glándula mamaria por lo
cual dichos AG, producidos principalmente mediante esta vía a partir de acetato y
37
β-hidroxibutirato y en una menor proporción por acción de las comunidades microbianas
del rumen (Lock y Bauman, 2004; Shingfield et al., 2013), se ven afectados.
El ácido oleico (C18:1 cis-9) en el grupo OO, superó en un 27% a los grupos Control y
HVO. Lo observado para C18:1 cis-9, no es consistente con los resultados obtenidos por
Fougére y Bernard (2019), donde junto con el aumento de dicho AG, aumentó también
la proporción de C16:0, C16:1 y C18:0. El aumento del ácido oleico en la leche se puede
deber al aporte dietario o a un aumento en la actividad de la enzima SCD (Loften et al.,
2014), en este estudio, dentro del grupo Control presentó diferencias en su expresión,
por lo que se calculó el índice de desaturación ∆9, que mide el grado de insaturación de
un AG específico, en este caso C18:1 cis-9/(C18:0+C18:1 cis-9) promediando en los tres
grupos 0,97 sin presentar diferencias entre ellos, por tanto se puede relacionar el
resultado con el efecto de la suplementación dietaria más que por un aumento en la
acción de la SCD, además de un proceso de biohidrogenación de C18:2 cis-9, cis-12
incompleto (Leuroux et al., 2016) debido a que no se evidenciaron diferencias
significativas en el contenido de C18:0 ni de C18:1 trans-11 en la leche de los grupos a
evaluar.
Respecto a los AGPI, se apreciaron diferencias en el ácido linoleico (C18:2 cis- 9, cis-
12), ácido α-linolénico (C18:3 cis- 9, cis-12, cis-15) y ácido ruménico (C18:2 cis -9, trans-
11), presentándose en mayor proporción en OO y en el caso del ácido ruménico aumentó
también en HVO, alcanzando un valor similar a lo reportado por Kupczynski et al (2012).
Se calcularon los índices trombogénico y aterogénico, ambos valores fueron menores
en OO (tabla7). Según Ulbritch y Southgate (1991) a mayor valor mayor es el efecto
negativo que tienen las grasas sobre la salud humana, aunque estudios realizados
durante la última década contradicen el rol tradicionalmente aceptado de los AG, ya que
en meta-análisis realizados en humanos, el consumo de AGS no tendrían asociación
con enfermedades cardiovasculares (Mente el at., 2009) sino que los AG que aumentan
ese riesgo es el consumo de AG trans de origen industrial y no producto de la
biohidrogenación ruminal (Gebauer et al., 2011).
38
Tabla 7: Perfil de ácidos grasos de la leche de vacas alimentadas con dieta control,
aceite de oliva (OO) y aceite hidrogenada de palma (HVO)
EE: Error estándar; n.d: no detectado. Valor P representa la probabilidad del efecto del
tratamiento. Las medias en la misma fila con diferentes superíndices (a, b, c) son
diferentes (P <0,05). (Vargas-Bello-Pérez et al., 2018)
Dietas
Ácido graso (g/100g de AG) Control OO HVO EE Valor P
C4:0 4,52 4,06 4,24 0,28 0,27
C6:0 2,82 2,49 2,93 0,26 0,24
C8:0 2,00b 1,31a 1,68b 0,23 0,02
C10:0 4,20 3,44 4,40 0,48 0,12
C11:0 0,26a 0,17b 0,27a 0,02 <0,001
C12:0 5,27a 4,14b 5,06a 0,34 <0,001
C13:0 0,16 0,11 0,10 0,04 0,38
C14:0 15,8 15,1 15,3 0,50 0,57
C14:1 0,85 0,96 0,82 0,13 0,50
C15:0 0,95 0,73 0,67 0,17 0,22
C15:1 0,91 0,72 0,68 0,16 0,34
C16:0 40,7 40,1 40,6 1,53 0,92
C17:0 0,61 0,43 0,84 0,19 0,10
C17:1 0,41 0,47 0,41 0,06 0,50
C18:0 5,05 3,70 4,20 0,81 0,25
C18:1 trans-11 0,23 0,35 0,35 0,19 0,75
C18:1 cis-9 8,39b 12,2a 8,89b 1,22 0,04
C18:2 trans-9, trans-12 1,12 0,58 1,07 0,25 0,07
C18:2 cis-9, cis-12 1,86b 2,51a 1,16b 0,37 0,03
C18:3 cis-9, cis-12, cis-15 0,95b 1,21a 0,72b 0,19 0,05
C18:3 cis-6, cis-9, cis-12 0,73 0,59 0,54 0,11 0,25
C18:2 cis-9, trans-11 0,11b 0,37a 0,42a 0,08 0,03
C20:0 0,20 0,13 0,35 0,13 0,24
C20:1n-9 0,11 0,05 0,12 0,09 0,71
C20:2 0,02 n.d n.d 0,01 0,30
C20:3n-3 0,16 0,29 0,29 0,06 0,07
C20:3n-6 0,22 0,39 0,35 0,11 0,28
C22:0 0,02 n.d n.d 0,02 0,38
C22:1n-9 n.d 0,04 n.d 0,02 0,13
Σ Ácidos grasos saturados 82,6 77,4 79,3 2,92 0,20
Σ Ácidos grasos monoinsaturados 12,2b 16,2a 12,2b 1,24 0,03
Σ Ácidos grasos poliinsaturados 5,17b 6,43a 4,06b 0,78 0,01
Indice aterogénico 4,29a 3,41b 4,86a 0,42 <0,001
Indice trombogénico 4,70a 3,90b 5,04a 0,38 0,02
AGPI/AGS 0,06 0,05 0,08 0,01 0,01
39
3. Genes involucrados en el metabolismo de ácidos grasos
En una primera etapa se comparó la evolución de la expresión de los genes al día 42 y
63 dentro del grupo Control con relación a la expresión del día 21 (Tabla 8), y a partir de
esos resultados se seleccionaron aquellos genes que no sufrieron cambios con el tiempo
para luego comparar el efecto de los tratamientos OO y HVO a lo largo del estudio,
quedando 5 genes a analizar: ACACA, ADFP (PLIN2), THRSP, FABP3 y FABP4.
Esta decisión se debe a que una de las desventajas de este tipo de estudios, que tienen
una duración de varias semanas, en este caso de 9 semanas, es que los efectos
atribuidos a la suplementación con AG en la dieta pueden confundirse con las diferencias
propias de la etapa de lactancia (Bionaz y Loor, 2008b; Mach et al., 2011). Es por esa
razón también que se seleccionaron aquellas vacas que se encontraban en la etapa de
lactancia media. Para identificar los cambios en la expresión de los genes en respuesta
a la suplementación se comparó la expresión de los genes de interés en cada período
evaluado (días 21, 42 y 63) con relación al grupo Control.
Posteriormente se evaluó mediante REST la expresión relativa de los genes de interés
dentro de cada tratamiento, los días 42 y 63 con relación al día 21, para luego
compararlos con el comportamiento del grupo Control, con la intención de poder
determinar si las suplementaciones con AG generaron variaciones en el tiempo en los
mismos grupos de genes, o si se vieron afectados de distinta manera (Tablas 9 y 10).
40
Tabla 8: Expresión relativa de los genes de interés dentro del grupo control al día 42 y
63 comparado con la expresión al día 21 del estudio.
Día 42 Día 63
Gen ER EE Resultado ER EE Resultado
Ingreso de ácidos grasos a la célula
LPL 5,565 0,924 - 33,144 UP 5,048 0,789 - 17,658 UP
VLDLR 2,194 0,779 - 7,782 4,497 1,264 - 14,804 UP
Síntesis y desaturación de ácidos grasos
ACACA 0,329 0,020 - 4,696
2,485 0,396 - 11,428
FASN 1,392 0,058 - 44,738
11,26 0,888 - 155,41 UP
SCD 0,171 0,024 - 1,968 DOWN 2,152 0,199 - 24,53
Activación y transporte intracelular de acetato y ácidos grasos
ACSL1 9,677 2,616 - 30,240 UP 2,914 1,031 - 14,209 UP
ACSS2 8,539 3,367 - 28,818 UP 2,46 0,620 - 9,342 UP
FABP3 1,512 0,605 - 4,438 1,057 0,517 - 2,065
FABP4 0,552 0,085 - 4,594 1,487 0,276 - 4,815
Síntesis de triglicéridos
DGAT1 0,562 0,037 - 12,375 9,123 1,079 - 62,956 UP
DGAT2 1,917 0,266 - 8,455 8,284 0,631 - 75,028 UP
LPIN1 2,313 0,098 - 54,753 19,13 2,728 - 117,02 UP
Formación de glóbulos de grasa
PLIN2 0,716 0,141 - 5,915 2,251 0,307 - 10,71
Regulación de la transcripción
INSIG1 2,361 0,421 - 7,384
15,83 2,18 - 546,33 UP
SCAP 0,046 0,016 - 0,109 DOWN 0,469 0,114 - 2,678
SREBF1 1,815 0,152 - 12,882
10,98 1,79 - 108,37 UP
THRSP 0,541 0,219 - 1,320
8,051 0,417 - 1,009
ER: Expresión relativa; EE: Error estándar; UP: regulación al alza; DOWN: regulación a
la baja
3.1 Efectos del grado de insaturación de la suplementación lipídica en la expresión
relativa de los genes analizados con relación al grupo Control
Como se mencionó anteriormente, en una primera instancia se evaluaron 5 genes:
ACACA, PLIN2, THRSP, FABP3 y FABP4. Dentro de estos, la suplementación con AG
generó un leve cambio en la expresión del gen que codifica para la proteína ACACA,
durante aumentando día 21 del estudio (anexos 7 y 8).
41
La escasa variación de la expresión de ACACA podría deberse a que, según diversos
estudios (Barber et al., 2005; Badoui et al., 2007), la transcripción de ACACA está
regulada por 4 promotores, y estos a su vez son regulados principalmente por el
contenido de glucosa presente en la célula, así como también por la relación insulina:
glucagón, y los niveles de la hormona T3 en sangre. Por su parte también es regulado
por el factor de transcripción SREBP1. Por tanto, no tendría mayor efecto la
suplementación de AG en la dieta sobre esta enzima, lo cual también fue observado por
diversos estudios, en los cuales evaluaron la suplementación con aceite de soya
(principalmente constituido por los ácidos linoléico y oleico), correspondiente al 5% de la
dieta en bovinos (Piperova et al., 2000) y un 3,6% de la dieta en cabras (Bernard et al.,
2005a; Chilliard et al., 1986), en los cuales no se presentaron diferencias a nivel de
glándula mamaria ni de tejido adiposo.
La expresión estable de ACACA podría explicar, en parte, que en los distintos
tratamientos no se presentaran diferencias significativas en las proporciones de los AG
C4:0 y C6:0 presentes en la leche, así como tampoco de C16:0 ya que se describe que
la producción de AG de cadena corta y de palmitato está regulado principalmente por la
acción de esta enzima, la cual sería un punto crítico en la síntesis de novo (Bionaz y
Loor, 2008a; Pegolo et al., 2016).
Los principales procesos que se vieron afectados debido a la suplementación en la dieta
son la activación de acetato y transporte intracelular, formación de glóbulo de grasa, y la
regulación de la transcripción. En el caso de HVO, se produjeron cambios a nivel de los
genes que codifican a las enzimas de la familia de las proteínas de unión a ácidos grasos,
ya que se evidenció una disminución en la expresión de FABP3 al día 21 y de FABP4 al
día 63. Mientras que THRSP, presentó una regulación al alza de su expresión al día 42
y posteriormente al día 63 se presenta una reducción en la expresión relativa (Figura 5).
Respecto a la suplementación con OO en la dieta estimuló la expresión de PLIN2 al día
42 del estudio y de THRSP en los días 21 y 42 (Figura 6).
42
Figura 5: Expresión relativa de genes involucrados con el metabolismo y secreción de
AG de la leche en vacas suplementadas con aceite hidrogenada de palma (HVO).
Al comparar con el grupo Control, la suplementación con HVO generó cambios en
FABP3 y FABP4, la importancia del primero es que FABP3 tiene un rol importante
canalizando al ácido palmítico y esteárico en su desaturación (Bionaz y Loor, 2008a;
Hanhoff et al., 2002), ya que proporciona estearoil-CoA (y otros sustratos como C16:0 y
C18:1 trans-11) a SCD que luego libera ácido oleico a FABP4 (Liang et al., 2014). Se
describe que una reducción de la expresión de FABP3 en cultivos celulares genera una
disminución en los niveles de SREBP1 Y PPARG, por lo que afecta la síntesis de grasa
láctea, y por otro lado se disminuye la acumulación de gotitas de grasa cuando su
expresión se reduce. Si bien aún no se conocen bien los detalles, se cree que FABP3
podría actuar directamente interactuando con los factores de transcripción o de manera
indirecta mediante moléculas de señalización (Liang et al., 2014).
Según el estudio realizado por Liang et al. (2014), la adición de ácido esteárico y
palmítico en los cultivos de células epiteliales de la glándula mamaria de vacas lecheras
43
genera un incremento en los niveles de expresión de FABP3. Sin embargo, en el
presente estudio se observó que al día 21 se produjo una reducción en la expresión de
dicho gen en el grupo HVO y los siguientes períodos se mantuvo estable (Figura 5), a
pesar de que la dieta HVO presentaba una mayor proporción de ambos AG.
A partir de lo anterior, considerando la acción de FABP3 en la glándula mamaria, al
observar una disminución en su expresión relativa dentro del grupo HVO, se hubiese
esperado una disminución de la proporción en la leche de C18:1 trans-11 y C18:1 cis-9,
1sin embargo, presentó un comportamiento similar al grupo Control y OO (anexos 4,5,6),
por lo que se podría decir que podrían haber otros factores involucrados en el contenido
de dichos AG.
En el caso del gen FABP4, su expresión puede verse afectada negativamente cuando
hay un alto contenido de AGS, tales como C12:0 y C14:0 y por el contrario hay una
regulación positiva en presencia de AGMI y AGPI (Nafikov et al., 2013). Como se
menciona anteriormente, en el grupo HVO hay una regulación a la baja de FABP4, lo
cual podría deberse a que en la dieta suministrada el grupo HVO recibió menos de un
1% de AGPI, a comparación del grupo Control y OO cuyas dietas contenían sobre un
50% de estos tipos de AG (Tabla 6), así como también podrían afectar en su expresión
la presencia en leche de un mayor contenido de C12:0 (5,06%) y a una menor proporción
en ésta de los AGMI (4,06%) y AGPI (4,86%; Tabla 7).
La importancia de la expresión de la enzima FABP4 en la glándula mamaria se basa en
que tiene diversos efectos con relación a la producción y calidad de la leche producida,
ya que es el principal responsable en la variación en la proporción de AG de cadena
media al reducirlos, y tiene un efecto positivo en el contenido de AG de cadena larga
(Marchitelli et al., 2013). En dicho estudio se menciona que genera cambios en el
contenido de C14:0 pero no en C14:1, lo cual se evidencia durante el día 63 (Figura 5),
donde se presenta una disminución en la expresión de FABP4 en el grupo HVO y al
evaluar el contenido de AG en la leche se observa una reducción en la proporción de
C14:0, sin presentar variaciones de C14:1, el cual se mantiene estable en su proporción
a lo largo del estudio (Anexo 6).
44
Figura 6: Expresión relativa de genes involucrados con el metabolismo y secreción de
AG de la leche en vacas suplementadas con aceite de oliva (OO).
La siguiente función afectada producto de la suplementación con AG fue la formación de
los glóbulos de grasa. Las principales proteínas encargadas de dicha acción son
BTN1A1, XDH y PLIN2, estas se encuentran en la membrana del retículo endoplásmico
y van permitiendo la incorporación de triacilglicerol recién formado y su transporte hacia
la membrana apical de la célula para su posterior secreción, estas actuarían en conjunto,
en lo que se ha propuesto como un modelo de acción tripartito (Bionaz y Loor, 2008a),
lo cual también ha sido descrito en ovejas (Suarez- Vega et al., 2016) y murinos
(McManaman et al., 2007). En este estudio sólo se pudo evaluar PLIN2, observándose
un aumento en su expresión durante el día 42 en el grupo OO (Figura 6).
Se ha descrito que desde la segunda mitad de la gestación hay un aumento en el
desarrollo de la glándula mamaria, es durante este periodo que aumenta la expresión de
PLIN2, debido a que dentro de sus funciones se encuentra la acumulación de glóbulos
45
de grasa en las células secretoras y que al momento que inicia la lactancia tanto su
expresión como el tamaño de los glóbulos de grasa se reducen (Russel et al., 2007).
En base a lo anterior, es que se podría considerar que, si en el grupo OO hay un aumento
en la expresión de PLIN2, esta podría ser una de las razones de que ocurra reducción
en el contenido de grasa en la leche, ya que los glóbulos de grasa se estarían
acumulando al interior de las células y no se secretarían de igual forma que en los grupos
HVO y Control. Estudios en los cuales se ha evidenciado una disminución en esta
proteína indican que la capacidad de acumular ácidos grasos en las células se reduce,
lo cual se traduce en un aumento en los niveles de AG en el suero sanguíneo (Martínez-
Botas et al., 2000; Tansey et al., 2001).
La síntesis de la grasa láctea a nivel de la glándula mamaria requiere de la coordinación
de múltiples procesos bioquímicos, por lo que participan diversos factores reguladores
de la transcripción, entre los cuales los que tienen una mayor importancia biológica
dentro de aquellos que regulan a los genes involucrados en el metabolismo de AG son
SREBP1 y PPARG (Mach et al., 2013).
Tal como se aprecia en la tabla 7, en este estudio se observó un aumento en la expresión
de SREBP1 y de INSIG1 al día 63 dentro del grupo Control, lo cual se relaciona con que
en este grupo se presentara una regulación al alza de FASN y LPL, ya que SREBP1 es
responsable de la regulación de la transcripción de estos genes y así como también de
ACACA y SCD (Harvatine et al., 2009), aunque estos últimos presentaron un
comportamiento diferente a los dos mencionados con anterioridad, ya que ACACA se
mantuvo estable a lo largo del estudio y SCD en el día 42 tuvo una regulación a la baja
y luego al día 63 no presentó mayor variación.
El hecho de que tanto SREBP1 e INSIG1 varíen su expresión en el grupo Control, se
podría deber a que INSIG1 interactúa junto al gen SCAP regulando la acción de
SREBP1, regulándose de esta forma la síntesis de triacilglicerol en la célula secretora
de la glándula mamaria, esto debido a que INSIG1 une a SCAP con SREBP1 en el
retículo endoplásmico, para luego ser transportados hacia el aparato de Golgi donde se
separan y luego SREBP1 ingresa al núcleo dónde ejerce su función (Bionaz y Loor,
2008a). Cabe destacar que lo observado en este estudio difiere a los resultados
entregados por Bionaz y Loor (2008a), quienes observaron una disminución de la
expresión de ambos genes entre los días 120 y 240 de lactancia, ya que es al día 120
46
en el cual se presenta el peak en la expresión de estos. En el caso del presente estudio,
durante el muestreo del día 63 se encontraban en el día 252± 23 de lactancia por lo cual
se hubiese esperado un comportamiento similar a lo ocurrido en el estudio realizado por
Bionaz y Loor (2008a).
En cuanto al factor de transcripción THRSP, también conocido como S14, dentro del
grupo OO presenta un aumento en su expresión durante el segundo período evaluado
(día 42; Figura 6). Un estudio realizado en cultivos de células epiteliales evidenció que
aquellos cultivos provenientes de glándula mamaria de vacas que producen un alto
contenido de grasas presentan una expresión de THRSP cerca de 900% mayor que
aquellas células de vacas que producen un bajo contenido de grasas, por lo cual este
factor de transcripción podría utilizarse como un marcador de la producción de AG en la
glándula mamaria bovina (Cui et al., 2015), además evidenciaron que 48 horas después
de una sobre expresión de este gen se genera un aumento en la producción de
triacilglicerol y que podría alterar la síntesis de novo de los AG.
Por otro lado, también se describe que la expresión de THRSP se reduce cuando hay
síndrome de depresión de grasa láctea o cuando a los cultivos de células epiteliales de
glándula mamaria se le adiciona CLA trans-10, cis-12 (Harvatine y Bauman, 2006:
Bauman et al., 2011). Sin embargo, en el presente estudio a pesar de que en el grupo
OO hay una regulación al alza de dicho factor de transcripción, es el grupo de vacas que
producen una menor cantidad de grasa láctea comparado con las vacas de los grupos
Control y HVO, y junto con esto al realizar la sumatoria de los AG en leche provenientes
de la síntesis de novo, es decir, los AG C4:0 a C12:0, se aprecia que en el grupo OO se
producen 16,89 g/100g de AG totales en la leche al día 42, mientras que los grupos
Control y HVO presentan 19,24 y 19,43 g/100g de AG totales respectivamente, lo que
representaría una reducción en la producción de dichos AG de un 12,2%. Este
comportamiento no se relaciona con lo observado en los estudios mencionados
anteriormente, así como tampoco con lo observado en estudios realizados en ratas,
donde la sobreexpresión del gen THRSP genera un incremento en los AG de cadena
media, ya que THRSP actuaría directamente sobre FASN estimulando la producción de
dichos AG (Cui et al., 2015).
47
3.2 Efecto del tiempo sobre la expresión relativa de los genes involucrados con el
metabolismo lipídico en glándula mamaria
Se evaluó la variación en el tiempo de la expresión de los genes involucrados con el
metabolismo de los AG en la glándula mamaria, para lo cual mediante el programa REST
se calcularon las expresiones relativas de los genes al día 42 y 63 utilizando como valor
base el día 21 dentro de cada grupo de estudio. Como se mencionó anteriormente se
comparó los comportamientos de cada grupo tratado con lo ocurrido en el grupo Control
(Tabla 8).
En la tabla 9 se indican la expresión relativa de los diversos genes evaluados dentro del
grupo HVO y en la tabla 10 lo correspondiente al grupo OO. Observándose a nivel
general un comportamiento similar entre el grupo Control y el grupo HVO, lo cual era lo
esperado debido a que al analizar los resultados productivos y del perfil de AG en la
leche ambos grupos presentaron respuestas sin mayores diferencias estadísticas
(Tablas 5 y 7).
Se aprecia que en los grupos Control y HVO de los 17 genes analizados 10 presentaron
el mismo comportamiento durante los días 42 y 63, los cuales son relacionados con las
siguientes funciones: Ingreso de AG a la célula (VLDLR), síntesis y desaturación de AG
(FASN), activación y transporte de AG (ACSL1, ACSS2, FABP3, FABP4), síntesis de
triglicéridos (DGAT1 y DGAT2) y regulación de la transcripción (SREBF1 y THRSP).
Dentro de estos genes, cabe destacar que FASN presenta un aumento en su expresión
al día 63, lo cual se contradice con lo observado por Bionaz y Loor (2008a) quienes
reportan que a partir del día 240 post parto, este gen junto a SCD y FABP3 son regulados
a la baja, en el presente estudio se observó una disminución de la expresión de SCD al
día 42 y luego se mantuvo estable, y en el caso de FABP3 se mantiene estable en cada
período. Sin embargo, en un estudio realizado en cabras se observó el mismo
comportamiento que en el presente trabajo, si bien Shi et al. (2015) obtuvo las células a
partir de biopsia, ellos indican que la diferencia en la expresión de los genes se podría
deber al método utilizado en el aislamiento de las células, ya que la glándula mamaria
está compuesta por una gran variedad de células, tales como epiteliales, estroma y
adipocitos que pueden dificultar la identificación de la contribución de cada una de estas
en el resultado final.
48
En el caso del grupo OO, únicamente los genes FABP3 y FABP4 mantienen el mismo
comportamiento que el grupo Control ya que se mantienen sin mayor variación en el
tiempo, al igual que en el grupo HVO. Durante el día 42 se evidencia que 9 genes tienen
el mismo comportamiento que el grupo Control, los cuales son los relacionados con las
siguientes funciones: ingreso de AG a la célula (LPL), síntesis y desaturación de AG
(FASN), activación y transporte de AG (ACSL1), síntesis de triglicéridos (DGAT2 y
LPIN1) y regulación de la transcripción (INSIG1 y THRSP). Sin embargo, durante el día
63 se evidencian diferencias en el comportamiento de 6 genes (LPL, FASN, ACSS2,
DGAT1, DGAT2 y SREBF1), donde se aprecia una regulación a la baja en este grupo
tratado, mientras que en los grupos Control y HVO aumentan su expresión.
Este comportamiento durante el día 63 dentro del grupo OO, en parte se podría explicar
debido a que una suplementación con AG insaturados genera una regulación a la baja
de SREBF1, lo cual conlleva una disminución de la actividad de aquellos genes que son
regulados por este factor de transcripción, tales como FASN y LPL (Harvatine et al.,
2009; Mach et al., 2011). Esto también se observó en un estudio realizado con ratones
(Rudolph et al., 2010), en el cual una dieta con alto contenido de AG insaturados suprime
la acción de SREBPF1, mientras que, por el contrario, una dieta con gran porcentaje de
AG saturados genera una inducción de dicho gen, lo cual ocurre tanto a nivel de glándula
mamaria como de hígado, provocando así una disminución en la producción de AG a
partir de síntesis de novo, lo cual explicaría las diferencias observadas con los grupos
Control y HVO.
49
Tabla 9: Comparación en el tiempo de la expresión relativa de los genes de interés del
grupo HVO con relación al día 21 del estudio.
Día 42
Día 63
Gen ER EE Resultado ER EE Resultado
Ingreso de ácidos grasos a la célula
LPL 1,118 0,519- 2,527 3,974 1,917-12,158 UP
VLDLR 0,804 0,474-1,347 1,872 1,029 - 3,219 UP
Síntesis y desaturación de ácidos grasos
ACACA 2,955 0,361 - 26,23 6,719 1,797-47,276 UP
FASN 3,652 0,233-58,76 43,97 2,382-1,384 UP
SCD 0,67 0,320 - 1,85 3,091 0,569-14,437
Activación y transporte intracelular de acetato y ácidos grasos
ACSL1 11,96 1,774-223,026
UP 5,809 0,947-108,28 UP
ACSS2 1,901 0,904-4,131 UP 3,824 0,622-11,613 UP
FABP3 2,512 0,656- 8,56 1,42 0,247 - 7,227
FABP4 2,099 0,317-21,54 0,635 0,245 - 2,848
Síntesis de triglicéridos
DGAT1 2,821 0,303-13,666 13,99 1,617-55,742 UP
DGAT2 1,117 0,190-12,477 20,26 3,898-69,142 UP
LPIN1 0,216 0,086-0,463 DOWN 2,338 0,837 - 7,286 UP
Formación de glóbulos de grasa
PLIN2 1,228 0,282 - 5,54 4,811 1,849-12,244 UP
Regulación de la transcripción
INSIG1 1,103 0,196 - 3,51 0,935 0,159 - 2,972
SCAP 0,305 0,057 - 2,12 1,473 0,129-17,374
SREBF1 0,371 0,091 - 2,32 7,777 0,614 -140,607
UP
THRSP 2,543 0,225-131,93 0,259 0,012 - 4,184
ER: Expresión relativa; EE: Error estándar; Down: Regulación a la baja; UP: regulación
al alza.
50
Tabla 10: comparación en el tiempo de la expresión relativa dentro del grupo OO
comparado con el día 21 del estudio
Día 42
Día 63
Genes ER EE Resultado ER EE Resultado
Ingreso de ácidos grasos a la célula
LPL 2,429 0.883 - 7.908 UP 0,458 0.168 - 1.516 DOWN
VLDLR 0,246 0.063 - 1.089 DOWN 0,528 0.167 - 1.514
Síntesis y desaturación de ácidos grasos
ACACA 19,80 0.478 - 4,912.8 UP 2,286 0.356 - 18.930
FASN 1,994 0.168 - 74.288
0,041 0.002 - 0.515 DOWN
SCD 0,881 0.367 - 2.172
2,337 0.369 - 21.641
Activación y transporte intracelular de acetato y ácidos grasos
ACSL1 28,49 4.217 -180.201 UP 0,705 0.140 - 2.961
ACSS2 2,636 0.734 - 16.940 0,268 0.044 - 2.152 DOWN
FABP3 1,512 0.260 - 5.239 0,489 0.089 - 1.677
FABP4 1,181 0.390 - 3.941 2,206 0.293 - 13.372
Síntesis de triglicéridos
DGAT1 7,379 2.437 - 23.592 UP 0,168 0.022 - 1.072 DOWN
DGAT2 1,455 0.306 - 14.246 0,147 0.017 - 0.806 DOWN
LPIN1 2,442 0.469 - 14.763 0,537 0.122 - 2.350
Formación de glóbulos de grasa
PLIN2 2,326 1.296 - 4.679 UP 0,579 0.168 - 1.900
Regulación de la transcripción
INSIG1 1,148 0.072 - 17.507 0,959 0.039 - 25.668
SCAP 1,13 0.164 - 6.585 0,322 0.028 - 2.949
SREBF1 0,593 0.098 - 9.093 0,136 0.025 - 0.992 DOWN
THRSP 0,915 0.245 - 3.531 0,186 0.043 - 1.169 DOWN
ER: Expresión relativa; EE: Error estándar; Down: Regulación a la baja; UP: regulación
al alza.
4. Limitantes y factores por considerar para la interpretación de los resultados
Se utilizó en un comienzo el reactivo RNAlater (Sigma-Aldrich, Francia), el cual, de
acuerdo con la información entregada por el fabricante, es un reactivo que se utiliza una
vez que la muestra es obtenida y permite tener un mayor tiempo antes de procesarlas,
ya que este reactivo estabiliza y protege al ARN de manera que no se afecta la cantidad
ni la calidad del ARN (Sigma- Aldrich, 2016). Sin embargo, las muestras del período 0
precipitaron al momento de realizar la extracción de ARN, impidiendo su posterior
análisis.
51
Por lo tanto, a partir del periodo 1 (día 21) se comenzó a utilizar TRIzol reagent (Qiagen).
Éste es un reactivo que inhibe la acción de la enzima ARNasa, destruye las células y
sus componentes, manteniendo así la integridad del ARN que se quiere evaluar
(ThermoFisher, 2019).
En cada muestreo se extrajeron 400 ml de leche, de los cuales se utilizaban para el
aislamiento de células epiteliales 200 ml, a partir de esto finalmente se obtenía una
concentración de ARN que era suficiente para poder ser analizado mediante qPCR, sin
embargo, lo aislado no lo era para poder evaluar también la integridad del ARN (RIN).
Este procedimiento que se realiza mediante electroforesis y hubiese sido ideal realizarlo
debido a que permite comparar las muestras, independiente del instrumento utilizado,
su concentración y el operador a cargo de analizarlas (Mueller et al., 2016).
El valor de RIN, que representa la relación entre los ribosomas 28S y 18S (Fleige y Pfaffl,
2006a), se encuentra en un rango de 1 a 10, siendo 1 muy degradado y 10 una muestra
intacta, se recomienda que este valor sea al menos de 5 (Fleige y Pfaffl, 2006b), aunque
Boutinaud et al. (2015) indican que lo mínimo aceptado en casos de células epiteliales
de la leche debería ser 8. Evaluar la pureza y la integridad del ARN son elementos claves
que podrían determinar el éxito de un estudio basado en ARN, considerando que en
algunos casos entre que se tomó la muestra y se aislaron las células epiteliales
transcurrieron varias horas lo que pudo afectar la integridad del ARN obtenido, ya que
estas muestras son muy sensibles a los procedimientos, manipulaciones y
almacenamiento inadecuados (Pérez-Novo et al., 2005), y que desde que la muestra es
obtenida comienzan a actuar las ribonucleasas presentes en la leche, y estas generan
una mayor susceptibilidad del ARN a la degradación (Boutinaud et al., 2015), es por esto
que una de las preocupaciones durante la manipulación de las muestras fue utilizar
productos libres de ARNasa y respetar en lo posible las temperaturas indicadas por los
protocolos utilizados y los fabricantes de los reactivos empleados en cada procedimiento
realizado.
Por último, la selección del software REST, se debe a que es una herramienta bastante
utilizada, que está disponible para Microsoft Windows, tiene la ventaja de que se puede
incorporar múltiples genes de referencia (o House Keeping en inglés) para realizar la
normalización de los datos, permite hacer gráficos a partir de los resultados e incluye
52
métodos para análisis estadístico luego de obtener la cuantificación y la normalización
de los resultados. A diferencia de otros métodos disponibles, como LinReg PCR, no
calcula los valores de Cq a partir de la fluorescencia ni calcula la eficiencia de la
amplificación, y tiene la desventaja además de generar actualizaciones bastante
espaciadas en el tiempo, siendo su última actualización del año 2009 (Pabinger et al.,
2014).
53
CONCLUSIONES
La suplementación con AG de distinto grado de saturación generó cambios a nivel de
las siguientes funciones: activación de AG, transporte intracelular, formación de glóbulo
de grasa y en el factor de transcripción, SREBF1. El comportamiento de los grupos
Control y HVO son similares a lo largo del estudio, mientras que en OO se produce un
comportamiento contrario, teniendo HVO un mayor efecto lipogénico que OO.
Las diferencias observadas se deben a que la suplementación con AG insaturados (OO)
genera supresión de este gen regulador de la transcripción, mientras que los AG
saturados (HVO) genera una regulación al alza de dicho gen. Lo cual provoca una
alteración en la síntesis de novo de los AG en la glándula mamaria, observándose en
OO una reducción en la leche de los AG de cadena corta y media.
Aún son escasos los estudios que permitan explicar el comportamiento de los genes
involucrados en el metabolismo de la producción y secreción de grasa láctea en períodos
prolongados de tiempo.
54
RESUMEN
Diversos genes participan regulando el contenido de la grasa láctea, desde la captación
de ácidos grasos (AG) desde el torrente sanguíneo hasta la secreción de la gota lipídica
al alveolo glandular. El objetivo fue determinar la expresión de genes relacionados con
el metabolismo y secreción de grasa láctea en la glándula mamaria en vacas
suplementadas con AG de distintos grados de saturación. Durante 63 días 15 vacas
multíparas (189 ± 28 días en lactancia), fueron divididas en 3 grupos según condición
corporal: Control sin suplementación, aceite de oliva (OO) y aceite hidrogenada de palma
(HVO; ambos 30 g de aceite/ kg de MS). Cada 21 días se analizó el perfil de AG de la
leche por cromatografía de gases, y mediante qPCR se estudió la expresión relativa de
17 genes candidatos. No hubo diferencias en ingesta de alimento, peso ni condición
corporal. OO produjo 9,7% más de leche y presentó disminución en AG de cadena media
y aumento AG de 18 carbonos. Suplementar con OO produjo aumento en la expresión
de PLIN2 y THRSP, mientras HVO generó una regulación a la baja de este último durante
el día 63 así como también disminución de FABP3 y FABP4. Como conclusión,
suplementar con AG afecta las activación de AG, transporte intracelular, formación de
glóbulo de grasa y un factor de transcripción (SREBF1). Este último se suprime por
acción de AGPI y se regula al alza por acción de AGS, por lo tanto, HVO tendría mayor
efecto lipogénico que OO.
Palabras claves: expresión génica, ácidos grasos, bovinos, células somáticas.
55
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
Anexo 1: Entrega de alimento con carro forrajero
Anexo 2: Administración de tratamientos en la ración (en la foto: HVO)
67
Anexo 3: Obtención de muestra de leche
68
Anexo 4: Perfil AG leche grupo control por período (g/ 100g de AG totales)
Ácido graso Día 21 Día 42 Día 63 Sig.
C4:0 4,70 ± 0,86 4,35 ± 0,36 4,51 ± 0,35 0,64
C6:0 2,81 ± 0,83 3,03 ± 0,27 2,62 ± 1,44 0,80
C8:0 2,43 ± 1,52 1,82 ± 0,27 1,75 ± 0,44 0,47
C10:0 3,71 ± 2,43 4,43 ± 1,20 4,45 ± 1,11 0,74
C11:0 0,25 ± 0,08 0,26 ± 0,07 0,26 ± 0,08 0,98
C12:0 5,26 ± 1,54 5,35 ± 0,84 5,20 ± 1,03 0,98
C13:0 0,24 ± 0,32 0,09 ± 0,05 0,14 ± 0,06 0,49
C14:0 15,86 ± 2,40 16,10 ± 0,88 15,64 ± 0,86 0,90
C14:1 0,81 ± 0,28 0,70 ± 0,07 1,03 ± 0,39 0,20
C15:0 0,68 ± 0,45 0,75 ± 0,52 1,43 ± 0,39 0,04
C15:1 1,00 ± 0,44 1,19 ± 0,24 0,53 ± 0,37 0,03
C16:0 39,85 ± 4,15 40,72 ± 2,62 41,67 ± 2,93 0,69
C16:1 0,73 ± 0,44 1,37 ± 0,47 1,70 ± 0,43 0,02
C17:0 0,70 ± 0,54 0,50 ± 0,19 0,64 ± 0,09 0,65
C17:1 0,51 ± 0,12 0,52 ± 0,17 0,19 ± 0,11 <0,01
C18:0 4,28 ± 2,08 5,35 ± 2,20 5,52 ± 3,03 0,70
C18:1n11t 0,52 ± 0,39 0,14 ± 0,32 0,02 ± 0,04 0,04
C18:1n9c 11,89 ± 6,22 7,78 ± 4,99 5,49 ± 4,23 0,19
C18:2n6t 0,96 ± 0,67 1,80 ± 1,05 2,83 ± 1,16 0,03
C18:2n6c 0,59 ± 0,40 1,13 ± 1,06 1,65 ± 0,64 0,13
C20:0 0,31 ± 0,40 0,06 ± 0,09 0,24 ± 0,25 0,38
C20:1n9 nd 0,20 ± 0,45 0,13 ± 0,29 0,59
C18:3n6 0,60 ± 0,31 0,93 ± 0,61 0,64 ± 0,22 0,41
C18:3n3 0,78 ± 0,74 0,92 ± 0,56 1,15 ± 0,49 0,64
C18:2c9t11 0,16 ± 0,20 0,07 ± 0,07 0,09 ± 0,10 0,51
C20:2 nd 0,05 ± 0,10 nd 0,31
C22:0 nd 0,06 ± 0,13 nd 0,40
C20:3n3 0,14 ± 0,11 0,11 ± 0,08 0,22 ± 0,09 0,19
C20:3n6 0,23 ± 0,23 0,18 ± 0,12 0,26 ± 0,09 0,73
AGS 81,08 ± 8,17 82,89 ± 3,84 84,06 ± 6,66 0,77
AGMI 15,46 ± 6,83 11,90 ± 4,16 9,10 ± 4,50 0,21
AGPI 3,46 ± 1,65 5,20 ± 3,17 6,84 ± 2,50 0,15
n3 0,92 ± 0,67 1,04 ± 0,51 1,37 ± 0,53 0,47
n6 2,38 ± 1,05 4,04 ± 2,61 5,38 ± 2,02 0,10
n6/n3 3,43 ± 2,02 3,65 ± 1,02 3,96 ± 0,91 0,84
AGPI/AGS 0,04 ± 0,03 0,06 ± 0,04 0,08 ± 0,04 0,26
IA 4,69 ± 1,72 4,08 ± 0,59 4,08 ± 1,08 0,67
AT 4,63 ± 1,44 4,62 ± 0,58 4,85 ± 1,09 0,93
AGMI: ácidos grasos monoinsaturados; AGPI: ácidos grasos poliinsaturados; n3: AGPI omega 3; n6: AGPI omega 6; IA: índice aterogénico; IT: índice trombogénico; nd: no detectado
69
Anexo 5: Perfil AG leche vacas suplementadas con aceite de oliva por período (g/ 100 g de AG totales)
Ácido graso Día 21 Día 42 Día 63 Sig.
C4:0 3,72 ± 1,24 4,33 ± 0,71 4,14 ± 1,04 0,63
C6:0 2,46 ± 0,89 2,71 ± 0,53 2,30 ± 0,73 0,68
C8:0 1,35 ± 0,53 1,41 ± 0,48 1,18 ± 0,51 0,76
C10:0 3,44 ± 0,97 3,81 ± 1,24 3,08 ± 1,21 0,61
C11:0 0,18 ± 0,05 0,18 ± 0,06 0,16 ± 0,05 0,74
C12:0 4,17 ± 0,72 4,45 ± 1,29 3,81 ± 0,97 0,62
C13:0 0,11 ± 0,04 0,10 ± 0,06 0,12 ± 0,03 0,74
C14:0 15,62 ± 1,74 15,20 ± 2,91 14,56 ± 2,23 0,78
C14:1 1,00 ± 0,60 0,83 ± 0,54 1,06 ± 0,48 0,78
C15:0 0,52 ± 0,38 0,44 ± 0,12 1,24 ± 0,22 0,00
C15:1 1,01 ± 0,47 0,89 ± 0,45 0,25 ± 0,21 0,02
C16:0 41,03 ± 3,11 40,27 ± 4,94 40,59 ± 3,73 0,96
C16:1 0,74 ± 0,59 1,55 ± 1,39 1,91 ± 1,41 0,32
C17:0 1,31 ± 1,23 0,64 ± 0,40 0,58 ± 0,09 0,28
C17:1 0,47 ± 0,17 0,50 ± 0,19 0,44 ± 0,16 0,84
C18:0 3,71 ± 1,81 3,63 ± 3,22 5,25 ± 1,38 0,47
C18:1n11t 1,01 ± 0,81 0,04 ± 0,09 nd 0,01
C18:1n9c 11,63 ± 7,87 13,73 ± 10,94 11,22 ± 9,34 0,90
C18:2n6t 2,39 ± 0,93 1,76 ± 0,60 3,37 ± 0,84 0,02
C18:2n6c 1,34 ± 0,87 0,33 ± 0,46 1,53 ± 0,42 0,02
C20:0 nd nd 0,38 ± 0,56 0,15
C20:1n9 nd nd 0,14 ± 0,31 0,40
C18:3n6 0,39 ± 0,18 0,75 ± 0,14 0,64 ± 0,15 0,01
C18:3n3 1,32 ± 0,43 1,02 ± 0,69 1,30 ± 0,59 0,66
C18:2c9t11 0,44 ± 0,04 0,48 ± 0,36 0,18 ± 0,21 0,14
C20:3n3 0,34 ± 0,18 0,34 ± 0,22 0,19 ± 0,04 0,29
C20:3n6 0,30 ± 0,12 0,60 ± 0,70 0,25 ± 0,13 0,39
AGS 77,61 ± 7,68 77,18 ± 10,10 77,40 ± 8,93 1,00
AGMI 15,86 ± 7,99 17,54 ± 10,75 15,14 ± 9,89 0,92
AGPI 6,53 ± 1,30 5,28 ± 1,60 7,47 ± 1,62 0,11
n3 1,66 ± 0,57 1,36 ± 0,73 1,49 ± 0,60 0,76
n6 4,43 ± 1,15 3,44 ± 1,28 5,80 ± 1,25 0,03
n6/n3 2,90 ± 1,05 2,76 ± 1,06 4,33 ± 1,49 0,12
AGPI/AGS 0,08 ± 0,02 0,07 ± 0,02 0,10 ± 0,02 0,08
IA 3,51 ± 0,92 3,64 ± 1,18 3,09 ± 0,98 0,69
AT 3,95 ± 1,05 3,97 ± 1,28 3,78 ± 1,01 0,96
AGS: ácidos grasos saturados; AGMI: ácidos grasos monoinsaturados; AGPI: ácidos grasos poliinsaturados; n3: AGPI omega 3; n6: AGPI omega 6; IA: índice aterogénico; IT: índice trombogénico; nd: no detectado
70
Anexo 6: Perfil de AG de leche de vacas suplementadas con aceite hidrogenada de
palma (g/ 100 g de AG totales)
Ácido graso Día 21 Día 42 Día 63 Sig.
C4:0 4,23 ± 0,62 4,29 ± 0,80 4,21 ± 0,84 0,99
C6:0 2,87 ± 0,41 2,98 ± 0,46 2,93 ± 0,58 0,94
C8:0 1,67 ± 0,29 1,79 ± 0,29 1,59 ± 0,23 0,50
C10:0 4,50 ± 0,67 4,69 ± 1,95 4,00 ± 0,57 0,66
C11:0 0,28 ± 0,08 0,27 ± 0,07 0,26 ± 0,05 0,94
C12:0 5,24 ± 0,74 5,41 ± 0,48 4,54 ± 0,64 0,11
C13:0 0,08 ± 0,06 0,12 ± 0,06 0,10 ± 0,02 0,38
C14:0 15,95 ± 1,36 16,55 ± 1,58 13,68 ± 2,02 0,04
C14:1 0,87 ± 0,12 0,84 ± 0,13 0,75 ± 0,19 0,44
C15:0 0,74 ± 0,36 0,63 ± 0,54 0,64 ± 0,25 0,89
C15:1 0,78 ± 0,38 0,74 ± 0,18 0,53 ± 0,47 0,52
C16:0 40,53 ± 1,95 42,72 ± 3,38 37,18 ± 8,19 0,28
C16:1 0,76 ± 0,40 1,20 ± 0,33 0,80 ± 0,57 0,26
C17:0 0,58 ± 0,54 0,34 ± 0,08 0,37 ± 0,09 0,47
C17:1 0,44 ± 0,07 0,40 ± 0,12 0,38 ± 0,18 0,78
C18:0 4,56 ± 2,08 1,96 ± 0,80 4,59 ± 1,93 0,05
C18:1n11t 0,85 ± 0,56 0,20 ± 0,24 nd 0,01
C18:1n9c 10,03 ± 5,43 11,05 ± 4,17 5,58 ± 4,28 0,19
C18:2n6t 1,19 ± 0,96 1,10 ± 0,92 1,17 ± 0,57 0,98
C18:2n6c 0,56 ± 0,23 0,51 ± 0,40 0,66 ± 0,54 0,85
C20:0 0,61 ± 0,42 0,24 ± 0,53 0,20 ± 0,28 0,28
C20:1n9 nd nd 0,35 ± 0,37 0,04
C18:3n6 0,48 ± 0,23 0,59 ± 0,18 0,55 ± 0,30 0,76
C18:3n3 0,70 ± 0,28 0,67 ± 0,12 0,78 ± 0,91 0,95
C18:2c9t11 0,81 ± 0,53 0,31 ± 0,41 0,14 ± 0,26 0,06
C20:3n3 0,28 ± 0,20 0,19 ± 0,09 0,40 ± 0,33 0,35
C20:3n6 0,41 ± 0,30 0,19 ± 0,06 0,46 ± 0,35 0,28
AGS 81,84 ± 6,57 82,00 ± 5,24 74,27 ± 13,41 0,34
AGMI 13,73 ± 5,28 14,43 ± 4,22 8,38 ± 4,76 0,13
AGPI 4,43 ± 1,86 3,57 ± 1,56 4,17 ± 2,14 0,76
n3 0,98 ± 0,33 0,86 ± 0,17 1,19 ± 1,03 0,71
n6 2,64 ± 1,45 2,40 ± 1,44 2,84 ± 1,66 0,90
n6/n3 2,82 ± 1,51 2,70 ± 1,21 2,98 ± 1,47 0,95
AGPI/AGS 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,02 0,05 ± 0,02 0,73
IA 4,42 ± 1,28 5,21 ± 1,35 4,95 ± 1,29 0,63
AT 4,72 ± 1,16 5,27 ± 1,25 5,12 ± 1,03 0,74
AGS: ácidos grasos saturados; AGMI: ácidos grasos monoinsaturados; AGPI: ácidos grasos poliinsaturados; n3: AGPI omega 3; n6: AGPI omega 6; IA: índice aterogénico; IT: índice trombogénico; nd: no detectado.
71
Anexo 7: Expresión relativa de genes involucrados en el metabolismo de AG en células
somáticas de la glándula mamaria de vacas suplementadas con aceite de oliva (OO) con
relación al grupo Control.
Gen Día Expresión Error estándar Valor P Resultado
ACACA 21 0,334 0.041 - 2.591 0,077
42 20,079 0.244 - 711.375 0,07
63 0,307 0.038 - 2.074 0,076
PLIN2 21 2,485 0.433 - 7.416 0,059
42 8,079 1.666 - 77.219 0 UP 63 0,639 0.231 - 2.658 0,319
THRSP 21 54,151 21.098 - 146.235 0 UP 42 91,637 26.148 - 402.981 0 UP 63 1,252 0.005 - 72.772 0,859
FABP3 21 1,266 0.294 - 3.534 0,565
42 1,266 0.200 - 13.812 0,713
63 0,586 0.206 - 3.130 0,199
FABP4 21 0,472 0.112 - 2.295 0,159
42 1,009 0.200 - 7.091 0,986
63 0,7 0.158 - 3.246 0,514
UP: regulación al alza; DOWN: regulación a la baja
72
Anexo 8: Expresión relativa de genes involucrados en el metabolismo de AG en células
somáticas de la glándula mamaria de vacas suplementadas con aceite hidrogenada de
palma (HVO) en relación al grupo Control.
Gen Día Expresión Error Estándar Valor P Resultado
ACACA 21 0,225 0.022 - 3.169 0,051
42 2,021 0.114 - 54.081 0,506
63 0,608 0.119 - 2.447 0,349
PLIN2 21 0,842 0.223 - 3.708 0,732
42 1,445 0.199 - 21.925 0,555
63 1,799 0.623 - 4.701 0,069
THRSP 21 1,722 0.079 - 27.974 0,531
42 8,096 1.274 - 30.976 0 UP 63 0,055 0.000 - 1.343 0,018 DOWN
FABP3 21 0,349 0.089 - 1.170 0,007 DOWN 42 0,579 0.170 - 2.806 0,23
63 0,468 0.143 - 2.135 0,076
FABP4 21 1,076 0.166 - 5.086 0,891
42 4,089 0.438 - 19.307 0,053
63 0,459 0.185 - 1.455 0,047 DOWN
UP: regulación al alza; DOWN: regulación a la baja
