TERCER INFORME TÉCNICO DE AVANCE PROYECTO (Abril 2001 - Marzo 2002)

CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE POBLACIONES DE Nothofagus obliqua (Mirb. Et Oerst.) y N. alpina (Poepp. Et Endl.) Oerst (=N. nervosa

(Phil.) Dim. Et Mil.) MEDIANTE MARCADORES MOLECULARES E ISOENZIMÁTICOS. BID (FONTAGRO)

Participantes Mario Paredes: Líder del Proyecto, Investigador, INIA, CRI-Quilamapu, Chillán, Chile Leonardo Gallo: Líder alterno, Investigador, INTA, Bariloche, Argentina Rodrigo Avilés, Gestión Proyecto, INIA, CRI Quilamapu Viviana Becerra, Investigadora, INIA, CRI Quilamapu Paula Marcelli, Investigadora, INTA, Bariloche, Argentina María Marta Azpilicueta, Investigadora, INTA, Bariloche, Argentina Roberto Ipinza, PROGENESIS, Valdivia, Chile Oriana Ortiz, PROGENESIS, Valdivia, Chile Braulio Gutiérrez, INFOR, Concepción, Chile María Paz Molina, INFOR, Concepción, Chile Gustavo Moreno, CONAF, Centro de Semillas, Chillán, Chile Jorge Urrutia, CEFOR, Valdivia, Chile

ABRIL, 2002

Programa Cooperativo para el Desarrollo Tecnológico Agroalimentario y Agroindustrial del Cono Sur

Argentina,Brasil, ChileParaguay, Uruguay

BoliviaInstituto Interamericanode Cooperación parala Agricultura

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RESUMEN

El objetivo general del proyecto es: Evaluar la variabilidad genética de roble y raulí, mediante el uso de marcadores moleculares (RAPDs, cpADN) e isoenzimáticos para ayudar a fijar criterios de conservación, mejoramiento genético, reforestación, manejo y aprovechamiento del bosque. Los objetivos específicos son: 1) Identificar y diferenciar genéticamente procedencias de Nothofagus alpina y N. obliqua, 2) Evaluar la variabilidad genética de roble y raulí chileno y argentino, mediante el uso de marcadores moleculares (RAPDs, cpADN) y bioquímicos, 3) Determinar niveles y dirección de la introgresión en los híbridos naturales formados por estas especies, 4) Asociar la información genética con la distribución geográfica de las especies y poblaciones y 5) Disponer de semilla de medios hermanos para un futuro establecimiento de ensayos de progenie. Las metas del proyecto son: 1) Identificar y colectar a lo menos 15 poblaciones de Nothofagus alpina y 35 de N. obliqua, durante el primer año; para completar la meta el segundo año en Chile y Argentina, 2) Determinar la variabilidad genética de un tercio de la poblaciones seleccionadas por año, 3) Determinar niveles y dirección de la introgresión existente entre las especies en el tercer año, 4) Asociación de distribución geográfica y diversidad genética en el tercer año y 5) Tener la colección de semilla almacenada en frío, en condiciones ex situ. Metas para el segundo año (Abril 2001-marzo 2002) • Completar la identificación y colección de las poblaciones chilenas y argentinas. • Determinar la variabilidad genética del segundo tercio de las poblaciones seleccionadas. Metas para el tercer año • Determinar introgresión existente entre las especies en el tercer año. • Asociación de distribución geográfica y diversidad genética en el tercer año. • Colección de semilla almacenada en frío (establecimiento de ensayos de progenie en la X región de Chile). Durante este período de desarrollo del proyecto se realizaron las actividades comprometidas en el proyecto dentro del período que se informa. Las actividades mencionadas anteriormente estuvieron relacionadas a los objetivos y metas planteadas en el proyecto: 1) Completar la identificación y colecta de las procedencias de roble y raulí en Argentina. Las poblaciones chilenas fueron colectadas el primer año del proyecto, 2) Continuar con los análisis bioquímicos y moleculares. En Chile, se continuó con: a) el estudio de RAPD utilizando los “partidores” y las condiciones de amplificación seleccionados en la temporada anterior, y b) se inició la evaluación de las condiciones de amplificación de SSR para el análisis de poblaciones chilenas de roble y raulí, c) Seleccionar partidores de cloroplasto y RAPD especie-específico para realizar el estudio de introgresión en las poblaciones naturales chilenas de roble y raulí. En Argentina, se a) continuó con el estudio de diversidad y diferenciación genética de las poblaciones argentinas de roble y raulí, b) se terminó el análisis genético de los sistemas enzimáticos utilizados y c) se inició el estudio de poblaciones chilenas y argentinas de roble y raulí mediantye cpADN; 3) Controlar los ensayos de procedencia y progenie de roble y raulí plantados en X región en Chile en la temporada anterior, 4) Realizar actividades de coordinación y transferencia con los profesionales del proyecto y otros profesionales, técnicos y alumnos para dar a conocer los objetivos y resultados preliminares del proyecto.

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COMPONENTE CHILE. INIA, CRI QUILAMAPU

ACTIVIDADES DESARROLLADAS POR OBJETVO ESPECÏFICO (Abril 2001 a marzo 2002) Objetivo 1. Identificar y colectar las poblaciones de Nothofagus alpina y N. obliqua Durante el primer año del proyecto se completó la identificación de los lugares de colecta y se realizó la colecta del material Chileno comprometido en el proyecto (Informe Técnico Nº1, mayo 2000). En el caso del material argentino durante esta temporada se realizó una colecta para completar las poblaciones comprometidas. Objetivo 2. Evaluar la variabilidad genética de roble y raulí chileno y argentino, mediante el uso de marcadores moleculares (RAPDs, cpADN) y bioquímicos (segundo y tercer año) A. Actividades de investigación Análisis molecular del germoplasma de roble y raulí Durante este período se realizó el análisis molecular de poblaciones colectadas en 21 localidades de Chile, 18 de roble (ocho macroregiones) y tres de raulí. (Cuadro 1). Cuadro 1 . Poblaciones de roble y raulí analizadas mediante RAPD.

Especie/ Pro- Cedencia

Punto Re- gión

Provincia Comuna Lugar

Raulí Ratra 305 Las Trancas X Valdivia La Unión Cam. Trumao-Hueicolla Rasan 212 Santa Bárbara VIII Bío-Bío Sta Bárbara El Huachi Rajau 218 Jauja IX Malleco Collipulli Jauja Roble Roruile 214 R.N. Los Ruiles VII Cauquenes Cauquenes Los Ruiles Roquir 264 Quirihue VIII Ñuble Quirihue Quirihue Rocayu 314 Cayumanqui VIII Concepción Quillón Cerro Cayumanqui Rolana 386 Lanalhue VIII Arauco Cañete Cañete-Purén Ropichi 400 Pichipillahuén IX Malleco Galvarino Pichipillahuén Rocruce 486 Cruces X Valdivia Valdivia Sector Cayumapu Ropurra 554 Purranque X Osorno Purranque Purranque-Frutillar Roque 428 Quepe IX Cautín Freire Quepe Romala 477 Malalhue X Valdivia Lanco Purulón Rorupan 536 Rupanco X Osorno P. Octay Hacienda Rupanco Robulli 175 Bullileo VII Linares Parral Bullileo Roral 375 Ralco VIII Bío-Bío Sta Bárbara Ralco-Panque Roreci 321 Recinto VIII Nuble Pinto Pinto-Recinto Rogalle 415 L. Galletue IX Malleco Melipeuco Icalma Rocoli 438 L. Colico IX Cautín Cunco Puerto Puma Rocurarre 460 Curarrehue IX Cautín Currahue Puesco Rolli 500 Llifén X Valdivia Futrono Llifén Romelli Melipeuco IX Cautín Melipeuco El Manzano

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Aislación, extracción y cuantificación del ADN Para el análisis genético de estas poblaciones se realizaron mini-extracciones de ADN de hojas jóvenes de las 21 procedencias (Cuadro 1). Las hojas fueron cosechadas desde plántulas establecidas en los ensayos de procedencia y progenie en la zona de Valdivia y transportadas a Chillán en cajas refrigeradas para evitar su deshidratación. Posteriormente, las hojas fueron liofilizadas para su almacenamiento a 4°C. Durante la extracción de ADN, las hojas fueron maceradas en un mortero en presencia de nitrógeno líquido. Este macerado se incubó con 300 µl de tampón de extracción (50 mM Tris pH 8,0; 0,7 M NaCl; 10mM EDTA; 2%CTAB y β-mercaptoetanol) a 65º C durante 45 min a baño María. Posteriormente, las muestras fueron enfriadas y se realizaron dos extracciones proteicas con cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). La emulsión fue centrifugada a 4.500 rpm por 15 minutos, para la separación de las fases. El sobrenadante acuoso se transfirió a un tubo limpio, y se precipitó el ADN con Isopropanol. El precipitado fue lavado con etanol (76%; 10 mM NH4Ac) y secado a temperatura ambiente. Finalmente, el ADN fue resuspendido (TE pH 8.0) y tratado con ARNasa antes de medir su concentración en un fluorómetro (DyNA QuantTM, Hoefer). Análisis molecular mediante RAPD Durante esta temporada se analizó un total de 21 poblaciones, de las cuales 18 fueron de roble y tres de raulí. Cada población estuvo representada por 10 individuos (Cuadro 1). Los 210 individuos fueron analizados con 20 partidores seleccionados del análisis molecular de la temporada anterior (Cuadro 2). Cuadro 2. Partidores seleccionados para el análisis de poblaciones de roble y raulí.

Partidores Operon OPAB- 1 OPAD-3 OPAB- 3 OPAD- 4 OPAB- 5 OPAD- 6 OPAB- 6 OPAD- 8 OPAB- 7 OPAD- 10 OPAB-8 OPAD- 12 OPAB- 9 OPAD- 14 OPAB- 11 OPAD- 16 OPAB- 14 OPAD-18 OPAB- 17 OPAB- 19

La Figura 1. muestra tres partidores de 10 mers de RAPDs que diferencian genéticamente entre las especies de Nothofagus analizadas (roble y raulí). Existen bandas de peso molecular específico y de alta reproducibilidad que son exclusivas de la especie.

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Roble Raulí

Roble Raulí

Roble Raulí

Figura 1 . Partidores de RAPD que diferencian entre roble y raulí.

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Análisis molecular mediante SSR. Durante este período de desarrollo del proyecto se inició la evaluación de las condiciones de reacción y amplificación para el estudio de las procedencias mediante microsatélites (SSR). Esta técnica tiene un mayor poder de discriminación entre genotipos, comparada con los RAPDs. Los SSR que son secuencias de di-tri y tetranucleótidos repetidas en tandem, han sido también utilizados para medir diversidad genética de diversas especies: arroz (WU Y TANKSLEY, 1993), trigo (RÖDER Y OTROS, 1995) y eucalipto (BECERRA Y PAREDES, 2000). Con esta técnica la diversidad genética es medida a través de la amplificación directa de los SSR por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los partidores usados son diseñados rodeando estos microsatélites (MORGANTE Y OLIVIERI, 1993; KATZIR Y OTROS, 1996). La amplificación de microsatélites ha demostrado que ellos son de un alto polimorfismo, multialélicos, y que además son transferibles entre especies y géneros y su amplificación sólo necesita cantidades mínimas de ADN. En el proyecto se está estudiando la homología que existe entre el ADN de Quercus con el de roble y raulí. Para ello se están utilizando 7 partidores de SSR derivados de Quercus . El producto de esta amplificación se verificó en geles de agarosa al 4%, como se puede apreciar en la Figura 3, no todos los partidores amplificaron, mientras que otros no indican polimorfismo.

Figura 3. Selección de partidores homólogos y polimórficos de Quercus en Nothofagus. Relacionado con esta técnica actualmente se están ajustando las condiciones de amplificación variando las temperaturas de acoplamiento de los partidores con el ADN molde para lograr la transferibilidad de estos partidores de microsatélites. Evaluación molecular de RAPD, PCR-RFLP y SSR Los resultados del análisis de RAPD, PCR-RFLP y SSR se están evaluando bajo los siguientes criterios: a) Bandas nítidas, reproducibles, consistentes y fáciles de evaluar; b) Presencia (1) o ausencia (0) de bandas; Con estos resultados se está empezando a conformar una base de datos, los cuales serán analizados una vez que se concluya el trabajo. B. Actividades de coordinación y transferencia 1. Reunión de Coordinación del proyecto Durante esta temporada se planificó una reunión de trabajo que se realizará en la Estación Experimental del INTA, Bariloche Argentina durante la semana del 28 de mayo. En esta reunión se discutirán los avances del proyecto y se planificarán las actividades de este año. 2. Asistencia al Simposio Internacional IUFRO. Tres profesionales del proyecto participaron en un Simposio Internacional “Desarrollando el Eucalipto del Futuro” organizado por la International Union of Forestry Research Organization (IUFRO), realizado en Valdivia, Chile. En esta oportunidad los profesionales tuvieron la oportunidad de discutir con profesionales

Sin amplificación Monomórfico

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chilenos y extranjeros varios trabajos que se están realizando en Chile y en el extranjero en la determinación de la diversidad genética y conservación de recursos genéticos en otras especies forestales, lo que podría servi r de modelo para el desarrollo sustentable de nuestras especies nativas. 3. Difusión del proyecto a autoridades y profesionales. Durante el año se recibió un número importante de visitas: autoridades nacionales y profesionales nacionales y extranjeros al Laboratorio de Biotecnología, a quienes se les dio a conocer los objetivos y avance del proyecto. Objetivo 3. Determinar niveles y dirección de la introgresión existente entre las especies. Uso de RAPD Durante esta temporada se seleccionaron seis partidores de RAPD que han diferenciado entre roble y raulí (especie específico). Estos partidores están siendo usados en el análisis de 31 poblaciones naturales que fenotípicamente indican introgresión genética entre ambas especies(Cuadro 3). Cuadro 3. Poblaciones de posibles híbridos naturales entre roble y raulí.

Poblaciones 424-1 438-IV 525-III 424-II 449-I 525-V

424-IV 449-II 537-I 427-I 458-II 537-IV 427-IV 458-III 550-I 427-V 458-V 550-II 428-I 505-II 550-V 428-III 505-IV 428-V 517-III 438-I 517-IV 438-II 525-I 438-III 525-II

La Figura 4 indica la presencia de híbridos (flechas amarillas), entre las 31 poblaciones analizadas.

Figura 4. Partidores que discriminan entre roble y raulí

Rau

lí

Rob

le

H

íbrid

os

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Uso de PCR-RFLP El ADN citoplasmático es de herencia materna y ha permitido estudiar la organización genética de centros de diversidad, establecer relaciones entre los genotipos cultivados y sus materiales silvestres ancestrales. Específicamente, en el caso del cloroplasto (cpADN), a pesar de su tamaño pequeño de 120-180 kb (PALMER, 1987), y de su relativa abundancia, los RFLP generados han sido usados para inferir la variación genética de varios géneros y para establecer relaciones taxonómicas entre especies vegetales (MUENCH Y OTROS, 1991). La conservación alta que presentan los organelos en la mayoría de los vegetales ha permitido diseñar partidores universales que amplifican regiones no codificadoras y que intercalan dos regiones codificadoras (TABERLET Y OTROS, 1991). Estas regiones pueden ser estudiadas por secuenciación o digestión con un número de enzimas de restricción para determinar el número de polimorfismos (RFLP-PCR). Comparada con el procedimiento estándar de RFLP, que usa los organelos completos o sondas de ellos, el análisis de RFLP de regiones amplificadas de ADNcp (PCR-RFLP) tiene varias ventajas, entre ellas destacan su simpleza, cantidad reducida de tejido necesaria para el análisis, y un tiempo y costo reducido. Para estudiar la diversidad de las poblaciones clasificados en base a su fenotipo como híbridos entre roble-raulí, se establecieron los parámetros de amplificación (PCR) y de restricción con enzimas de corte frecuente (RFLP). En el proyecto se están analizando 31 individuos provenientes de poblaciones híbridas. El ADN genómico fue diluído en una concentración de 50 ηg para proceder a la amplificación de los partidores de cloroplasto (Cuadro 3). La condición de amplificación fue de 3 ciclos de 95°C por 1 minuto, 37°C por 1 minuto y 72°C por 1.2 minutos y 37 ciclos de 94°C por 35 segundos, 42°C por 40 segundos, 72°C por 1 minuto; terminando con un período de extensión de 72°C por 10 minutos y un almacenaje a 4°C (Amplitron II, Termolyne). Cuadro 3. Partidores que amplifican regiones conservadas de cloroplasto de 31 individuos híbridos de

Nothofagus. Partidor Cp Región 1 Región 2

1 TrnH [tRNA-His (GUG)] TrnK [TRNA-Lys (UUU) exon 1]

2 TrnN [tRNA-Lys (UUU) exon 1] TrnK [tRNA-Lys (UUU) exon 2]

3 TrnC [tRNA-Cys (GCA)] TrnD [tRNA-Asp (GUC)]

4 TrnD [tRNA-Asp (GUC)] TrnT [tRNA-Thr (GGU)]

5 PsbC [psII 44kd protein] TrnS [tRNA-Ser (UGA)]

6 TrnS [tRNA-Ser (UGA)] TrnfM [Trna-fMet (CAU)]

7 PsaA [PS I (P700 apoprotein A1)] TrnS [tRNA-Ser (GGA)]

8 TrnS [tRNA-Ser (GGA)] TrnT [tRNA-Thr (UGU)]

9 TrnM [tRNA-Met (CAU)] RbcL [RuBisCO large subunit

Digestión de ADN amplificado (RFLP). Terminada la amplificación, ésta se verificó en un gel de agarosa. Posteriormente, se realizó la digestión en un volumen total de reacción de 30 µl, con 10 µl de ADN amplificado, 1X de tampón específico para cada enzima, dependiendo de la enzima de restricción se usaron 5-8 unidades (Cuadro 4) y se completó con H2O destilada estéril. Las muestras se incubaron a 37°C por 2 horas. Para el estudio se usarán un total de 8 enzimas de restricción (Cuadro 4), seleccionadas por la secuencia de corte y la frecuencia de éste.

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Cuadro 3. Enzimas de restricción usadas para producir los RFLP en ADN de cloroplasto de poblaciones híbridas de Nothofagus.

Enzima

endonucleasa

Aislada de Tampón Secuencia de reconocimiento

MboI Moraxella bovis M React2 5`-↓GATC-3` 3`- CTAG↑ - 5`

MseI Micrococcus species React1 5`- T↓TA A-3` 3`- A AT ↑T-5`

NdeI Neisseria dentrificans NRCC 31009

React10 5`- ↓GATC -3` 3`- CTAG↑-5`

RsaI Rhodopseudomonas sphaeroides React1 5`-GT↓AC-3` 3`-CA↑TG-5`

Sau3AI Staphylococcis aureus 3ª React4 5`- ↓GATC-3` 3`- CTAG↑-5`

ThaI Thermoplasma acidophilium React 1 5`- CG↓CG-3` 3`- GC↑GC-5`

StyI Escherichia coli/Salmonella typhi React3 5`-G↓C(AT)(AT )GG-3` 3`-G G(A

T)(AT)C↑C-5` XhoI Xanthomonas campestris React2 5´-C↓TCGA G-3´

3´-G AGCT↑C-5´

Electroforesis del producto de PCR-RFLP Finalizada la incubación de digestión, a cada muestra se le agregó 4 µl de tampón de carga. Los fragmentos fueron separados en geles de agarosa (4%) con el tampón 1X TAE y bromuro de etidio. La electroforesis se realizó a 200 Voltios durante 2,5 hrs. Los geles fueron fotografiados en un transluminador de luz ultravioleta para su evaluación.

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La Figura 4 muestra el monomorfismo hasta ahora detectado en las posibles poblaciones híbridas de Nothofagus, durante esta temporada se completarán los partidores de cloroplasto con las enzimas de restricción del cuadro 3. Objetivo 4. Asociación de distribución geográfica y diversidad genética. La información obtenida en la caracterización genética se está procesando y empezando a formar una base de datos para iniciar los análisis correspondientes. Para este objetivo se solicitó y aceptó por parte del FONTAGRO la compra de un sistema computacional con capacidad para realizar los análisis estadísticos y sirva de base para la incorporación de nuevas poblaciones de las misma especies o género. Objetivo 5. Tener la colección de semilla almacenada en frío (ex situ). Este objetivo planteaba la posibilidad de almacenar la semilla no utilizada en la evaluación molecular en un banco de germoplasma ex situ. Dada la calidad de la semilla colectada, se decidió que un mejor aprovechamiento de este germoplasma era la plantación inmediata de ensayos de procedencia y progenie donde se cumpliría el objetivo de mantener el germoplasma colectado, pero en condiciones in situ, y así tener la posibilidad de evaluar el material de acuerdo a características silvícolas y productivas, para realizar posteriormente la selección de los árboles plus y cumplir de esta manera con el objetivo general del proyecto. Durante este temporada se realizaron controles y trabajos en terreno destinados a mantener estos ensayos en forma adecuada.

Figura 4. Patrones de PCR-RFLP obtenidos con las combinaciones del partidor de cloroplasto 4 y Nde I (A) y Tha I (B) .

Rau

lí

Rob

le

Híb

ridos

A B

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COMPONENTE ARGENTINA, INTA EEA BARILOCHE

METAS PARA EL PERÍODO • Completar la identificación y colección de las poblaciones argentinas y chilenas. • Determinar la variabilidad genética de dos tercios de las poblaciones seleccionadas en estos dos primeros

años. OBJETIVOS • Realizar el análisis de control genético para el establecimiento de la relación inequívoca entre fenotipo y

genotipo. • Analizar la variación y diferenciación genética a través de marcadores isoenzimáticos determinados. • Estudiar la variación de las poblaciones chileno-argentinas a través de marcadores moleculares de ADN

de cloroplasto. ACTIVIDADES DESARROLLADAS POR OBJETIVO

OBJETIVO 1. ESTUDIO DE DIVERSIDAD Y DIFERENCIACIÓN GENÉTICAS DE LAS POBLACIONES ARGENTINAS A. Raulí (Nothofagus nervosa) 1. Análisis genético Previamente al análisis poblacional se realizó el análisis de control genético para la determinación de los marcadores génicos isoenzimáticos. Materiales y métodos Se recolectaron yemas y semillas de polinización abierta de 53 árboles madre pertenecientes a dos poblaciones puras de N. nervosa ubicadas en las cuencas de los lagos Tromen y Huechulafquen, Argentina. Por otro lado, con el fin de determinar la especificidad de dos marcadores génicos (Adh y Pgi) previamente descriptos como posibles marcadores diagnósticos entre N. nervosa y N. obliqua, se recolectaron yemas de 47 árboles más de N. nervosa de la población de Tromen, 110 árboles de una población pura de N. obliqua (Las Lagunas del Epulafquen) y 190 árboles (100 de N. obliqua y 90 de N. nervosa) de la zona de simpatría (Lago Lácar). Las semillas se mantuvieron a 4º C y las yemas a –20º C hasta que fueron utilizadas en los análisis electroforéticos. Se probaron distintos sistemas enzimáticos encontrándose buena resolución y variación en seis de ellos. Se detectaron los árboles madre supuestamente heterocigotas para cada locus putativo y se analizaron al menos 100 semillas de los mismos. Utilizando el método descripto por Gillet & Hattemer (1991) se puso a prueba la hipótesis de segregación 1:1 de las variantes detectadas. Con este método se determinaron ocho loci marcadores. Resultados La superposición de zonas de actividad en los zimogramas de algunos sistemas enzimáticos, la existencia de bandas dobles o triples para genotipos homocigotas y la hibridación natural con Roble Pellín resaltan la importancia del análisis genético previo a la utilización de las variantes fenotípicas como marcadores génicos. Se determinaron ocho marcadores génicos isoenzimáticos: Mdh-B; Mdh-C; Idh; Adh; Got-A; Got -B; Got-C; Pgi (Cuadros4; 5a,b; 6). Dos de estos marcadores (Adh y Pgi) presentaron alelos específicos de especie, permitiendo el seguimiento del proceso de hibridación entre ambas especies (Cuadro 7).

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Cuadro 4. Análisis genético de la zona enzimática MDH-B.

Arbol

madre

Genotipo

materno

Genotipos de la descendencia

N12 N13 N22 N23 N33

∑ χ21

N22+N33=N23

χ22

N12=N13

χ21+2

gl=2

21 H 23 0 1 18 72 37 128 2,28 ns 1 ns 3,27 ns

24 H 23 0 11 28 47 40 126 3,83 ns 11 * 14,83 *

3 T ? 10 4 49 25 16 104 17,78 * 2,57 ns 20,35 *

6 T 23 3 22 16 37 19 97 0,06 ns 14,44 * 14,50*

10 T ? 1 3 24 6 11 45 20,51 * 1,00 ns 21,51*

17 T ? 6 8 35 40 4 93 0,01 ns 0,29 ns 0,30 ns

24 T ? 3 1 29 54 2 89 6,22 * 1,00 ns 7,22 *

30 T 23 0 43 5 25 34 107 3,06 ns 43,00 * 46,06*

21 T ? 0 10 0 30 60 100

Hipótesis evaluada: N22 + N33 = N23 y N12 = N13. ∑: tamaño de la muestra. H: Población del Lago Huechulafquen; T: Población del Lago Tromen. ns: no significativo; * P < 0,05.

Cuadro 5a. Análisis genético de la enzima GOT.

Arbol Genotipo de la descendencia ∑ χ2 11 12 22 gl=1

9 H 24 52 24 100 0,16 ns

10 H 30 56 14 100 1,44 ns

24 H 60 37 3 100 6,76 *

29T 45 54 8 107 0,00 ns

21T 17 47 36 100 0,36 ns

24T 44 40 16 100 4,00*

21 H 67 22 9 98 29,76*

17T 68 29 4 101 18,31*

30T 55 34 11 100 10,24*

3T 0 18 21 39

13T 83 22 0 105

16 H 67 27 0 94

6T 39 25 0 64

16T 35 17 0 52

10T 27 12 0 39

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Tabla 5.b

Arbol Got-B ∑ χ2 Got-C ∑ χ2 N11 N12 N22 gl=1 N11 N12 N22 gl=1

9 H 3 45 56 104 1,88 ns 2 46 56 104 1,38 ns

10 H 8 53 43 104 0,04 ns 8 53 43 104 0,04 ns

16 H 4 44 52 100 1,44 ns 4 44 52 100 1,44 ns

24 H 3 53 46 102 0,16 ns 3 50 49 102 0,04 ns

13T 2 53 45 100 0,36 ns 2 54 45 101 0,49 ns

29T 12 87 1 100 54,76* 12 88 0 100

6T 0 4 59 63 0 4 55 59

16T 0 20 33 53 0 20 31 51

17T 0 1 103 104 0 1 103 104

21T 0 1 102 102 0 1 102 103

24T 0 0 86 86 0 0 86 86

21 H 0 0 92 92 0 0 99 99

30T 0 0 105 105 0 0 105 105

3T 0 0 38 38 0 0 38 38

10T 0 0 37 37 0 0 33 33

25T 0 1 21 22 0 1 20 21

Hipótesis evaluada: N11+N22=N12. ∑: tamaño de la muestra. H: Población del Lago Huechulafquen; T: Población del Lago Tromen. a) Got-A; b) Got-B y Got-C. ns: no significativo; * P < 0,05.

Tabla 6. Análisis genético de la enzima IDH.

Arbol

Madre

Genotipo

materno

Genotipo de la descendencia

N11 N12 N22

∑ χ2

gl=1

21 H 12 59 39 2 100 4,84 *

24 H 12 68 49 6 123 5,08*

3 T 12 39 51 10 100 0,04 ns

6 T 12 40 50 15 105 0,24 ns

17 T 12 54 40 6 100 4,00 *

21 T 12 46 44 10 100 1,44 ns

24 T 12 51 46 12 109 2,65 ns

30 T 12 50 40 10 100 4,00 *

7 T 11 41 2 0 43

10 T 11 43 10 0 53

25 T 22 0 20 16 36

Hipótesis evaluada: N11 + N22 = N12. ∑: tamaño de la muestra. H: Población del Lago Huechulafquen; T: Población del Lago Tromen. ns: no significativo; * P < 0,05.

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Tabla 7. Determinación de marcadores específicos de especie en árboles adultos de Nothofagus nervosa y N. obliqua de poblaciones puras y de zona de simpatría.

Loci Pgi Adh Mdh

Población 11 12 22 11 12 22 12 22 23 33 24 44 45

N. obliqua Zona pura 0 2 99 32 0 0 3 78 3 2 0 0 0

N. obliqua Zona simpatría 0 14 78 21 0 0 6 78 3 0 2 0 0

N. nervosa Zona simpatría 89 0 0 0 0 67 0 0 0 0 0 87 2

N. nervosa Zona pura 114 0 0 0 0 28 0 0 0 0 0 114 1

2. Análisis poblacional Materiales y métodos Con los marcadores determinados se analizaron la diversidad y diferenciación genéticas en 9 poblaciones de Raulí a las que se agregaron 11, siendo el total de 20 poblaciones de Argentina y tres de Chile. En cada población se estudió un mínimo de 100 semillas analizando los ocho loci marcadores. Resultados Se detectaron altos niveles de variación intrapoblacional con un número medio de alelos (AL) de 3,38, diversidad génica (ν) de 1,29, heterocigosis observada (Ho) y esperada (He) de 15,9 % y 18,1 % respectivamente. La diferenciación de cada población respecto a las restantes (Dj) varió entre 2,4 % y 8,1 % siendo el valor medio de diferenciación entre poblaciones (δ) de 4,7 % (Cuadro 8 y Figura 5). Todos estos parámetros fueron variables entre las poblaciones, incluso entre aquellas cercanas y pertenecientes a una misma cuenca lacustre. Las poblaciones más diferenciadas se encontraron en el sector occidental de la distribución, mientras que las mayores proporciones de semillas híbridas se observaron entre las poblaciones del este, detectándose altos porcentajes de retrocruzas en algunas de ellas. Las poblaciones de Chile mostraron niveles menores de variación.

15

Cuadro 8. Diversidad genética en las poblaciones de Raulí estudiadas.

Pob. Locus

Mdh-B Mdh-C Idh Adh Got-A Got-B Got-C Pgi Pool génico

ν Ho He ν Ho He ν Ho He ν Ho He ν Ho He ν Ho He ν Ho He ν Ho He P AL ν Ho He

1 1,94 0,49 0,49 1,00 0,00 0,00 1,12 0,10 0,11 1,00 0,00 0,00 1,91 0,43 0,48 1,12 0,10 0,11 1,19 0,16 0,16 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,20 0,16 0,17

4 2,04 0,61 0,51 1,01 0,01 0,01 1,06 0,06 0,06 1,00 0,00 0,00 1,54 0,18 0,35 1,01 0,01 0,01 1,01 0,01 0,01 1,00 0,00 0,00 75,0 1,88 1,13 0,11 0,12

5 2,10 0,56 0,52 1,00 0,00 0,00 1,69 0,45 0,41 1,00 0,00 0,00 1,81 0,52 0,45 1,06 0,06 0,06 1,05 0,05 0,04 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,23 0,20 0,19

6 1,79 0,40 0,44 1,00 0,00 0,00 1,13 0,10 0,12 1,00 0,00 0,00 1,96 0,35 0,49 1,08 0,08 0,08 1,08 0,08 0,08 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,18 0,13 0,15

8 1,97 0,37 0,49 1,02 0,02 0,02 1,05 0,05 0,05 1,00 0,00 0,00 1,66 0,40 0,40 1,08 0,08 0,08 1,08 0,08 0,08 1,01 0,01 0,01 87,5 1,88 1,16 0,13 0,14

10 1,85 0,47 0,46 1,07 0,04 0,07 1,08 0,06 0,08 1,05 0,04 0,05 1,89 0,46 0,47 1,12 0,11 0,10 1,12 0,11 0,10 1,06 0,04 0,06 100 2,38 1,21 0,17 0,17

11 1,91 0,47 0,48 1,03 0,03 0,03 1,19 0,14 0,16 1,04 0,03 0,04 1,61 0,36 0,38 1,05 0,05 0,05 1,05 0,05 0,05 1,06 0,03 0,06 100 2,25 1,18 0,14 0,16

12 1,88 0,32 0,47 1,00 0,00 0,00 1,34 0,19 0,25 1,00 0,00 0,00 1,76 0,37 0,43 1,20 0,18 0,17 1,20 0,18 0,17 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,23 0,16 0,19

14 2,02 0,40 0,50 1,01 0,01 0,01 1,05 0,05 0,04 1,01 0,01 0,01 1,83 0,48 0,45 1,81 0,45 0,45 1,86 0,44 0,46 1,01 0,01 0,01 100 2,50 1,32 0,23 0,24

16 2,00 0,44 0,50 1,06 0,06 0,06 1,13 0,12 0,11 1,00 0,00 0,00 1,92 0,51 0,48 1,19 0,14 0,16 1,20 0,15 0,17 1,00 0,00 0,00 75,0 1,75 1,23 0,18 0,19

17 2,09 0,59 0,52 1,00 0,00 0,00 1,03 0,03 0,03 1,04 0,04 0,04 1,35 0,25 0,26 1,10 0,10 0,09 1,10 0,09 0,09 1,00 0,00 0,00 75,0 1,88 1,15 0,14 0,13

18 1,97 0,43 0,49 1,00 0,00 0,00 1,19 0,15 0,16 1,00 0,00 0,00 1,74 0,32 0,43 1,09 0,09 0,08 1,06 0,06 0,06 1,02 0,00 0,00 62,5 1,75 1,18 0,13 0,15

19 2,01 0,52 0,50 1,02 0,00 0,02 1,59 0,38 0,37 1,01 0,01 0,01 1,54 0,36 0,35 1,22 0,20 0,18 1,21 0,19 0,18 1,01 0,01 0,01 100 2,38 1,25 0,21 0,20

21 1,94 0,31 0,48 1,00 0,00 0,00 1,14 0,14 0,13 1,00 0,00 0,00 1,87 0,41 0,47 1,27 0,22 0,21 1,26 0,21 0,20 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,23 0,16 0,19

23 1,58 0,28 0,37 1,00 0,00 0,00 1,12 0,11 0,11 1,00 0,00 0,00 1,90 0,34 0,47 1,15 0,14 0,13 1,15 0,14 0,13 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,16 0,13 0,15

24 2,02 0,53 0,50 1,02 0,02 0,02 1,30 0,24 0,23 1,00 0,00 0,00 1,95 0,48 0,49 1,09 0,09 0,09 1,09 0,08 0,08 1,00 0,00 0,00 75,0 2,13 1,21 0,18 0,18

26 1,95 0,47 0,49 1,06 0,06 0,06 1,20 0,10 0,17 1,00 0,00 0,00 1,55 0,32 0,35 1,09 0,06 0,08 1,06 0,04 0,05 1,00 0,00 0,00 75,0 2,25 1,18 0,13 0,15

27 2,17 0,46 0,54 1,02 0,02 0,02 1,53 0,31 0,35 1,00 0,00 0,00 1,97 0,40 0,49 1,06 0,05 0,05 1,06 0,05 0,05 1,02 0,02 0,02 87,5 2,13 1,23 0,16 0,19

28 2,11 0,41 0,53 1,00 0,00 0,00 1,52 0,29 0,34 1,00 0,00 0,00 1,85 0,36 0,46 1,06 0,06 0,06 1,07 0,07 0,06 1,00 0,00 0,00 62,5 1,75 1,22 0,15 0,18

30 2,14 0,52 0,53 1,00 0,00 0,00 1,39 0,28 0,28 1,00 0,00 0,00 1,98 0,38 0,50 1,17 0,14 0,14 1,17 0,14 0,14 1,01 0,01 0,01 75,0 1,88 1,25 0,18 0,20

Ne 1,77 0,54 0,43 1,04 0,04 0,04 1,06 0,06 0,06 1,01 0,01 0,01 1,85 0,44 0,46 1,08 0,05 0,07 1,07 0,05 0,07 1,01 0,01 0,01 100 2,25 1,17 0,15 0,14

Ma 2,01 0,44 0,50 1,01 0,01 0,01 1,16 0,13 0,13 1,02 0,02 0,02 1,35 0,29 0,26 1,07 0,07 0,07 1,05 0,05 0,05 1,02 0,02 0,02 100 2,13 1,15 0,13 0,13

Na 1,80 0,41 0,44 1,02 0,02 0,02 1,16 0,15 0,14 1,02 0,02 0,02 1,99 0,43 0,50 1,04 0,04 0,04 1,04 0,04 0,04 1,08 0,08 0,08 100 2,00 1,19 0,15 0,16

Diversidad génica (ν), heterocigosis observada (Ho), heterocigosis esperada (He) (Nei, 1973), porcentaje de loci polimórficos (P) y número medio de alelos por locus (AL) para cada locus y para el pool génico en poblaciones de Argentina y Chile (Ne: Neltume, Ma: Mallalcahuello, Na: Nahuelbuta)

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Figura 5. “Caracoles de diferenciación”, según Gregorius & Roberds (1986) para el pool génico y los ocho loci analizados. Cada sección corresponde a una población y cada color a poblaciones de una misma cuenca lacustre. El radio de cada sección representa la diferenciación de dicha población con respecto a su complemento (Dj) y el ángulo representa el tamaño proporcional de cada población (cj). El círculo en línea punteada corresponde al nivel de diferenciación media entre poblaciones (δ).

B. Roble Pellín (Nothofagus obliqua)

1. Análisis genético En Chile y Argentina la distribución de Nothofagus obliqua está dividida en Regiones de Procedencia, conformadas por áreas o conjunto de áreas con condiciones ecológicas uniformes, según el Ordenamiento de la Tierra de Schlatter, basado principalmente en un factor climático con apoyo de mapas de vegetación y de tipos forestales, que abarcan la Cordillera de la Costa, Valle Medio o Longitudinal y Cordillera de los Andes. La utilización de un carácter como marcador génico requiere el establecimiento de la relación unívoca entre el fenotipo y cada uno de los genes involucrados en su expresión. Esto se logra a

14

5

19

30

17

26

11

27

4

23 6 10

16

12

18

8

21

28

1 24

Pool génicoδ=0,047

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

16

través del análisis de control genético, que determina el modo de herencia (modo de transmisión y modo de acción génica) de los fenotipos enzimáticos. Materiales y Método Para este análisis se utilizaron yemas de árbol madre y semilla producto de la polinización abierta, cosechada en forma individual de 45 árboles de 3 poblaciones (Quila Quina, Las Lagunas de Epulafquen y Pilolil). Se analizaron 100 individuos medio hermanos por madre que presentó genotipo heterocigota para el sistema evaluado. En este estudio se aplicó el Método de Árbol Individual, desarrollado por GILLET Y HATTEMER (1991), y en el que no resulta necesaria la realización de cruzamientos controlados, tarea que se torna dificultosa en el caso de especies forestales. Para la confirmación cualitativa y cuantitativa de la hipótesis de segregación Mendeliana planteada, se realiza un análisis estadístico de Chi cuadrado, donde la hipótesis a probar es N12 = N11 + N22. Resultados Los sistemas isoenzimáticos analizados correspondieron a aquellos que mostraron buena resolución y polimorfismo en el ajuste de técnica y estudio exploratorio previo. Los sistemas isoenzimáticos evaluados se detallan a continuación: Mdh (Malate dehydrogenase), Skdh (Shikimic acid dehydrogenase, Idh ((Isocitrate dehydrogenase), Adh (Alcohol dehydrogenase), Pgm (Phosphoglucomutase), Pgi (Phosphoglucose isomerase) y Got (Glutamate oxalacetate transaminase). Sistema isoenzimático Skdh (shikimate dehydrogenase) En este sistema se encontró una única zona de actividad.

Genotipos progenie Árbol madre Nº Genotipo madre N11 N12 N22 Σ χ2

Pilolil 1 12 7 52 36 95 1,88 ns Quila Quina 24 12 32 54 11 97 2,81 ns Quila Quina 34 12 15 55 42 112 0,07 ns Quila Quina 35 12 35 70 40 145 0,33 ns Quila Quina 45 12 39 62 9 110 4,08 ns Las Lagunas 9 12 29 29 0 58 0,00 ns ns: no significativo *: significativo al nivel del 5% Sistema isoenzimático Idh-B (isoocitrate dehydrogenase ) Se encontraron dos zonas de actividad. La zona A aparentemente polimórfica pero con mala resolución e irregular. La zona B polimórfica fue la que se analizó. En esta zona se vieron cuatro alelos, dos de ellos no se presentaron en estado homocigota. Confirmación cuantitativa de la hipótesis

Genotipos progenie

Árbol madre Nº Genotipo madre

N22 N23 N33 N13 Σ χ2

Pilolil 1 23 0 56 54 13 123 0,07 ns Pilolil 7 23 0 48 53 2 103 0,47 ns Quila Quina 31 23 0 22 29 3 54 1,68 ns Quila Quina 36 23 0 30 48 0 78 6,75 * Quila Quina 45 23 0 68 84 3 157 3,04 ns ns: no significativo *: significativo al nivel del 5%

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Confirmación cualitativa de la hipótesis (alelos 1 y 2)

Genotipos progenie Σ Árbol madre Nº Genotipo madre N23 N33 N13

Pilolil 2 33 14 116 0 130 Pilolil 8 33 6 118 1 125 Quila Quina 26 33 6 91 1 98 Quila Quina 34 33 5 119 0 124 Quila Quina 35 33 4 148 0 152 Quila Quina 58 33 14 27 3 44 Intendencia 1 33 7 40 1 48

Sistema Adh (alcohol dehydrogenase) Una única zona de actividad. Se localizó un único individuo heterocigota, sobre el que se aplicó el Método para la confirmación cuantitativa. El resto de las madres y progenies analizadas permitió la confirmación cualitativa de la hipótesis. Confirmación cuantitativa de la hipótesis

Genotipos progenie Σ χ2

Árbol madre Nº Genotipo madre N11 N12 N22

Pilolil 8 12 73 77 10 160 0,43 ns ns: no significativo *: significativo al nivel del 5% Confirmación cualitativa de la hipótesis

Genotipos progenie Σ Árbol madre Nº Genotipo madre N11 N12 N22

Pilolil 1 11 114 21 0 135 Pilolil 2 11 109 19 0 128 Pilolil 7 11 88 16 0 104 Quila Quina 35 11 47 1 0 48 Quila Quina 25 11 30 1 0 31 Quila Quina 45 11 158 2 0 160 Intendencia 1 11 59 3 0 62 Sistema Pgm (phosphoglucomutase) Dos zonas de actividad. La zona A con buena resolución y polimórfica.

Genotipos progenie Σ χ2

Árbol madre Nº Genotipo madre N11 N12 N22

Pilolil 1 12 62 20 17 99 44,06 * Pilolil 2 12 38 29 38 105 29,07 * Pilolil 7 12 30 18 25 73 24,89 * Pilolil 8 12 43 15 12 70 29.09 * Quila Quina 26 12 36 29 14 79 8,82 * Quila Quina 34 12 59 19 4 82 30,73 * Quila Quina 35 12 53 20 31 104 48,76 * Quila Quina 45 12 29 26 43 98 29,39 * Intendencia 1 12 6 24 23 53 0,86 ns Las Lagunas 44 12 27 9 7 43 18,38 * ns: no significativo *: significativo al nivel del 5%

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Sistema isoenzimático Got (glutamate oxalacetate transaminase) Esta enzima presentó tres zonas de actividad. Las zonas B y C resultaron polimórficas, si bien no se hallaron individuos madres heterocigotas para estas zonas, por lo que la hipótesis de segregación se planteó únicamente en forma cualitativa. La zona B presentó el patrón de bandas del homocigota (simple banda) y del heterocigota (triple banda), mientras que la zona C presentó dos patrones (simple y doble banda). Confirmación cualitativa Got-B

Genotipos progenie Σ Árbol madre Nº Genotipo madre N11 N12 N22

Pilolil 1 11 120 0 0 120 Pilolil 2 11 117 0 0 117 Pilolil 7 11 106 0 0 106 Pilolil 8 11 109 0 0 109 Quila Quina 34 11 129 1 0 130 Quila Quina 35 11 146 13 0 159 Quila Quina 45 11 134 0 0 134 Las Lagunas 9 11 84 0 0 84 Intendencia 1 11 64 0 0 64

Los sistemas isoenzimáticos Mdh (malate dehydrogenase) y Pgi (phoshoglucoisomerase) se están evaluando a la fecha debido al patrón de bandas complejo que presentaron. Conclusiones A partir del análisis de control genético llevado a cabo podemos decir que contamos, hasta el momento, con 6 loci marcadores, que corresponden a 5 sistemas isoenzimáticos y 14 alelos con los cuales llevar adelante los estudios de diversidad genética planteados en el presente Proyecto. Si bien para el sistema Pgm no pudo comprobarse la hipótesis cuantitativa, se podría inferir el no cumplimiento en este sistema de alguno de los supuestos necesarios para la aplicación del Método de Hattemer y Gillet. El patrón simple con buena resolución impediría pensar en errores en la lectura de los mencionados zimogramas. 2. Análisis poblacional Materiales y métodos Para el estudio de la diversidad y diferenciación genéticas se seleccionaron 9 poblaciones a las que se agregaron 5 poblaciones, totalizando 14 poblaciones. Las poblaciones cubren el gradiente latitudinal de la especie en Argentina. • Cuenca Lagunas de Epulaufquen: 1 población • Cuenca del Lago Ñorquinco: 3 poblaciones • Cuenca del Lago Quillén: 3 poblaciones • Cuenca Río Aluminé - Pilolil: 1 población • Cuenca Lago Lácar Bandurrias, Rodal Semillero, Nonthué, Quila Quina, Hua Hum y Pío

Protto: 6 poblaciones El análisis isoenzimático de las poblaciones se llevó a cabo con semilla producto de la cosecha con redes dispuestas de manera aleatoria previo a la época de caída de los frutos, de modo de captar semillas de al menos 40 individuos por población. Se analizaron 100 semillas de cada una de las poblaciones del rango de distribución natural de la especie. La cosecha de semilla se realizó con el apoyo logístico de la Administración de Parques Nacionales, Parque Nacional Lanín.

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En esta etapa se procedió al estudio de las frecuencias alélicas y genotípicas de las poblaciones bajo estudio, a través de los loci marcadores identificados en el análisis de control genético. Resultados Los datos obtenidos en laboratorio permitieron confeccionar tablas de frecuencias genotípicas y alélicas de las poblaciones bajo estudio, que posibilitan un primer acercamiento a su diversidad genética. Actualmente se está llevando a cabo el ingreso de los datos en una base para su utilización posterior en programas para la determinación de parámetros genéticos que caractericen la diversidad y diferenciación existentes en las poblaciones. En la Figura 6 se observa cómo la menor frecuencia genotípica para Adh corresponde al genotipo homocigota para el alelo 2, alelo específico de Nothofagus nervosa (GALLO et al., 1997), presente en poblaciones de las cuencas del Lago Ñorquinco, Lácar (Nonthué) y Pilolil. Esto permitiría inferir la presencia de individuos adultos heterocigotas, hecho que pudo ser confirmado únicamente y hasta el momento en la población Pilolil durante el desarrollo del análisis de control genético (Árbol 8). Figura 6. Frecuencias genotípicas sistema Adh por poblaciones

En la Figura 3 se muestra la frecuencia de los cuatro alelos presentes en Idh-B, tomando a las poblaciones en conjunto. La presencia de los alelos de menor frecuencia (1 y 4) se encuentra circunscripta a determinadas cuencas lacustres (Figuras 8 y 9).

Frecuencias genotipos Adh

010

20304050

607080

90100

11 12 22Genotipos

%

Bandurrias 1 Rodal Semillero Nonthué 3 Hua Hum 4 Pío Protto 5 Quillén 6 Quillén 7 Quillén 8 Ñorquinco 9 Ñorquinco 10 Ñorquinco 11 Pilolil 12 Las Lagunas 13Quila Quina 14

20

Figura 7. Frecuencia alélica Sistema Idh-B

Figura 8. Frecuencia alelo 1 Sistema Idh-B Figura 9. Frecuencia alelo 4 Sistema Idh-B

Frecuencia alelos Sistema Idh-B

3%

1%

88%

8%

Alelo 1

Alelo 2

Alelo 3

Alelo 4

Frecuencia alelo 4 Sistema Idh-B

8,6%

0,3%1,2%9,6%

35,0%30,4%

4,3%

3,8%

6,8%

Bandurrias 1 Pío Protto 5 Quillén 6 Quillén 7 Quillén 8 Ñorquinco 9 Ñorquinco 10 Ñorquinco 11 Pilolil 12

Frecuencia alelo 1 Sistema Idh-B

18,7%

57,8%

12,9%10,5%

Quillén 6 Quillén 7

Pilolil 12

Quila Quina 14

21

OBJETIVO 2. ESTUDIO DE LA VARIACIÓN DE LAS POBLACIONES CHILENO-ARGENTINAS A TRAVËS DE MARCADORES MOLECULARES DE ADN DE CLOROPLASTO. A. Raulí (N. nervosa) La elevada conservación del genoma cloroplástico y la herencia clonal permiten que las variantes haplotípicas se mantengan en un linaje a través de las generaciones. La baja tasa de mutaciones de este genoma, la herencia materna y la escasa dispersión de las semillas en Raulí facilitan la diferenciación entre poblaciones y el seguimiento de los caminos migratorios recorridos por las distintas poblaciones de la especie luego de las glaciaciones del Cuaternario. Materiales y métodos Mediante las técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) y RFLP (Polimorfismo en el Largo de los Fragmentos de Restricción) se buscaron regiones variables en el genoma cloroplástico de Raulí. Se analizaron hasta el momento las mismas 20 poblaciones de Argentina analizadas con marcadores isoenzimáticos y 11 de Chile. Se utilizaron primers universales descriptos por TABERLET et al., 1991; DEMESURE et al., 1995; DUMOLIN-LÁPEGUE et al., 1997 Resultados Se detectaron dos fragmentos polimórficos con las combinaciones primer/enzima FV/TaqI y DT/HaeIII DT/TaqI. El polimorfismo permitió la identificación de cinco haplotipos: dos entre las poblaciones de Argentina y los 5 entre las poblaciones de Chile. La distribución geográfica de los haplotipos presenta un marcado sentido latitudinal en Argentina así como también en Chile (Figura 10), donde a su vez se diferencian las poblaciones situadas en la Cordilleras de la Costa de aquellas pertenecientes a la Cordillera de los Andes. La identificación de distintos haplotipos cloroplásticos sugiere la expansión de las poblaciones a partir de diferentes refugios glaciarios.

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Figura 10. Ubicación geográfica de los dos haplotipos encontrados entre las poblaciones de Nothofagus

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B. Roble Pellín (Nothofagus obliqua) Materiales y métodos Para este análisis se evaluaron 10 individuos en dos poblaciones con el objetivo de verificar la posible existencia de variación intrapoblacional. En caso de comprobar la falta de variación dentro de estas dos poblaciones, el tamaño muestral se reduciría a 5 individuos para el resto de las poblaciones (e.g. MÁTYÁS and SPERISEN, 2001). Para el estudio a través de cpADN se utilizó tejido foliar de plántulas obtenidas en vivero (invernáculo y cantero) para este fin. A partir de este tejido se prepararon los polvos de nitrógeno con mortero, para luego realizar la extracción de ADN (método adaptado de DOYLE AND DOYLE, 1990 (DUMOLIN et al., 1995).

Hasta la fecha se evaluaron 4 poblaciones argentinas, utilizando la combinación primer-enzima DT - HaeIII (Cuadro 9).

Resultados Parciales

Cuadro 9. Haplotipos para el par DT-HaeIII poblaciones Argentina N. Obliqua

Población Haplotipo

Qullén 6 NORTE

Pilolil 12 NORTE

Pío Protto SUR

Quila Quina SUR

Los resultados obtenidos hasta la fecha coinciden con lo hallado para Nothofagus nervosa Raulí. Actualmente se continúa con el análisis de las poblaciones de Argentina, mientras que el material de Chile está conservado en freezer de ultrafrío (-80ºC), hasta su utilización.

A través de este análisis se espera encontrar una diferenciación genética en las poblaciones analizadas a partir de haplotipos, que permita inferir la existencia de posibles refugios glaciarios y reconstrucción de rutas migratorias de la especie luego de la retracción de los hielos. 3. OTRAS ACTIVIDADES REALIZADAS Cosecha de semilla Debido a que el año 2001 fue un año de mala producción de semilla de Roble Pellín (Comunicación Personal de APN Lanín e Informes Guardaparques de las distintas Seccionales del Parque), se condujo una nueva cosecha de semilla. La cosecha se realizó en forma conjunta con APN, Parque Nacional Lanín, a través de redes dispuestas en los distintos rodales a 1,5 m de altura y de manera tal de captar un total de 40 árboles productores. De esta manera, se logró obtener semilla de las 14 poblaciones a analizar y se completó la colección de semilla (conservada a 4ºC) de Nothofagus obliqua, poblaciones Argentina. En Raulí ya se cuenta con el material seminal de 20 poblaciones el cual se encuentra almacenado a 4º C.

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