caracterización de una actividad d-malato oxidasa y
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TESIS DOCTORAL
CARACTERIZACIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA Y ESTUDIO DE LOS SISTEMAS DE DEFENSA FRENTE A DNAs EXOacuteGENOS EN Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344
Ana Beleacuten Goacutemez Poblacioacuten
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
2020
TESIS DOCTORAL
CARACTERIZACIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA Y ESTUDIO DE LOS SISTEMAS DE DEFENSA FRENTE A DNAs EXOacuteGENOS EN Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344
Ana Beleacuten Goacutemez Poblacioacuten
PROGRAMA DE DOCTORADO EN CIENCIA DE LOS ALIMENTOS
Conformidad de los Directores
La conformidad de los directores de la tesis consta en el original en papel de esta Tesis Doctoral
Faustino Merchaacuten Sorio Rafael Blasco Plaacute
2020
A mi madre
De todas las islas visitadas dos eran portentosas La isla
del pasado dijo en donde soacutelo existiacutea el tiempo pasado y en la
cual sus moradores se aburriacutean y eran razonablemente felices
pero en donde el peso de lo ilusorio era tal que la isla se iba
hundiendo cada diacutea un poco maacutes en el riacuteo Y la isla del futuro
en donde el uacutenico tiempo que existiacutea era el futuro y cuyos
habitantes eran sontildeadores y agresivos tan agresivos dijo
Ulises que probablemente acabariacutean comieacutendose los unos a los
otrosldquo
ldquoLos detectives salvajesrdquo
Roberto Bolantildeo
ldquo
A G R A D E C I M I E N T O S
Ante todo quiero agradecer a la Fundacioacuten Tatiana Peacuterez de Guzmaacuten el Bueno por concederme la Beca de Investigacioacuten con la cual ha sido posible la realizacioacuten de esta Tesis Gracias a la Junta de Patronato al Equipo Directivo y al Equipo de Gestioacuten No soacutelo habeacuteis apoyado el proyecto sino que me habeacuteis hecho sentir partiacutecipe de vuestra gran labor La ilusioacuten el trabajo y el empentildeo por mejorar que infundiacutes en todo lo que haceacuteis ha sido un gran ejemplo para miacute Gracias a Blanca por su paciencia y comprensioacuten somos muchos a los que ayuda la Fundacioacuten y conoces el nombre de cada uno de nosotros Al grupo de whatsapp FTPGB Rociacuteo Elena Miriam Isabel y Cris Gracias por estar ahiacute
Al Dr Juan Luis Ramos Martiacuten (Grupo de investigacioacuten Microbiologiacutea ambiental y biodegradacioacuten Centro Experimental del Zaidiacuten Granada Espantildea) y al Dr Viacutector de Lorenzo (Centro Nacional de Biotecnologiacutea Madrid Espantildea) gracias por las bacterias y plaacutesmidos que me habeacuteis cedido con tanta amabilidad
A mis directores los Doctores D Rafael Blasco Plaacute y D Faustino Merchaacuten Sorio asiacute como al resto de componentes del grupo de investigacioacuten Dra Mariacutea Isabel Igentildeo y Dra Mariacutea Isabel Guijo Tambieacuten debo agradecer a la Dra Inmaculada Romero su ayuda en todo momento
A todos los profesores del departamento con los que he compartido en estos antildeos risas y cafeacutes a Maribel y a Chus por esas sobremesas tan entretenidas y por todos sus consejos seguiacutes siendo mis favoritas A Julia por tener siempre palabras amables a Alberto por su paciencia y por concederme siempre 5 minutos cuando le necesitaba A Marisa que siempre me ha dedicado una sonrisa y ha apostado por miacute A Ineacutes por sus alocadas charlas
A Gloria que me ha ensentildeado y ayudado con una generosidad infinita Esta Tesis tambieacuten es tuya No soacutelo has sido compantildeera de trabajo sino que te has convertido en amiga Eres una gran profesional pero mejor persona Perdona por los dramas que me has soportado Has sido un gran apoyo muchas veces penseacute en dejarlo todo y otras tantas me animaste para que siguiera adelante Te admiro y tienes todos mis respetos
A Aacutelex el tipo maacutes noble que conozco Gracias por esos cafeacutes y esas charlas Eres grande y aun asiacute tienes una humildad asombrosa
A Juan Carlos Ricardo y Raquel sois los relojeros que lograacuteis que todo funcione sin que nos demos cuenta Gracias por todas vuestras atenciones Gracias por las tertulias de pasillo con las que tanto he disfrutado
A mis compantildeeros becarios en especial a Patricia y Mariela Gracias por vuestro apoyo Patricia gracias por ensentildearme los secretos de la PCR y por tu paciencia eres inteligente y guapa y no me cabe duda de que triunfaraacutes en la vida Te lo mereces todo Al Dr Joseacute Aacutengel Padilla gracias por ayudarme siempre que lo he necesitado
8
A todos los alumnos de Bioquiacutemica que he tenido el placer de conocer Rahim Elena Pablo Carmen Lourdes Irene Nieves Inma y Ana Siento que hayaacuteis tenido que padecer todas mis maniacuteas Gracias por dejarme ser parte de vuestras vidas
A Pedro Manolo Luisa y Adam por esos cafeacutes que te despiertan al primer sorbo gracias por ser tan amables y simpaacuteticos
A mi estado matriarcal Abuela Madre y Tiacutea Soy lo que soy gracias y a pesar de ellas A mi Abuela mujer fuerte y trabajadora a la que le tocoacute vivir en una eacutepoca dura y complicada con todo ello siempre mantuvo la entereza A mi madre por su amor y por inculcarnos a mis hermanos y a miacute sus valores en el trabajo y en la vida por ensentildearnos que el humor y la bondad son nuestras sentildeas de identidad A mi Tiacutea Ino con la que nunca estoy de acuerdo pero a la que adoro ella fue la primera que me habloacute de los microbios y despertoacute en miacute la curiosidad infantil por unos bichitos que no se ven pero que estaacuten ahiacute Todas ellas me ensentildearon a no conformarme a que nunca es suficiente y a ser criacutetica no a dejarme llevar por la autocomplacencia Al resto de mi pequentildea familia a mis hermanos Chus y David A mis sobrinos Mariacutea y Alejandro a los que tanto quiero A mi tiacuteo Isidoro y a su fabulosa familia A mi tiacuteo Antonio que vivioacute seguacuten sus reglas y siempre fue un soplo de aire fresco A mi tiacuteo Blas escribo estas palabras sabiendo que ha superado la infeccioacuten por coronavirus pero que su cuerpo estaacute cansado y con pocas fuerzas para la lucha
A mi amor Rafa que me quiere me aguanta y me soporta No podemos estar maacutes en desacuerdo y al mismo tiempo maacutes en consonancia Eres mi compantildeero de viaje Por todo lo que vales y por todo lo que me aportas Te quiero
A mis perritos Dul que se fue justo al empezar esta Tesis y Flamenca que ha llegado casi al final A mi perripandi personas maravillosas con las que comparto el final del diacutea
A todos mis amigos Manguumle Elia Elisa Isabel y Aacutengel Mariacutea y Mario Eva Gema y Manolo Patricia y Fernando Alicia Delia Olga Maribel y Jenaro Beatriz Sabrina y Carlos Olga y Diego Elena L Elena V Emilia y Viacutector Mely y Juan Andreacutes Sofiacutea y Nano Mordf Paz y Chuchi Juani Noelia Juanma Inma y Carlos Romanillos Loli Seguramente falteacuteis muchos en esta lista imperfecta pero todos los que se fueron los que estaacuteis y los que llegaraacuten podeacuteis contar conmigo iexclNos vemos en los bares
A Carlota Candela Adolfo y Mariacutea que me tienen preparada una habitacioacuten en Alemania iexclOs quiero chicos
F I N A N C I A C I Oacute N
FUNDACIOacuteN TATIANA PEacuteREZ DE
GUZMAacuteN EL BUENO
- Beca Predoctoral de 2015-2018
UNIVERSIDAD DE EXTREMADURA
- PPGRU15C6
- PPGRU16C6
- PLAN DE INICIACIOacuteN A LA INVESTIGACIOacuteN
DESARROLLO TECNOLOacuteGICO E INNOVACIOacuteN 2018
ACCIOacuteN III DCPI0591
JUNTA DE EXTREMADURA
- GR15083
- IB16062
P U B L I C A C I O N E S
El trabajo que se presenta en esta memoria de Tesis Doctoral se ha realizado en
el Grupo de Biotecnologiacutea de Microorganismos (BIOMIC) del Departamento de
Bioquiacutemica y Biologiacutea Molecular y Geneacutetica de la Facultad de Veterinaria de la
Universidad de Extremadura
Parte de los resultados de este trabajo se ha presentado en el siguiente
congreso
bull XIV Reunioacuten Nacional del Metabolismo del Nitroacutegeno Segovia 16 ndash 18 de
mayo de 2018
Parte de los resultados obtenidos durante el desarrollo de esta Tesis Doctoral se
han incluido en las siguientes publicaciones cientiacuteficas
bull Igentildeo M I Saacutenchez-Clemente R Poblacioacuten A G Guijo M I Merchaacuten
F amp Blasco R (2018) Biodegradation of 5-(Hydroxymethyl)-furfural and
Furan Derivatives Multidisciplinary Digital Publishing Institute Proceedings
2(20) 1283
bull Igentildeo M I Maciacuteas D Guijo M I Saacutenchez-Clemente R Poblacioacuten A
G Merchaacuten F amp Blasco R (2018) Bacterial Consortiums Able to Use Metal-
Cyanide Complexes as a Nitrogen Source Multidisciplinary Digital Publishing
Institute Proceedings 2(20) 1284
IacuteNDICE
Iacute N D I C E S
1 Iacutendice General
2 Iacutendice de Tablas
3 Iacutendice de Figuras
4 Abreviaturas
Iacutendice general
Iacute N D I C E G E N E R A L
I INTRODUCCIOacuteN 5
1 LA CONTAMINACIOacuteN Y EL MEDIO AMBIENTE LA BIOTECNOLOGIacuteA 7
2 EL CIANURO 10
21 FUENTES DE CIANURO 10
22 TOXICIDAD DEL CIANURO 11
23 ELIMINACIOacuteN DEL CIANURO 12
3 EL GEacuteNERO PSEUDOMONAS 13
31 Pseudomonas pseudoalcaligenes 15
32 Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 16
4 SISTEMAS DE MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN (MR) 18
41 SISTEMAS DE MR TIPO I 21
42 SISTEMAS DE MR TIPO II 24
43 SISTEMAS DE MR TIPO III 26
44 SISTEMAS DE MR TIPO IV 27
45 EVOLUCIOacuteN DE LOS SISTEMAS DE MR 28
5 EL PERIPLASMA PROCARIOTA 29
6 EL AacuteCIDO MAacuteLICO 32
7 BIOSENSORES 38
II OBJETIVOS 41
III MATERIAL Y MEacuteTODOS 45
1 MATERIAL BIOLOacuteGICO 47
2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO 48
21 MEDIOS LIacuteQUIDOS DE CULTIVO 48
211 Medio Luria-Bertani (LB o medio rico) 48
212 Medio M9 48
213 Medio SOB 49
214 Medio SOC 50
215 Medio GYT 50
22 MEDIOS DE CULTIVO SOacuteLIDOS CON AGAR 50
Iacutendice general
16
23 MEDIOS SELECTIVOS 51
231 Antibioacuteticos 51
24 CONDICIONES DE CULTIVO 52
25 PUREZA Y CONSERVACIOacuteN DE LOS CULTIVOS 52
3 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ACELULARES 52
31 RECOGIDA DE CEacuteLULAS 52
32 ROTURA DE CEacuteLULAS 53
33 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR 53
4 DETERMINACIONES ANALIacuteTICAS 54
41 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE CIANURO 54
42 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS 55
421 Meacutetodo de Bradford 55
422 Meacutetodo de Lowry 55
5 DETERMINACIOacuteN DE ACTIVIDADES ENZIMAacuteTICAS 56
51 ACTIVIDAD FUMARASA L-MALATO HIDRO-LIASA (EC 4212) 57
52 ACTVIDAD ACONITASA (EC 4213) 57
53 ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA (EC 17994) 57
54 ACTIVIDAD SUCCINATO OXIDASA (EC 1351) 58
55 ACTIVIDAD MALATOQUINONA OXIDORREDUCTASA (EC 1154) 58
56 CARACTERIZACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO-EC 1124) 58
561 Electroforesis nativa en geles de poliacrilamida (native ndashPAGE) 59
562 Meacutetodo espectrofotomeacutetrico 60
563 Reconstitucioacuten fisioloacutegica de la actividad D-malato oxidasa 62
564 Determinacioacuten del producto de la reaccioacuten de D-malato oxidasa 62
6 FRACCIONAMIENTO DE PROTEIacuteNAS POR PRECIPITACIOacuteN SALINA 62
7 CROMATOGRAFIacuteA DE EXCLUSIOacuteN MOLECULAR 63
8 TEacuteCNICAS DE BIOLOGIacuteA MOLECULAR 64
81 PLAacuteSMIDOS 64
82 EXTRACCIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE DNA GENOacuteMICO 65
83 EXTRACCIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE DNA PLASMIacuteDICO 65
84 DIGESTIOacuteN DE DNA 66
85 DESFOSFORILACIOacuteN DE LOS EXTREMOS DE MOLEacuteCULAS DE DNA 66
86 LIGACIOacuteN DEL DNA 66
Iacutendice general
87 ELECTROFORESIS DE DNA EN GEL DE AGAROSA 67
88 CUANTIFICACIOacuteN DE DNA 68
89 RECUPERACIOacuteN DE FRAGMENTOS DE DNA DE LOS GELES DE AGAROSA 68
810 TRANSFORMACIOacuteN POR ELECTROPORACIOacuteN 69
8101 Preparacioacuten de ceacutelulas electrocompetentes 69
8102 Transformaciones de ceacutelulas electrocompetentes 70
8103 Seleccioacuten de las colonias recombinantes 70
811 REACCIOacuteN DE AMPLIFICACIOacuteN EN CADENA CON DNA POLIMERASA TERMORRESISTENTE (PCR) 71
8111 Disentildeo de la teacutecnica de PCR para amplificar el gen aph(3acute) 72
8112 Amplificacioacuten del gen dmo (BN5_4044) de P pseudoalcaligenes CECT 5344 73
8113 Amplificacioacuten del gen mrr (BN5_0077) de P pseudoalcaligenes CECT 5344 73
8114 Amplificacioacuten de un fragmento interno del gen hsdR (BN5_3167 BN5_3168) de P pseudoalcaligenes CECT 5344 73
8115 Amplificacioacuten de un fragmento interno del gen mcrB (BN5_3170) de P pseudoalcaligenes CECT 5344 74
8116 Amplificacioacuten de un inserto de DNA en el vector de clonacioacuten pGEMreg-T Easy 74
812 PCR DE COLONIAS 74
9 ANAacuteLISIS BIOINFORMAacuteTICO 75
10 EQUIPOS 76
11 REACTIVOS 77
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN 79
CAPIacuteTULO 1 CARACTERIZACIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO) DE P
pseudoalcaligenes CECT 5344 81
1 DETECCIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO) 83
2 DESARROLLO DE UN ENSAYO ESPECTROFOTOMEacuteTRICO PARA LA DMO 84
21 CAacuteLCULO DEL COEFICIENTE DE EXTINCIOacuteN MOLAR DEL INT REDUCIDO (FORMAZAN) 84
22 CONCENTRACIOacuteN OacutePTIMA DE INT Y Km DE LA DMO 85
23 TEMPERATURA OacutePTIMA Y TERMOESTABILIDAD 87
24 pH OacutePTIMO DE LA ACTIVIDAD DMO 88
25 COMPARATIVA ENTRE EL MEacuteTODO ESPECTROFOTOMEacuteTRICO Y LA ELECTROFORESIS NATIVA EN GEL DE POLIACRILAMIDA 89
3 LOCALIZACIOacuteN INTRACELULAR 90
Iacutendice general
18
31 MODIFICACIONES DEL PROTOCOLO DE IMPERI 93
311 Sustitucioacuten del PMSF 94
312 Cambio en la concentracioacuten de sacarosa 94
313 Adicioacuten de Cloruro soacutedico 95
314 Modificaciones del protocolo del kit comercial peripreps periplasting de epicentre 96
4 ESTABILIZACIOacuteN DE LOS EXTRACTOS 100
5 CARACTERIZACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA DMO 102
51 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO 102
52 OXALACETATO COMO POSIBLE PRODUCTO DE LA OXIDACIOacuteN DE D-MALATO 107
53 RECONSTITUCIOacuteN FISIOLOacuteGICA DE LA ACTIVIDAD DMO CITOCROMO C COMO POSIBLE ACEPTOR DE ELECTRONES 109
6 REQUERIMIENTO DE METALES 113
61 EFECTO DEL EDTA 114
62 EFECTO DE CATIONES METAacuteLICOS DIVALENTES EN LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO) 115
63 EFECTO DEL CIANURO SOBRE LA ACTIVIDAD DMO 117
64 ESTABILIZACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA POR Zn2+ 118
65 INDUCCIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO 119
7 PURIFICACIOacuteN Y CARACTERIZACIOacuteN MOLECULAR DE LA ACTIVIDAD DMO 122
71 PRECIPITACIOacuteN SALINA 122
72 CROMATOGRAFIacuteA DE EXCLUSIOacuteN MOLECULAR 124
8 IDENTIFICACIOacuteN DEL GEN RESPONSABLE DE LA ACTIVIDAD DMO 127
81 GEN CANDIDATO POR DATOS BIBLIOGRAacuteFICOS 127
9 CLONACIOacuteN DEL GEN 4044 QUE CODIFICA A LA PROTEIacuteNA D-MALATO OXIDASA 134
91 CLONACIOacuteN DEL GEN dmo (BN5_4044) 134
10 EXPRESIOacuteN DE BN5_4044 Y COMPROBACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO 136
CAPIacuteTULO 2 ESTUDIO DE LOS SISTEMAS DE MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN EN P
PSEUDOALCALIGENES CECT 5344 143
1 SISTEMAS DE MODIFICACION RESTRICCIOacuteN EN Ppseudoalcaligenes CECT 5344 145
2 MUTAGEacuteNESIS DIRIGIDA DE LOS SISTEMAS MR DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 151
3 ELIMINACIOacuteN DEL SISTEMA MR TIPO IV ldquoMRRrdquo EN P pseudoalcaligenes CECT 5344 151
31 DISRUPCIOacuteN INSERCIONAL DEL GEN CROMOSOacuteMICO mrr (BN5_0077) DE P Pseudoalcaligenes CECT 5344 152
Iacutendice general
4 ELIMINACIOacuteN DE LA SUBUNIDAD HsdR (Tipo I) Y DEL SISTEMA McrBC (Tipo IV) EN P pseudoalcaligenes CECT 5344 156
41 MUTANTE R1∆hsdR-mcrCBKmr (R1∆hsdR) 157
411 Ligacioacuten del fragmento hsdR 157
412 Ligacioacuten del fragmento mcrB 158
413 Ligacioacuten pGhsdR linearizado con fragmento interno del gen mcrB 159
414 Extraccioacuten del casete de Kanamicina 160
415 Clonacioacuten de pGhsdR mcrB con casete de kanamicina 160
416 Mutageacutenesis de P pseudoalcaligenes CECT 5344 161
5 EVALUACIOacuteN DE LA ELIMINACIOacuteN DE LAS BARRERAS DE RESTRICCIOacuteN TIPO I Y TIPO IV EN P PSEUDOALCALIGENES CECT 5344 164
V DISCUSIOacuteN GENERAL 167
VI CONCLUSIONES 173
VII BIBLIOGRAFIacuteA 173
Iacutendice de tablas
Iacute N D I C E D E T A B L A S
TABLA 1 CARACTERIZACIOacuteN Y ORGANIZACIOacuteN DE LOS GENES Y SUBUNIDADES
DE LOS CUATRO TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCIOacuteN (ERASAS) 19 TABLA 2 MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO 47 TABLA 3 ANTIBIOacuteTICOS EMPLEADOS COMO MEDIOS SELECTIVOS 51 TABLA 4 COMPOSICIOacuteN DE LOS GELES DE ACRILAMIDA NATIVA 59 TABLA 5 LISTADO DE PROTEIacuteNAS UTILIZADAS COMO PATROacuteN 64 TABLA 6 PLAacuteSMIDOS EMPLEADOS EN ESTE TRABAJO 64 TABLA 7 OLIGONUCLEOacuteTIDOS EMPLEADOS EN ESTE TRABAJO 71 TABLA 8 DIFERENTES COMPUESTOS SOBRE LOS QUE SE ENSAYOacute LA ACTIVIDAD DMO
103 TABLA 9 COMPARATIVA DE VALORES DE KM DE DMO DE P
PSEUDOALCALIGENES CON DIFERENTES ENZIMAS Y SUSTRATOS 107 TABLA 10 RECONSTITUCIOacuteN DE LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA ASOCIADA A LA
RESPIRACIOacuteN 113 TABLA 11 DIFERENCIAS EN LA TASA DE TRANSFORMACIOacuteN DE P PUTIDA KT2440 Y P
PSEUDOALCALIGENES CECT 5344 150 TABLA 12 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIOacuteN DEL MUTANTE R1∆MRR 154 TABLA 13 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIOacuteN DEL MUTANTE R1∆HSDR 162 TABLA 14 EFICIENCIA DE TRANSFORMACIOacuteN DE LAS CEPAS R1∆MRR Y R1∆HSDR-
MCRBC DE P PSEUDOALCALIGENES CECT 5344 166 TABLA 15 LISTADO DE LOS SISTEMAS DE MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN DE P
PSEUDOALCALIGENES CECT 5344 172
Iacutendice de figuras
Iacute N D I C E D E F I G U R A S
FIGURA 1 DETECCIOacuteN POR MICROOSCOPIacuteA ELEacuteCTRONICA DE TRANSMISIOacuteN
DE PHAs 17
FIGURA 2 REPRESENTACIOacuteN ESQUEMAacuteTICA DEL PAPEL FUNCIONAL DE LAS
DIVERSAS FORMAS DE ORGANIZACIOacuteN DE LOS SISTEMAS MR 20
FIGURA 3 DEFENSA ANTIVIRAL MEDIADA POR SISTEMAS DE MR 21
FIGURA 4 RECONOCIMIENTO Y CORTE DEL DNA POR ENZIMAS DE RESTRICCIOacuteN
TIPO II 26
FIGURA 5 MICROGRAFIacuteA ELECTROacuteNICA 30
FIGURA 6 POSIBLES RUTAS PARA EL METABOLISMO DE D- Y L- MALATO 34
FIGURA 7 SISTEMAS DE OXIDASAS PERIPLAacuteSMICAS INDEPENDIENTES DE NAD+
35
FIGURA 8 LA D2HGDH JUEGA UN PAPEL DUAL EN LA BIOSIacuteNTESIS DE L-SERINA Y
EN LA UTILIZACIOacuteN DE D-MALATO EN P stutzeri 39
FIGURA 9 MECANISMO DE FUNCIONAMIENTO DE UN BIOSENSOR 38
FIGURA 10 DETECCIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA 83
FIGURA 11 EFECTO DE ALGUNOS METALES SOBRE LA ACTIVIDAD DMO 84
FIGURA 12 ESPECTRO DE ABSORCIOacuteN Y COEFICIENTE DE EXTINCIOacuteN MOLAR
DEL FORMAZAN 85
FIGURA 13 DETERMINACIOacuteN DE LA KM DE LA DMO PARA EL INT 86
FIGURA 14 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DMO 88
FIGURA 15 EFECTO DEL pH EN LA ACTIVIDAD DMO 89
FIGURA 16 COMPARACIOacuteN ENTRE LOS MEacuteTODOS ESPECTROFOTOMEacuteTRICOS Y
EN PAGE NATIVA 90
FIGURA 17 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR 91
FIGURA 18 REPRESENTACIOacuteN GRAacuteFICA DE LA DISTRIBUCIOacuteN DE LOS
MARCADORES PROTEICOS DE LAS DISTINTAS FRACCIONES CELULARES 92
FIGURA 19 EFECTO DE LA UTILIZACIOacuteN DE PMSF O DE INHIBIDOR DE
PROTEASAS EN LA EXTRACCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS PERIPLAacuteSMICAS 94
FIGURA 20 EFECTO DE LA CONCENTRACIOacuteN DE SACAROSA EN EL PROCESO DE
EXTRACCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS PERIPLAacuteSMICAS 95
FIGURA 21 EFECTO DEL NaCl EN EL PROCESO DE EXTRACCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
PERIPLAacuteSMICAS 96
FIGURA 22 EFECTO DEL GLICEROL Y DEL ZINC EN EL PROCESO EN EL PROCESO
DE EXTRACCIOacuteN DE PROTEIacuteNAS PERIPLAacuteSMICAS 99
Iacutendice de figuras
24
FIGURA 23 EFECTO DEL GLICEROL EN EL FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
UTILIZANDO EL KIT COMERCIAL DE EPICENTRE 100
FIGURA 24 EFECTO DE LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS SOBRE LA
CONSERVACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO 102
FIGURA 25 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO DE LA ACTIVIDAD DMO 104
FIGURA 26 CAacuteLCULO DE LA KM DE LA DMO PARA EL D-MALATO 105
FIGURA 27 DETERMINACIOacuteN EXPERIMENTAL DE LOS VALORES DE LA KM DE LA
DMO 106
FIGURA 28 FORMACIOacuteN DE OXALACETATO (OAA) COMO PRODUCTO DE LA
OXIDACIOacuteN DEL D-MALATO REACCIOacuteN CATALIZADA POR LA DMO 108
FIGURA 29 DETERMINACIOacuteN EXPERIMENTAL DE LOS VALORES DE LA KM DE LA
DMO PARA EL CITOCROMO c 109
FIGURA 30 CITOCROMO c COMO POSIBLE ACEPTOR DE ELECTRONES 112
FIGURA 31 IacuteNDICE DE RECUPERACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO 113
FIGURA 32 EFECTO DEL EDTA EN LA ACTIVIDAD DMO DE P pseudoalcaligenes
CECT 5344 114
FIGURA 33 EFECTO DE ALGUNOS IONES METAacuteLICOS DIVALENTES EN LA
ACTIVIDAD DMO 116
FIGURA 34 EFECTO DEL ZN2+ SOBRE LA ACTIVIDAD DMO 117
FIGURA 35 EFECTO DEL CIANURO SOBRE LA ACTIVIDAD DMO 118
FIGURA 36 ESTABILIZACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA DMO POR ZN2+ 119
FIGURA 37 CURVAS DE CRECIMIENTO DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 EN
MEDIOS CON DIFERENTES FUENTES DE CARBONO 121
FIGURA 38 INDUCIBILIDAD DE LA ACTIVIDAD DMO SEGUacuteN LA FUENTE DE
CARBONO O NITROacuteGENO 121
FIGURA 39 FRACCIONAMIENTO ldquoSALTING OUTrdquo CON SULFATO AMOacuteNICO DE LA
DMO DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 Y DE LA DMO RECOMBINANTE EN E
coli XL1 124
FIGURA 40 PERFIL DE ELUCIOacuteN DE LA DMO EN LA CROMATOGRAFIacuteA DE
EXCLUSIOacuteN MOLECULAR 125
FIGURA 41 CAacuteLCULO DEL RADIO DE STOKES Y DEL PESO MOLECULAR DE LA
DMO 126
FIGURA 42 ANAacuteLISIS FILOGENEacuteTICO DE LA PROTEIacuteNA D2HGDH DE P stutzeri 128
FIGURA 43 RESULTADO DEL ALINEAMIENTO DE LAS SECUENCIAS DE
AMINOAacuteCIDOS DE LA D2HGDH 128
FIGURA 44 ENTORNO GEacuteNICO DEL GEN QUE CODIFICA A LA DMO 128
FIGURA 45 RELACIOacuteN FUNCIONAL DE SerA Y D2HGDH 129
Iacutendice de figuras
FIGURA 46 ANAacuteLISIS FILOGENEacuteTICO DE LA SECUENCIA DEDUCIDA DE
AMINOAacuteCIDOS DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 131
FIGURA 47 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA SECUNDARIA DE LA DMO DE P
pseudoalcaligenes CECT 5344 133
FIGURA 48 PREDICCIOacuteN DE LA ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE DMO DE P
pseudoalcaligenes CECT 5344 134
FIGURA 49 LOCALIZACIOacuteN DEL GEN DMALATO OXIDASA (dmo) EN P
pseudoalcaligenes CECT 5344 134
FIGURA 50 ESQUEMA DE LA CLONACIOacuteN DEL GEN BN5_4044 EN EL VECTOR
PGEMT-EASY 135
FIGURA 51 EXPRESIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO DE P pseudoalcaligenes CECT 5344
EN E coli 136
FIGURA 52 ACTIVIDAD DMO DE P putida KT2440 137
FIGURA 53 ANAacuteLISIS FILOGENEacuteTICO DE LA SECUENCIA DE AMINOAacuteCIDOS DE
DMO DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 138
FIGURA 54 ACTIVIDAD DMO EN P putida KT2440 Y EN P putida KT2440 ∆5154 139
FIGURA 55 CRECIMIENTO DE LAS ESPECIES BACTERIANAS P pseudoalcaligenes
CECT 5344 P putida KT2440 (WT) Y P putida KT2440 ∆5154 CON DISTINTAS
FUENTES DE CARBONO 140
FIGURA 56 CRECIMIENTO DE LAS CEPAS DE P putida KT2440 WT (SILVESTRE) Y P
putida KT2440 ∆5154 (CEPA CON DELECIOacuteN EN EL GEN PP_5154) CON
DISTINTAS FUENTES DE CARBONO 141
FIGURA 57 GRAacuteFICA DEL GENOMA COMPLETO DE P pseudoalcaligenes CECT 5344
147
FIGURA 58 PATROacuteN DE METILACIOacuteN DE P pseudoalcaligenes CECT 5344 147
FIGURA 59 PATRONES DE METILACIOacuteN DE B anthracis Ames y B subtilis 168 149
FIGURA 60 PATROacuteN DE METILACIOacuteN DE P putida KT2440 150
FIGURA 61 SINTENIA DEL GEN mrr 152
FIGURA 62 REPRESENTACIOacuteN TEOacuteRICA DEL PRODUCTO DE PCR CON
CEBADORES mrrU y mrrL 152
FIGURA 63 AMPLIFICACIOacuteN POR PCR DEL GEN mrr DE P pseudoalcaligenes CECT
5344 152
FIGURA 64 COMPROBACIOacuteN DE LA ORIENTACIOacuteN DEL GEN mrr EN EL VECTOR
DE CLONACIOacuteN pGEM T-easyreg 153
FIGURA 65 COMPROBACIOacuteN DE LA INSERCIOacuteN GEacuteNICA DEL GEN mrr
INTERRUMPIDO POR EL CASETE DE Gm EN EL GENOMA DE P
pseudoalcaligenes CECT 5344 154
Iacutendice de figuras
26
FIGURA 66 ESQUEMA DE LA ESTRATEGIA SEGUIDA PARA LA CONSTRUCCIOacuteN
DEL PLAacuteSMIDO pGmrr Gm 155
FIGURA 67 SINTENIA DE LOS SISTEMAS DE MR TIPO I HsdRMS Y TIPO IV McrBC
EN P pseudoalcaligenes CECT 5344 156
FIGURA 68 COMPROBACIOacuteN DE LA INSERCIOacuteN DEL FRAGMENTO H1 (hsdR) EN
EL VECTOR DE CLONACIOacuteN pGEM T-easyreg 158
FIGURA 69 COMPROBACIOacuteN DE LA ORIENTACIOacuteN DE INSERCIOacuteN DEL
FRAGMENTO H1 (hsdR) 158
FIGURA 70 COMPROBACIOacuteN DE LA INSERCIOacuteN DEL FRAGMENTO M2 (mcrB) EN
EL VECTOR DE CLONACIOacuteN pGEM T-easyreg 159
FIGURA 71 COMPROBACIOacuteN DE LA ORIENTACIOacuteN DE INSERCIOacuteN DEL
FRAGMENTO M2 (mcrB) 159
FIGURA 72 COMPROBACIOacuteN DE LA CONSTRUCCIOacuteN DEL PLAacuteSMIDO pGhsdR mcrB
160
FIGURA 73 COMPROBACIOacuteN MEDIANTE PCR DE LA ORIENTACIOacuteN DEL CASETE
DE KANAMICINA 160
FIGURA 74 COMPROBACIOacuteN DE LA INSERCIOacuteN GEacuteNICA DEL FRAGMENTO hsdR-
Kam-mcrBC EN P pseudoalcaligenes CECT 5344 161
FIGURA 75 ESQUEMA DE LA ESTRATEGIA PARA OBTENER LA CONSTRUCCIOacuteN
DEL LAacuteSMIDO pGhsdR mcrB Km 163
FIGURA 76 POSIBLE RUTA METABOacuteLICA DE LA OXIDACIOacuteN DE D-MALATO A
OXALACETATO CATALIZADA POR LA DMO 171
FIGURA 77 CARRERA ARMAMENTIacuteSTICA ENTRE FAGOS Y BACTERIAS 171
Abreviaturas
A B R E V I A T U R A S
degC grado centiacutegrado
2-KG 2-cetoglutarato
3-PHP 3-fosfohidroxipiruvato
A Adenina
Aring Aacutengstrom
Abs Absorbancia
AdoMet SAM S-Adenosil metionina
ADP Adenosina difosfato
Ap Ampicilina
APS Persulfato de amonio
ATP Adenosina trifosfato
BSA Seroalbuacutemina bovina
C Citosina
CFUufc Unidades formadoras de colonias
CIO oxidasa terminal insensible a cianuro
DO 600nm Densidad oacuteptica (λ = 600 nm)
D-2-HGD2HG D-2-hidroxiglutarato
D2HGDH D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa
D-3-PG D-3-fosfoglicerato
Da Dalton
DCPIP 26-diclorofenolindofenil
D-iDLDH D-lactato deshidrogenasa independiente de NAD
DLDHDld D-lactato deshidrogenasa
DMD D-malato deshidrogenasa
Abreviaturas
2
DMO D-malato oxidasa
D-MT D-malato
DNA Aacutecido desoxirribonucleico
EDTA Aacutecido etilendiaminotetraaceacutetico
ERasa Endonucleasa de restriccioacuten
Ɛ Coeficiente de extincioacuten molar
FAD Flavin Adenina dinucleoacutetido
FPLC Cromatografiacutea liacutequida de la proteiacutena raacutepida
G Guanina
g Unidades de fuerza G
Gm Gentamicina
Gmr Resistencia a gentamicina
h hora
INT (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolium
IPTG Isopropil-1-tio-β-galactosidasa
Km Kanamicina
Kmr Resistencia a Kanamicina
mA miliamperio
MDRE Enzima de restriccioacuten dependiente de metilacioacuten (methylation-dependent
Restriction enzymes)
Medio LB Medio Luria Bertani
Medio M9 Medio miacutenimo M9
MQO Malatoquinona oxidorreductasa
MTasa Metiltransferasa
MW peso molecular
NADH Nicotinamida adenina dinucleoacutetido
nm nanoacutemetro
Abreviaturas
N-NEDA N-naftilendiamina
OAA Oxalacetato
ORF Marco abierto de lectura
Pv relacioacuten pesovolumen
PAM Motivo adyacente al protoespaciador (protospacer)
pb pares de bases
PCR Reaccioacuten de amplificacioacuten en cadena con DNA polimerasa termorresistente
PHA Polihidroxialcanoato
PMS Metosulfato de fenazina
PMSF fluoruro de metilfenilsulfonilo
ppm partes por milloacuten
PRQ Pirroquiliacuten quinolona
Rif Rifampicina
Rifr Resistencia a Rifampicina
RNA Aacutecido ribonucleico
rpm revoluciones por minuto
RT Temperatura ambiente (Room Temperature)
SD desviacioacuten estaacutendar
SerA D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa
Sistema MR Sistema de modificacioacuten ndash restriccioacuten
T Tiamina
TBE Tris base aacutecido boacuterico y EDTA
TCA Ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos
TE Tris y EDTA
TEMED NNNacuteNacuteTetrametiletilendiamina
Tet Tetraciclina
Tetr Resistencia a Tetraciclina
Abreviaturas
4
TRIS Tris (hidroximetil) aminometano
TRD Dominio de reconocimiento diana (Target Recognition Domain)
TRM Motivo de reconocimiento diana (Target Recognition Motif)
U unidad de actividad enzimaacutetica
U Unidades
UV Ultravioleta
vv Relacioacuten volumenvolumen
X-gal 5-Bromo-4-cloro-2-indol-β-galactopiranoacutesido
I INTRODUCCIOacuteN
Introduccioacuten
7
1 LA CONTAMINACIOacuteN Y EL MEDIO AMBIENTE LA BIOTECNOLOGIacuteA
Decimos que existe contaminacioacuten ambiental cuando se produce un
desequilibrio entre la entrada (produccioacuten) y la salida (descomposicioacuten) de sustancias
en los ecosistemas como consecuencia de una alteracioacuten en el transporte horizontal de
una materia que no ha sido asimilada por la evolucioacuten (1) La produccioacuten primaria de la
Biosfera ha variado poco en los uacuteltimos milenios pero la biomasa de plantas y animales
siacute lo ha hecho y en parte ha sido sustituida por la biomasa humana y sus artefactos El
desarrollo de la Antroposfera ha sido realmente vertiginoso si lo comparamos con el
ritmo al que suelen funcionar los procesos naturales (1) La contaminacioacuten ambiental es
un efecto directo del crecimiento de la poblacioacuten humana y el desarrollo tecnoloacutegico
(2) La poblacioacuten humana ha crecido de 1800 millones hace un siglo a 7600 millones en
la actualidad (3) Es maacutes a partir del S XX el ser humano ha vivido en la Tierra como si
tuviera otro lugar en el que vivir sin importarle las consecuencias de sus actos asiacute pues
desde la Revolucioacuten Industrial la perturbacioacuten causada en los ecosistemas ha alcanzado
la categoriacutea de impacto ambiental (1) La creciente demanda de los recursos del planeta
ha alterado al menos una cuarta parte de la superficie terrestre debido a los efectos
combinados de la erosioacuten la contaminacioacuten ambiental la compactacioacuten y la
salinizacioacuten (3) La contaminacioacuten ambiental estaacute causada tanto por compuestos
orgaacutenicos como por compuestos inorgaacutenicos Durante este periacuteodo la industria de la
siacutentesis quiacutemica ha experimentado un notable desarrollo lo que ha ocasionado la
liberacioacuten al medio de una enorme variedad de compuestos orgaacutenicos Algunos de ellos
poseen una estructura quiacutemica considerablemente diferente a la de los compuestos
orgaacutenicos que se encuentran en la naturaleza por lo que se denominan compuestos
xenobioacuteticos y pueden ocasionar grandes problemas de contaminacioacuten (4) Entre estos
compuestos se encuentran compuestos orgaacutenicos halogenados (propelentes
disolventes refrigerantes e insecticidas) nitroaromaacuteticos (explosivos disolventes
plaguicidas) bifenilos policlorados (plastificantes aislantes-refrigerantes etc)
dioxinas sulfonatos alquilbenciacutelicos (detergentes) y poliacutemeros sinteacuteticos (envoltorios y
materiales de empaquetado) (4) En otras ocasiones el problema de la contaminacioacuten
Introduccioacuten
8
ambiental por compuestos orgaacutenicos no es debido a su naturaleza xenobioacutetica sino a
la cantidad de compuestos que se vierten en un determinado punto como por ejemplo
el caso de los vertidos de petroacuteleo durante su transporte Lo mismo ocurre con los
compuestos inorgaacutenicos ya que la mayoriacutea entran dentro de los ciclos biogeoquiacutemicos
de una forma natural pero los problemas de contaminacioacuten aparecen cuando la
actividad de la sociedad industrializada aumenta la cantidad de material orgaacutenico
superando la capacidad de la microflora autoacutectona para reciclarlos (1) Las actividades
mineras (drenaje aacutecido provocado por la oxidacioacuten microbiana del hierro y del azufre)
las actividades agriacutecolas (abonos nitrogenados) o las actividades industriales
(produccioacuten de residuos o vertidos) han agravado los problemas de contaminacioacuten
ocasionados por compuestos inorgaacutenicos entre los que se encuentran metales pesados
oacutexidos de nitroacutegeno cianuro cianato etc (4) Entre todos estos residuos merece la
pena realizar un inciso para hablar de la raacutepida acumulacioacuten de desechos plaacutesticos
derivados del petroacuteleo que estaacute impulsando la demanda internacional de plaacutesticos
renovables con cualidades superiores por ejemplo biodegradabilidad total hasta CO2
sin subproductos dantildeinos como parte de una bioeconomiacutea circular en expansioacuten (5) y
de alguna manera esta es la filosofiacutea que estaacute imperando en el tratamiento de los
distintos residuos
A los problemas de contaminacioacuten ambiental se une ahora el denominado
cambio climaacutetico Aunque algunos se empentildeen en negarlo todos conservamos en la
memoria colectiva la imagen del fameacutelico oso polar a punto de perecer debido al
deshielo Esto solo es un ejemplo de coacutemo los signos del cambio climaacutetico
antropogeacutenico son innegables y muy preocupante el impacto que supone para la
Tierra y todos sus habitantes El hielo se estaacute derritiendo los niveles del mar estaacuten
aumentando la biodiversidad estaacute disminuyendo las precipitaciones aumentando los
niveles atmosfeacutericos de dioacutexido de carbono y los gases de efecto invernadero son
alarmantemente altos y las condiciones climaacuteticas extremas cada vez se dan con maacutes
frecuencia (6) Es por esto que nos urge tomar medidas al respecto Desde el 2017 se
celebra el World Circular Economy Forum (WCEF) en el que se trabaja hacia la
implementacioacuten de una economiacutea circular como una de la soluciones para paliar la crisis
climaacutetica (7) En la Cumbre sobre la Accioacuten Climaacutetica ONU 2019 (COP25) celebrada en
Introduccioacuten
9
Madrid el Secretario General de Naciones Unidas Antoacutenio Guterres convocoacute dicha
Cumbre con la intencioacuten de hacer cumplir los objetivos del Acuerdo de Pariacutes (8) e incitar
a tomar medidas que puedan limitar el cambio climaacutetico a 2ordmC por lo que ha hecho un
llamamiento no soacutelo a los liacutederes poliacuteticos sino tambieacuten a los liacutederes financieros
empresariales de la sociedad civil y locales de sectores puacuteblicos y privados para que
acudan a Nueva York en septiembre de 2020 con planes concretos y realistas que
contribuyan a reducir las emisiones de gases de efecto invernadero en un 45 en los
proacuteximos diez antildeos y con cero emisiones netas para 2050 (9)
El teacutermino Biotecnologiacutea es una miscelaacutenea con el denominador comuacuten de
utilizar seres vivos o parte de ellos para usos concretos En el caso de los
microorganismos la biotecnologiacutea incluye tanto cepas naturales como
microorganismos modificados geneacuteticamente con ambos se pueden desarrollar bio-
reactores que eliminen los residuos de manera respetuosa sin generar subproductos
igual de contaminantes (o incluso maacutes) que el residuo que se quiere eliminar En este
sentido la biotecnologiacutea se pondriacutea al servicio del medio ambiente evitando su
contaminacioacuten Ademaacutes en muchos casos los productos finales que surgen del
proceso aportan un valor propio por lo que el proceso se hace sostenible (10)
Asiacute pues la Biotecnologiacutea ambiental trata de corregir los desequilibrios que
causan la contaminacioacuten quiacutemica o bioloacutegica y que tambieacuten afectan a los grandes ciclos
biogeoquiacutemicos en la biosfera mayoritariamente catalizados por seres vivos entre los
que los microrganismos juegan un papel esencial Para intentar eliminar los problemas
(calentamiento global destruccioacuten de la capa de ozono contaminacioacuten ambiental
lluvia aacutecidahellip) que acucian a nuestro planeta es necesario avanzar en el conocimiento
a nivel molecular de la ecologiacutea microbiana y del funcionamiento de los ciclos
biogeoquiacutemicos aunque no es menos necesario desarrollar tecnologiacuteas para la
eliminacioacuten de contaminantes industriales in situ y ex situ evitar su produccioacuten y
utilizacioacuten incontroladas asiacute como corregir las actuaciones desequilibrantes actuales o
futuras de la biogeoquiacutemica planetaria (10)
El uso de bacterias en teacutecnicas de biorremediacioacuten queda justificado por su
enorme versatilidad metaboacutelica que se basa en el principio de infalibilidad microbiana
en el cual se propone que todo compuesto natural puede ser degradado si se dan las
Introduccioacuten
10
condiciones ambientales adecuadas (11) Esto se debe al temprano origen de los
microorganismos aproximadamente 36 giga-antildeos lo que les ha permitido coexistir
con una inmensa variedad de compuestos y ser capaces de desarrollar sistemas que
pudieran utilizarlos lo que seriacutea la explicacioacuten a esta amplia capacidad degradativa de
los mismos (4) Ademaacutes su alta tasa reproductora posibilita que evolucionen de una
forma maacutes raacutepida que los organismos macroscoacutepicos (12) Sin embargo aunque
algunos compuestos orgaacutenicos sinteacuteticos pueden ser degradados por el metabolismo
microbiano debido a su parecido con alguacuten compuesto natural algunos son
recalcitrantes y se acumulan en la cadena troacutefica como el DDT las dioxinas y los PCBs
(4)
2 EL CIANURO
El cianuro es un anioacuten monovalente consistente en un aacutetomo de carbono unido
a un aacutetomo de nitroacutegeno mediante un triple enlace que se encuentra en la naturaleza
tanto en forma simple (HCN o -CN) como en forma de sal (las maacutes comunes de sodio o
potasio) El cianhiacutedrico en un aacutecido deacutebil con un pKa de 922 a 25degC soluble en agua o
en etanol La forma protonada es volaacutetil y por tanto a pH aacutecido pasa a la fase gaseosa
pudiendo desplazarse a largas distancias desde la fuente de emisioacuten (13) Sin embargo
cuando el pH es superior a 105 praacutecticamente todo el cianuro libre estaacute presente como
-CN en condiciones normales de temperatura y presioacuten La concentracioacuten de HCN y -
CN son iguales a un valor de pH de 922 estas formas de cianuro libre son importantes
porque son las maacutes toacutexicas Los cianuros no son retenidos ni absorbidos de manera
permanente por el suelo con lo cual permanecen en la fase acuosa y a menudo forman
complejos con otros contaminantes metaacutelicos procedentes de diferentes vertidos
industriales tales como hierro cobre niacutequel y zinc (14)
21 FUENTES DE CIANURO
Los compuestos cianogeacutenicos son de naturaleza ubicua y son producidos tanto
por bacterias como por hongos plantas y algunos insectos Se estima que alrededor
de 2500 especies de plantas presentan este tipo de metabolitos secundarios en su
sistema Los compuestos cianurados son sintetizados por muchas plantas en forma de
Introduccioacuten
11
cianoliacutepidos y cianogluacutecidos que actuacutean como elementos disuasorios contra plagas de
insectos y otros animales Por ejemplo las semillas de algunas plantas (almendras
amargas manzanas albaricoques melocotones cebada habas sorgo semillas de
lino) tienen una cantidad considerable de cianogluacutecidos que pueden transformarse en
cianuro tras producirse dantildeo tisular (15)
Ademaacutes de las fuentes naturales los compuestos cianurados pueden aparecer
en el medio ambiente debido a las actividades antropogeacutenicas Estos compuestos
tienen muchas aplicaciones en la industria farmaceacuteutica la fabricacioacuten de poliacutemeros la
mineriacutea y la fabricacioacuten de acero la galvanoplastia y la produccioacuten de agroquiacutemicos
(16)
Las praacutecticas agriacutecolas debido a la utilizacioacuten de nitrilos como pesticidas
contribuyen de manera significativa al aumento del nivel de cianuro en el suelo y en
medio ambiente (17) El cianuro se usa en los procesos de lixiviacioacuten de metales
preciosos en la mineriacutea ya que forma complejos fuertes con oro plata y otros metales
pesados ademaacutes de ayudar a solubilizar el mineral En Espantildea la contaminacioacuten por
cianuro se debe de forma importante a las actividades de la industria joyera que utiliza
el cianuro para la limpieza de metales preciosos como el oro y en los bantildeos electroliacuteticos
(18) El cianuro se utiliza en una concentracioacuten relativamente diluida en la extraccioacuten
del oro conocido como el proceso de cianidacioacuten del oro (19) Otros residuos que
contribuyen a aumentar la cantidad de cianuro en el suelo son los producidos en la
construccioacuten de carreteras en la que el ferrocianuro de sodio y el ferrocianuro feacuterrico se
utilizan como antiaglomerantes debido a la exposicioacuten a la luz solar y a la actividad
microbiana los ferricianuros se degradan quiacutemicamente y los iones de cianuro se
liberan en el suelo (15)
22 TOXICIDAD DEL CIANURO
De sobra es conocido el cianuro como un veneno de raacutepida accioacuten Como
ejemplo el dramaturgo Juan Joseacute Alonso Millaacuten en su obra de teatro ldquoEl cianurohellip iquestsoacutelo
o con lecherdquo elegiacutea al cianuro como un meacutetodo faacutecil y eficaz de envenenamiento El
cianuro de hidroacutegeno se aisloacute por primera vez a partir del tinte azul de Prusia en 1786 y
de las almendras alrededor de 1800 Se ha utilizado como veneno en homicidios
Introduccioacuten
12
masivos y suicidios Durante la Segunda Guerra Mundial los nazis utilizaron el cianuro
como agente de genocidio en las caacutemaras de gas debido a su volatilidad a pH aacutecido (20)
como HCN Aunque tambieacuten se dan casos de envenenamiento involuntario por cianuro
existen poblaciones que dependen como principal fuente de alimentos de la yuca que
es una planta cianogeacutenica En estas poblaciones las concentraciones subletales (hasta
80 μmoll) de cianuro en sangre son comunes y provocan signos de intoxicacioacuten aguda
que a largo plazo desembocan en una paraacutelisis espaacutestica e irreversible conocida como
Konzo (21)
Existen al menos tres mecanismos de toxicidad del cianuro (22)
o Formacioacuten de complejos de cianuro con metales di- o trivalentes
presentes en el sitio activo de metalo-enzimas como por ejemplo la
citocromo oxidasa
o Formacioacuten de intermediarios con bases de Schiff durante la cataacutelisis
enzimaacutetica para formar nitrilos derivados estables
o Formacioacuten de cianohidrinas con grupos ceto de intermediarios
metaboacutelicos
23 ELIMINACIOacuteN DEL CIANURO
Debido a su gran toxicidad a lo largo de las uacuteltimas deacutecadas se han desarrollado
diferentes estrategias de desintoxicacioacuten del cianuro existen multitud de meacutetodos
quiacutemicos y fiacutesicos uacutetiles en este proceso pero factores como la composicioacuten quiacutemica de
los desechos su volumen la calidad del efluente y la disponibilidad de los reactivos
afectan negativamente a la viabilidad de estos meacutetodos (15)
Entre los meacutetodos bioloacutegicos de eliminacioacuten del cianuro la fitorremediacioacuten del
tiocianato (SCN-) y de los complejos metalocianurados asiacute como la degradacioacuten
microbiana del cianuro de las aguas residuales de la mineriacutea son los meacutetodos maacutes
exitosos (23)
El uso continuo de cianuro en una gran variedad de procesos industriales estaacute
aumentando de manera considerable en todo el mundo por lo que se requiere de
tecnologiacuteas de remediacioacuten eficaces y econoacutemicas El uso de bacterias naturales para
Introduccioacuten
13
la biorremediacioacuten del cianuro de aguas residuales de todo tipo no es muy favorable
debido a la necesidad de condiciones ambientales extremas pH alto o bajo o la
toxicidad de otros contaminantes que causan un efecto inhibitorio en el crecimiento
de los microorganismos Por tanto los organismos deben seleccionarse no solo por su
capacidad de biodegradacioacuten sino tambieacuten por tolerar las condiciones ambientales
adicionales (23) En este sentido la bacteria Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
es una candidata ideal a tener en cuenta en los procesos de biorremediacioacuten y
biodegradacioacuten del cianuro ya que puede crecer a pH alcalino y utilizar tanto cianuro
como residuos industriales que contienen cianuro como uacutenica fuente de nitroacutegeno
(24)
3 EL GEacuteNERO PSEUDOMONAS
El geacutenero Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonaceae Orden
Pseudomonales La primera vez que se tiene constancia de este geacutenero se cree que fue
en 1894 cuando Walter Migula publicoacute ldquoUumlber ein neues System der Bakterienrdquo (25)
donde describiacutea y comparaba todas las bacterias conocidas hasta el momento (14) La
descripcioacuten inicial de Pseudomonas por Migula estaba basada uacutenicamente en
caracteriacutesticas morfoloacutegicas y no fue hasta la deacutecada de los 60 en el S XX con el
desarrollo de nuevas teacutecnicas cuando la taxonomiacutea dejoacute de tener en cuenta soacutelo los
aspectos morfoloacutegicos (26)
Todos los geacuteneros de este grupo son bacilos rectos o ligeramente curvados con
flagelacioacuten polar Las Pseudomonas son un grupo importante de bacilos Gram
negativos quimiorganotroacuteficos aeacuterobicos que no muestran nunca metabolismo
fermentativo aunque pueden producir aeroacutebicamente pequentildeas cantidades de aacutecido
procedentes de glucosa siendo su principal medio de catabolismo la viacutea de Entner-
Doudoroff (27) Caracteres distintivos de este geacutenero son la ausencia de formacioacuten de
gas a partir de la glucosa y ser oxidasa positiva caracteriacutesticas que las distinguen de las
bacterias enteacutericas Filogeneacuteticamente y basaacutendose en la comparacioacuten de la secuencia
del gen del RNA ribosoacutemico 16S los diferentes grupos de Pseudomonas pueden
considerarse incluidos en el phylum Proteobacterias que a su vez se divide en 5 grupos
denominados con letras griegas alfa beta gamma delta y eacutepsilon en el que el geacutenero
Introduccioacuten
14
Pseudomonas se encuadra dentro de las 16S gamma (RNA-I-V) (28) El trabajo de Jean-
Marie Mayer y sus colaboradores en la Universidad de Estrasburgo (29) ha antildeadido una
nueva y muy interesante estrategia para la identificacioacuten de especies basada en la
determinacioacuten del tipo de sideroacuteforos fluorescentes o no fluorescentes producidos por
las bacterias (4) Es probable que las Pseudomonas deriven de bacterias fototroacuteficas
ancestrales que han dejado de ser fotosinteacuteticas en el proceso evolutivo que las llevoacute a
colonizar haacutebitats en los que la fotosiacutentesis anoxigeacutenica no presentaba ninguna ventaja
por ejemplo en el suelo o en la superficie de plantas y animales (28)
Este geacutenero tiene requerimientos nutritivos muy sencillos y crecen
quimiorganotroacuteficamente a pH neutro y a temperaturas en la zona de la mesofilia Una
propiedad sorprendente de este grupo es la gran variedad de compuestos orgaacutenicos
que pueden usar como fuentes de carbono y energiacutea Algunas especies usan maacutes de
cien compuestos diferentes y soacutelo unas pocas especies usan menos de veinte Como
ejemplo de esta flexibilidad una sola cepa de Pseudomonas aeruginosa puede usar
muchos azuacutecares diferentes aacutecidos grasos aacutecidos dicarboxiacutelicos aacutecidos tricarboxiacutelicos
alcoholes polialcoholes glicoles compuestos aromaacuteticos aminoaacutecidos y aminas
ademaacutes de otros compuestos que no corresponden a ninguna de las categoriacuteas
anteriores Por otra parte las Pseudomonas normalmente no pueden descomponer
poliacutemeros en sus componentes monomeacutericos (28)
El hecho de que puedan utilizar maacutes de cien fuentes de carbono y energiacutea
diferentes les ha permitido colonizar con eacutexito una gran variedad de nichos bioloacutegicos
(suelos aguas dulces y marinas) y pueden ser saproacutefitas patoacutegenas o actuar en
simbiosis con plantas y animales Esta versatilidad metaboacutelica las hace organismos
ecoloacutegicamente muy importantes en suelo y agua participando en la degradacioacuten de
muchos compuestos solubles derivados de la degradacioacuten de materiales de plantas y
animales en ambientes toacutexicos (28)
Las Pseudomonas son por tanto nutricionalmente adaptables y poseen
numerosos operones inducibles ya que el catabolismo de sustratos orgaacutenicos poco
corrientes suele requerir la accioacuten de varias enzimas distintas (28) Algunas especies
sintetizan sideroacuteforos fluorescentes de color amarillo-verdoso con gran valor
taxonoacutemico siendo comuacuten la presencia de plaacutesmidos (30) En general no acumulan
Introduccioacuten
15
graacutenulos de poli-β-hidroxibutirato en condiciones oacuteptimas de crecimiento excepto
cuando se cultivan con gluconatos o alcanos (31) o cuando el medio de cultivo estaacute
desbalanceado (32)
El nuacutemero de especies asignadas al denominado grupo sensu stricto de
Pseudomonas ha crecido considerablemente y sigue creciendo como consecuencia de
la notable adaptabilidad de la familia Pseudomonadaceae a las condiciones de los
distintos entornos Entre estas condiciones variables se encuentran principalmente la
composicioacuten quiacutemica de los compuestos para satisfacer las necesidades de carbono y
nitroacutegeno Sin embargo las bacterias pertenecientes a esta familia son poco tolerantes
a variaciones de pH y de temperatura lo que explicariacutea la ausencia de cepas realmente
acidoacutefilas o termoacutefilas (26) El geacutenero Pseudomonas incluye cepas patoacutegenas
oportunistas de animales (P aeruginosa) patoacutegenos de plantas (P syringae) y cepas
que estimulan el crecimiento de plantas como P fluorescens (33) Actualmente existen
anotados en la base de datos ldquoPseudomonas Genome DBrdquo
(httpwwwpseudomonascom) aproximadamente 9000 genomas de Pseudomonas
spp con continuas anotaciones y actualizaciones (34)
31 Pseudomonas pseudoalcaligenes
Pseudomonas pseudoalcaligenes es una bacteria aislada por primera vez a partir
del agua de una piscina (35) Etimoloacutegicamente pseudoalcaligenes significa falso
productor de aacutelcalis (httpwwwbacterionetpseudomonashtml) Basaacutendose en el
anaacutelisis de la secuencia del gen del rRNA 16S se ha incluido en el mismo grupo que P
aeruginosa P mendocina y P stutzeri y pertenece al subgrupo de P aeruginosa de
Palleroni (30) La coleccioacuten examinada por Stanier (36) incluiacutea al menos dos grupos de
las cepas pertenecientes al primero de ellos capaces de almacenar PHB
(polihidroxibutirato) y arginina dihidrolasa positivas en tanto que las pertenecientes al
segundo grupo no poseiacutean estas propiedades y mostraban caracteriacutesticas nutricionales
diferentes (37)
La especie estaacute constituida por tres subespecies P pseudoalcaligenes subsp
Pseudoalcaligenes la original descrita por Stainer (36) P pseudoalcaligenes subps
citrulli patoacutegena de plantas (38) y P pseudoalcaligenes subps Konjaci tambieacuten
Introduccioacuten
16
fitopatoacutegena (agente causal de la enfermedad bacteriana del tubeacuterculo japoneacutes
Amorphophalus konjaci) (39) Algunas cepas de P pseudoalcaligenes aisladas de suelos
y aguas subterraacuteneas contaminadas con nitrobenceno son capaces de utilizar el
nitrobenceno como uacutenica fuente de carbono nitroacutegeno y energiacutea (40) de co-
metabolizar bifenilos policlorados (41) de crecer en presencia de telurio (42) y algunas
ademaacutes presentan tolerancia a metales y metaloides toacutexicos (43)
32 Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
La bacteria Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 fue aislada en lodos
recogidos en la margen izquierda del riacuteo Guadalquivir a su paso por Coacuterdoba donde
tiene gran importancia la industria joyera Esta cepa fue aislada por su capacidad de
crecer en medio miacutenimo con cianuro como uacutenica fuente de nitroacutegeno (44) Esta bacteria
es capaz de crecer en medios alcalinos hasta un pH de 115 lo que evita que el cianuro
(pKa 92) se volatilice y tolera concentraciones de cianuro libre de hasta 30 mM (24)
Ademaacutes tambieacuten lleva a cabo la asimilacioacuten de complejos metaacutelicos del cianuro por
todo ello se puede considerar a esta cepa una firme candidata para ser utilizada como
agente bioloacutegico en tratamientos de biorremediacioacuten de residuos cianurados (44) Su
potencial biotecnoloacutegico ha quedado demostrado mediante la desintoxicacioacuten de
cianuro en un reactor discontinuo (45) y tambieacuten mediante el uso de la enzima cianasa
que es inducida por cianuro en la construccioacuten de un biosensor para detectar cianato
(46)
En crecimiento cianotroacutefico necesita una fuente de carbono como acetato o D
L-malato ya que no se produce crecimiento si se utiliza el cianuro como uacutenica fuente de
carbono y de nitroacutegeno El cianuro y el amonio son asimilados por la bacteria de manera
simultaacutenea sin embargo el cianuro inhibe fuertemente la asimilacioacuten de nitrato y
nitrito (44) Bajo condiciones cianotroacuteficas la bacteria acumula polihidroxialcanoatos
un tipo de bioplaacutestico (figura 1) Existen tres agrupaciones de genes en el genoma de
esta bacteria implicados en el metabolismo de polihidroxialcanoatos que podriacutean ser
considerados una alternativa a los plaacutesticos procedentes del petroacuteleo (47)
Introduccioacuten
17
Mediante electroforesis bidimensional se identificaron en P pseudoalcaligenes
CECT 5344 algunas proteiacutenas inducidas por cianuro encontraacutendose que este
compuesto toacutexico produciacutea una respuesta que incluiacutea proteiacutenas relacionadas con la
defensa frente a estreacutes oxidativo el hambre de nitroacutegeno y la produccioacuten de
sideroacuteforos (4849) Existen muchas otras proteiacutenas de funcioacuten desconocida que
tambieacuten son inducidas por la presencia de cianuro lo que es indicativo de que la bacteria
desarrolla una respuesta compleja frente a este compuesto Se inducen enzimas de
rutas para la asimilacioacuten del cianuro y cianato (como la nitrilasa y la cianasa) y de hierro
mediante la siacutentesis de sideroacuteforos (ya que ndashCN y Fe2+ forman complejos muy estables
que limitan la disponibilidad de este elemento (4850ndash53)) Los mecanismos de defensa
incluyen la induccioacuten de una oxidasa terminal insensible a cianuro y de mecanismos de
defensa frente al estreacutes oxidativo y de control del balance CN intracelular en respuesta
a la limitacioacuten de nitroacutegeno (44484954) En cuanto a la produccioacuten de sideroacuteforos
cabe destacar que trabajos posteriores han demostrado que P pseudoalcaligenes CECT
5344 no sintetiza sideroacuteforos conocidos (55) Sin embargo la ausencia de hierro induce
mecanismos de transporte y utilizacioacuten de sideroacuteforos producidos por otros seres vivos
denominados xenosideroacuteforos (5556) Ademaacutes la ausencia de hierro afecta a
mecanismos relacionados con la respuesta al estreacutes oxidativo procesos de inmunidad
o metabolismo energeacutetico (5556)
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 tiene un genoma con un tamantildeo
total de 4686340 pb (5758) con un contenido en CG del 6234 Su genoma de 464
Figura 1 Deteccioacuten por microscopiacutea electroacutenica de transmisioacuten de PHAacutes acumulados en P pseudoalcaligenes CECT 5344 Las ceacutelulas se cultivaron con acetato de sodio 50 mM y cloruro de amonio 2 mM (a) con octanoato 125 mM maacutes cloruro de amonio (b) cianuro de sodio (c) o cianuro del residuo de joyeriacutea (d) cada uno a una concentracioacuten inicial de 2 mM Las muestras se analizaron a las 30 h de cultivo antes de que el cianuro se consumiera por completo
en medios que conteniacutean cianuro Fotografiacutea extraiacuteda de (47)
Introduccioacuten
18
Mb consta de un uacutenico cromosoma circular comparte el 75 de sus genes (3 191) con
P mendocina Ymp y no contiene plaacutesmidos accesorios La secuenciacioacuten del genoma
de este organismo (58) ha permitido identificar la presencia de genes implicados en
procesos con gran potencial biotecnoloacutegico como la resistencia y asimilacioacuten de
cianuro el metabolismo de bioplaacutesticos la degradacioacuten de furfurales y otros
contaminantes o la resistencia a metales pesados (57)
Una de las caracteriacutesticas maacutes importantes a la hora de manipular
geneacuteticamente la cepa P pseudoalcaligenes CECT 5344 (R1) es su dificultad para que las
transformaciones geacutenicas tengan eacutexito ya que es una bacteria recalcitrante y no replica
ninguno de los plaacutesmidos descritos para la mayoriacutea de Pseudomonas probablemente
debido a que los sistemas de defensa son muy eficientes en esta bacteria (5455)
4 SISTEMAS DE MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN (MR)
La Modificacioacuten y Restriccioacuten del DNA se describioacute por primera vez en 1962
cuando Arber y Dussoix exploraron los mecanismos moleculares de la modificacioacuten
controlada por el hospedador del bacterioacutefago λ (59) Una de las primeras
clasificaciones que se establecioacute fue diferenciando aquellos sistemas en los que el DNA
celular estaacute protegido de la restriccioacuten por modificacioacuten en la metilacioacuten de residuos de
adenina o citosina dentro de secuencias reconocidas por las enzimas de restriccioacuten (los
sistemas de MR claacutesicos) y aquellos que cortan el DNA que lleva modificaciones
especiacuteficas (60)
Los sistemas de Modificacioacuten Restriccioacuten (sistemas MR) se descubrieron junto
con el aislamiento de elementos geneacuteticos extracromosoacutemicos ya que proporcionan
un mecanismo de defensa innato de las bacterias frente a plaacutesmidos y virus (61)
A todo aquel que trabaje con DNA le resultan familiares las endonucleasas de
restriccioacuten (ERasas) como por ejemplo EcoRI enzima de restriccioacuten de tipo II que
representan el mayor grupo de enzimas caracterizadas en parte debido a su uso en
teacutecnicas de recombinacioacuten de DNA Las ERasas se encuentran clasificadas en cuatro
tipos principales de I a IV (62) Todas las ERasas conocidas estaacuten anotadas en la base
Introduccioacuten
19
de datos REBASE (httprebasenebcom) (63) La mayoriacutea de las ERasas necesitan un
cofactor metaacutelico divalente para ejercer su actividad (62) En la Tabla 1 se muestran las
principales caracteriacutesticas de estas enzimas
Tabla 1 Caracterizacioacuten y organizacioacuten de los genes y subunidades de los cuatro tipos de enzimas de restriccioacuten (ERasas) Adaptada de (606264)
TIPO I TIPO II TIPO III TIPO IV EJEMPLO DE SISTEMA MR
EcoKI EcoR1 EcoP1I EcoMcrBC
GENES hsdR hsdM hsdS ecoIR ecoIM mod res mcrb mcrcr SUBUNIDADES Tres subunidades
diferentes (R M y S) combinadas ERase 2R + 2M + S MTasa 2M + S (plusmn 2R)
Dos subunidades diferentes (R y M) ERase 2R (ortodoxo) MTasa M (ortodoxo)
ERase 1 o 2 R + 2M MTasa 2M + (plusmn 2R)
Dos subunidades diferentes McrB y McrC
ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA
ERasa MTasa y ATPasa
ERasa o MTasa ERasa MTasa y ATPasa
ERasa y GTPasa
SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
Asimeacutetrica y bipartita Ej EcoKI 5rsquoAAC(N6)GTGC
La mayoriacutea asimeacutetrica Ej EcoRI 5rsquoGAATTC
Asimeacutetrica Ej EcoP1I 5rsquoAGACC
Bipartita y metilada Ej EcoMcrBC 5rsquoRmC(N30-
4000)RmC COFACTORES NECESARIOS
PARA LA RESTRICCIOacuteN
Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP (SAM) Mg2+ GTP (McrBC)
COFACTORES NECESARIOS
PARA LA METILACIOacuteN
SAM SAM SAM No metilacioacuten
SITIO DIANA Localizacioacuten variable a 1000 pb desde el sitio de reconocimiento
Localizacioacuten fija o cerca del sitio de reconocimiento
Localizacioacuten fija a 25 ndash 27 pb desde el sitio de reconocimiento
Muacuteltiples sitios de entre las bases metiladas
TRASLOCACIOacuteN DE DNA
Siacute No Siacute Siacute
LAS ENZIMAS DEL TIPO IV SON ALTAMENTE DIVERSAS Y SOLO UNAS POCAS HAN SIDO CARACTERIZADAS EN DETALLE ERASA ENZIMA DE RESTRICCIOacuteN MTASA METILTRANSFERASA SAMADOMET S-ADENOSIL METIONINA
Estos cuatro tipos de sistemas MR se componen en combinaciones variables
(figura 2) de dos elementos principales una metiltransferasa (MTasa) que modifica el
DNA del hospedador para protegerlo y una endonucleasa de restriccioacuten (ERasa) que
reconoce secuencias diana especiacuteficas y corta el DNA invasor no metilado (6264)
Basado en la prediccioacuten bioinformaacutetica al menos un sistema MR estaacute codificado en casi
todos los genomas procarioacuteticos (httprebasenebcomrebaserebasehtml) (63)
Introduccioacuten
20
Los sitios de reconocimiento de un sistema MR son tiacutepicamente secuencias
palindroacutemicas de 4-8 pb de longitud lo bastante cortas para aparecer al azar en el
genoma de un organismo procariota con una frecuencia relativamente alta Los
organismos procariotas al carecer de una envoltura nuclear que aiacutesle su material
geneacutetico del citoplasma emplean la metilacioacuten para proteger su cromosoma y otros
elementos del DNA nativo del ataque de las ERasas Por otro lado las ERasas
proporcionan inmunidad frente a los elementos geneacuteticos invasores que no han estado
suficientemente expuestos a la MTasa de la ceacutelula incluido el DNA de fagos y plaacutesmidos
(figura 3) Asiacute pues el sistema MR es una herramienta de la bacteria para distinguir el
ldquoyordquo del ldquono-yordquo (65)
Figura 2 Representacioacuten esquemaacutetica del papel funcional en las diversas formas de organizacioacuten de los sistemas de Modificacioacuten ndashRestriccioacuten Entre dichas funciones se incluyen S dota de especificidad en la secuencia de ADN MT actividad cataliacutetica de metiltransferasa M unioacuten SAM E endonucleasa T translocacioacuten Los cuadros delinean funciones que estaacuten ocupadas por distintos dominios de proteiacutenas Los diferentes colores indican diferentes funciones mientras que diferentes cuadros representan dominios distintos Los dominios en un solo polipeacuteptido estaacuten unidos y aquellos en polipeacuteptidos separados en espacio aparte El orden de los dominios en un polipeacuteptido puede variar por ejemplo no todas las enzimas Tipo IIS tienen el dominio de escisioacuten en el extremo C-terminal En algunos casos las funciones se integran entre siacute vg Funciones S y E de Tipo IIP (caja rayada) en otros casos son dominios separados los que los llevan a cabo Las grandes familias de los sistemas Tipo I y Tipo II se subdividen actualmente en 5 y 11 grupos diferentes respectivamente Las familias Tipo I se distinguen por homologiacutea Los grupos de tipo II se distinguen por sus propiedades cataliacuteticas maacutes que por la homologiacutea de secuencia Las enzimas tipo IV se identificaron inicialmente como enzimas de restriccioacuten dependientes de hidroximetilacioacuten y actualmente comprenden una familia muy diversa Se muestran dos ejemplos con y sin un dominio de translocacioacuten (62)
Introduccioacuten
21
41 SISTEMAS DE MR TIPO I
Las ERasas Tipo I se identificaron originariamente en E coli y otros organismos
enteacutericos como barreras para la entrada de DNA (62) Antes del desarrollo de la
secuenciacioacuten del DNA las pruebas de complementacioacuten geneacutetica definieron tres
genes denominados hsd (host specificity determinant determinante de especificidad
del hospedador) hsdR codifica la subunidad de Restriccioacuten (R) hsdM la subunidad de
Modificacioacuten (M) y hsdS la subunidad de reconocimiento (S especificidad) Suelen
formar un complejo pentaacutemeacuterico de composicioacuten 2R + 2M + S (ERasas) y triacutemerico
pentameacuterico de composicioacuten 2M + S 2M + S + 2R (las MTasas) (ver tabla 1 y figura 2)
(62) En el complejo baacutesico de modificacioacuten HsdMS la subunidad HsdM metila residuos
de adenina en una secuencia de DNA especiacutefica denominada Motivo de
Reconocimiento Diana (TRM Target Recognition Motif) guiado por la subunidad HsdS
mientras que la subunidad HsdR corta el DNA no metilado (6266) La enzima de este
tipo estudiada con maacutes detalle es la EcoKI sobre todo en trabajos de biologiacutea molecular
con E coli K12 Los genes de EcoKI se localizan con muy pocas excepciones cerca de
aquellos que codifican a McrBC y a Mrr en un cluacutester denominado ldquoregioacuten de control de
inmigracioacutenrdquo (66)
Figura 3 Defensa antiviral mediada por sistemas de MR Las endonucleasas de restriccioacuten (ERasas en rojo) escinden el DNA viral invasor en motivos de secuencia corta conocidos como sitios de reconocimiento (cuadros naranja) Las enzimas metiltransferasas (MTasa en azul) pueden modificar el DNA en las mismas secuencias de sitios de reconocimiento (anexadas con recuadros azules) para prevenir la escisioacuten por su ERasa correspondiente (65)
Introduccioacuten
22
Los estudios de hibridacioacuten de DNA inmunoloacutegicos con anticuerpos dirigidos a
EcoKI establecieron una clasificacioacuten de 5 familias (IA-IE) del sistema de MR Tipo I
basado en la interaccioacuten bioloacutegica el Tipo IA (EcoKI EcoB EcoDI and Salmonella
typhimurium StySPI) Tipo IB (EcoAI EcoEI and Citrobacter freundii CfrAI) Tipo IC
(EcoR124 EcoDXXI EcoprrI) Tipo ID (StyBLI y Klebsiella pneumoniae KpnAI) y Tipo IE
(KpnBI) (6266)
Los TRMs reconocidos por los Dominios de Reconocimiento Diana (TRDs
Target Recognition Domains) de la subunidad S suelen ser secuencias asimeacutetricas y
bipartitas de DNA por comparacioacuten de dos ldquomedias secuenciasrdquo separadas por un
espaciador de entre 6 ndash 8 nucleoacutetidos al azar (vg AAC (N6) GTGC para EcoKI) De este
hecho se deriva la organizacioacuten repetitiva de la subunidad S que presenta dos TRDs
separados uno para reconocer a cada ldquomedia secuenciardquo (66) Como cofactores las
enzimas de este tipo necesitan S-adenosilmetionina (SAM) para su actividad cataliacutetica
ademaacutes de Mg2+ y ATP (6266)
Este sistema de MR Tipo I utiliza motores moleculares para translocar al DNA y
alcanzar los sitios de corte La subunidad R de las enzimas Tipo I pertenece a la
superfamilia de proteiacutenas helicasa translocasa SNF2 Eacutestas parecen ser el resultado de
una antigua fusioacuten entre una nucleasa y dominios dependientes de ATP tipo RecA
(AAA+ o motor) una agrupacioacuten que se encuentra en muchas enzimas involucradas en
la reparacioacuten replicacioacuten recombinacioacuten y remodelacioacuten cromosoacutemica del DNA Esta
unioacuten de dominios permite realizar los pasos coordinados de escaneo de DNA
reconocimiento unioacuten y alteracioacuten de la estructura helicoidal facilitando que otros
dominios o subunidades del sistema se muevan y entren en contacto con el DNA Todos
los pasos anteriores son necesarios para evitar una actividad nucleasa indiscriminada
(62) La subunidad R de la ERasa contacta con el nuacutecleo de la MTasa M2S si ni la mitad
de la secuencia de reconocimiento estaacute metilada las subunidades R traslocan el DNA
adyacente y lo separan a una distancia variable aproximadamente entre los sitios de
reconocimiento vecinos mientras que la enzima permanece unida al sitio Este
comportamiento genera bucles de DNA que pueden producirse en ausencia de
hidroacutelisis de ATP Una vez que se bloquea la translocacioacuten ya sea por colisioacuten con otra
moleacutecula o la presencia de DNA superenrollado el DNA se escinde (66)
Introduccioacuten
23
La metilacioacuten de las secuencias del reconocimiento (DNA propio) requiere del
cofactor SAM como donador de grupos metilos Por lo general la metilacioacuten convierte
una adenina en cada media secuencia en N6-metiladenina (m6A)
La plasticidad en el reconocimiento de secuencias de DNA se debe a la
subunidad S que presenta dos regiones variables (TRDs) que se alternan con regiones
conservadas maacutes pequentildeas de forma que cada regioacuten variable reconoce una parte de
la secuencia bipartita diana (62)
Los sistemas de MR se suprimen despueacutes de dantildeo en el DNA producido por
exposicioacuten a radiacioacuten UV 2-aminopurina o aacutecido nalidiacutexico en un fenoacutemeno
denominado ldquoalivio de restriccioacutenrdquo (RA) Se supone que este mecanismo protege la
ceacutelula mientras se repara el dantildeo o durante la recombinacioacuten homoacuteloga Durante este
periodo se pueden crear sitios no modificados en el cromosoma hospedador y el ldquoalivio
de restriccioacutenrdquo (RA) evita que eacutestos sean cortados La restriccioacuten (pero no la metilacioacuten)
tambieacuten se suprime despueacutes de la transferencia de genes MR a un nuevo hospedador
es decir la expresioacuten de los nuevos genes no conduce a la rotura del cromosoma no
modificado del hospedador (66)
Por otro lado los fagos plaacutesmidos y transposones han desarrollado numerosos
mecanismos de anti-restriccioacuten y anti-modificacioacuten restriccioacuten en una encarnizada
lucha armamentiacutestica Ocr ArdA y ArdB parecen ser proteiacutenas anti-MR El fago T7 al
infectar a E coli el primer gen que introduce es el gen 03 que codifica a la proteiacutena
Ocr Eacutesta es sintetizada en grandes cantidades por la maquinaria de E coli durante los
dos primeros minutos de infeccioacuten durante los cuales se detiene la insercioacuten de DNA
de T7 En este breve periodo de tiempo se produce suficiente cantidad de Ocr para
inhibir completamente las enzimas de Tipo I del hospedador tras lo cual se detiene su
siacutentesis y puede entrar el resto del genoma del fago con total seguridad Las proteiacutenas
ArdA y ArdB generalmente estaacuten codificadas por plaacutesmidos y transposones
conjugados y tambieacuten a menudo son los primeros genes en ingresar a la ceacutelula
receptora Como el DNA ldquoentranterdquo es monocatenario y resistente a la restriccioacuten se
forma un promotor inusual el DNA del plaacutesmido (ColIb-P9) forma una horquilla de
doble cadena para permitir la transcripcioacuten de ardA La produccioacuten de ArdA o ArdB
provoca una raacutepida inhibicioacuten de las enzimas Tipo I del hospedador Estos dos genes
Introduccioacuten
24
estaacuten muy extendidos y con frecuencia acompantildean a los genes de resistencia a
antibioacuteticos (66)
42 SISTEMAS DE MR TIPO II
El sistema MR tipo II lo forman una metiltransferasa (MTasa) y una
endonucleasa de restriccioacuten (ERasa) que reconocen secuencias cortas de 4-8 pb
normalmente palindroacutemicas monopartitas (tiacutepico de virus) y que cortan en el sitio
especiacutefico del TRM o a una distancia fija del mismo (figura 4) (67)
Las ERasas de tipo II difieren del resto de tipos de sistemas de MR por una
organizacioacuten de subunidades maacutes simple Suelen ser homodiacutemeros u homotetraacutemeros
que cortan el DNA dentro o cerca de su sitio de reconocimiento No requieren de ATP o
GTP salvo alguna excepcioacuten pero si necesitan Mg2+ como cofactor (68) muchas
pueden usar Mn2+ y algunas pueden usar una variedad de cationes que incluyen Co2+
Zn2+ Ni2+ o Cu2+ en su lugar (67) Las enzimas ortodoxas de tipo II son homodiacutemeros que
reconocen secuencias palindroacutemicas de 4 ndash 8 pb y cada monoacutemero corta dentro de esta
secuencia en ambas cadenas Los fragmentos de DNA producidos tras el corte pueden
tener extremos ldquoromosrdquo o extremos cohesivos (figura 4) (6468) Las MTasas del Tipo II
generalmente actuacutean como monoacutemeros para modificar una base especiacutefica de sus
secuencia de reconocimiento en cada hebra de la cadena la metilacioacuten de una citosina
ocurre en la posicioacuten N4 o C5 y la metilacioacuten de adenina ocurre en la posicioacuten N6 (64)
La mayoriacutea de las enzimas de restriccioacuten utilizadas en teacutecnicas de DNA
recombinante pertenecen al subtipo Tipo IIP (P de palindroacutemico) La clasificacioacuten del
grupo se basa en su comportamiento dividieacutendose en A B C E F G H M P S y T
(62) pero debido a la gran diversidad de este grupo la superposicioacuten no puede evitarse
(68) Estas enzimas reconocen con gran precisioacuten su secuencia de restriccioacuten asiacute que
una manera de proteger el DNA propio de la fragmentacioacuten es que la MTasa modifique
la secuencia de reconocimiento (vg GAATTC secuencia de reconocimiento para
EcoRI es modificada por la MTasa a GAm6ATTC impidiendo su reconocimiento) (67)
Mucho de lo que se sabe sobre las enzimas Tipo II se descubrioacute primero con
EcoRI y EcoRV Estas ERasas son representativas de la subclase de Tipo IIP El
Introduccioacuten
25
descubrimiento de las enzimas de restriccioacuten que cortan el DNA en posiciones fijas
permitioacute por ejemplo utilizar la enzima HindIII en el bacterioacutefago λ obteniendo un
conjunto de fragmentos discretos que producen un patroacuten de bandas caracteriacutestico
cuando se analizan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida o agarosa La
visualizacioacuten de los fragmentos en los geles por tincioacuten con bromuro de etidio se
convirtioacute en una teacutecnica universal en los laboratorios de biologiacutea molecular que culminoacute
en el desarrollo de huellas dactilares (fingerprinting) de DNA (67)
En los sistemas MR Tipo II se han identificado MTasas ldquohueacuterfanasrdquo es decir se
encuentran de forma aislada sin las correspondientes enzimas de restriccioacuten pero que
sin embargo metilan activamente sitios especiacuteficos en el genoma Esta caracteriacutestica
plantea la posibilidad de que estas MTasas esteacuten involucradas en funciones que no son
de MR como la regulacioacuten geneacutetica Las MTasas hueacuterfanas estaacuten ampliamente
distribuidas entre los procariotas (69)
A diferencia de las enzimas Tipo I se ha demostrado un control transcripcional
para las enzimas Tipo II ya que sus productos ademaacutes de ser una barrera frente a DNA
exoacutegenos matan las ceacutelulas bacterianas (hospedadoras) que han perdido los genes de
MR proceso que ayuda a mantener la frecuencia de los sistemas MR en la poblacioacuten
celular viable por lo que se espera un regulacioacuten de su expresioacuten (70) Se sabe que la
expresioacuten de algunos sistemas MR de Tipo II estaacute controlada por proteiacutenas de tipo
represor conocidas como proteiacutenas C Por ejemplo se ha demostrado que una proteiacutena
C activa la expresioacuten del gen de restriccioacuten PvuII (64)
Introduccioacuten
26
43 SISTEMAS DE MR TIPO III
El sistema MR tipo III tiene en la mayoriacutea de los casos una composicioacuten 2R +
2M Este complejo reconoce TRMs cortas y asimeacutetricas de maacutes o menos 5-6 pb de
longitud La restriccioacuten suele ocurrir 25-27 nucleoacutetidos maacutes allaacute del sitio de
reconocimiento (71) Tienen propiedades intermedias entre los Tipos I y II (tabla 1)
Como cofactores suelen utilizar ATP y SAM (este uacuteltimo no es requisito indispensable)
Los Sistemas de MR Tipo III han sido identificados casi en exclusiva en fagos y
en bacterias Gram negativas siendo los ejemplos mejor estudiados Eco P1I y EcoP15I
estos dos sistemas se complementan es decir mutaciones en uno de los sistemas
pueden ser suplementadas por el alelo silvestre del otro sistema Las enzimas de Tipo
III estaacuten codificadas por genes contiguos res necesarios solo para la restriccioacuten y mod
cuyo producto proporciona el reconocimiento de DNA por M y R y ademaacutes cataliza la
modificacioacuten Asiacute pues mod en este sentido seriacutea un anaacutelogo funcional de los
productos de los genes hsdS y hsdM del Sitema MR tipo I (6062)
Se cree que se necesitan dos copias del sitio de reconocimiento para la escisioacuten
del DNA pero que estos sitios deben estar en la misma orientacioacuten (cabeza a cabeza)
una orientacioacuten contraria (cabeza a cola) prevendriacutea la restriccioacuten pero no la
Figura 4 Reconocimiento y corte del DNA por enzimas de restriccioacuten Tipo II (67)
Introduccioacuten
27
modificacioacuten Parece ser que el bucle de DNA puede tener un papel importante en la
unioacuten entre los dos sitios de reconocimiento aunque esta aproximacioacuten provoca ciertas
controversias Este sistema podriacutea ser un plan B en la defensa de la bacteria cuando
falla el sistema MR Tipo I por ejemplo porque la hidroacutelisis del ATP sea insuficiente para
la traslocacioacuten del DNA y para la actividad cataliacutetica de las enzimas (6062)
44 SISTEMAS DE MR TIPO IV
El sistema MR tipo IV presenta una uacutenica endonucleasa dependiente de
modificacioacuten que reconoce citosinas metiladas hidroximetiladas y
glucosilhidroximetiladas como DNA extrantildeo y lo corta (6472) Las enzimas de Tipo IV
son muy difiacuteciles de localizar ya que los paraacutemetros de buacutesqueda son diferentes para
cada taxoacuten (73)
La endonucleasa de Tipo IV McrA es capaz de reconocer modificaciones hm5C
m5C y m6C y recientemente se ha descubierto que tambieacuten reconocen enlaces de
fosforotioato (PT) en el esqueleto fosfodieacutester de los nucleoacutetidos (6273)
El sistema Tipo IV McrBC es el ejemplo mejor estudiado (64) en su extremo
amino terminal reside el dominio de unioacuten al DNA mientras que los dominios de
translocacioacuten y restriccioacuten se encuentran en el extremo carboxilo terminal (73) Parece
ser que mcrB y mcrC estaacuten organizados dentro del mismo operoacuten y codifican al menos
tres polipeacuteptidos Las enzimas de restriccioacuten McrBC reconocen en el DNA citosinas
metiladas m5C hm5C y m4C y necesitan GTP como cofactor para la restriccioacuten y la
modificacioacuten (6064) Un reciente anaacutelisis distingue en los sistemas MR Tipo IV un
complejo formado por dos subunidades una GTPasa de la familia RecA (AAA+) y una
endonucleasa(74)
En 1987 Heitman y Model (75) descubrieron que la transferencia de varias
MTasas m6A exoacutegenas induciacutea una respuesta SOS debido a dantildeo en el DNA este dantildeo
era producido por cortes realizados por un nuevo sistema Mrr Aunque no existe una
descripcioacuten concreta de las secuencias de reconocimiento de Mrr las MTasas de
adenina como las de citosina hacen sensible al DNA al ataque y restriccioacuten por parte
de Mrr (73) El locus de mrr se suele localizar cerca del locus de hsd y de mcrBC (60)
Introduccioacuten
28
45 EVOLUCIOacuteN DE LOS SISTEMAS DE MR
Una forma de comprender la gran variedad de sistemas de restriccioacuten y su
distribucioacuten esporaacutedica es ubicar los impulsores evolutivos en los genes enzimaacuteticos en
siacute mismos como elementos egoiacutestas Existen diversos trabajos (7677) en los que se
demuestra que el hospedador se vuelve adicto al sistema MR Una vez que una ceacutelula
ha adquirido un par MR la peacuterdida de estos genes da como resultado la muerte de los
descendientes de esa ceacutelula ya que la ERasa con frecuencia todaviacutea estaacute presente y
puede actuar sobre el genoma despueacutes de la peacuterdida de la actividad de metilacioacuten (73)
Desde este punto de vista el papel desempentildeado por las enzimas dependientes
de modificacioacuten es la defensa del hospedador que trata de eliminar los sistemas con
patrones MTasa extrantildeos y evitar que la ceacutelula se ldquocarguerdquo con paraacutesitos La
especificidad de secuencia deacutebil de las enzimas Tipo IV podriacutea resultar de la necesidad
de controlar la entrada de una amplia variedad de sistemas invasores ya que el
hospedador no presenta hm5C y los fagos estaacuten completamente sustituidos (73)
Los virus y otros elementos geneacuteticos moacuteviles han desarrollado muacuteltiples
estrategias para evadir a la ERasas tales como la adquisicioacuten de modificaciones
similares a las de su hospedador la siacutentesis de sus propias MTasas o hipermodificando
su DNA incorporando bases inusuales la siacutentesis de proteiacutenas ldquoantirrestriccioacutenrdquo que
imitan el DNAhellip Todos estos procesos permiten que los fagos se vuelvan resistentes a
las ERasas que se encuentran por lo que eacutestas dejan de ser efectivas frente a ese fago
en particular La solucioacuten a esta disminucioacuten paulatina de la proteccioacuten frente a los
elementos externos pasa por un cambio perioacutedico de la especificidad de las ERsas No
obstante para que este cambio sea efectivo la especificidad de la MTasa debe cambiar
de manera simultaacutenea de la misma manera que la ERasa ya que si no ldquola nuevardquo ERasa
eliminaraacute el DNA modificado incorrectamente (deja de reconocer ese DNA como
propio) y la ceacuteula moriraacute El sistema de MR Tipo I ha resuelto este problema
desarrollando una forma eficiente de cambiar las especificidades de la ERasa y la MTasa
de manera armoniosa mediante el uso de una subunidad de reconocimiento de
secuencia de DNA (S Especificidad) comuacuten para la modificacioacuten y la restriccioacuten (66)
Introduccioacuten
29
Una segunda interpretacioacuten supone que las enzimas Tipo IV dependientes de
modificacioacuten surgieron de la interaccioacuten co-evolutiva competitiva entre fagos y sus
hospedadores Es decir a lo largo de la carrera armamentiacutestica entre bacterias y fagos
los hospedadores usaron enzimas de restriccioacuten bloqueadas por modificacioacuten a lo que
los fagos respondieron con el desarrollo de meacutetodos para sustituir bases ldquoordinariasrdquo
por bases modificadas en este punto de la batalla los hospedadores se ldquoarmaronrdquo con
enzimas tipo IV en defensa los fagos antildeadieron azuacutecar y otras modificaciones para
frustrar a las enzimas tipo IV Los hospedadores dotaron a las enzimas tipo IV de nuevas
propiedades extendidas con las que poder reconocer las nuevas modificaciones de los
fagos Finalmente los fagos desarrollaron inhibidores de proteiacutenas especiacuteficos para las
enzimas bacterianas (73)
5 EL PERIPLASMA PROCARIOTA
Peter Mitchell (78) nombroacute periplasma por primera vez al compartimento
celular acuoso delimitado por dos capas de membrana conceacutentricas Una definicioacuten
maacutes actual es aquella en la que se denomina periplasma como la regioacuten gelatinosa
situada entre la capa externa de la membrana plasmaacutetica y la interna de la capa
liposacariacutedica de las bacterias gram-negativas (figura 5) El periplasma es maacutes denso
que el citoplasma debido a su alto contenido en proteiacutenas (79) La membrana externa
de las bacterias gram-negativas es relativamente permeable a pequentildeas moleacuteculas
gracias a la presencia de unas proteiacutenas llamadas porinas que actuacutean como canales de
entrada y salida de sustancias hidrofiacutelicas de bajo peso molecular Sin embargo esta
membrana externa no es permeable a enzimas y otras moleacuteculas de gran tamantildeo por
lo que se puede decir que una de las principales funciones de eacutesta es la de mantener
fuera determinadas enzimas que se hallan en el exterior de la membrana plasmaacutetica
evitando que difundan al exterior Esta compartimentacioacuten celular tambieacuten protege a
las bacterias gram-negativas de enzimas potencialmente dantildeinas como la RNAsa o la
fosfatasa alcalina que quedan atapadas en el espacio periplasmaacutetico Por tal hecho se
considera al periplasma como el precursor evolutivo de los lisosomas de las ceacutelulas
eucariotas (80) Este espacio periplasmaacutetico de entre 12-15 nm se compone de una
solucioacuten acuosa de oligosacaacuteridos iones y un abundante nuacutemero de proteiacutenas entre las
Introduccioacuten
30
que podemos encontrar enzimas hidroliacuteticas que participan en la degradacioacuten inicial de
las moleacuteculas de los nutrientes proteiacutenas de unioacuten implicadas en el proceso de
transporte de sustratos y quimiorreceptores responsables de la respuesta
quimiotaacutectica (28)
En las bacterias Gram negativas la mayoriacutea de las proteiacutenas cuyo destino es el
periplasma o la membrana externa se sintetizan en el citoplasma y lo hacen como
precursores con una sentildeal N-terminal escindible exportaacutendose a su destino final
Aunque existen varias formas de transporte hacia el espacio periplaacutesmico la mayoriacutea
de las proteiacutenas precursoras se trasladan en estados no estructurados a traveacutes de un
canal de membrana interno formado por el complejo de membrana heterotrimeacuterica
SecYEG Despueacutes de la traslocacioacuten al periplasma y la divisioacuten de la secuencia sentildeal se
clasifican a traveacutes de diferentes viacuteas de plegamiento Si bien de manera general se cree
que la localizacioacuten periplaacutesmica es el destino predeterminado de las proteiacutenas con
secuencia sentildeal escindible los intermediarios plegables de proteiacutenas de la membrana
externa deben transitar a traveacutes del periplasma en un estado conformacional
compatible con su insercioacuten en la bicapa lipiacutedica (81) En el periplasma se localizan maacutes
de 150 proteiacutenas diferentes (82)
Como ya se ha mencionado con anterioridad el periplasma estaacute separado del
medio extracelular solo por la membrana externa porosa la cual permite la entrada de
cualquier soluto por debajo de sim600 Da debido a esto el periplasma es maacutes sensible a
los cambios que se producen en el entorno externo que el citoplasma Las proteiacutenas
Figura 5 Micrografiacutea electroacutenica
de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 en la que se aparece el espacio periplaacutesmico visible (82)
Introduccioacuten
31
periplaacutesmicas por tanto deben poder hacer frente a los diferentes cambios extremos
que se produzcan en el medio ambiente por lo que estas proteiacutenas son a menudo
altamente estables lo que las hace resistentes al despliegue y la agregacioacuten (81)
El periplasma juega un papel crucial en el desarrollo de la respiracioacuten celular de
las bacterias gram-negativas ya que es en este espacio donde van a parar los protones
como consecuencia de la transferencia de electrones entre moleacuteculas reductoras y
oxidantes en la cadena de transporte electroacutenico asociada a la membrana plasmaacutetica
Este hecho genera un gradiente de pH y un potencial electroquiacutemico a traveacutes de eacutesta
en el que la parte interna el citoplasma se encuentra cargada negativamente y posee
pH alcalino mientras que la parte externa el periplasma estaacute cargada positivamente y
tiene pH aacutecido Este potencial electroquiacutemico provoca un estado energizado de la
membrana que se expresa como fuerza protoacuten-motriz (28) Este gradiente de protones
se disipa mediante su vuelta al citoplasma a traveacutes de la enzima ATP sintasa que
cataliza la formacioacuten de ATP En su conjunto este proceso se denomina fosforilacioacuten
oxidativa En la respiracioacuten anaerobia la fuerza motriz de protones se genera por la
transferencia de electrones a sustratos periplaacutesmicos (nitritos oacutexido niacutetrico dimetil
sulfoacutexido y otros) que actuacutean como aceptores finales de electrones En la respiracioacuten
aeroacutebica la fuerza motriz de protones se genera por transferencias electroacutenicas desde
sustratos periplaacutesmicos (iones de hierro nitritos y otros) a la moleacutecula de oxiacutegeno (82)
En el espacio periplaacutesmico radica un nuacutemero insospechado de procesos
metaboacutelicos y reguladores algunos de extraordinaria importancia para el equilibrio de
los gases en la biosfera o para las interconversiones de los diferentes componentes
carbonados nitrogenados azufrados o metaacutelicos de los grandes ciclos
biogeoquiacutemicos Estas rutas bioquiacutemicas estaacuten catalizadas por proteiacutenas que se
sintetizan en el citoplasma y se insertan en la membrana plasmaacutetica o exportan al
periplasma a traveacutes de eacutesta (82)
Otra de las funciones que se pueden atribuir al periplasma bacteriano en la de
transporte de metabolitos desde el exterior hasta el citoplasma asiacute nutrientes
orgaacutenicos (azuacutecares aminoaacutecidoshellip) iones o sentildeales quiacutemicas externas se unen a
proteiacutenas periplaacutesmicas que facilitan su transporte hasta el citoplasma en muchos
casos este transporte de nutrientes estaacute impulsado por la hidroacutelisis de ATP (82)
Introduccioacuten
32
6 EL AacuteCIDO MAacuteLICO
En 1785 el quiacutemico Scheele aisloacute un aacutecido de manzanas inmaduras al que
denominoacute aacutecido maacutelico derivado de la palabra latina malum que significa manzana
Tambieacuten lo producen las uvas y el ruibarbo Los estudios estructurales demostraron que
se trata del aacutecido L (-) hidrosucciacutenico En 1817 Braconnet y Vauquelin de manera
independiente llegaron al descubrimiento de los aacutecidos maleico y fumaacuterico que se
producen como consecuencia de la destilacioacuten en seco del aacutecido maacutelico (83) La
implicacioacuten del aacutecido maacutelico en el ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (TCA) fue
descubierta en 1937 por Krebs (84)
El aacutecido maacutelico es un aacutecido dicarboxiacutelico de cuatro carbonos que contiene un
carbono asimeacutetrico y por lo tanto presenta dos isoacutemeros D - (-) Y L - (+) El aacutecido L-maacutelico
es el isoacutemero natural que se encuentra en muchas frutas y verduras algunos
microorganismos y artroacutepodos tambieacuten lo producen y es utilizado como fuente de
carbono por una gran variedad de microorganismos (8586) El aacutecido maacutelico se utiliza
como acidulante principalmente en bebidas dulces y otros alimentos Las aplicaciones
no alimentarias para el aacutecido maacutelico incluyen la limpieza y el acabado de metales el
acabado de textiles el revestimiento electroliacutetico productos farmaceacuteuticos y pinturas
(85) En la actualidad el aacutecido maacutelico se produce a traveacutes de siacutentesis quiacutemica y estaacute
disponible como la mezcla raceacutemica que es la que se utiliza como aditivo en la industria
alimentaria aunque la forma D- del aacutecido maacutelico presenta problemas de seguridad para
el consumo humano (87)
En el Codex Alimentarius (88) se definen los usos y cantidades permitidas del
aditivo E-296 (DL-aacutecido maacutelico) utilizado como acidulante en infinidad de productos
en Quantum Satis (teacutermino latino que significa ldquola cantidad adecuadardquo) Este aditivo en
grandes dosis puede provocar problemas digestivos en lactantes y nintildeos ya que eacutestos
carecen de la capacidad de metabolizar grandes cantidades de aacutecido maacutelico por lo que
la legislacioacuten espantildeola regula a traveacutes del Real Decreto 1422002 de 1 de febrero la
lista de aditivos colorantes y edulcorantes para su uso en la elaboracioacuten de productos
alimenticios asiacute como sus condiciones de utilizacioacuten y que por ejemplo establece que
Introduccioacuten
33
en alimentos infantiles la adicioacuten de aacutecido maacutelico soacutelo se permita su uso para ajustar el
pH
El L-malato es un isoacutemero natural que es utilizado como fuente de carbono por
numerosos microorganismos Existen enzimas que catalizan la transformacioacuten del L-
malato en tres compuestos diferentes oxalacetato fumarato y piruvato Algunas de
estas enzimas son la malato deshidrogenasa (L-malatoNAD+ oxidorreductasa EC
11137) la fumarasa (L-malatohidroliasa EC 4212) pertenecientes al TCA y la
enzima maacutelica (L-malatoNADP+ oxidorreductasa EC 11182) Cuando las bacterias
crecen en condiciones de aerobiosis y en oscuridad el ciclo de Krebs (TCA) funciona en
direccioacuten fumarato ndash L-malato ndash oxalacetato (en sentido horario) mientras que en
condiciones reductoras lo puede hacer al contrario (sentido antihorario) Por otro lado
las enzimas maacutelicas de las que hay descritas numerosas actividades dependiendo de la
especificidad de sustrato constantes cineacuteticas actividad oxalacetato-
descarboxilacioacuten distribucioacuten localizacioacuten intracelular y funcioacuten bioloacutegica catalizan la
descarboxilacioacuten oxidativa de L-malato a piruvato (86)
Otra forma de transformacioacuten de malato a oxalacetato en algunas bacterias es
mediante la actividad MQO (malatoquinona oxidorreductasa) como alternativa a la
malato deshidrogenada dependiente de NAD+ (EC 11137) Eacutesta enzima parece
especialmente importante cuando la fuente de carbono principal es el etanol o el
acetato (89) P pseudoalcaligenes CECT 5344 carece de Malato deshidrogenasa y la
MQO seriacutea esencial para el funcionamiento del ciclo de Krebs Esta enzima tambieacuten se
ha relacionado con la asimilacioacuten del cianuro por parte de esta bacteria (90) en
combinacioacuten con una oxidasa terminal insensible a cianuro (Cio) tambieacuten llamada
citocromo bd oxidasa (54) El oxalacetato formado reaccionariacutea espontaacuteneamente con
el cianuro libre presente formando cianhidrinas que seriacutean metabolizadas mediante
una actividad nitrilasa que genera amonio el cual seriacutea utilizado como fuente de
nitroacutegeno para el crecimiento bacteriano (90) Cuando P pseudoalcaligenes CECT 5344
utiliza el cianuro como uacutenica fuente de carbono tanto el acetato como el DL-malato se
presentan como fuentes de carbono asequibles (44)
Se han mostrado las distintas rutas de asimilacioacuten del L-malato pero iquestcoacutemo se
metaboliza el D-malato Se ha mencionado con anterioridad que el D-malato es un
Introduccioacuten
34
isoacutemero artificial pero tambieacuten puede tener un origen natural aunque es minoritario
En la deacutecada de los 70 del SXX se describioacute una especie de Pseudomonas capaz de
transformar el aacutecido gentiacutesico derivado del m-cresol a piruvato y D-malato este uacuteltimo
seriacutea usado como sustrato ya que esta especie presenta una enzima D-maacutelica
dependiente de NAD+ (91) El D-malato se puede originar de manera endoacutegena a partir
del gentisato el maleato o el oxalacetato (92) Resulta interesante el hecho de que
varios microorganismos son capaces de utilizar el D-malato como fuente de carbono y
de energiacutea por ejemplo en E coli existe una enzima D-maacutelica dependiente de NAD+ y
Mn2+ (D- malato deshidrogenasa EC 11183) inducida por D-malato que cataliza la
descarboxilacioacuten oxidativa de este compuesto a piruvato En Rhodobacter capsulatus
E1F1 se ha hallado una actividad racemasa dependiente de Mn2+que acoplada a una
actividad malato deshidrogenasa (EC 11137) o a una actividad fumarasa (EC 4212)
incorpora el D-malato al Ciclo de Krebs (86) (figura 6)
Durante estudios de la actividad MQO anteriormente mencionada en P
pseudoalcaligenes CECT 5344 se observoacute una actividad D-malato oxidasa (DMO) no
dependiente de NAD(P) cuyo sustrato es el D-malato y el producto de esta reaccioacuten
seriacutea oxalacetato (figura 6) (93)
Figura 6 Posibles rutas para el metabolismo de D- y L-malato Esquema tomado de (86) La flecha punteada es la posible ruta metaboacutelica del D-malato catalizada por la actividad D-Malato oxidasa
Introduccioacuten
35
La importancia de este hallazgo radica en que existen pocas referencias para una
actividad D-malato independiente de cofactores nicotiacutenicos Pudiera ser que esta
actividad DMO dependa de otros cofactores como PQQ (Pirroquinoliacuten quinolona) o
FAD (Flaviacuten Adeniacuten Dinucleoacutetido) como es el caso algunas deshidrogenasas
fermentativas dependientes de PQQ o FAD situadas en el periplasma (figura 7) lo que
ademaacutes podriacutea ser clave en la localizacioacuten intracelular de la actividad DMO (94)
Recientemente se ha descrito una enzima D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa
(D2HGDH) dependiente de FAD que convierte el D-2-hidroxiglutarato (D-2-HG) en 2-
cetoglutarato (2-KG) y que junto con la D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa (SerA)
parece estar implicada en la siacutentesis de L-serina en bacterias (95) En ciertos desoacuterdenes
neurometaboacutelicos raros se acumulan las formas D y L de 2-hidroxiglutarato (2HG) El D-
2HG ademaacutes se encuentra en altos niveles en muchos tipos de caacutencer que se producen
en humanos De hecho en ceacutelulas tumorales de leucemia la acumulacioacuten de este
oncometabolito produce la inhibicioacuten de la enzima α-cetoglutarato deshidrogenasa
que es uno de los puntos de control del metabolismo celular (9697)
El D-malato es un aacutecido dicarboxiacutelico con una estructura muy similar al D-2-
hidroxiglutarato (D-2-HG) (tiene cuatro carbonos en lugar de cinco) Como ya se ha
descrito con anterioridad el geacutenero Pseudomonas es muy amplio y dentro de eacuteste
existen varias especies con la capacidad de utilizar D-malato como fuente de carbono y
energiacutea sin embargo la mayoriacutea de Pseudomonas presentan una ausencia de
homoacutelogos de la D-malato deshidrogenasa de E coli Estudios realizados en
Pseudomonas stutzeri A1501 indican que la enzima D2HGDH presenta actividad de
Figura 7 Sistemas de oxidasas periplaacutesmicas independientes de NAD+ Las diferentes deshidrogenasas (marcadas en la figura como PQQ o FAD seguacuten sea el caso) donan los electrones procedentes de la oxidacioacuten del sustrato pertinente a la ubiquinona (UQ) que a su vez los transfiere a la ubiquinol oxidasa terminal La oxidasa terminal genera un gradiente electroquiacutemico de protones permitiendo que el organismo adquiera bioenergiacutea a traveacutes de la oxidacioacuten del sustrato (94)
Introduccioacuten
36
oxidacioacuten del D-malato De hecho esta enzima tiene un doble papel en la siacutentesis de L-
serina y en la utilizacioacuten de D-malato La reaccioacuten con la que se inicia la biosiacutentesis de L-
serina es la transformacioacuten del D-3-fosfoglicerato (D-3-PG) a 3-fosfohidroxipiruvato (3-
PHP) catalizada por la SerA esta enzima ademaacutes reduce el oxalacetato a D-malato
(figura 8A) aunque con baja eficiencia La D2HGDH junto con el grupo prosteacutetico FAD
se ocupa de la oxidacioacuten del D-malato a oxalacetato (OAA) (figura 8) En este mismo
estudio de Guo y colaboradores se ha descubierto que la siacutentesis de la proteiacutena
D2HGDH se induce por D-2-HG o por D-malato y que una flavoproteiacutena soluble
transporta los electrones procedentes de la oxidacioacuten del D-malato a la cadena de
transporte electroacutenico (92)
(A) El acoplamiento entre D2HGDH y SerA hace que las interconversiones producidas entre D-2-HG 2-KG D-MT y oxaloacetato (OAA) ayuden a superar la barrera termodinaacutemica de la deshidrogenacioacuten de D-3-PG facilitando asiacute el proceso biosinteacutetico L-serina (B) D2HGDH participa en la utilizacioacuten de D-MT extracelular (sombra naranja) y en la regeneracioacuten de OAA y 2-KG en el ciclo de Krebs (CIT citrato ICIT isocitrato SUC succinato MAL L-malato) in vivo (sombra verde y sombra azul) durante la siacutentesis de L-serina (92)
Figura 8 La D2HGDH juega un papel dual en la biosiacutentesis de l-serina y en la utilizacioacuten de d-malato en P stutzeri
Introduccioacuten
37
Estudios filogeneacuteticos han demostrado que la proteiacutena D2HGDH de varios
grupos bacterianos estaacute relacionada con las denominadas D-lactato deshidrogenasas
independientes de NAD (D-iLDH) La mayoriacutea de las D-iLDH microbianas pertenecen a
la familia tipo 4 de unioacuten a FAD y se clasifican en 3 grupos D-iLDH quinona dependiente
(Q D-iLDH) D-iLDH citocromo c dependiente (cyt D-iLDH) y Fe-S D-iLDH aunque todas
ellas catalizan la oxidacioacuten del D-lactato a piruvato diferenciaacutendose en el aceptor de
electrones por el que tienen preferencia (98) El D-lactato se puede producir por
procesos fermentativos (fermentacioacuten laacutectica) aunque tambieacuten se origina como
resultado del metabolismo del metilglioxal de muchos organismos (99100) para los
que la capacidad de utilizar el D-lactato como fuente de carbono podriacutea ser una ventaja
En Pseudomonas putida KT2440 la enzima mayoritaria con actividad D-lactato oxidasa
es la Fe-S D-iLDH (NP_746845) la cual se ha utilizado para dilucidar los procesos de
utilizacioacuten del D-lactato Esta enzima presenta dos partes un dominio deshidrogenasa
que contiene FAD y un dominio Fe-S oxidorreductasa de los estudios realizados se ha
determinado que el dominio FAD deshidrogenasa incrementa su eficiencia cataliacutetica
cuando se utiliza citocromo c como aceptor de electrones y pierde la capacidad de usar
el coenzima Q10 mientras que el dominio Fe-S oxidorreductasa es un componente
esencial en la transferencia de electrones hacia la quinona y ayuda a la proteiacutena a
asociarse a la membrana celular La enzima ademaacutes de por el D-lactato tiene afinidad
por los sustratos D-2-hidroxibutirato y D-glicerato (98)
En plantas el D-lactato como producto de la eliminacioacuten del metilglioxal (MGO)
por el sistema glioxilasa se metaboliza por la D-lactato deshidrogenasa (D-LDH) que al
menos en Arabidopsis thaliana estaacute codificada por un uacutenico gen (At5g06580) pero es
activa como diacutemero actuando de manera especiacutefica sobre el D-lactato Los anaacutelisis in
silico de esta proteiacutena predicen una sentildeal de direccionamiento en el extremo amino
terminal compuesto por un motivo TOM20 y una heacutelice anfipaacutetica lo que implicariacutea
una localizacioacuten mitocondrial seguida de un intervalo de heacutelice transmembrana
Ademaacutes en los ensayos enzimaacuteticos se observa que los electrones producidos por la
oxidacioacuten del D-lactato a piruvato se ceden a la cadena de transporte a traveacutes del
citocromo c moleacutecula soluble del espacio intermembranal lo que sugiere
considerando la presencia del peacuteptido sentildeal y la secuencia hidrofoacutebica del extremo
Introduccioacuten
38
amino terminal una localizacioacuten para la D-LDH en este espacio o anclado a la membrana
interna pero de cara al espacio entre membranas de la mitocondria (101)
7 BIOSENSORES
En la actualidad los biosensores son herramientas imprescindibles tanto en el
diagnoacutestico meacutedico como en el seguimiento del tratamiento y progresioacuten de la
enfermedad pero ademaacutes abarcan otras aacutereas tales como el control ambiental el
control de los alimentos el descubrimiento de faacutermacos la investigacioacuten forense y la
investigacioacuten biomeacutedica Se puede utilizar una amplia gama de teacutecnicas para el
desarrollo de biosensores (102)
Un biosensor se define como un dispositivo analiacutetico compacto que incorpora
un elemento de deteccioacuten bioloacutegico aacutecido nucleico enzima anticuerpo receptor
tejido ceacutelula o biomimeacutetico Poliacutemeros de Impresioacuten Molecular (PIMs) aptaacutemeros
Aacutecidos Nucleicos Peptiacutedicos (PNAs) asociado a un sistema de transduccioacuten que permite
procesar la sentildeal debida a la unioacuten entre el receptor y el analito (figura 9) (103)
Un biosensor se basa en la unioacuten especiacutefica del analito de intereacutes al elemento de
biorreconocimiento complementario inmovilizado en un medio de soporte adecuado
Como resultado de esta unioacuten se produce un cambio en una o maacutes propiedades fiacutesico-
quiacutemicas (cambio de pH transferencia de electrones cambio de masa transferencia de
Figura 9 Mecanismo de funcionamiento de un biosensor Incorporando los diferentes componentes que pueden integrarlo Imagen desarrollada a partir del texto de (104)
Introduccioacuten
39
calor captacioacuten o liberacioacuten de gases o iones especiacuteficos) que se detectan y pueden ser
medidos por el transductor Normalmente esta sentildeal se traduce en una sentildeal eleacutectrica
cuya magnitud o frecuencia es proporcional a la concentracioacuten del analito de estudio
(103)
En las muacuteltiples aplicaciones de los biosensores las caracteriacutesticas comunes que
deben poseer entre otras son su especificidad alta sensibilidad capacidad de
respuesta que conduce a un corto tiempo de anaacutelisis su capacidad de inclusioacuten en
sistemas integrados facilidad de automatizacioacuten capacidad de trabajar en tiempo real
su versatilidad y bajo coste (104)
El primer biosensor como tal fue desarrollado por Clark y Lyons en 1962
quienes basaacutendose en el electrodo de oxiacutegeno incorporaron la enzima glucosa oxidasa
atrapada en una membrana semipermeable en la proximidad del electrodo
observando que el descenso de oxiacutegeno era proporcional a la concentracioacuten de glucosa
estos autores acuntildearon el teacutermino ldquoelectrodo enzimaacuteticordquo y en 1975 fue comercializado
por la compantildeiacutea Yellow Springs Instrument (Ohyo) como analizador de glucosa basado
en la deteccioacuten amperomeacutetrica del peroacutexido de hidroacutegeno Ese mismo antildeo Divis
publicoacute la determinacioacuten de etanol a traveacutes de biosensores realizados con
microorganismos (104) Desde entonces el desarrollo de los biosensores aplicados a
infinidad de aacutembitos cientiacutefico-teacutecnicos no ha dejado de crecer
Ademaacutes de los biosensores de glucosa cuyo uso estaacute generalizado no solo en
el diagnoacutestico de la enfermedad diabetes mellitus sino para el control preciso de los
niveles de glucosa en sangre de los pacientes que padecen esta enfermedad en el
campo de la medicina se incluyen otras aplicaciones tales como la deteccioacuten de
enfermedades infecciosas identificacioacuten de paacutetogenos y su suscetibilidad microbiana
deteccioacuten de problemas cardiacos deteccioacuten de multiples mascadores
tumoraleshellip(105)
En el campo agroalimentario el intereacutes de los biosensores se centra en el anaacutelisis
de la composicioacuten de los alimentos en la seguridad alimentaria (deteccioacuten de
compuestos contaminantes aleacutergenos antinutrientes toxinas y microrganismos
patoacutegenos) y en el control on line de los procesos fermentativos (106)
Introduccioacuten
40
En cuanto a la seguridad alimentaria la incorporacioacuten de aditivos a los
productos de consumo humano se encuentra fuertemente legislada a nivel europeo y
estatal Su deteccioacuten y cuantificacioacuten son muy importantes para evitar malas praacutecticas
de fabricacioacuten usos fraudulentos peacuterdida de las caracteriacutesticas organoleacutepticas del
alimento y en definitiva prevenir problemas de salud en la poblacioacuten En la actualidad
existen pocas referencias de biosensores destinados al anaacutelisis de aditivos y otras
sustancias que afecten a la calidad alimentaria aunque existen en el mercado
dispositivos para el anaacutelisis de edulcorantes artificiales (aspartamo y sorbitol) de
conservantes (aacutecido benzoico y sulfitos) y de la presencia de otros componentes
presentes en los alimentos como el L-malato la glucosa o la lactosa (107)
Aunque existen diversas estrategias la utilizacioacuten de enzimas como elementos
bioloacutegicos de reconocimiento molecular resulta muy interesante ya que proporcionan
una elevada selectividad respuesta raacutepida y ldquoa priorirdquo simplicidad en la construccioacuten
de los dispositivos
En los seres vivos las enzimas son proteiacutenas que catalizan reacciones quiacutemicas
en las cuales se unen de manera especiacutefica con su sustrato en el denominado centro
activo Las enzimas a menudo requieren de la presencia de cofactores que o bien no
manifiestan cambios o bien actuacutean como segundo sustrato modificaacutendose despueacutes
del ciclo cataliacutetico Una vez formados los productos la enzima se recupera pudiendo
comenzar un nuevo ciclo La actividad enzimaacutetica estaacute controlada por la presencia de
cofactores por la temperatura pH y fuerza ioacutenica del medio en el que se produce la
cataacutelisis El factor limitante para determinar el tiempo de vida de un biosensor
enzimaacutetico es la estabilidad de las enzimas Las maacutes utilizadas para tal fin son de la
familia de las oacutexido-reductasas que son enzimas muy estables que catalizan reacciones
de oacutexido reduccioacuten y pueden acoplarse a distintos sistemas de transduccioacuten mediante
diferentes teacutecnicas de inmovilizacioacuten (104)
II OBJETIVOS
Objetivos
43
O B J E T I V O S
El objeto de estudio en esta Tesis es Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
una bacteria muy interesante desde el punto de vista biotecnoloacutegico por su capacidad
de asimilar cianuro
Los objetivos generales planteados en esta Tesis son
1 Conocer la ruta de asimilacioacuten del D-malato en Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344 y su posible relacioacuten con el metabolismo del
cianuro Este objetivo se puede dividir en los siguientes sub-objetivos
concretos
a) Puesta a punto de un meacutetodo colorimeacutetrico para la determinacioacuten de
la actividad D-Malato oxidasa
b) Caracterizacioacuten y optimizacioacuten de la actividad D-Malato oxidasa
c) Identificacioacuten y clonacioacuten de gen que codifica esta D-Malato oxidasa
2 Estudiar los sistemas de defensa contra DNA exoacutegeno de Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344 (sistemas de modificacioacuten-restriccioacuten) con el
propoacutesito de construir variantes maacutes susceptibles de manipulacioacuten geneacutetica
Los sub-objetivos concretos de este apartado son los siguientes
a) Construccioacuten de cepas en las que se ha eliminado cada uno de los
sistemas de restriccioacuten-metilacioacuten
b) Estudio de la capacidad de las cepas resultantes del apartado
anterior de aceptar y mantener plaacutesmidos promiscuos que replican
en otras Pseudomonas
III MATERIAL Y MEacuteTODOS
Material y Meacutetodos
47
1 MATERIAL BIOLOacuteGICO
El objeto de estudio de este trabajo es el microorganismo Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344 (24) aunque en el laboratorio se ha utilizado la cepa
denominada R1 que se trata de un mutante espontaacuteneo resistente a rifampicina (50
μgml) y que favorece su seleccioacuten
A continuacioacuten en la tabla 2 se enumeran y describen las cepas microbianas
utilizadas a lo largo de este trabajo
Tabla 2 Microorganismos utilizados en este trabajo
CEPA DESCRIPCIOacuteN REFERENCIA
PSEUDOMONAS PSEUDOALCALIGENES CECT 5344
CECT 5344 R1 Mutante espontaacuteneo de P pseudoalcaligenes CECT 5344 resistente a rifampicina (Rfr)
(24)
CECT 5344 R1∆MRRGMR (R1∆MRR)
Mutante de la cepa 5344 R1 obtenido por insercioacuten cromosoacutemica en el gen mrr Rfr Gmr
Este trabajo
CECT 5344 R1 ∆HSDR-MCRCBKMR (R1∆HSDR)
Mutante de la cepa 5344 R1 obtenido por insercioacuten cromosoacutemica en los genes hsdR mcrB y mcrC Rfr Kmr
Este trabajo
PSEUDOMONAS PUTIDA
KT2440 Saproacutefita Muy versaacutetil y uacutetil en la clonacioacuten de DNA foraacuteneo
(108)
KT2440 ∆5154 Mutante de KT2440 Kmr (109)
KT2442 Derivado de KT2440 Rfr (110)
ESCHERICHIA COLI
XL1 BLUE MRFacute(XL1B) ∆ (mcra) 183 ∆ (mcrB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 gyrA96 relA1 lac [FacuteproAB lacIqZ∆M15 tn10 (Tetr)]
(111)
DH5Α ∆lacZ ∆ M15 ∆ (lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rK-mK+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1
(112)
GM48 Fndash thr leu thi lacY galK galT ara fhuA tsx dam dcm
glnV44
(113)
Material y Meacutetodos
48
2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
21 MEDIOS LIacuteQUIDOS DE CULTIVO
Todos los medios fueron sometidos a esterilizacioacuten teacutermica con vapor de agua a
121 C de temperatura y a una presioacuten de una atmoacutesfera relativa durante 20 minutos El
equipo utilizado fue un autoclave vertical de manejo manual Una vez sometidos a este
proceso los medios se mantuvieron a temperatura ambiente hasta su uso posterior
211 Medio Luria-Bertani (LB o medio rico)
El medio LB (111) fue ajustado a pH 85 para el crecimiento de P
pseudoalcaligenes y a pH 7 5 para el crecimiento de P putida y E coli
Los ajustes de pH se realizaron con una solucioacuten de NaOH 10N
Su composicioacuten es la siguiente
Bactotriptona 10 g Extracto de levadura 5 g Cloruro soacutedico 5 g Agua hasta 1 litro
212 Medio M9
Como medio miacutenimo definido se utilizoacute este medio sobre todo para estudiar el
efecto ejercido de distintas fuentes de carbono o de nitroacutegeno en algunos aspectos del
metabolismo de las cepas bacterianas La composicioacuten de este medio es la siguiente
Na2HPO4 6 g
KH2PO4 3 g
NaCl 05 g
NaCH3CO2 41 g
Solucioacuten trazas 2 ml
Agua hasta 1 litro
Toda la mezcla anterior se esterilizoacute en autoclave excepto las trazas que se
esterilizaron por filtracioacuten y conteniacutean
MgCl2 1075 g
Material y Meacutetodos
49
CaCO3 2 g
MgSO4middot7H2O 616 g
FeSO4middot7H2O 475 g
ZnSO4middot7H2O 144 g
MnSO4middot7H2O 112 g
CuSO4middot5H2O 025 g
CoSO4middot7H2O 028 g
H3BO3 006 g
HCl 12N 513 ml
Agua hasta 1 litro
Esta solucioacuten primero se esterilizoacute en el autoclave pero sin incluir los 616 g de
MgSO4middot7H2O y antildeadiendo solo 45 g de FeSO4middot7H2O El MgSO4middot7H2O y el resto de
FeSO4middot7H2O se prepararon aparte esterilizaacutendose por filtracioacuten (filtros esteacuteriles con un
diaacutemetro de poro de 022 μm de la marca MILLIPORE) una vez hecho esto se
adicionaron a la solucioacuten anterior y se guardoacute en una botella aacutembar en condiciones de
esterilidad para proteger la solucioacuten trazas de la luz solar
Dependiendo de las necesidades de cada experimento se utilizaron distintas
fuentes de carbono como DL-malato D-malato L-malato Acetato D-α
Hidroxiglutarato Oxalacetato o α-cetoglutarato siempre a una concentracioacuten final de
4 gl Si no se indica otra cosa la fuente de nitroacutegeno utilizada fue el amonio a una
concentracioacuten final de 5 mM Del mismo modo tambieacuten se modificaron las fuentes de
nitroacutegeno utilizando concentraciones finales de 1 gl para amonio y nitrato y 1 mM
para el cianuro manteniendo fija la fuente de carbono a una concentracioacuten final de 4gl
213 Medio SOB
A 950 ml de agua destilada se antildeadioacute
Bactotriptona 5 g
Extracto de levadura 05 g
NaCl 20 g
Material y Meacutetodos
50
Se agitoacute hasta que los solutos se disolvieron posteriormente se agregaron
10 ml de una solucioacuten de KCl 250 mM (Esta solucioacuten se hizo disolviendo 186 g de KCl
en 100 ml de agua destilada) Se ajustoacute el pH a 70 con NaOH 5 N (aproximadamente
02 ml) Por uacuteltimo se aforoacute el volumen de la solucioacuten a 1 litro Se sometioacute a
esterilizacioacuten en el autoclave Justo antes de utilizar este medio se antildeadieron 5 ml de
solucioacuten esteacuteril de MgCl2 2 mM (esta solucioacuten se hizo disolviendo 19 g de MgCl2 en 90
ml de agua destilada se ajustoacute el volumen de la solucioacuten a 100 ml y se esterilizoacute
mediante el uso del autoclave)
214 Medio SOC
Este medio se utilizoacute para la recuperacioacuten de las ceacutelulas electrocompetentes
Este medio es ideacutentico al medio SOB salvo que contiene glucosa 20 mM Despueacutes de
haber autoclavado el medio SOB se dejoacute enfriar a 60degC o menos y se antildeadieron 20 ml
de Glucosa 1 M (esta solucioacuten se obtuvo al disolver 18 g de glucosa en 90 ml de agua
destilada) una vez que toda la glucosa estuvo disuelta se ajustoacute el volumen con agua
destilada a 100 ml y se esterilizoacute pasando la solucioacuten a traveacutes de un filtro de 022 μm de
tamantildeo de poro
215 Medio GYT
El medio GYT (114) se utilizoacute para disgregar las ceacutelulas electrocompetentes y
disminuir la conductividad de las mismas Su composicioacuten es la siguiente
Glicerol 10 (vv)
Extracto de levadura 0125 (pv)
Bactotriptona 025 (pv)
Una vez esterilizado el medio por filtracioacuten (filtro de 022 μm de diaacutemetro de
poro) se almacenoacute a 4degC hasta su utilizacioacuten
22 MEDIOS DE CULTIVO SOacuteLIDOS CON AGAR
Se prepararon los medios de acuerdo con las directrices dadas anteriormente y
justo antes de introducirlos en el autoclave se incorporoacute el agar bacterioloacutegico en
proporcioacuten 15 gl Al retirar los medios con agar del autoclave se agitaron suavemente
Material y Meacutetodos
51
para distribuir de manera uniforme el agar Los medios se dejaron enfriar a 50deg-60degC
antes de antildeadir sustancias termolaacutebiles (como por ejemplo antibioacuteticos) Las placas se
rellenaron vertiendo directamente desde el matraz un volumen aproximado de 30-35
ml de medio para placas de 90 mm de diaacutemetro Cuando el medio solidificoacute las placas
mantuvieron invertidas a 4degC hasta su uso
Cuando fue necesario se antildeadieron los reactivos 5-bromo-4-cloro-3indolil-β-D-
galactopiranoacutesido (X-Gal) a una concentracioacuten final de 02 mM e isopropil-1-tio-β-
galactopiranoacutesido (IPTG) a una concentracioacuten final de 05 mM
23 MEDIOS SELECTIVOS
231 Antibioacuteticos
Como forma de seleccionar las distintas cepas bacterianas se utilizoacute la
resistencia frente a diferentes antibioacuteticos Eacutestos se prepararon a una concentracioacuten mil
veces mayor a la de su utilizacioacuten y se esterilizaron por filtracioacuten (filtro de 022 μm de
tamantildeo de poro) Se incorporaron a los medios de cultivo y siempre seguacuten las
necesidades especiacuteficas cuando los medios estaban atemperados (50 degC) Los
antibioacuteticos las concentraciones y disolventes empleados se resumen en la tabla 3
Tabla 3 Antibioacuteticos empleados como medios selectivos
ANTIBIOacuteTICO SOLUCIOacuteN
MADRE (MGML)
CONCENTRACIOacuteN FINAL
(ΜGML) DISOLVENTE
AMPICILINA (AP) 100 100 Agua
GENTAMICINA (GM) 10 10 Agua
KANAMICINA (KM) 50 50 Agua
RIFAMPICINA (RF) 40 40 DMSO
TETRACICLINA (TC) 12 12 Etanol 50
Material y meacutetodos
52
24 CONDICIONES DE CULTIVO
Las ceacutelulas de E coli y Pseudomonas spp se incubaron a 37degC y 30degC
respectivamente en un incubador agitador orbital (Infors) a 200 rpm El crecimiento de
las bacterias en medio liacutequido fue medido por turbidimetriacutea a 600 nm (DO 600 nm)
utilizando para ello un espectrofotoacutemetro Helios Epsilon (Thermo Spectronics)
25 PUREZA Y CONSERVACIOacuteN DE LOS CULTIVOS
Para conservar las bacterias a largo plazo se almacenaron en aliacutecuotas de 1 ml
de medio LB con 20 (vv) de glicerol esteacuteril a -80degC
Para recuperarlas se tomoacute una pequentildea cantidad de las cepas conservadas en
glicerol 20 (vv) con un asa de platino despueacutes de esterilizarla al rojo vivo y se realizoacute
una siembra por estriacuteas en una placa de Petri con el medio selectivo pertinente estas
placas se mantuvieron a 4degC durante aproximadamente un mes
3 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ACELULARES
31 RECOGIDA DE CEacuteLULAS
Las ceacutelulas (500 ml de cultivo) de P pseudoalcaligenes y P putida se recogieron
por centrifugacioacuten a 9632 x g (10000 rpm) las ceacutelulas de E coli sin embargo fueron
recogidas por centrifugacioacuten a 2000 x g (4557 rpm) Aunque en todos los casos las
centrifugaciones se realizaron durante 15 minutos a 4degC en una centriacutefuga Avanti TM J-
25 Beckman Coulter con un rotor JA-14 El sobrenadante se desechoacute y el precipitado se
disgregoacute en tampoacuten TrisHCl 50 mM 10 glicerol pH 8 este proceso se repitioacute varias
veces para eliminar los posibles restos del medio de cultivo Finalmente las ceacutelulas se
homogeneizaron en 35 ml de Tampoacuten TrisHCl pH 8 10 glicerol e inhibidor de
proteasas (Roche) Los extractos se mantuvieron a -20degC para su conservacioacuten y
posterior utilizacioacuten
Material y Meacutetodos
53
32 ROTURA DE CEacuteLULAS
Las ceacutelulas recogidas en el apartado anterior se sometieron a rotura por
diferencia de presioacuten mediante la utilizacioacuten de la Prensa de French (Thermo
Spectronic) con una presioacuten aproximada de 68 atm (mini-cell de Thermo Spectronic)
El resultado se centrifugoacute durante 15 minutos a 4degC a 12857 x g (10000 rpm) en
centrifuga Eppendorf 5810 (rotor F-34-6-38) para eliminar restos celulares y ceacutelulas sin
romper El sobrenadante obtenido se ultracentrifugoacute en la ultracentriacutefuga
OptimaTMTLX de Beckman Coulter rotor TLA 110 a 70131 x g (41000 rpm) durante 1
hora a 4degC El sobrenadante fue denominado extracto libre de ceacutelulas y utilizado en los
distintos ensayos enzimaacuteticos
33 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
El fraccionamiento celular se llevoacute a cabo seguacuten el protocolo de Imperi et al
(115) con modificaciones se recogieron las ceacutelulas a una DO600nmasymp06 (4000 x g 10
minutos a 4degC rotor JA-14 Avanti TM J-25 Beckman Coulter) y se lavaron dos veces con
tampoacuten TrisHCl 30 mM pH 71 150 mM NaCl Posteriormente el precipitado
bacteriano procedente de un litro de cultivo se disgregoacute en 30 ml de TrisHCl 30 mM
pH 8 sacarosa 20 EDTA 4 mM lisozima 05 mgml y PMSF 1 mM y se incuboacute durante
60 minutos en un bantildeo termostaacutetico a 30degC con agitacioacuten suave Pasados dos minutos
desde que se inicioacute la incubacioacuten se antildeadioacute MgCl2 a una concentracioacuten final de 10 mM
Transcurrido el tiempo de incubacioacuten la suspensioacuten fue centrifugada (11000 x g
durante 15 minutos a 4degC) y se recogioacute el sobrenadante (fraccioacuten periplaacutesmica) A esta
fraccioacuten se le antildeadioacute glicerol 10 como meacutetodo de conservacioacuten de las actividades
enzimaacuteticas Por otro lado el precipitado obtenido (esferoplastos) se disgregoacute en 3 ml
de TrisHCl 30 mM pH 8 MgCl2 10 mM y fue sometido a rotura por presioacuten en la prensa
de French bajo las condiciones mencionadas en el apartado anterior Una vez hecho
esto se realizoacute una centrifugacioacuten suave (15 minutos a 4degC a 12857 x g (10000 rpm) en
centrifuga Eppendorf 5810 rotor F-34-6-38) que eliminaron los restos celulares y
ceacutelulas sin romper Seguidamente el sobrenadante obtenido se ultracentrifugoacute en la
ultracentriacutefuga OptimaTMTLX de Beckman Coulter rotor TLA 110 a 70131 x g (41000
rpm) durante 1 hora a 4degC Por uacuteltimo el sobrenadante (fraccioacuten citoplasmaacutetica) se
Material y meacutetodos
54
separoacute con cuidado del precipitado que se homogeneizoacute en 3 ml de Tampoacuten TrisCl 30
mM glicerol 10 constituyendo este uacuteltimo la fraccioacuten de membranas
En algunas ocasiones se utilizoacute el Kit comercial ldquoPeriPrepsTM Periplasting Kitrdquo
de EPICENTRE Biotechnologies realizando los ensayos tal y como indicaba el
protocolo con ciertas modificaciones de ldquoPreparacioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas y
esferoplastos para 1 ml de cultivo bacterianordquo adjunto al kit La fraccioacuten obtenida
correspondiente a los esferoplastos tuvieron el mismo tratamiento detallado en el
paacuterrafo anterior para obtener por separado las fracciones citoplasmaacuteticas y de
membrana
4 DETERMINACIONES ANALIacuteTICAS
La concentracioacuten de la mayoriacutea de los metabolitos se determinoacute
colorimeacutetricamente A partir de rectas de calibrado utilizando concentraciones
conocidas se pudieron confeccionar patrones a traveacutes de los cuales se interpolaron los
valores experimentales
41 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE CIANURO
La concentracioacuten de cianuro se determinoacute espectrofotomeacutetricamente
adaptando el meacutetodo descrito por Luque et al (44)
El meacutetodo colorimeacutetrico tiene como base la reaccioacuten del cianuro libre con la
Cloramina T a pH alcalino (pH=8) eacutesta en contacto con la piridina se convierte en aacutecido
glutacoacutenico que en presencia de aacutecido barbituacuterico se transforma en un compuesto
coloreado susceptible de determinacioacuten colorimeacutetrica a λ=578 nm
El procedimiento es el siguiente a 1 ml de muestra convenientemente diluida
(para una concentracioacuten inicial de 2 mM es necesario diluir aproximadamente unas
250 veces) se antildeadieron 0040 ml de cloramina T 1 (pv) y se incuboacute a temperatura
ambiente durante 5 minutos A continuacioacuten se antildeadieron 0120 ml del denominado
Reactivo B (3 g de aacutecido barbituacuterico 15 ml de piridina 3 ml de HCl y agua destilada hasta
alcanzar 50 ml) Se dejoacute incubando alrededor de 10 minutos tras los cuales se midioacute la
Material y Meacutetodos
55
absorbancia a 578 nm el valor obtenido se interpoloacute en una recta patroacuten realizada con
anterioridad con concentraciones conocidas de KCN
Todas las manipulaciones se realizaron en campana de extraccioacuten de gases
42 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
Para medir la concentracioacuten de proteiacutenas se emplearon los siguientes meacutetodos
421 Meacutetodo de Bradford
Este meacutetodo (116) se basa en la capacidad que presenta el Azul Brillante de
Coomasie G-250 de interaccionar con las proteiacutenas mediante interacciones
hidrofoacutebicas cambiando su maacuteximo de absorcioacuten desde 465 nm hasta 595 nm Debido
a que la respuesta del meacutetodo es la misma para una gran cantidad de proteiacutenas la
cuantificacioacuten se puede llevar a cabo usando cualquier estaacutendar disponible aunque en
este caso se utilizaron concentraciones conocidas de seroalbuacutemina bovina (BSA Bio-
Rad) La interferencia de otros compuestos distintos a las proteiacutenas es miacutenima aunque
este meacutetodo no es adecuado para la determinacioacuten de proteiacutenas de membrana ni en
presencia de detergentes La sensibilidad del meacutetodo estaacute en el rango de 02 a 20 μgml
Para la cuantificacioacuten de proteiacutenas por este meacutetodo se procedioacute de la siguiente
manera
A 1 ml de la mezcla comercial (BioRad) diluido 5 veces se antildeadieron 0020 ml de
muestra convenientemente diluida y se incuboacute durante 5 min a temperatura ambiente
determinaacutendose la absorbancia de la muestra a 595 nm
422 Meacutetodo de Lowry
Este meacutetodo fue desarrollado por Lowry (117) y modificado por Peterson (118)
Los iones de cobre (antildeadidos como tartrato) en medios alcalinos forman complejos
con las proteiacutenas favoreciendo su desnaturalizacioacuten Como consecuencia se exponen
los residuos de tirosina cuyos grupos fenoacutelicos reducen en una reaccioacuten catalizada por
el propio cobre a pH baacutesico el reactivo de Folin amp Ciocalteau (Sigma-Aldrich) que se
antildeade posteriormente Este proceso de reduccioacuten del reactivo de Folin provoca que su
Material y meacutetodos
56
principal componente el aacutecido fosfomolibdotuacutengstico vire de un color amarillo a un
azul intenso La cantidad de proteiacutena puede ser estimada a traveacutes de una curva de
calibracioacuten realizada con concentraciones conocidas de una proteiacutena estaacutendar como
por ejemplo seroalbuacutemina bovina (BSA BioRad) Este meacutetodo presenta una alta
sensibilidad con un liacutemite de deteccioacuten de entre 10-1000 microgml
El meacutetodo es el siguiente a 025 ml de extracto convenientemente diluido se
antildeadieron 125 ml de solucioacuten de trabajo 1 Esta solucioacuten de trabajo 1 se compone de 10
ml de Reactivo A (20 g de carbonato de sodio y 4g de hidroacutexido de sodio aforado en 500
ml de agua) 01 ml de Reactivo B (2 g sulfato de cobre aforado en 100 ml de agua
destilada) 01 ml de Reactivo C (2 g de tartrato de sodio potasio aforado en 100 ml de
agua destilada) y 10 ml de agua destilada La mezcla se agitoacute suavemente y se dejoacute
reposar durante 10 minutos Transcurrido este tiempo se antildeadieron 0125 ml de
reactivo de Folin-Ciocalteau diluido 50 con agua destilada Tras mantener en
incubacioacuten a temperatura ambiente durante media hora se midioacute la absorbancia a 750
nm interpolando los resultados con la recta patroacuten realizada con anterioridad
5 DETERMINACIOacuteN DE ACTIVIDADES ENZIMAacuteTICAS
Una unidad de actividad enzimaacutetica (U) se define cono la cantidad de enzima
que cataliza la desaparicioacuten de 1 micromol de sustrato o la aparicioacuten de 1 micromol de producto
por minuto en condiciones oacuteptimas
La mayoriacutea de las actividades descritas fueron utilizadas como marcadoras de
la pureza de las distintas fracciones celulares extraiacutedas de cultivos celulares del geacutenero
Pseudomonas Asiacute pues como indicadora de la fraccioacuten citoplasmaacutetica se utilizaron las
actividades Fumarasa (EC 4212) o Aconitasa (EC 4213) indistintamente La fraccioacuten
periplaacutesmica se determinoacute con la actividad Nitrato Reductasa (EC 17994) y por
uacuteltimo la actividad Succinato Deshidrogenasa (EC 1351) fue utilizada para detectar
membranas en las diferentes fracciones celulares
Material y Meacutetodos
57
51 ACTIVIDAD FUMARASA L-MALATO HIDRO-LIASA (EC 4212)
Su determinacioacuten se realizoacute midiendo la aparicioacuten de fumarato (ε=24 mM-1 cm-
1) a 50degC determinado como incremento de absorbancia a 240 nm (119)
La mezcla de reaccioacuten conteniacutea 50 mM TrisHCl pH 8 20 mM L-malato y la
cantidad adecuada de muestra en 1 ml de volumen final
52 ACTVIDAD ACONITASA (EC 4213)
La determinacioacuten de la actividad aconitasa se llevoacute a cabo tal y como lo describe
Becerra Leoacuten G (4) midiendo la produccioacuten del intermediario de la reaccioacuten cis-
Aconitato (ε= 36 mM-1 cm-1) observando el aumento de la absorbancia a 240 nm y a
una temperatura de 60degC
La mezcla de reaccioacuten se componiacutea de 50 mM TrisHCl pH 8 30 mM Isocitrato y
la cantidad conveniente de muestra y agua destilada hasta alcanzar 1 ml de volumen
final
53 ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA (EC 17994)
El tratamiento de las muestras para determinar la actividad nitrato reductasa
fue el siguiente a las distintas fracciones celulares convenientemente diluidas se
antildeadieron 01 ml de Nitrato 100 mM 02 ml de TrisHCl 05 M pH 8 01 ml de Metil
Violoacutegeno 01 ml de ditionito soacutedico (8 mg por ml disuelto en tampoacuten TrisHCl 05 M
pH 8) Se mantuvo en incubacioacuten a 30degC durante 10 minutos Transcurrido este tiempo
se paroacute la reaccioacuten por agitacioacuten y se antildeadioacute 1 ml de sulfanilamida (20 ml de HCl 37 1
g de sulfanilamida 99 y hasta 100 ml de agua destilada) seguido de otro mililitro de
N-naftiletilendiamina (20 mg de N-NEDA aforado en 100 ml de volumen final con agua
destilada) Se esperaron 10 minutos a temperatura ambiente y se midioacute la absorbancia
a 540 nm extrapolando los resultados a una recta de calibracioacuten de nitrito
Para la realizacioacuten de la recta patroacuten se utilizaron concentraciones conocidas de
nitrito a las que se les antildeadioacute en cada caso 1 ml de sulfamida y 1 ml de N-NEDA
Material y meacutetodos
58
dejando reaccionar durante 10 minutos a temperatura ambiente y midiendo la
absorbancia 540 nm
54 ACTIVIDAD SUCCINATO OXIDASA (EC 1351)
Se recurrioacute a esta determinacioacuten como actividad tipo indicadora de la integridad
de la fraccioacuten de membrana ya que se midioacute consumo de oxiacutegeno acoplada a la adicioacuten
de succinato Para ello se utilizoacute un electrodo de oxiacutegeno tipo Clark (Hansatech) con el
cual se midioacute el consumo de oxiacutegeno que se produciacutea al antildeadir 10 μl de Succinato 500
mM (5 mM de concentracioacuten final) en una mezcla de reaccioacuten compuesta por 50 μl de
muestra 100 μl de TrisHCl 05 M pH 8 y hasta 1 ml de volumen final de agua
55 ACTIVIDAD MALATOQUINONA OXIDORREDUCTASA (EC 1154)
Esta actividad igual que la succinato deshidrogenasa se midioacute acoplada al resto
de componentes de la cadena de transporte electroacutenico que estaacute asociada a las
membranas y que tiene como uacuteltimo aceptor al oxiacutegeno Por tanto utilizando el
oxiacutemetro tipo Clark (Hansatech) se determinoacute el consumo de oxiacutegeno en una disolucioacuten
acuosa que conteniacutea 50 microl de tampoacuten TrisHCl 1 M pH 8 (concentracioacuten final 50 mM)
10 μl de extracto de membranas y agua destilada hasta 1 ml la reaccioacuten se inicioacute al
antildeadir 25 μl de L-malato 200 mM (concentracioacuten final 5 mM) en la que el aparato
detectoacute el consumo de oxiacutegeno Para asegurar que este consumo de O2 era debido al
proceso de respiracioacuten celular se comproboacute que se inhibiacutea tras la adicioacuten de 10 microl de
KCN 200 mM
56 CARACTERIZACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO-EC 1124)
La reduccioacuten de INT para formar el compuesto coloreado insoluble formazaacuten ha
sido utilizado en varias ocasiones para la medida de actividades enzimaacuteticas en geles
nativos de poliacrilamida (120)
Material y Meacutetodos
59
561 Electroforesis nativa en geles de poliacrilamida (native ndashPAGE)
Antes de desarrollar el meacutetodo espectrofotomeacutetrico se empleoacute esta teacutecnica
para detectar la actividad D-malato oxidasa ya que es un procedimiento que somete a
las proteiacutenas a migracioacuten sin desnaturalizacioacuten asiacute pues las proteiacutenas migran en
funcioacuten de su carga de su tamantildeo y de su forma (121) manteniendo en principio su
actividad El sistema tampoacuten empleado fue Tris-glicina (Tris-base 25 mM glicina 250
mM pH 83) Para elaborar el gel se utilizoacute AccuGeltrade 40 (vv) 291 Acrilamida Bis-
Acrilamida (National Diagnostics) como iniciador de la polimerizacioacuten se utilizoacute
TEMED (N N N Nrsquo-tetrametilen-diamina) y como catalizador persulfato de amonio
(APS) La composicioacuten del gel concentrador (5) y del gel separador (75) se detallan
la siguiente tabla 4 (111)
Tabla 4 Composicioacuten de los geles de acrilamida nativa
GEL SEPARADOR 75 GEL CONCENTRADOR 5
Componentes Volumen 15 ml Componentes Volumen 8 ml
Agua 828 ml Agua 583 ml
TrisHCl 15 M pH 88 375 ml TrisHCl 1 M pH 68 1 ml
Acrilamida 40 281 ml Acrilamida 40 0970 ml
APS 10 0150 ml APS 10 0080 ml
TEMED 0006 ml TEMED 0008 ml
El sistema de electroforesis utilizado fue Mini-Proteanreg 3 Cell de BioRad con un
voltaje constante de 100 V proporcionado por la fuente de alimentacioacuten Power Pac
Basic (BioRad) y en friacuteo (4 oC) para evitar el sobrecalentamiento del sistema y que la
proteiacutena pudiera desnaturalizarse El tampoacuten de carga concentrado 4 veces conteniacutea
glicerol 40 (vv) azul de bromofenol 0004 (pv) y TrisHCl 0125 M pH 68 Por
uacuteltimo la solucioacuten de revelado del gel se realizoacute con los siguientes reactivos DL-malato
5 mM Tris-glicina 50 mM pH 9 INT (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-
tetrazolium) 2 mM ZnCl2 2 mM y agua destilada hasta alcanzar el volumen oportuno y
se mantuvo el gel en agitacioacuten suave hasta la aparicioacuten de una banda rojiza como
Material y meacutetodos
60
consecuencia de la accioacuten ejercida por la actividad DMO (la D-malato oxidasa cataliza
la reaccioacuten de oxidacioacuten del DL-malato reducieacutendose el INT a formazaacuten que forma un
precipitado rojizo) Seguidamente el gel revelado se sometioacute a diversos lavados con
agua destilada y se sumergioacute para posteriores anaacutelisis en una solucioacuten preservadora
de geles que conteniacutea 10 de aacutecido aceacutetico 5 de glicerol y 85 de agua destilada
562 Meacutetodo espectrofotomeacutetrico
Esta actividad se midioacute espectrofotomeacutetricamente a 495 nm y a 45degC La mezcla
de reaccioacuten para un volumen final de 1 ml conteniacutea Tampoacuten Tris-Glicina 50 mM pH 9
INT (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-fenil-2H-tetrazolium) 2 mM ZnCl2 2 mM y
extracto acelular o fraccioacuten celular convenientemente diluido La cineacutetica se comenzoacute
antildeadiendo 5 mM de D-malato La actividad se determinoacute por el incremento de la
pendiente teniendo en cuenta que el coeficiente de extincioacuten molar del INT reducido
es Ɛ=1317 mM-1cm-1
5621 Determinacioacuten del coeficiente de extincioacuten molar del formazaacuten (INT reducido)
Se realizoacute una espectrofotometriacutea de barrido en el espectrofotoacutemetro
Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies) con longitudes de ondas comprendidas
entre los 200-800 nm utilizando una concentracioacuten de INT 50 μM reducido
quiacutemicamente con ditionito Posteriormente se utilizaron distintas
concentraciones conocidas de INT reducido de igual manera que en el caso
anterior con el que determinar el coeficiente de extincioacuten molar utilizando la
expresioacuten matemaacutetica de la Ley de Lambert-Beer
Ademaacutes se realizaron varios ensayos con distintas concentraciones de
INT de entre 01 a 3 mM
5622 Determinacioacuten de la especificidad de sustrato de la DMO
Se utilizaron como posibles donadores de e- de la actividad los siguientes
reactivos D-malato L-malato D-glucosa D-gluconato etanol polietilenglicol
succinato mesotartrato aacutecido laacutectico y D-α-hidroxiglutarato todos a una
concentracioacuten final de 5 mM
Material y Meacutetodos
61
Para determinar si la actividad necesita cofactores se realizaron ensayos
utilizando diferentes metales divalentes en concentracioacuten final 5 mM ZnCl2
FeCl3bull6H2O CoCl2bull6H2O CuCl2bull2H2O MnCl2 MgCl2bull6H2O CaCl2bull2H2O y
FeO4Sbull7H2O En todos los casos se utilizoacute EDTA 05 microM para evitar posibles
interferencias
Como posibles aceptores de electrones se utilizaron ademaacutes del INT
citocromo c ferricianuro potaacutesico y DCPIP
5623 Determinacioacuten de la Km para diferentes sustratos
La KM se determinoacute ajustando los datos de las velocidades iniciales en
funcioacuten de diferentes concentraciones de los distintos sustratos utilizados a la
ecuacioacuten de Lineweaver-Burk (122ndash124) Los ensayos se realizaron en un
mililitro de reaccioacuten y se tomaron medidas del INT reducido producido para cada
concentracioacuten de sustrato De esta manera mediante datos experimentales se
pudo calcular la KM de la DMO para cada sustrato ya que -1KM toma el valor de
la abscisa en el origen (124) en la representacioacuten graacutefica de dobles inversos de la
velocidad inicial frente a la concentracioacuten de sustrato
5624 Temperatura oacuteptima de la DMO
La temperatura oacuteptima de esta actividad enzimaacutetica se determinoacute
realizando cada ensayo en un espectrofotoacutemetro termostatizado (Cary 60 UV-
Vis de Agilent technologies) a diferentes temperaturas comprendidas entre
30degC y 60degC Los reactivos fueron equilibrados a la temperatura requerida en
cada ensayo
5625 pH oacuteptimo de la DMO
El pH oacuteptimo se fijoacute realizando el ensayo de la actividad enzimaacutetica a
distintos pHs entre 7 y 11 de una mezcla de dos tampones TrisHCl y Tris-
glicina cada uno a una concentracioacuten en el ensayo de 50 mM
Material y meacutetodos
62
563 Reconstitucioacuten fisioloacutegica de la actividad D-malato oxidasa
Para determinar si la D-malato oxidasa cediacutea los electrones desde el D-malato a
la cadena de transporte electroacutenico se disentildeoacute el siguiente ensayo en el oxiacutemetro de
oxiacutegeno tipo Clark (Hansatech) se observoacute el consumo de oxiacutegeno en la siguiente
mezcla de reaccioacuten 100 μl de tampoacuten 05 M pH 9 10 μl de ZnCl2 200mM 20 microl de
extracto celular de fraccioacuten de membranas 25 μl de D-malato 200 mM) y 745 microl de
agua La reaccioacuten se inicioacute al antildeadir 100 microl de extracto celular de fraccioacuten de periplasma
(concentrada por precipitacioacuten salina 4060)
564 Determinacioacuten del producto de la reaccioacuten de D-malato oxidasa
Para determinar el oxalacetato (OAA) como el posible producto derivado de la
reaccioacuten de oxidacioacuten del D-malato catalizado por la DMO se disentildeoacute un experimento
acoplado con la malato deshidrogenasa (MDH) por desaparicioacuten de NADH
En un volumen final de 100 μl se antildeadioacute Tris HCl 50 mM pH 8 INT 200 μM D-
malato 2 mM y extracto de fraccioacuten periplaacutesmica de P pseudoalcaligenes parcialmente
purificada mediante cromatografiacutea en FPLC en columna Mono-Q 550 GL (GE
Healthcare) instalada en un sistema de cromatografiacutea liacutequida raacutepida para proteiacutena (Aumlkta
purifier GE Healthcare) Se aforoacute con agua destilada y se incuboacute a 50degC durante 15
minutos A continuacioacuten se antildeadioacute Tris HCl 100 mM pH 8 y agua destilada hasta un
volumen final de 500 microl Se midioacute la cineacutetica de esta mezcla de reaccioacuten a una longitud
de onda de 340 nm transcurrido maacutes de un minuto se antildeadieron 50 microl de NADH 2 mM
(concentracioacuten final 200 μM) y 1 microl de Malato deshidrogenasa comercial (MDH) (L-
malato deshidrogenasa de corazoacuten de cerdo 1200 unidadesmg proteiacutena Roche)
registraacutendose la desaparicioacuten de NADH
6 FRACCIONAMIENTO DE PROTEIacuteNAS POR PRECIPITACIOacuteN SALINA
Se utilizoacute esta teacutecnica (125) para lograr la precipitacioacuten de una fraccioacuten de
proteiacutenas mediante el aumento de la fuerza ioacutenica del medio utilizando para ello
Material y Meacutetodos
63
(NH4)2SO4 en solucioacuten acuosa suacuteper-saturada (100 g (NH4)2SO4 100 ml H20) Primero
se realizoacute la adicioacuten gradual de esta sal en friacuteo y antildeadiendo un 10 del volumen total
(muestra + sulfato de amonio) de Tampoacuten TrisHCl 1 M 10 glicerol hasta conseguir el
40 de saturacioacuten de la solucioacuten Se mantuvo en agitacioacuten y en friacuteo durante
aproximadamente una hora adquiriendo la muestra un aspecto lechoso A
continuacioacuten se centrifugoacute a 25000 x g (17857 rpm) 20 minutos a 4degC en centriacutefuga
Avanti TM J-25 Beckman Coulter con rotor JA-20 El precipitado se disgregoacute en 05 ml de
tampoacuten TrisHCl 50 mM pH 8 10 glicerol y se guardoacute a -20degC para posteriores anaacutelisis
El sobrenadante fue llevado a una saturacioacuten de 60 en sulfato amoacutenico procediendo
de la misma manera que en el caso anterior Nuevamente tras la centrifugacioacuten el
precipitado fue disgregado en 05 ml de tampoacuten TrisHCl 50 mM pH 8 10 glicerol que
junto con el sobrenadante fueron guardados a -20degC
Resultoacute muy uacutetil a la hora de aplicar esta teacutecnica el recurso ldquoon linerdquo de
ldquoAmmonium Sulfate Calculatorrdquo (126)
Cada una de las fracciones obtenidas se sometioacute a cromatografiacutea utilizando una
columna ldquoPD-10 Desalting Columnrdquo (Healthcare Bio-Science AB) equilibrada con
tampoacuten TrisHCl 50 mM pH 8 glicerol 10 para eliminar el exceso de sales y evitar
interferencias en el resultado de los ensayos
7 CROMATOGRAFIacuteA DE EXCLUSIOacuteN MOLECULAR
Esta teacutecnica se utilizoacute como paso de purificacioacuten y para determinar el peso
molecular y el radio de Stokes (127) de la proteiacutena D-malato oxidasa de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 Para obtener tal fin se utilizoacute una columna de exclusioacuten
molecular (Superdex 200 10300 GL de GE Healthcare) instalada en un sistema de
cromatografiacutea liacutequida raacutepida para proteiacutenas (Aumlkta purifier de GE Healthcare) La
columna se equilibroacute con Tampoacuten TrisHCl 100 mM 10 glicerol y se programoacute un flujo
de 05 mlmin recogieacutendose en fracciones de 05 ml En todas las fracciones se
determinoacute la concentracioacuten de proteiacutenas (meacutetodo de Bradford) y la actividad D-malato
oxidasa tal y como se especifica en el apartado 56
Material y meacutetodos
64
Con anterioridad y bajo las mismas condiciones se realizoacute una cromatografiacutea
de exclusioacuten molecular de una mezcla de proteiacutenas estaacutendar y de peso molecular
conocido seleccionadas del Kit comercial HMW Gel Filtration Calibration Kit
(Amersham Biosciences) ver tabla 5 a fin de poder realizar una recta de calibracioacuten y
poder interpolar el peso molecular y el radio de Stokes de la proteiacutena D-malato oxidasa
se utilizoacute ademaacutes Azul dextrano para poder calcular el volumen vaciacuteo de la columna
Tabla 5 Listado de proteiacutenas utilizadas como patroacuten
Proteiacutena Peso molecular (Da)
Radio de Stokes (Aring)
Origen
Tiroglobulina 669000 850 Tiroides bovino
Ferritina 440000 610 Bazo equino
Catalasa 232000 522 Hiacutegado bovino
Aldolasa 158000 481 Muacutesculo de conejo
Ovoalbuacutemina 43000 305 Huevo de gallina
Quimotripsinoacutegeno A 25000 209 Paacutencreas bovino
Ribonucleasa A 137000 164 Paacutencreas bovino
8 TEacuteCNICAS DE BIOLOGIacuteA MOLECULAR
81 PLAacuteSMIDOS
Los plaacutesmidos son herramientas fundamentales en las teacutecnicas de biologiacutea
molecular En la tabla 6 se detallan todos los vectores que se utilizaron en este trabajo
y sus caracteriacutesticas
Tabla 6 Plaacutesmidos empleados en este trabajo
Plaacutesmido Descripcioacuten Referencia pGEMreg-T Easy (pG) Vector de clonacioacuten de productos de PCR
Apr oriColE1 lacZα Vector suicida en P pseudoalcaligenes CECT 5344
Promega
pG aph(3acute) pGEMreg-T Easy que contiene el gen aph(3acute) casete de resistencia a kanamicina Apr
Kmr
(14)
pGBN5_4044 pGEMreg-T Easy que contiene el gen BN5_4044 Apr
Este trabajo
pGmrr pGEMreg-T Easy que contiene el gen mrr Apr
Este trabajo
Material y Meacutetodos
65
Tabla 6 Plaacutesmidos empleados en este trabajo (continuacioacuten) Plaacutesmido Descripcioacuten Referencia pGmrr-gm pGEMreg-T Easy que contiene el gen mrr
truncado por el casete de gentamicina (aacC1) Apr Gmr
Este trabajo
pGhsdR pGEMreg-T Easy que contiene un fragmento del gen hsdR Apr
Este trabajo
pGmcrB pGEMreg-T Easy que contiene un fragmento del gen mcrB Apr
Este trabajo
pGhsdR mcrB pGEMreg-T Easy que contiene fragmentos de los genes hsdR y mcrB Apr
Este trabajo
pG hsdR mcrB aph(3acute) pGEMreg-T Easy que contiene fragmentos de los genes hsdR mcrB y aph(3acute) Apr Kmr
Este trabajo
pMS255 Vector pMS255 que contiene el gen aacC1 que confiere resistencia a gentamicina Apr
Gmr
(128)
pBluescriptSKII (-) Vector de clonacioacuten Apr Stratagen pSEVA221 Vector estaacutendar (Standard European Vector
Architecture) Kmr (129)
pSEVA231 Vector estaacutendar (Standard European Vector Architecture) Kmr
pSEVA281 Vector estaacutendar (Standard European Vector Architecture) Kmr
pSEVA 621 Vector estaacutendar (Standard European Vector Architecture) Gmr
pSEVA 631 Vector estaacutendar (Standard European Vector Architecture) Gmr
pSEVA 681 Vector estaacutendar (Standard European Vector Architecture) Gmr
82 EXTRACCIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE DNA GENOacuteMICO
Para realizar la extraccioacuten y purificacioacuten de DNA genoacutemico de P
pseudoalcaligenes se utilizoacute el kit comercial ldquoGentra Puregene YeastBact Kit Brdquo
(QIAGENreg) siguiendo las especificaciones dadas por el fabricante para la extraccioacuten de
DNA genoacutemico de bacterias Gram-Negativas Una vez aislado y comprobada su
concentracioacuten y pureza por espectrofotometriacutea (λ260nm280nm) se mantuvo a 4degC oacute -20degC
para posteriores usos
83 EXTRACCIOacuteN Y PURIFICACIOacuteN DE DNA PLASMIacuteDICO
Este proceso se llevoacute a cabo gracias a la utilizacioacuten del kit comercial ldquoDNA-spintrade
Plasmid DNA Purification Kitrdquo (iNtRON BIOTECHNOLOGY) siguiendo las indicaciones del
fabricante
Material y meacutetodos
66
84 DIGESTIOacuteN DE DNA
Las digestiones de DNA se realizaron utilizando endonucleasas de restriccioacuten
ldquoThermo ScientifictradeFastDigesttraderdquo(Thermo Fisher Scientific) cuya ventaja ademaacutes de
que el tiempo de incubacioacuten de la mayoriacutea es de 5 minutos es que todas utilizan el
mismo tampoacuten para preparar la mezcla de reaccioacuten lo que evita problemas de
incompatibilidades a la hora de realizar una digestioacuten muacuteltiple Las condiciones de la
reaccioacuten asiacute como de la inactivacioacuten de eacutesta se marcaron considerando las pautas
establecidas para cada enzima En cuanto a la concentracioacuten maacutexima de DNA y el
volumen de reaccioacuten dichos paraacutemetros variaban seguacuten el tipo de DNA a digerir DNA
plasmiacutedico 1microg20 μl producto de PCR sin purificar ~02 μg30 microl y DNA genoacutemico 5
microg50 μl
85 DESFOSFORILACIOacuteN DE LOS EXTREMOS DE MOLEacuteCULAS DE DNA
Al someter a un plaacutesmido a una digestioacuten enzimaacutetica simple para linearizarlo
se generan extremos fosforilados Para evitar la autoligacioacuten el plaacutesmido se
desfosforiloacute con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP Roche) Se antildeadioacute 1 U
de fosfatasa alcalina por cada 5 ndash 10 pmoles de extremos 5acute La reaccioacuten se incuboacute a
37degC durante 30 minutos en presencia del tampoacuten adecuado seguacuten las instrucciones
dadas por el fabricante La reaccioacuten se paralizoacute al antildeadir EDTA 05 M pH 8
86 LIGACIOacuteN DEL DNA
Para la ligacioacuten de moleacuteculas de DNA en plaacutesmidos se partioacute de fragmentos
lineales obtenidos por digestioacuten con enzimas de restriccioacuten en sitios compatibles para
la ligacioacuten o de fragmentos lineales obtenidos por PCR La reaccioacuten se llevoacute a cabo
antildeadiendo 1 U de DNA ndashligasa del fago T4 (Takara) el tampoacuten de ligacioacuten suministrado
por el fabricante y las concentraciones adecuadas de DNA y plaacutesmido en un volumen
final de 10 μl completaacutendose eacuteste con agua Las ligaciones de fragmentos con
extremos romos se realizaron bajo las siguientes condiciones a 16degC durante 24 horas
o a temperatura ambiente durante dos horas Sin embargo los extremos cohesivos se
mantuvieron a temperatura ambiente aproximadamente durante 15 minutos
Material y Meacutetodos
67
En el caso particular del vector de clonacioacuten de pGEMreg-T Easy (Promega)
especialmente desarrollado para la ligacioacuten de productos de PCR la casa comercial
establece las siguientes condiciones de reaccioacuten 1 hora a temperatura ambiente o bien
8 horas a 4degC
En cualquier caso para calcular las concentraciones de vector e inserto se utilizoacute
la siguiente foacutermula
119899119899119899119899 119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907 times 119907119907119905119905119905119905119905119905ntilde119907119907 119894119894119899119899119894119894119907119907119907119907119907119907119907119907 (119870119870119870119870)119907119907119905119905119905119905119905119905ntilde119907119907 119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907 (119870119870119870119870)
times 119894119894119899119899119894119894119907119907119907119907119907119907119907119907 119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907 (119907119907119907119907119903119903119905119905119907119907119894119894oacute119899119899 119905119905119907119907119903119903119905119905119907119907)
= 119899119899119899119899 119889119889119907119907 119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907119907
La relacioacuten molar insertovector se varioacute seguacuten el tamantildeo del vector y del inserto
y seguacuten el tipo de extremos para extremos cohesivos se aplicoacute un ratio molar de 31 y
para extremos romos de 51 (111)
87 ELECTROFORESIS DE DNA EN GEL DE AGAROSA
La electroforesis de DNA se llevoacute a cabo utilizando geles de agarosa (08 pv)
en tampoacuten TBE 05x (Tris-borato45 mM EDTA 1 mM) La solucioacuten madre de TBE se
preparoacute 5 veces concentrada siguiendo las indicaciones establecidas en el apartado de
preparacioacuten de tampones de electroforesis (111) a un litro de agua destilada se
antildeadieron 54 g de Tris base 275 g de aacutecido boacuterico y 20 ml de EDTA 05 M pH 8 Por
cada 100 ml de gel se antildeadieron 10 microl de ldquoSYBR Safe DNA Gel Stainrdquo (Invitrogen) que
permite ver el DNA al iluminar el gel con luz UV
A cada 5 μl de muestras de DNA se incorporoacute 1 μl de tampoacuten de carga comercial
de Thermo Scientific compuesto por TrisHCl pH 76 azul de bromofenol 003 (pv)
xilen-cianol 003 (pv) glicerol 60 (vv) y EDTA 60 mM La mezcla entonces se
depositoacute en el pocillo creado en el gel sumergido eacuteste en una cubeta con tampoacuten TBE
05x La electroforesis se llevoacute a cabo en las cubetas horizontales Sub-Cell GT MINI y
Sub-Cell GT WIDE MINI (BioRad) con un voltaje constante entre 40 y 80 V durante el
tiempo necesario para separar los fragmentos de intereacutes de DNA
Como marcadores de tamantildeo de los fragmentos se utilizaron
Material y meacutetodos
68
o DNA del bacterioacutefago λ digerido con HindIII (Roche) (fragmentos de
23130 9416 6557 2322 2027 y 564 pb)
o 100bp DNA gTP-Ladder (gTPbio) (Fragmentos de 1500 1000 900 800
700 600 500 400 300 200 y 100 pb)
o 1kb DNA gTP-Ladder (gTPbio) (Fragmentos de 10000 8000 6000
5000 4000 3000 2500 2000 1500 1000 750 500 y 250 pb)
88 CUANTIFICACIOacuteN DE DNA
El caacutelculo de la concentracioacuten de DNA de manera rutinaria se realizoacute
visualmente por comparacioacuten con una muestra patroacuten de concentracioacuten conocida
mediante electroforesis en gel de agarosa (ver apartado 107) ya que ademaacutes de
obtener una estimacioacuten de la cantidad de DNA se podiacutea comprobar el tamantildeo de la
moleacutecula en cuestioacuten
Asimismo en los casos en los que se disponiacutea de preparaciones de DNA de alta
pureza la cuantificacioacuten se realizoacute espectrofotomeacutetricamente utilizando el programa
ldquoRNA-DNA estimationrdquo incluido en el espectrofotoacutemetro Cary 60 UV-vis (Agilent
technologies) que mide la absorbancia de las muestras a dos longitudes de onda
distintas 260 nm y 280 nm
La lectura a 260 nm permite calcular la concentracioacuten de aacutecidos nucleicos
presentes en la muestra teniendo en cuenta que 1 DO corresponde a ~ 50 μgml para
DNA de doble cadena (111) La relacioacuten entre las lecturas a 260 nm y 280 nm
(DO260DO280) proporciona una estimacioacuten de la pureza considerando que un valor
menor de 15 supone una elevada cantidad de proteiacutenas entre 15 y 18 el DNA es de
buena calidad y mayores a 18 indica contaminacioacuten por RNA (130)
89 RECUPERACIOacuteN DE FRAGMENTOS DE DNA DE LOS GELES DE AGAROSA
Para tal fin se empleoacute el kit comercial ldquoMEGA quick-spintrade plusrdquo (iNtRON
BIOTECHNOLOGY) siguiendo el protocolo facilitado por el fabricante
Material y Meacutetodos
69
810 TRANSFORMACIOacuteN POR ELECTROPORACIOacuteN
Este meacutetodo consiste a grandes rasgos en cultivar las bacterias (E coli o
Pseudomonas spp) hasta la fase media del crecimiento exponencial dejar enfriar
centrifugar y realizar diversos lavados con agua friacutea para reducir la fuerza ioacutenica de la
suspensioacuten celular y posteriormente disgregar en un tampoacuten friacuteo que contenga 10
glicerol El DNA debe ser introducido en la bacteria exponiendo a eacutestas a una corta
descarga eleacutectrica de alto voltaje (111)
8101 Preparacioacuten de ceacutelulas electrocompetentes
Este protocolo que se realizoacute en todos los pasos en condiciones de esterilidad
se aplicoacute tanto para transformaciones de E coli como para todos los tipos de
Pseudomonas
Protocolo
1 Inocular una colonia de E coli o Pseudomonas spp en 50 ml de medio LB con el antibioacutetico correspondiente e incubar toda la noche a 37degC para E coli y 30degC Pseudomonas spp) en agitacioacuten vigorosa (200 rpm)
2 Preparar dos matraces de 2 litros de capacidad e introducir 500 ml de medio LB precalentado a la temperatura oacuteptima correspondiente inocular cada matraz con 25 ml del cultivo crecido e incubar en las condiciones apropiadas hasta llegar a una DO600 nm de 04 UDO
3 Mantener los cultivos en un bantildeo de agua helada Entre 15-30 minutos A partir de este momento todas las manipulaciones han de realizarse en friacuteo
4 Centrifugar a 1000 x g (3222 rpm en rotor JA-14 de Beckman Coulter) durante 15 minutos a 4degC Decantar el sobrenadante y homgeneizar el precipitado celular en 500 ml de agua friacutea
5 Recoger las ceacutelulas por centrifugacioacuten a 1000 x g (3222 rpm en rotor JA-14 de Beckman Coulter)
durante 20 minutos a 4degC Nuevamente decantar el sobrenadante y disgregar el precipitado en 250 ml glicerol 10 (pv) friacuteo
6 Centrifugar a 1000 x g (3222 rpm en rotor JA-14 de Beckman Coulter) durante 20 minutos a 4degC Desechar el sobrenadante y disgregar el precipitado en 10 ml de glicerol 10 (pv) friacuteo
7 Recoger las ceacutelulas por centrifugacioacuten a 1000 x g (3222 rpm en rotor JA-14 de Beckman Coulter)
durante 20 minutos a 4degC Con mucho cuidado decantar el sobrenadante y homogeneizar la pella en 1 ml de medio GYT friacuteo
8 Medir la DO600nm de la suspensioacuten celular en dilucioacuten 1100 Diluir la suspensioacuten celular con GYT friacuteo en caso de que fuera necesario hasta alcanzar una concentracioacuten de entre 2 x 1010 a 3 x 1010 ceacutelsml (10 DO600nm = 25 x 108 ceacutelsml)
9 Alicuotar en voluacutemenes de 50 μl
10 Conservar a -80degC hasta su uso
Material y meacutetodos
70
8102 Transformaciones de ceacutelulas electrocompetentes
Las ceacutelulas de E coli y de Pseudomonas spp fueron modificadas geneacuteticamente
por transformacioacuten mediante electroporacioacuten
A 50 μl de ceacutelulas electrocompetentes se antildeadieron de entre 10 pg a 25 ng de
DNA para E coli y Pseudomonas putida KT2440 y en torno a 200 ng para
transformaciones en Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 en un volumen de 1-
2 μl que se mantuvo en hielo durante 60 segundos Despueacutes esta suspensioacuten se
introdujo en una cubeta de electroporacioacuten de 02 cm (BioRad) friacutea Se fijaron la
condiciones de electroporacioacuten en el sistema Micropulsertrade (BioRad) para que se diera
un pulso eleacutectrico de 25 μF de capacitancia 25 kV y 200 ohm de resistencia Tras el
pulso se deberiacutean registrar en el sistema un tiempo constante de 4 - 5 milisegundos
con un campo eleacutectrico de 125 kV (111) Posteriormente se antildeadioacute un ml de medio LB
o SOC a temperatura ambiente y las ceacutelulas se transfirieron a un tubo de ensayo esteacuteril
donde se incubaron (recuperaron) con agitacioacuten suave durante 1 hora a 37degC (E coli) y
de 2 a 3 horas a 30degC (Pseudomonas spp) Por uacuteltimo 100 μl de suspensioacuten celular
concentrada 10 veces se repartieron homogeacuteneamente en la superficie de una placa de
Petri con LB-agar y el antibioacutetico de seleccioacuten correspondiente (4)
8103 Seleccioacuten de las colonias recombinantes
Para diferenciar las bacterias transformantes que han incorporado el plaacutesmido
recombinante de las que han incorporado el plaacutesmido sin inserto se utilizoacute del meacutetodo
de la α-complementacioacuten de la actividad β-galactosidasa Este meacutetodo requiere que el
vector usado contenga el sitio de clonacioacuten dentro de la regioacuten codificante del
fragmento α de la β-galactosidasa (pGEMreg-T Easy) y la bacteria hospedadora exprese
el otro fragmento β de la β-galactosidasa necesario para la complementacioacuten
(lacZDM15 presente normalmente en el profago f80 en Facute) En los plaacutesmidos
recombinantes la incorporacioacuten del inserto inactiva el fragmento α de forma que las
bacterias que contienen estos plaacutesmidos carecen de actividad β-galactosidasa
originando colonias blancas en un medio de cultivo que contiene el sustrato incoloro X-
gal (4)
Material y Meacutetodos
71
Las colonias recombinantes se seleccionaron mediante su crecimiento en placas
con medio LBA (LB + antibioacutetico) IPTG y X-gal tal y como se indica en el apartado 22
de este trabajo Las placas se incubaron a 37degC el tiempo necesario hasta la aparicioacuten
de colonias recombinantes (color blanco)
811 REACCIOacuteN DE AMPLIFICACIOacuteN EN CADENA CON DNA POLIMERASA TERMORRESISTENTE (PCR)
Se emplearon oligonucleoacutetidos como cebadores en las reacciones de PCR cuyas
secuencias (Tabla 7) se disentildearon con la ayuda del programa informaacutetico OLIGO6 (131)
Posteriormente se encargoacute su siacutentesis a una casa comercial metabion international
AG
Tabla 7 Oligonucleoacutetidos empleados en este trabajo Nombre Secuencia 5acute-3acute Descripcioacuten Referencia
mrrU TCATCAACCACCTGCTCGAAC Amplificacioacuten de mrr para su mutageacutenesis
Presente trabajo
mrrL TGCGACCTGATCCTTGCCTA Presente trabajo
HF1U CGCACATAGCCCTGACGAATCA Amplificacioacuten de hsdR para la mutageacutenesis de hsdR-mcrC-mcrB
Presente trabajo
HF1BamL AGATCGGATCCGAACTCACCGACAGC
Amplificacioacuten de hsdR para la mutageacutenesis de hsdR-mcrC-mcrB Diana BamHI
Presente trabajo
mrrU TCATCAACCACCTGCTCGAAC Amplificacioacuten de mrr para su mutageacutenesis
Presente trabajo
MF2L GCTGCCATTCGTGAGCGATTCCC Amplificacioacuten de mcrB para la mutageacutenesis de hsdR-mcrC-mcrB
Presente trabajo
3U23 GCTGGATCCTGCCGCAAGCACTC Amplificacioacuten del gen aph(3acute) resistencia a kanamicina para la construccioacuten del mutante ∆hsdR-mcrCB Kmr Diana BamHI
(14)
1607L23 AAGCTGGATCCTTGTAAACCGTT (14)
4044U CTTCTCGCCGATCATCCACT Amplificacioacuten de gen dmo (BN5_4044) para su clonacioacuten y posterior expresioacuten de la proteiacutena heteroacuteloga
Presente trabajo
4044L GCACCGGGTTGTTCAGTTCG Presente trabajo
SP6 ATTTAGGTGAATAGAA
DNA complementario al promotor del fago SP6 presente en el sitio de clonacioacuten del vector pGEMreg-T Easy Se utilizoacute para amplificar insertos presentes en dicho lugar de clonacioacuten
Thermo Scientific
T7 TAATACGACTATAGGG
DNA complementario al promotor del fago T7 presente en el sitio de clonacioacuten del vector pGEMreg-T Easy Se utilizoacute para amplificar insertos presentes en dicho lugar de clonacioacuten
Thermo Scientific
Material y meacutetodos
72
Para la amplificacioacuten rutinaria por PCR de fragmentos de DNA de hasta 6 Kb de
DNA genoacutemico se utilizoacute el kit comercial DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo
Scientific) Este sistema tambieacuten se utilizoacute para la generacioacuten de productos de PCR
usados en clonacioacuten TA (la DNA polimerasa Taq antildeade una sola desoxiadenosina al
extremo 3 del producto de PCR por su parte el vector linealizado pGEMreg-T Easy
suministrado por la casa comercial presenta un residuo de desoxitimidina 3 (T)
complementario lo que permite la ligacioacuten del inserto en el vector con eficacia) Para
50 microl de reaccioacuten se antildeadieron los siguientes componentes DreamTaq Green PCR
Master Mix (2X) pareja de cebadores correspondientes (01-10 microM cada uno) DNA
molde (10 pg-1 microg) y se completoacute el volumen final con agua libre de nucleasas
Sin embargo para amplificar el DNA genoacutemico sin posibles mutaciones se
empleoacute el kit comercial KOD Hot Start Master Mix DNA PolymERasa (Novagen) Para
ello en un volumen de reaccioacuten de 50 microl se agregaron 002 Umicrol de KOD Hot Start
Master Mix DNA PolymERasa (004 Umicrol) una cantidad de DNA molde a amplificar de
hasta 10 ng de DNA plasmiacutedico y de hasta 100 ng de DNA genoacutemico 03 microM de pareja
de cebadores correspondientes y agua libre de nucleasas hasta completar el volumen
final
En ambos casos los paraacutemetros de la reaccioacuten de PCR que se programaron en
el S1000trade Thermal Cycler (BioRad) se eligieron en funcioacuten de los tamantildeos de los
fragmentos de DNA a amplificar temperatura de hibridacioacuten de los cebadores y tiempo
de elongacioacuten Al finalizar la reaccioacuten de PCR el tamantildeo y calidad de los productos se
comprobaron mediante electroforesis en gel de agarosa 08 (14)
Los productos amplificados se purificaron con el sistema MEGA quick-spintrade plus
Fragment DNA Purification Kit (iNtRON BIOTECHNOLOGY)
8111 Disentildeo de la teacutecnica de PCR para amplificar el gen aph(3acute)
El meacutetodo que se describe a continuacioacuten contempla la construccioacuten de pGEM-
TE aph(3acute) plaacutesmido utilizado en este trabajo cuyo disentildeo y construccioacuten aparece
reflejado en la Tesis doctoral ldquoEstudio del papel de los genes cio en la resistencia al
cianuro de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344rdquo (14) El gen aph(3acute) que confiere
Material y Meacutetodos
73
resistencia a kanamicina se amplificoacute a partir de DNA plasmiacutedico del vector pVLT33 (10
ng) con los oligonucleoacutetidos 3U23 y 1607L23 haciendo uso de ldquoPCR extender systemrdquo
(PRIME) Las condiciones de PCR usadas fueron 3 minutos a 94degC seguidos por 30
ciclos de 30 segundos a 94degC 30 segundos a 616degC y 2 minutos a 68degC y una extensioacuten
final de 10 minutos a 68degC Se obtuvo un fragmento de 1627 pb que posteriormente se
clonoacute en el vector comercial pGEMreg-T Easy originaacutendose el plaacutesmido pGEM-TE
aph(3acute)
8112 Amplificacioacuten del gen dmo (BN5_4044) de P pseudoalcaligenes CECT 5344
Se utilizaron como cebadores la pareja de oligonucleoacutetidos 4044U y 4044L
para amplificar el gen dmo (1392 pb) en una reaccioacuten de PCR utilizando el sistema
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific) con los siguientes ciclos 2
minutos a 95degC seguidos de 39 ciclos de 30 segundos a 95degC 30 segundos a 615degC y 1
minuto a 72degC con una extensioacuten final de 5 minutos a 72degC El producto de PCR
esperado era de 2474 pb Como DNA molde se utilizoacute DNA genoacutemico de Pseudomonas
pseudoalcaligenes CECT 5344 (100 ng)
8113 Amplificacioacuten del gen mrr (BN5_0077) de P pseudoalcaligenes CECT 5344
Para amplificar un fragmento genoacutemico que incluiacutea el gen mrr (882pb) se
utilizaron como cebadores la pareja de oligonucleoacutetidos mrrU y mrrL en una reaccioacuten
de PCR (DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific) con los siguientes
ciclos 2 minutos a 95degC seguidos de 39 ciclos de 30 segundos a 95degC 30 segundos a
588degC y 1 minuto a 72degC con una extensioacuten final de 10 minutos a 72degC Como producto
de PCR Se obtuvo un fragmento de 1977 pb Como DNA molde se utilizoacute DNA
genoacutemico de R1 (100 ng)
8114 Amplificacioacuten de un fragmento interno del gen hsdR (BN5_3167 BN5_3168) de P pseudoalcaligenes CECT 5344
Este fragmento se amplificoacute por PCR utilizando como DNA molde DNA
genoacutemico de R1 (hasta 100 ng) y la pareja de cebadores HF1U y HF1BamL cuyo
producto de PCR fue de 592 pb para ello se utilizoacute el sistema DreamTaq Green PCR
Material y meacutetodos
74
Master Mix (2X) (Thermo Scientific) con un programa de 3 minutos a 95degC seguidos de
29 ciclos de 30 segundos a 95degC 30 segundos a 565degC y 1 minutos a 72degC con una
extensioacuten final de 10 minutos a 72degC
8115 Amplificacioacuten de un fragmento interno del gen mcrB (BN5_3170) de P pseudoalcaligenes CECT 5344
En este caso la pareja de cebadores utilizada fue MF2BamU y MF2L que
amplificaron un fragmento interno del gen mcrB de 702 pb Nuevamente se utilizoacute el
sistema DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) (Thermo Scientific) con un programa muy
similar 3 minutos a 95degC seguidos de 29 ciclos de 30 segundos a 95degC 30 segundos a
573degC y 1 minutos a 72degC con una extensioacuten final de 10 minutos a 72degC Como molde
de la reaccioacuten se empleoacute DNA genoacutemico de R1 (hasta 100 ng)
8116 Amplificacioacuten de un inserto de DNA en el vector de clonacioacuten pGEMreg-T Easy
Para amplificar los insertos clonados en el vector pGEMreg-T Easy y comprobar
asiacute que se habiacutea producido la ligacioacuten se utilizoacute la pareja de cebadores SP6-T7 con las
condiciones de PCR siguientes 5 minutos a 95degC seguidos de 29 ciclos de 30 segundos
a 95degC 30 segundos a 54degC y el tiempo del periodo de extensioacuten se calculoacute en funcioacuten
del tamantildeo del inserto a 72degC con una extensioacuten final de 10 minutos a 72degC Como DNA
molde se utilizoacute DNA plasmiacutedico correspondiente en cada caso (10 ng)
812 PCR DE COLONIAS
Para comprobar las colonias transformantes tras una electroporacioacuten (ver
apartado 810) se realizoacute como anaacutelisis rutinario la teacutecnica denominada PCR de
colonias Con el asa de platino debidamente esterilizada se seleccionaron en torno a 4
ndash 5 colonias supuestamente transformadas y escogidas al azar y se disgregaron en
sendos viales con 100 microl de tampoacuten TE (TrisHCl 10 mM y EDTA 1 mM pH 8) A
continuacioacuten se sometieron las muestras a un proceso de desnaturalizacioacuten utilizando
el S1000trade Thermal Cycler (BioRad) con el programa 96degC durante 10 minutos y 4degC
durante otros 10 minutos Por uacuteltimo para separar el DNA de los demaacutes fragmentos
celulares se centrifugoacute a 11000 xg (10177 rpm rotor F 45-30-11 centriacutefuga 5804 R de
Material y Meacutetodos
75
Eppendorf) durante 10 minutos a 4degC El sobrenadante se transfirioacute con cuidado para
no arrastrar precipitado a un nuevo tubo utilizaacutendose como molde para la reaccioacuten de
PCR
9 ANAacuteLISIS BIOINFORMAacuteTICO
Para la identificacioacuten de sitios de restriccioacuten se empleoacute el servidor
httpwwwrestrictionmapperorg
La edicioacuten de las secuencias en formato PEARSONFASTA se realizoacute en el
servidor httpwwwbioinformaticsorgsms2
Los anaacutelisis de secuencias de nucleoacutetidos se realizaron en el servidor
httpwwwebiacukToolsblast
Las buacutesquedas de similitudes de secuencia de nucleoacutetidos y de aminoaacutecidos se
realizaron utilizando el programa BLAST en el servidor del NCBI
httpblastncbinlmnihgovBlastcgi
Los entornos geacutenicos de las proteiacutenas ortoacutelogas a las proteiacutenas estudiadas se
identificaron en los servidores httpcmrjcviorgcgi-binCMRCmrHomePagecgi y
httpwwwpseudomonascom (132)
Los alineamientos de secuencias de nucleoacutetidos y los alineamientos muacuteltiples
de proteiacutenas se realizaron con el programa CLUSTALW (133) en el servidor
httpwwwebiacukToolsclustalw2
La secuencia de nucleoacutetidos del cromosoma circular de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 R1 estaacute disponible en el EMBL-EBI (European
Bioinformatics Institute database) (GenBank HG9168261) (57)
Los aacuterboles filogeneacuteticos se realizaron con el meacutetodo Phylogenyfr (134) en
el servidor httpwwwphylogenyfr
Las predicciones de estructura secundaria y terciaria se realizaron con el
programa Phyre2 en el servidor httpespriptibcpfrESPriptcgi-
binESPriptcghttpwwwsbgbioicacuk~phyre2htmlpagecgiid=indexi (135)
Material y meacutetodos
76
Los puntos isoeleacutectricos y las masas moleculares de las proteiacutenas se calcularon
de forma teoacuterica mediante el servidor httpwwwexpasychtoolspi_toolhtml
Los cebadores y condiciones de PCR se desarrollaron con el programa
informaacutetico OLIGOreg (131)
10 EQUIPOS
Balanza analiacutetica (Cobos)
Balanza (Cobos)
Bantildeo termostatizado (Selecta)
Bantildeo termostatizado con agitacioacuten (Memmert)
Campana de flujo laminar MH-100 provista de luz ultravioleta (Telstar)
Centriacutefuga de sobremesa minispin plus (Eppendorf)
Centriacutefuga Eppendorf 5810R utilizada con los rotores basculante A-4-62 y de
aacutengulo fijo F34-6-38 (Eppendorf)
Centriacutefuga Eppendorf 5804R que soporta los rotores de aacutengulo fijo F34-6-38 y
F45-30-11 (Eppendorf)
Centriacutefuga Avanti J-25 con rotores JA-14 y JA-20 (Beckman Coulter)
Digitalizador de imaacutegenes visible-UV BioRad Chemi Doc provisto del software
Quantity One 431 (Biorad)
Electroporador Micropulser (Biorad)
Equipo de cromatografiacutea liacutequida raacutepida para proteiacutenas (FPLC) (GE Healthcare)
Espectrofotoacutemetro Helios Epsilon (Thermo Spectronics)
Espectrofotoacutemetro Cary 60 UV-Vis (Agilent Technologies)
Espectrofotoacutemetro Multiskan GO (Thermo Scientific)
Estufas de incubacioacuten Selecta Incudigit (empleada a 30degC) y Raypa incuterm (a
37degC)
Fuentes de alimentacioacuten BioRad PowerPac HV y PowerPac Basic (BioRad)
Incubadores orbitales Infors Multitron y Multitron II
Kit de electroforesis de Mini-PROTEAN 3 Cell (BioRad)
Oxiacutemetro de oxiacutegeno tipo Clark (Hansatech)
pHmetro GLP21 (Crison)
Material y Meacutetodos
77
Prensa de French (SLM-Amino)
Termobloques Tembloc (Selecta) y Digital Heatblock (VWR)
Termociclador Eppendorf Mastercycle (Eppendorf)
Termociclador S1000 Thermal Cycler (Biorad)
Ultracentriacutefuga L8-80M con rotores 80 Ti y 502 Ti (Beckman)
Ultracentriacutefuga Optima TLX con rotor TLA110 (Beckman)
11 REACTIVOS
Los reactivos utilizados fueron de la mayor pureza comercialmente disponible
en las casas comerciales BioRad Conda Fluka gTPbio Merk Novagen Panreac
Riedel-de Haeumln Sigma-Aldrich VWR-ProLabohellip
IV RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
CAPIacuteTULO 1 CARACTERIZACIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD
D-MALATO OXIDASA (DMO) DE P pseudoalcaligenes
CECT 5344
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
83
1 DETECCIOacuteN DE UNA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO)
La bacteria Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 (R1) es capaz de asimilar
cianuro y utilizarlo como uacutenica fuente de nitroacutegeno (44) pero ello solo es posible
cuando se suministra una fuente de carbono adecuada La mejor fuente de carbono
para la asimilacioacuten de cianuro se ha demostrado que es el DL-malato (136) El L-malato
es directamente un intermediario del ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos y del ciclo del
glioxilato Esta bacteria no posee malato deshidrogenasa por lo que este compuesto
se transforma en oxalacetato gracias a una actividad MalatoQuinona oxidorreductasa
(MQO) (90)
El D-malato es tambieacuten utilizado por la bacteria pero no se conoce exactamente
la ruta metaboacutelica que permite su asimilacioacuten En estudios preliminares se observoacute en
geles nativos de poliacrilamida la presencia de una actividad D-malato oxidasa no
dependiente de NAD(P)H que utilizaba INT (2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-
feniltetrazolium) como aceptor artificial de electrones La reduccioacuten del INT genera
formazaacuten que es un compuesto insoluble de color violeta (figura 10) (93) A esta
actividad se le denominoacute D-Malato Oxidasa (DMO)
Los primeros ensayos enzimaacuteticos se realizaron utilizando electroforesis nativas
en geles de poliacrilamida Para ello una vez realizada la electroforesis los geles eran
sometidos a incubacioacuten durante tiempos de hasta 24 horas en la siguiente mezcla de
reaccioacuten D-malato 5 mM Tampoacuten tris-glicina 50 mM pH 95-10 INT 10 mM (5 mgml)
y agua destilada hasta alcanzar el volumen deseado Existiacutean evidencias de que la
mediante electroforesis nativa en geles de poliacrilamida utilizando como aceptor de electrones INT y L-malato (A) oacute D-malato (B) como donadores de electrones E Extracto crudo P Periplasma C Citoplasma M Membrana (93)
Figura 10 Deteccioacuten de una actividad D-malato oxidasa
A B
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
84
actividad pudiese verse afectada por la presencia de sales metaacutelicas (92) tales como
CaCl2 MgCl2 o ZnCl2 que podriacutean acelerar la reaccioacuten Asiacute utilizando diferentes
metales se identificoacute como posible cofactor de la DMO al catioacuten divalente Zn2+ (figura
11) Existen antecedentes bibliograacuteficos de proteiacutenas con actividades similares que
requieren de este mismo cofactor como por ejemplo la D-lactato deshidrogenasa de
Archaeoglobus fulgidus que necesita FAD y Zn2+ (137)
En este contexto se planteoacute caracterizar la actividad enzimaacutetica D-malato
oxidasa de la bacteria P pseudoalcaligenes CECT 5344 asiacute como su posible relacioacuten con
el metabolismo del cianuro
2 DESARROLLO DE UN ENSAYO ESPECTROFOTOMEacuteTRICO PARA LA DMO
21 CAacuteLCULO DEL COEFICIENTE DE EXTINCIOacuteN MOLAR DEL INT REDUCIDO (FORMAZAN)
Para determinar el maacuteximo de absorcioacuten del formazaacuten y establecer la longitud
de onda a la cual realizar las mediciones espectrofotomeacutetricas se utilizoacute una solucioacuten
de INT 50 μM reducido quiacutemicamente con 100 μl de ditionito (8 mgml) a 25degC y pH 95
Se realizoacute la medicioacuten de un espectro entre 800 y 300 nm observaacutendose un maacuteximo en
la zona visible a 495 nm (Figura 12A)
Establecida la longitud de onda de maacutexima absorbancia (λmax) el siguiente paso
fue el caacutelculo del coeficiente de extincioacuten molar del INT reducido (formazaacuten) Para ello
se emplearon distintas concentraciones de INT entre 0 y 100 microM reducido
quiacutemicamente con ditionito y se midioacute la absorbancia de cada muestra a 495 nm 25degC
Figura 11 Efecto de algunos metales sobre la actividad DMO
1 2 3 4 5
Las proteiacutenas del extracto crudo (100 μg de proteiacutena total) se separaron mediante electroforesis nativa en un gel de poliacrilamida al 75 Se utilizaron distintas variaciones sobre la mezcla de tincioacuten control 1 (d-malato 5 mM Tampoacuten tris-glicina 50 mM pH 95-10 INT 10 mM y agua destilada)2 Adicioacuten de EDTA 2 mM 3 Adicioacuten de cloruro de calcio 2 mM 4 Adicioacuten de cloruro de magnesio 2 mM 5 Adicioacuten de cloruro de zinc 2 mM La fotografiacutea se realizoacute tras 24 horas de incubacioacuten
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
85
y pH 95 El coeficiente de extincioacuten molar determinado experimentalmente para el
INT reducido (ƐINTred) fue de 1317 mM-1 cm-1 (Figura 12B) Este dato fue el que se utilizoacute
para el caacutelculo de la actividad enzimaacutetica DMO en los ensayos posteriores
Los datos obtenidos son similares con los de la bibliografiacutea consultada en los
que la longitud de onda de maacutexima absorbancia del formazaacuten oscila entre los 480-500
nm Menos coincidencias se producen a la hora de determinar el coeficiente de
extincioacuten molar del INT reducido en los que aparecen valores tales como ƐINTred =110
mM-1 cm-1 (138) ƐINTred = 124 mM-1 cm-1 (139) y ƐINTred =180 mM-1 cm-1 (140) Estas
variaciones pueden ser debidas a varios factores como las diferencias de pH de
temperatura o pureza de los reactivos utilizados
22 CONCENTRACIOacuteN OacutePTIMA DE INT Y Km DE LA DMO
La concentracioacuten oacuteptima del aceptor artificial de electrones INT y la Km de la
enzima para este sustrato se calcularon utilizando extractos parcialmente purificados
de la DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 (aproximadamente 160 ng por ensayo)
Para ello el extracto crudo de periplasma se sometioacute a precipitacioacuten fraccionada
(4060) con sulfato amoacutenico y se dializoacute utilizando una columna de desalado PD-10
siguiendo el protocolo del fabricante (GE Healthcare Bio-Science AB) Los ensayos
enzimaacuteticos se llevaron a cabo realizando medidas cineacuteticas en el espectrofotoacutemetro a
una λ= 495 nm durante 5 minutos utilizando distintas concentraciones de INT de entre
(A) Espectro de absorcioacuten del formazaacuten (50 μM) entre 800 y 300 nm (B) Curva de calibrado del formazaacuten ƐINTred 1317 mM-1 cm-1
Figura 12 Espectro de absorcioacuten y coeficiente de extincioacuten molar del Formazaacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
86
01 y 5 mM La concentracioacuten de d-malato se mantuvo fija en 5 mM Ademaacutes se antildeadioacute
a la mezcla de reaccioacuten ZnCl2 2mM todo ello en tampoacuten Tris-glicina 50 mM pH 95 las
mediciones se realizaron a temperatura ambiente Con estos datos se llegoacute a la
conclusioacuten de que la concentracioacuten oacuteptima de INT en el ensayo en estas condiciones es
de aproximadamente 2 mM (figura 13A) Aunque la mayor actividad se observoacute
aparentemente a una concentracioacuten de 3 mM a esta concentracioacuten se produce un
aumento considerable de actividad inespeciacutefica (reduccioacuten de INT independiente de D-
malato) por lo que la actividad es realmente menor que a concentraciones inferiores
Por otro lado a partir de 4 mM se produce un descenso en la actividad DMO que podriacutea
deberse bien a una inhibicioacuten por sustrato o bien a la formacioacuten de artefactos
quiacutemicos Por este motivo para proceder al caacutelculo de la Km del INT a partir de la
representacioacuten de Lineweaver-Burk (124) no se tuvieron en cuenta los datos obtenidos
con concentraciones iguales o superiores a 4 mM Con estos datos la Km de la DMO
para el sustrato INT fue de aproximadamente 35677 plusmn088 mM (figura 13B) Este
resultado indica que la afinidad de la enzima DMO por el INT es relativamente baja
(141) pero al ser un sustrato artificial ello no tiene consecuencias fisioloacutegicas
destacables
A Determinacioacuten de la Km de la DMO para el INT Cada punto de la graacutefica corresponde a la Actividad Especiacutefica (Umg) de la enzima D-malato oxidasa (extractos de P pseudoalcaligenes parcialmente purificados) frente a distintas concentraciones de INT (aceptor artificial de electrones) y D-malato 5 mM como donador de electrones (liacutenea naranja) La actividad inespeciacutefica es independiente del sustrato D-malato (liacutenea azul) B Representacioacuten de Lineweaver-Burk (124) para el caacutelculo de la Km de la DMO para el INT El resultado para la Km es de 3577plusmn088 mM Los valores de las barras de error corresponden a la SD de dos ensayos independientes
Figura 13 Determinacioacuten de la Km de la DMO para el INT
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
87
23 TEMPERATURA OacutePTIMA Y TERMOESTABILIDAD
Los ensayos de actividad para determinar la temperatura oacuteptima se llevaron a
cabo tal y como se explica en el apartado de ldquoMaterial y meacutetodosrdquo de esta Tesis
utilizando aproximadamente 160 μg de extractos de P pseudoalcaligenes CECT 5344
parcialmente purificados La maacutexima actividad se detectoacute a 45 degC (figura 14A) Esta
temperatura aunque es algo elevada para una bacteria mesoacutefila es consistente con los
datos de otras enzimas de P pseudoalcaligenes CECT 5344 que mostraron
temperaturas oacuteptimas igual de altas o incluso mayores Asiacute la 3-cianoalanina nitrilasa
de esta bacteria tiene una temperatura oacuteptima de 45degC (142) la fumarasa y la aconitasa
de 55degC (136) y la cianasa de 65degC (143)
Para determinar el intervalo de temperaturas en el que la enzima es estable
(termoestabilidad) se utilizaron por una parte extractos acelulares de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 parcialmente purificados y por otro lado extractos con
la proteiacutena DMO expresada de manera heteroacuteloga en E coli (ver maacutes adelante) y se
sometieron a los tratamientos que se detallan a continuacioacuten Los extractos se
incubaron a diferentes temperaturas dentro del intervalo comprendido entre
temperatura ambiente (20degC ~25degC) y 80degC durante 5 minutos tras lo cual se
centrifugaron para eliminar las proteiacutenas insolubles y a continuacioacuten se midioacute la
actividad seguacuten el ensayo estaacutendar Tal y como se observa en la figura 14B ambos
extractos mostraron un comportamiento similar respecto a su estabilidad teacutermica
manteniendo su integridad hasta casi los 50degC siendo maacutes sensible en la proteiacutena
expresada en E coli Ademaacutes con este experimento se reveloacute la naturaleza proteica de
esta actividad
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
88
24 pH OacutePTIMO DE LA ACTIVIDAD DMO
A continuacioacuten se determinoacute el pH oacuteptimo de la actividad DMO Para ello el
resto de variables se ajustoacute a las condiciones estaacutendar descritas en material y meacutetodos
para ajustar la mezcla de reaccioacuten a los distintos pHs se utilizoacute una mezcla de tampoacuten
TrisHCl y tampoacuten Glicina (ambos a una concentracioacuten final de 50 mM) en
proporciones variables dependiendo del pH final deseado La mayor actividad se
detectoacute a pH 9 (figura 15) Este dato es consistente con lo esperado para una bacteria
que crece a pH alcalino (24) asiacute como con los datos obtenidos para las enzimas
estudiadas hasta la fecha de esta misma bacteria La 3-cianoalanina nitrilasa mostroacute un
pH oacuteptimo de 8 (142) la fumarasa y la aconitasa de 85 (136) y la cianasa tuvo su maacutexima
actividad tambieacuten a pH 85 (143)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
30 35 40 45 50 55 60
AE
(U
mg-1
)
Temperatura (degC)
AE (Umg) DMO AE (Umg) (inespeciacutefica)
0102030405060708090
100
RT 40 50 60 70 80
Porc
enta
je d
e ac
tivid
ad
Temperatura (degC)PROTEINA DMO WT (100= 18359 mU totales)
PROTEINA DMO EXPRESADA EN E coli (100= 97266 mUtotales)
A B
Figura 14 Efecto de la temperatura sobre la DMO
A Determinacioacuten de la temperatura oacuteptima de la actividad DMO (liacutenea naranja) en la que se utilizaron extractos parcialmente purificados de la enzima obtenidos a partir de P pseudoalcaligenes con una cantidad de proteiacutena de 160 μg y a tiempos muy cortos (5 minutos) B Termoestabilidad de la DMO Se representa el porcentaje de actividad DMO retenida tras la incubacioacuten durante 5 minutos a la temperatura indicada de extractos parcialmente purificados de P pseudoalcaligenes (color naranja) y de la proteiacutena expresada en E coli (color malva) RT Temperatura ambiente Las barras de error representan la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en tres ensayos independientes
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
89
25 COMPARATIVA ENTRE EL MEacuteTODO ESPECTROFOTOMEacuteTRICO Y LA ELECTROFORESIS NATIVA EN GEL DE POLIACRILAMIDA
Una vez optimizado el meacutetodo espectrofotomeacutetrico este se comparoacute con el
descrito anteriormente tras electroforesis nativa en geles de poliacrilamida Para ello
se tomaron 50 μl de varios extractos de proteiacutena de P pseudoalcaligenes CECT 5344
parcialmente purificados de distintas preparaciones y se midieron en el
espectrofotoacutemetro mediante el ensayo de actividad estaacutendar DO 495 nm 45degC 5
minutos y una mezcla de reaccioacuten de volumen final de 1 ml que conteniacutea D-malato 5
mM Tampoacuten tris-glicina 50 mM pH 9 INT 2 mM ZnCl2 2 mM y agua destilada De
manera paralela se realizoacute una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida 75
(Figura 16) cargando en cada pocillo aproximadamente unos 20 μg de proteiacutena total
de los mismos extractos medidos con anterioridad con el espectrofotoacutemetro La mezcla
de reaccioacuten para el revelado del gel presentaba la misma composicioacuten que figura con el
meacutetodo espectrofotomeacutetrico pero con un volumen final de 10 ml
Los resultados obtenidos indican que ambos meacutetodos coinciden en que se
obtienen mejores resultados si los extractos son sometidos a precipitacioacuten fraccionada
4060 con sulfato amoacutenico ya que se evitan interferencias de posibles artefactos
Figura 15 Efecto del pH en la actividad DMO La determinacioacuten del pH oacuteptimo se llevoacute a cabo mediante la reaccioacuten estaacutendar (5 minutos a 45degC) La actividad enzimaacutetica (liacutenea naranja) se determinoacute a distintos pHs utilizando una mezcla de tampones TrisHCl y Glicina en concentracioacuten 50 mM cada uno La actividad inespeciacutefica (liacutenea azul) se midioacute sin antildeadir D-malato a la mezcla de reaccioacuten Las barras de error representan la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en dos ensayos independientes
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
90
quiacutemicos Ademaacutes el meacutetodo espectrofotomeacutetrico que reduce considerablemente el
tiempo de deteccioacuten de la actividad DMO en comparacioacuten con el meacutetodo tradicional
aporta una gran sensibilidad y permite cuantificar la actividad tal y como se muestra
en la figura 16 De manera visual por ejemplo se observa que el pocillo 3 de la figura
16 es el que tiene mayor intensidad en el gel de acrilamida lo que concuerda con el
dato numeacuterico obtenido por espectrofotometriacutea
1 2 3 4
Gel de
poliacrilamida
75
Absmin
DO495nm
00313 00174 01666 0006
Actividad
Especiacutefica
(Umg)
267 1874 9166 1283
3 LOCALIZACIOacuteN INTRACELULAR
Para acotar la funcioacuten fisioloacutegica y la ruta o rutas metaboacutelicas en la que pueda
estar involucrada la D-malato oxidasa es imprescindible conocer su localizacioacuten
intracelular Para ello se realizoacute un fraccionamiento subcelular (115) de ceacutelulas
procedentes de un cultivo fresco de P pseudoalcaligenes CECT 5344 A continuacioacuten se
realizoacute una electroforesis nativa en geles de poliacrilamida cargando en los pocillos y
por duplicado las distintas fracciones subcelulares y se procedioacute al revelado utilizando
dos soluciones de tincioacuten distintas una que conteniacutea como sustrato DL-malato y la otra
L-malato Los resultados (figura 17) muestran que la actividad DMO solo aparecioacute
claramente en la fraccioacuten periplaacutesmica en el gel revelado con DL-malato como donador
Figura 16 Comparacioacuten entre los meacutetodos espectrofotomeacutetrico y en PAGE nativa La segunda fila corresponde al gel de poliacrilamida 75 tras 4 horas de revelado con la mezcla de reaccioacuten estaacutendar en la que se cargaron aproximadamente 20 μg de proteiacutenas En la tercera fila se muestras los datos obtenidos por el meacutetodo espectrofotomeacutetrico La cuarta fila corresponde al caacutelculo de la Actividad Especiacutefica de cada estracto teniendo en cuenta que ƐINT reducido es de 1317 mM-1 cm-1 En los pocillos del gel se cargaron 20 μg de proteiacutena total de diferentes fracciones subcelulares de P pseudoalcaligenes CECT 5344 1 Fraccioacuten periplaacutesmica precipitada con sulfato amoacutenico 60 y filtrada con columna PD-10 (almacenada durante 4 meses a - 20degC aliacutecuota descongelada en varias ocasiones) 2 Fraccioacuten periplaacutesmica (sin tratamientos previos y almacenada a - 20degC sin descongelaciones previas) 3 Fraccioacuten periplaacutesmica precipitada con sulfato amoacutenico 60 y filtrada con columna PD-10 (1 semana guardada a - 20degC sin descongelar hasta su uso) 4 Fraccioacuten citoplasmaacutetica (mismas condiciones de almacenaje que la muestra 3)
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
91
de electrones (figura 17A) mientras que al utilizar como solucioacuten de tincioacuten L-malato
no se advierte sentildeal en el gel (figura 17B)
Ademaacutes se midioacute la actividad D-malato oxidasa en cada una de las fracciones
realizando el ensayo espectrofotomeacutetrico detectaacutendose mayoritariamente la
actividad en la fraccioacuten periplaacutesmica (5430) aunque tambieacuten se observa actividad en
la fraccioacuten citosoacutelica (3891) y en menor medida en la fraccioacuten de membranas
(679) (figura 18D) Por lo tanto la localizacioacuten coincide con el resultado obtenido en
la electroforesis nativa en gel de poliacrilamida descrita anteriormente si bien el
meacutetodo espectrofotomeacutetrico es maacutes sensible a la actividad detectado eacutesta en las tres
fracciones
Para determinar la pureza de las preparaciones se realizaron ensayos
enzimaacuteticos para las actividades de localizacioacuten conocida como la aconitasa
(citoplasma) (figura 18A) la nitrato reductasa (periplasma) (figura 18B) y la succinato
oxidasa (membranas) (figura 18C) Para ello se utilizaron voluacutemenes iguales (o
diluciones apropiadas) de cada fraccioacuten subcelular La actividad enzimaacutetica especiacutefica
de cada actividad fue analizada y calculado el porcentaje de la actividad celular total
(Figura 18)
El protocolo de fraccionamiento consiste en una primera separacioacuten de
esferoplastos y periplasma por el tratamiento con lisozima de las ceacutelulas en medio
isotoacutenico Una vez separada por centrifugacioacuten la fraccioacuten periplaacutesmica la rotura de los
esferoplastos permite la separacioacuten de membranas y citoplasma por
ultracentrifugacioacuten La presencia de actividad aconitasa en la fraccioacuten periplaacutesmica
Figura 17 Fraccionamiento subcelular Para determinar la localizacioacuten intracelular de la actividad D-malato oxidasa en la bacteria Gram- P pseudoalcaligenes CECT 5344 se realizaoacute un fraccionamiento subcelular tal y como se describe en el apartado de Material y Meacutetodos de este trabajo Posteriormente las distintas fracciones subcelulares obtenidas fueron sometidas a electroforesis nativa en gel de poliacrilamida 75 y reveladas con diferentes soluciones de tincioacuten A Solucioacuten de tincioacuten Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM DL-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml de volumen final B Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM L-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml de volumen final La flecha indica que la actividad D-malato oxidasa aparece en la fraccioacuten periplaacutesmica C Citoplasma M Membranas P Periplasma
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
92
(Figura 18A) indica que parte de los esferoplastos se lisan en el primer paso
contaminado asiacute el periplasma con citoplasma Sin embargo la actividad aparece
mayoritariamente en el citoplasma La actividad nitrato reductasa (figura 18B)
marcadora de la fraccioacuten periplaacutesmica aparece mayoritariamente en el periplasma y en
menor medida en el citoplasma Ello indica que por el contrario la accioacuten de la lisozima
no fue completa y que parte de las ceacutelulas permanecieron intactas La posterior rotura
de estas contaminariacutea de periplasma la fraccioacuten citosoacutelica Por el contrario la succinato
oxidasa aparece iacutentegramente en las membranas (figura 18C) Estos resultados indican
que el protocolo de fraccionamiento subcelular aunque provoca algunas
contaminaciones cruzadas entre las distintas fracciones es lo suficientemente raacutepido y
preciso para poder afirmar que la DMO al igual que la nitrato reductasa es una enzima
periplaacutesmica
Las proteiacutenas de membrana y las secretadas al espacio periplaacutesmico suelen
tener un peacuteptido sentildeal en la regioacuten N-terminal que las dirige a su destino Sin embargo
el programa bioinformaacutetico de prediccioacuten de secuencias sentildeal (SignalP-50) en el que se
ha cotejado la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena D-malato oxidasa no reconoce
ninguacuten peacuteptido sentildeal en dicha secuencia Que no tenga un peacuteptido sentildeal reconocible
Figura 18 Representacioacuten graacutefica de la distribucioacuten de los marcadores proteicos de las distintas fracciones celulares Tras el fraccionamiento subcelular se determinaron las actividades especiacuteficas de A aconitasa (enzima citosoacutelica) que aparece mayoritariamente en la fraccioacuten citoplasmaacutetica B Nitrato Reductasa periplaacutesmica (enzima periplaacutesmica) que aparece mayoritariamente en la fraccioacuten periplaacutesmica C Succinato Oxidasa (complejo de membrana) cuya actividad aparece iacutentegramente en la fraccioacuten correspondiente a membranas y D DMO que aparece en el periplasma en un 54 en el citoplasma aparece en un 38 y por uacuteltimo con un 7 en la fraccioacuten de membranas
AE (Umg) AT(U) AT AE (Umg) AT(U) AT AE (Umg) AT(U) AT AE (Umg) AT(U) AT
Periplasma 940x108 103x105 591 481x105 5296 9226 000 000 000 8283 0009 5430Citoplasma 352x109 160x106 9193 973x103 444 774 000 000 000 1432 0007 3891Membranas 613x107 377x104 216 000 000 000 218x105 336x104 10000 185 0001 679
ACONITASA NITRATO REDUCTASA SUCCINATO OXIDASA D-MALATO OXIDASA
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
93
por este programa no quiere decir que no se encuentre en el periplasma Asiacute
Archaeoglobus fulgidus tiene una D-lactato deshidrogenasa (KUJ943681) que es una
proteiacutena integral de membrana pero con una parte incluido el ldquobolsillo de unioacuten a FADrdquo
en la superficie de la membrana en direccioacuten al periplasma que no muestra peacuteptido
sentildeal (137) Usando el programa de alineamiento de secuencias BLAST (144) se observa
que ambas proteiacutenas coinciden en un 98 de alineamiento con una identidad
aproximada de 36 por lo que no se descartariacutea una localizacioacuten similar
En plantas concretamente en Arabidopsis thaliana la D-lactato deshidrogenasa
(At5g06580) que tiene un 79 de alineamiento de secuencias y un 27 de identidad
con la DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 presenta en su secuencia en el extremo
amino terminal un peacuteptido sentildeal mitocondrial canoacutenico (TOM20 del 3 a 7 aminoaacutecidos)
seguido de una regioacuten amfifiacutelica (de 11 a 20 aminoaacutecidos) y una secuencia hidrofoacutebica
corta (α-heacutelice transmembranal de 48 a 68 aminoaacutecidos) por lo que parece que ser que
o bien se encuentra anclada a la membrana interna mitocondrial aunque de cara al
espacio intermembranal o bien es soluble en este mismo espacio intermembranal
(101)
Siguiendo con este apartado para optimizar el proceso de extraccioacuten
subcelular se realizaron distintas modificaciones tanto en el protocolo descrito en
material y meacutetodos de Imperi y colaboradores (115) como en el Kit comercial de
PeriPrepstrade Periplasting Kit (Epicentre)
31 MODIFICACIONES DEL PROTOCOLO DE IMPERI
Siguiendo el meacutetodo de Imperi (115) el precipitado bacteriano procedente de
un litro de cultivo se disgregoacute en 30 ml de un tampoacuten que conteniacutea TrisHCl 30 mM pH
8 sacarosa 20 EDTA 4 mM lisozima 05 mgml y PMSF 1 mM y se incuboacute durante 60
minutos a 30degC en un bantildeo termostaacutetico con agitacioacuten suave transcurridos dos minutos
de incubacioacuten se antildeadioacute MgCl2 10 mM en concentracioacuten final A continuacioacuten se
centrifugoacute (11 000 x g durante 15 minutos a 4degC) para recoger el sobrenadante que
conteniacutea las proteiacutenas periplaacutesmicas Sobre este procedimiento se realizaron las
siguientes modificaciones con los resultados que se detallan a continuacioacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
94
311 Sustitucioacuten del PMSF
Se realizaron 4 ensayos de fraccionamiento subcelular En el primero el PMSF
fue sustituido por un coacutectel comercial de inhibidor de proteasas (Roche) al 4 En el
segundo se mantuvieron las condiciones estaacutendar de PMSF 1 mM en el tercero se
antildeadioacute al tampoacuten Inhibidor de proteasas 4 y PMFS 1 mM Por uacuteltimo en el cuarto
ensayo no se antildeadieron ni PMSF ni Inhibidor de proteasas Una vez extraiacutedas las
proteiacutenas periplaacutesmicas se realizoacute una electroforesis nativa en de poliacrilamida 75
y se incuboacute con la solucioacuten de tincioacuten estaacutendar para la D-malato oxidasa El mejor
resultado se obtuvo utilizando PMSF aunque la intensidad de la sentildeal en el gel no es
muy buena pues se tuvo poco tiempo en contacto con la solucioacuten de tincioacuten (figura 19)
312 Cambio en la concentracioacuten de sacarosa
En el tampoacuten original de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas conteniacutea un 20
de sacarosa Se elaboraron cuatro tampones diferentes con concentraciones
decrecientes de sacarosa (20 10 5 y 0) y con cada uno de ellos se procedioacute tal y
como indicaba el protocolo de Imperi (115) Una vez obtenidas las fracciones
periplaacutesmicas correspondientes a cada ensayo se procedioacute a medir las actividades
enzimaacuteticas aconitasa (como actividad indicadora de fraccioacuten citoplasmaacutetica) nitrato
reductasa (actividad tiacutepica de fraccioacuten periplaacutesmica) y D-malato oxidasa El resultado
obtenido (figura 20) indica que el meacutetodo que emplea sacarosa al 20 es el maacutes eficaz
en cuanto a actividad D-malato oxidasa (DMO) ya que es en el que se detecta una
mayor actividad de esta enzima si bien el periplasma estaacute maacutes contaminado de
fraccioacuten citoplasmaacutetica que en el meacutetodo que emplea 10 de sacarosa en el que la
actividad aconitasa es menor y la actividad nitrato reductasa es alta lo que significa que
Figura 19 Efecto de la utilizacioacuten de PMSF o de inhibidor de proteasas en la extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas Se realizoacute una electroforesis nativa en gel de acrilamida 75 con aproximadamente 150 μg de proteiacutenas en cada pocillo Para la tincioacuten se utilizoacute la solucioacuten estaacutendar para medir DMO Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM DL-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml Al tampoacuten de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas se le antildeadioacute 1 Inhibidor de proteasas 4 2 PMSF 1 Mm 3Inhibidor de proteasas 4 maacutes PMSF 1 Mm 4 No se antildeadioacute ninguacuten protector de proteiacutenas La sentildeal del gel es muy tenue ya que se mantuvo poco tiempo en incubacioacuten con la solucioacuten de tincioacuten pero aun asiacute se observa que el mejor resultado aparece en la calle nuacutemero 2
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
95
se trata de una fraccioacuten periplaacutesmica muy ldquolimpiardquo aunque la actividad DMO es maacutes
baja respecto a la detectada con el meacutetodo de sacarosa 20 Con el meacutetodo de
sacarosa 5 la actividad nitrato reductasa se reduce considerablemente aunque la
actividad DMO no se ve afectada Por uacuteltimo la que mayor actividad aconitasa
demuestra y por tanto mayor porcentaje de fraccioacuten citoplasmaacutetica lo que significa
que los esferoplastos al encontrarse en un medio hipotoacutenico sufrieron turgencia (145)
con lo que se liberoacute todo el contenido citoplasmaacutetico a la fraccioacuten periplaacutesmica Con
esta experiencia se determinoacute continuar con el meacutetodo de sacarosa 20 que si bien
no es con el que se consigue una mayor pureza de periplasma si es con el que se detecta
mayor actividad DMO
313 Adicioacuten de Cloruro soacutedico
Al tampoacuten de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas se antildeadioacute NaCl 200 mM En
este caso por un lado se recogioacute la fraccioacuten periplaacutesmica y por otro los esferoplastos
obtenidos se disgregaron en TrisHCl 30 mM y MgCl2 10 mM y se pasoacute tres veces por la
Prensa de French se ultracentrifugoacute (70000 xg 1 hora 4degC) y se recogioacute el sobrenadante
que conteniacutea la fraccioacuten citoplasmaacutetica En paralelo se realizoacute un fraccionamiento
subcelular de fraccioacuten periplaacutesmica y de fraccioacuten citoplasmaacutetica habitual En ambos
Figura 20 Efecto de la concentracioacuten de sacarosa en el proceso de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas Al tampoacuten de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas TrisHCl 30 mM pH 8 sacarosa 20 EDTA 4 mM lisozima 05 mgml y PMSF 1 mM se modificoacute la concentracioacuten de sacarosa (20 10 5 y 0) y se procedioacute como indica el protocolo Los datos obtenidos para cada extraccioacuten fueron Tampoacuten con sacarosa 20 Aconitasa 3728x108 Umg Nitrato reductasa 31351 Umg y DMO 11246 Umg Tampoacuten con sacarosa 10 Aconitasa 2950x108 Umg Nitrato reductasa 47348 Umg y DMO 8974 Umg Tampoacuten con sacarosa 5 Aconitasa 255x108 Umg Nitrato reductasa 22156 Umg y DMO 8123 Umg Tampoacuten con sacarosa 0 Aconitasa 4080x108 Umg Nitrato reductasa 1778 Umg y DMO 6148 Umg
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
96
casos se realizaron los ensayos enzimaacuteticos de aconitasa nitrato reductasa y D-malato
oxidasa (figura 21) Con los dos tratamientos se encuentra maacutes actividad aconitasa
(actividad tipo de citoplasma) en la fraccioacuten citoplasmaacutetica y la actividad nitrato
reductasa (actividad tipo de periplasma) aparece en su totalidad en la fraccioacuten
periplaacutesmica Estos datos indican que ambas fracciones estaacuten muy poco contaminadas
la una con la otra lo que resulta cuanto menos algo desconcertante ya que la D-malato
oxidasa aparece casi por igual en ambas fracciones si bien en el tratamiento con NaCl
aparece en una proporcioacuten muy alta en el citoplasma Ademaacutes la actividad especiacutefica
de la DMO es mayor al antildeadir sal al tampoacuten
314 Modificaciones del protocolo del kit comercial peripreps periplasting de epicentre
1 ml de cultivo bacteriano incubado durante la noche se centrifugoacute y el
precipitado se disgregoacute en 50 μl de Tampoacuten denominado PeriPreps Periplasting
(TrisHCl 200 mM pH 75 sacarosa 20 EDTA 1 mM y 30 Uμl de lisozima) Se incuboacute
durante 5 minutos a temperatura ambiente A continuacioacuten se antildeadieron 50 μl de agua
friacutea purificada y se incuboacute en hielo durante 5 minutos maacutes Se centrifugoacute durante dos
minutos a temperatura ambiente Se transfirioacute el sobrenadante que contiene la
fraccioacuten periplaacutesmica a un vial limpio El precipitado se disgregoacute en 100 μl de Tampoacuten
de lisis (TrisHCl 10 mM pH 75 KCl 50 mM EDTA 1 mM desoxicolato 01
Figura 21 Efecto del NaCl en el proceso de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas Al tampoacuten de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas TrisHCl 30 mM pH 8 sacarosa 20 EDTA 4 mM lisozima 05 mgml y PMSF 1 mM se antildeadioacute NaCl 200 mM en concentracioacuten final y se procedioacute como indica el protocolo Los datos obtenidos para cada extraccioacuten fueron A Tampoacuten sin modificaciones Fraccioacuten periplaacutesmica (azul) Aconitasa 3472x107 Umg Nitrato reductasa 6703x104 Umg y DMO 2009 Umg Fraccioacuten citoplasmaacutetica (naranja) ) Aconitasa 2538x108 Umg Nitrato reductasa 0 Umg y DMO 2453 Umg B Tampoacuten con NaCl 200 mM Fraccioacuten periplaacutesmica (azul) Aconitasa 3382x107 Umg Nitrato reductasa 1170x105 Umg y DMO4348 Umg Fraccioacuten citoplasmaacutetica (naranja) ) Aconitasa 1934x108 Umg Nitrato reductasa 0 Umg y DMO 22957 Umg
A
B
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
97
endonucleasa 400 U y MgCl2 100 mM) y se mantuvo a temperatura ambiente durante
5 minutos transcurridos los cuales se centrifugoacute durante 5 minutos a temperatura
ambiente se recogioacute el sobrenadante que conteniacutea la fraccioacuten de esferoplastos y se
antildeadioacute EDTA 10 mM para quelar el magnesio Sobre este protocolo se realizaron las
modificaciones que se detallan a continuacioacuten
3141 Adicioacuten de glicerol y Zinc
Al agua purificada se le antildeadieron en concentracioacuten final glicerol 5 y ZnCl2 4
mM solo glicerol 5 o solo ZnCl2 4mM Como control se utilizaron los resultados
obtenidos siguiendo las indicaciones del protocolo del fabricante (EPICENTRE) sin
modificar (figura 22A) en el cual la actividad aconitasa (indicadora de citoplasma) se
encontroacute mayoritariamente en el citoplasma la actividad nitrato reductasa (actividad
tipo de periplasma) apareciacutea en la fraccioacuten periplaacutesmica y la actividad D-malato oxidasa
apareciacutea en maacutes de un 75 en el periplasma En los ensayos con modificaciones los
resultados para la actividad aconitasa (figuras 22B 22C y 22D) fueron similares en las
tres extracciones encontraacutendose esta actividad de manera predominante en la
fraccioacuten citoplasmaacutetica En cuanto a la nitrato reductasa cabe destacar que en los
procedimientos en los que se utilizoacute glicerol 5 los ensayos enzimaacuteticos dieron
resultado negativo (figuras 22B y 22C) de lo que se deduce que el glicerol debe afectar
al ensayo de esta enzima Sin embargo al antildeadir ZnCl2 4 mM al agua purificada la
nitrato reductasa reaparecioacute casi en su totalidad en la regioacuten del citoplasma (figura
25D) En los tres casos en los que se realizaron las modificaciones al protocolo original
la actividad D-malato oxidasa aparece en la fraccioacuten citoplasmaacutetica Al no tener
referencias de la actividad nitrato reductasa excepto en el caso de la adiccioacuten de ZnCl2
4 mM al agua purificada se puede afirmar que el fraccionamiento subcelular no es
efectivo
Se repitioacute la experiencia soacutelo con glicerol 5 pero en esta ocasioacuten a la fraccioacuten
citoplasmaacutetica se la sometioacute a tres ciclos de Prensa de French (950 psi) y se
ultracentrifugoacute la fraccioacuten (41000 rpm a 4degC durante una hora) con lo que se obtuvo
un sobrenadante correspondiente a fraccioacuten citoplasmaacutetica y el precipitado se
disgregoacute en Tampoacuten TrisHCl 50 mM y se realizaron sobre las tres fracciones obtenidas
(periplasma citoplasma y membranas) los ensayos enzimaacuteticos correspondientes
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
98
(figura 23) aunque se decidioacute no realizar el ensayo estaacutendar de la actividad Nitrato
Reductasa (actividad tipo de fraccioacuten periplaacutesmica) ya que no habiacutea dado ninguacuten
resultado en las pruebas anteriores El resultado del meacutetodo sin modificacioacuten es muy
similar al de resto de ocasiones (figura 23A) en el que la actividad aconitasa (indicadora
de fraccioacuten citoplasmaacutetica) alcanza casi un 70 de actividad en el citoplasma en
comparacioacuten con el resto de fracciones periplasma y membranas La actividad D-
Malato oxidasa por su parte tiene mayor relevancia en la fraccioacuten periplaacutesmica En
cuanto al ensayo que se realizoacute antildeadiendo glicerol 10 al protocolo original (figura
23B) el resultado fue el siguiente la actividad aconitasa se detectoacute principalmente en
la fraccioacuten citoplasmaacutetica pero en comparacioacuten con el control disminuyoacute mucho en la
fraccioacuten periplaacutesmica y se observoacute por el contrario un ligero aumento en la fraccioacuten de
membranas En cuanto a la actividad D-malato oxidasa eacutesta actividad se detectoacute casi
por completo en membranas disminuyendo considerablemente en el periplasma y en
el citoplasma si se compara con los resultados del control A la vista de estos
resultados cabriacutea la posibilidad de que la D-malato oxidasa fuera una proteiacutena anclada
a la membrana interna del lado periplaacutesmico puesto que al antildeadir el glicerol al ensayo
se produce una concentracioacuten de actividad en las membranas Esto puede deberse a
que el glicerol favorece la compactacioacuten de las proteiacutenas haciendo maacutes estables las
interacciones membrana-proteiacutena(146)
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
99
Figura 22 Efecto del glicerol y del Zinc en el proceso de extraccioacuten de proteiacutenas periplaacutesmicas Al agua purificada friacutea se le antildeadioacute glicerol 5 o ZnCl2 4 mM o ambos y se continuoacute con el protocolo tal y como indica el fabricante (EPICENTRE) Los resultados obtenidos se compararon con los resultados del protocolo sin modificar Los datos obtenidos para cada extraccioacuten fueron A Protocolo sin modificaciones Fraccioacuten periplaacutesmica (azul) Apenas aparecioacute actividad aconitasa indicadora de fraccioacuten citoplasmaacutetica sin embargo la nitrato reductasa aparece mayoritariamente en esta fraccioacuten La actividad DMO se encuentra en mayor porcentaje en el periplasma Fraccioacuten citoplasmaacutetica (naranja) La actividad aconitasa es predominante en este fraccioacuten apenas hay presencia de actividad Nitrato Reductasa y hay actividad D-malato oxidasa pero esta es inferior que en la fraccioacuten periplaacutesmica B Agua con glicerol 5 y ZnCl2 4 mM La actividad aconitasa predomina en el citoplasma la actividad nitrato reductasa no funcionoacute en ninguna fraccioacuten ensayada y la actividad D-malato oxidasa aparecioacute mayoritariamente en la fraccioacuten citoplasmaacutetica C Agua con glicerol 5 Similar resultado al anterior la actividad nitrato reductasa no obtuvo resultado en el ensayo la actividad aconitasa predominaba en citoplasma al igual que la actividad D-malato oxidasa D Agua con ZnCl2 4 mM La actividad aconitasa y nitrato reductasa aparecieron en la faccioacuten citoplasmaacutetica la actividad D-malato oxidasa aparecioacute mayoritariamente en el citoplasma En B C y D el resultado de la localizacioacuten de la DMO fue casi ideacutentico apareciacutea en una proporcioacuten mayor en citoplasma aunque tambieacuten existiacutea presencia en la fraccioacuten citoplasmaacutetica AC Aconitasa NR Nitrato Reductasa DMO D-Malato oxidasa
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
100
4 ESTABILIZACIOacuteN DE LOS EXTRACTOS
Para hallar la mejor forma de conservar los extractos a lo largo del tiempo y
prolongar asiacute la vida uacutetil de la DMO un mismo extracto de proteiacutena de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 parcialmente purificado se sometioacute a distintos
tratamientos de conservacioacuten Se seleccionaron como aditivos para evitar la peacuterdida
de actividad glicerol 10 EDTA 2 mM e Inhibidor de proteasas (Roche) Estas muestras
se mantuvieron durante los diacuteas que duroacute el experimento bien refrigeradas (4degC) o
bien congeladas (-20degC) de manera paralela La actividad de las distintas aliacutecuotas se
comproboacute por electroforesis nativa en geles de poliacrilamida (ver material y meacutetodos)
Los resultados obtenidos se muestran en la figura 24 Se puede concluir que las
Figura 23 Efecto del glicerol en el fraccionamiento subcelular utilizando el kit comercial de Epicentre Al agua purificada friacutea se le antildeadioacute glicerol 10 y se continuoacute con el protocolo tal y como indica el fabricante (EPICENTRE) Ademaacutes los esferoplastos obtenidos fueron sometidos a rotura a traveacutes de la Prensa de French (3 ciclos) y se realizoacute una ultracentrifugacioacuten (41000 rpm 1 hora 4degC) que separoacute la fraccioacuten citoplasmaacutetica (sobrenadante) de las membranas (pella) siendo esta uacuteltima fraccioacuten disgregada en Tampoacuten TrisHCl 50 mM Los resultados obtenidos se compararon con los resultados del protocolo sin modificar A Protocolo sin modificaciones Fraccioacuten periplaacutesmica (azul) La actividad Aconitasa alcanza el 25 del total de la actividad (3819 x 107 Umg) mientras que la actividad DMO alcanza en esta fraccioacuten maacutes del 65 (3658 Umg) Fraccioacuten citoplasmaacutetica (rojo) La actividad aconitasa es predominante en esta fraccioacuten (1000 x 108 Umg) y se detecta actividad D-malato oxidasa pero esta es inferior que en la fraccioacuten periplaacutesmica aproximadamente de un 22 del total (1211 Umg) Fraccioacuten membranas (verde) Se registraron bajos iacutendices de actividad tanto de Aconitasa como de D-malato Oxidasa (1043 x 107 Umg y 586 Umg respectivamente) B Agua con glicerol 10 Fraccioacuten periplaacutesmica (azul) La actividad Aconitasa apenas se detectoacute en esta fraccioacuten en comparacioacuten con el resto de fracciones aunque muy similar al dato obtenido en el ensayo sin modificacioacuten (3840 x 107 Umg) La actividad DMO apenas alcanza en esta fraccioacuten un 12 del total (2440 Umg) Fraccioacuten citoplasmaacutetica (rojo) La actividad aconitasa es predominante en esta fraccioacuten al igual que ocurriacutea con el ensayo control (1751 x 109 Umg) y se detecta actividad D-malato oxidasa similar a la que se detectoacute en la fraccioacuten periplaacutesmica (3000 Umg) Fraccioacuten membranas (verde) La actividad aconitasa detectada en esta fraccioacuten fue mayor que en la fraccioacuten periplaacutesmica pero sin apenas relevancia si se compara con el dato de activdad que se obtuvo en el citoplasma (1696x 108 Umg) La actividad DMO en membranas registroacute su mayor dato (163 Umg) AC Aconitasa NR Nitrato Reductasa DMO D-Malato oxidasa
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
101
muestras pierden su actividad mantenidas a 4degC con EDTA o con inhibidor de
proteasas (calles 3 y 4 respectivamente de la figura 24 de los distintos diacuteas) mientras
que muestra refrigerada pero mantenida con glicerol 10 conserva su actividad hasta
el diacutea 14 aunque en este diacutea la intensidad de la sentildeal en el gel se ve disminuida (columna
2 figura 24) La mayor resistencia al paso del tiempo la presentan las muestras
congeladas (columnas 5 de la figura 24) sin tratamiento alguno y con 10 glicerol
(columnas 6 Figura 24) Tras 29 diacuteas de congelacioacuten la uacutenica parte aliacutecuota que
mantuvo actividad DMO fue la que conteniacutea glicerol al 10 (calle 6 Figura 24 DIacuteA 29)
Este resultado tiene sentido ya que la estabilidad de las proteiacutenas en solucioacuten
acuosa se mejora rutinariamente con codisolventes como el glicerol De hecho se sabe
que el glicerol cambia el conjunto de proteiacutenas nativas a estados maacutes compactos Esto
se debe a que el glicerol actuacutea como una interfaz anfifiacutelica entre la superficie hidrofoacutebica
de la proteiacutena y el disolvente polar Ademaacutes las interacciones electroestaacuteticas que se
producen entre la superficie de la proteiacutena y las moleacuteculas de glicerol desplazan a la
proteiacutena a conformaciones maacutes compactas (146)
Las proteiacutenas a menudo se congelan para mejorar su estabilidad ya que pueden
sufrir degradaciones que conllevan la peacuterdida de la actividad bioloacutegica aunque durante
la congelacioacuten el entorno fiacutesico de una proteiacutena cambia draacutesticamente lo que lleva al
desarrollo de tensiones que afectan a la estabilidad de la misma La baja temperatura
la concentracioacuten de congelacioacuten y la formacioacuten de hielo contribuyen a la inestabilidad
de las proteiacutenas congeladas (147)
En este caso la D-malato oxidasa aguanta la congelacioacuten sin aditivos durante
aproximadamente medio mes pero por ejemplo se ha demostrado que la lactato
deshidrogenasa congelada sin aditivos perdiacutea casi por completo su actividad tras un diacutea
de almacenamiento sin embargo al antildeadir glutamato (02 M) o albuacutemina (01) la
actividad residual despueacutes de un diacutea fue del 50 del valor de precongelacioacuten inicial para
el primero y del 10 para el uacuteltimo respectivamente Cabe destacar que la estabilidad
de la enzima se incrementaba al incrementar la concentracioacuten de eacutesta (148) Otras
proteiacutenas como la catalasa o β-galactosidasa tambieacuten han exhibido peacuterdida de
actividad dependiente de la concentracioacuten y despueacutes de la congelacioacuten con una
recuperacioacuten significativamente mayor a una concentracioacuten maacutes alta (149)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
102
5 CARACTERIZACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD ENZIMAacuteTICA DMO
51 ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO
Con la enzima parcialmente purificada de P pseudoalcaligenes CECT 5344 se
realizaron ensayos de actividad tanto electroforesis nativa en geles de poliacrilamida
como espectrofotomeacutetricamente con diferentes sustratos como donadores de
electrones En concreto se utilizaron D-malato D-lactato DL-2-hidroxiglutarato
mesotartrato D-gluconato succinato DL-isocitrato polietilenglicol D-glucosa y etanol
todos a una concentracioacuten de 5 mM El resto de componentes de la mezcla de reaccioacuten
fueron los estaacutendar (Tampoacuten Trisglicina 50 mM pH 9 INT 2 mM ZnCl2 2 mM y agua
hasta alcanzar 1 ml para los ensayos espectrofotomeacutetricos y 5 ml para las soluciones de
tincioacuten de los distintos geles de poliacrilamida) Para cada ensayo se utilizaron
aproximadamente 55 μg de proteiacutena Con ambas teacutecnicas se obtuvieron resultados
Figura 24 Efecto de diferentes tratamientos sobre la conservacioacuten de la actividad DMO Los extractos de proteiacutena de P pseudoalcaligenes CECT 5344 parcialmente purificados sometido a distintos tratamientos de conservacioacuten muestras mantenidas a 4degC 1 Sin aditivos 2 glicerol 10 3 EDTA 2 mM y 4 Inhibidor de proteasas muestras mantenidas a -20degC 5 Sin aditivos 6 glicerol 10 7 EDTA 2 mM y 8 Inhibidor de proteasas El tratamiento con el que se obtuvo una mayor vida uacutetil de la actividad DMO fue conservando los extractos a -20degC y con un 10 de glicerol
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
103
similares (Tabla 8) La actividad D-malato oxidasa puede utilizar como donadores de
electrones ademaacutes de D-malato D-lactato DL-2-hidroxiglutarato y D-gluconato si bien
este uacuteltimo solo fue apenas detectado por el meacutetodo espectrofotomeacutetrico que como
ya se ha mencionado con anterioridad es maacutes sensible y ademaacutes proporciona una
estimacioacuten cuantitativa de los ensayos enzimaacuteticos Como se observa en la tabla 8 y en
la figura 25 la maacutexima actividad especiacutefica se detecta con el D-malato razoacuten por la que
se mantuvo el nombre de D-malato oxidasa para esta enzima El siguiente paso
consistioacute en calcular la Km de la proteiacutena para esos sustratos
Tabla 8 Diferentes compuestos sobre los que se ensayoacute la actividad DMO Se realizoacute una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida 75 Se realizaron los ensayos enzimaacuteticos estaacutendar (ver material y meacutetodos) con diferentes sustratos como donadores de electrones en concentracioacuten 5 Mm 1 D-malato 2 D-lactato 3 DL-2-hidroxiglutarato 4 Mesotartrato 5 D-gluconato 6 Succinato 7 DL-isocitrato 8 Polietilenglicol 9 D-glucosa 10 Etanol La sentildeal de formazaacuten en el gel de poliacrilamida es maacutes intensa con el D-malato (1) seguido del DL-2-hidroxiglutarato (3) y con menor intensidad el D-lactato (2)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
104
El descubrimiento de que la actividad D-malato oxidasa es capaz de utilizar D-2-
hidroxiglutarato (tabla 8 columna 3) ademaacutes de D-malato relaciona esta actividad con
la D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa de P stutzeri A1501 (WP_09119116351) que
juega un doble papel en la biosiacutentesis de L-serina y en la utilizacioacuten de D-malato al
convertirlo en oxalacetato Sin embargo esta enzima no presenta actividad con D-
lactato ni con otros 2-hidroxiaacutecidos (92)
En humanos la acumulacioacuten de D-2-hidroxiglutarato en la orina estaacute relacionada
con determinados tipos de caacutencer (9697) En la mayoriacutea de los casos esta aciduria es
el resultado de mutaciones de peacuterdida de funcioacuten en el gen D2HGDH que codifica a una
D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa (NP_6899964) una enzima mitocondrial En
Saccharomyces cerevisiae se han descubierto dos D-lactato deshidrogenasas (Dldacutes)
homologas a esta proteiacutena humana la Dld2 (NP_0101031) ubicada en la mitocondria
y la Dld3 (NP_0108431) localizada en el citosol Aunque estas dos enzimas estaacuten
anotadas como D-lactato deshidrogenasas Dld2 muestra su maacutexima actividad con D-
2HG mientras que la Dld3 ademaacutes de tener maacutexima actividad con D-2HG tambieacuten
presenta una elevada actividad con D-malato cuya estructura molecular es muy similar
al D-2HG (tiene 4 carbonos en su esqueleto carbonatado en lugar de 5) y ambas en
menor medida presentan actividad con D-lactato (97) Estos resultados son muy
parecidos a los obtenidos en este trabajo con la DMO (Figura 25)
La capacidad de oxidacioacuten del D-lactato independiente de NAD(P)H por parte de
la DMO de P pseudoalcaliacutegenes CECT 5344 (tabla 8 columna 2) tambieacuten se encuentra
en otras D-lactato deshidrogenasas de diversos microorganismos teles como P putida
Como donadores de electrones se emplearon diferentes compuestos en concentracioacuten final de 5 mM La maacutexima actividad especiacutefica se detectoacute con D-malato (2830 Umg) Las barras de error representan la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en 4 ensayos independientes 0
20
40
60
80
100
120
Activ
idad
rela
tiva
DMO
()
[sustrato] 5 mM
Figura 25 Especificidad de sustrato de la actividad DMO
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
105
(NP_746845) (98) Arabidopsis thaliana (At5g06580) (101) o Archaeoglobus fulgidus
(KUJ943681) (137)
Una vez demostrado que el D-malato es el sustrato de todos los probados con
el que la enzima muestra mayor actividad especiacutefica (tabla 8 y figura 25) se determinoacute
su KM de manera experimental Para ello se realizaron los ensayos enzimaacuteticos
estaacutendar con extractos de P pseudoalcaligenes parcialmente purificados con distintas
concentraciones de D-malato Los resultados experimentales obtenidos fueron que la
KM para D-malato es de 0674plusmn0067 mM (figura 26)
Posteriormente se realizaron los mismos ensayos enzimaacuteticos para determinar
de manera experimental la KM de la enzima con los otros sustratos La KM para el DL-
α-hidroxiglutarato (D-2-HG) y el D-lactato fue de 14869 plusmn 4616 microM y 1360 plusmn 0473 mM
respectivamente (Figura 27)
Figura 26 Caacutelculo de la KM de la DMO para el D-malato
y = 27112x + 40188Rsup2 = 09828
-20
0
20
40
60
80
100
-2 -1 0 1 2
1V
0
1[S] (mM)
D-malato
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6
AE
(U
mg)
[sustrato] mM
D-malato
A B
A Representacioacuten directa de la actividad DMO a distintas concentraciones de D-malato B Determinacioacuten graacutefica de la KM de la DMO para el D-malato mediante representacioacuten de Lineweaver-Burk (124) Todos los experimentos se llevaron a cabo con INT 2 mM con aceptor de electrones Las barras de error representan la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en dos ensayos independientes
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
106
En principio una menor KM para un determinado sustrato significa una mayor
afinidad por el mismo y por lo tanto que la enzima seraacute activa a concentraciones bajas
de ese sustrato (123) La menor KM de la DMO fue para el D2HG Sin embargo hay que
tener en cuenta que para la determinacioacuten de la KM se utilizoacute la mezcla raceacutemica por lo
que eacutesta debe ser auacuten menor aunque cabe destacar que tal y como se refleja en la tabla
9 este resultado es mucho menor a los obtenidos en otras D-2-hidroxiglutarato
deshidrogenasa de distintos organismos para este mismo sustrato
Por otra parte la velocidad maacutexima se obtuvo con D-malato La eficiencia
cataliacutetica es el cociente entre la velocidad maacutexima y la KM por lo que para conocer el
papel fisioloacutegico de esta enzima es necesario conocer otros datos como su localizacioacuten
intracelular inducibilidad sintenia del gen otros sustratos fisioloacutegicos etc Esto se
analizaraacute en los siguientes apartados Sin embargo cabe destacar que como se ha
indicado en la introduccioacuten a la enzima homoacuteloga de Pseudomonas stutzeri se le ha
atribuido un papel en la asimilacioacuten de D-malato y en la siacutentesis de serina (9295) Esta
0
5
10
15
20
25
0 200 400 600 800 1000
AE
(U m
g-1)
[DL-α-hidroxiglutarato] μM
y = 13258x + 89167Rsup2 = 09731
-50
0
50
100
150
200
250
-0075 -0025 0025 0075
1V 0
1[DL-α-HIDROXIGLUTARATO] (microM)
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6
AE
(U m
g-1)
[D-lactato] mM
y = 15136x + 11175Rsup2 = 09758
-50
0
50
100
150
200
250
300
-1 -05 0 05 1
1V 0
1[D-lactato] (mM)
Figura 27 Determinacioacuten experimental de los valores de KM de la DMO Para los sustratos DL-α-hidroxiglutarato (A) y (B) 14869plusmn4616 microM y D-lactato (C) y (D) 1360plusmn0473 mM Las barras de error representan la desviacioacuten estaacutendar de los resultados obtenidos en dos ensayos independientes
A B
C D
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
107
enzima tambieacuten tiene una KM maacutes baja pare el D-2-HG que para el D-malato aunque
siempre con un aceptor artificial de electrones (DCPIP)
La tabla 9 resume los valores de KM de la DMO para los distintos sustratos
obtenidos en este trabajo en comparacioacuten con algunos datos bibliograacuteficos Mientras
que la DMO de P pseudoalcaligenes presenta una KM para el d-malato de 066plusmn007
mM la D2HGDH de P stutzeri tiene menos afinidad por este sustrato (361Dagger014 mM)
En cuanto al sustrato d-lactato es el sustrato con menor afinidad en todos los casos
52 OXALACETATO COMO POSIBLE PRODUCTO DE LA OXIDACIOacuteN DE D-MALATO
Se partioacute de la hipoacutetesis que la oxidacioacuten independiente de NAD(P)H del malato
produciriacutea oxalacetato y este oxalacetato seriacutea oxidado por la Malato deshidrogenasa
Tabla 9 Comparativa de Valores de KM de DMO de P pseudoalcaligenes con diferentes enzimas y sustratos Enzima Sustrato KM (mM) Referencia
DMO (CDM425861) de P
pseudoalcaligenes
D-malato 066 plusmn 007 Este trabajo
DL-2-HG 0015 plusmn 0004
D-lactato 136 plusmn 047
D2HGDH (WP_09119116351) de P
stutzeri
D-malato 361 plusmn 014 (92)
D-2-HG 017 plusmn 002
D2HGDH (AT4G36400) de A
thaliana
D-2-HG 058 (150)
Dld2 (NP_0101031) de S cerevisiae D-2-HG 003 plusmn 001 (97)
D-lactato 521 plusmn 023
Dld3 (NP_0108431) de S cerevisiae D-2-HG 013 plusmn 001
D-lactato 053 plusmn 014
DLDH (At5g06580) de A thaliana D-lactato 0164 (101)
DMO D-malato oxidasa D2HGDH D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa DLDHDld D-lactato deshidrogenasa
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
108
de E coli formando L-malato y utilizando como donador de electrones NADH (151) Para
determinar cuaacutel era el producto de la reaccioacuten catalizada por la DMO se utilizaron
proteiacutena DMO parcialmente purificada 2 mM de D-malato como sustrato y 02 mM de
INT como aceptor de electrones dejando que la reaccioacuten transcurriera hasta el final La
posible acumulacioacuten de oxalacetato se determinoacute en una reaccioacuten acoplada con malato
deshidrogenasa (MDH) midiendo la desaparicioacuten de NADH Al antildeadir a la mezcla de
reaccioacuten el NADH (200 microM en concentracioacuten final) se observoacute una DO340NADH = 0967
al antildeadir 1 microl de DMH eacutesta disminuyoacute a DO340NADH = 0835 Tomando como coeficiente
de extincioacuten molar del NADH Ɛ340 NADH = 6220 M-1cm-1 esta bajada supondriacutea que
habriacutean desaparecido 2129 microM de NADH lo que seriacutea equivalente al oxalacetato
producido (Figura 28A)
El oxalacetato por tanto parece ser el producto de la oxidacioacuten del D-malato
(figura 28B) de hecho la D2HGDH (WP_011911631) de P stutzeri que presenta un
90 de identidad con la DMO (CDM425861) de P pseudoalcaligenes cataliza la α-
deshidratacioacuten de D-malato a oxalacetato pero no la β-descarboxilacioacuten de d-malato a
piruvato (92)
Figura 28 Formacioacuten de oxalacetato (OAA) como producto de la oxidacioacuten del D-malato reaccioacuten catalizada por la DMO A Reaccioacuten acoplada a la desaparicioacuten de NADH por accioacuten de la malato deshidrogenasa Una primera reaccioacuten se llevoacute a cabo con proteiacutena DMO parcialmente purificada y utilizando como sustrato 2 mM de D-malato y como aceptor de electrones 02 mM de INT Se produjeron aproximadamente 25 microM de oxalacetato los cuales fueron utilizados por la MDH al antildeadir NADH como cofactor la desaparicioacuten del NADH que se percibioacute por la bajada de absorbancia medida a 340 nm (de 0967 bajoacute a 0835) que es proporcional al oxalacetato originado por la reaccioacuten de la DMO B Esquema de la oxidacioacuten de D-malato catalizada por la DMO acoplada al consumo de NADH producido por la oxidacioacuten catalizada por la MDH del oxalacetato a L-malato MDH Malato deshidrogenasa DMO D-malato oxidasa OAA Oxalacetato
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
109
53 RECONSTITUCIOacuteN FISIOLOacuteGICA DE LA ACTIVIDAD DMO CITOCROMO C COMO POSIBLE ACEPTOR DE ELECTRONES
La D-lactato deshidrogenasa (At5g06580) de Arabidopsis thaliana que se
localiza en el espacio intermembranal mitocondrial y es ortoacuteloga de la DMO de P
pseudoalcaligenes utiliza como aceptor fisioloacutegico de electrones el citocromo c (101)
Dado que la DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 tambieacuten utiliza D-lactato como
sustrato y ademaacutes se encuentra en el periplasma el siguiente paso fue probar si el
citocromo c moleacutecula soluble en el periplasma (152153) actuacutea como aceptor de
electrones en la reaccioacuten catalizada por la DMO
Para analizar la posibilidad de que el citocromo c sea el aceptor fisioloacutegico de los
electrones procedentes de la oxidacioacuten del D-malato se midioacute la actividad DMO en
proteiacutena recombinante parcialmente purificada de P pseudoalcaligenes CECT 5344 con
la reaccioacuten estaacutendar (Tampoacuten TrisGly 50 mM pH 9 ZnCl2 D-malato 5 mM) pero con
distintas concentraciones de citocromo c y se midioacute por espectrofotometriacutea a una
longitud de onda de 550nm Se detectoacute una actividad maacutexima de la actividad DMO con
una concentracioacuten de 200 μM de citocromo c (figura 29A) Para los caacutelculos cineacuteticos se
tuvo en cuenta que el coeficiente de extincioacuten molar del citocromo es Ɛ550nm 212 mM-1
cm-1 (154) El valor experimental obtenido es de una KM 651 microM para el citocromo c
(figura 29B)
020406080
100120
20 50 100 200
d
e ac
tivid
ad
(U m
g-1)
[citocromo c] μM
y = 06351x + 001Rsup2 = 0944
-001
0
001
002
003
004
005
-004 -002 0 002 004 006
1V₀
1[citocromo c] microM
A B
Figura 29 Determinacioacuten experimental de los valores de la Km de la DMO para el citocromo c Se analizoacute la actividad DMO en extracto de proteiacutena recombinante parcialmente purificada con una AE de 5953 U mg-1 en reaccioacuten estaacutendar (Tris HClGly 50 Mm pH 9 INT 2 mM D-malato 5 mM y Zn2+ 2mM) (A) Representacioacuten graacutefica de la actividad DMO medida por espectrofotometriacutea (λ550 nm) utilizando distintas concentraciones de citocromo c (B) Determinacioacuten graacutefica de la Km de la DMO para el citocromo c mediante representacioacuten de Lineweaver-Burk (123) y cuyo valor es de 651 microM
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
110
Una vez comprobado espectrofotomeacutetricamente que la DMO oxida al D-malato
cediendo los electrones al citocromo c el siguiente paso fue analizar el papel fisioloacutegico
de eacuteste como aceptor de electrones natural de la DMO
La comprobacioacuten de la actividad de las membranas se realizoacute mediante un
ensayo acoplado de la MalatoQuinona oxidorreductasa (1154) con el resto de
componentes de la cadena de transporte electroacutenico que estaacute asociada a las
membranas y que tiene como uacuteltimo aceptor al oxiacutegeno (136) Por tanto utilizando el
oxiacutemetro de oxiacutegeno tipo Clark (Hansatech) se determinoacute el consumo de oxiacutegeno en
una disolucioacuten acuosa que conteniacutea 50 microl de tampoacuten TrisHCl 1 M pH 8 (concentracioacuten
final 50 mM) 10 μl de extracto de membranas (aproximadamente 400 μg) y agua
destilada hasta 1 ml la reaccioacuten se inicioacute al antildeadir 25 μl de L-malato 200 mM
(concentracioacuten final 5 mM) en la que el aparato detectoacute el consumo de oxiacutegeno Para
asegurar que este consumo de O2 era debido al proceso de respiracioacuten celular se
paralizoacute con 10 microl de KCN 200 mM (figura 30A)
La siguiente experiencia consistioacute en antildeadir al oxiacutemetro la mezcla de reaccioacuten
que conteniacutea membranas de P pseudoalcaligenes (aproximadamente 400 μg) tampoacuten
TrisHCl 50 mM pH 8 citocromo c (500 μM) y agua destilada (hasta alcanzar 1 ml) se
puso en marcha el oxiacutemetro y a continuacioacuten se antildeadioacute el sustrato D-malato en
concentracioacuten final 5 mM observaacutendose que el D-malato no es un donador directo de
electrones a la cadena de transporte electroacutenico Sin embargo el consumo de oxiacutegeno
se restauroacute al antildeadir 100 μl extracto de proteiacutena DMO recombinante parcialmente
purificada (aproximadamente 65 μg) (Figura 30B)
En un tercer caso la mezcla de reaccioacuten que conteniacutea membranas de P
pseudoalcaligenes (aproximadamente 400 μg) tampoacuten TrisHCl 50 mM pH 8 citocromo
c (500 μM) y agua destilada (hasta alcanzar 1 ml) se le antildeadioacute la proteiacutena DMO
parcialmente purificada aproximadamente 65 μg maacutes ZnCl2 2 mM Posteriormente se
incorporoacute D-malato en concentracioacuten final 5 mM con lo que se registroacute en el oxiacutemetro
un consumo de oxiacutegeno incluso mayor que en el caso anterior (figura 30 C)
En la tabla 10 se muestran los datos obtenidos en las tres experiencias y la
actividad de la proteiacutena D-malato oxidasa en comparacioacuten con el meacutetodo
espectrofotomeacutetrico La MalatoQuinona oxidorreductasa muestra en el oxiacutemetro una
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
111
pendiente de consumo de oxiacutegeno de 4506 (figura 30A) lo que se traduce en 36 mU de
actividad enzimaacutetica (Tabla 10 columna 1) A continuacioacuten se midioacute la actividad DMO
de la fraccioacuten parcialmente purificada espectrofotomeacutetricamente utilizando INT como
aceptor de electrones artificial tal y como se describe con anterioridad en este trabajo
dando un resultado de 3700 mU (AE 5600 Umg) (Tabla 10 columna 2) La actividad
enzimaacutetica calculada seguacuten el consumo de oxiacutegeno de la enzima D-malato oxidasa sin
ZnCl2 y con ZnCl2 fue de 10 mU y 31 mU respectivamente (Tabla 10 columnas 3 y 4)
Con estos datos se calculoacute el iacutendice de recuperacioacuten de la D-malato oxidasa respecto a
la actividad detectada de manera espectrofotomeacutetrica con lo que se comproboacute de
nuevo que el Zn2+ es un potente activador de esta actividad ya que en ausencia del
mismo soacutelo se produce un 27 de recuperacioacuten de la actividad mientras que su
presencia aumenta este valor en un 84 (Tabla 10 y Figura 31)
De estos resultados podriacuteamos sugerir que los electrones producidos por la
oxidacioacuten del D-malato son cedidos a la cadena de transporte electroacutenico a traveacutes del
citocromo c ya que ambas moleacuteculas se encuentran en el espacio periplaacutesmico De
hecho el citocromo tipo c es una moleacutecula transportadora de electrones con una
distribucioacuten relativamente amplia entre los procariotas que se localizan en el lado
periplaacutesmico de la membrana citoplasmaacutetica bacteriana unida a la membrana o
soluble en el espacio periplaacutesmico (153)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
112
Figura 30 Citocromo c como posible aceptor de electrones Consumo de oxiacutegeno registrado por el oxiacutemetro tipo Clark al antildeadir membranas de P pseudoalcaligenes (aproximadamente 400 μg) con distintas mezclas de reaccioacuten en un volumen final de 1 ml (A) Tampoacuten TrisHCl 50 mM pH 8 agua destilada L-malato 5 Mm Y Kcn 2Mm (que es un inhibidor de la cadena de transporte electroacutenico) con esta reaccioacuten se comproboacute la funcionalidad de las membranas (B) Tampoacuten TrisHCl 50 mM pH8 citocromo c (500 μM) agua destilada y extracto de proteiacutena DMO recombinante parcialmente purificada (100 μl aproximadamente 65 μg) se registroacute una pendiente de ndash 5070 que indica que se produjo consumo de oxiacutegeno (C) Tampoacuten TrisHCl 50 mM pH8 citocromo c (500 μM) agua destilada y extracto de proteiacutena DMO recombinante parcialmente purificada (aproximadamente 65 μg) y ZnCl2 2 mM El consumo de oxiacutegeno en esta ocasioacuten fue mayor registraacutendose una pendiente de -15390 con lo que se confirma que el Zn2+ es inductor de la actividad DMO y que el citocromo c podriacutea ser el aceptor fisioloacutegico de los electrones producidos por la oxidacioacuten del d-malato
DMO D-malato oxidasa
A B
C
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
113
Tabla 10 Reconstitucioacuten de la actividad D-malato oxidasa asociada a la respiracioacuten En la columna 1 se muestra la actividad enzimaacutetica de la Malatoquinona oxidorreductasa que cede los electrones producidos en oxidacioacuten del L-malato a oxalacetato a la cadena de transporte electroacutenico (fraccioacuten de membranas de P pseudoalcaligenes) (135) El resultado fue una actividad de 36 mU La columna 2 muestra la actividad DMO medida con el meacutetodo espectrofotomeacutetrico estaacutendar utilizando INT como aceptor artificial de electrones con una actividad enzimaacutetica de 37 mU que se tomoacute como referencia para calcular el iacutendice de recuperacioacuten de la actividad Columna 3 La actividad DMO sin Zn2+ medida con el oxiacutemetro fue de 10 mU lo que supone un 27 de actividad enzimaacutetica Columna 4 La actividad DMO con Zn2+ medida con el oxiacutemetro fue de 31 mU lo que supone un 84 de actividad enzimaacutetica
1 2 3 4
MQO (oxiacutemetro)
DMO (espectrofotoacutemetro)
DMO sin Zn2+
(Oxiacutemetro) DMO con Zn2+
(oxiacutemetro)
Actividad (mU) 36 37 10 31
Ā (mUμl) 18 037 01 031
actividad 97 100 27 84
MQO Malatoquinona oxidorreductasa DMO D-malato oxidasa
6 REQUERIMIENTO DE METALES
Los iones metaacutelicos son una parte importante de muchas proteiacutenas ya que
proporcionan funciones estructurales cataliacuteticas y de transferencia de electrones (155)
Muchas de las enzimas conocidas deben asociarse con un metal concreto para
funcionar como por ejemplo las oxidorreductasas en las que aproximadamente el
44 de las enzimas de esta familia son metaloproteiacutenas que utilizan principalmente
Fe2+ Cu2+ Mo2+ y en menor medida Mn2+ y Zn2+ como cofactores (156)
Antes de desarrollar el meacutetodo espectrofotomeacutetrico ya se sabiacutea que la actividad
D-malato oxidasa (DMO) era estimulada por el catioacuten bivalente metaacutelico Zn2+ tal y
como se refleja en el apartado anterior Sin embargo al disponer de un meacutetodo
espectrofotomeacutetrico para medir la actividad DMO se estudioacute cuantitativamente el
Figura 31 Iacutendice de recuperacioacuten de la actividad DMO Se tomoacute como 100 de la actividad DMO la actividad registrada mediante el meacutetodo espectrofotomeacutetrico estaacutendar utilizando INT como aceptor de electrones Se observa en la graacutefica que se produce mayor recuperacioacuten de la actividad al incorporar Zn2+ al ensayo realizado con el oxiacutemetro tipo Clark que en ausencia de este catioacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
114
efecto del EDTA y de diferentes metales en la actividad DMO de P pseudoalcaligenes
CECT 5344
61 EFECTO DEL EDTA
El efecto del EDTA sobre la actividad DMO se investigoacute utilizando tanto extractos
de proteiacutenas parcialmente purificados de P pseudoalcaligenes CECT 5344 como
extractos de la proteiacutena expresada en E coli (ver maacutes adelante) Para ello se realizaron
los experimentos estaacutendar (sin antildeadir Zn2+) de determinacioacuten de la actividad con
distintas concentraciones de EDTA Los resultados obtenidos indican que 05 μM de
EDTA es suficiente para inhibir el 100 de la actividad DMO de extractos parcialmente
purificados de P pseudoalcaligenes (figura 32A) mientras que cuando se expresa en E
coli eacutesta se inhibe maacutes del 90 al antildeadir 12 mM de EDTA (Figura 32B) La diferencia
en el porcentaje de inhibicioacuten se puede atribuir a que son extractos diferentes con
diferentes actividades especiacuteficas Sin embargo en ambos casos la actividad es
completamente inhibida por EDTA a partir de una determinada concentracioacuten
La inhibicioacuten de la actividad de metaloproteiacutenas por EDTA es de sobra conocida
(94) Por ejemplo la actividad D2HGDH (WP_0119116351) de P stutzeri A1501 se
inhibe parcialmente por EDTA (92) La adicioacuten de 1 mM de EDTA tambieacuten inhibe la
actividad D-2-HG basal de Ddl2 (NP_0108431) y Ddl3 (NP_0108431) de S cerevisiae en
maacutes de un 75 (97)
000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
noEDTA
02 04 05 1 2 20 200 2000
d
e ac
tivid
ad D
MO
(100
=
426
3 U
mg)
[EDTA] microM
P pseudoalcaligenes CECT 5344
000
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
noEDTA
02 04 08 1 12 16 2
d
e ac
tivid
ad D
MO
(1
00
= 47
40
Um
g)
[EDTA] mM
E coli XL1 con el plaacutesmido pGBN5_4044
Figura 32Efecto del EDTA en la actividad DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344
A B
La actividad DMO de (A) extractos parcialmente purificados de P pseudoalcaligenes CECT 5344 y de (B) la enzima expresada en E coli fue ensayada en presencia del aceptor artificial de electrones INT y de de D-malato en concentracioacuten final 25 mM y 5 mM respectivamente Se utilizoacute como control la reaccioacuten sin sustrato D-malato para eliminar el ruido de fondo El 100 de actividad en (A) fue de 4263 plusmn 980 U mg-1 En (B) el 100 se corresponde con una actividad DMO de 4740 plusmn 554 U mg-1 Las barras de error corresponden a la desviacioacuten tiacutepica de dos reacuteplicas
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
115
62 EFECTO DE CATIONES METAacuteLICOS DIVALENTES EN LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO)
El efecto de iones metaacutelicos sobre la actividad DMO fue analizado en extractos
parcialmente purificados de la enzima recombinante Para ello sobre el ensayo
estaacutendar (Tris glicina 50 mM pH9 INT 25 mM y D-malato 5 mM) se antildeadioacute 12 mM de
EDTA a la mezcla de reaccioacuten que es la miacutenima concentracioacuten de EDTA necesaria para
eliminar la actividad basal (Figura 32B) y a la que se supone que no queda nada de metal
disuelto ni unido a la enzima A continuacioacuten se intentoacute la reconstitucioacuten de la actividad
enzimaacutetica antildeadiendo distintos iones metaacutelicos a una concentracioacuten final de 2 mM
Como se muestra en la figura 33 a esta concentracioacuten el Zn2+ no solo restablece la
actividad sino que la incrementa respecto de la inicial Co2+ Mg2+ y Ca2+ tuvieron un
pequentildeo efecto activador sin recuperar la actividad inicial mientras que Fe2+ Cu2+ y
Mn2+ parecen ejercer un efecto inhibidor de la actividad
Ademaacutes de la D-lactato deshidrogenasa de Archaeoglobus fulgidus mencionada
con anterioridad que utiliza Zn2+ como cofactor (137157) existen otras enzimas
oxidorreductasas similares activadas por Zn2+ como la D-2HG mitocondrial de hiacutegado
de rata que es ademaacutes estimulada por otros cationes metaacutelicos divalentes (158) o la
D2HGDH de P stutzeri cuya actividad D-malato deshidrogenasa se activa por Zn2+ (10
μM) pero es inhibida a concentraciones superiores (10 mM) En esta uacuteltima el Ca2+ a
una concentracioacuten final de 10 mM tambieacuten tiene un efecto positivo sobre la actividad
Sin embargo Fe2+ y Co2+ inhiben la actividad (92) Por uacuteltimo en S cerevisiae la Dld2
triplica su actividad al antildeadir 5 μM de Zn2+ sin embargo al aumentar la concentracioacuten
hasta 50 μM el efecto estimulador disminuye (97) A diferencia de lo mostrado para la
DMO de Ppseudoalcaligenes CECT 5344 la actividad Dld2 de S cerevisiae no se ve
afectada con la presencia de los iones Co2+ Mn2+ Mg2+ y Ca2+ sin embargo la Dld3 ve
incrementada su actividad con Zn2+ y con Co2+ de manera similar tanto con 5 μM como
con 50 μM mientras que los iones Mn2+ Mg2+ y Ca2+ apenas afectan a la actividad (97)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
116
Dado que la D2HGDH de P stutzeri se inhibe a concentraciones muy altas de
Zn2+ (92) se plantearon experimentos para estudiar el efecto del Zn2+ a altas
concentraciones Para ello se utilizoacute nuevamente la enzima parcialmente purificada de
P pseudoalcaligenes CECT 5344 Se midioacute primero la actividad DMO sin Zn2+
comprobaacutendose a continuacioacuten si se inhibiacutea a una concentracioacuten de 2 mM de EDTA A
continuacioacuten se analizoacute la actividad antildeadiendo al ensayo estaacutendar distintas
concentraciones de Zn2+ (sin antildeadir EDTA) Con una concentracioacuten de 1 microM de Zn2+ se
incrementa 4 veces la actividad DMO mantenieacutendose al menos hasta una
concentracioacuten de 2 mM (figura 34) Concentraciones superiores no resultaron
inhibitorias Asiacute pues a partir de este momento se antildeadioacute a la mezcla de reaccioacuten usada
para los anaacutelisis espectrofotomeacutetricos de la actividad DMO 2 mM de cloruro de Zinc
0
20
40
60
80
100
120
140
Nometal
NoEDTA
EDTA Znsup2⁺ Fesup2⁺ Cosup2⁺ Cusup2⁺ Mnsup2⁺ Mgsup2⁺ Casup2⁺
Porc
enta
je d
e ac
tivid
ad D
MO
(U m
g pr
oteiacute
na-1
)
Figura 33 Efecto de algunos iones metaacutelicos divalentes en la actividad DMO La actividad DMO de la D-malato oxidasa recombinante parcialmente purificada fue analizada en ausencia de metales y de EDTA Posteriormente fue analizado el efecto de EDTA en concentracioacuten final de 12 mM Una vez inhibida la actividad DMO se analizoacute la actividad en presencia del ion metaacutelico indicado en concentracioacuten final 2 mM En todos los casos se incluyeron 25 mM de INT 5 mM de D-malato y 12 mM de EDTA Se comproboacute que el Zn2+ aumentaba la actividad de la DMO en un 20 en relacioacuten con la actividad que se detectoacute al realizar el ensayo estaacutendar sin metales y sin EDTA
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
117
63 EFECTO DEL CIANURO SOBRE LA ACTIVIDAD DMO
Es conocida la utilizacioacuten del cianuro por parte de P pseudoalcaligenes CECT
5344 como uacutenica fuente de nitroacutegeno (44136) Por otra parte como se ha indicado al
principio de este bloque el DL-malato es la fuente de carbono con la que la asimilacioacuten
de cianuro por parte de esta bacteria es maacutes eficiente (136) Por lo tanto parece
pertinente estudiar coacutemo afecta este compuesto a la actividad DMO
Se realizaron los ensayos de medida de actividad en presencia y ausencia de Zn2+
y de cianuro ambos en concentracioacuten final 2 mM (figura 35) Los resultados obtenidos
sugieren que el cianuro inhibe aproximadamente un 75 la actividad DMO Sin
embargo dicha actividad se restaura en parte mediante la adicioacuten de Zn2+ Tanto la
inhibicioacuten de la enzima por cianuro como la reactivacioacuten por el metal estaacute de acuerdo
con el consenso general de que el cianuro es un potente inhibidor de muchas
metaloenzimas (56) El hecho de que la inhibicioacuten no sea completa asiacute como la
reactivacioacuten por Zn2+ hace necesario estudiar el efecto del cianuro en la asimilacioacuten de
D-malato in vivo que estudiaremos maacutes adelante
0
100
200
300
400
500
600
No metal EDTA 1 10 25 250 500 2000
d
e Ac
tivid
ad(U
mg-1
)
[Zn2+] μMFigura 34 Efecto del Zn2+ sobre la actividad DMO La actividad DMO fue medida espectrofotomeacutetricamente en ausencia (100) y presencia de concentraciones entre 1 y 2000 microM de Zn2+Se emplearon extractos parcialmente purificados de proteiacutena de P pseudoalcaligenes Ademaacutes se comproboacute el efecto del EDTA en concentracioacuten final de 2 mM Los valores mostrados en las barras de error corresponden a la desviacioacuten tiacutepica de dos ensayos independientes Se considera el 100 a la AE = 1283 plusmn 074 U mg-1
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
118
64 ESTABILIZACIOacuteN DE LA PROTEIacuteNA POR Zn2+
Como ya se ha mostrado en el apartado de estabilizacioacuten la actividad DMO
oxidasa es muy sensible al paso del tiempo perdiendo actividad paulatinamente y tras
someterla a procesos de congelacioacuten y descongelacioacuten (figura 24) Uno de los
mecanismos de conservacioacuten de la vida uacutetil de la enzima se trata de incluir en los
tampones en los que se hayan purificadas los cofactores metaacutelicos de la enzima para
que eacutesta no pierda actividad por ejemplo la arginasa humana para cuya purificacioacuten
se hace necesaria la presencia en todas las soluciones utilizadas de concentraciones
apreciables del ion Mn+2 (159)
Para determinar si el Zn2+ influye sobre la estabilidad de la actividad DMO se
antildeadieron concentraciones crecientes de Zn2+ a diferentes aliacutecuotas de extractos de
proteiacutena de P pseudoalcaligenes CECT 5344 parcialmente purificada (sin precipitar por
sulfato amoacutenico) y se incubaron a 50degC y se monitorizoacute su comportamiento a lo largo
del tiempo (Figura 36) En todos los casos la actividad disminuyoacute a lo largo del tiempo
en comparacioacuten con la aliacutecuota control sin tratamiento teacutermico Aunque la actividad
Figura 35 Efecto del cianuro sobre la actividad DMO Se midioacute la actividad DMO en extracto de proteiacutena recombinante DMO parcialmente purificada en ensayo estaacutendar (100 mM Tris HClglicina pH 9 2 mM INT y 5 mM d-malato (-) Sin Zn2 + sin CN (CN-) Con 2 mM de KCN (Zn2+) Con 2 Mm Zn2+ (Zn2+ CN-) Con 2 mM En los dos casos al utilizar KCN 2 Mm la actividad se inhibe en maacutes de un 75 Se utilizoacute como control la reaccioacuten sin sustrato (D-malato) para eliminar el ruido de fondo Los valores mostrados en las barras de error corresponden a la desviacioacuten tiacutepica de dos ensayos independientes Se considera el 100 a la AE = 7190 plusmn 655 U mg-1
0
50
100
150
200
250
(-) CN⁻ Znsup2⁺ Znsup2⁺ CN⁻
A
E (
U m
gsup1
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
119
DMO disminuye a lo largo del tiempo en todos los supuestos se advierte que con una
concentracioacuten de 1 mM de Zn2+ se mantiene aproximadamente el 40 de la actividad
despueacutes de dos horas a 50degC (figura 36)
65 INDUCCIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO
La actividad DMO se detectoacute inicialmente en extractos de ceacutelulas provenientes
de cultivos bacterianos en medio LB (medio rico en nutrientes) Este es un medio no
definido y se planteoacute estudiar el efecto de determinadas fuentes de carbono y de
nitroacutegeno en la actividad DMO
Para conocer la inducibilidad de la DMO ceacutelulas de P pseudoalcaligenes CECT
5344 se cultivaron en distintas condiciones nutricionales Como base se utilizoacute medio
miacutenimo M9 con distintas fuentes de carbono (4 g l-1) y amonio como fuente de
nitroacutegeno (1 g l-1) Cuando se cambioacute la fuente de nitroacutegeno nitrato o cianuro (1 g l-1) se
empleoacute como fuente de carbono L-malato Como control se utilizoacute un cultivo en LB El
crecimiento de los cultivos se siguioacute espectrofotomeacutetricamente a lo largo del tiempo
(Figura 37) y cuando eacutestos llegaron a su fase exponencial (DO600nm asymp06) se realizoacute la
recogida de ceacutelulas Los extractos acelulares se obtuvieron tal y como se detalla en
0
20
40
60
80
100
120
(-) 30 MINUTOS 60 MINUTOS 90 MINUTOS 120MINUTOS
A
ctiv
idad
(U m
g-1)
no calor 0μM ZnCl₂ 100 μM ZnCl₂ 500 μM ZnCl₂ 1000 μM ZnCl₂
Figura 36 Estabilizacioacuten de la proteiacutena DMO por Zn2+ La actividad DMO de extractos parcialmente purificados fue medida espectrofotomeacutetricamente con el ensayo estaacutendar (Tris HClGly 50 Mm pH 9 INT 2 mM D-malato 5 mM y Zn2+ 2mM) Se analizoacute la actividad en ausencia y presencia de Zn2+ en concentraciones finales de 100 500 y 1000 microM y sometidas durante distintos intervalos de tiempo a 50degC Con una concentracioacuten de 1 mM de Zn2+ incluido en el tampoacuten de conservacioacuten la actividad tras 2 horas expuesta a tratamiento teacutermico mantiene aproximadamente el 40 de la actividad Los valores mostrados en las barras de error corresponden a la desviacioacuten tiacutepica de dos ensayos independientes Se considera el 100 a la AE = 391 plusmn 028 U mg-1 que corresponde a la actividad DMO del extracto sin someter a calor y sin antildeadir Zn2+ a su tampoacuten de conservacioacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
120
material y meacutetodos Para cada cultivo se realizoacute el ensayo estaacutendar de actividad DMO
(Figura 38) No se tomaron datos para realizar las curvas de crecimiento (figura 37)
correspondientes a cianuro como fuente de nitroacutegeno (figura 38 barra amarilla) y a
ldquohambre de nitroacutegenordquo (figura 38 barra verde oscuro) puesto que ambos cultivos se
recogieron transcurridas 3 horas desde su inoculacioacuten ya que lo que nos interesaba era
saber si la actividad DMO era inducida en presencia de cianuro o en situacioacuten de estreacutes
(ausencia de nitroacutegeno)
En relacioacuten con la figura 37 correspondiente a las curvas de crecimiento en
distintas condiciones de cultivo se puede decir que en todos los casos el crecimiento
bacteriano fue muy similar aunque tardaron maacutes en llegar a su fase exponencial
respecto al control (LB) excepto cuando se utiliza acetato como uacutenica fuente de
carbono que muestra un crecimiento maacutes ralentizado lo que coincide con trabajos
anteriores que demuestran que en esta bacteria el malato es maacutes efectivo como
fuente de carbono que el acetato (136) Cabe destacar que al utilizar succinato como
fuente de carbono se detecta un incremento de actividad de la DMO Al utilizar como
fuente de carbono L-malato y como fuente de nitroacutegeno amonio no se detectaron
diferencias significativas con el control Por el contrario la actividad parecioacute inhibirse al
utilizar como fuente de carbono DL-malato y como fuente nitroacutegeno cianuro o nitrato
Ademaacutes se pudo apreciar que al utilizar como uacutenica fuente de carbono el succinato al
medir la actividad DMO de los extractos acelulares de las ceacutelulas cultivadas bajo estas
condiciones se produjo un aumento de actividad respecto a los resultados obtenidos
de los extractos cultivados en el medio de referencia (medio LB) (figura 38) Que la
actividad DMO no se vea afectada por la presencia de D-malato en P pseudoalcaligenes
CECT contrasta con los resultados obtenidos en P stutzeri A1501 donde la actividad
DMO desarrollada por la enzima D2HGDH (WP_09119116351) se induce claramente
tanto por malato como D2HG (92) De hecho esta actividad es indispensable para la
utilizacioacuten de D-malato por la bacteria Ocurre algo similar en E coli en donde la
expresioacuten de la D- malato deshidrogenasa es inducida por D-malato (160)
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
121
0
01
02
03
04
05
06
07
0 1 2 3 4 5 6 7 8
DO
600n
m
Tiempo (h)
LB MM9+ACETATO MM9+SUCCINATO MM9+DL MALATO
MM9+L MALATO MM9+NITRATO MM9+AMONIO
Figura 37 Efecto de la fuente de carbono en el crecimiento de P pseudoalcaligenes CECT 5344 Las ceacutelulas se cultivaron en medio LB (pH 95) como cultivo de control y en mdeio M9 (Ph 95) con acetato succinato dl-malato o l-malato (4 gl) como fuente de carbono y amonio (1 gl) como fuente de nitroacutegeno Se utilizaron tambieacuten como medios de cultivo medio M9 con Nitrato amonio 0 cianuro (1 gl) como fuente de nitroacutegeno y l-malato (4 gl) como fuente de carbono (no se muestra la curva de KCN como fuente de nitroacutegeno) MM9+L-Malato y MM9+amonio alcanzan el crecimiento exponencial aproximadamente al mismo tiempo hecho que no es de extrantildear pues ambos medios contienen L-malato (4 gl) como fuente de carbono y amonio (1 gl) como fuente de nitroacutegeno Los cultivos cultivados en MM9 + DL-malato y MM9 + succinato tienen un comportamiento similar Los cultivos con crecimiento maacutes ralentizado fueron los que se inocularon em MM9 + Acetato y MM9 + nitrato
Figura 38 Inducibilidad de la actividad DMO seguacuten la fuente de carbono o nitroacutegeno Se produjo un aumento de actividad DMO en las ceacutelulas que fueron cultivadas en succinato como fuente de carbono aquellas cultivadas en MM9 + amonio y MM9 + L-malato la actividad DMO no sufrioacute variaciones respecto al cultivo control (crecido en LB) Con el resto de cultivos ensayados se produjo un descenso de la actividad DMO La actividad DMO de los extractos crudos se determinoacute seguacuten el ensayo estaacutendar (LB) La AE = 2530 U mg-1 del cultivo control (LB) 100
0
20
40
60
80
100
120
140
160
a
ctiv
idad
(U m
g-1pr
oteiacute
na)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
122
7 PURIFICACIOacuteN Y CARACTERIZACIOacuteN MOLECULAR DE LA ACTIVIDAD DMO
La DMO fue parcialmente purificada a partir de la fraccioacuten periplaacutesmica de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 (ver fraccionamiento subcelular en Material y meacutetodos) y
de extractos acelulares de E coli XL1 portadora del plaacutesmido pGBN5_4044 donde se
expresa la proteiacutena nativa de P pseudoalcaligenes CECT 5344 La proteiacutena obtenida de
ambas fuentes presentoacute las mismas propiedades
71 PRECIPITACIOacuteN SALINA
Las proteiacutenas solubles en medios acuosos presentan en su superficie una capa
de solvatacioacuten (capa de moleacuteculas de agua) Cuando se incrementa en el medio la
concentracioacuten de sal esta capa de solvatacioacuten disminuye favoreciendo las
interacciones de tipo hidrofoacutebico entre las proteiacutenas Esto produce su precipitacioacuten que
dependiendo de su naturaleza lo haraacuten a una determinada saturacioacuten de sulfato
amoacutenico (161)
Se seleccionaron 4 extractos de fraccioacuten periplaacutesmica de P pseudoalcaligenes
CECT 5444 y se llevaron a distintas saturaciones con sulfato amoacutenico (0 20 40 y
60) a continuacioacuten se centrifugaron (12000 rpm 20 minutos 4degC) y fueron
analizados los precipitados (disgregados en Tampoacuten TrisHCl 1M pH8) y los
sobrenadantes obtenidos mediante electroforesis nativa en gel de poliacrilamida 75
que posteriormente se reveloacute con la tincioacuten estaacutendar con D-malato (figura 39A) Se
actuoacute de igual manera para la proteiacutena recombinante parcialmente purificada extraiacuteda
de E coli aunque esta vez el meacutetodo de deteccioacuten de la actividad DMO fue el ensayo
espectrofotomeacutetrico estaacutendar que es mucho maacutes sensible (figura 39B) En ambos casos
la precipitacioacuten de la proteiacutena responsable de la actividad DMO se produjo a una
saturacioacuten del 60 de sulfato amoacutenico si bien el meacutetodo espectrofotomeacutetrico fue maacutes
sensible y detectoacute la actividad DMO en los sobrenadantes en todos los casos
observaacutendose como disminuiacutea la actividad conforme aumentaba el grado de saturacioacuten
con sulfato amoacutenico y aumentando paulatinamente en los precipitados estudiados
dando su maacuteximo resultado con una saturacioacuten de 60 de (NH4)2SO4 (figura 39B) En
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
123
el caso de los extractos analizados por electroforesis nativa solo se aprecioacute actividad al
estar completamente precipitada (60) (Figura 39B) Esto puede deberse a que las
fracciones obtenidas por precipitacioacuten con sulfato amoacutenico contienen una elevada
concentracioacuten de esta sal que puede interferir con algunos ensayos Ademaacutes la sal evita
la correcta migracioacuten de las proteiacutenas en las electroforesis (161) Por este motivo a
partir de este momento una vez realizada la precipitacioacuten salina se procedioacute a su
desalado mediante una cromatografiacutea en columnas ldquoPD-10 Desalting Columnrdquo
(Healthcare Bio-Science AB) La columna fue equilibrada con tampoacuten TrisHCl 50 mM
pH 8 glicerol 10 que es el tampoacuten en el que finalmente queda disuelta la proteiacutena
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
124
72 CROMATOGRAFIacuteA DE EXCLUSIOacuteN MOLECULAR
Las cromatografiacuteas de exclusioacuten molecular se utilizan para separar las proteiacutenas
en funcioacuten de su tamantildeo aunque tambieacuten influye su forma Por lo tanto ademaacutes de ser
uacutetiles en protocolos de purificacioacuten de proteiacutenas se pueden utilizar para calcular el peso
molecular de proteiacutenas nativas siempre y cuando la columna se calibre con proteiacutenas
de peso molecular conocido Para el caso de la DMO se utilizoacute una columna de exclusioacuten
molecular (Superdex 200 10300 GL de GE Healthcare) instalada en un sistema de
Figura 39 Fraccionamiento ldquosalting outrdquo con sulfato amoacutenico de la DMO de P pseudoalcaligenes (A) y de la DMO recombinante en Ecoli (B)
La actividad DMO precipita al 60 de saturacioacuten con (NH4)2SO4 tanto en fraccioacuten periplaacutesmica de P pseudoalcaligenes CECT 5344 como en extractos acelulares de E coli con el plaacutesmido pGBN5_4044 (A) Electroforesis nativa en gel de poliacrilamida 75 se tomaron cuatro muestras de proteiacutena DMO parcialmente purificada y se llevaron a distintas saturaciones de (NH4)2SO4 (0 20 40 y 60) Los diferentes extractos se centrifugaron (12000 rpm 20 minutos a 4degC) Los sobrenadantes y los precipitados (disgregados en Tampoacuten TrisHCl 1M pH8) se cargaron en el gel de poliacrilamida Como control de actividad se utilizaron aproximadamente 130 μg de proteiacutena DMO parcialmente purificada sin tratamiento La solucioacuten de tincioacuten fue la estaacutendar (Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM dl-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml (B) De igual manera se procedioacute con los extractos acelulares de E coli XL110 con plaacutesmido pGBN5_4044 pero esta vez el meacutetodo de deteccioacuten de la actividad DMO fue la determinacioacuten por espectrofotometriacutea en mezcla de reaccioacuten estaacutendar (Tris HClGly 50 Mm pH 9 INT 2 mM D-malato 5 mM y Zn2+ 2mM) En ambos casos la precipitacioacuten de la proteiacutena DMO ocurrioacute tras someterla al 60 de saturacioacuten de Sulfato amoacutenico si bien el meacutetodo espectrofotomeacutetrico es mucho maacutes sensible que la electroforesis nativa
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
125
cromatografiacutea liacutequida raacutepida para proteiacutenas (Aumlkta purifier de GE Healthcare) La
columna se calibroacute tal y como se especifica en el apartado de Material y meacutetodos
utilizando una mezcla de proteiacutenas estaacutendar y de peso molecular conocido
seleccionadas del Kit comercial HMW Gel Filtration Calibration Kit (Amersham
Biosciences) El volumen vaciacuteo de la columna utilizando Azul dextrano que eluyoacute a un
volumen de 7785 ml (cromatograma azul figura 40) Bajo las mismas condiciones se
realizoacute la cromatografiacutea de un extracto parcialmente purificado (precipitacioacuten por
sulfato amoacutenico 60 de saturacioacuten) de fraccioacuten periplaacutesmica de P pseudoalcaligenes
CECT 5344 Tras obtener el perfil proteico (cromatograma verde claro figura 40) y
medir la actividad DMO de todas las fracciones (histograma de actividad se muestra en
la figura 40 en verde oscuro) se determinoacute que el volumen de elucioacuten de la actividad
DMO fue a los 1322 ml (figura 40) El calibrado con las proteiacutenas patroacuten permitioacute
estimar la masa molecular aparente de la proteiacutena nativa en unos 102 KDa (figura 41B)
y su radio de Stokes en 383 Aring (Figura 41A) (127)
Figura40 Perfil de elucioacuten de la DMO en la cromatografiacutea de exclusioacuten molecular Superdex 200 10300 GL de GE Healthcare Sobre este perfil se representa la actividad DMO (histograma verde oscuro) El volumen de exclusioacuten del pico de la actividad se situacutea en 1322 ml (cada fraccioacuten de 05 ml se representa en el eje de abscisas) El cromatograma verde claro corresponde al perfil de elucioacuten de la proteiacutena DMO Los cromatogramas azules son las calibraciones realizadas con las proteiacutenas de masa molecular y radio de Stokes conocidos
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
126
Figura41 Caacutelculo del radio de Stokes (A) y del peso molecular de la DMO (B)
Tiroglobulina
Ferritina
Catalasa
Aldolasa
Ovoalbuacutemina
Quimotripsinoacutegeno
Ribonucleasa A DMO R1
y = 00133x + 01775Rsup2 = 09409
0
02
04
06
08
1
12
14
16
00 100 200 300 400 500 600 700 800 900
radic(minus119903119903119907119907119899119899119870119870
119905119905119907119907)
Rs (Aring)
Tiroglobulina
Ferritina
Catalasa
Aldolasa
Ovoalbuacutemina
QuimotripsinoacutegenoRibonucleasa A
DMO R1
y = -03459x + 20707Rsup2 = 0962
0
01
02
03
04
05
06
07
4 45 5 55 6
K av
log MWB
Interpolando los datos de elucioacuten de proteiacutena obtenidos en la cromatografiacutea de exclusioacuten molecular con el calibrado de la columna de exclusioacuten molecular Superdex 200 10300 GL de GE Healthcare Las etiquetas rojas en (A) y en (B) que corresponden con el coeficiente de distribucioacuten de la DMO lo que permitioacute calcular el radio de Stokes (383 Aring) y el peso molecular 102 KDa
A
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
127
8 IDENTIFICACIOacuteN DEL GEN RESPONSABLE DE LA ACTIVIDAD DMO
81 GEN CANDIDATO POR DATOS BIBLIOGRAacuteFICOS
Al no existir hasta hace poco antecedentes claros de una actividad D-malato
oxidasa independiente de NAD(P)H la identificacioacuten del gen que codifica esta actividad
resultoacute complicada En primer lugar se buscaron en el genoma de P pseudoalcaligenes
CECT 5344 genes que codificacaran proteiacutenas periplaacutesmicas y con posible actividad
alcohol oxidasa sin obtener candidatos convincentes Sin embargo fueron dos los
indicios los que nos pusieron sobre la pista de gen El primero es el hecho de que la D-2-
hidroxiglutarato deshidrogenasa (D2HGDH) dependiente de FAD (WP_0119116351) de
P stutzeri A1501 tiene actividad DMO (92) La segunda sentildeal fue el descubribiento del
D-2-hidroxiglutarato como sustrato de la DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344
Por tanto utilizando la D2HGDH (464 aminoaacutecidos) de P stutzeri como referencia
se realizoacute una buacutesqueda de ortoacutelogos con las secuencias depositadas en la base de datos
PubMed utilizando para ello la herramienta bioinformaacutetica BLASTp (144)
(httpsblastncbinlmnihgovBlastcgiPAGE=ProteinsampPROGRAM=blastpampBLAST
_PROGRAMS=blastpampQUERY=WP_0119116351ampLINK_LOC=proteinampPAGE_TYPE=
BlastSearche) En la buacutesqueda se introdujo manualmente en el motor de buacutesqueda el
organismo P pseudoalcaligenes CECT 5344 El resultado fue la alineacioacuten con cuatro
proteiacutenas de P pseudoalcaligenes CECT 5344 La comparacioacuten de estas cuatro proteiacutenas
con la proteiacutena de P stutzeri A1501 (resaltada en amarillo en la figura 42 mostroacute que la
maacutes cercana filogeneacuteticamente es una anotada como D-2-hidroxiglutarato
deshidrogenasa (figura 42) Se trata del gen BN5_4044 y codifica una proteiacutena de 463
aminoaacutecidos y con nuacutemero de acceso de GenBank CDM425861 El alineamiento de
ambas secuencias reveloacute un 90 de identidad (figura 43)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
128
En el entorno geacutenico del gen BN5_4044 (ver figura 44A) se encuentra el gen serA
(BN5_4045) que codifica a una D-3-fosfoglicerato deshidrogenasa al igual que ocurre
en P stutzeri y en otras Pseudomonas (Figura 44B) (95)
Figura 42 Anaacutelisis filogeneacutetico de la proteiacutena D2HGDH de P stutzeri Al realizar una buacutesqueda de ortoacutelogos (BLASTp) en el microorganismo P pseudoalaligenes CECT 5344 Los valores representan el grado de diferencia entre las secuencias (07 muestra una diferencia del 70 entre dos secuencias) Entre pareacutentesis se proporcionan los nuacutemeros de acceso correspondientes a GenBank del Centro Nacional de Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI) de cada una de ellas Imagen extraiacuteda de httpswwwncbinlmnihgovblasttreeviewtreeViewcgirequest=pageampblastRID=U0GFVXNM014ampqueryID=ref|WP_0119116351|ampentrezLim=ampex=ampexl=ampexh=ampns=100ampscreenWidth=1366ampscreenHeight=76
Figura 43 Resultado del alineamiento de la secuencia de aminoaacutecidos de la D2HGDH de P stutzeri (Query) y de la DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 (Subject) Se observa un 90 de identidad Imagen extraiacuteda de httpsblastncbinlmnihgov
Figura 44 Entorno geacutenico del gen que codifica a la DMO
B A El gen dmo (BN5_4044) es adyacente al serA (BN5_4045) Imagen extraiacuteda de la base de datos httpsgendbcomputationalbiouni-giessende B Entorno geacutenico de la d2hgdh en varias especies de Pseudomonas Imagen extraiacuteda de (95)
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
129
El hecho de que la sintenia del gen sea similar podriacutea sugerir una relacioacuten funcional
entre ambos genes El taacutendem formado por SerA y D2HGDH de P stutzeri establece
una relacioacuten entre los intermediarios de la glicoacutelisis (d-3-fosfoglicerato) el ciclo del
aacutecido ciacutetrico (2-cetoglutarato) y la biosiacutentesis de L-serina Es maacutes los autores del trabajo
sugieren que la conversioacuten del D-2-hidroxiglutarato a 2-cetoglutarato mediada por la
D2HGDH ayuda a superar la barrera termodinaacutemica de la deshidrogenacioacuten del D-3-
fosfoglicerato (D-3-PG) a 3-fosfohidroxipiruvato (3-PHP) catalizada por la SerA
facilitando el proceso de biosiacutentesis de la L-serina (figura 45) (95)
El aacuterbol filogeneacutetico obtenido a partir del alineamiento muacuteltiple (ClustalW) de
las secuencias de aminoaacutecidos de diversas oxidorreductasas de varias especies incluida
la DMO de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 (figura 46) mostroacute que entre
todas las secuencias existe un elevado grado de identidad De todas las proteiacutenas la
maacutes cercana filogeneacuteticamente a la DMO de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT
5344 es la D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa (WP_09119116351) de P stutzeri
A1501 Al comparar las secuencias (BLASTp) (144) entre ambas proteiacutenas se encontroacute
un 90 de identidad y un 94 de similitud Esto no es de extrantildear ya que la
comparacioacuten de secuencias de los genomas completos realizado mediante EDGAR
refleja que ambas especies bacterianas estaacuten muy cercanas filogeneacuteticamente (57)
La D-lactato deshidrogenasa de Archaeoglobus fulgidus (KUJ943681) (137)
presenta homologiacutea con dos proteiacutenas de P pseudoalcaligenes CECT 5344 Una es la
subunidad D de la glicolato oxidasa GlcD (BN5_0128-CDM387441) con una identidad
de 32 y una similitud de 52 La otra es la D-malato oxidasa (BN5_4044-
Figura 45 Relacioacuten funcional de SerA y D2HGDH El taacutendem entre SerA y D2DGDH establece una relacioacuten entre los intermediarios de la glicolisis del ciclo de los aacutecidos tricarboxiacutelicos (TCA cycle) y la biosiacutentesis de serina (95) OAA oxalacetato PEP fosfoenolpiruvato D-3-PG D-3-fosfoglicerato 3-PHP 3-fosfohidroxipiruvato D-2-HG D-2-hidroxiglutarato 2-KG 2-cetoglutarato
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
130
CDM425861) con una identidad de 30 y una similitud de 48 Sin embargo con esta
uacuteltima la similitud empieza a partir del aminoaacutecido 4 coincidiendo casi en su totalidad
en el extremo amino terminal y se mantiene praacutecticamente hasta el final de la
secuencia mientras que para la glicolato oxidasa el alineamiento no comienza hasta el
aminoaacutecido 37 de la D-lactato deshidrogenasa La D-lactato deshidrogenasa de
Archaeoglobus fulgidus parece encontrase en el s-periplasm (equivalente al periplasma
bacteriano) (137) a pesar de no poseer un peacuteptido sentildeal reconocible Por lo tanto se
podriacutea especular que ambas proteiacutenas comparten un motivo no descrito hasta la fecha
en la regioacuten amino-terminal que les permita exportarse al periplasma
Si como en el caso anterior se toma la secuencia de aminoaacutecidos de la proteiacutena
D-lactato deshidrogenasa (At5g06580) de Arabidopsis thaliana y se realiza una
buacutesqueda de secuencias homoacutelogas en P pseudoalcaligenes CECT 5344 aparecen las
mismas proteiacutenas la glicolato oxidasa subunidad GlcD con una identidad de 27 y una
similitud de 47 y la D-malato oxidasa con una identidad de 27 y una similitud de
45 aunque en ambos casos no se produce el alineamiento de secuencias hasta los
aminoaacutecidos 99 y 111 respectivamente
En cuanto a la D-lactato deshidrogenasa de P putida KT2440 con un dominio
FADFMN deshidrogenasa y un dominio sulfofeacuterrico con actividad oxidorreductasa
(98) DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 es homoacuteloga al dominio FADFMN
deshidrogenasa de esta proteiacutena manteniendo un 22 de identidad y un 40 de
similitud
Por uacuteltimo realizando una comparacioacuten de secuencias la DMO de P
pseudoalcaligenes presenta tambieacuten homologiacutea con las proteiacutenas de S cerevisiae Dld2
34 de identidad y 55 positivos y Dld3 34 de identidad 54 positivos) ubicadas en
la mitocondria y en el citosol respectivamente
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
131
La prediccioacuten de la estructura secundaria (figura 47) y tridimensional (figura 48)
de la DMO se realizoacute utilizando el servidor ldquoPhyre2rdquo (Protein HomologyanalogY
Recognition Engine V 20) (135)
(httpwwwsbgbioicacukphyre2htmlpagecgiid=index) La estructura
tridimensional se basa el modelo c3pm9A una oxidorreductasa de Rhodopseudomonas
palustris (162) y una identidad de secuencia de 39 y un 54 de positivos aunque con
una cobertura del 97 Este mismo servidor identifica a la proteiacutena c3pm9A como un
homodiacutemero caracteriacutestica que podriacutea compartir la DMO ya que se estimoacute
Figura 46 Anaacutelisis filogeneacutetico de la secuencia deducida de aminoaacutecidos de la proteiacutena DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 El alineamiento muacuteltiple de las secuencias de aminoaacutecidos de DMO con otras proteiacutenas de diversos organismos se realizoacute utilizando el servidor Phylogenyfr (133) Se proporcionan los nuacutemeros de acceso correspondientes al GenBank de cada una de las proteiacutenas de los diferentes microorganismos Los valores representan el grado de diferencia entre las secuencias (1 muestra una diferencia del 100 entre dos secuencias) D-LDHDld D-lactato deshidrogenasa D-2HGDH D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa DMO D-malato oxidasa G2DH Glutarato-2-deshidrogenasa
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
132
experimentalmente su masa molecular en unos 102 KDa (figura 41B) El producto del
gen BN5_4044 tiene 463 aminoaacutecidos y una masa molecular teoacuterica de 50 KDa
(httpwwwexpasychtoolspi_toolhtml) por lo que se podriacutea afirmar que la DMO
podriacutea estar compuesta en su estructura cuaternaria por dos subunidades ideacutenticas
La D-lactato deshidrogenasa (D-iLDH) de P putida KT2440 tiene una secuencia de 963
aminoaacutecidos y de 100 a 118 KDa de peso molecular por lo que parece ser que esta
proteiacutena estaacute compuesta por una uacutenica unidad aunque presenta 2 dominios del
aminoaacutecido10 al 519 se situa el dominio deshidrogenasa con unioacuten a FAD y la secuencia
comprendida entre los aminoaacutecidos 530 a 936 corresponderiacutea al dominio Fe-S
oxidorreductasa (98) El dominio deshidrogenasa con unioacuten a FAD de P putida KT2440
y la proteiacutena D-malato oxidasa de P pseudoalcaligenes CECT 5344 tienen un tamantildeo
similar pero con una identidad del 22 Sin embargo la D-lactato deshidrogenasa
(At5g06580) de A thaliana con un 27 de identidad con la DMO de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 tiene una estructura primaria de 567 aminoaacutecidos tiene
una estructura cuaternaria de homodiacutemero (150)
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
133
Figura 47 Prediccioacuten de la estructura secundaria de DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344 Panel generado por el servidor ldquoPhyre2rdquo (135)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
134
9 CLONACIOacuteN DEL GEN 4044 QUE CODIFICA A LA PROTEIacuteNA D-MALATO OXIDASA
91 CLONACIOacuteN DEL GEN dmo (BN5_4044)
Una de las aproximaciones para comprobar que el gen dmo de la D-malato
oxidasa es BN5_4044 (figura 49) fue clonarlo para expresarlo de forma heteroacuteloga en E
coli
Se utilizaron como cebadores la pareja de oligonucleoacutetidos 4044U y 4044L (ver
tabla 8 de Material y meacutetodos) para amplificar el gen dmo en una reaccioacuten de PCR
Como DNA molde se utilizoacute DNA genoacutemico de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT
5344 (10 ng) El producto resultante (2474 pb) se clonoacute en el vector pGEMreg-T Easy y se
introdujo por electroporacioacuten en ceacutelulas electrocompetentes XL1 blue MRFacute Se
A Bl
Figura 48 Prediccioacuten de la estructura tridimensional de DMO de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
A Estructura tridimensional de p pseudoalcaligenes basada en el modelo c3pm9A de Rhodopseudomonas palustris B con una confianza del 100 una cobertura del 99 y una identidad del 37 Los paneles fueron generados utilizando el servidor ldquoPhyre2rdquo (135)
Figura 49 Localizacioacuten del gen D-malato oxidasa (dmo) en P pseudoalcaligenes CECT 5344
Figura extraiacuteda de la base de datos GenDB
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
135
recogieron las colonias transformantes se preparoacute un extracto libre de ceacutelulas seguacuten
lo descrito en Material y meacutetodos y se guardoacute a -20degC para su posterior anaacutelisis
En la figura 50A se refleja el esquema de la construccioacuten del plaacutesmido pGBN5_4044
para la clonacioacuten y posterior expresioacuten de la proteiacutena D-malato oxidasa en XL1 blue
MRFacute y gel de agarosa 08 con pGBN5_4044 digerido con las enzimas de digestioacuten ApaI y
EcoRV utilizadas para determinar la orientacioacuten del gen BN5_4044 insertado en el
plaacutesmido (figura 50B) En una orientacioacuten SP6-T7 se generariacutea un fragmento de 5386
pb y otro de 104 y si se tratase de una orientacioacuten T7-SP6 los fragmentos que
apareceriacutean tendriacutean el tamantildeo de 3027 pb y 2463 pb siendo esta uacuteltima opcioacuten la que
se aprecioacute (figura 50B)
Figura50 Esquema de la clonacioacuten del gen BN5_4044 en el vector pGemT Easy
A B ApaI
EcoRV
A Imagen de la estrategia de la construccioacuten del plaacutesmido pG4044 creada con el programa SnapGene Se amplificoacute el gen BN5_4044 utilizando la pareja de cebadores 4044U y 4044L y DNA genoacutemico de R1 dando un producto de PCR de tamantildeo de 2474pb que fue introducido mediante clonacioacuten TA en el vector pGTeasy B Gel de agarosa al 08 que muestra en la calle 1 el marcador peso molecular 1Kb (gTBio) y en la calle nuacutemero 2 el plaacutesmido pGBN5_4044 digerido con las enzimas de restriccioacuten ApaI y EcorV que determinan la orientacioacuten del gen (T7-SP6) T7 promotor de la RNA polimerasa del fago T7 lacZ gen que codifica la β-galactosidasa f1 regioacuten del fago λ AmpR gen que confiere resistencia a ampicilina MCS sitio de clonacioacuten muacuteltiple
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
136
10 EXPRESIOacuteN DE BN5_4044 Y COMPROBACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD DMO
Antes de insertar el plaacutesmido pGBN5_4044 en E coli XL1 se comproboacute mediante
un ensayo utilizando electroforesis nativa en gel de poliacrilamida que esta cepa
bacteriana de E coli no presentaba actividad DMO (figura 51A) Posteriormente se
realizoacute otra electroforesis nativa con los extractos anteriores y antildeadiendo una tercera
calle en la que se cargoacute extracto crudo de E coli que portaba el plaacutesmido pGBN5_4044 Tal
y como se observa en la figura 51 B en la calle 3 del gel aparece una banda mucho maacutes
intensa pero a la misma altura que la banda del extracto parcialmente purificado de P
pseudoalcaligenes CECT 5344 demostrando que el gen BN5_4440 codifica la actividad
D-malato oxidasa En la figura 51C se observa que la actividad de la proteiacutena heteroacuteloga
DMO expresada en E coli es detectada mediante el ensayo estaacutendar
espectrofotomeacutetrico en mayor medida que el correspondiente al extracto de DMO
parcialmente purificado de P pseudoalcaligenes CECT 5344 dato que coincide con el
obtenido mediante electroforesis nativa (figura 51B)
P pseudoalcaligenes CECT 5344 (R1) es una bacteria recalcitrante a la
transformacioacuten geacutenica ya que no mantiene ninguno de los plaacutesmidos replicativos
descritos para la mayoriacutea de Pseudomonas probablemente debido a la accioacuten de los
muacuteltiples sistemas de Modificacioacuten-Restriccioacuten (Sistemas MR) presentes en esta
Figura 51 Expresioacuten de la actividad DMO de P pseudoalcaligenes en E coli Se realizaron varias electroforesis nativas en gel de poliacrilamida 75 A y B 1 Ensayo con extracto de fraccioacuten periplaacutesmica parcialmente purificada de P pseudoalcaligenes con actividad DMO (control positivo)2 Ensayo con extracto crudo de E coli 3 Ensayo con extracto crudo de E coli conteniendo el plaacutesmido pGBN5_4044 C Medida de la actividad DMO espectrofotomeacutetricamente mediante ensayo estaacutendar 100 hace referencia a 53 U mg-1 que corresponde a la actividad especiacutefica extracto de P pseudoalcaligenes Las barras de error corresponden a los valores de la desviacioacuten tiacutepica de dos ensayos independientes Solucioacuten de tincioacuten estaacutendar Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM D-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
137
bacteria (5455) Por este motivo se decidioacute trabajar con un mutante en el gen
homoacutelogo de Pseudomonas putida KT2440 de la cual existe una coleccioacuten de mutantes
(163)
La cepa Pseudomonas putida KT2440 que proviene de la estirpe mt-2
(capacidad para degradar meta-toluenos) de P putida se considera una cepa de
bioseguridad certificada apta para manipulaciones en el laboratorio (164165) y cuyo
genoma estaacute iacutentegramente secuenciado (166)
En primer lugar se comproboacute que la cepa silvestre de KT2440 posee actividad
DMO Para tal fin se realizoacute una electroforesis en gel de poliacrilamida 75 de un
extracto crudo de KT2440 Como control positivo se utilizoacute un extracto de fraccioacuten
periplaacutesmica de R1 En la figura 52 se observa que KT2440 presenta actividad DMO (la
banda rojiza de formazaacuten se encuentra a la misma distancia que la banda de R1) si bien
la intensidad es mucho menor que en R1
Una vez revelada la presencia de actividad DMO en KT2440 con la secuencia de
aminoaacutecidos de la proteiacutena DMO (CDM425861) se realizoacute una buacutesqueda de ortoacutelogos
de la proteiacutena utilizando el programa BLASTp (144) e introduciendo en el motor de
buacutesqueda la especie bacteriana Pseudomonas putida KT2440 En el alineamiento
muacuteltiple de secuencias la primera proteiacutena que aparecioacute fue una posible D-2-
hidroxiglutarato deshidrogenasa (NP_74722551) con una confianza de 97 una
identidad del 88 y 94 de positivos muy cercana filogeneacuteticamente (figura 53) En el
mismo servidor obtuvimos la informacioacuten del gen que codifica esta proteiacutena el PP_5154
(163167)
Figura 52 Actividad DMO de P putida KT2440 Se realizoacute una electroforesis nativa en gel de poliacrilamida en la que se cargoacute el ensayo utilizando la misma cantidad de proteiacutena total (30 μg) en ambos pocillos 1 Fraccioacuten periplaacutesmica de R1 2 Extracto libre de KT2440 Se observa actividad DMO en las dos especies bacterianas Solucioacuten de tincioacuten estaacutendar Tris HCl-glicina 50 mM pH 9 ZnCl2 2 mM INT 2 mM D-malato 2 mM y agua destilada hasta alcanzar 10 ml
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
138
Se solicitoacute el mutante KT2440 ∆5154 al Dr Juan Luis Ramos Martiacuten (Grupo de
investigacioacuten Microbiologiacutea ambiental y biodegradacioacuten Centro Experimental del
Zaidiacuten) (163) y una vez recibido se inocularon P pseudoalcaligenes (R1) P putida
(KT2440 WT) y P putida KT2440 ∆5154 (KT2440 MUT) en medios de cultivos selectivos
pertinentes que fueron recogidos en fase exponencial (DO600nm ~06) a continuacioacuten
se rompieron las ceacutelulas por presioacuten (prensa de French) se ultracentrifugaron y se
obtuvieron extractos libres tal y como se detalla en el apartado de material y meacutetodos
Sobre estos extractos crudos de las tres cepas bacterianas se realizoacute el ensayo
estaacutendar de actividad DMO (figura 54) con lo que se aprecioacute de manera cuantitativa
que la cepa silvestre de P putida KT2440 si presenta actividad DMO aunque su sentildeal
es maacutes deacutebil que la que se produce en P pseudoalcaligenes CECT 5344 y que el mutante
P putida KT2440 ∆5154 que carece del gen que codifica la actividad D-2-HGDH
tambieacuten carece de actividad DMO Con este ensayo se demuestra que el gen PP_5155
de KT2440 ortoacutelogo del gen BN5_4044 de la cepa R1 de P pseudoalcaligenes CECT5344
es el gen responsable de codificar la actividad D-malato oxidasa
Figura 53 Anaacutelisis filogeneacutetico de la secuencia de aminoaacutecidos de DMO de P pseudoalcaligenes CECT 5344
El alineamiento muacuteltiple de las secuencias de aminoaacutecidos de DMO con otras proteiacutenas de P putida KT2440 se realizoacute utilizando el servidor NCBI haciendo uso del programa BLASTp Se proporcionan los nuacutemeros de acceso correspondientes al GenBank del Centro Nacional de Informacioacuten Biotecnoloacutegica (NCBI) de cada una de las proteiacutenas NP_7472551 D-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa NP_7458761 Subunidad glicolato oxidasa con unioacuten FAD NP_7466041 Oxidorreductasa putativa NP_7468451 D-lactato deshidrogenasa NP_7458771 Subunidad glicolato oxidasa con unioacuten FAD todas ellas de P putida KT2440 y CDM425861 D-malato oxidasa de P pseudoalcaligenes CECT 5344 Los valores representan el grado de diferencia entre las secuencias (09 muestra una diferencia del 90 entre dos secuencias) Imagen extraiacuteda de httpswwwncbinlmnihgovblasttreeviewtreeViewcgirequest=pageampblastRID=U6WY0U0X014ampqueryID=emb|CDM425861|ampentrezLim=ampex=ampexl=ampexh=ampns=100ampscreenWidth=1366ampscreenHeight=768
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
139
Ademaacutes se realizaron curvas de crecimiento con P pseudoalcaligenes CECT
5344 y las dos cepas de P putida KT2440 (silvestre y mutante en PP_5144) utilizando
como uacutenica fuente del carbono DL-malato (4gl de concentracioacuten final) El resultado
obtenido fue que la cepa que carece del gen PP_5144 presenta un crecimiento maacutes
lento que la cepa silvestre aunque al final llegan praacutecticamente a la misma densidad
oacuteptica En comparacioacuten con P putida P pseudoalcaligenes utilizando como uacutenica
fuente de carbono DL-malato tiene un crecimiento maacutes lento (figura 55) Este
experimento demuestra que el mutante estaacute afectado en la utilizacioacuten de DL-malato
Puesto que el mutante no tiene actividad DMO se supone que el retraso en el
crecimiento se debe a una utilizacioacuten menos eficiente de este isoacutemero pero a la vez
sugiere que probablemente exista una ruta alternativa a la DMO para su utilizacioacuten
Por uacuteltimo se realizaron distintas curvas de crecimiento utilizando como
fuentes de carbono L-malato o D-malato (a una concentracioacuten final 4 gl) para
caracterizar fenotiacutepicamente las cepas KT2440 silvestre y KT240 mutante en el gen
que codifica la DMO (figura 56) En las graacuteficas se puede apreciar que el L-malato es
mejor fuente de carbono en ambos casos si se comparan las dos fuentes de carbono en
cada una Sin embargo al comparar el crecimiento bacteriano entre cepas se observa
que la cepa mutante utiliza mejor el L-malato que la silvestre cosa contraria cuando se
utiliza D-malato como uacutenica fuente de carbono en este caso resulta maacutes eficiente la
cepa silvestre Podemos concluir con estos resultados que la DMO si tiene como
sustrato al D-malato pero eacuteste debe estar involucrado en otras rutas metaboacutelicas
independientes de eacutesta que le permitan crecer en ausencia de la proteiacutena DMO
0102030405060708090
100
R1 KT2440 KT2440 ∆5154
A
E
(U m
g-1)
Figura 54 Actividad DMO en P putida KT2440 y en P putida KT2440 ∆5154 Se analizoacute la actividad DMO en extractos crudos de R1 P pseudoalcaligenes CECT 5344 KT2440 P putida KT2440 y KT2440 ∆5154 P putida KT2440 ∆5154 Se tomoacute como 100 de actividad a la AE de 55 U mg-1 correspondiente a la actividad DMO en R1 Se observa que la sentildeal de KT2440 es muy inferior a la detectada en R1 La cepa mutante de P putida carece de actividad Reaccioacuten estaacutendar (Tris HClGly 50 Mm pH 9 INT 2 mM D-malato 5 mM y Zn2+ 2mM)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 1
140
Figura 55 Crecimiento de las especies bacterianas P pseudoalcaligenes CECT 5344 P putida KT2440 WT (silvestre) y KT2440 MUT5154 (cepa con deleccioacuten en el gen PP_5154) Se utilizoacute como medio de cultivo medio M9 amonio (1 gl) como fuente de nitroacutegeno y DL-malato (4 gl) como fuente de carbono Aunque ambas cepas tienen un comportamiento similar se observa que la cepa silvestre de P putida (liacutenea azul) presenta un crecimiento maacutes raacutepido que la cepa con deleccioacuten en el gen PP_5154 (liacutenea verde) En violeta se representa la curva de crecimiento de P pseudoalcaligenes CECT 5344 Curva realizada con Multiskan GO (Thermo Scientific) Las barras de error corresponden a la desviacioacuten estaacutendar de tres reacuteplicas de este ensayo
00
01
02
03
0 4 8 12 16 20 24D
O 6
00nm
Tiempo (h)
R1 KT2440 KT2440 ∆5144
Capiacutetulo 1 Resultados y Discusioacuten
141
Figura 56 Crecimiento de las cepas de P putida KT2440 WT (silvestre) y KT2440 ∆5154 (cepa con deleccioacuten en el gen PP_5154) con distintas fuentes de carbono
0
01
02
03
0 4 8 12
KT2440∆5144L-malato vs D-malato
L-MALATO MUT D-MALATO MUT
0
01
02
03
0 4 8 12
KT2440 WTL-malato vs D-malato
L-MALATO WT D-MALATO WT
000
010
020
030
0 4 8 12
KT2440 WT vs KT2440∆5144L-malato
L-MALATO WT L-MALATO MUT
000
010
020
030
0 4 8 12
KT2440 WT vs KT2440∆5144D-malato
D-MALATO WT D-MALATO MUT
DO 600nm DO 600nm
DO 600nm DO 600nm
Tiempo (h) Tiempo (h)
Tiempo (h) Tiempo (h)
Se utilizoacute como medio de cultivo medio M9 amonio (1 gl) como fuente de nitroacutegeno y D o L-malato (4 gl) como fuente de carbono La cepa silvestre se comporta de manera similar en presencia de D y L- malato aunque en ambas cepas tienen un crecimiento un poco maacutes eficiente al utilizar L-malato como fuente de carbono Al utilizar D-malato como fuente de carbono y comparar las cepas se observa que la cepa silvestre presenta un crecimiento maacutes raacutepido Curvas realizada con Multiskan GO (Thermo Scientific) Las barras de error corresponden a la desviacioacuten estaacutendar de tres reacuteplicas de este ensayo
143
CAPIacuteTULO 2 ESTUDIO DE LOS SISTEMAS DE
MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN EN P
PSEUDOALCALIGENES CECT 5344
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
145
1 SISTEMAS DE MODIFICACION RESTRICCIOacuteN EN Ppseudoalcaligenes CECT 5344
Se ha comentado con anterioridad que los sistemas de modificacioacuten restriccioacuten
(MR) son las principales barreras geneacuteticas para la transformacioacuten bacteriana porque
reconocen y eliminan el DNA exoacutegeno (168)
Realizando un breve resumen existen cuatro tipos definidos de sistemas MR en
funcioacuten de sus componentes aunque la mayoriacutea disponen de dos elementos
principales una metiltransferasa (MTasa) que modifica el DNA del hospedador para
protegerlo y una endonucleasa de restriccioacuten (ERasa) que reconoce secuencias diana
especiacuteficas y corta el DNA invasor no metilado excepto los tipos IIM y IV que son ERasas
dependientes de metilacioacuten (6172) Basado en sistemas de prediccioacuten bioinformaacuteticos
existe al menos un sistema MR en casi todos los genomas procarioacuteticos
(httprebasenebcomrebaserebasehtml) (63)
El sistema MR tipo I es el maacutes diverso y contiene unidades de restriccioacuten
modificacioacuten y especificidad designadas como HsdR HsdM y HsdS respectivamente
ensambladas en un complejo de muacuteltiples subunidades El complejo baacutesico de
modificacioacuten es el HsdMS HsdM metila residuos de adenina dentro de una secuencia
especiacutefica de DNA (TRM) seguacuten lo dictado por HsdS mientras que HsdR corta el DNA
no metilado (168)
El sistema MR tipo II estaacute compuesto por una metiltransferasa (MTasa) y una
endonucleasa (ERasa) aunque es comuacuten encontrar MTasas ldquohueacuterfanasrdquo (ej Dcm y
Dam) (168)
En el sistema de MR tipo III la metilacioacuten ocurre en un residuo de adenina dentro
de la TRM y el corte se produce fuera de esta regioacuten (168)
Finalmente los sistemas MR de tipo IV generalmente contienen una uacutenica
endonucleasa dependiente de metilacioacuten (MDREs methylation-dependent restriction
enzymes) que reconoce el DNA metilado inapropiadamente como extrantildeo y lo corta
(McrB McrBC y Mrr) (168)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
146
El locus mcrBC (rglB) en E coli K-12 es adyacente a los genes hsd que codifican
el sistema de MR claacutesico EcoK Curiosamente el gen que codifica el sistema Mrr (ERasa
dependiente de metilacioacuten) se encuentra justamente en el otro lado de los genes hsd
asiacute aunque todos son genes que codifican sistemas MR independientes se encuentran
agrupados en una pequentildea regioacuten del genoma (60)
Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 presenta un uacutenico cromosoma de
4698984 pb con 4435 genes (nuacutemero de acceso LK391695) (figura 57) (169) En eacutel se
han detectado aproximadamente 77000 bases metiladas de las cuales 405 son
metilcitosinas (m5C) y el resto metiladeninas (m6A) El patroacuten de metilacioacuten se
muestra en la figura 58 (63169) En total de todas estas modificaciones tan solo 8500
podriacutean ser asociadas a un motivo de secuencia especiacutefico y el resto metiladas al azar
y distribuidas por todo el genoma Aunque la deteccioacuten de citosinas metiladas estaacute
incompleta se han identificado seis motivos de modificacioacuten m6A y un tipo de
modificacioacuten especiacutefica de adenina auacuten desconocida Entre los motivos m6A
detectados hay dos secuencias palindroacutemicas invertidas la mayoriacutea de las cuales son
reconocidas por los Sistemas de MR Tipo I (169)
Se han predicho en total nueve loci que codifican sistemas MR (figura 58) Tres
de estos loci representan Sistemas MR tipo I (en marroacuten en la figura 58) 5 son de tipo II
(en naranja en la figura 58) y otro corresponde a un sistema MR tipo III (en amarillo en
la figura 58) Otros dos loci representados en azul claro en la figura 58 representan al
Sistema Tipo IV (169)
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
147
Figura 57 Graacutefico del genoma completo de P pseudoalcaligenes CECCT 5344 El genoma consta de 4696984 pares de bases y 4436 secuencias de codificacioacuten predichas Los ciacuterculos representan desde adentro 1 inclinacioacuten de GC (rojo arriba y negro debajo de cero ventana de 5kb) 2 contenido de GC (azul arriba y negro debajo del promedio del genoma de 6246 ventana de 5 kb) 3 metilacioacuten de genoma especiacutefico de cadena especiacutefica analizada en ventanas de 10 kb 4 metilacioacuten especiacutefica de cadena por gen 5 escala en millones de pares de bases (Mb) El espectro de color de la metilacioacuten va del azul (cero) sobre el amarillo (media) al rojo (2 media)Imagen extraiacuteda de httpsgithubcomabremges2015-pseudo (169)
Figura 58 Patroacuten de metilacioacuten de P pseudoalcaligenes CECT5344 Imagen obtenida del servidor REBASE (63) httprebasenebcom El coacutedigo de colores simboliza los distintos tipos de sistemas MR Las enzimas de restriccioacuten (ERs) se marcan en rosa oscuro y se indica el nombre y la orientacioacuten de los respectivos genes Las Metiltransferasas (MTasas) estaacuten marcadas en azul y las enzimas encargadas de reconocer las secuencias especiacuteficas S en verde El ciacuterculo interno representa el genoma de P pseudoalcaligenes CECT 5344 y el nuacutemero de marcos de lectura abierto Los sistemas de MR que se reflejan son 3 sistemas Tipo I 5 sistemas tipo II un sistema tipo III y dos sistemas Tipo IV
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
148
La presencia de tal variedad de sistemas de MR en P pseudoalcaligenes CECT
5344 (R1) podriacutean ser la causa de la dificultad en las transformaciones geacutenicas con la
mayoriacutea de los plaacutesmidos que siacute replican en otras Pseudomonas (5455) Estas trabas a
la transformacioacuten no son un hecho aislado de la bacteria que nos ocupa por ejemplo
estudios realizados en Bacillus anthracis indicaron que esta bacteria solo podiacutea
transformarse con DNA obtenido de la cepa 168 de B subtilis o cepas de E coli
deficientes en metiltransferasas (dam dcm) (170) La secuenciacioacuten y anaacutelisis de los
genomas de varias cepas de B anthracis para detectar la presencia de enzimas de
restriccioacuten mostroacute que la mayoriacutea de estas cepas tienen perfiles ideacutenticos en lo que
respecta a los sistemas MR y que aparentemente todas carecen de sistemas de MR
completos de los Tipo I y III ademaacutes los plaacutesmidos de virulencia pXO1 tampoco
codifican ninguacuten sistema MR identificable Lo que siacute presentan todas las cepas son una
uacutenica DNA MTasa hueacuterfana tipo II (BA_3814) y al menos 3 sistemas Tipo IV
(Endonucleasas dependientes de metilacioacuten MDREs) que estaacute presente en la mayoriacutea
de las cepas secuenciadas (171) La presencia de un sistema de MR Tipo IV (MDREs) en
B anthracis podriacutea ser la razoacuten por la que se solo se produzca la transformacioacuten con
DNA aislado de la cepa B subtilis 168 ya que eacutesta solo dispone de sistemas de MR tipo
II (figura 59)
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
149
Otro ejemplo es P putida KT2440 (166167) que tan solo presenta un sistema de
MR tipo I y cuatro sistemas de Metiltransferasas ldquohueacuterfanasrdquo (Tipo II) destacando la
ausencia de alguacuten sistema de MR tipo IV (figura 60) P putida KT2440 es una de las
bacterias Gram negativa mejor caracterizadas en el laboratorio que resulta
relativamente faacutecil transformar con DNA exoacutegeno (163) Por esta razoacuten en este trabajo
se generaron ceacutelulas electrocompetentes de ambas especies bacterianas (R1 y KT2440)
y se sometieron a transformacioacuten por electroporacioacuten con distintos plaacutesmidos de la
familia pSEVA (129) con diferentes oriacutegenes de replicacioacuten El resultado obtenido fue
que todas las transformaciones realizadas en KT2440 tuvieron eacutexito por el contrario
en R1 no se consiguioacute ninguacuten transformante en el medio selectivo pertinente en
ninguno de los casos (tabla 11)
Figura59 Patrones de metilacioacuten de B anthracis Ames y B subtillis 168 Imagen obtenida del servidor REBASE (63) httprebasenebcom El coacutedigo de colores simboliza los distintos tipos de sistemas MR Las enzimas de restriccioacuten (ERs) se marcan en rosa oscuro y se indica el nombre y la orientacioacuten de los respectivos genes Las Metiltransferasas (MTasas) estaacuten marcadas en azul y las enzimas encargadas de reconocer las secuencias especiacuteficas S en verde El ciacuterculo interno representa el genoma de A Bacillus anthracis Ames y B Bacillus subtilis 168 y el nuacutemero de marcos de lectura abierto Los sistemas de MR que se reflejan son A sistemas Tipo I 5 sistemas tipo II un sistema tipo III y dos sistemas Tipo IV
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
150
Tabla 11 Diferencias en la tasa de transformacioacuten de P putida KT2440 y P pseudoalcaligenes CECT 5344 Origen de
replicacioacuten del pSEVA
Nombre canoacutenico de pSEVA (129)
Antibioacutetico Tasa de transformacioacuten en
KT2440
Tasa de transformacioacuten en
R1
RK2 221 KmR ++ 0 621 GmR + 0
pBBR1 231 KmR +++ 0 631 GmR +++ 0
pUC 281 KmR + 0 681 GmR +++ 0
Las eficiencias de transformacioacuten se establecieron utilizando 100 ng de DNA plasmiacutedico en cada caso Para comparar las eficiencias se usaron las mismas preparaciones de plaacutesmidos para la trasformacioacuten de las colecciones de las cepas Se utilizaron las diferentes preparaciones de ceacutelulas electrocompetentes para las diferentes preparaciones de plaacutesmido Las cepas se cultivaron hasta una DO600nm asymp 035 ndash 04 y se usoacute un equivalente de 5 ndash 7 ml de cultivo por transformacioacuten + hace referencia a una tasa de transformacioacuten de asymp1x104
++ hace referencia a una tasa de transformacioacuten de asymp1x105
+++ hace referencia a una tasa de transformacioacuten de asymp1x106
A la vista de estos resultados la hipoacutetesis de partida es que la razoacuten de la
imposibilidad de transformar P pseudoalcaligenes CECT 5344 podriacutea deberse a la
presencia de alguna combinacioacuten de estos sistemas MR Por lo tanto se decidioacute
eliminar consecutivamente los sistemas de MR diferenciales con P putida kt2440 para
comprobar si asiacute se logra aumentar la eficiencia de transformacioacuten
Figura 60 Patroacuten de metilacioacuten de P putida KT2440 Imagen obtenida del servidor REBASE (63) httprebasenebcom El coacutedigo de colores simboliza los distintos tipos de sistemas MR Las enzimas de restriccioacuten (ERs) se marcan en rosa oscuro y se indica el nombre y la orientacioacuten de los respectivos genes La Metiltransferasas (MTasas) estaacuten marcadas en azul y las enzimas encargadas de reconocer las secuencias especiacuteficas S en verde El ciacuterculo interno representa el genoma de P putida KT2440 y ORF el nuacutemero de marcos de lectura abierto
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
151
2 MUTAGEacuteNESIS DIRIGIDA DE LOS SISTEMAS MR DE P pseudoalcaligenes CECT 5344
Las mutaciones dirigidas se llevaron a cabo mediante intercambio aleacutelico por doble recombinacioacuten entre el gen diana y el gen modificado (bien con parte de su secuencia reemplazada o bien mediante insercioacuten de un casete de resistencia a antibioacutetico) insertado en el vector de clonacioacuten
Para introducir las mutaciones pertinentes en Pseudomonas pseudoalcaligenes
CECT 5344 se utilizoacute el plaacutesmido pGEMreg-T Easy (suicida en bacterias de este geacutenero) y
se procedioacute tal y como se indica en Material y Meacutetodos en el apartado
ldquoTransformaciones por electroporacioacutenrdquo de este trabajo
3 ELIMINACIOacuteN DEL SISTEMA MR TIPO IV ldquoMRRrdquo EN P pseudoalcaligenes CECT 5344
Las endonucleasas de restriccioacuten dependientes de modificacioacuten (MDREs) se definen como enzimas que cortan DNA soacutelo si eacuteste estaacute modificado (172) Tradicionalmente estas enzimas se dividen en los sistemas tipo IIM (necesita secuencia diana metilada ej DpnI) y tipo IV (pej EcoKMcrBC) (173) Estas uacuteltimas cortan a una distancia variable del sitio de modificacioacuten y se cree que dependen de ATP o GTP para poder trasladarse del sitio de modificacioacuten al sitio de corte (172)
En E coli una de las causas de las bajas eficiencias de transformacioacuten se atribuye
a su sistema MR Mrr (methylated adenine Recognition and Restriction) Se ha sugerido
que Mrr funciona independientemente de otros sistemas tales como McrA McrBC y
Hsd lo que no excluye posibles interacciones entre ellos y Mrr La introduccioacuten de DNA
especiacuteficamente metilado genes de metilasas y lo maacutes importante los sistemas de
modificacioacuten restriccioacuten estaacuten regulados en E coli por mrr(174)
Con estos antecedentes se decidioacute como primer objetivo la eliminacioacuten del
sistema Mrr Tipo IV en P pseudoalcaligenes CECT 5344
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
152
31 DISRUPCIOacuteN INSERCIONAL DEL GEN CROMOSOacuteMICO mrr (BN5_0077) DE P Pseudoalcaligenes CECT 5344
Para la creacioacuten del mutante R1∆mrr lo primero que se hizo fue amplificar un
fragmento genoacutemico que incluiacutea el gen mrr (882pb) (figuras 61 62 y 66A) utilizando
como cebadores la pareja de oligonucleoacutetidos mrrU y mrrL en una reaccioacuten de PCR (2rsquo
95degC 39 ciclos 30rsquorsquo 95degC 30rsquorsquo 588degC y 1rsquo 72degC 10rsquo 72degC) Se obtuvo un fragmento de
1977 pb cuyo tamantildeo se comproboacute por electroforesis en gel de agarosa 08 (figura
63) Como DNA molde se utilizoacute DNA genoacutemico (10 ng)
A continuacioacuten el producto de PCR purificado se ligoacute en el plaacutesmido pGEMreg-T Easy con una relacioacuten molar 31 (insertovector) el fragmento se insertoacute en orientacioacuten SP6-T7 (figura 64 figura 66B)
Figura 61 Sintenia del gen mrr (BN5_0077) El gen responsable de codificar al sistema de MR Tipo IV Mrr de P pseudoalcaligenes CECT 5344 estaacute marcado en azul Imagen obtenida de la base de datos GenDB (29)
Figura 62 Representacioacuten teoacuterica del producto de PCR con cebadores mrrU y mrrL Su tamantildeo teoacuterico es de 1977 pb Imagen realizada a escala con el programa SnapGene
Gel de agarosa 08 en el que se muestra en la primera calle el marcador de peso molecular λHindIII En la segunda calle se cargoacute el producto de PCR cuyo tamantildeo teoacuterico esperado es de 1977 pb lo cual coincide con el tamantildeo que se muestra en el gel
Figura 63 Amplificacioacuten por PCR del gen mrr de P pseudoalcaligenes CECT 5344
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
153
Esta construccioacuten (pGmrr) (figura 64A) se linearizoacute con la enzima de restriccioacuten NruI
(figura 66B) que deja extremos romos Por otro lado se purificoacute el plaacutesmido pMS255 y
se tratoacute con la enzima de restriccioacuten SmaI extrayendo con esta accioacuten el casete de
resistencia a gentamicina tambieacuten con extremos romos (figura 66C) Asiacute pues este
casete de gentamicina se insertoacute en el plaacutesmido pGmrr utilizando una proporcioacuten molar
de 51 (insertovector) en presencia de la DNA ligasa del fago T4 seguacuten se establece en
material y meacutetodos Esta construccioacuten final fue denominada pGmrr-gm (figura 66D) y
transferida a la cepa R1 por electroporacioacuten con una tasa de transformacioacuten de 15x102
(Tabla 12) Las bacterias transformadas obtenidas deberiacutean ser el resultado de una
mezcla de recombinacioacuten homoacuteloga doble o simple entre el gen nativo cromosoacutemico y
el correspondiente fragmento interno clonado en el vector suicida con la consiguiente
disrupcioacuten geacutenica por integracioacuten plasmiacutedica (4) Estos transformantes fueron
seleccionados en medio LB pH 85 maacutes gentamicina (10 microgml) Para favorecer la
probabilidad de seleccionar aquellas colonias en las que se hubiera dado una doble
recombinacioacuten sobre los transformantes que sufrieron recombinacioacuten simple se
escogieron varias colonias al azar y se incubaron en medio liacutequido sin antibioacutetico
posteriormente una aliacutecuota de este cultivo se sembroacute en placa con gentamicina por
el meacutetodo de agotamiento con el fin de obtener colonias aisladas de bacterias
transformantes que habiacutean sufrido una doble recombinacioacuten homoacuteloga entre el gen
nativo cromosoacutemico y el gen truncado por el casete de gentamicina y clonado en el
vector suicida (175)
La correcta sustitucioacuten del gen mrr se comproboacute mediante amplificacioacuten por PCR
de la regioacuten mutada utilizando los cebadores mrrU y mrrL (3rsquo a 95degC 29 ciclos de 30rsquorsquo
a 95degC 30rsquorsquo a 60degC 2rsquo a 72degC 10rsquo a 72degC) y DNA genoacutemico purificado de una colonia
transformante como molde El producto de PCR teoacuterico es de 2977 pb (1977 pb del
fragmento que contiene el gen mrr maacutes 1000 pb que presenta el casete de resistencia a
A B
Figura 64 Comprobacioacuten de la orientacioacuten del gen mrr en el vector de clonacioacuten pGEMreg-T
A Representacioacuten graacutefica del plaacutesmido pGenTeasy con el inserto mrr (pGmrr) en verde se sentildealan las enzimas de restriccioacuten (ApaI y HindIII) empleadas para digerir el plaacutesmido para comprobar la orientacioacuten del inserto B 1 Patroacuten de digestioacuten del DNAp pGmrr tras someterlo a digestioacuten doble con ApaI y HindIII La orientacioacuten del inserto es Sp6-T7 ya que se observa una banda de 4331 pb y otra de 682 pb en caso contrario apareceriacutea un patroacuten de bandas de 3600 y 1384 pb 2 Marcador de peso molecular 1Kb
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
154
gentamicina) que coincide con el encontrado experimentalmente (figura 65) (El
producto de la cepa silvestre se puede observar en la figura 63 y es de 1977 pb)
Se obtuvo asiacute la cepa P pseudoalcaligenes CECT 5344 R1∆mrrGmr (R1∆mrr) sobre
la cual se realizaron los experimentos de transformacioacuten Los datos muestran que la
ausencia funcional de la barrera del sistema Mrr no aumenta la eficiencia de la
transformacioacuten (Tabla 12)
Tabla 12 Eficiencia de transformacioacuten del mutante R1∆mrr (nordm de transformantesμg de DNAp) pSEVA 231 pSEVA 221 pGmrr-Gm KT2440 17 plusmn 04 x106 39 plusmn 01 x105 yen R1 lt1 lt1 15x102 R1∆mrr lt1 lt1 yen Las eficiencias de transformacioacuten se establecieron utilizando 600 ng de DNAp pGmrr-Gm para R1 La cantidad de DNAp pSEVA fue de 100 ng en todos los casos Para comparar las eficiencias se usaron las mismas preparaciones de plaacutesmidos para la trasformacioacuten de las colecciones de las cepas Las cepas se cultivaron hasta una DO600nm asymp 035 ndash 04 y se usoacute un equivalente de 5 ndash 7 ml de cultivo por transformacioacuten Los valores representan dos experimentos independientes para las transformaciones de KT2440 con los plaacutesmidos pSEVA El ensayo de la cepa R1 con el plaacutesmido pGmrr-Gm solo se realizoacute una vez con las condiciones descritas 6 experimentos de transformacioacuten independientes se realizaron para la cepa R1∆mrr con los dos plaacutesmidos pSEVA sin detectar transformantes yen No testado lt1 No transformantes detectados
Figura 65 Comprobacioacuten de la insercioacuten geacutenica del gen mrr interrumpido por el casete de Gm en el genoma de P pseudoalcaligenes 5344
1 Marcador de peso molecular 1Kb 2 Producto de PCR utilizando los cebadores mrrU y mrrL y DNAg R1∆mrr extraiacutedo de una colonia transformante En el caso de producirse recombinacioacuten homoacuteloga doble el producto de esta PCR ha de ser de 2977 pb (1977 pb fragmento que engloba a mrr+ 1000 pb del casete de gentamicina
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
155
A
B
C
D
A Disentildeo de cebadores mrrU y mrrL que amplifican un fragmento de 1977 pb en el que se engloba al gen mrr (882 pb) B Ligacioacuten del producto de PCR (inserto) con el vector pGemTeasy con lo que se obtiene el plaacutesmido pGmrr C Extraccioacuten del casete de gentamicina D Construccioacuten final pGmrr gm en el que el gen mrr se halla interrumpido por la insercioacuten del casete de Gm E Para definir la orientacioacuten del casete de gentamicina en el plaacutesmido pGmrr-gm se realizoacute una doble digestioacuten con las enzimas de restriccioacuten HindIII y EcoRV si el patroacuten resultante fuera de 5900 y 100 pb se tratariacutea de una orientacioacuten T7-SP6 pero tal como se muestra en el gel de agarosa el patroacuten es de 5000 y 1000 por lo que el casete se encuentra en posicioacuten Sp6-T7 Esquema realizado con el programa informaacutetico SnapGene
Figura 66 Esquema de la estrategia seguida para la construccioacuten del plaacutesmido PGmrr-gm
HindIII (696) E
EcoRV (1728)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
156
4 ELIMINACIOacuteN DE LA SUBUNIDAD HsdR (Tipo I) Y DEL SISTEMA McrBC (Tipo IV) EN P pseudoalcaligenes CECT 5344
En segundo lugar se intentoacute eliminar parte de los sistemas Tipo I y Tipo IV que
se encuentran muy cercanos en el genoma de P pseudoalcaligenes CECT 5344 (Figura
67) y teniendo en cosideracioacuten que el sistema de MR Tipo IV no estaacute presente en P
putida KT2440 (figura 60) Los sistemas MR Tipo I son enzimas multifuncionales que
pueden catalizar tanto la restriccioacuten (HsdR) como la modificacioacuten (HsdM) de manera
especiacutefica (HsdS) Como cofactores utilizan ATP Mg2+ y S-adenosilmetionina (AdoMet
o SAM) que es cofactor y donante de grupos metilos (176) Es posible que no se
encuentren dentro del mismo operoacuten pero que la transcripcioacuten de los genes esteacute
estrechamente ligada y que la ERasas dependientes de metilacioacuten del sistema Tipo IV
(McrC y McrB) sean compatibles con las MTasas del Sistema I (177)
Un sistema de MR tipo I generalmente comprende tres subunidades codificadas
por tres genes estrechamente unidos hsdR hsdM y hsdS (host specicifity DNA) hsdM
y hsdS se transcriben desde el mismo promotor aunque hsdR tiene el su propio
promotor Las dos subunidades codificadas por hsdM y hsdS HsdM y HsdS (a menudo
denominadas M y S) son necesarias y suficientes para la actividad metiltransferasa
(MTasa) La tercera subunidad (HsdR o R) se necesita para la restriccioacuten La subunidad
S (especificidad) incluye dos dominios de reconocimiento de objetivos (Target
Recognition Domains TRDs) HsdM incluye el sitio de unioacuten para AdoMet (o SAM) y el
sitio activo para la metilacioacuten del DNA HsdR incluye el sitio activo para la hidroacutelisis de
ATP y otras secuencias esenciales para la translocacioacuten del DNA ademaacutes de la actividad
endonucleasa (176)
BN5_3167BN5_3168 BN5_3169 BN5_3170 BN5_3171 BN5_3172
Figura 67 Sintenia de los Sistemas de MR Tipo I HsdRMS y de Tipo IV McrBC en P pseudoalcaligenes CECT 5344 Imagen realizada a escala con el programa informaacutetico SnapGene
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
157
Las endonucleasas de restriccioacuten dependientes de modificacioacuten (MDREs) se
definen como enzimas que cortan del DNA mucho mejor o solo si el sustrato (DNA) estaacute
modificado Tradicionalmente estas enzimas se dividen en ERasas de Tipo IIM (cortan
inmediatamente despueacutes de una o varias bases modificadas) y Tipo IV (cortan a una
distancia variable del sitio de modificacioacuten) (172)
Las modificaciones de DNA que protegen contra las ERasas convencionales
incluyen C-5-metilcitosina (m5C) 5-hidroximetilcitosina (hm5C) y su derivado con un
residuo de glucosa (ghm5C) N6-metieladenina (m6A) N4-metilcitosina (m4C) y
descubierto recientemente sustitucioacuten de un fosfodieacutester de la cadena de DNA por un
fosfotioeacutester (PT-DNA) (73)
Las ERasas de Tipo IV solo rompen DNA que ha sido modificado (metilacioacuten
hidroximetilacioacuten y glucosilhidroximetilacioacuten) El ejemplo mejor estudiado de este
grupo es McrBC de E coli K12 (EcoKMcrBC) que reconoce modificaciones m5C hm5C
y m4C Necesitan de Mg2+ para su actividad y es la uacutenica nucleasa conocida que utiliza
GTP para la restriccioacuten y la translocacioacuten de DNA (6473)
Puesto que eliminando la subunidad de restriccioacuten (HsdR) se evitariacutea la
degradacioacuten del DNA causada por el sistema Tipo I se decidioacute eliminar el gen hsdR
junto con los genes tipo IV de esta regioacuten cromosoacutemica
41 MUTANTE R1∆hsdR-mcrCBKmr (R1∆hsdR)
Para la construccioacuten de la cepa mutante CECT 5344 R1 ∆hsdR-mcrCBKmr
(R1∆hsdR) se procedioacute a la disrupcioacuten insercional de los genes hsdR (BN5_3167
BN5_3168) mcrC (BN5_3169) y mcrB (BN5_3170) por el casete de Km Para ello se
amplificaron fragmentos internos de hsdR y de mcrB y se clonaron por separado en el
vector de clonacioacuten pGEMreg-T Easy
411 Ligacioacuten del fragmento hsdR
Este fragmento se amplificoacute por PCR utilizando la pareja de cebadores HF1U y
HF1BamL tal y como se especifica en material y meacutetodos El producto de PCR que fue
de 592 pb se purificoacute en columna y el resultado se clonoacute en el vector con una relacioacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
158
molar 31 (insertovector) siguiendo lo descrito en material y meacutetodos de este trabajo
Posteriormente se transformoacute en XL1 blue MRFacute para obtener un mayor nuacutemero de
copias Mediante PCR de colonias utilizando como cebadores HF1U y HF1BamL se
comprobaron las ceacutelulas transformantes (figura 68) se comproboacute la orientacioacuten del
inserto se eligioacute una colonia en orientacioacuten T7-SP6 (figura 69) se purificoacute y cuantificoacute
quedando denominado con pGhsdR (figura 75A)
412 Ligacioacuten del fragmento mcrB
En este caso la pareja de cebadores utilizada fue MF2BamU y MF2L que
amplificaron un fragmento interno del gen mcrB de 702 pb seguacuten protocolo definido
en el apartado de Material y Meacutetodos El resultado se clonoacute en el vector con una relacioacuten
molar 31 (insertovector) siguiendo lo descrito en el apartado 86 de este trabajo
Posteriormente se transformoacute en XL1 blue MRFacute para obtener un alto nuacutemero de
copias Tras una PCR de colonias (figura 70) se seleccionaron aquellas que teniacutean
1 2 y 3 Digestiones realizadas con las enzimas de restriccioacuten ApaI y BamHI sobre DNAp pGhsdR Una orientacioacuten del inserto SP6-T7 dariacutea lugar a dos fragmentos 2980 pb y 628 pb mientras que una orientacioacuten T7-SP6 los fragmentos tendriacutean un tamantildeo de 3555 pb y de 53 pb con lo que se conseguiriacutea linearizar el vector conservando el fragmento interno del gen hsdR MW marcador de peso molecular 1Kb
Figura 69 Comprobacioacuten de la orientacioacuten de insercioacuten del fragmento H1 (hsdR)
Usando la pareja de cebadores HF1U y HF1BamL y utilizando DNAp extraiacutedo de las colonias transformantes El producto de PCR es de 592 pb por lo que se comprueba que las colonias de las calles 1 2 y 3 integraron el plaacutesmido pGhsdR
1Kb y 100bp Marcadores de peso molecular
Figura 68 Comprobacioacuten de la insercioacuten del fragmento H1 (hsdR) en el vector de clonacioacuten pGEMreg-T Easy
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
159
insertado el plaacutesmido en posicioacuten T7-SP6 (figura 71) se purificoacute y cuantificoacute quedando
denominado con pGmcrB (figura 75B)
413 Ligacioacuten pGhsdR linearizado con fragmento interno del gen mcrB
A continuacioacuten el vector pGhsdR fue linearizado mediante las enzimas de
restriccioacuten ApaI (extremo 5acute) y BamHI (extremo 3acute) que dejan extremos cohesivos Esta
construccioacuten con parte del gen hsdR (592 pb) integrado en el plaacutesmido se utilizariacutea
posteriormente como vector Por otro lado el plaacutesmido pGmcrB fue digerido con estas
mismas enzimas (ApaI y BamHI) y se extrajo un fragmento interno del gen mcrB de 740
pb con el extremo 5acuteen ApaI y el extremo 3acuteen BamHI Este fragmento se purificoacute en
gel comprobando asiacute su tamantildeo y se clonoacute en el plaacutesmido pGhsdR linearizado cuyos
extremos al ser cohesivos y complementarios se unieron en relacioacuten molar 31
(insertovector) a traveacutes de la reaccioacuten de la DNA ligasa T4 (Takara) (figura 75C)
restauraacutendose el sitio de restriccioacuten de BamHI y obteniendo la construccioacuten pGhsdR
mcrB (figura 75D) Nuevamente se transformoacute en XLI Blue MRFacute y se seleccionaron
varias colonias al azar para realizar una PCR de colonias (figura 72) con los cebadores
SP6 y T7 (2rsquo a 95degC 29 ciclos de 30rsquorsquo a 95degC 30rsquorsquo a 54degC 5rsquo y 36rsquorsquo a 72degC y 10rsquo a 72degC)
cuyo producto de PCR teoacuterico debe ser de 1457 pb que corresponde a la suma de los dos
fragmentos (592 pb hsdR y 702 pb mcrB)
Resultado de la PCR usando como molde DNAp extraiacutedo de las colonias tras la transformacioacuten y la pareja de cebadores MF2BamU y MF2L era de 701 pb por lo que se comprueba que excepto la colonia 3 el resto integraron el plaacutesmido pGmcrB 100 bp marcador
Figura 70 Comprobacioacuten de la insercioacuten del fragmento M2 (mcrB) en el vector de clonacioacuten
700
1 Doble digestioacuten con las enzimas de restriccioacuten ApaI y BamHI en el plaacutesmido pGmcrB Una orientacioacuten del inserto SP6-T7 dariacutea lugar a dos fragmentos 3667 pb y 51 pb mientras que una orientacioacuten T7-SP6 los fragmentos tendriacutean un tamantildeo de 2978 pb y de 740 pb Este uacuteltimo fragmento se purificoacute en gel de agarosa para poder ser usado como inserto 1Kb marcador de peso molecular
Figura 71 Comprobacioacuten de la orientacioacuten de la insercioacuten del fragmento M2 (mcrB)
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
160
414 Extraccioacuten del casete de Kanamicina
Por otro lado el casete de resistencia a kanamicina aph(3acute) (ver apartado
8111) se extrajo mediante digestioacuten con BamHI del plaacutesmido pG aph(3acute) y se purificoacute en
gel de agarosa (figura 75E)
415 Clonacioacuten de pGhsdR mcrB con casete de kanamicina
Por uacuteltimo el plaacutesmido pGhsdR mcrB se linearizoacute con BamHI y se insertoacute el casete
de kanamicina purificado con anterioridad cuyos extremos eran complementarios
con lo que se formoacute la construccioacuten final pG hsdR mcrB aph(3acute) (figura 75F) Se pudo
confirmar la direccioacuten de insercioacuten del casete de kanamicina ya que se produjo
amplificacioacuten al utilizar la pareja de cebadores T7 y 3U23 (Producto de PCR= 2303 pb)
y no lo hizo con la pareja de cebadores SP6 y 3U23 (2400 pb) lo que indicoacute que el casete
de kanamicina se insertoacute en direccioacuten SP6-T7 en la colonia seleccionada (colonia 2)
(Figura 73)
PCR de Colonias de XLI Blue MRFacute transformadas con el plaacutesmido pGhsdR-mcrB utilizando la pareja de cebadores SP6 y T7 cuyo producto de PCR teoacuterico debiacutea ser de 1457 pb la suma de 592pb (hsdR) y 702 pb (mcrB)
Figura 72 Comprobacioacuten de la construccioacuten del plaacutesmido pGhsdR-mcrB
Utilizando como molde los diferentes DNAp extraiacutedos de las colonias transformantes se realizaron con cada uno dos PCR una con la pareja de cebadores SP63U23 que amplifica un producto de PCR de 2303 pb teoacutericas si se produce esta amplificacioacuten significa que el casete de kanamicina se ha insertado en direccioacuten T7-SP6 Si por el contrario si al usar la pareja de cebadores T73U23 se produce la amplificacioacuten con un producto de PCR teoacuterico de 2400 pb la kanamicina se encuentra orientada en posicioacuten SP6-T7 Todos los DNAp probados excepto el 9 tienen una orientacioacuten del casete de Kanamicina SP6-T7 Los nuacutemeros hacen referencia al nuacutemero de colonia transformante seleccionada 1Kb marcador de peso molecular
1000
3000
Figura 73 Comprobacioacuten mediante PCR de la orientacioacuten del casete de Kanamicina
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
161
416 Mutageacutenesis de P pseudoalcaligenes CECT 5344
La construccioacuten final pG hsdR mcrB aph(3acute) purificada de la colonia 2 (figura 75F) fue
transferida a la cepa R1 por electroporacioacuten Se obtuvo una colonia (tasa de
transformacioacuten de 166 transformantes μg de DNAp) (tabla 13) la cual se crecioacute en LB
pH 85 y con Kanamicina como medio de seleccioacuten Posteriormente se extrajo el DNA
genoacutemico del mutante que fue utilizado como molde en la PCR que se realizoacute para
comprobar que efectivamente se habiacutea producido recombinacioacuten homoacuteloga doble y
no quedaban restos del vector de clonacioacuten suicida Se utilizoacute la pareja de cebadores
HF1 y MF2L en condiciones de PCR de 5 minutos a 95degC seguidos de 29 ciclos de 30
segundos a 95degC 30 segundos a 585degC y 5 minutos y 36 segundos a 72degC con una
extensioacuten final de 10 minutos a 72degC producieacutendose una amplificacioacuten de 2892 pb en
caso de que la mutageacutenesis dirigida no hubiera tenido eacutexito esta amplificacioacuten habriacutea
tenido un tamantildeo de 6602 pb (figura 74) Por lo tanto parece que el plaacutesmido suicida
se integroacute correctamente obteniendose el mutante de P pseudoalcaligenes CECT 5344
R1∆hsdR-mcrCBKmr (R1∆hsdR)
Con la cepa P pseudoalcaligenes CECT 5344 ∆hsdR-mcrCBKmr (R1∆hsdR) se
elaboraron ceacutelulas electrocompetentes tal y como se desarrolla en Material y meacutetodos
y se realizaron los experimentos de transformacioacuten (tabla 13) que muestran que no se
consiguioacute superar la barrera de los sistemas Tipo I y Tipo IV Esto puede ser debido a
que existe otra copia de estos sistemas en su cromosoma
Con los datos obtenidos cabe concluir que este sistema no es el responsable
uacutenico de la baja eficiencia en la transformacioacuten de P pseudoalcaligenes CECT 5344
1 PCR con pareja de cebadores HF1 y MF2L utilizando como molde DNAg del mutante R1∆hsdR de P pseudoalcaligenes Aparece un tamantildeo de producto de PCR de aproximadamente 2892 pb que coincide con el tamantildeo teoacuterico (suma de los fragmentos 592 pb de hsdR + 1613 pb de kanamicina + 702 pb de mcrB) Si no se hubiese producido la deleccioacuten por mutageacutenesis dirigida en los genes hsdR mcrC y mcrB el resultado habriacutea sido de un tamantildeo de producto de PCR de 6602 pb Marcadores de peso molecular 1Kb (tamantildeos en negro) y λHindIII (tamantildeos en blanco)
Figura 74 Comprobacioacuten de la insercioacuten geacutenica del fragmento hsdR-Km-mcrB en P pseudoalcaligenes CECT 5344
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
162
Tabla 13 Eficiencia de transformacioacuten del mutante R1∆hsdR (nordm de transformantesμg de DNAp pSEVA 621 pSEVA 631 pSEVA 681 pG hsdR mcrB aph(3acute) KT2440 325 plusmn 175 x105 12 plusmn 01 x106 3401 x105 yen R1 lt1 lt1 lt1 166 R1∆hsdR lt1 lt1 lt1 yen Las eficiencias de transformacioacuten se establecieron utilizando 600 ng de DNAp pG hsdR mcrB aph(3acute) para R1 La cantidad de DNAp pSEVA fue de 200 ng en todos los casos Para comparar las eficiencias se usaron las mismas preparaciones de plaacutesmidos para la trasformacioacuten de las colecciones de las cepas Se utilizaron las diferentes preparaciones de ceacutelulas electrocompetentes para las diferentes preparaciones de plaacutesmido Las cepas se cultivaron hasta una DO600nm asymp 035 ndash 04 y se usoacute un equivalente de 5 ndash 7 ml de cultivo por transformacioacuten Los valores representan dos experimentos independientes para las transformaciones de KT2440 con los plaacutesmidos pSEVA El ensayo de la cepa R1 con el plaacutesmido pG hsdR mcrB aph(3acute) solo se realizoacute una vez con las condiciones descritas 4 experimentos de transformacioacuten independientes se realizaron para la cepa R1∆mrr con los tres plaacutesmidos pSEVA sin detectar transformantes yen No testado lt1 No transformantes detectados
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
163
A Amplificacioacuten y ligacioacuten en el vector de clonacioacuten suicida pGEMreg-T Easy de un fragmento de 592 pb en el que se engloba al gen hsdR utilizando los cebadores HF1U y HF1BamL B Amplificacioacuten y ligacioacuten en el vector suicida pGEMreg-T Easyutilizando la pareja de cebadores MF2BamU y MF2L que amplifican un fragmento interno de 702 pb del gen mcrB C Ligacioacuten del vector pGhsdR linearizado con las enzimas de restriccioacuten ApaI y BamHI con el inserto extraiacutedo con las mismas enzimas del plaacutesmido pG mcrB D pG hsdR-mcrB plaacutesmido que contiene dos fragmentos internos de hsdR y mcrB en el que se ha reconstituido el sitio de corte de BamHI E Extraccioacuten del casete de Kanamicina mediante digestioacuten con BammH1 y ligacioacuten con pGhsdR-mcrB que ha sido linearizado con BamH1 F Construccioacuten final del plaacutesmido pG hsdR-mcrB aph(3acute) utilizado para realizar mutageacutenesis dirigida en R1 G Secuencia del genoma de la cepa mutante en la que se han sustituido los genes hsdR mcrC y mcrB por el casete de resistencia a kanamicina Esquema realizado con el programa informaacutetico SnapGene
Figura 75 Esquema de la estrategia para obtener la construccioacuten final del plaacutesmido pGhsdr-mcrB-Km
A B
D
E
F
G
C
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
164
5 EVALUACIOacuteN DE LA ELIMINACIOacuteN DE LAS BARRERAS DE RESTRICCIOacuteN TIPO I Y TIPO IV EN P PSEUDOALCALIGENES CECT 5344
Para comprobar la tasa de eficiencia de las dos cepas de P pseudoalcaligenes
CECT 5344 obtenidas (R1∆mrr y R1∆hsdR-mcrBC) se realizaron transformaciones con
plaacutesmidos pSEVA purificados (Kit de purificacioacuten de DNA plasmiacutedico INTRONBIO) de
E coli DH5 pero no se obtuvieron resultados satisfactorios (Tablas 12 y 13) con lo que
se concluyoacute que la eliminacioacuten de estos sistemas de MR no es suficientes para evadir
dichas barreras
En Staphylococcus aureus con dos cepas cliacutenicas distintas SA564 y UAMS-1 se
inactivaron en ambas cepas los sistemas hsdR y un sistema de tipo III (no especificado)
La cepa SA564 hsdR- aumentaba su tasa de eficiencia cuando el DNA plasmiacutedico
procediacutea de diferentes cepas de S aureus (RN4220 SA564 o UAMS-1) pero no se
produciacutea transformacioacuten si el origen del plaacutesmido era E coli DH5α Sin embargo esta
misma cepa SA564 Tipo III- o con ambos sistemas eliminados (sistemas hsdR y Tipo III)
aumentaba su tasa de eficiencia de transformacioacuten en todos los casos Por otro lado la
cepa UAMS-1 solo aumentoacute su eficiencia de trasformacioacuten de manera considerable
cuando ambos sistemas fueron eliminados (hsdR y Tipo III) En este caso la tasa de
eficiencia de transformacioacuten en la cepa UAMS-1 fue menor con los plaacutesmidos
procedentes de su propia cepa Esto sugiere que UAMS-1 tiene otras barreras que
reducen la transferencia de informacioacuten geneacutetica (178)
En Staphylococcus epidermidis bacteria recalcitrante a la transformacioacuten se ha
descubierto que entre cepas que tienen el mismo sistema de MR Tipo I la
transformacioacuten es maacutes efectiva Los sistemas MR tipo I y tipo IV de S epidermidis actuacutean
como fuertes barreras para la transformacioacuten En este estudio se demostroacute que la
transformacioacuten directa y eficiente de S epidemidis es posible utilizando plaacutesmidos
aislados de cepas de E coli DC10B (∆dcm eliminacioacuten de metilasa) que expresan las
enzimas HsdMS afines de S epidermidis (168)
Capiacutetulo 2 Resultados y Discusioacuten
165
En Haloferax volcanii los sistemas de MR reconocen y cortan sitios adenina
metilados 5acute- GATC ndash 3acute(dam+) para evitar estos sistemas y aumentar la eficacia de
transformacioacuten de esta bacteria el DNA plasmiacutedico utilizado se introduce primero en
una cepa mutante en dam de E coli (61)
Con estos antecedentes se purificaron los plaacutesmidos pSEVA de diversas
especies bacterianas E coli DH5α E coli GM48 y P putida KT2440 y se realizaron
distintos ensayos de transformacioacuten bacteriana (Tabla 14) La particularidad de E coli
GM48 es que carece de metiltransferasas hueacuterfanas Dcm y Dam (113) En P putida
KT2440 apenas se apreciaron diferencias en las transformacioacuten realizadas con el DNA
plasmiacutedico de distintos oriacutegenes (DH5α GM48 y KT2440) excepto con el plaacutesmido
pSEVA 681 cuya tasa de eficiencia fue mayor con el plaacutesmido purificado desde DH5α y
menor con el que procediacutea de la cepa GM48 (Tabla 15)
En cuanto a P pseudoalcaligenes CECT 5344 en ninguna de las tres cepas
silvestre R1 mutante R1∆mmr (ausencia del sistema mrr Tipo IV) y mutante R1∆hsdR-
mcrBC (ausencia de sistemas Tipo IV y Tipo I) se obtuvieron colonias transformantes
tras la transformacioacuten por electroporacioacuten (Tabla 14) Esto sugiere que P
pseudoalcaligenes CECT 5344 suple la ausencia de estos sistemas con los otros sistemas
de los que dispone (figura 58) por lo que seriacutea interesante realizar en futuros trabajos
un doble mutante de estas dos cepas (R1∆mrr y R1∆hsdR-mcrBC) ademaacutes de intentar
localizar un sistema de MR Tipo III (BN5_1777) eliminarlo y estudiar el comportamiento
de esta cepa
Para intentar franquear los sistemas de MR en el laboratorio se hace necesario
fijar la atencioacuten en coacutemo los fagos evitan la restriccioacuten Los fagos y plaacutesmidos provocan
cambios en la secuencia de DNA en el genoma que conllevan la eliminacioacuten de los sitios
de reconocimiento (TRDs) de los distintos sistemas de MR Algunos fagos tambieacuten
incorporan bases inusuales (por ejemplo la sustitucioacuten de una timina con 5-
hidroximetiluracilo) como proteccioacuten de su DNA contra los hospedadores con sistemas
de MR En otras ocasiones el primer gen que introduce el fago tras la infeccioacuten es el de
una MTasa que una vez codificada modifica y protege el DNA del fago dentro de la
bacteria infectada Otra manera de protegerse es el uso de proteiacutenas accesorias del
fago que se co-inyectan con el DNA y se unen al eacutel bloqueando los sitios de restriccioacuten
Resultados y Discusioacuten Capiacutetulo 2
166
del sistema de MR tipo I del hospedador El fago T3 codifica una hidrolasa SAM que
destruye la SAM intracelular poco despueacutes de la infeccioacuten esto no inhibe las ERasas
Tipo I y Tipo III ya unidas a SAM pero evita que las enzimas recieacuten sintetizadas
adquieran su cofactor Aun asiacute todaviacutea permanecen sin resolver muchos mecanismos
utilizados por los fagos para evadir la restriccioacuten de su hospedador (64)
Tabla 14 Eficiencia de transformacioacuten de las cepas R1∆mrr y R1∆hsdR-mcrBC de P Pseudoalcaligenes CECT 5344 (nordm de transformantesμg de DNAp)
CEPAS BACTERIANAS DESTINATARIAS
Plaacutesmidos purificados KT2440 GM48 R1 R1∆mrr R1∆hsdR-
mcrBC
Desde E coli DH5α
pSEVA 231 76 x 105 44 x 104 lt1 lt1 pSEVA 631 12 x 106 17 x 104 lt1 yen lt1 pSEVA 221 15 x 105 22 x 103 lt1 lt1 pSEVA 621 90 x 105 46 lt1 yen lt1 pSEVA 281 4 74 x 104 lt1 lt1 pSEVA 681 12 x 106 54 lt1 yen lt1
Desde P putida
KT2440
pSEVA 231 10 x 105 yen lt1 lt1 pSEVA 631 43 x 106 yen lt1 yen lt1 pSEVA 221 40 x 105 yen lt1 lt1 pSEVA 621 64 x 105 yen lt1 yen lt1 pSEVA 681 10 x 105 yen lt1 yen lt1
Desde E coli GM48
pSEVA 231 22 x 105 yen lt1 lt1 pSEVA 631 94 x 105 yen lt1 yen lt1 pSEVA 221 30 x 104 yen lt1 lt1 pSEVA 621 25 x 105 yen lt1 yen lt1 pSEVA 681 57 x 104 yen lt1 yen lt1
Las eficiencias de transformacioacuten se establecieron utilizando 600 ng de DNAp pSEVA para R1 R1∆mrr y R1∆hsdR-mcrBC y de 100 ng de DNAp pSEVA para KT2440 y GM48 Para comparar las eficiencias se usaron las mismas preparaciones de plaacutesmidos para la trasformacioacuten de las colecciones de las cepas Las cepas se cultivaron hasta una DO600nm asymp 035 ndash 04 y se usoacute un equivalente de 5 ndash 7 ml de cultivo por transformacioacuten yen No testado lt1 No transformantes detectados
V DISCUSIOacuteN GENERAL
Discusioacuten General
169
La bacteria gram negativa P pseudoalcaligenes CECT 5344 es capaz de asimilar
cianuro en su forma libre y a pH alcalino (24) y este es uno de los motivos por el cual es
ampliamente estudiada con el fin de mejorar sus posibilidades biotecnoloacutegicas
P pseudoalcaligenes CECT 5344 utiliza el cianuro como fuente de nitroacutegeno sin
embargo eacuteste compuesto es una peacutesima fuente de carbono por lo que para el
crecimiento de la bacteria se hace necesario la utilizacioacuten de una fuente de carbono
adicional En trabajos anteriores se han probado como fuentes de carbono en el
metabolismo cianotroacutefico algunos de los metabolitos implicados en el ciclo de Krebs
tales como citrato succinato piruvato y fumarato Con todas estas fuentes de carbono
la bacteria es capaz de asimilar cianuro (179) pero ninguna es tan apropiada como el
DL-malato (136)
El L-malato que es el isoacutemero natural es un donador directo de la cadena de
transporte electroacutenico gracias a una actividad L-MalatoQuinona oxidorreductasa
(MQO) asociada a una cadena de transporte electroacutenico e implicada en el metabolismo
del cianuro (90) En cuanto al D-malato como sustrato se detectoacute una actividad D-
malato oxidasa la cual se ha caracterizado en este trabajo siendo eacutesta sensible a
cianuro (figura 35) Como resultado de las investigaciones se ha desarrollado un
meacutetodo espectrofotomeacutetrico capaz de detectar y cuantificar esta actividad de manera
raacutepida y efectiva que junto con el descubrimiento del gen que codifica dicha actividad
(BN5_4044) y demostrando su naturaleza proteica (se trata de un diacutemero de
aproximadamente 100 KDa) abre un amplio abanico de utilidades biotecnoloacutegicas
tales como la construccioacuten de biosensores que detecten el exceso de aacutecido maacutelico
utilizado en la industria alimentaria como acidulante E-296 en los procesos productivos
de zumos vinos salsas y otros alimentos en los que se incorpora la mezcla raceacutemica de
este compuesto Pero no solo tiene aplicaciones en la industria alimentaria esta
actividad ademaacutes presenta afinidad por otros sustratos tales como el D-2-
Hidroxiglutarato (D-2-HG) y el D-lactato El D-2-HG es un metabolito asociado con
numerosos tipos de caacutencer y desoacuterdenes neurometaboacutelicos en humanos (95ndash97) por lo
que seriacutea muy interesante inmovilizar esta proteiacutena en un biosensor y utilizarlo como
indicador tumoral en los casos de aciduria de D-2-HG
Discusioacuten General
170
En cuanto al papel fisioloacutegico de esta actividad DMO posiblemente se trate de
una proteiacutena periplaacutesmica anclada a la cara externa (lado intermembranal) de la
membrana plasmaacutetica que oxida la moleacutecula de D-malato a oxalacetato utilizando
Zn2+ como cofactor Cabe suponer que la enzima transfiere los electrones directamente
al citocromo c intermediario de la cadena de transporte electroacutenico tal y como
sugieren estudios realizados con otras enzimas que oxidan D-2-hidroaacutecidos (9798101)
Por otro lado esta actividad podriacutea tener importancia en la proteccioacuten de la bacteria
frente al cianuro ya que el oxalacetato producido por la oxidacioacuten del D-malato
reacciona quiacutemicamente con el NaCN formando cianhidrina que puede ser utilizado
como fuente de nitroacutegeno para el crecimiento de la bacteria (90) Otro posible papel
fisioloacutegico es el que se contempla en la bacteria P stutzeri A1501 en la cual la D-2-
Hidroxiglutarato Deshidrogenasa (D-2-HGDH) estaacute implicada de manera dual en la
utilizacioacuten de D-malato y en la siacutentesis de serina (92) En P stutzeri A1501 l la expresioacuten
de la D-2-HGDH es inducida por D-malato o D-2-HG (92) hecho este que contrasta con
lo observado en P pseudoalcaligenes CECT 5344 puesto que la actividad DMO no es
inducible en presencia de D-malato cuando se utiliza como uacutenica fuente de carbono
pero si lo es en presencia de succinato (figura 38)
El descubrimiento del gen que codifica la actividad DMO ademaacutes de poder
realizar la clonacioacuten y la expresioacuten heteroacuteloga del mismo en E coli XL1 permitioacute la
buacutesqueda de la cepa mutante en ese gen de P putida KT2440 (Pputida KT2440 ∆5154)
con la cual se realizaron curvas de crecimiento diferenciales con L-malato y D-malato
como fuentes de carbono con la cepa silvestre El hecho de que el crecimiento sea
mayor con L- que con D-malato tanto en el WT como en el mutante estaacute de acuerdo
con el papel de la DMO (figura 76) La cesioacuten directa de un par de electrones del D-
malato al citocromo c supone ldquocortocircuitarrdquo el paso de estos electrones por el
complejo I y II y por lo tanto un menor rendimiento energeacutetico Por otra parte se puede
concluir que a diferencia de lo descrito P stutzeri A1501 en P pseudoalcaligenes CECT
5344 existe una ruta alternativa a la DMO para la asimilacioacuten de D-malato
Con todos los datos obtenidos se puede realizar una aproximacioacuten de una de las
rutas metaboacutelicas en la que podriacutea estar involucrada la DMO (figura 76)
Discusioacuten General
171
El motivo por el que se decidioacute trabajar con P putida KT2440 y la cepa mutante
en el ortoacutelogo del gen dmo de P pseudoalcaligenes CECT 5344 fue por la poca capacidad
que tiene esta uacuteltima para la transferencia geacutenica horizontal (5455) debido en parte
a los Sistemas de Modificacioacuten-Restriccioacuten (Sistemas RM) con los que P
pseudoalcaligenes CECT 5344 se protege frente a fagos y DNAs exoacutegenos
Los sistemas de MR juegan un papel central en la defensa de los organismos
procariotas y se clasifican en cuatro tipos principales El sistema Tipo I es un
multicomplejo compuesto por diferentes subunidades Enzima de restriccioacuten (ERasa
R) Metiltransferasa (MTasa M) y la subunidad de especificidad de reconocimiento del
DNA (S) distribuidas estas subunidades en diferentes combinaciones (69) P
pseudoalcaligenes CECT 5344 presenta dos sistemas Tipo I uno de ellos compuesto por
las tres subunidades (RSM) y cuya secuencia de reconocimiento es
GCCANNNNNNTTA y otro que carece de la subunidad R (SM) aunque tambieacuten se
tiene identificada su secuencia de reconocimiento GAGNNNNNNCTGG (Tabla 15)
En el sistema Tipo II las subunidades MTasa y ERasa estaacuten separadas aunque
parece ser que muestran la misma especificidad de unioacuten al DNA Dentro de este grupo
se engloban las MTasas hueacuterfanas (69) P pseudoalcaligenes CECT 5344 tiene tres
sistemas Tipo II RM uno de los cuales tiene identificada la secuencia de
Figura 76 Posible ruta metaboacutelica de la oxidacioacuten de d-malato a oxalacetato catalizada por la DMO DMO D-malato oxidasa citC citocromo c Por motivos de simplicidad se ha omitido la traslocacioacuten del par electroacutenico en la cadena de transporte
Discusioacuten General
172
reconocimiento AATATT y dos sistemas de MTasas hueacuterfanas en el que una de ella
tiene como secuencia de reconocimiento GGCC (Tabla 15)
En el sistema Tipo III la MTasa solo contiene dominios especiacuteficos de unioacuten a
DNA y forma un complejo con la ERasa realizando el corte del DNA extrantildeo fuera de la
regioacuten de reconocimiento (69) P pseudoalcaligenes CECT 5344 presenta un sistema de
este tipo (Tabla 15)
En los sistema Tipo IV la REasas cortan el DNA que estaacute metilado de manera
incorrecta (MDREs) y no presentan componente MTasa (69) P pseudoalcaligenes CECT
5344 presenta en su genoma tres sistemas Tipo IV Mrr McrC y McrB (Tabla 15)
Tabla 15 Listado de los Sistemas de Modificacioacuten Restriccioacuten de P pseudoalcaligenes CECT 5344
TIPO SISTEMA MR
NOMBRE GEN (REBASE)
NOMBRE GEN (GENDB)
LOCUS PREDICCIOacuteN DE SECUENCIA DE RECONOCIMIENTO
I R Pps5344IIIP hsdR BN5_3167BN5_3168 GCCANNNNNNTTA I S SPps5344III hsdS BN5_3171 GCCANNNNNNTTA I M MPps5344III hsdM BN5_3172 GCCANNNNNNTTA I S SPps5344II hsdS BN5_3558 GAGNNNNNNCTGG I M MPps5344II hsdM BN5_3560 GAGNNNNNNCTGG II R Pps5344ORF914P Ppsal_930 BN5_0913 II M MPps5344ORF914P sinIM BN5_0914 II R Pps5344IP Ppsal_3527 BN5_1030 AATATT II M MPps5344I BN5_1031 AATATT II M MPps5344ORF1740P dcmB BN5_1740 GGCC II M MPps5344ORF1977P dcm BN5_1977 II RM Pps5344ORF4076P yeeA BN5_4076 III R Pps5344ORF1777P Ppsal_2894 BN5_1776
IV R Pps5344MrrP mrr BN5_0077 IV R Pps5344McrCP mcrC BN5_3169 IV R Pps5344McrBP mcrB BN5_3170
Como primera estrategia para poder generar una cepa de P pseudoalcaligenes
CECT 5344 susceptible a la transformacioacuten geacutenica con una eficiencia superior a la cepa
Discusioacuten General
173
silvestre se decidioacute truncar el sistema MR tipo IV Mrr ya que este podriacutea ser la causa de
la baja eficiencia de transformacioacuten como ocurre por ejemplo en B anthracis que tiene
3 sistemas Tipo IV (171) o en E coli con un sistema Tipo IV Mrr que funciona de manera
independiente al resto de sus sistemas de MR (174)
Para comparar resultados de transformacioacuten se utilizoacute P putida KT2440
(KT2440) como cepa faacutecilmente transformable por electroporacioacuten(163) y que no
presenta sistema de MR tipo IV (figura 60) Se utilizaron plaacutesmidos pSEVA (129) con
diferentes oriacutegenes de replicacioacuten para realizar transformaciones geacutenicas tanto en P
putida KT2440 (KT2440) como en P pseudoalcaligenes CECT 5344 (R1) Los resultados
obtenidos (Tabla 11) confirmaron que efectivamente R1 es difiacutecil de transformar ya
que no se apreciaron colonias transformantes mientras que por el contrario todas las
transformaciones realizadas en KT2440 tuvieron eacutexito La cepa mutante en el sistema
Mrr de P pseudoalcaligenes CECT 5344 (R1∆mrr) obtenida por mutageacutenesis dirigida
tampoco consiguioacute elevar la tasa de eficiencia de transformacioacuten (Tabla 12) por lo que
se deduce que la eliminacioacuten de este uacutenico sistema de MR no es suficiente para la
generacioacuten de una cepa hipertransformante de R1
Similar resultado se obtuvo al eliminar la subunidad HsdR (integrante del
sistema Tipo I RSM) y otro de los sistemas Tipo IV (McrC ndash McrB) La cepa mutante
R1∆hsdR no obtuvo resultados positivos en las transformaciones realizadas (Tabla 13)
En ambas cepas mutantes (R1∆mrr y R1∆hsdR) se intentoacute por uacuteltimo realizar
las transformaciones geacutenicas con DNA plasmiacutedico procedente de la cepa GM48 de E
coli que carece de MTasas hueacuterfanas (Dcm y Dam) (113) con los mismos resultados
nefastos que en casos anteriores (Tabla 14)
A la vista de estos resultados el siguiente marco de actuacioacuten podriacutea ser intentar
eliminar la subunidad hsdR del Tipo I y el sistema Tipo III que ha dado muy buenos
resultados en trabajos realizados con Staphylococcus aureus SA564 (72) Otra posible
actuacioacuten futura para intentar aumentar la tasa de transformacioacuten geacutenica podriacutea ser la
metilacioacuten in vitro del plaacutesmido a integrar en la bacteria con una MTasa apropiada
como ocurrioacute en el trabajo realizado con Neisseria gonorrhoeae que es una especie
Discusioacuten General
174
bacteriana que produce al menos cinco ERasas diferentes y once DNA Metilasas
hueacuterfanas que impiden la adquisicioacuten de DNA foraacuteneo (180)
Como reflexioacuten final las ERasas de las bacterias son las centinelas frente a la
invasioacuten de DNAs exoacutegenos Sin embargo al mismo tiempo los genomas invasores
(fagos y plaacutesmidos) han desarrollado multitud de estrategias anti-restriccioacuten para
incrementar sus posibilidades de infeccioacuten Las bacterias contraatacan mediante la
adquisicioacuten de sistemas de MR adicionales con distintas especificidades de
reconocimiento En el turno de los fagos eacutestos introducen modificaciones de DNA
(metilacioacuten o glucosidacioacuten) o disminuyen las secuencias palindroacutemicas Las bacterias
con sus sistemas de MR altamente especiacuteficos desarrollan sistemas de ERasas
promiscuas para mejorar la proteccioacuten frente al DNA invasor obteniendo una ventaja
fiacutesica durante la carrera armamentiacutestica co-evolutiva hospedador-paraacutesito (figura 77)
(181)
Discusioacuten General
175
Figura 77 Carrera armamentiacutestica entre fagos y bacterias A En ausencia de un sistema MR el fago emerge como ganador debido a su capacidad de infectar a la bacteria B La bacteria se adapta adquiriendo un sistema MR que ahora puede eliminar a los elementos invasores de DNA C Esto a su vez conduce al desarrollo de estrategias anti-restrictivas en los fagos D Sin embargo una ERasa promiscua eliminariacutea incluso a aquellos fagos equipados con mecanismos anti restriccioacuten lo que le confiere a las bacterias una ventaja de supervivencia Imagen extraiacuteda de (181)
VI CONCLUSIONES
179
C O N C L U S I O N E S
1 La proteiacutena D-malato oxidasa de P pseudoalcaligenes CECT 5344 es un diacutemero
estaacute codificada por el gen BN5_4044 que cataliza la oxidacioacuten del D-malato
oxidasa a oxalacetato independiente de NAD(P)H y cuya ubicacioacuten celular
parece ser el periplasma
2 El ioacuten Zn2+ es un potente activador de la actividad D-malato oxidasa en P
pseudoalcaligenes CECT 5344
3 La proteiacutena D-malato oxidasa de P pseudoalcaligenes CECT 5344 puede
catalizar la oxidacioacuten de los sustratos D-malato D-2-hidroxiglutarato y D-
lactato y ceder los electrones a la cadena respiratoria a traveacutes del citocromo c
4 La eliminacioacuten del sistema de MR Mrr (Tipo IV) de P pseudoalcaligenes CECT
5344 no mejora la eficiencia de transformacioacuten de dicha bacteria
5 La eliminacioacuten simultaacutenea de los sistemas de MR HsdR (tipo I) y mcrBC (tipo
IV) de P pseudoalcaligenes CECT 5344 no es suficiente para superar la barrera
para que se produzca la transferencia geacutenica horizontal con alta eficiencia
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- IacuteNDICE
- I INTRODUCCIOacuteN
- 1 LA CONTAMINACIOacuteN Y EL MEDIO AMBIENTE LA BIOTECNOLOGIacuteA
- 2 EL CIANURO
-
- 21 FUENTES DE CIANURO
- 22 TOXICIDAD DEL CIANURO
- 23 ELIMINACIOacuteN DEL CIANURO
-
- 3 EL GEacuteNERO PSEUDOMONAS
-
- 31 Pseudomonas pseudoalcaligenes
- 32 Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344
-
- 4 SISTEMAS DE MODIFICACIOacuteN RESTRICCIOacuteN (MR)
-
- 41 SISTEMAS DE MR TIPO I
- 42 SISTEMAS DE MR TIPO II
- 43 SISTEMAS DE MR TIPO III
- 44 SISTEMAS DE MR TIPO IV
- 45 EVOLUCIOacuteN DE LOS SISTEMAS DE MR
-
- 5 EL PERIPLASMA PROCARIOTA
- 6 EL AacuteCIDO MAacuteLICO
- 7 BIOSENSORES
- II OBJETIVOS
- III MATERIAL Y MEacuteTODOS
- 1 MATERIAL BIOLOacuteGICO
- 2 MEDIOS Y CONDICIONES DE CULTIVO
-
- 21 MEDIOS LIacuteQUIDOS DE CULTIVO
-
- 211 Medio Luria-Bertani (LB o medio rico)
- 212 Medio M9
- 213 Medio SOB
- 214 Medio SOC
- 215 Medio GYT
-
- 22 MEDIOS DE CULTIVO SOacuteLIDOS CON AGAR
- 23 MEDIOS SELECTIVOS
-
- 231 Antibioacuteticos
-
- 24 CONDICIONES DE CULTIVO
- 25 PUREZA Y CONSERVACIOacuteN DE LOS CULTIVOS
-
- 3 OBTENCIOacuteN DE EXTRACTOS ACELULARES
-
- 31 RECOGIDA DE CEacuteLULAS
- 32 ROTURA DE CEacuteLULAS
- 33 FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
-
- 4 DETERMINACIONES ANALIacuteTICAS
-
- 41 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE CIANURO
- 42 DETERMINACIOacuteN DE LA CONCENTRACIOacuteN DE PROTEIacuteNAS
-
- 421 Meacutetodo de Bradford
- 422 Meacutetodo de Lowry
-
- 5 DETERMINACIOacuteN DE ACTIVIDADES ENZIMAacuteTICAS
-
- 51 ACTIVIDAD FUMARASA L-MALATO HIDRO-LIASA (EC 4212)
- 52 ACTVIDAD ACONITASA (EC 4213)
- 53 ACTIVIDAD NITRATO REDUCTASA (EC 17994)
- 54 ACTIVIDAD SUCCINATO OXIDASA (EC 1351)
- 55 ACTIVIDAD MALATOQUINONA OXIDORREDUCTASA (EC 1154)
- 56 CARACTERIZACIOacuteN DE LA ACTIVIDAD D-MALATO OXIDASA (DMO-EC 1124)
-
- 561 Electroforesis nativa en geles de poliacrilamida (native ndashPAGE)
- 562 Meacutetodo espectrofotomeacutetrico
-
- 5621 Determinacioacuten del coeficiente de extincioacuten molar del formazaacuten (INT reducido)
- 5622 Determinacioacuten de la especificidad de sustrato de la DMO
- 5623 Determinacioacuten de la Km para diferentes sustratos
- 5624 Temperatura oacuteptima de la DMO
- 5625 pH oacuteptimo de la DMO
-