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CARACTERIZACION DE LA RESISTENCIA A METICILINA EN CEPAS DE S.
aureus AISLADAS DE PACIENTES HOSPITALIZADOS EN EL
HOSPITAL GENERAL DE MEDELLÍN
AGOSTO DE 2009 A FEBRERO DE 2010
Presentado por
Dora Eugenia Rivas Rendón
Alejandra María Marín Giraldo
Asesor Temático: Clara María Duque Restrepo
Asesor Metodológico: Doctor Álvaro Quintero
Asesor Metodológico: Ángela María Gaviria Núñez
Hospital General de Medellín Luz Castro de Gutiérrez
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia
Facultad de Ciencias de la salud.
Especialización en Microbiología Clínica
Medellín 2010
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CARACTERIZACION DE LA RESISTENCIA A METICILINA EN CEPAS DE S.
aureus AISLADAS DE PACIENTES HOSPITALIZADOS EN EL
HOSPITAL GENERAL DE MEDELLÍN
AGOSTO DE 2009 A FEBRERO DE 2010
Dora Eugenia Rivas Rendón
Alejandra María Marín Giraldo
Investigación para optar al título de Especialistas en Microbiología Clínica
Asesor Temático: Clara María Duque Restrepo
Asesor Metodológico: Doctor Álvaro Quintero Posada
Asesor Metodológico: Ángela María Gaviria Núñez
Hospital General de Medellín Luz Castro de Gutiérrez
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia
Facultad de Ciencias de la salud.
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Nota de aceptación
___________________________________
___________________________________
___________________________________
Presidente del jurado
___________________
Jurado
___________________
Jurado
_________ _____ ______ _____
Ciudad día mes año
4
AGRADECIMIENTOS
Hospital General de Medellín. Luz Castro de Gutiérrez E S E.
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia.
Asesor Temático: Clara María Duque Restrepo
Asesor Metodológico: Doctor Álvaro Quintero Posada
Asesor Metodológico: Ángela María Gaviria Núñez
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TABLA DE CONTENIDO
1. LISTA DE TABLAS
2. LISTA DE GRAFICOS
3. LISTA DE ANEXOS
4. GLOSARIO
5. RESUMEN
6. INTRODUCCION 1
7. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 2
8. PREGUNTA DE INVESTIGACION 3
9. JUSTIFICACION 3
10. MARCO CONCEPTUAL 4
10.1 GENERALIDADES 4
10.2 HISTORIA DE LA RESISTENCIA 5
10.3 VIRULENCIA 5
11. OBJETIVOS 7
11.1 OBJETIVO GENERAL 7
11.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 7
12. METODOLOGIA 8
12.1 DISEÑO DEL ESTUDIO 8
12.2 DISEÑO MUESTRAL 8
12.3 TECNICAS E INSTRUMENTOS 8
12.4 RECOLECCION DE MUESTRAS 9
12.5 PROCESAMIENTO, IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD 9
12.6 CONSERVACION DE CEPAS 10
12.7 EXTRACCION DEL DNA 10
6
13.ASPECTOS ETICOS SOBRE EL MANEJO DE LA INFORMACION 12
14. RESULTADOS 12
15DISCUSION 19
16RECOMENDACIONES 20
17. CONCLUSION 21
ANEXOS 22
BIBLIOGRAFIA 32
7
1. LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Indicadores y tamaño del producto de amplificación.
Tabla 2. Perfil fenotípico de las cepas SAMR
8
2. LISTA DE GRAFICOS
Gráfico 1. Perfil de sensibilidad de SARM
Gráfico 2. Clasificación de las infecciones.
Gráfico 3. Frecuencia de las edades de los pacientes con aislamientos de
SARM.
9
3. LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Captura de datos de la historia clínica.
Anexo 2. Tabla de sistematización
Anexo 3. Cronograma de actividades.
10
4. GLOSARIO
FENOTIPO: Características expresadas por un organismo y determinado
por sus genes, es producto de la interacción con el medio ambiente donde
se desarrolla.
GENOTIPO: Composición genética de un organismo.
GISA: Glycopeptide Intermediate Staphylococus aureus.
SAMR: Staphylococcus aureus meticilino - resistente.
SAMR-C: Staphylococcus aureus meticilino-resistente de origen
comunitario.
SAMR-H: Staphylococcus aureus meticilino-resistente de origen
hospitalario.
VISA: Vancomycin Intermediate Staphylococus aureus.
11
5. RESUMEN.
Se realizó un estudio de tipo prospectivo transversal para caracterizar las
cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina con base a su
fenotipo y técnica molecular de PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
en el Hospital General de Medellín, en un periodo comprendido entre el 1
de agosto de 2009 al 1 febrero de 2010.
Se obtuvo un total de 34 aislamientos, de los cuales 55.9% presentaron
patrón de sensibilidad sugestivo de Staphylococcus aureus meticilino -
resistente de origen hospitalario (SAMR-H) y 44.1% con patrón fenotípico
sugestivo de Staphylococcus aureus meticilino-resistente de origen
comunitario (SAMR-C).
El mecanismo más importante de la resistencia a meticilina es la expresión
genética de una proteína de unión a la penicilina (PBP) denominada PBP2a
(Penicillin Blindig Protein 2a), la cual es codificada por el gen cromosomal
mecA caracterizada por tener muy baja afinidad a los B-lactámicos.
Staphylococcus aureus es un microorganismo de fácil diseminación, que ha
incorporado múltiples factores de virulencia. La capacidad de este
microorganismo de adquirir factores de resistencia por transferencia
horizontal entre su misma especie y de otras diferentes le permite sobrevivir
a la acción de una gran variedad de antibióticos, por lo tanto se debe tener
precaución al administrar tratamientos empíricos sin realizar un estudio
previo de laboratorio.
1
6. INTRODUCCIÒN.
Staphylococcus aureus meticilino - resistente es considerado un importante
patógeno causante de múltiples infecciones comunitarias y nosocomiales.
El reporte del primer mecanismo de resistencia data de 1941, un año
después de la introducción de la penicilina como antibiótico para el
tratamiento de infecciones por este microorganismo. En 1959 se introduce
la meticilina y en 1961 se registra la primera cepa meticilino-resistente en
el reino unido en aislamientos nosocomiales.
A partir de 1990 se ha venido reportando la presencia de una nueva cepa
(no menos agresiva), que difiere de los aislamientos previos, caracterizada
por presentar resistencia a la meticilina y sensibilidad a una amplia gama de
antibióticos, los mecanismos que originaron estas cepas siguen siendo
motivos de controversia. En 1996 y 1997 se reportaron las primeras cepas
con sensibilidad disminuida a glicopeptidos (Vancomicina y Teicoplanina)
VISA (Vancomycin Intermediate S.aureus) y GISA (Glycopeptide
Intermediate S.aureus).
Este es el primer estudio realizado en el Hospital General de Medellín sobre
la caracterización de las cepas de Staphylococcus aureus meticilino -
resistentes en base a su fenotipo y demostración de la banda de 967pb
correspondiente a un fragmento del gen mecA, confirmándose así la
resistencia de las cepas estudiadas.
Esta investigación hace parte de un macro proyecto en el cual se estudia
además la presencia de S. aureus meticilino-resistente en pacientes
inmunosuprimidos (pacientes con VIH) y S. aureus meticilino - resistente en
portadores sanos.
2
7. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Staphylococcus aureus meticilino-resistente ha emergido durante los
últimos años como un microorganismo de gran importancia debido a la
agresividad y patogenicidad que presenta (1).
A nivel mundial se ha evidenciado un marcado incremento en la resistencia
de los microorganismos a los antibióticos, no solo en los centros de salud
sino también entre la comunidad sin factores de riesgo aparentes (2, 3,12).
Como parte de una estrategia global de vigilancia de la resistencia en 1996
y 1998 se realizó en nuestro país el primer estudio sobre la caracterización
molecular de SAMR en cepas aisladas de hospitales de Bogotá y Manizales
(3).
En el año 2005 Cruz y colaboradores publican los resultados de su estudio
realizado en muestras provenientes en su mayoría de hospitales de Bogotá
y Cali, demostrando un cambio en la población genética del MRSA,
encontrando el patrón correspondiente al clon chileno en la mayoría de
esas cepas, hallazgo muy significativo, pues hasta entonces se tenía
conocimiento únicamente del clon pediátrico circulando en el país al igual
que en otras regiones del mundo (Europa, Nueva York y Sur América) (3).
En 2009 Yomayusa y colaboradores estudiaron cepas de SAMR
provenientes de 7 hospitales generales de varios departamentos y desde el
punto de vista molecular confirmaron la presencia del clon chileno como el
predominante en Colombia (5).
Se ha encontrado además otro cambio en el perfil de las infecciones,
reportándose la presencia de S. aureus sugestivo de origen comunitario
causando infecciones agresivas con implicaciones importantes en salud
pública, como demuestran Cortes y colaboradores (1).
En Medellín se conocen muy pocos estudios sobre la caracterización de las
cepas de SAMR de origen nosocomial y comunitario (3).
3
Londoño, Ortiz y Gaviria en la unidad de terapia intensiva de la Universidad
Bolivariana determinaron la presencia de S. aureus resistente a la meticilina
en personal de la salud, encontrando una significativa prevalencia de este
microorganismo en las fosas nasales (6).
Teniendo en cuenta que no se ha realizado hasta la fecha un estudio que
combine métodos moleculares y tradicionales en la identificación de los
aislamientos de SARM en el HOSPITAL GENERAL DE MEDELLIN, se
efectuó la caracterización de la resistencia a meticilina en cepas de S.
aureus entre el 1 de agosto de 2009 al 1 febrero de 2010.
8. PREGUNTA DE INVESTIGACION
¿Cómo está caracterizada la resistencia a meticilina de cepas de S. aureus
en el Hospital General de Medellín en un periodo comprendido entre el 1 de
agosto de 2009 al 1 de febrero de 2010?
9. JUSTIFICACION
El desarrollo de las cepas de Staphylococcus aureus meticilino - resistentes
con características propias a la respuesta antimicrobiana, obligan a realizar
trabajos de investigación en este campo y difundir el conocimiento frente a
esta situación.
En nuestro país el uso de antibióticos no está regulado, lo que facilita el
desarrollo de múltiples mecanismos de resistencias; la presencia de SAMR
a nivel hospitalario es alto y poco se conoce de su comportamiento en la
comunidad por lo tanto es conveniente realizar estudios de caracterización
para tener mayor conocimiento de la epidemiologia molecular, establecer
medidas de prevención y control y evaluar el cambio o no del perfil del
microorganismo a través del tiempo.
4
10. MARCO CONCEPTUAL
10.1 GENERALIDADES
Staphylococcus aureus es uno de los principales microorganismos causantes
de enfermedad en el humano, pertenece a la familia Microccocaceae del
genero Staphylococcus. Es responsable de una gran cantidad de patologías
que abarcan desde infecciones en la piel y vías urinarias, hasta infecciones
sistémicas y de tejidos blandos que comprometen la vida del paciente.
S. aureus posee características de virulencia propias y se ha encontrado en
portadores sanos implicando un riesgo de diseminación en la comunidad (7).
Crece rápidamente en agar sangre y en medios con altas concentraciones de
sal, NaCl al 4%; presenta colonias de 1 a 3 mm brillantes, cremosas y con un
ligero pigmento amarillo gracias a la presencia de carotenoides, algunas
pueden ser hemolíticas, son catalasa positivo, su capacidad para coagular el
plasma se ha utilizado para diferenciarlo de otras especies de Staphylococcus
coagulasa negativo (7).
Las cepas de S. aureus resistentes a meticilina (SARM) presentan una
resistencia cruzada a todos los demás antimicrobianos betalactamicos
incluyendo cefalosporinas y carbapenemicos.
Las cepas nosocomiales que presentan esta resistencia y además a otras
familias de antibióticos derivadas de la presión selectiva por los medicamentos
en los centros de salud, se les denomina (SARM-H) S. aureus Resistente a
meticilina de origen hospitalario o nosocomial (8).
5
Existe otro grupo de S. aureus resistente a meticilina, con tendencia a ser
menos resistente pero no menos agresivo que las cepas de origen hospitalario,
a este grupo de microorganismos se les ha denominado (SARM-C) S. aureus
porque tienen o tuvieron su inicio en la comunidad, en niños, adultos y
ancianos, que carecían de factores de riesgo aparente para esta infección (8,
10,11).
10.2 HISTORIA DE LA RESISTENCIA
En 1940 se introduce por primera vez la penicilina para tratar infecciones
causadas por S.aureus, reportándose al año siguiente el inicio de la resistencia
a esta. En los años 50 se introducen los primeros betalactamicos estables a la
acción de la penicilinasa: cefalosporinas de primera generación y la meticilina
semisintetica observándose en 1961 las primeras cepas de SAMR (3), durante
el año de 1968 se reporta el primer brote por SAMR (USA); las cepas de
S.aureus se diseminaron paulatinamente a través del tiempo y en 1980 SARM
es endémico en hospitales de todo el mundo. En 1996 y 1997 se reportaron las
primeras cepas VISA y GISA respectivamente (3). Para el 2002 se informa
VRSA (S.aureus resistente a vancomicina) y durante el 2003 se presenta una
diseminación del SAMR-C, causando preocupación y alerta en los centros de
salud a nivel mundial (12).
10.3 VIRULENCIA
Los mecanismos de virulencia del microorganismo tienen características
propias en la pared celular, enzimas (catalasa, coagulasa, hialuronidasa,
penicilinasa y otras enzimas) que hidrolizan los ácidos nucleicos.
Toxinas, Hemolisinas y la Leucocidina PVL (descrita por primera vez por
Panton y Valantine en 1934) con capacidad hemolítica y citolitica que además
favorecen la invasión a los tejidos en pacientes que presentan deterioro del
sistema inmune (2).
6
La Leucocidina de Panton Valentine (PVL) es una proteína que forma poros en
la membrana de los leucocitos (monocitos, macrófagos y polimorfo nucleares)
provocando un aumento en la permeabilidad y lisis celular, está presente en
menos del 5% de las cepas (2,7).
La resistencia a la meticilina en S. aureus está dada por la adquisición
horizontal del gen mecA y se encuentra unido al DNA, es conocido como
casete cromosomal ( Staphylococcal chromosome cassette mec, CCCmec)
que se inserta en un sitio especifico del cromosoma bacteriano (att BSCC)
cerca del origen de replicación, característica esta que le permite replicarse y
transcribir los genes de resistencia importados(2,3).
El casete cromosómico SCCmec tiene 3 componentes genéticos
importantes:
Complejo de genes mec: compuesto por el gen mecA y sus genes
reguladores mecR y mecI (se cree que confieren mayor expresión de PBP2a).
En base a su estructura se han encontrado 4 clases de complejo mec: A, B, C,
D, las clases A y B son comunes en S.aureus, la clase C en S. haemolyticus y
algunas cepas de S.aureus y la D en S. hominis.
Complejo de genes ccr: compuesto por genes que codifican recombinasas
responsables de la movilización del SCCmec.
Región J (junkyard) que comprende 3 fragmentos J1,J2,J3 que pueden
contener plásmidos o transposones portadores de genes de resistencia a
antibióticos no B-lactámicos y metales pesados como el mercurio (2, 3).
Existen 5 tipos de casete cromosomal que van del I al V y se diferencian uno
del otro por su resistencia a los antibióticos y por el lugar y año de aislamiento
(7), los tipos I, II, III son asociados a infecciones nosocomiales y los tipos IV y
V asociados a cepas de la comunidad (2) Sin embargo en un estudio realizado
en Irlanda por Shore Anna y col. presentan 7 tipos de casete cromosomal (23).
7
11. OBJETIVOS
11.1 OBJETIVO GENERAL
Caracterizar la resistencia a meticilina en cepas de S aureus mediante la
identificación fenotípica y molecular por PCR (Reacción en cadena de
polimerasa), en el Hospital General de Medellín entre el 1 de agosto de 2009
al 1 febrero de 2010.
11.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Determinar el porcentaje de resistencia a meticilina en cepas de
S. aureus aisladas durante el1 Agosto 2009–1 Febrero 2010 en el HGM
2. Diferenciar el perfil de resistencia de las cepas de S. aureus adquiridos en
la comunidad y las intrahospitalarias con base a los resultados obtenidos
en el antibiograma y los datos obtenidos de la historia clínica.
3. Confirmar la resistencia de las cepas de S. aureus a meticilina mediante la
detección del gen mecA por medio de la PCR.
4. Describir los principales factores de riesgo, relacionados con la resistencia
a meticilina.
5. Entregar datos al comité de infecciones para toma de decisiones.
8
12. METODOLOGIA
12.1 DISEÑO DEL ESTUDIO
Se realizó un estudio de tipo prospectivo transversal; se captaron todos los
casos nuevos de infección detectados en el Hospital General de Medellín
durante el periodo comprendido entre el 1 Agosto 2009 y el 1 de Febrero 2010.
12.2 DISEÑO MUESTRAL:
Se tuvo en cuenta un universo en el cual se capturaron todos los casos
nuevos de infección que llegaron al Hospital General de Medellín durante el
periodo del estudio, la fuente(muestra) se seleccionó si el microorganismo
aislado era S. aureus meticilino-resistente.
12.3 TECNICAS E INSTRUMENTOS
Captura de datos de la historia clínica:
Se recolectó la información clínica del MRSA aislado
a través de un Formato de registro microbiológico que tiene como fundamento
las normas del CDC (17). Anexo 1
Los factores de riesgo para adquirir una infección por SAMR se reunieron en 2
grupos: factores de riesgo asociados al hospedero: comorbilidad,
enfermedades de base y edad, y factores de riesgo asociados con la atención
hospitalaria ,uso de dispositivos invasivos, cirugías, tratamiento antibiótico, y
días de estancia hospitalaria, los parámetros se basaron en el estudio
realizado por Gaviria H. Jorge: Factores de riesgo asociados con la infección
por S.aureus meticilino-resistente relacionados con la atención del paciente
Hospital Pablo Tobón Uribe-Medellín (20).
Siguiendo los estándares de la CDC se estableció si la infección fue de tipo
nosocomial, incierta, o comunitaria (17).
9
12.4 RECOLECCION DE MUESTRAS:
Se analizaron 34 muestras clínicas de pacientes hospitalizados en los
diferentes servicios del Hospital General de Medellín en el periodo
comprendido entre 1 de Agosto de 2009 a 1 Febrero de 2010, estas muestras
fueron registradas en la recepción del laboratorio y posteriormente ubicadas
en la sección de microbiología.
12.5 PROCESAMIENTO, IDENTIFICACION Y SENSIBILIDAD
IDENTIFICACIÓN BIOQUIMICA DE LOS AISLAMIENTOS.
En todas las cepas se confirma la identificación mediante:
Gram: cocos gram positivos de 0.5 a 1um de diâmetro, no forman esporas.
Catalasa: degradación del peróxido de hidrogeno positva.
Coagulasa: enzima extracelular libre producida por el microorganismo capaz
de coagular el plasma. La técnica utilizada fue el Test rápido de aglutinación de
partículas de látex para la identificación de cepas de S. aureus a partir de
aislamientos en medios de cultivo. El reactivo SLIDEX Staph Plus (bioMérieux
SA), permite la detección con gran sensibilidad de estas cepas gracias a la
utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra las estructuras
periféricas específicas de S. aureus.
Estudio de la sensibilidad antibiótica
El estudio de la sensibilidad de las cepas se realiza mediante el método de
concentración inhibitoria minima siguiendo las normas del Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente National Comittee for
Clinical Laboratory Standards o NCCLS)
10
Se preparó un inóculo con turbidez 0,5 de la escala McFarland a partir de un
cultivo joven y se sembró en la tarjeta de sensibilidad AST-577 método
automatizado de Biomerieux, dicha tarjeta incluye los antimicrobianos
Gentamicina, Ciprofloxacina, Levofloxacina, Moxifloxacina, Minociclina,
Eritromicina, Clindamicina, Quinipristina/Dalfopristina, Linezolid, Teicoplanina,
Vancomicina, Rifampicina, Trimetroprima/Sulfametoxazol, Tetraciclina y
Nitrofurantoina.; Como control interno que permita la validación de las pruebas
se utilizaron las cepas de referencia de la ATCC (American Type Culture) de
S. aureus 29213 sensible a meticilina y 43300 meticilino-resistente (9,13).
Confirmación de la resistencia a meticilina
La confirmación de la resistencia a meticilina se realizó automáticamente en la
tarjeta de sensibilidad en el pozo cefoxitin screen (14).
12.6 CONSERVACION DE LAS CEPAS:
Se realizó una dilución de la cepa a 0.5 en la escala de Mcfarland en BHI
glicerinado al 30% y fue conservado en alícuotas de 2ml.
Estas cepas fueron preservadas en ultra congelación a - 70°C en la Institución
Universitaria Colegio Mayor de Antioquia.
12.7 EXTRACCION DEL DNA, AMPLIFICACION Y ELECTROFORESIS
Técnica de PCR para detección de gen mecA
La técnica de elección para la detección del gen mecA fue la amplificación
mediante PCR (reacción en cadena de la Polimerasa).
Extracción del DNA: A las cepas de S. aureus obtenidas en el estudio se les
realizó extracción de ADN genómico utilizando el kit comercial de Promega
“Wizard® Genomic DNA Purification Kit cat A1120”, siguiendo las instrucciones
indicadas por el fabricante. Este kit está diseñado para obtener ADN genómico
de glóbulos blancos, cultivos celulares, levaduras, bacterias gram-negativas y
11
gram-positivas, con una pureza adecuada para la utilización en técnicas de
biología molecular, incluyendo la técnica de PCR (15).
Amplificación del DNA: A partir del ADN bacteriano obtenido por el método
descrito anteriormente, se amplificó mediante PCR convencional un fragmento
correspondiente al gen mecA (marcador molecular de meticilino-resistencia).
Se utilizaron como controles un gen especifico del género Staphylococcus (16S
RNAr de Staphylococcus) y un gen especifico de bacteria (16S RNAr de
bacteria). La secuencia de los iniciadores y el tamaño de los fragmentos se
especifican en la tabla 1. Las condiciones de la PCR utilizadas fueron las
descritas por Jaffe y col. en el 2000 con una modificación en la temperatura de
annealing a 57°C por minuto.
Electroforesis de agarosa: Se utilizó gel de agarosa al 1.2% teñido con
bromuro de etidio 1 microlitro por cada 10 mL, la corriente utilizada fue de 80
voltios por 90 minutos.
Tabla 1. Iniciadores y tamaño del producto de amplificación.
Gen Pareja de Primers Tamaño
(pb)
MecA 5´-CAT TTT GAG TTC TGC ACT ACC-3’
5’-GCA ATA CAA TCG CAC ATA CAT TAA
TAG-3’
967
16S RNAr
Staphylococcus
5’-GTT ATT AGG GAA GAA CAT ATG TG-3’
5´-CCA CCT TCC TCC GGT TTG TCA CC-3’
750
5’-GCG GAT CCT GAC TGC AGT GCC AGC
AGC CGC GGT AA-3’
5’-GCG GAT CCG CGG CCG CGG ACT ACC
AGG GTA TCT AAT-3’
292
12
13. ASPECTOS ETICOS SOBRE EL MANEJO DE LA INFORMACION
La confidencialidad de la información será tenida en cuenta durante todo el
proyecto, la identidad de los pacientes será preservada en total reserva. Los
resultados serán de uso exclusivo del Colegio Mayor de Antioquia y el Hospital
General de Medellín, como apoyo a la investigación y a la docencia.
Esta investigación no representa ningún riesgo para los pacientes.
Dando cumplimiento a las normas contempladas en la resolución 8430 de 1993
del Ministerio de salud:
Título II de la investigación en seres humanos; Capítulo 1 artículo: 5, 6, 7, 8, 11
Título IV de la bioseguridad de las investigaciones Capítulo I (16).
14. RESULTADOS
Durante el período de estudio se obtuvieron 141 aislamientos de
Staphylococcus aureus, de los cuales 107 (75%) fueron Staphylococcus
aureus susceptibles a meticilina (SASM), y 34 (25%) pertenecientes a S.
aureus meticilino resistentes (SARM). Se observó que el fenotipo sugestivo
SARM-H (55.9 %) presentó mayor proporción sobre el fenotipo SAMR-C
(44.1%).
La diferenciación del perfil fenotípico de las cepas SAMR obtenidos en los
antibiogramas se presentan a continuación, los perfiles sugestivos de SAMR-H
se encuentran resaltados, los demás corresponden a las cepas sugestivas de
SAMR-C Tabla 2.
13
Tabla 2. Perfil fenotípico cepas SAMR
Informe de Antibiograma
Paciente
B-
lac oxa
D
cef Gen Cipro Levo Moxi Eritro Clinda Q/Dal Riclin Line Teico vanco mino Tet Rif Trim/sulfa Nitro
139106 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
139714 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
139334 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
139799 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
140797 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
141693 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
1451143 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S I
141023 NEG R POS S R I S R R S NEG S S S S S S S I
16532050 NEG R POS I R I S S S S NEG S S S S R S S S
15927651 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
16200251 POS R POS R R R I R R S NEG S S S S S S S I
16577450 NEG R POS S S S S R R S POS S S S S R S S S
15944350 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
16766351 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
16596251 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
15686050 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
16060050 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
17731450 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
187612 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
191853 POS R POS S S S S R R S POS S S S S S S S S
19290751 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
190574 POS R POS S S S S S S S NEG S S S I R S S S
18974451 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
196231 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
201916 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
20216451 NEG R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
21297051 POS R POS R R R S R R S NEG S S S S S S S S
21318652 POS R POS S S S S R S S NEG S S S S R S S S
223762 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
22620752 NEG R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
2301060 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S S S S S
24575451 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
25083250 NEG R POS S S S S R S S NEG S S S S S S S S
25121951 POS R POS S S S S S S S NEG S S S S R S S S
17989752 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
249507 POS R POS R R I S R R S NEG S S S S S S S S
14
El perfil de sensibilidad a los demás antibióticos estudiados se describe en la
figura 1.
Figura 1: Perfil de sensibilidad hallado en las cepas de SARM
15
Siguiendo los estándares de la CDC el tipo de infección se clasificó como
Nosocomial, Comunitaria e Incierta. Figura 2
Figura 2. Clasificación de las infecciones según la CDC
16
Los pacientes fueron clasificados según su edad en cuatro grupos que se
muestran a continuación. Figura 3.
Figura 3. Frecuencia de las edades de pacientes con aislamientos de SARM
Las muestras a partir de las cuales se identificaron los 34 aislamientos de perfil SARM fueron: 17 secreciones (50%), (incluye muestras de piel y tejidos blandos), sangre 8 (23.5%), orina 3 (8.8%), liquido peritoneal, hueso, herida quirúrgica y secreción traqueal que representan cada uno menos del 5% del total.
Se encontró que la causa más frecuente de adquisición de una infección por SARM asociada a factores del hospedero son las heridas abiertas y traumas cerrados con 7 casos (20.6%) seguido por prematurez con 5 casos (14.7%), abscesos cutáneos y celulitis sin ningún tipo de antecedentes 4 (11.8%), infecciones asociadas a tumores 4 (11.8%), se encontraron además otros factores de riesgo con menor frecuencia como, diabetes, hipertensión y enfermedad cerebro vascular, entre otros .
17
En los factores de riesgo asociados a la atención hospitalaria se encontraron,
infecciones originadas por sonda 3 (8.8%) e infección de herida quirúrgica 2
(5.9%).
Otro factor de riesgo importante para la adquisición de la infección es una estancia
hospitalaria prolongada; 28 pacientes (82.4%) tuvieron una estancia hospitalaria
mayor a 9 días y 6 pacientes (17.6%) menor a este número.
Los servicios donde se obtuvieron el mayor número de aislamientos para
SARM-H fueron neonatos, la UCI neonatal, ortopedia y urgencias adultos con 2
aislamientos cada uno.
El servicio donde se aisló con mayor frecuencia las cepas de SAMR-C fue el
quinto piso cirugía con 5 casos.
PCR (Reacción en cadena de la polimerasa).
Se realizó PCR a 34 aislamientos. Como se esperaba, la PCR confirmó la
presencia del gen mecA en todas las cepas de S. aureus meticilino-resistente
obtenidas. Foto 1 y 2
18
FOTO 1
FOTO 2
19
15. DISCUSION
Este es el primer estudio realizado en el Hospital General de Medellín sobre la caracterización de S. aureus resistente a meticilina, diferenciándose inicialmente su patrón fenotípico sugestivo de SARM-C y SARM- H y confirmándose la presencia del gen mecA en las las cepas aisladas.
Hay diferencias claras entre los aislamientos de SARM-H y los aislamientos SARM-C , consistentes en su conformación genética, ocasionando diferentes perfiles de resistencia antibiótica y diferentes factores de virulencia; en el estudio de Cortes J y colaboradores encontraron que SARM-C fue más susceptible a tres antibióticos distintos a los beta-lactamicos (eritromicina, clindamicina y quinolonas) de igual manera en nuestro estudio partimos de esta descripción para hacer la diferenciación entre los dos tipos de Staphylococcus.(1,19).
Las cepas de SARM- H se aislaron en su mayoría en los recién nacidos mientras que SARM-C se encontró principalmente en las edades de 16- 59 años, varios de estos pacientes no tenían factores de riego relacionados para adquirir la infección (8). Aunque las infecciones son debidas a microorganismos localizados en los servicios, estos también pueden estar presentes en el material de diagnóstico y/o tratamiento contaminado; además pueden trasmitirse por el personal que interactúan con el paciente como los visitantes y el personal encargado de su cuidado. Vale la pena aclarar que no todas las infecciones hospitalarias son prevenibles; se estima que por lo menos la mitad se produciría a pesar de la aplicación de estrictas medidas de prevención (21).
La diseminación de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina es una preocupación a nivel mundial y las infecciones asociadas al cuidado del paciente son un importante problema de salud pública e implican costos adicionales a las instituciones de salud.
Se sabe que debido al desequilibrio inmunológico por el que atraviesa el paciente y la estancia prolongada en el hospital, las formas localizadas de la infección pueden evolucionar rápidamente y desarrollar en pocos días cuadros de sepsis con hemocultivos positivos para SARM-C (1), igualmente en nuestro estudio las muestras que presentaron mayor frecuencia de aislamientos de SARM fueron las secreciones y tejidos blandos, seguidos por las muestras de sangre. La co-morbilidad tiene un impacto importante en la salud de las personas, los pacientes
20
con heridas ocasionadas por traumas tienen mayor riesgo de sufrir complicaciones ya que se producen cambios llevando a disfunciones orgánicas que facilitan el desarrollo de las infecciones, atribuible a una pobre respuesta inmunológica contra el ataque al microorganismo.
En los factores de riesgo asociados a la atención hospitalaria, la estancia prolongada fue el factor de riesgo predominante para contraer una infección nosocomial, tal como se reporta en un estudio realizado en el HPTU, una estancia prolongada en el hospital tiene 14.5 veces más riesgo de presentar infección y por cada día menos de estancia hospitalaria el riesgo de infección se reduce en un 37%(20). Otros factores encontrados estuvieron relacionados con dispositivos invasivos: catéter y sonda vesical, sin embargo la fuente de información historia clínica electrónica presentó limitaciones en esta información en la mayoría de los pacientes.
En la PCR de las 34 cepas de S. aureus meticilino resistente se obtuvo una banda de 967 pb correspondiente a un fragmento del gen mecA similar al amplicón obtenido en la cepa resistente utilizada como control positivo lo cual confirma la meticilino resistencia en las cepas estudiadas. La implementación de técnicas moleculares podría disminuir el tiempo en la detección de éstos microorganismos y facilitaría el tratamiento oportuno de los pacientes.
16. RECOMENDACIONES
Continuar con el programa de vigilancia activa para el control de SARM y sensibilizar al personal médico y de enfermería en el reconocimiento de las manifestaciones clínicas, la importancia de obtener un diagnostico microbiológico y conocer los perfiles de sensibilidad del microorganismo.
Realizar educación periódica y entrenamiento del personal mediante medidas preventivas en hábitos de asepsia y lavado de manos, seguimiento de protocolos de manejo que impidan la infección del paciente o incrementen su estadía hospitalaria y los factores de riesgo relacionados con la atención.
Informe telefónico inmediato por parte del laboratorio de microbiología al médico o enfermera profesional encargados de la atención del paciente sobre el aislamiento del SARM y de microorganismos responsables de brotes y resistencias inusuales, para la toma de decisiones en el tiempo oportuno.
Dar informe escrito al comité de infecciones intrahospitalarias y comité de vigilancia epidemiológica.
21
Recomendamos realizar estudios futuros que determinen la frecuencia de portadores de SARM en el personal hospitalario para definir estrategias de prevención y transmisión de diferentes clones en los servicios.
17. CONCLUSION.
Se demostró claramente la presencia de S. aureus resistente a meticilina de forma comunitaria y nosocomial en el Hospital General de Medellín afectando pacientes de todas las edades.
La presencia de SARM-C es un gran problema de salud pública debido a su fácil diseminación en la comunidad; los resultados encontrados en nuestro estudio indican que los aislamientos de este microorganismo en nuestro medio, son más frecuentes de lo que pensamos; por lo tanto debe tenerse mucha precaución en utilizar de forma empírica el tratamiento clásico con cefalosporinas de primera generación, recomendado en cepas estafilocicas de la comunidad, sin realizar un estudio de laboratorio.
El aumento de la frecuencia de SARM está llevando a un mayor uso de glucopeptidos con el consiguiente aumento de la presión de selección antibiótica lo que podría favorecer el desarrollo de resistencia a esta familia de drogas.
Las nuevas técnicas como la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para la detección del gen mecA constituyen una nueva alternativa clínica que permite la identificación de cepas de SARM con mayor rapidez y sensibilidad que los métodos que se disponen actualmente.
Anexo 1. CAPTURA DE DATOS DE LA HISTORIA CLINICA
1. NUMERO IDENTIFICACION: FECHA: 2. EDAD: DIAS : MESES : ANOS: 3. SERVICIOS 01 2 Ginecoobstetricia 02 Apoyo terapéutico 03 Lactantes / Neonatos 2 04 Neonatos 1
22
05 Preescolares 06 UCI adultos 07 UCI neonatal 08 Urgencias adultos 09 Urgencias pediátricas 10 1 piso hospitalización 11 Cuarto piso norte 12 Quinto piso norte 13 Sexto piso norte 14 Séptimo piso norte 15 Octavo piso norte 16 Noveno piso norte 17 Quinto piso sur 18 Sexto piso sur 19 Unidad de cuidados especiales, noveno piso sur 4. ADQUISICION DE SARM INFECCION NOSOCOMIAL (después 48 horas de ingreso del paciente)
01 Si
INFECCION INCIERTA (aislado primeras 48 horas de ingreso del pte y / o
haya tenido contacto con el sistema de salud, en al menos una ocasión
en al ano)
02 Si INFECCION COMUNITARIA (primeras 48 horas de ingreso del
paciente)
03 Si 5. ENFERMEDAD CRONICA DE BASE 6. FACTORES DE RIESGO (DISPOSITIVOS , CIRUGIAS) 7. TRATAMIENTO ANTIMICROBIANO 01 SI PREVIO 02 NO 03 SI ACTUAL 04 NO
Anexo 2
TABLA SISTEMATIZACIÓN
23
Objetivo Variable Nivel
de
medició
n
Operacionalizac
ión
código
Edad
2.
Infección
nosocomial
Aislamiento de MRSA
antes de 48 horas del
ingreso del paciente
Nomina
l
Si
No
Si =01
No=02
3.
infección
incierta
Ingreso del paciente en el
ultimo año al Sistema de
Salud
Nomina
l
Si
No
Si=01
No=02
4.
Infección
Comunitari
a
Aislamiento de MRSA
despues de 48 horas del
ingreso del paciente
Nomina
l
Si
No
Si=01
No=02
24
5.
servicio
Servicio de procedencia
hospitalaria
Nomina
l
2GINECOOBST
ETRICIA
APOYO
TERAPEUTICO
LACTANTES
NEONATOS 2
PREESCOLAR
ES
UCI ADULTOS
UCI
NEONATAL
URGENCIAS
ADULTOS
URG.
PEDIATRICAS
1 PISO
HOSPITALIZAC
I
CUARTO PISO
NORTE
2GINEC
OOBST
ETRICIA
= 01
APOYO
TERAPE
UTICO =
02
LACTAN
TES =
03
NEONA
TOS 2 =
04
PREES
COLAR
ES = 05
UCI
ADULTO
S = 06
UCI
NEONA
TAL =
07
25
QUINTO PISO
NORTE
SEXTO PISO
NORTE
SEPTIMO PISO
NORTE
OCTAVO PISO
NORTE
NOVENO PISO
NORTE
URGEN
CIAS
ADULTO
S = 08
URG.
PEDIAT
RICAS =
09
1 PISO
HOSPIT
ALIZACI
= 10
CUART
O PISO
NORTE
= 11
QUINTO
PISO
NORTE
= 12
SEXTO
PISO
NORTE
= 13
SEPTIM
26
O PISO
NORTE
= 14
OCTAV
O PISO
NORTE
= 15
NOVEN
O PISO
NORTE
= 16
6.
Tipo de
muestra
7.
Enfermeda
d de base
8.
Factores
de riesgo
9. tto Previo =
Actual =
Software: Epi-Info. Vers
27
Anexo 3
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
MESES
ACTIVIDADES
Ago
Sep Oct
Nv Dic En Fe Mar
Abr
May
Jun
Jul
Ago
Sep
Oct
Anteproyecto Recolección de cepas identificación, sensibilidad y conservación
X X
X X
X X
X X
X
X
Recolección datos, informe laboratorio microbiología
X X X X X X X
Montaje de pruebas moleculares
X X
Captura datos historia clínica
X X X
Análisis de datos
X X X X
Presentación informe final
X
28
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDADES MES / DESCRIPCION
AGOSTO 1 de 2009
ELABORACION
ANTEPROYECTO
RECOLECCION DE
CEPAS,
PROCESAMIENTO
DE CULTIVOS,
CONSERVACION
Búsqueda bibliográfica; informes y artículos relacionados;
lectura y profundización del tema.
Aislamiento cepas e identificación, Determinación de
patrones de susceptibilidad.
Recolección de información del microorganismo en los
equipos de microbiología
Preservación de las cepas (BHI): Los aislamientos de
S. aureus serán conservados en caldo BHI glicerol al 30%,
previa dilución a 0.5 en la escala de McFarland y
alicuotados para ultra congelación.
SEPTIEMBRE DE 2009
ELABORACION
ANTEPROYECTO
RECOLECCION DE
CEPAS,
PROCESAMIENTO
DE CULTIVOS,
IDENTIFICACION,
SENSIBILIDAD Y
CONSERVACION
Búsqueda bibliográfica; informes y artículos relacionados;
lectura y profundización del tema.
Recolección de muestras e información del
microorganismo en los equipos de microbiología
Aislamiento de las cepas e identificación
Determinación de patrones de susceptibilidad e
interpretación de resultados del laboratorio.
Preservación de las cepas (BHI): Los aislamientos de
S. aureus o serán conservados en caldo BHI glicerol al
29
REUNIONES DE
ASESORIAS Y
PRESENTACION
DEL
ANTEPROYECTO
30%, previa dilución a 0.5 en la escala de McFarland y
alicuotados para ultra congelación.
Reunión con asesor del Colegio Mayor Clara Duque
Reunión con asesor del HGM Dr. Alberto Pérez
Presentación del anteproyecto al Colegio Mayor
Presentación del anteproyecto al HGM
Aprobación del proyecto en el HGM y Colegio Mayor
Reunión con asesores temáticos para correcciones y
sugerencias
OCTUBRE Y NOVIEMBRE 2009
ELABORACION
ANTEPROYECTO
RECOLECCION DE
CEPAS,
PROCESAMIENTO
DE CULTIVOS,
IDENTIFICACION,
SENSIBILIDAD Y
CONSERVACION
REUNIONES DE
ASESORIAS Y
CORRECCIONES
DEL
Búsqueda bibliográfica; informes y artículos relacionados;
lectura y profundización del tema.
Recolección de muestras e información del
microorganismo en los equipos de microbiología
Aislamiento de las cepas e identificación
Determinación de patrones de susceptibilidad y análisis de
resultados del laboratorio.
Reunión con asesor del Colegio Mayor Clara Duque
Reunión con asesor del HGM Dr. Alberto Pérez.
Presentación del anteproyecto al Colegio Mayor
30
ANTEPROYECTO
PRESENTACION
DEL
ANTEPROYECTO
Presentación del anteproyecto al HGM
Aprobación del proyecto en el HGM y Colegio Mayor
Reunión con asesores temáticos para correcciones y
sugerencias
DICIEMBRE 2009 ENERO 2010
RECOLECCION DE
CEPAS,
PROCESAMIENTO
DE CULTIVOS,
IDENTIFICACION,
SENSIBILIDAD Y
CONSERVACION
REUNION CON EL
ASESOR
Recolección de las muestras
Aislamiento de las cepas e identificación.
Determinación de patrones de susceptibilidad y análisis de
resultado del laboratorio de microbiología.
Los aislamientos de S. aureus que participarán en el
estudio serán conservados en caldo BHI glicerol al 30%,
previa dilución a 0.5 a la escala de McFarland y
alicuotados para ultra congelación.
Mario Zapata. (Bact. Epi. MSC; Docente)
FEBRERO 2010
ANALISIS DE
DATOS
REUNION ASESOR
TEMATICO
Análisis de datos del de laboratorio, relacionados con los
informes microbiológicos de las cepas.
Clara Duque Restrepo.
MARZO, ABRIL 2010
MONTAJE DE
PRUEBAS
MOLECULARES
Extracción y amplificación: DNA bacteriano (lisis celular,
extracción, purificación, cuantificación y manipulación de
DNA)
Reacción en cadena de la polimerasa: amplificación de
31
REUNION CON
ASESOR
METODOLOGICO
DNA
Electroforesis en gel de agarosa: separación de fracciones
proteicas por cargas eléctricas
Dr. Álvaro Quintero.
JUNIO , JULIO, AGOSTO , SEPIEMBRE OCTUBRE
2010
ANALISIS DE
DATOS
TABULACION Y
CORRECCION DE
DATOS
REUNIÓN CON
ASESORES
Análisis pruebas de sensibilidad.
Análisis moleculares.
Análisis estadístico.
Recolección y análisis de toda la información obtenida
durante todo el proceso y digitación.
Observaciones, sugerencias, correcciones y digitación.
INFORME FINAL NOVIEMBRE DE 2010:
Entrega del informe final
32
18. BIBLIOGRAFIA.
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