caracterización de rutas metabólicas de las bacterias
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Caracterización de Rutas Metabólicas de las Bacterias Ácido Lácticas Presentes en la
Fermentación del Cacao Theobroma cacao
Miguel Bravo Gaviria
Proyecto de grado, Ingeniería Química, Biología, Universidad de los Andes
Asesores: Andrés González Barrios
Alejandro Reyes Muñoz
Resumen: La fermentación del cacao se considera una etapa de procesamiento de gran importancia. Esto se
debe a que todos los precursores que ayudan a generar los perfiles de sabor en el producto final son producidos
a partir de los cambios que suceden durante la fermentación. Se conocen distintos grupos de microrganismos
que se encuentran presentes durante este proceso, entre los cuales los de mayor importancia se consideran las
levaduras, las bacterias ácido lácticas y las bacterias ácido acéticas. Cada cual tiene sus distintas funciones
durante el proceso y generan condiciones que afectarán los cotiledones del cacao. En el presente trabajo se
modelaron dos especies de bacterias ácido lácticas, Lactobacillus plantarum y Lactobacillus fermentum con el
objetivo de buscar distintos compuestos que aportan al sabor del chocolate, así como entender sus interacciones
durante el proceso. A partir de la reconstrucción del genoma, se realizó un proceso de anotación por medio de
la herramienta RAST, para obtener una primera aproximación de la red metabólica. Se realizó adicionalmente un
primer acercamiento a la curación de la red para poder realizar modelamientos por medio de algoritmos como
FBA y SteadyCom. Este último permite optimizar el crecimiento de dos o más organismos que comparten el
mismo espacio. A partir de la anotación genética, se observó que estas especies no parecen producir compuestos
precursores del sabor. Además, por medio de las simulaciones se logró obtener perfiles de producción de lactato
para las dos especies, en donde los perfiles de producción de biomasa alcanzaron un valor de 25ℎ−1. La
producción de lactato para los dos modelos alcanzo un flujo máximo de 1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ cuando el límite de
glucosa se estableció en 500 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. Aunque las simulaciones de SteadyCom no arrojaron resultados
importantes debido a la falta de curación del modelo, se observó una producción de biomasa que alcanzó 125
𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ cuando la glucosa se estableció en 400 𝑚𝑚𝑜𝑙/ℎ. Por medio de estos resultados, se concluyó que
la glucosa es un compuesto limitante en el crecimiento de los organismos, además de que SteadyCom es una
metodología adecuada para la simulación de modelos conjuntos de organismos. Por otro lado, la modelación de
organismos a partir de la anotación de sus genomas requiere una gran cantidad de tiempo y no resulta eficiente
cuando se desea observar el comportamiento de pocas rutas de la red metabólica.
Palabras Clave: Theobroma cacao, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Fermentación, SteadyCom
1. Introducción
El proceso de fermentación para la fruta del cacao
Theobroma cacao se da de forma variable en distintos
lugares del mundo dependiendo de la cantidad que se
tenga para procesar. Esto se puede hacer apilando en
montones el cacao y cubriéndolo con hojas, técnica
utilizada mayormente en plantaciones pequeñas, o
también por medio de la técnica de fermentación en
caja, en la cual se utilizan mayormente cajas de
madera capaces de albergar entre 1 y 2 toneladas de
producto (Lima & Nout, 2013).
La fruta del cacao consiste en una agregación de
semillas además de una pulpa mucilaginosa que
contiene aproximadamente un 83% agua, 12%
azucares como glucosa, fructosa y sacarosa, 2%
pentosas, 1% ácido cítrico y 1% pectina además de
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otros polisacáridos (Pettipher, 1986). Cada uno de
estos compuestos funciona como substrato para el
crecimiento de los distintos organismos que se
presentan durante el proceso de fermentación
(Galvez et al., 2007). El pH cambiará dependiendo de
la concentración de ácido cítrico en la pulpa y puede
tomar valores entre 3.0 y 4.0 (Schwan et al., 2014).
Para que la fermentación se dé de forma correcta es
necesario que los embriones mueran, proceso que
sucede debido a la difusión de compuestos como
etanol, ácido acético y ácido láctico, que con el calor
producido por los distintos procesos microbianos lo
finalizan (Hansen et al., 1998). Esto desencadena una
serie de procesos de descomposición de las paredes
celulares acompañado por una baja en el pH de las
semillas de 7.0 a 5.0 que permite la activación de
enzimas que degradan las proteínas de los cotiledones
en distintos aminoácidos y péptidos (Schwan et al.,
2014). En cuanto a los proceso que ocurren fuera de
la semilla es importante determinar cuáles son los
organismos presentes, pues sus procesos metabólicos
pueden cambiar de forma importante dependiendo
de la estructura poblacional que se tenga.
Entre estos organismos, existen tres grupos a los
cuales se les atribuye la mayor parte de los efectos
que se producen durante la fermentación. Estas son
las levaduras, las bacterias ácido lácticas y las
bacterias ácido acéticas (Coppeti et al., 2011). Los
microorganismos son introducidos al proceso de
manera natural y pueden provenir de las manos de los
trabajadores, utensilios usados para el transporte,
apertura de la mazorca o de los mismos recipientes
donde se haga el proceso de fermentación (Ostovar &
Keeney 1973). También se ha sugerido la importancia
de ciertos vectores como moscas de la fruta, abejas y
otros insectos en la introducción de los
microorganismos (Ostovar & Keeney 1973).
En cuanto a los grupos responsables de la
fermentación, las levaduras son las más estudiadas,
debido a que se han aislado de manera frecuente y se
consideran esenciales para que el proceso se dé de
manera apropiada (Schwan et al., 2014). Entre las
especies que más se encuentran durante la
fermentación del cacao en Brasil, están
Saccharomyces cerevisiae, Hanseniaspora uvarum y
algunas especies de los géneros Candida y Pichia
(Pereira et al., 2012).
Las levaduras inician el proceso de fermentación
alcohólica, consumiendo azucares y produciendo
etanol y dióxido de carbono, además de distintos
compuestos como parte del metabolismo secundario
(Romano et al., 2003). El etanol producido durante el
crecimiento de las levaduras sirve como sustrato para
el posterior crecimiento de las bacterias ácido
acéticas, pero también puede permear las semillas y
causar su muerte (Quesnel 1965). Por otro lado, el
aumento de dióxido de carbono en el medio mejora
las condiciones para el crecimiento de las bacterias
ácido lácticas. Otro aspecto importante en este grupo
es la degradación de la pulpa, generando así el
exudado que se produce durante la primera etapa del
proceso (Schwan et al., 1995). Esto último favorece la
entrada de oxígeno en el sistema, que ayuda
posteriormente al crecimiento de la comunidad de
bacterias ácido acéticas. Finalmente, la muerte de
estos organismos puede proveer micronutrientes
como vitaminas y aminoácidos a los demás grupos
(Fleet 2003).
Las bacterias ácido lácticas actúan en las primeras
etapas del proceso y lo dominan justo después que la
comunidad de levaduras empieza a decaer. Estos
microorganismos producen lactato como producto de
la fermentación y pueden consumir glucosa u otras
azucares además de citrato. Las especies que más se
asocian a este proceso en Brasil y Ecuador son
Lactobacillus fermentum y Lactobacillus plantarum,
debido a que se pueden encontrar en grandes
cantidades y suelen dominar en tamaño poblacional
frente a otras especies (Papalexandratou et al., 2011;
Garcia-Armisen et al., 2010; Illeghems et al., 2011).
Funcionalmente, las bacterias ácido lácticas al
producir lactato y consumir citrato del medio, son
capaces de regular el pH del medio, lo que permite la
activación de enzimas dentro de las semillas del cacao
(De Vuyst et al. 2010). Sin embargo, la producción de
lactato se considera en algunos casos indeseable
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debido a la capacidad de este compuesto de entrar en
las semillas y generar niveles de acidez en el sabor del
producto final (De Vuyst et al. 2010). Es también
conocido, que este grupo es capaz de producir
sustancias con funciones antimicrobianas que pueden
afectar las comunidades de otros grupos (Fleet 2003).
En cuanto a las bacterias ácido acéticas, existen
muchas especies que se han encontrado durante la
fermentación. Entre ellas están Acetobacter
pasteurians, Acetobacter tropicalis, Acetobacter
lovaniensis y Glucanobacter oxydans (Garcia-Armisen
et al., 2010). Se conoce que los organismos que hacen
parte de este grupo se encuentran desde el comienzo
del proceso de fermentación, pero la falta de oxígeno
en el medio limita su crecimiento. En el momento que
la concentración de oxígeno aumenta, el crecimiento
de este grupo se da de manera acelerada, utilizando
el etanol presente en el medio y produciendo ácido
acético (Lima et al., 2011). Este proceso se da de
manera exotérmica, lo que lleva a una subida de la
temperatura del fermentado hasta 50°C (De Vuyst et
al. 2010). Estos cambios generan finalmente la muerte
de las semillas y su desorganización interna, ayudando
a la producción de compuestos precursores que
generan los distintos sabores del chocolate (Lima
et al., 2011).
Una reconstrucción metabólica de un organismo que
ha sido curada, contiene las distintas reacciones que
se presentan dentro de este, ya sea parte del
metabolismo central o de intercambio. (Price et al.,
2004). Estos modelos pueden utilizarse para simular
su comportamiento frente a condiciones en las cuales
las concentraciones de ciertos compuestos cambian,
permitiendo entender su funcionamiento (Reed &
Palsson, 2003). La construcción y solución de estos
modelos se basa en la formulación de restricciones,
así como una función objetivo, que definen el
problema de manera lineal. Para la modelación de
redes metabólicas se usa el estado estacionario del
sistema, por lo que la restricción principal del sistema
es que la suma de todos los flujos en los que participa
cada metabolito sea igual a cero, basado en la
estequiometria de las reacciones. La forma de
modelar organismos individuales más utilizada es el
análisis de balance de flujo (FBA) (Orth et al., 2010).
Para el modelamiento de consorcios existen dos
aproximaciones que son principalmente usados, Joint
FBA y OptCom. El primero crea un espacio para el
intercambio de metabolitos entre especies en donde
la función objetivo es la suma de las reacciones de
biomasa, por lo que es necesario agregar nuevas
restricciones para modelar un comportamiento lo
más real posible (Stolyar et al., 2007). OptCom utiliza
las mismas restricciones que los modelos basados en
Joint FBA, pero su función objetivo se diferencia en
usar una formulación de dos niveles, donde la función
de biomasa es la función objetivo interna, y la biomasa
de la comunidad es la externa (Zomorrodi & Maranas,
2012). También es posible la utilización de otra
función que tenga en cuenta parámetros del
consorcio.
SteadyCom es un modelo de optimización para
consorcios basado en joint FBA, y se considera una
forma generalizada del mismo (Chan et al., 2017). La
principal ventaja de este modelo está en la predicción
de comunidades sin necesidad de imponer una
cantidad adicional de restricciones. Este modelo es
además compatible con análisis de variabilidad de
flujo (FVA), lo que hace que esta sea una herramienta
importante que puede ser usada para modelar las
comunidades microbianas de manera más
aproximada.
Para poder realizar estas simulaciones, es necesario
generar los modelos adecuados, los cuales son de
análisis y reconstrucción basados en restricciones o
COBRA por sus siglas en inglés. Las restricciones que
se generan son dadas debido a la falta de información
que existe para los modelos biológicos. Entre estas se
encuentran la compartimentación, conservación de la
masa y direccionalidad termodinámica (Heirendt et
al., 2017). Este modelo permite entonces encontrar
un set de soluciones por medio de la optimización
basado en el organismo estudiado.
El objetivo principal de este estudio fue realizar una
reconstrucción metabólica y curación preliminar de
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los modelos de bacterias ácido lácticas, Lactobacillus
fermentum y Lactobacillus plantarum, y observar su
comportamiento a distintas concentraciones de
glucosa. Para lograrlo, se realizaron procesos de
anotación genómica y curación, además, utilizaron los
modelos de optimización FBA para su modelamiento
individual y StedyCom para el consorcio. Esto, con el
objetivo final de poder entender cómo interactúan las
distintas especies de bacterias ácido lácticas durante
el proceso de fermentación, y cuál es su principal
función. De igual manera, se hace un análisis
topológico de las redes metabólicas para observar las
estructuras metabólicas presentes en los distintos
organismos.
2. Materiales y Métodos
Teniendo en cuanta la gran cantidad de organismos
que pueden participar durante la fermentación, la
escogencia de L. plantarum y L. fermentum para este
estudio se fundamentó en estudios realizados en
Brasil y Ecuador, en donde se realizó una
determinación de las comunidades microbianas
presentes en la fermentación del cacao. Con estos
datos se soporta la idea de la utilización de estas dos
especies de Lactobacillus, debido a que se
presentaban en todos los estudios y tenían unas
concentraciones altas, por lo que se consideraban los
organismos dominantes de la bacterias ácido lácticas.
A partir de esta información se buscaron los genomas
en la base de datos de NCBI. Se utilizaron los archivos
FASTA para los genomas de referencia que
corresponden a Lactobacillus plantarum WCF S1 y
Lactobacillus fermentum IFO 3959, con números de
acceso GCA_000203855.3 y GCA_000010145.1
respectivamente (Wheeler et al., 2007).
2.1. Anotación del genoma
El proceso de anotación de los genomas se realizó por
medio de la herramienta en línea RAST (Aziz et al.,
2008), en donde se subieron los archivos FASTA para
los dos organismos estudiados a la plataforma en línea
de RAST.
El funcionamiento de anotación de RAST está dividido
en varios pasos para poder identificar los genes, así
como su función. Una de las características de esta
metodología, es la utilización de FIGfams, familias de
proteínas que se agrupan de acuerdo a su función y su
similitud. Estas dos características definen si las
familias creadas hacen parte de un subsistema, en
caso de ser agrupadas principalmente por función, o
aquellas que no hacen parte de algún subsistema (Aziz
et al., 2008).
En primer lugar, se identifican las regiones
codificantes para el ARN de transferencia y ARN
ribosomal (tRNA y rRNA por sus siglas en inglés). Este
proceso se realiza con el fin de evitar estas regiones
en los siguientes pasos, debido a la posible existencia
de genes codificantes para proteínas que se
sobreponen con las regiones encontradas. El siguiente
paso consiste en estimar los posibles genes que se
encuentren en el genoma, los cuales se consideran
genes putativos. Este último proceso se realiza por
medio de la herramienta GLIMMER2, el cual utiliza un
método interpolado de Markov (Delcher et al., 1999).
Teniendo un estimado inicial de genes codificantes
para proteínas, se usan un conjunto de FIGfams que
se consideran universales para los procariotas (grupo
de enfoque para RAST). Con esto se busca además de
encontrar estos genes en el genoma, hallar un
estimado de los organismos filogenéticamente
cercanos al genoma que se está anotando. En caso
que alguno de los genes sea identificado en este paso,
se pasa del conjunto de genes putativos al conjunto
de genes determinados.
La identificación de los genomas cercanos, sirve para
usar un conjunto FIGfams que se encuentren
presentes en estos. Este conjunto se usa entonces en
el nuevo genoma debido a que se espera una alta
relación entre los FIGfams de los distintos genomas.
Aquellos genes que se identifiquen son entonces
trasladados al conjunto de determinados. Los genes
que aún se encuentren en el conjunto de putativos
son comparados con todos los FIGfams. Aunque esta
búsqueda se hace únicamente con un conjunto
representativo para determinar familias potenciales
que se deban identificar en el genoma. El último paso
del proceso consiste en realizar un blast de los genes
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putativos restantes con una base de datos no
redundante de proteínas. Esto con el fin de hallar
ciertas similitudes y poder asignar funciones a estos
genes.
2.2. Curación del modelo
Habiendo anotado los distintos genomas, se bajaron
los datos por medio de ModelSEED (Henry et al.,
2010), plataforma en la cual ya se había realizado el
proceso de gapfind y gapfill, por lo que se tomaron las
distintas reacciones, así como los distintos
metabolitos presentes para cada organismo. A partir
de estos daos, se realizó una búsqueda de las rutas del
metabolismo central, así como de compuestos
esenciales para el desarrollo de los organismos
escogidos. Este proceso también incluyo una revisión
de la reversibilidad de las reacciones más
importantes, entra las cuales se encontraban las que
involucraban la producción de lactato a partir de
citrato y glucosa.
A partir de los modelos obtenidos anteriormente, se
buscaron en los mapas para distintos subsistemas del
metabolismo central para encontrar reacciones que
no hubieran sido anotadas durante el proceso
realizado con RAST. Las reacciones que no estuvieran
en el modelo fueron agregadas siempre y cuando se
tuviera evidencia suficiente de que estas hicieran
parte del metabolismo del organismo. La información
fue corroborada con literatura para poder obtener un
modelo más robusto.
Las energías libres de Gibbs de las reacciones para
estos subsistemas fueron también revisadas para
poder determinar si la reversibilidad de la reacción
fuera la correcta. Esta revisión de datos se realizó por
medio de la información dada por la base de datos de
ModelSeed (Henry et al., 2010), en donde es posible
encontrar los valores para (delta de G) para cada una
de las reacciones que se revisaron
Figura 1. Diagrama de flujo para la metodología utilizada
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2.3. Mapeo de la red metabólica
Teniendo las distintas reacciones para los dos
organismos estudiados, se creó una red metabólica
con las interacciones entre los distintos compuestos
por medio de Cytoscape (Doncheva et al., 2012). Este
proceso se realizó para establecer los distintos
metabolitos que participan en la mayoría de las
reacciones presentes. Esto revela la cantidad de
interacciones presentes para cada uno de los
metabolitos existentes en cada uno de los
microorganismos. Este proceso se realizó por medio
de un conteo de cada una de las interacciones para los
distintos metabolitos entre si, determinando sus
relaciones en la red metabólica.
2.4. Optimización del modelo
El modelo corregido fue entonces modificado para
poder generar un modelo COBRA con el cual fuera
posible trabajar con los algoritmos de FBA y de
SteadyCom (ver Anexo 1). Por medio de FBA, se
realizó un análisis de sensibilidad para L. plantarum y
L. fermentum con la glucosa como variable para
evaluar el comportamiento de cada población de
manera individual. Esto con el fin de determinar si
cada modelo permitía el crecimiento y se definía la
glucosa como recurso limitante, además de servir
como comparación para el crecimiento del consorcio
La glucosa se varió entre los valores de 0 y 600
𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. El sistema de optimización de
SteadyCom fue usado para modelar el
comportamiento de la comunidad a las mismas
condiciones que con el FBA.
SteadyCom consiste en la maximización de los
distintos organismos que comparten un espacio
comunal conocido como lumen. Este se basa en
encontrar la tasa de crecimiento comunal máxima, µ.
Una diferencia que tiene esta formulación en
comparación al modelo de FBA es el uso de una nueva
variable llamada el flujo agregado, 𝑉𝑗𝑘, que se define
para cada reacción j en cada organismo k y se define
como el flujo agregado.
𝑉𝑗𝑘 = 𝑋𝑘 ∗ 𝑣𝑗
𝑘
Donde 𝑋𝑘 es la abundancia relativa del organismo k,
por lo que 𝑉𝑗𝑘 tiene unidades de 𝑚𝑚𝑜𝑙/ℎ. Esta
diferencia, hace que los flujos no estén normalizados
por la biomasa del organismo. A continuación, se
observan las distintas ecuaciones para resolver
SteadyCom, basado en lo anterior.
La restricción (1) se basa en la ecuación que relaciona
todas las reacciones con sus metabolitos, que al
igualar a 0 se está calculando un estado estacionario
del sistema, donde 𝑆𝑖𝑗𝑘 es la estequiometria del
metabolito i en la reacción j. La restricción (2) limita
los valores que pueden tomar los flujos agregados de
cada reacción, donde 𝐿𝐵𝑗𝑘 y 𝑈𝐵𝑗
𝑘 son los limites
inferiores y superiores para cada una de las reacciones
j en cada organismo k. La restricción (3) indica que la
producción de biomasa es igual a la abundancia
relativa de la especie k por la tasa de crecimiento
comunal. Esta última restricción es un cambio
considerable al modelo de joint FBA, debido a que no
se espera que el crecimiento de las distintas especies
sea igual. La restricción (4) es un balance para los
flujos de intercambio entre el espacio comunal y los
distintos organismos, donde 𝑢𝑖𝑐 y 𝑒𝑖
𝑐 son los flujos de
entrada y de salida para los metabolitos que pueden
existir en el espacio compartido, y 𝑉𝑒𝑥𝑘 son los flujos de
intercambio entre el espacio comunal y el individuo k.
Este último tiene en cuenta la abundancia relativa del
organismo por lo que cuantifica la contribución de
cada especie al balance de los metabolitos i.
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En cuanto a la restricción (6), esta no permite que se
solucione el problema con valores de 𝑉𝑗𝑘 = 𝑋𝑘 = 0,
dado que todas las restricciones se cumplen para este
caso para cualquier µ. Al tener 𝑋𝑘 = 1, esta
restricción hace inviable la solución con flujos iguales
a 0. Por último, las restricciones (4) y (7) corresponden
a la naturaleza de las variables.
3. Resultados y Discusión
Los modelos con los que se realizaron los distintos
análisis fueron revisados para poder generar la mayor
exactitud en comparación con la realidad del
comportamiento de los organismos. La adición de
reacciones, así como de metabolitos corresponde a
esta expectativa del modelo. Uno de los primeros
problemas que se observó al manipular los datos
obtenidos de la anotación, fue la falta de ciertos
compuestos esenciales en el crecimiento de los
microorganismos seleccionados. Según los modelos
iniciales, la salida de lactato no se presentaba en
ninguno de los organismos, por lo que se debió
agregar una reacción de transporte para este
compuesto. También se observó la falta de citrato en
L. fermentum, por lo que se debía agregar tanto la
reacción de transporte, así como la descomposición
de este de acuerdo con lo descrito por Hugenholtz en
1993.
También se revisaron los distintos compuestos
pertenecientes a la función objetivo de biomasa para
poder crear rutas para su producción. En primer lugar,
se analizaron los distintos aminoácidos, aunque
algunos no tenían rutas de síntesis, por lo que la
agregación de reacciones de intercambio para que
pudiera existir un flujo fue necesario. Esto permite su
adición en la función objetivo de biomasa. Entre estos
metabolitos se encuentran Isoleucina, Metionina y
Triptófano. Esto no se logró hacer para todos los
compuestos, debido a la complejidad del modelo y el
número de reacciones y metabolitos presentes como
se observa en la Tabla 1
Tabla 1. Numero de metabolitos y reacciones presentes
para los modelos de L. plantarum y L.fermentum
Si bien el proceso de anotación permite obtener una
gran cantidad de rutas presentes partir del genoma, si
se realiza una comparación con otros modelos, se
puede observar una gran diferencia en el número de
reacciones y metabolitos con los que se trabaja. Un
ejemplo de esto es el modelo usado por Teusink et al.
en el 2006, el cual tiene 643 reacciones y 531
metabolitos. Esto permite identificar la magnitud de
los modelos con los que se está trabajando.
3.1. Análisis de compuestos volátiles
Haciendo una comparación entre los metabolitos
presentes en los modelos y los distintos compuestos
volátiles conocidos que tienen un efecto en el sabor
del chocolate de acuerdo con lo descrito por
Rodriguez et al., 2011, se encontró únicamente un
compuesto en L. fermentum. Se trata de Acetoina, una
cetona que proporciona una calidad de olor calificada
como cremosa (Rodriguez et al., 2011). Por otro lado,
La mayor producción de compuestos que generan las
bacterias ácido lácticas son lactato y manitol (Camu et
al., 2007), compuestos necesarios para el crecimiento
de las bacterias ácido acéticas, las cuales dominan el
proceso de fermentación después de 48 h de empezar
la fermentación (Passos et al., 1984). El proceso de
producción de manitol no genera lactato, por lo que
la acidez del proceso se verá limitada en caso que las
especies presentes en la fermentación prioricen esta
producción (Lefeber et al., 2011).
Esto parece confirmar en primer lugar que la función
de las bacterias ácido lácticas en la fermentación es la
producción de lactato, el cual baja el pH del medio y
hace inviables las semillas con la ayuda de las altas
temperaturas que alcanza el proceso (Schwan &
Wheals 2004). Esto permite la destrucción de las
divisiones biológicas presentes en los cotiledones. Es
entonces cuando comienza la degradación de
compuestos dentro del cacao, donde se producen los
distintos precursores que darán origen a los distintos
sabores durante el proceso de tostado. Es además
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importante notar que un cacao con un bajo contenido
de precursores no logrará obtener un sabor deseado
sin importar como se lleve a cabo el proceso de
fermentación (Rohan & Stewart, 1967).
3.2. Análisis topológico de la red
De acuerdo con el Anexo 2, La mayor parte de las
interacciones entre metabolitos están dadas por
aquellas asociadas al intercambio energético como lo
son H+, ATP, ADP, Fosfato, etc. Otro compuesto de
importancia en el modelo es el piruvato, el cual está
asociado a las distintas rutas de producción de lactato
como un intermedio, ya sea por el metabolismo de
citrato o por el de carbohidratos (Hugenholtz, 1993;
Kandler, 1993). Para los dos casos, L. fermentum y L.
plantarum, este último compuesto tiene una gran
participación en el metabolismo, además de
presentar funcionalidades parecidas. Esto último se
confirma por medio de los distintos procesos
realizados en este estudio, especialmente en el
metabolismo central. La gran similitud es concorde a
los distintos procesos que estos organismos pueden
presentar, dado que se trata de bacterias ácido
lácticas heterofermentativas. En el caso particular de
L. plantarum, aunque pueda usar el metabolismo
homofermentativo, no se pudo reflejar en las
simulaciones debido a la falta de curación.
teniendo la red metabólica, no solo se observan las
relaciones entre metabolitos, también se pueden
encontrar algunas reacciones que no se encuentran
conectadas a la red principal. Esto se puede comparar
con un grafo no conexo, indicando que el gapfill
realizado por ModelSeed no fue completo. Esto se
evidencia al observar el Anexo 3. En este se tiene que
algunas de estas reacciones son de transporte, más
específicamente por difusión. Otra reacción que se
puede encontrar sin conectividad es la de
Violaxanthin a Neoxanthin, compuestos asociados en
la producción de ácido abscísico en plantas (Bouvier
et al., 2000). Esto muestra la posibilidad de que este
tipo de compuestos fue identificado de forma errónea
al realizar la anotación, y por lo tanto no es posible
generar una conectividad adecuada con la red
metabólica.
Además, se tienen varios metabolitos que solo están
conectados a 1, por lo que no se podrá obtener flujo
en la reacción a la que este asociado. Esto sucede
debido a la forma de solución del modelo de
optimización, es igualar a 0 la suma de los flujos para
cada metabolito. Debido a esto, si solo existe un
metabolito en una reacción, su flujo debe ser igual a 0
y se mantendrá bloqueada hasta que se analice su
función y la ruta a la cual pertenece.
3.3. Modelamiento de las redes metabólicas
En la figura 2 se puede observar el crecimiento para
los dos modelos, mostrando que la concentración de
glucosa en el medio es un factor limitante para el
crecimiento de las dos poblaciones. El valor máximo
que alcanzó fue de 25 ℎ−1, Pero el comportamiento
que se obtiene no es igual para los dos modelos. Para
L. plantarum existe un crecimiento inicial mayor que
el de L. fermentum, pero desacelera cuando la
concentración de glucosa es de 250 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ. Al
observar la figura 3, se puede apreciar un cambio
significativo en la producción de lactato entre L.
plantarum y L. fermentum. Mientras que para el
primero se empieza a producir este compuesto
cuando la concentración de glucosa llega a 250
𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ, momento que coincide con la
desaceleración de la producción de biomasa. Aunque
la producción de este compuesto se mantiene estática
al pasar el umbral de los 500 (unidades) de consumo
de glucosa, la producción de lactosa para L.
fermentum termina siendo un poco menor que la de
L. plantarum, pero su crecimiento termina siendo
ligeramente mayor.
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Figura 2. Producción de lactato en función de la
glucosa disponible en el medio
Figura 3. Tasa de crecimiento para L. fermentum y L.
plantarum en función de la disponibilidad de glucosa
en el medio
Por otro lado, al realizar el modelamiento en conjunto
para los dos organismos solo se obtuvo crecimiento
para L. plantarum. El comportamiento se da de
manera directamente proporcional con la
disponibilidad de glucosa hasta que se llega a un
umbral de crecimiento de 125 ℎ−1 cuando la
concentración de glucosa es de 400 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ,
como se muestra en la figura 4. Pero la producción de
lactato no aumenta y se mantiene en valores muy
cercanos a 0, indicando que no existe producción de
este compuesto bajo el modelo de SteadyCom.
Además, el crecimiento de L. fermentum es nulo bajo
cualquiera de las condiciones dadas.
Figura 4. Tasa de crecimiento de L. plantarum por
medio de SteadyCom
A partir de la simulación del modelo conjunto se
esperaba una posible diferencia en el crecimiento de
los distintos organismos debido a que L. fermentum y
L. plantarum no se encuentran en iguales
proporciones en la mayoría del proceso de
fermentación (Ardhana and Fleet 2003; Camu et al.
2007). Esto puede deberse a que L. fermentum es un
heterofermentativo por lo que el 50% del producto de
su fermentación es lactato, mientras que L. plantarum
es heterofermentativa facultativa y puede producir
una cantidad de lactato mayor. Un proceso distinto en
las rutas metabólicas puede llevar un cambio en el
crecimiento, especialmente cuando los cultivos en la
fermentación del cacao son de gran tamaño. Además
de las distintas rutas que poseen estos organismos, su
crecimiento está condicionado por factores
ambientales imposibles de modelar en este estudio
como el pH y la temperatura, los cuales condicionan
el crecimiento de formas distintas, hasta para cepas
de la misma especie (Fu et al.,1999, Santoyo et al.,
2003, Garro et al., 2004). Estos modelos no son
entonces adecuados para medir sus interacciones, y
no es posible determinar a que condiciones se podría
disminuir la producción de lactato.
Teniendo en cuenta que las bacterias ácido lácticas
dominan el proceso después de las levaduras, la
10
disponibilidad de glucosa dependerá de estas últimas
y por consiguiente, el crecimiento de las ácido lácticas.
De la figura 3 se puede observar que a una tasa de
entrada menor a 500 𝑚𝑚𝑜𝑙/ ℎ de glucosa, L.
plantarum tendrá una tasa de crecimiento mayor, y
por ende dominará por encima de L. fermentum. Por
medio de la figura 2 es posible determinar que la
producción de lactato de L. plantarum es nula hasta
que la glucosa se encuentra a un nivel de 250
𝑚𝑚𝑜𝑙/ ℎ, por lo que la acides causado por la
presencia de lactato no será tan grande. Cuando la
glucosa empieza a aumentar, se esperaría que L.
fermentum domine esta etapa de la fermentación,
aunque en estas condiciones los dos organismos
tienen tasas de producción de lactato muy cercanas,
por lo que la acides aumentara en el proceso. Debido
a que grandes cantidades de lactato son indeseadas
para el proceso por su capacidad de penetrar la testa
y acidificar el sabor final del chocolate, es necesario
entonces controlar el crecimiento de las bacterias
ácido lácticas por medio de las concentraciones de
glucosa que se produzcan anteriormente en el
proceso
Uno de los posibles problemas que existen con los
modelos es la falta de curación, por lo que los sistemas
del metabolismo central no se encuentran completos
y son en gran parte iguales entre los dos organismos,
esto lleva a que las rutas tomadas por el algoritmo
SteadyCom sean las mismas. Debido a que la función
objetivo de biomasa no se encuentra completa, el
algoritmo no dirigirá flujos hacia la producción de
compuestos necesarios para el crecimiento del
organismo. Esto se debe a que las reacciones para
producir estos compuestos se encuentran bloqueadas
y no es posible generar flujo al correrlo. Si bien este
proceso puede hacerse, es necesario revisar cada
compuesto perteneciente a la función objetivo y sus
distintas rutas de producción para poder completar el
modelo. Cada reacción que se adicione o se elimine
del modelo debe tener un soporte con literatura que
respalde las decisiones tomadas. Si bien se logró hacer
la curación de producción de lactato por las rutas
descritas por Gänzle en 2015, estas solo corresponden
aproximadamente al 1% del modelo total. Uno de los
factores determinantes a la hora de realizar la
curación fue la gran cantidad de metabolitos
obtenidos de la anotación genética.
Por otro lado, las rutas de producción de ciertos
aminoácidos no se lograron completar haciendo su
producción inviable, esto se presentaba en aquellos
que tenían la mayor cantidad de reacciones asociadas,
debido a que esto implica una mayor cantidad de
metabolitos con los que también se debe cumplir un
flujo hacia su producción. En el Anexo 2 se puede
observar que el grado de conectividad para el
glutamato es alta para los dos organismos,
complicando así su proceso de curación.
El número de rutas que se logró desbloquear al usar
FBA para L. plantarum y L. fermentum fue de 139 y 123
respectivamente, correspondiendo
aproximadamente a un 10% de las reacciones totales.
En la mayoría de los casos, el valor para las reacciones
fue de 1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ o -1000 𝑚𝑚𝑜𝑙/𝑔𝐷𝑊 ℎ.
Para el caso de SteadyCom, únicamente se obtuvo
flujo en 82 de las reacciones combinadas y todas
fueron en L. plantarum, por lo que no hubo
crecimiento para L. fermentum. En cuanto a la función
objetivo de biomasa, se usó la estequiometria dada
por ModelSEED para los distintos compuestos, pero
solo se logró añadir además de los requerimientos
energéticos, ATP, ADP y H+ algunos aminoácidos
como triptófano y metionina, que solo estaban
involucrados en reacciones de intercambio con muy
pocas dentro del organismo. Esto no garantiza que los
resultados mostrados en las figuras 3 y 4 sean
consistentes, haciendo necesaria la continuación del
proceso de curación ya siendo buscando más
reacciones que se le deban agregar al sistema para
resolver ciertas rutas, o encontrar métodos más
efectivos para realizar este proceso.
4. Conclusiones
En este trabajo se realizó un primer acercamiento a
los modelos metabólicos para L. plantarum y L.
fermentum, por medio de la anotación de sus
genomas y una curación básica. Gracias a estos, se
realizaron simulaciones para determinar el
11
comportamiento de las interacciones entre estos dos
microorganismos. Por medio de los resultados
obtenidos se pudo determinar que no parecen existir
compuestos conocidos producidos por estas bacterias
ácido lácticas que influyan en el sabor final del
chocolate a excepción del lactato, mostrando que
aparentemente la función de este grupo no es la
producción de este tipo de compuestos. Aunque es
necesario continuar con el proceso de curación para
obtener un modelo que compruebo lo dicho
anteriormente.
Por medio de las simulaciones se mostró que la
glucosa es un compuesto limitante en el crecimiento
de los organismos, aunque su papel no sea tan
evidente cuando se trabajó con SteadyCom, indicando
la falta de curación que se debe realizar para poder
obtener un modelo completamente funcional. Es
entonces importante mencionar que el modelo de
SteadyCom puede ser utilizado para modelar
comunidades microbianas, pero es necesario tener en
primer lugar modelos funcionales en donde no existan
rutas metabólicas bloqueadas. Finalmente se observó
que existe una cantidad considerable de metabolitos
que se mantienen bloqueados debido a la falta de
conexiones que tienen, además de existir reacciones
no conectadas al sistema, indicando un error en el
gapfill hecho por ModelSeed. Es entonces necesario
seguir con el proceso de curación para poder obtener
modelos completos para L. plantarum y L. fermentum.
Por medio de este trabajo se logró utilizar
SteadyCom, el cual parece ser un método adecuado
para la simulación de modelos conjuntos, además de
entender en primera instancia el comportamiento de
las bacterias ácido lácticas en el proceso de
fermentación. Aunque no fue del alcance de este
trabajo, sería interesante lograr modelos completos
para todos los grupos de microorganismos presentes
durante la fermentación para poder modelar sus
interacciones, ya que como se observó, existe una
dependencia entre los grupos para que puedan
crecer. Esto podría mejorar el proceso, así como el
sabor del producto final al poder aplicar los
conocimientos obtenidos de estos estudios.5.
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14
ANEXOS
A.1. Creación del modelo COBRA y código para StedyCom
Para poder correr SteadyCom por medio del toolbox de COBRA en Matlab, es necesario en primer lugar organizar
los datos de manera correcta en un archivo de Excel. En las figuras A1.1 y A1.2 se muestra un ejemplo del modelo
usado para L. plantarum.
Figura A1.1 Estructura de los datos para la lista de reacciones
Figura A1.2 Estructura de los datos para la lista de metabolitos
El archivo .xlsx debe tener dos hojas distintas en donde se muestre la información relacionada con las reacciones
y los metabolitos en hojas distintas. En la primera debe estar la información correspondiente a las reacciones y
en la segunda la de los metabolitos, sus nombres deben ser ‘Reaction List’ y ‘Metabolite List’ respectivamente.
Para las reacciones, las filas ‘Abbreviation’ y ‘Reaction’ son obligatarios, mientras que ‘Descripton’ y ‘Notes’ dan
información adicional que puede ser consultada posteriormente al generar el modelo. Es importante arregkar la
direccionalidad de las reacciones, dado que solo se puede tener => o , por lo que si se tiene una reacción con
direccionalidad <= debe cambiarse el orden para que cumpla con la estructura necesaria para crear el modelo
COBRA.
En cuanto a los metabolitos, únicamente la columna ‘Abbreviation’ es necesaria. Los nombres dados a los
metabolitos, deben ser los mismos usados en las reacciones para que la función xls2model sea capaz de generar
la matriz S. Nótese que después del nombre de cada metabolito existe una letra encerrada en los paréntesis
cuadrados [ ]. Esta hace referencia al espacio en el que se encuentra, [c] para citosol y [e] para extracelular.
Teniendo esta estructura de datos, se usa la función,
model1 =xls2model('L_plantarum_Model.xlsx')
Donde model1 es el modelo COBRA creado y L_plantarum_Model.xls es el archivo en el que se guardaron los
datos anteriormente descritos. A continuación, se generan las estructuras con las se creará el modelo conjunto
15
utilizado por SteadyCom. Deben existir dos, en la primera se juntan los modelos COBRA y en la segunda los
nombres que se les desee dar cada uno de los modelos.
models{1,1}=model1 models{2,1}=model2 nameTag{1,1}='L_plantarum'; nameTag{2,1}='L_fermentum';
Estos deben tener un orden interno, por lo que el modelo en la posición {1,1}, será al que se le asignará el nombre en la posición {1,1} de la estructura donde se encuentren los nombres. El siguiente paso es generar el modelo conjunto, donde se creará un espacio nuevo [u] donde se compartirán los distintos metabolitos que tengan reacciones de intercambio. Esto se genera con la función que se muestra a continuación
[JointModel]=createMultipleSpeciesModel(models,nameTag);
El modelo JointModel corresponde al modelo conjunto, en donde se creó la matriz S para los dos organismos. Para poder correr el algoritmo de SteadyCom, es necesario crear dos nuevas estructuras internas, infoCom e indCom. Esto se realiza con la función getMultiSpeciesModelId, como se muestra a continuación
[names, ids] = getMultiSpeciesModelId(JointModel, nameTag)
JointModel.infoCom=names JointModel.indCom=ids
Habiendo creado infoCom e indCom solo hace falta agregar la información correspondiente a las funciones objetivo de biomasa, las cuales se encuentran dentro de estas estructuras y deben llamarse spBM. En infoCom.spBM deben agregarse los nombres asignados a las funciones objetivo de biomasa, las cuales pueden encontrarse en JointModel.rxn, mientras que en indCom.spBM deben agregarse las posiciones de estas funciones. A continuación, se muestra el código utilizado para esta sección. JointModel.infoCom.spBm{1,1}='L_plantarumbiomasa1' JointModel.infoCom.spBm{2,1}='L_fermentumbiomasa2' JointModel.indCom.spBm=[406;734]
El modelo generado puede entonces ser utilizado para usar el algoritmo SteadyCom, el cual se encuentra en el
toolbox de COBRA y se corre usando la siguiente función,
[sol, result, LP, LPminNorm, indLP] = SteadyCom(JointModel,[])
Donde los resultados pueden ser encontrados en la estructura ‘result’
16
A.2. Conectividad de los metabolitos
Tabla A.2
17
A.3. Redes Metabólicas
Figura A.3. Redes metabólicas para L. plantarum y L. fermentum