caracterização de microdomínios lipídicos de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE / INSTITUTO DE BIOQUÍMICA MÉDICA

FERNANDA SOUZA DE OLIVEIRA CAMPOS

Caracterização de microdomínios lipídicos de membrana

(lipid rafts) da glia embainhante olfatória

Rio de Janeiro

2009

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Fernanda Souza de Oliveira Campos

Caracterização de microdomínios lipídicos de membrana (lipid

rafts) da glia embainhante olfatória

Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-

Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica

Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Orientadoras: Georgia Corrêa Atella

Leny Alves Cavalcante

Rio de Janeiro

2009

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CARACTERIZAÇÃO DE MICRODOMÍNIOS LIPÍDICOS DE

MEMBRANA (LIPID RAFTS) DA GLIA EMBAINHANTE OLFATÓRIA

Fernanda Souza de Oliveira Campos

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Química Biológica).

Aprovada por:

____________________________________Orientadora

Profa. Georgia Corrêa Atella (Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ)

____________________________________Orientadora

Profa. Leny Alves Cavalcante (Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho - UFRJ)

____________________________________Revisor / Suplente Interno

Prof. Aurélio Vicente Graça de Souza (Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ)

____________________________________Examinador

Prof. André Marco de Oliveira Gomes (Instituto de Bioquímica Médica - UFRJ)

____________________________________Examinadora

Profa. Silvana Allodi (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)

____________________________________Examinadora

Profa. Penha Cristina Barradas Daltro Santos (Departamento Farmacologia e Psicobiologia- IB- UERJ)

____________________________________Suplente Externa

Profa. Cláudia dos Santos Mermelstein (Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ)

Rio de Janeiro - Agosto / 2009

iv

FICHA CATALOGRÁFICA

Campos, Fernanda Souza de Oliveira

Caracterização de microdomínios lipídicos de membrana (lipid rafts) da glia embainhante olfatória / Fernanda Souza de Oliveira Campos. Rio de Janeiro, 2009.

83pp, xvi

Orientadoras: Georgia Corrêa Atella e Leny Alves Cavalcante.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, 2009.

1. Glia embainhante olfatória - 2. Microdomínios Lipídicos - 3. CNPase (2’, 3’-nucleotídeo cíclico 3’-fosfodiesterase).

v

O presente trabalho foi realizado nos Laboratório de Bioquímica de Lipídeos e Lipoproteínas

no Instituto de Bioquímica Médica e de Neurobiologia do Desenvolvimento do Instituto de

Biofisica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, sob a

orientação das Professoras Geórgia Correa Atella e Leny Alves Cavalcante, na vigência de

auxílios concedidos pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -

CAPES e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq).

vi

À minha família

vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por estar sempre ao meu lado e nunca ter me

desamparado.

Agradeço principalmente aos meus pais, Jaime e Neusa. Tudo o que sou hoje na vida é

fruto do amor desse casal maravilhoso. Vocês não existem!!! Parte da minha formação

também depende das minhas irmãs (Maria José, Renata e Juliana). Obrigada pela força que

vocês me dão. Amo vocês!

Agradeço as minhas orientadoras, Geórgia Corrêa Atella e Leny Alves Cavalcante, pela

orientação eficiente ao longo desses anos e por todo o carinho depositado em mim nessa longa

caminhada.

Agradeço ao meu amor e ao meu companheiro de trabalho, Felipe. Sem ele, em minha

vida muitas histórias eu não teria vivido. Obrigada sempre por estar ao meu lado, ser

compreensivo e me ajudar nas minhas dificuldades. Te amo!

Agradeço aos meus amigos do laboratório NBD: Eliane, Fred, Hugo, Lítia, Paulinho,

Serginho, Tainá, Vivi e Wagner. Obrigada por tornar meus dias no laboratório mais

“divertidos”, por todos os bons momentos, pelas ajudas nos protocolos... E também a minha

ex-coorientadora, Alessandra Santos Silva, pelo início da minha iniciação científica.

Agradeço aos meus amigos do laboratório de Bioquímica: Nuccia, Nicole, Lívia, Karla,

Michele, Paulinha, Alessandra e Liliane. Obrigada por me ensinarem a base da bioquímica

para os meus experimentos. Agradeço também a Miria, companheira de trabalho das rafts.

Agradeço as minhas amigas, Marcella, Vinha e Bárbara pela amizade que começou na

faculdade e espero que dure por muitos outros longos anos.

Agradeço a Maria, Nanana e Marcella por toda força, carinho e amizade que foram

fundamentais na minha formação pessoal.

As minhas amigas Anna, Virgínia, Flávia, Fernanda e respectivos. Pelo carinho, amizade,

cumplicidade que duram mais de 9 anos.

A todos aqueles que me ajudaram de alguma maneira para que essa dissertação virasse

realidade.

viii

RESUMO

A glia embainhante olfatória (GEO) tem sido apresentada como uma ferramenta

promissora da bioengenharia para reparo de lesões no sistema nervoso. No entanto, o efetivo

uso desta célula em terapias neuroregenerativas ainda depende de um melhor conhecimento

de suas propriedades fundamentais. Desta forma, a caracterização das lipid rafts, estruturas

envolvidas na transdução de sinal, adesão celular, migração e organização do citoesqueleto,

podem representar um ponto fundamental no entendimento dos processos regenerativos da

GEO. Neste trabalho caracterizamos as lipid rafts da GEO, verificando a presença da CNPase

(2’3’-nucleotídeo cíclico 3’-fosfodiesterase), 9-O-acetil GD3 e os gangliosídeos reconhecidos

pelo anticorpo A2B5, expressos em células neurais de alta motilidade. As lipid rafts da GEO,

aqui identificadas pelos marcadores gangliosídeo GM1, flotilina-1 e caveolina-1,

apresentaram fosfatidilcolina, esfingomielina, alta quantidade de colesterol, baixo conteúdo

protéico e uma concentração preferencial em relação ao restante da membrana de

componentes como os gangliosídeos mencionados acima e CNPase. Foi possível ainda

constatar que a destruição das lipid rafts pela metil-beta-ciclodextrina altera a distribuição dos

componentes identificados nestes microdomínios lipídicos. Estes resultados sugerem que as

membranas resistentes a detergente da GEO podem estar, pelo menos parcialmente,

envolvidas em eventos relevantes na migração promovida por esta célula.

ix

ABSTRACT

The olfactory ensheathing cell (OEC) has been referred as a promising tool for

bioengineering in the repair of nervous system injuries. However, the effective use of this cell

in neuroregenerative therapies still depends on better understanding of its fundamental

properties. Thus, the characterization of lipid rafts, which are structures involved in signal

transduction, cell adhesion, migration and cytoskeleton organization, may represent a major

subject in the understanding of the regenerative events promoted by OEC. Our aim is the

purification and characterization of OEC’s lipid rafts, verifying the presence of CNPase (non-

compact myelin protein 2' 3' cyclic nucleotide 3' phosphodiesterase), 9-O-acetyl GD3 and

other gangliosides recognized by the A2B5 antibody, which are commonly expressed by high

motility neural cells. Lipid rafts were identified by the labeling of markers such as the GM1

ganglioside, flotillin and caveolin. OEC’s lipid rafts showed phosphatidylcholine,

sphingomyelin, high cholesterol, low protein content and a concentration of the above

mentioned gangliosides and CNPase. Furthermore, the destruction of lipid rafts by methyl-

beta-cyclodextrin alters the distribution of components here identified in OEC’s lipid

microdomains. These results suggest that the detergent resistant membranes of OEC may be

at least partly involved in relevant events of the migration regeneration promoted by this cell.

x

ABREVIAÇÕES E SIGLAS

BCA - ácido bicinchonínico

BDNF - fator neurotrófico derivado do cérebro

BO - bulbo olfatório

BOA - bulbo olfatório acessório

BOP - bulbo olfatório principal

BSA - albumina sérica bovina

Cav-1 - caveolina-1

Cav-2 - caveolina-2

Cav-3 - caveolina-3

CCGr - camada de células granulares

CCM - camada de células mitrais

cDNA – DNA complementar

CEMs - membranas enriquecidas de colesterol

CFO - camada de fibras olfatórias

Cgl - camada glomerular

CNPase - 2’ 3’ nucleotídeo cíclico 3’ fosfodiesterase

CPE - camada plexiforme externa

CPI - camada plexiforme interna

CT-B - toxina do cólera subunidade B

DAPI - 4’.6-diamidino-2-fenilindole-dilactate

DIGs - membranas enriquecidas de glicoesfingolipídios insolúveis a detergente

DRMs - membranas resistentes a detergentes

EDTA - ácido etilenodiaminotetracético

FGF - fator de crescimento de fibroblastos

FITC – isotiocianato de fluresceína

GDNF - fator de crescimento derivado de células gliais

GEMs - membranas enriquecidas de glicoesfingolipídios

GEO - glia embainhante olfatória

GFAP - proteína ácida do filamento glial

GM1- monossialogangliosídeo

GPI - glicosilfosfatidilinositol

HRP – peroxidase de rabanete

xi

HPTLC – cromatografia de camada fina de alta performace

KDa - kilo Dalton

M.E.T. - microscopia eletrônica de transmissão

MβCD - metil-beta-ciclodextrina

MO - mucosa olfatória

N-CAM - molécula de adesão celular neural

ND - não determinado

NGF - fator de crescimento de neurônios

NGS - soro normal de cabra

NROs - neurônios receptores olfatórios

OVN - órgão vomeronasal

OEC - olfactory ensheathing cell

PC - fosfatidilcolina

PBS- tampão fosfato com salina

PSA-NCAM - molécula de adesão celular neural polisiálica

p75-NGFR - receptor para fator de crescimento neuronal de baixa afinidade

RNAm - ácido ribonucléico mensageiro

SDS - lauril sulfato de sódio

SM - esfingomielina

SNC - sistema nervoso central

SNP - sistema nervoso periférico

SPFH - estomatina-proibitina-flotilinas-HflK/C

TBS - solução tris base

TRIS - tris-hidroximetil-aminometano

TRITON X-100 - t-octilfenoxipolietoxietanol

VIP21 – proteína de membrana vesicular integral

xii

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Camadas do bulbo olfatório de rato adulto......................................................................... 3

Figura 2- Representação do sistema olfatório ..................................................................................... 5

Figura 3- Etapas de regeneração axonal pela GEO ........................................................................... 7

Figura 4- Moléculas de glicolipídios ...................................................................................................11

Figura 5- Modelo esquemático do mosaico fluido das membranas celulares e seus componentes .............................................................................................................................................. 13

Figura 6- Esquema do modelo dos microdomínios de membrana ............................................... 15

Figura 7- Esquema da proteína caveolina-1 inserida na membrana plasmática ........................ 19

Figura 8- Esquema da proteína flotilina-1 inserida parcialmente na membrana plasmática .. 21

Figura 9- Estrutura do gangliosídeo GM1 ......................................................................................... 22

Figura 10- Representação da metil-β-ciclodextrina ......................................................................... 23

Figura 11- Microscopia de fluorescência da cultura de células isoladas da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína S100 e CNPase ........................................................................... 36

Figura 12- Ilustração da obtenção do gradiente de sacarose ......................................................... 37

Figura 13- Densidade das frações do gradiente de sacarose da GEO .................................... 37

Figura 14- Distribuição do gangliosídeo GM1 nas frações do gradiente de sacarose ............. 39

Figura 15- Microscopia de fluorescência da GEO incubada na presença de toxina do cólera subunidade B conjugada à FITC a 4 e 37°C ...................................................................................... 40

Figura 16- Distribuição da proteína flotilina-1 nas frações do gradiente de sacarose ............. 41

Figura 17- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína flotilina-1 ................................................................................................................................... 42

Figura 18- Distribuição da proteína caveolina-1 nas frações do gradiente de sacarose .......... 43

Figura 19- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína caveolina-1 ................................................................................................................................ 44

Figura 20- Micrografias eletrônicas das frações do gradiente de sacarose ................................ 45

Figura 21- Concentração total de colesterol e proteínas nas frações do gradiente de sacarose da GEO .................................................................................................................................... 47

Figura 22- Caracterização lipídica das frações do gradiente de sacarose da GEO ................... 49

xiii

Figura 23- Distribuição da proteína CNPase nas frações do gradiente de sacarose ................. 51

Figura 24- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para CNPase e flotilina-1 ............................................................................................................................. 52

Figura 25- Distribuição do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e dos gangliosídeos reconhecidos pelo anticorpo A2B5 (G-A2B5) nas frações do gradiente de sacarose ....................................... 54

Figura 26- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína S100 e CNPase .......................................................................................................................... 57

Figura 27- Representação da obtenção dos gradientes de sacarose com MβCD e em condição controle ....................................................................................................................................................... 58

Figura 28- Distribuição dos marcadores de rafts ............................................................................. 59

Figura 29- Concentração total de colesterol e proteínas nas frações do gradiente de sacarose da GEO .................................................................................................................................... 60

Figura 30- Distribuição das moléculas candidatas no envolvimento da migração da GEO nas frações do gradiente de sacarose ....................................................................................................... 61

Figura 31- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para CNPase e flotilina-1 ................................................................................................................................ 62

LISTA DE TABELAS

Tabela1- Anticorpos Primários .............................................................................................. 30

Tabela 2- Anticorpos Secundários …………...…………………...……………..…………. 31

Tabela 3 - Ligantes e Sondas …………………………………………………………..….. 31

xiv

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO

1.1 Organização geral do sistema olfatório ............................................................................... 1

1.2 Anatomia do bulbo olfatório …........................................................................................... 2

1.2.1 Organização citoarquitetônica do bulbo olfatório principal ................................. 2

1.3 Glia embainhante olfatória (GEO) ...................................................................................... 4

1.4 Moléculas candidatas no envolvimento da migração da GEO ........................................... 8

1.4.1 2’ 3’ nucleotídeo cíclico 3’ fosfodiesterase – CNPase ......................................... 8

1.4.2 Gangliosídeos ..................................................................................................... 10

1.5 Visão geral da membrana plasmática ................................................................................ 12

1.6 Microdomínios lipídicos de membrana (lipid rafts) ......................................................... 14

1.7 Diversidade de componentes dos microdomínios lipídicos .............................................. 16

1.7.1 Cavéolas e Caveolinas ........................................................................................ 17

1.7.2 Flotilinas ............................................................................................................. 20

1.7.3 Gangliosídeo GM1 ............................................................................................. 22

1.8 Rafts desorganizadas: depleção de colesterol ................................................................... 23

1.9 A relevância do estudo .................................................................................................... 24

OBJETIVO

2.1 Objetivos geral................................................................................................................... 25

2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 25

MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 Animais ............................................................................................................................. 26

3.2 Cultura de células isoladas .................................................................................................26

3.3. Tratamento das células com metil-beta-ciclodextrina (MβCD) ........................................27

3.4 Isolamento das membranas resistentes a detergente da GEO ........................................... 27

3.5 Densidade das frações do gradiente de sacarose ............................................................... 28

3.6 Dot blotting das frações do gradiente de sacarose ............................................................ 28

3.7 Fluorescência da toxina do cólera subunidade B (CT-B) ................................................. 29

3.8 Imunocitoquímica ............................................................................................................. 29

3.9 Anticorpos e outros ligantes .............................................................................................. 30

xv

3.10 Microscopia Eletrônica de Transmissão (M.E.T.): Contrastação negativa ..................... 32

3.11 Dosagem de Proteína ...................................................................................................... 32

3.12- Análise Lipídica ............................................................................................................. 33

3.12.1 Extração de lipídios .......................................................................................... 33

3.12.2 Identificação dos lipídios ................................................................................. 33

3.13.3 Análise de Colesterol ....................................................................................... 34

RESULTADOS

4.1 Perfil do gradiente de sacarose .......................................................................................... 35

4.2 Detecção do gangliosídeo GM1 nas frações do gradiente de sacarose e em células

vivas......................................................................................................................................... 38

4.3 Detecção da proteína flotilina-1 nas frações do gradiente de sacarose e em células

permeabilizadas ....................................................................................................................... 41

4.4 Detecção da proteína caveolina-1 nas frações do gradiente de sacarose e em células


4.5 Morfologia das frações resistentes a detergente ............................................................... 45

4.6 Distribuição de proteína e colesterol nas frações do gradiente de sacarose ...................... 46

4.7 Análise dos lipídios totais das frações do gradiente de sacarose da GEO ........................ 48

4.8 Localização da proteína CNPase nas frações do gradiente de sacarose e em células


4.9 Localização do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e dos gangliosídeos reconhecidos pelo

anticorpo A2B5 (G-A2B5) nas frações do gradiente de sacarose .......................................... 53

4.10 Desorganização das lipid rafts ........................................................................................ 55

DISCUSSÃO

5.1 Diversas metodologias são usadas para o isolamento das rafts ........................................ 63

5.2 Membranas resistentes a detergentes da GEO são positivas para marcadores das lipid

rafts.......................................................................................................................................... 64

5.3 Perfil lipídico e dosagem protéica da membrana da GEO confirmam a presença de lipid

rafts ......................................................................................................................................... 65

5.4 As lipid rafts isoladas formam espontaneamente vesículas .............................................. 66

5.5 Moléculas candidatas no envolvimento da migração se associam as rafts da GEO ......... 67

5.6 A depleção de colesterol altera a distribuição de componentes protéicos e lipídicos das

rafts da GEO ........................................................................................................................... 68

xvi

5.7 Considerações finais …………..............…………………………...........……………… 69

CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 71

PERSPECTIVAS………………………………………........…...…………........………… 72

REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 73

1

1 Introdução

1.1 Organização geral do sistema olfatório

O olfato é um sentido que permite as espécies animais de receberem e processarem as

informações do ambiente, transmitidas por substâncias químicas. O sistema olfatório é

composto pelo epitélio olfatório, nervo olfatório e estruturas centrais como o bulbo olfatório

(Schwob, 2002).

O epitélio olfatório abrange os neurônios receptores olfatórios (NROs), células

sustentaculares, células basais (globosas e horizontais) e as glândulas de Bowman (Schwob,

2002). Os neurônios receptores olfatórios representam o principal componente do epitélio

olfatório, uma vez que são responsáveis pela recepção e transdução da informação olfatória. O

NRO apresenta morfologia bipolar, com axônio amielínico e de pequeno diâmetro (0,1-0,4

mm). Sabe-se que esses neurônios periféricos exibem contínua renovação a partir de células

basais precursoras, ao longo da vida dos mamíferos (Graziadei & Monti-Graziadei, 1979;

Schwob, 2002).

Os NROs emitem dendritos apicais, voltado para a cavidade nasal, e um axônio basal

que segue amielínico através da lâmina própria. Estes axônios são então organizados em

feixes por um tipo especial de glia, a glia embainhante olfatória (GEO) e a coalizão de feixes,

por vez, forma o primeiro par de nervos cranianos ou nervo olfatório. Em seguida, os axônios

olfatórios atravessam a placa cribiforme, entram no sistema nervoso central (SNC),

dispersam-se na camada de fibras olfatórias do bulbo olfatório (BO) e rumam para a camada

glomerular do BO, onde estabelecem sinapses com outros tipos neuronais (Henion &

Schwarting, 2007).

O bulbo olfatório recebe uma grande variedade de informações provenientes de

moléculas odoríferas, captadas pelos NROs na cavidade nasal e as redirecionam para o córtex

piriforme, onde os odores são processados (Johnson et al., 2000).

2

1.2 Anatomia do bulbo olfatório

O BO é uma estrutura telencefálica laminada, situada na face anterior do lobo frontal,

imediatamente acima da placa crivosa do osso etmóide. O BO de animais macrosmáticos

pode ser dividido em duas regiões: bulbo olfatório principal (BOP) e bulbo olfatório acessório

(BOA), localizado em uma posição caudo-dorsal em relação ao BOP (Halpern & Martínez-

Marcos, 2003). Além disso, essas regiões são funcionalmente separadas e embora o BOA

apresente uma organização laminar semelhante à do BOP, este é formado por camadas mais

delgadas e menos distintas.

1.2.1 Organização citoarquitetônica do bulbo olfatório principal

A estrutura histológica do BOP consiste em seis camadas distintas (da camada mais

externa para interna): camada de fibras olfatórias, camada glomerular, camada plexiforme

externa, camada de células mitrais, camada plexiforme interna e camada de células granulares

(Meisami & Bhatnagar, 1998) (Figura 1).

A camada de fibras olfatórias, camada mais externa do BO, marca a transição entre o

sistema nervoso periférico (SNP) e o SNC, onde os fascículos dos axônios olfatórios

penetram no BO para inervar neurônios de segunda ordem. Esta camada também é composta

por astrócitos e pela glia embainhante olfatória (GEO).

A camada glomerular contém, além dos glomérulos, os corpos celulares das células

tufosas externas e pequenos interneurônios, denominados neurônios periglomerulares

(Doetsch & Alvarez-Buylla, 1996). Os glomérulos são formados por neurópilo, circundado

por neurônios, oligodendrócitos, astrócitos e, possivelmente, por glia embainhante olfatória

(Valverde & Lopez-Mascareque, 1991).

3

A camada plexiforme externa é a camada relativamente espessa de neurópilo, no qual

predominam dendritos de células mitrais, células tufosas e células granulares. Contém corpos

celulares esparsos de células tufosas (Lledo et al., 2004).

A camada de células mitrais forma uma lamina, delgada e compacta, contendo os

corpos celulares das células mitrais (Margrie et al., 2001).

A camada plexiforme interna é uma camada fina com baixa densidade celular, mas

com axônios colaterais de células mitrais e outras fontes não identificadas e dendritos das

células granulares.

A camada de células granulares, camada mais interna do BO, é composta por uma

grande quantidade de neurônios granulares desprovidos de axônios.

Figura 1- Camadas do bulbo olfatório de rato adulto. Coloração do núcleo por DAPI mostrando as seis camadas (da mais externa para mais interna) do bulbo olfatório de mamífero: camada de fibras olfatórias – CFO, camada glomerular – Cgl, camada plexiforme externa – CPE, camada de células mitrais – CCM, camada plexiforme interna – CPI e camada de células granulares – CCGr. Barra de calibração: 40µm.

4

1.3 Glia embainhante olfatória (GEO)

A GEO foi originalmente descrita como células estreladas ou fusiformes presentes

entre as fibras do BO próximas à pia máter (Ramón-Cueto & Nieto-Sampedro, 1994; revisto

por Levine & Marcillo, 2008). Embora mais tarde, estudos se refiram a essas células como

“glia de Blañes” ou “célula de Schwann olfatória”, a nomeclatura atualmente empregada é a

de glia embainhante olfatória, proposta por Doucette (1984).

A GEO origina-se de células progenitoras gliais que emigram do placódio olfatório

(Marin-Padilla & Amieva, 1989). Esse tipo celular é encontrado apenas no eixo olfatório,

mais especificamente na lâmina própria da mucosa olfatória, no nervo olfatório, na camada de

fibras olfatórias e possivelmente na camada glomerular (Valverde et al., 1992) do BO, sendo

portanto, a única glia capaz de atravessar o limite entre os sistemas nervosos periférico e

central (Doucette, 1984; Au & Roskams, 2003) (Figura 2). No SNP, a GEO acompanha

axônios de neurônios olfatórios, emitindo prolongamentos que embainham grupos destes

axônios organizando-os como fascículos, até sua entrada no bulbo olfatório.

No eixo olfatório é observada uma contínua reposição de neurônios receptores, bem

como a reorganização de sinapses ao longo da vida e embora todos os determinantes destes

eventos não sejam conhecidos, a GEO é apontada como um dos elementos chaves deste

processo. A GEO é capaz de produzir vários fatores de crescimento como fator neurotrófico

derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator de

crescimento de neurônios (NGF), fator de crescimento derivado de células gliais (GDNF),

neurotrofina 4/5, neuregulinas (Ramón-Cueto e Valverde, 1995; revisto por Ramón-Cueto e

Ávila, 1998; Kaftz e Greer, 1999; Chuah et al., 2000; Woodhall et al., 2001) e moléculas de

adesão celular como N-CAM (molécula de adesão celular neural), PSA-NCAM, laminina,

fibronectina e L1 (Miragall et al., 1988; Franceschini & Barnett, 1996). Estes fatores

possivelmente participam do crescimento fisiológico de novos axônios olfatórios primários.

5

Além de moléculas promotoras de crescimento, a GEO pode proporcionar uma barreira entre

fascículos de axônios olfatórios e respectivas moléculas quimiorepelentes (Schwarting et al.,

2000).

Figura 2- Representação do sistema olfatório. (A) Células basais (em marrom) dão origem a neurônios receptores olfatórios (em azul). A glia embainhante olfatória (em verde) embainha os axônios olfatórios ao longo de seu trajeto da membrana basal do epitélio olfatório até a camada glomerular do bulbo olfatório. (B) Seção sagital da cabeça de rato, mostrando o sistema olfatório. Bulbo olfatório acessório - BOA; bulbo olfatório - BO; mucosa olfatória –MO. Modificado e adaptado de Firestein, 2001 e Thuret et al., 2006.

6

Inicialmente, a idéia de que culturas de GEO apresentam diferentes tipos de células foi

sugerida por Ramón-Cueto e colaboradores (Pixley, 1992; Ramón-Cueto & Nieto-Sampedro,

1992; Ramón-Cueto et al., 1993), que relatou através de ensaios imunocitoquímicos a

presença de três morfologias celulares distintas nas culturas de GEO do BO de ratos adultos:

(1) “Schwann cell-like OECs” ou GEO similar à célula de Schwann fusiforme com

prolongamentos finos; (2) “astrocyte-like OECs” ou GEO semelhante a astrócitos com

morfologia aplanada com número variável de prolongamentos achatados que lembram

astrócitos tipo-1 e (3) “macrophage like cells” ou células similares a macrófagos, nem sempre

detectável in vitro. O primeiro grupo de GEO apresenta características morfológicas

semelhantes às das células de Schwann não-mielinizante do SNP e, tal como estas, estão

ligadas à regeneração axonal. Esse perfil morfológico expressa a proteína ligadora de cálcio

associada ao citoesqueleto S100, a molécula de adesão L1, o receptor para fator de

crescimento neuronal de baixa afinidade (p75-NGFR) e marcação fraca para proteína ácida do

filamento glial (GFAP) (Ramón-Cueto & Nieto-Sampedro, 1992). O segundo grupo

(semelhantes a astrócitos) apresenta forte expressão das proteínas GFAP, S100 e da molécula

de adesão celular neural polisiálica (PSA-NCAM) (Franceschini & Barnett, 1996).

Nos últimos anos, o interesse na GEO tem aumentado em estudos de transplante

celular para regeneração do SNC. Estes estudos revelaram um potencial regenerativo da GEO

ao proporcionar um ambiente favorável para o crescimento axonal nas áreas de lesão, o que

frequentemente resulta na regeneração axonal e em casos de recuperação funcional dos

animais (Franklin & Barnett, 1996; Rámon-Cueto at al., 2000; Li et al., 2003; Santos-Benito

& Ramón-Cueto, 2003; Keyvan-Fouladi et al., 2005; revisto por Franssen et al., 2007)

(Figura 3).

Embora a GEO represente uma potente ferramenta terapêutica, alguns autores relatam

falhas no processo de regeneração. O motivo desta falha não pode ser determinado, mas

7

coincidentemente foi observada uma concomitante interrupção na migração da GEO (Li et al.,

2003). Desta forma, a determinação das estruturas celulares e vias de sinalização envolvidas

na migração da GEO constitui um dos pontos centrais para o entendimento da capacidade e

limitações desta célula na promoção da regeneração axonal, bem como para seu uso

terapêutico.

Figura 3- Etapas de regeneração axonal pela GEO. Efeito regenerativo da GEO transplantada (em vermelho) acompanhada de fibroblastos (em verde) sobre axônios corticoespinhais lesionados (em cinza) de rato. (A) Durante a primeira semana, os axônios avançam sob aposição da GEO e fibroblastos. (B) Entre a terceira e a quarta semana, os axônios prosseguem através da lesão, envoltos pela GEO, formando uma ponte entre os domínios de mielina central produzidas por oligodendrócitos (em azul). Modificado de Li et al., 2003.

A

B

8

1.4 Moléculas candidatas no envolvimento da migração da GEO

1.4.1 2’ 3’ nucleotídeo cíclico 3’ fosfodiesterase - CNPase

Inicialmente, a 2’ 3’ nucleotídeo cíclico 3’ fosfodiesterase (CNPase) foi caracterizada

no baço e no pâncreas bovino (Whitfeld et al., 1955). Atualmente, sabe-se que a CNPase é

expressa em níveis mais baixos fora do SNC e foi verificada sua associação com proteínas do

citoesqueleto, mitocôndria e mielina (Bifulco et al., 2002; Lee et al., 2005, 2006).

Diversos estudos demonstraram que a CNPase (pertencente à super-família das 2H

fosfoesterases) tem capacidade de hidrolizar ligações fosfodiester em oligonucleotídeos,

nucleotídeos cíclicos e 2’, 3’ NADP cíclico. Entretanto, pela aparente ausência de

nucleotídeos 2’, 3’ (substrato) em tecidos animais, a atividade enzimática desta proteína tem

sido questionada (Tsukada & Kurihara, 1992).

Duas isoformas, CNPase I (46 kDa) e CNPase II (48 kDa) são codificadas pelo único

gene de CNPase, distinguindo em apenas 20 aminoácidos no domínio N-terminal (Tsukada &

Kurihara, 1992). Estas duas isoformas moleculares são resultantes de splicing alternativo.

Esses dados sugerem que o ácido ribonucléico mensageiro (RNAm) que codifica a CNPase I

pode ser expresso principalmente no SNC, enquanto que o RNAm que codifica a CNPase II

pode ser expresso em diferentes tecidos (Scherer et al., 1994).

A CNPase é reconhecida como marcadora precoce de oligodendrócitos, marcadora de

células de Schwann (revisto por Sprinkle, 1989) e GEO adultas (Santos-Silva & Cavalcante,

2001). A CNPase está aparentemente envolvida nas etapas iniciais de embainhamento

anteriores à compactação da mielina (Reynolds & Wilkin, 1988; Yoshino et al., 1989; Amur-

Urmarjee et al., 1990; Barradas et al., 1995).

Em oligodendrócitos, a CNPase aparece associada à membrana e mantém fortes

relações com microtúbulos e microfilamentos, distribuindo-se nas expansões de membrana

destas células, num padrão de nervuras e prolongamentos intercomunicantes mais finos, co-

9

localizada com tubulina e actina (Dyer & Benjamins, 1989; Reynolds et al., 1989). Desse

modo, os autores descrevem a CNPase como uma proteína membrano-esqueletal. Além disso,

diversos estudos sugerem um papel da CNPase na migração e/ou na expansão da membrana

celular durante a mielinização (De Angelis & Braun, 1996).

Além da associação com o citoesqueleto, a presença da CNPase em oligodendrócitos

também foi detectada em lipid rafts, microdomínios enriquecidos em colesterol e

esfingolipídios (Kim & Pfeiffer, 1999; Taylor et al., 2002; Hinman et al., 2008). Sabe-se que

as plataformas lipídicas estão envolvidas no controle do tráfego de proteínas pela célula e

modulam cascatas de sinalização intracelular (Simons & Toomre, 2000), como será detalhado

adiante. Desta forma, é possível que a CNPase esteja envolvida em vias de sinalização

membrano-esqueletais.

Apesar de evidências experimentais, a função biológica da CNPase ainda não é clara.

Lappe-Siefke e colaboradores (2003) demonstraram, por exemplo, que ratos transgênicos

incapazes de expressar CNPase apresentam redução na espessura do corpo caloso,

degeneração axonal, gliose reativa, diminuição do desempenho motor e aumento na

mortalidade. Por outro lado, a superexpressão de CNPase induz a formações aberrante de

membranas de mielina, evidenciando que a CNPase desempenhe um importante papel na

compactação de mielina (Yin et al., 1997).

10

1.4.2 Gangliosídeos

Os gangliosídeos compreendem um grande grupo de glicoesfingolipídios sialilados,

isto é, glicolipídios formados por uma cadeia de ácido graxo e uma cadeia de esfingosina

ligada ao ácido siálico (Wiegandt, 1985) (Figura 4A). Esses componentes são importantes na

estrutura das membranas biológicas, devido ao seu caráter anfipático e são amplamente

expressos em tecidos de mamíferos, particularmente no SNC (Loyd & Furukawa, 1998), onde

representam 5 a 10% da massa total de lipídios. Os gangliosídeos participam de várias

funções importantes, entre elas: reconhecimento, adesão e sinalização celular (Hakomori,

1990, Yu et al., 2004).

Dentre os gangliosídeos, pode-se citar o gangliosídeo reconhecido pelo anticorpo

monoclonal Jones, o 9-O-acetil GD3 (Constantine-Paton et al., 1986). Este gangliosídeo está

presente no sistema nervoso central e periférico, sendo particularmente abundante durante o

desenvolvimento (Mendez-Otero et al., 1988), e em algumas regiões específicas no adulto,

onde há migração celular e/ou crescimento neurítico. O 9-O-acetil GD3 é também expresso

em culturas de neurônios e precursores de oligodendrócitos (Farrer & Quarles, 1999; Santiago

et al., 2001). O 9-O-acetil GD3 é um derivado do gangliosídeo GD3 em que um grupo acetil é

anexado por uma ligação éster na posição 9 do resíduo de ácido siálico terminal (Ren et al.,

1992) (Figura 4B). A esfingosina do 9-O-acetil GD3 é uma lactosilceramida, que se insere na

membrana plasmática. Por sua vez, situadas na face externa da membrana plasmática,

encontram-se as duas moléculas de ácido siálico presas a lactosilceramida.

O anticorpo monoclonal A2B5 reconhece uma variedade de gangliosídeos expressos

por precursores oligodendrogliais de elevada motilidade, como o gangliosídeo GT3 e o 9-O-

acetil GT3 na superfície das células neuronais e gliais (Dubois et al., 1990), bem como o 9-O-

acetil GD3 (Farrer & Quarles, 1999).

Dados preliminares do grupo envolvido nesse estudo, realizados por Santos-Silva e

11

colaboradores indicaram através de ensaios de imunobloqueio em culturas de GEO de

explante do BO utilizando o anticorpo Jones, que há uma redução de aproximadamente 3

vezes na capacidade migratória da GEO. O mesmo ocorria quando a atividade do

gangliosídeo era bloqueada, por adição do anticorpo A2B5. O tratamento com esse anticorpo

ocasionou igualmente uma redução de 4,8 vezes (na diluição de 10 vezes) e de 4 vezes (na

diluição de 1000 vezes) na migração da GEO (dados não publicados). Tais resultados

sugerem que esses gangliosídeos desempenhem um importante papel na motilidade da GEO,

in vitro, sob substrato de laminina. Essas moléculas vêm sendo crescentemente associadas à

função das lipid rafts, que são estruturas especializadas da membrana plasmática,

contextualizadas a seguir.

Figura 4- Moléculas de glicolipídios. (A) Um gangliosídeo geralmente contém um ou mais resíduos de ácido siálico carregados negativamente. (B) O gangliosídeo 9-O-acetil GD3 é formado pela adição de um grupo acetil ao carbono da posição 9 do ácido siálico terminal do GD3. Modificado de Fishman, 1982 e Mendez-Otero & Santiago, 2003.

A

B

12

1.5 Visão geral da membrana plasmática

A membrana plasmática corresponde à interface por meio da qual a célula interage

com seu ambiente e células vizinhas. Esta estrutura é composta principalmente de proteínas,

lipídios e eventuais glícidos associados (Unwin et al., 1984).

As proteínas associadas à membrana, podem ser classificadas em: proteínas periféricas

ou extrínsecas (localizadas à superfície da membrana) e proteínas integrais ou intrínsecas

(localizadas entre os fosfolipídios, podendo atravessar completamente a bicamada). Além

disso, as proteínas podem também estar associadas a glicídios na monocamada externa, sendo

denominadas, dessa forma, glicoproteínas. Sabe-se que as proteínas e glicoproteínas

promovem importantes eventos celulares como o transporte de íons, armazenamento de

energia, migração e transdução de sinais (Zheng et al., 2009).

Os três principais grupos de lipídios da membrana são: os fosfolipídios, o colesterol e

os glicolipídios (Figura 5B), que podem variar em presença e quantidade, em função do tipo

celular ou especializações membranares de uma mesma célula. Os fosfolipídios são

compostos por um ácido fosfórico, uma molécula de glicerol esterificado e duas cadeias

hidrofóbicas de ácidos graxos. Este componente representa o principal componente lipídico

da membrana plasmática, conferindo propriedades de permeabilidade seletiva e organização

em bicamada da membrana celular e organelas. O colesterol é outro lipídio constituinte da

membrana plasmática, responsável pela fluidez e formação de microdomínios lipídicos

(Alberts et al., 2002). Por vez, os glicolipídios são moléculas de lipídios associados a glicídios,

localizados na monocamada externa da bicamada lipídica, cuja função está em grande parte

associada a sítios receptores específicos da membrana celular (Alberts et al., 2002).

O clássico modelo do mosaico fluido de Singer e Nicholson (1972) sugere que as

proteínas e os lipídios difundem livremente sob a superfície bidimensional da célula, sendo as

proteínas incorporadas randomicamente na bicamada de fosfolipídios (Figura 5A).

13

Atualmente sabe-se que a estrutura física da bicamada pode ser profundamente alterada pela

concentração localizada de componentes como colesterol e esfingolipídios, um tipo de

glicolipídio. O colesterol naturalmente se insere na região hidrofóbica da bicamada lipídica,

reduzindo a permeabilidade membranar e inibindo possíveis transições de fase (Alberts et al.,

2002). Já os esfingolipídios possuem cadeias de ácidos graxos saturadas e mais longas do que

a maioria dos lipídios membranares, o que proporciona uma maior interação entre estes,

reduzindo, por vez, a difusão lateral de componentes membranares. A concentração destes

componentes pode eventualmente alterar o estado de fluidez da membrana, que passaria de

líquido desordenado, descrito no modelo tradicional do mosaico fluido, para um estado de

líquido ordenando (revisto por Munro et al., 2003).

Figura 5- Modelo esquemático do mosaico fluido das membranas celulares e seus componentes. (A) A membrana celular é uma estrutura complexa composta principalmente por proteínas e lipídios. (B) Os lipídios são separados em: fosfolipídios, glicolipídios e esterol. A quantidade relativa desses componentes varia de célula para célula. Modificado de Pietzsch, 2004 e Fantini et al., 2002.

A B

14

1.6 Microdomínios lipídicos de membrana (lipid rafts)

Em 1988, Simons e van Meer revelaram uma nova característica da membrana

plasmática quando propuseram a existência de microdomínios ordenados em células epiteliais

polarizadas. Estudos seguintes demonstraram que estes microdomínios lipídicos, designados

lipid rafts, correspondiam a uma separação de fase temporária na bicamada lipídica fluida

onde se concentravam grandes quantidades de esfingolipídios e colesterol (Simons & Ehehalt,

2002; Pike, 2006) (Figura 6). Dessa forma, a presença de microdomínios líquidos ordenados

nas células transformou o modelo do mosaico fluido em um sistema mais complexo. Em

outras palavras, as lipid rafts formam distintas fases líquidas ordenadas na bicamada lipídica,

inseridas em uma matriz líquida desordenada de lipídios insaturados (Schroeder et al., 1994;

revisto por Brown & London, 1998).

As rafts representam áreas especializadas de pequeno diâmetro (de 10 a 200 nm) das

membranas eucarióticas as quais são caracterizadas por uma composição química e

propriedades físicas únicas (Simons & Ikonen, 1997; Pike, 2006). Desta forma, as lipid rafts

criam um microambiente físico e bioquímico adequado para o funcionamento e recrutamento

por afinidade de diversas proteínas. Através da agregação dos diferentes lipídios e proteínas

que a constituem, as rafts medeiam muitos processos biológicos importantes, incluindo vias

de transdução de sinais, apoptose, adesão/migração celular, organização do citoesqueleto,

bem como eventos de endocitose e exocitose (revisto por Simons & Toomre, 2000; revisto

por Harris & Siu, 2002; Prag et al., 2007). Esses últimos eventos, em especial, são também

utilizados para a invasão e propagação de patógenos virais (Bavari et al., 2002) e bacterianos

(Fivaz et al., 2000).

A composição das rafts é melhor caracterizada em sua monocamada externa (revisto

por Parton & Richards, 2003). Estudos recentes sugerem que a monocamada interna tenha

uma organização equivalente à externa, sendo, portanto, rico em fosfolípidios com ácidos

15

graxos saturados e colesterol. A indeterminação persistente até o momento de propriedades

fundamentais das rafts é em grande parte resultado da dificuldade metodológica da

observação destes microdomínios em células vivas.

Figura 6- Esquema do modelo dos microdomínios de membrana. A lipid raft é uma região da membrana plasmática enriquecida de colesterol, glicoproteínas, glicolipídios, proteínas transmembranares e proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI). Modificado de Alberts et al., 2002.

LÚMEN

CITOSOL

LIPID RAFT

16

1.7 Diversidade de componentes dos microdomínios lipídicos

Na literatura encontramos inúmeros métodos para o isolamento das lipid rafts.

Entretanto, trabalhos realizados utilizando diferentes metodologias bioquímicas de extração

das rafts resultaram em dados heterogêneos quanto a concentrações de componentes e

densidades das rafts (Radeva & Sharom, 2004). Desse modo, a lipid raft é relatada como uma

estrutura dinâmica. Sob algumas circunstâncias, parece ser um domínio enriquecido de

colesterol e glicoesfingolipídios e sob outras, parece ser uma estrutura mais diversificada de

lipídios.

Dependendo da distribuição bioquímica, as rafts podem receber diversas nomeclaturas,

como: membranas enriquecidas de colesterol (cholesterol-enriched membranes, ou CEMs),

membranas enriquecidas de glicoesfingolipídios (glycosphingolipid-enriched membranes, ou

GEMs), membranas enriquecidas de glicoesfingolipídios insolúveis a detergente (detergent-

insoluble, glycosphingolipid-enriched membranes, ou DIGs) e membranas resistentes a

detergentes (detergent-resistant membranes, ou DRMs). Os dois últimos termos refletem a

observação de que esses domínios não são solubilizados em detergentes não-iônicos (revisto

por Pike, 2004).

A extração com 1% de Triton X-100 a 4°C consiste na ferramenta bioquímica

tradicional usada para estudar estas plataformas lipídicas. Análises desses microdomínios a

partir dessa preparação têm revelado uma composição similar entre diferentes tipos celulares.

Essa composição abrange basicamente lipídios como o colesterol (de 35-50% do total das

rafts); esfingomielina (de 10-15%); glicoesfingolipídios, como o gangliosídeo GM1 (de 10-

20%); glicerofosfolipídios, incluindo os maiores fosfolipídios da membrana, fosfatidicolina e

fosfatidiletanolamina (menos de 30%) (revisto por Pike, 2004).

Embora grande parte das proteínas membranares encontrem-se dispersas, algumas se

inserem preferencialmente em rafts. Essas proteínas atuam como importantes moduladores da

17

estrutura, estabilidade e funções desses microdomínios (revisto por Bauer & Pelkmans, 2006).

Exemplos típicos incluem proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI) (revisto por

Chatterjee & Mayor, 2001); cinases da família Src (Lck, Fyn e Lyn), que são ancoradas na

monocamada externa (revisto por Simons & Toomre, 2000); proteínas aciladas via S-

palmitoilação ou N-miristoilação como flotilinas (Rajendran et al., 2003) e proteínas

associadas a colesterol, como caveolinas (Kurzchalia & Parton, 1999).

Entre as proteínas e lipídios residentes das lipid rafts, daremos destaque para as

proteínas flotilina e caveolina, bem como para o gangliosídeo GM1, co-expressos em

diferentes tipos celulares de mamíferos e, portanto, utilizados como biomarcadores

convencionais destes microdomínios.

1.7.1 Cavéolas e Caveolinas

Uma das maiores subclasses das lipid rafts é a cavéola, uma estrutura identificável

morfologicamente (Kurzchalia & Parton, 1999), que contém um enriquecimento significativo

da proteína caveolina. As cavéolas quando observadas pela microscopia eletrônica mostram-

se como pequenas invaginações na membrana plasmática da célula de 50 a 100 nm de

diâmetro, não revestidas por moléculas de clatrina (Yamada, 1955; Anderson, 1998; Shin &

Abraham, 2001).

As cavéolas podem desempenhar funções de endocitose, transporte de colesterol e

sinalização. Dados da literatura sugerem a proteína integrante das cavéolas, caveolina

(ligadora de colesterol), seja parte integrante do maquinário de transporte do colesterol celular.

Uma vez complexada com o colesterol, a caveolina forma a estrutura de grampo (hairpin

loop) típica dos microdomínios caveolares, o que propicia os eventos de endocitose

característicos destas estruturas (Figura 7). A afinidade da caveolina pelo colesterol pode

18

variar de acordo com seu estado de polimerização, tendo sua forma monomérica ou em

oligômeros uma afinidade menor do que a forma polimerizada (Murata et al., 1995).

A família da caveolina é composta pelas proteínas caveolina-1, caveolina-2 e

caveolina-3 (Scherer et al., 1996, 1997; Couet et al., 1997). Todas as isoformas da caveolina

são integrais, apesar disso, não atravessam a membrana plasmática. Tanto a região carboxi,

quanto a região amino terminal ficam voltadas para o lado citosólico. Embora mostrem

semelhanças em estrutura e função, todas as caveolinas diferem em propriedades específicas e

na distribuição nos tecidos (Way & Parton, 1995; Scherer et al., 1996; Tang et al., 1996).

Além do colesterol, estas proteínas podem se ligar diretamente a glicoesfingolipídios e

moléculas sinalizadoras modificadas por lipídios (Li et al., 1995; Murata et al., 1995).

O primeiro membro da família caveolina a ser identificado foi a caveolina-1 (21 kDa),

também conhecida como VIP21 (vesicular integral membrane protein) ou Cav-1. Esta

proteína estrutural das cavéolas é a principal componente das vesículas derivadas da rede

trans-Golgi (Kurzchalia at al., 1992). A caveolina-1 (Figura 7) pode também participar de

diversas vias de sinalização ao ser fosforilada em resíduos de tirosina por membros da família

Src de cinases (Corley et al., 2001). Além disso, a caveolina-1 apresenta um domínio

conservado de 20 aminoácidos denominado de caveolin-scaffolding domain, que corresponde

a uma sub-região do domínio de oligomerização implicado na interação funcional da proteína

com moléculas de sinalização (Shin & Abraham, 2001; Williams & Lisanti, 2004).

A caveolina-2 (Cav-2) e a caveolina-3 (Cav-3) foram identificadas em 1996 usando

diferentes métodos experimentais. A Cav-2 foi descoberta pelo microsequenciamento de uma

proteína de 20 kDa que foi co-purificada de membranas caveolares derivadas de adipócitos

(Scherer et al., 1996). Outras caracterizações revelaram que a Cav-2 colocaliza com a Cav-1,

formando hetero-oligômeros em cavéola e é co-expressada em muitas células e tecidos, e

exige a presença da Cav-1 para a correta localização na membrana (Scherer et al., 1997;

19

Parolini et al., 1999). Cav-3, também conhecida como M-caveolina foi identificada através de

dados de pesquisas tradicionais com a biblioteca de cDNA numa tentativa de encontrar Cav-1

homólogas (Way & Parton, 1995; Tang et al., 1996). Esta proteína é encontrada de forma

específica no tecido muscular e apresenta peso molecular de 18 kDa.

Figura 7- Esquema da proteína caveolina-1 inserida na membrana plasmática. (A) A proteína caveolina, quando complexada com o colesterol forma a estrutura de um grampo de cabelo(hairpin loop), acredita-se para induzir a curvatura da bicamada lipídica para formar a cavéola. Observa-se os dois monômeros de caveolina-1, formando um dímero e que o domínio carbox e amino terminais estão direcionados para o citoplasma (B) Seqüência primária da Cav-1, evidenciando os seus domínios. O grupo palmitoil, auxilia na inserção na membrana plasmática. Modificado de Williams & Lisanti, 2004.

20

1.7.2 Flotilinas

Uma segunda família de proteínas, a família da flotilina, pode também ter um papel

estrutural na formação das lipid rafts, colaborando com a estabilização destes microdomínios.

Duas isoformas da flotilina tem sido caracterizadas, a flotilina-1 (45 kDa), também conhecida

como Reggie-2 e a flotilina-2 (42 kDa), também chamada de Reggie-1 (Bickel et al., 1997;

Volonte et al., 1999).

As flotilinas são proteínas pertencentes à superfamília SPFH (Stomatins, Prohibitins,

Flotillins, HflK/C), sendo altamente conservadas evolutivamente e com propensão à

oligomerização (Babuke & Tikkanen, 2007; revisto por Browman et al., 2007; Solis et al.,

2007). Esta proteína encontra-se associada à monocamada interna da membrana celular, na

qual se ancora por meio de acetilação (revisto por Langhorst et al., 2005). A interação entre a

flotilina e a monocamada interna ocorre em diferentes pontos hidrofóbicas de sua estrutura

alongada, o que colabora para a referida estabilização das rafts mediada por esta proteína. Os

2 tipos de flotilina podem valer-se de diferentes mecanismos de acetilações para seu

ancoramento na membrana, sendo a flotilina-1 ancorada por palmitoilização (Figura 8) e a

flotilina-2 por miristoilização, além de palmitoilização.

Embora se saiba que caveolinas e flotilinas possam interagir através de hetero-

oligomerização in vitro (Lisanti et al., 1993; Scherer et al., 1997; Volonte et al., 1999), o

mecanismo pelo qual estas proteínas facilitam a formação de vesículas ainda não foi

caracterizado. A flotilina-1 tem sido implicada na organização caveolar juntamente com

caveolina (Bickel et al., 1997; Volonte et al., 1999). Embora existam lipid rafts não

caveolares, toda cavéola se forma a partir de um arcabouço inicial destes microdomínios

lipídicos, o que é fundamental para a correta inserção da caveolina na membrana celular

(revisto por Ikonen, 2001).

Estudos recentes sugerem funções alternativas para flotilina, frequentemente utilizada

21

como proteína marcadora de rafts (Lang et al., 1998; Hazarika et al., 1999). Por fim, as

flotilinas também ligam ao colesterol, interagem com moléculas sinalizadoras através de

proteínas ancoradas por GPI (Anderson, 1998), regulam a reorganização do citoesqueleto de

actina, adesão celular dependente de actina e migração celular (Vassilieva et al., 2009).

Outros estudos, porém, têm implicado a flotilina-2 na formação de filopódios em células

neuronais (Lang et al., 1998; Hazarika et al., 1999).

Figura 8- Esquema da proteína flotilina-1 inserida parcialmente na membrana plasmática. A associação da flotilina-1 na membrana é mediada por duas regiões hidrofóbicas no domínio SPFH e um resíduo palmitato. Azul: domínio SPFH; marrom: domínio hidrofóbico; vermelho: sítio de palmitoilação; verde: domínio flotilina. Modificado de Browman et al., 2007.

22

1.7.3 Gangliosídeo GM1

O GM1 é um esfingolipídio presente na monocamda externa da membrana plasmática

e enriquecido em lipid rafts (Peterson, 2005) (Figura 9). Sabe-se que este gangliosídeo é

parte integrante do maquinário responsável pela endocitose da toxina do cólera. Esta toxina é

liberada pela bactéria Vibrio cholera e é formada por uma subunidade A (catalítica) e 5

subunidades B, responsáveis pela ligação ao gangliosídeo GM1 e consequente entrada na

célula-alvo (revisto por Fantini et al., 2002). A subunidade B reconhece o motivo

pentassacarídeo deste gangliosídeo (revisto por Fantini et al., 2002). Devido à sua afinidade

pelo GM1, a toxina do cólera, vêm sendo frequentemente utilizado como ferramenta de

identificação de lipid rafts que são, como mencionado, enriquecidas neste ganglisídeo.

Figura 9- Estrutura do gangliosídeo GM1. O esquema demonstra a inserção da esfingomielina, fosfolipídios saturados, colesterol e GM1 nas rafts. Por vez, na direita, há a representação bioquímica desse último componente lipídico. Modificado de Peterson, 2005.

23

1.8 Rafts desorganizadas: depleção de colesterol

Uma das formas de desfazer/desorganizar os microdomínios lipídicos de membrana é

através do uso da metil-β-ciclodextrina (MβCD). Essa droga depleta o colesterol da

membrana plasmática, desestruturando formações de lipid rafts do tipo caveolar ou não e,

consequentemente, bloqueando processos biológicos dependentes dessas regiões, o que

constitui uma importante ferramenta bioquímica para o estudo de funcionalidade desses

microdomínios lipídicos (Ilangumaran & Hoessli, 1998). A MβCD é um polímero constituído

de sete unidades de glicose que pode formar complexos solúveis em água com pequenas

moléculas e partes de grandes compostos (Pitha et al., 1988).

Diferentemente de outros agentes de ligação a colesterol que se incorporam em

membranas, as ciclodextrinas agem estritamente na superfície extraindo seletiva e

rapidamente o colesterol de membrana pela inclusão desta molécula em sua cavidade central

hidrofóbica (Zidovetzki & Levitan, 2007). O grau de depleção do colesterol na célula é

dependente da concentração da droga, tempo de incubação, temperatura e do tipo celular

utilizado no estudo.

Figura 10- Representação da metil-β-ciclodextrina. Essa estrutura é um polímero com uma cavidade não polar, onde o colesterol é armazenado na sua depleção na membrana plasmática. Fonte: www.chemblink.com

24

1.9 A relevância do estudo

O estudo sobre microdomínios lipídicos (lipid rafts) vem se intensificando nos últimos

anos. O envolvimento destas estruturas em importantes eventos celulares torna de particular

interesse sua caracterização em células como a glia embainhante olfatória (GEO), cujo efetivo

uso em terapias neuroregenrativas depende de um melhor entendimento de suas propriedades

fundamentais. O objeto de estudo deste trabalho é a caracterização das lipid rafts da GEO, por

critérios bioquímicos estabelecidos na literatura e por meio dos marcadores GM1, flotilina e

caveolina. Bem como, verificar as possíveis alterações dos microdomínios lipídicos da GEO

após a depleção de colesterol pelo fármaco metil-beta-ciclodextrina.

A conhecida falha na regeneração promovida pela GEO é atribuída a uma reduzida

motilidade dessa célula em determinadas circunstâncias. Dados preliminares do grupo

envolvido nesse estudo sugerem que o bloqueio funcional de gangliosídeos reconhecidos

pelos anticorpos Jones e A2B5, resulta na redução da motilidade da GEO. A identificação da

distribuição membranar destes componentes e da CNPase (proteína de mielina não-compacta)

em relação à microdomínios lipídicos, portanto, representa um importante passo no estudo de

seu envolvimento em vias de sinalização de influência na motilidade.

25

2 Objetivos

2.1 Geral

Isolar e caracterizar os microdomínios lipídicos (lipid rafts) presentes na membrana

plasmática da glia embainhante olfatória (GEO).

2.2 Específicos

Avaliar a presença de marcadores específicos nas frações resistentes a detergente;

Verificar a morfologia das lipid rafts;

Avaliar a composição lipídica das frações do gradiente de sacarose;

Investigar a presença da CNPase (proteína da mielina não-compacta característica da

GEO) nos microdomínios lipídicos da membrana;

Verificar se o gangliosídeo 9-O-acetil-GD3 e os gangliosídeos reconhecidos pelo

A2B5 co-localizam com lipid rafts, estabelecendo uma correlação no contexto da

migração da GEO;

Identificar as possíveis alterações dos microdomínios lipídicos da GEO após a

depleção de colesterol pela droga metil-beta-ciclodextrina.

26

3 Material e Métodos

3.1 Animais

Foram utilizados em nossos experimentos 53 ratos Wistar fêmeas e machos, com

idade de dois meses, a partir de cruzamentos feitos no biotério do Instituto de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Todos os procedimentos que utilizaram animais foram aprovados pelo Comitê de Ética

no Uso de Animais do Centro de Ciências da Saúde da UFRJ (protocolo IBCCF 020).

3.2 Cultura de células isoladas

Para aplicação dessa cultura, realizamos o método de isolamento de Nash e

colaboradores (2001) com algumas alterações.

Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical, as cabeças foram cortadas

imediatamente e postas em PBS 10 mM, pH7.4 estéril (8 g de NaCl; 0,2 g de KCl; 1,44 g de

Na2HPO4. 2H2O; 0,2 g de KH2PO4 em 1 litro de água). A dissecção do BO foi realizada em

fluxo laminar, sendo o BO fatiado em um cortador de tecidos. As fatias (800 μm) foram

cortadas no plano transversal e tinham suas partes centrais retiradas, restando somente à

camada de fibras olfatórias (fatias enucleadas). As fatias enucleadas foram colocadas em

solução de Gey (0,17 g de CaCl2, 0,37 g KCl, 0,03 g de KH2PO4, 0,098 g de MgCl2, 0,139 g

de MgCO3 7.H2O, 8 g de NaCl, 0,227 g de NaHCO3 e 0,12 g de NaHPO4) gelada e estéril e

picotadas, onde o tecido foi dissociado através da adição de EDTA 0.01% por 15 minutos e

triturado através de várias passagens por uma seringa de 5 ml com agulha nº21. Obtida a

suspensão de células, foram feitas três centrifugações a 1.500 rpm por 5 minutos, onde os

sobrenadantes foram descartados e o pellet de células foi ressuspenso em meio DMEM/F12

(com 3,15 g/l de glicose, fungisona 25 g/ml, 10.000 g/ml unidades de penicilina, 10.000

g/ml de estreptomicina, 0,365 g/l de glutamina e 50 g/ml de gentamicina) com 10% soro

27

fetal bovino (Gibco, inativado a 56C por uma hora). Após a última centrifugação, o

sobrenadante foi desprezado e o pellet de células foi ressuspenso em 5 ml de DMEM/F12,

enriquecido com extrato de pituitária bovina (20 l/ml, Sigma-Aldrich) e forscolina (2 M,

Sigma-Aldrich). As células foram postas na garrafa de cultura e mantidas na estufa a 37C

submetidas a uma concentração de 5% de CO2. Passadas as primeiras 18 horas, o

sobrenadante da cultura foi passado para uma nova garrafa (ocorria adesão de fibroblastos na

primeira garrafa) e após 36 horas, o sobrenadante da cultura foi colocado em lamínulas

tratadas previamente com poli-L-lisina (20 g/ml, Sigma-Aldrich) cobertas com laminina (40

g/ml, Invitrogen), uma vez que ocorria adesão de astrócitos na segunda garrafa. O meio de

cultura era trocado a cada dois dias e após cinco dias em cultura após o plaqueamento

diferencial, as células foram fixadas em solução de paraformaldeído 4% em tampão fosfato

0,1 M pH 7, por 15 minutos, lavadas com PBS e guardadas na mesma solução a 4ºC.

3.3. Tratamento das células com metil-beta-ciclodextrina (MβCD)

Antes da realização do isolamento das membranas resistentes a detergente, 109 células

foram incubadas com metil-beta-ciclodextrina 20 mM por 30 minutos a 37ºC. Logo após,

essas células puderam seguir a metodologia de isolamento das membranas resistentes a

detergente, conferindo parte integrante do gradiente de sacarose em condição tratada.

3.4 Isolamento das membranas resistentes a detergente da GEO

Uma suspensão de 109 células (em condição controle ou tratada com MβCD 20 mM)

foi avolumada para 1 ml com tampão TNE [Tris-HCl 25 mM pH 7,3; NaCl 150 mM; EDTA

(ácido etilenodiaminotetracético) 5 mM], acrescida de inibidores de protease (PMSF 1mM.

Benzamidina 5 mM, pepstatina 10 μM, coquetel da Sigma e leupeptina 10 mM) a 4°C. Esse

material foi passado na seringa com agulha de 23G e sonicado 10% da amplitude total do

28

aparelho (Branson Sonifier 250) por 3 ciclos de 10 s e intervalo de 3 s para o rompimento

total das membranas. Ao término, foi realizada a extração com Triton X-100 1% em tampão

TNE a 4°C por 20 minutos. Finalizando o tratamento, a amostra foi misturada com um

tampão de sacarose 80% (2,3 M) em TNE na proporção de 1:1, de forma que a concentração

resultante da amostra fosse de 40%. No fundo do tubo da centrífuga foi colocada essa

solução, acima foram acrescentados 4 ml de sacarose 30% (0,88 M) e por último, 4 ml de

sacarose 5% (0,15 M). O gradiente foi centrifugado por 20-22 horas a 38.000 rpm com rotor

basculante do tipo SW40Ti em uma ultracentrífuga Beckman (Beckman Coulter Inc), a 4°C.

Depois da centrifugação, o material foi fracionado de 1 em 1 ml do topo do tubo ao final,

resultando em 13 frações.

3.5 Densidade das frações do gradiente de sacarose

Após o isolamento das membranas resistentes a detergente da GEO, 10 μl de cada

fração do gradiente controle foi analisada no refratômetro (American Optical Company). Os

valores obtidos nesse equipamento, índice de refração, foram convertidos com o uso da tabela

da Fiberlite (Piramoon Technologies Inc.) em densidade de sacarose (g/cm3).

3.6 Dot blotting das frações do gradiente de sacarose

Após o recolhimento das 13 frações dos gradientes de sacaroses controle e tratado com

MβCD, foram separados 500 µl de cada amostra. Na cuba do dot blotting, colocávamos duas

folhas de papel de filtro e uma membrana de nitrocelulose. Fechando a cuba, foi aplicado em

cada poço os 500 µl correspondentes das 13 frações. Com uma bomba de sucção acoplada na

cuba, as amostras foram passadas para a membrana de nitrocelulose, podendo assim iniciar o

bloqueio com TBS-Tween-Leite em pó desnatado (Tris-HCL 10 mM pH 7,2; NaCl 150 mM;

Tween 20 0,05% e leite em pó desnatado 15 g) per noite a 4°C. No dia seguinte, todo o

29

tampão foi retirado e incubado com o anticorpo primário (vide tabela 1) diluídos em TBS-

Tween-Leite em pó desnatado por 2 horas a temperatura ambiente. Agitando manualmente a

membrana foi lavada 5 vezes de 2 minutos com TBS-Tween-Leite em pó desnatado e logo em

seguida, incubada com o anticorpo secundário fluorescente por 1 hora à temperatura ambiente

(vide tabelas 2 e 3). Novamente, a membrana foi lavada 5 vezes de 2 minutos com TBS-

Tween-Leite em pó desnatado. Depois, lavada 3 vezes de 2 minutos com TBS-Tween (Tris-

HCL 10 mM pH 7,2; NaCl 150 mM; Tween 20 0,05%) e por último 3 lavagens de 2 minutos

de TBS (Tris-HCL 10 mM pH 7,2; NaCl 150 mM). A presença de fluorescência foi detectada

no aparelho Storm 860 (Molecular dynamics, Amersham Pharmacia Biotech).

3.7 Fluorescência da toxina do cólera subunidade B (CT-B)

As células purificadas de GEO foram previamente resfriadas em meio DMEM/F12 por

1 hora a 4°C. Posteriormente foram incubadas com a toxina do cólera (100 µg/ml) em meio

DMEM/F12 por 15 minutos a 4°C, donde uma lamínula foi retirada e fixada em

paraformaldeído 4% em PBS para observação no microscópio. O restante foi lavado em PBS

para remover o excesso do marcador não ligado e foi incubado por 30 minutos a 37°C. Por

fim, as células foram lavadas 2 vezes de 5 minutos em PBS, fixadas e incubadas com 4’,6-

Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) por 5 minutos. Após lavagem com

solução de cloreto de sódio 0,9% por 5 minutos, o material foi montado em solução de p-

fenilenodiamino (5 mg de fenilenodiamino em 500 µl de PBS 0,15 M; 3,5 ml de glicerol e 1

ml de tampão carbonato-bicarbonato 0,5 M pH 9,2) e analisadas por microscopia de

fluorescência (Axioscope Zeiss).

3.8 Imunocitoquímica

30

As amostras (células isoladas fixadas da cultura de GEO) foram lavadas 5 vezes de 5

minutos com solução de PBS/Triton X-100 0,3%. Em seguida, foi feito o bloqueio das

reações inespecíficas com 10% de soro normal de cabra (NGS) e 2% de albumina sérica

bovina (BSA) em PBS/Triton X-100 durante 1 hora e meia. Após esse período, o material foi

novamente lavado e incubado com o(s) anticorpo(s) primário(s) de interesse (vide tabela 1)

diluído em PBS/Triton X-100 0,3%/BSA 1%, em pernoite. As amostras foram submetidas a

novas lavagens com PBS/Triton X-100 (5 vezes de 5 minutos cada). Ao término foi incubado

com anticorpo(s) secundário(s) adequado(s) (vide tabela 2), diluído em PBS/Triton X-100

0,3%/BSA 1% por 1 hora e em seguida, lavados 5 vezes de 5 minutos com PBS e incubado

novamente com DAPI (vide tabela 3) por 5 minutos. Após nova lavagem com solução de

NaCl 0,9% por 5 minutos, o material foi montado em solução de p-fenilenodiamino (5mg de

fenilenodiamino em 500 µl de PBS 0,15 M; 3,5 ml de glicerol e 1 ml de tampão carbonato-

bicarbonato 0,5 M pH9,2). As imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência

(Axioscope Zeiss).

3.9 Anticorpos e outros ligantes

Tabela1- Anticorpos Primários

Anticorpo

PrimárioTipo Feito em Diluição Utilizada

Peso

MolecularOrigem

anti-CNPase monoclonal camundongo

1:100(imunocitoquímica)

1:1.000(immunoblotting)

46 kDa Sigma

anti-S100 policlonal coelho1:100

(imunocitoquímica) 20 kDa Sigma

anti-flotilina-1 policlonal ovelha

1:100(imunocitoquímica)


45 kDa

Santa Cruz

Biotechnology

anticorpo A2B5 monoclonal camundongo1:100

(immunoblotting)Abcam

31

anti-caveolina-1 policlonal coelho

1:100 (imunocitoquímica)


21 kDa Sigma

Jones monoclonal camundongo1:1000

(immunoblotting)Sigma

Tabela 2- Anticorpos Secundários

AnticorpoSecundário

Feito em Diluição Utilizada Origem

anti-IgG Alexa 488

coelho 1:200 Molecular

Probes

anti-IgG Alexa 488

camundongo1:200 Molecular

Probes

anti-IgG Alexa 546

camundongo1:200 Molecular

Probes

anti-IgG biotinilado

camundongo 1:1.000 Sigma


ovelha 1:1.000 Sigma


coelho 1:1.000 Sigma

anti-IgM μ-chain biotinilado

camundongo 1:1.000 Sigma

Tabela 3 - Ligantes e Sondas

Ligante/Sonda Diluição Utilizada Origem

DAPI 1:12.000 Molecular

Probes

toxina colérica conjugada a HRP (peroxidase de rabanete)

1:1.000 Sigma

toxina colérica conjugada a FITC (isotiocianato de fluresceína )

1:1.000 Sigma

extravidina conjugada a Cy31:500

Sigma

extravidina conjugada a FITC1:500

Sigma

extravidina conjugada a HRP1:1.000

Sigma

32

3.10 Microscopia Eletrônica de Transmissão (M.E.T.): Contrastação negativa

A quinta fração correspondente a raft e a fração pellet, correspondente à uma fração

não-raft foram depositadas sobre grades de cobre cobertas com filme de Formvar 0,4% em

clorofórmio e deixadas por 1 minuto. Depois de retirado o excesso de material com auxílio de

papel de filtro Whatman número 1 foi realizado contrastação negativa do material com 1% de

acetato de uranila aquosa por 1 minuto, seguida por secagem completa da solução. As

amostras foram observadas no microscópio eletrônico (Zeiss 900) na voltagem de 80 kV. Essa

técnica foi realizada com a colaboração do Professor José Garcia Ribeiro A. Júnior e sua

aluna de mestrado Alice Helena dos Reis, do ICB da UFRJ.

3.11 Dosagem de Proteína

As determinações protéicas foram estimadas através do kit baseado no ácido

bicinchonínico (BCA – Protein Assay Reagent, Pierce), tendo como proteína padrão a

albumina sérica bovina (BSA).

Para o procedimento da dosagem, foram misturados os reagentes de trabalho de

acordo com as instruções do fabricante: 25 partes do reagente MA; 24 partes do reagente MB

e 1 parte do reagente MC. Uma solução conservada em estoque de BSA foi preparada, para

após o experimento, realizar a curva padrão. A curva padrão foi constituída de 12 pontos de

0,5 µg/ml até 200 µg/ml de BSA. Nas amostras do padrão foram acrescentados, 150 µl de

reagente de reagente de trabalho e completados até 300 µl com SDS 0,2%. Para dosar as

frações dos gradientes controle e tratado com MβCD, foram usadas 150 µl do reagente de

trabalho, 40 µl de água, 10 µl das amostras e 100 µl de SDS 0,3%. Após 2 horas a 37°C, foi

realizada a leitura das amostras no comprimento de onda de 562 nm.

33

3.12- Análise Lipídica

3.12.1 Extração de lipídios

As frações recolhidas dos gradientes controles foram submetidas à extração lipídica de

acordo com o método de Bligh e Dyer (1959) em clorofórmio:metanol:água 1:2:0,8 (v/v),

cujo volume final foi de 1 ml, sob agitação de 5 em 5 minutos por 1 hora. Após o período da

extração, a solução foi centrifugada a 3000 rpm por 15 minutos, para separação do

sobrenadante. Esse sobrenadante (Sb1) foi separado e o pellet tinha sua continuidade na

extração. Novamente, foi usado clorofórmio:metanol:água 1:2:0,8, agitados por 1 hora e foi

centrifugado por 15 minutos a 3000 rpm. O pellet dessa centrifugação correspondia ás

proteínas desnaturadas. Por vez, esse sobrenadante (Sb2) foi acrescentado com o primeiro

(Sb1) para completar a re-extração, que consistiu em água:clorórmio 1:1 (v/v). Essa etapa

tinha uma nova centrifugação de 15 minutos a 3000 rpm. A fase orgânica (inferior)

apresentando os lipídios foi seca em vapores de nitrogênio gasoso.

3.12.2 Identificação dos lipídios

Os lipídios secos por nitrogênio gasoso da fase orgânica foram ressuspensos num

volume de 50-100 µl de clorofórmio e analisados numa cromatografia de camada fina de alta

performance (High Performance Thin-Layer Chromatography, HPTLC) unidimensional em

placas de Silica Gel 60 (Merck), sendo aplicados em faixas de 0,5 cm situadas a 1cm da

extremidade inferior da placa. Para a HPTLC de lipídios neutros, foi utilizado o sistema de

solventes hexano:éter etílico:ácido acético 60:40:1 (v/v/v; Kawooya e Law, 1988), por

aproximadamente 10 minutos de corrida. Após a corrida, as placas secas foram embebidas

com Reagente de Charring (CuSO4 10% + H3PO4 8%), e aquecidas a 200oC em estufa FAMO

Modelo ST200 por 20 minutos (Ruiz e Ochoa, 1997), permitindo a visualização quantitativa

dos lipídios presentes.

34

Para a análise de fosfolipídios, utilizamos o sistema de solventes

clorofórmio:acetona:metanol:ácido acético:água 40:15:13:12:8 (v/v; Ruiz e Ochoa, 1997) por

aproximadamente 30-40 minutos. O sistema foi revelado utilizando Reagente de Charring

(CuSO4 10% em H3PO4 8%) por 10 minutos a 100°C (Bitman e Wood, 1982).

As placas foram digitalizadas com o auxílio de um scanner e submetidas à análise

densitométrica, sendo utilizado o programa Image Master Total Lab v1.11 (Amersham

Pharmacia Biotech). Cada lipídio foi assinalado comparando-se com a migração de padrões

aplicados paralelamente.

3.13.3 Análise de Colesterol

Lipídios extraídos das frações dos gradientes de sacarose controle e tratado com

MβCD, como descrito no item 3.13.1, foram quantificados quanto ao seu conteúdo de

colesterol pelo método de Zlatkis e colaboradores, 1953. As amostras foram ressuspensas em

750 µl de ácido acético glacial e, em seguida, foram adicionados 500 µl da solução de FeCl3

0,2% em H3PO4 85% e H2SO4 concentrado. Após 5 a 10 minutos, as amostras apresentavam

uma cor amarronzada e desse modo à absorbância foram lidas com o comprimento de onda de

550 nm no espectrofotômetro (Analyser), utilizando colesterol (Sigma) como padrão para

análise.

35

4 Resultados

Com a finalidade de confirmar a identidade da GEO em culturas de células isoladas,

utilizamos o anticorpo policlonal anti-S100 e o anticorpo monoclonal anti-CNPase, um

marcador da GEO proposto pelo nosso grupo (Santos-Silva e Cavalcante, 2001). Os dados

demonstraram através da microscopia de imunofluorescência que, virtualmente todas as

células das culturas isoladas da GEO apresentaram imunorreatividade para a proteína S100 e

CNPase (Figura 11). Desse modo, os objetivos propostos e os resultados obtidos passam a ser

descritos.

4.1 Perfil do gradiente de sacarose

Com o propósito de caracterizar os microdomínios lipídicos, extratos de GEO foram

incubados com o detergente não iônico, Triton X-100, e submetidos a um gradiente de

sacarose. Após a centrifugação, pudemos verificar a presença de um material flutuante na

interface de 5-30% de sacarose (Figura 12B). Esse material em suspensão foi visualizado em

todas as purificações das lipid rafts. Desse modo, os gradientes de sacarose foram recolhidos

em 13 frações de 1 ml contendo diferentes densidades (Figura 13) e posteriormente

analisados.

36

Figura 11- Microscopia de fluorescência da cultura de células isoladas da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína S100 e CNPase. (A) Marcação das células, fixadas com paraformaldeído 4%, reagidas com o anticorpo policlonal anti-S100 e visualizadas com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 488. (B) O mesmo campo reagido com o anticorpomonoclonal anti-CNPase e visualizado com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 546. (C) Marcação do núcleo das células coradas com DAPI. Tanto células bipolares (cabeça de seta), quanto células tripolares (seta) apresentaram-se duplamente marcadas. Barra de calibração: 10 µm.

B

C

A

37

Figura 12- Ilustração da obtenção do gradiente de sacarose. (A) Esquema do tubo do rotor basculante do tipo SW40Ti da ultracentrífuga Beckman, com o perfil das soluções de sacarose. (B) Fotografia do resultado do gradiente de sacarose após 20-22 horas de centrifugação. Pode-se observar um material flutuante na interface de sacarose 5-30% (seta). Deste gradiente, treze frações de 1 ml foram recolhidas e analisadas nos experimentosseguintes.

Figura 13- Densidade das frações do gradiente de sacarose da GEO. As células (109

células/ml) foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Após a retirada do gradiente de sacarose da ultracentrífuga, as treze frações foram analisadas no refratômetro e seus resultados convertidos em densidade (vide item 3.5 do material e métodos). Observa-se um aumento gradual da densidade ao longo do gradiente. A análise estatística foi realizada usando o programa GraphPad Prism. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 5 experimentos diferentes.

Sacarose 5%

Sacarose 30%

Amostra em sacarose 40%

20-22hs a 38000rpm

A B

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

Densidade do gradiente de sacarose

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130.95

1.00

1.05

1.10

1.15

1.20

Frações

g/cm

3

topo

38

4.2 Detecção do gangliosídeo GM1 nas frações do gradiente de sacarose e em células

vivas

Com o intuito de distinguir as frações lipid rafts isoladas foi realizado o método do dot

blotting usando a toxina colérica para o reconhecimento do gangliosídeo GM1 (esfingolipídio

marcador das lipid rafts). Na figura 14, pode se observar na forma do dot blotting (A) e

análise densitométrica (B), que a presença do gangliosídeo GM1 não é homogênea em todas

as frações do gradiente. As marcações foram mais intensas nas frações menos densas do

gradiente de sacarose.

Decidimos examinar a presença do gangliosídeo GM1 em células vivas, a partir do

resultado positivo do dot blotting para esse esfingolipídio. Com esse objetivo, nosso primeiro

ensaio consistiu na incubação das células com a toxina do cólera conjugado a FITC a 4°C, a

fim de verificar apenas os sítios de ligação da toxina com o gangliosídeo. A figura 15A

mostra marcação homogênea ao longo de toda a célula, não sendo possível observar

evidências de internalização da toxina na GEO. Logo após, foi realizada a mesma incubação

da toxina colérica, entretanto colocamos a GEO na temperatura ideal do metabolismo basal

(37°C). A marcação na região perinuclear observada nessa condição sugere possivelmente a

internalização da toxina nas células (Figura 15D).

39

A

B

Figura 14- Distribuição do gangliosídeo GM1 nas frações do gradiente de sacarose. As células (109 células/ml) foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. (A) Para averiguar a presença do gangliosídeo GM1, as frações foram submetidas ao dot blotting usando a subunidade B da toxina do cólera conjugado a FITC. Em destaque, as frações 4-6 que correspondem com o material flutuante do gradiente de sacarose. (B) A análise densitométrica foi realizada usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 5 experimentos diferentes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1 0

2 0

F r a ç õ e s

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

topo

Por

cen

tage

m

40

Figura 15- Microscopia de fluorescência da GEO incubada na presença de toxina do cólera subunidade B conjugada à FITC a 4 e 37°C. (A e D) Marcação com ligante do gangliosídeoGM1. (B e E) O mesmo campo mostra os núcleos das células corados pelo DAPI. (C e F) Sobreposição das imagens. Observa-se marcações mais evidentes principalmente na região perinuclear (setas). Barra de calibração: 5 μm.

B

4°C

A

E

D

37°C

C F

41

4.3 Detecção da proteína flotilina-1 nas frações do gradiente de sacarose e em células

permeabilizadas

Flotilina-1 é uma proteína integral de membrana (45 kDa), encontrada como

componente residente das lipid rafts em diferentes tecidos e tipos celulares. Na figura 16A,

visualizamos através do dot blotting, marcações para flotilina-1 nas frações de baixas

densidades (4 a 6) e na fração pellet do gradiente de sacarose. As marcações mais intensas

correspondem às mesmas frações, imunorreativas para o gangliosídeo GM1, e que foram

visualizadas o material flutuante do gradiente de sacarose.

Outra metodologia utilizada foi a análise da presença da flotilina-1 nas células

permeabilizadas (Figura 17). A marcação da proteína foi mais intensa na borda da célula.

A

B

Figura 16- Distribuição da proteína flotilina-1 nas frações do gradiente de sacarose. As células (109 células/ml) foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Após a retirada do gradiente de sacarose da ultracentrífuga, as treze frações foram submetidas ao (A) dot blotting para o anticorpo policlonal anti-flotilina-1. Em destaque, frações menos densas do gradiente de sacarose que apresentaram marcações mais intensas. (B) A análise densitométrica foi realizada usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 5 experimentos diferentes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1 0

2 0

3 0

F r a ç õ e s

topo

Por

cen

tage

m

42

Figura 17- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína flotilina-1. (A) Marcação da GEO, fixada com paraformaldeído 4%, para o anticorpo policlonal anti-flotilina-1, posterior incubação com anticorpo secundário conjugado à biotina e extravidina conjugada a FITC. (B) Marcação do núcleo da célula corado com DAPI. (C) Sobreposição das imagens. Notar a maior intensidade na borda da célula (seta). Barra de calibração: 5 μm.

A

B

C

43

4.4 Detecção da proteína caveolina-1 nas frações do gradiente de sacarose e em células

permeabilizadas

Outra proteína marcadora dos microdomínios lipídicos analisada nesse trabalho foi a

caveolina. Essa proteína é integrante das cavéolas, uma subclasse das lipid rafts. Com a

finalidade de verificar se a raft da GEO, podia ser do tipo caveolar foi realizada a metodologia

de dot blotting para a proteína caveolina-1. Na figura 18, visualizamos marcações para

caveolina-1 nas frações 4 a 9 do gradiente de sacarose.

Outra abordagem de estudo realizada com células da GEO permeabilizadas foi o

experimento de imunocitoquímica para caveolina-1 (Figura 19). Observa-se marcação da

proteína em toda a célula, com algumas regiões puntiformes na borda da célula.

A

B

Figura 18- Distribuição da proteína caveolina-1 nas frações do gradiente de sacarose. As células (109 células/ml) foram sonicadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Em seguida, as treze foram submetidas ao (A) dot blotting para o anticorpo policlonal anti-caveolina-1. Em destaque, maior intensidade de marcação no meio do gradiente de sacarose. (B) A análise densitométrica foi realizada usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 5 experimentos diferentes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

topo

44

Figura 19- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína caveolina-1. (A) Marcação da GEO, fixada com paraformaldeído 4%, reagida com o anticorpo policlonal anti-caveolina-1 e visualizada com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 488. (B) Marcação do núcleo da célula corado com DAPI. (C) Sobreposição das imagens. Observa-se marcações puntiformes na borda da célula (seta). Barra de calibração: 5 μm.

A

B

C

45

4.5 Morfologia das frações resistentes a detergente

Por meio da microscopia eletrônica de transmissão, visualizamos a morfologia das

lipid rafts e de componentes da fração de alta densidade (pellet) do gradiente de sacarose da

GEO. Estas frações foram previamente dialisadas e coradas negativamente com acetato de

uranila.

A micrografia eletrônica presente na figura 20A demonstra a natureza vesicular com

aparência multilamelar das membranas resistentes a detergente. Por vez, a fração pellet

(Figura 20B) foi analisada como fração controle negativo. Nesta fração não aparece formação

de vesículas, apenas estruturas irregulares e aglomerados de material amorfo. Provavelmente,

estas estruturas representam agregados macromoleculares de proteínas e/ou lipídios

solubilizados pelo detergente.

FRAÇÃO FRAÇÃO LIPID RAFT PELLET

Figura 20- Micrografias eletrônicas das frações do gradiente de sacarose. As células (109

células/ml) foram sonicadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação por gradiente de sacarose. Após a retirada do gradiente de sacarose da ultracentrífuga foram recolhidas treze frações. A quinta fração (fração lipid raft) e uma fração de alta densidade (pellet) foram dialisadas e coradas negativamente com acetato de uranila, pela técnica de contrastação negativa. (A) Fração lipid raft mostrando perfis de membranas altamente organizados e (B) fração pellet apresentando estruturas pequenas de aparência granular. Barra de calibração: 0,2 μm.

A B

46

4.6 Distribuição de proteína e colesterol nas frações do gradiente de sacarose

Com o intuito de dar continuidade a caracterização das rafts foi realizada a dosagem

de colesterol pelo método colorimétrico. Na figura 21A, observamos a quantidade de

colesterol ao longo das frações do gradiente de sacarose. A concentração maior de colesterol

foi observada na fração 5, uma fração raft.

A dosagem de proteína foi realizada pela metodologia baseada no ácido

bicinchonínico (BCA). Essa identificação das frações ao longo do gradiente se torna

essencial, visto que as rafts apresentam poucas quantidades de proteínas. Na figura 21B,

notamos pequenas concentrações de proteínas nas frações de baixa densidade de sacarose,

comparado com as frações de alta densidade. A quantidade de proteínas tornou-se elevada,

principalmente a partir da fração 11.

Outra forma de avaliar a presença de colesterol e proteína nos microdomínios lipídicos

foi através da relação destes dois elementos (colesterol/proteína), como pode ser visto na

figura 21C. A fração com maior razão de colesterol por proteína foi a fração 5, uma fração

raft.

47

Figura 21- Concentração total de colesterol e proteínas nas frações do gradiente de sacarose da GEO. (A) A dosagem de colesterol foi realizada após a extração lipídica de acordo com Bligh e Dyer (1959). Nas frações 4-6 observa-se um pico de colesterol, características dasfrações rafts. (B) A dosagem de proteína foi quantificada de acordo com o método BCA. Pode-se observar que a concentração protéica aumenta em frações de maior densidade do gradiente. (C) Razão colesterol/proteína de todas as frações do gradiente de sacarose. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 4 experimentos diferentes.

topo

topo

Dosagem de colesterol

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

5

10

15

20

25

30

35

Frações

g/m

l

A Dosagem de proteína

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

25

50

75

Frações

g/m

l

B

Colesterol/Proteína

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1

2

Frações

N°

arb

itrá

rio

C

48

4.7 Análise dos lipídios totais das frações do gradiente de sacarose da GEO

Os microdomínios lipídicos foram localizados através dos marcadores específicos das

rafts e como próximo passo foi realizada a análise de lipídio total pela cromatografia de

camada fina de alta performance (HPTLC) das frações do gradiente de sacarose. A separação

ocorreu de acordo com o grau de afinidade dos lipídios com o substrato e sua comparação

com padrões comerciais.

A análise dos lipídios neutros revelou a presença de colesterol, a partir da quinta

fração (Figura 22A). Por vez, os dados de densitometria da HPTLC foram plotados em um

gráfico, no qual se demonstrou maior quantidade deste lipídio na quinta fração (Figura 22B).

Pela análise dos fosfolipídios (Figura 22C), observamos que na maioria das frações

do gradiente, a fosfatidilcolina (PC) e um fosfolipídio de natureza não determinada (ND)

correspondiam aos principais fosfolipídios presentes no gradiente de sacarose. Curiosamente,

a quinta fração foi a única que apresentou além desses componentes, a esfingomielina (SM).

A esfingomielina é um esfingolipídio encontrado no sistema nervoso, que age concentrando

moléculas sinalizadoras e também, como precursora de vários lipídios bioativos.

49

Lipidio Neutro - Colesterol

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

5

10

15

20

25

30

35

Frações

Por

cent

agem

B

Figura 22- Caracterização lipídica das frações do gradiente de sacarose da GEO. Após o gradiente de sacarose, as frações marcadas foram submetidas à extração lipídica e analisadas em cromatografia de camada fina de alta performance (HPTLC) para (A) lipídio neutro e (C)fosfolipídios. (B e D) Análise densitométrica da HPTLC, usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 3 experimentos diferentes.CHO - Colesterol; PC - Fosfatidilcolina; SM - Esfingomielina; ND - Não determinado.

CHO

A

SM PC

C D

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

ND

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Fosfolipídios

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

10

20PCNDSM

Frações

Po

rcen

tag

em

50

Após essa caracterização e sobreposição dos marcadores das lipid rafts, podemos

destacar, nesse estudo, que as frações 4-6 correspondem as frações rafts. Esses resultados são

corroborados pelos critérios bioquímicos: baixa quantidade de proteína e alta quantidade de

colesterol que essas frações apresentam.

4.8 Localização da proteína CNPase nas frações do gradiente de sacarose e em células

permeabilizadas

Dados na literatura sugerem que a CNPase pode participar da intermediação de

interações entre elementos do citoesqueleto (actina e microtúbulo) e da membrana plasmática

(Dyer e Benjamins, 1989). Desta forma, a CNPase poderia estar envolvida em eventos de

sinalização membrano-esqueletais. Por esta razão, decidimos verificar se a CNPase colocaliza

com as lipid rafts da GEO.

Para verificar a localização da CNPase nas rafts, foi realizada o método de dot blotting

(Figura 23). O resultado da marcação para CNPase apresentou similaridade ao encontrado

para a proteína flotilina-1 (Figura 16). A CNPase no dot blotting apresentou marcação mais

expressiva na quinta fração, correspondente a uma fração raft.

Outra abordagem apresentada neste estudo, foi a análise da distribuição das proteínas

flotilina-1 e CNPase na GEO. Para tal, foram realizadas imunocitoquímicas em culturas de

células isoladas (Figura 24). A distribuição da CNPase foi observada ao longo de toda a

célula, apresentando regiões de maior intensidade e a da flotilina foi mais limitada a

determinadas regiões. A sobreposição das marcações se deu em apenas alguns pontos da

célula.

51

A

B

Figura 23- Distribuição da proteína CNPase nas frações do gradiente de sacarose. As células (109 células/ml) foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Em seguida, as treze frações foram submetidas ao (A) dot blotting para o anticorpo monoclonal anti-CNPase. Observa-se uma marcação mais intensa na fração 5, que corresponde a uma fração raft. (B) A análise densitométrica foi realizada usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 4 experimentos diferentes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

F r a ç õ e s

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

topo

Por

cen

tage

m

52

Figura 24- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para CNPase e flotilina-1. (A) Marcação da célula, fixada com paraformaldeído 4%, para o anticorpo monoclonal anti-CNPase reagido com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 488. (B) Marcação da célula com o anticorpo policlonal anti-flotilina-1, posterior incubação com anticorpo secundário biotinilado e reação deste com extravidina conjugada a Cy3. (C) Marcação do núcleo da célula corada com DAPI. (D) Sobreposição das imagens. Notar, sobreposição das proteínas em uma região da célula (seta). Barra de calibração: 5µm.

B

A

C

D

53

4.9 Localização do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e dos gangliosídeos reconhecidos pelo

anticorpo A2B5 (G-A2B5) nas frações do gradiente de sacarose

Trabalhos preliminares do grupo envolvido neste estudo, demonstraram que células

migratórias da GEO cultivadas sobre o substrato de laminina expressam 9-O-acetil GD3 e os

gangliosídeos reconhecidos pelo anticorpo A2B5. Um ponto importante para entender a

influência desses gangliosídeos no processo de migração da GEO é verificar a relação destes

esfingolipídios com as lipid rafs. Dessa forma, para verificar se as rafts da GEO possuem

esses gangliosídeos foi realizado o método dot blotting.

Os resultados obtidos para 9-O-acetil GD3 (através do anticorpo Jones) e G-A2B5

apresentaram marcação mais evidente na quinta fração, uma fração raft, e no pellet, onde se

encontram os outros componentes celulares pesados, tais como: núcleo e organelas (Figura

25).

54

A

B

C

D

Figura 25- Distribuição do gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e dos gangliosídeos reconhecidos pelo anticorpo A2B5 (G-A2B5) nas frações do gradiente de sacarose. As células (109

células/ml) foram sonicadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Em seguida, as treze foram submetidas ao dot blotting para (A) o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e (C) G-A2B5. (A e C) Observa-seuma marcação mais intensa na fração 5, uma fração raft. (B e D) A análise densitométrica foi realizada usando o programa Image Master TotalLab. Cada fração representa a média e o desvio padrão de 4 experimentos diferentes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

3 5

F r a ç õ e s

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

9-O-acetil GD3

G-A2B5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

F r a ç õ e s

topo

topo

Por

cen

tage

mP

orce

nta

gem

55

4.10 Desorganização das lipid rafts

Uma das formas de desfazer as lipid rafts é através do uso da MβCD que depleta o

colesterol da membrana plasmática. Para investigar alterações na morfologia celular

associadas à retirada de colesterol, GEOs foram tratadas com MβCD 20 mM durante 30

minutos a 37°C e em seguida, foram realizadas ensaios de imunocitoquímica com as proteínas

marcadoras: S100 e CNPase (Figura 26). As células tratadas com MβCD mostraram-se mais

aplanadas no substrato, se comparadas com as controles. Outra diferença resultante do uso da

MβCD nas células foi observada no gradiente de sacarose. Os gradientes das células tratadas,

diferentemente dos gradientes controles, não apresentaram o material flutuante na interface de

5-30% de sacarose (Figura 27).

Para analisar o efeito da depleção de colesterol na organização dos componentes

encontrados nos microdomínios lipídicos, realizamos a mesma metodologia de dot blotting

com os gradientes de células tratadas com MβCD. Observa-se na figura 28A, uma

distribuição mais homogênea dos componentes analisados das rafts (GM1, flotilina-1 e

caveolina-1) ao longo do gradiente, se comparado com o gradiente controle (Figura 28B).

Com o intuito de dar continuidade ao estudo do efeito da depleção de colesterol, foram

realizadas dosagens de colesterol e de proteínas (Figura 29). Ambos componentes tiveram

sua distribuição alterada com o uso da droga. Houve uma redução de colesterol de quase 22%

no gradiente com células tratadas com MβCD (Figura 29A). Por vez, a dosagem de proteína

apresentou uma distribuição homogênea ao longo das frações do gradiente (Figura 29B).

Outra forma de avaliar a presença de colesterol e proteína foi através da razão destes dois

elementos (Figura 29C).

A distribuição das moléculas candidatas ao envolvimento da migração da GEO

encontradas nos microdomínios lipídicos, também foram analisadas nos gradientes de células

tratadas com MβCD. Na figura 30A, pudemos observar uma distribuição homogênea dos

56

componentes analisados (CNPase, o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e G-A2B5) ao longo das

frações do gradiente, se comparado com o gradiente controle (Figura 30B).

Outra abordagem apresentada neste estudo, foi a análise da distribuição das proteínas

flotilina-1 e CNPase em culturas de células isoladas tratadas com MβCD (Figura 31). Para

tal, foram realizados ensaios de imunocitoquímicas, que revelaram para ambas as proteínas

um padrão de marcação distribuído mais intensamente no corpo celular (colocalização em

amarelo). Em células sem o tratamento com a droga, a sobreposição acontece em alguns

pontos da célula.

57

MβCD Controle

Figura 26- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para a proteína S100 e CNPase. (A-C) Células tratadas com MβCD 20 mM e (D-F) células controles. (A e D) Marcação das células, fixadas com paraformaldeído 4%, para o anticorpo policlonal anti-S100, reagido com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 488. (B e E) Marcação das células com o anticorpo monoclonal anti-CNPase, reagido com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 546. (C e F) Marcação do núcleo das células coradas com DAPI. Tanto células bipolares (seta), quanto células tripolares (cabeça de seta) apresentaram-se duplamente marcadas. Barra de calibração: 5 µm.

D

E

A

B

C F

58

Figura 27- Representação da obtenção dos gradientes de sacarose com MβCD e em condição controle. (A) Esquema do tubo do rotor basculante do tipo SW40Ti da ultracentrífuga Beckman, com o perfil das soluções de sacarose. (B) Fotografia do resultado do gradiente de sacarose da GEO (109 células/ml) tratada com MβCD 20 mM por 30 minutos e (C) gradiente controle, após 20-22 horas de centrifugação. Pode-se observar um material flutuante na interface de sacarose 5-30% no gradiente controle (seta), dado não observado no tratado com a droga.

Sacarose 5%

Sacarose 30%

Amostra em sacarose 40%

20-22hs a 38000rpm

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10

11

12

13

A CB1

2

34

5

6

7

8

9

10

11

12

13

59

A

MβCD

Gangliosídeo GM1

Flotilina-1

Caveolina-1

B

Gangliosídeo GM1

Flotilina-1

Caveolina-1

Figura 28- Distribuição dos marcadores de rafts. (A) GEOs (109 células/ml) tratadas com MβCD 20 mM por 30 minutos ou (B) em condição controle foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. Para averiguar a presença do gangliosídeo GM1, flotilina-1 e caveolina-1 as treze frações foram submetidas ao dot blotting. (A) Observa-se distribuição dos componentes das rafts por todas as frações do gradiente, quando as células são tratadas com a droga depletora de colesterol. (B) Em destaque, as frações 4-6 que correspondem com as lipid rafts da GEO.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

60

MβCD Controle

Figura 29- Concentração total de colesterol e proteínas nas frações do gradiente de sacarose da GEO. (A-C) Gradiente de sacarose da GEO tratada com MβCD e (D-F) gradiente em condição controle. (A e D) A dosagem de colesterol foi realizada após a extração lipídica de acordo com Bligh e Dyer (1959). (A) Observa-se distribuição heterogênea de colesterol entre as frações. (B e E) A dosagem de proteína foi quantificada de acordo com o método BCA. (B)Observa-se uma distribuição de proteína homogênea pelo gradiente de sacarose, com um pico na 13ª fração. (C e F) Razão colesterol/proteína de todas as frações do gradiente de sacarose.


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1

2

Frações

Nº

arb

itrá

rio

Dosagem de proteína

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

25

50

75

Frações

g

/ml


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

5

10

15

20

25

Frações

g/m

l


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

5

10

15

20

25

30

35

Frações

g/m

l

Dosagem de proteína

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

25

50

75

Frações

g/m

l


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 130

1

2

Frações

N°

arbi

trár

io

A

B

C

E

F

Dtopo topo

topo topo

topo topo

61

A

MβCD

B

Figura 30- Distribuição das moléculas candidatas no envolvimento da migração da GEO nas frações do gradiente de sacarose. (A) As células (109 células/ml) tratadas com MβCD 20 mM por 30 minutos ou (B) em condição controle foram lisadas, homogeneizadas e incubadas a 4°C com 1% Triton X-100 e submetidas à centrifugação em gradiente de sacarose. As treze frações foram submetidas ao dot blotting para CNPase, o gangliosídeo 9-O-acetil GD3 e G-A2B5. (A) Observa-se distribuição das moléculas candidatas no envolvimento da migração da GEO por todas as frações do gradiente, quando as rafts são desfeitas por depleção de colesterol. (B) Em destaque, as frações 4-6 que correspondem com as lipid rafts da GEO.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

CNPase

9-O-acetil GD3

G-A2B5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

CNPase

9-O-acetil GD3

G-A2B5

62

MβCD Controle

Figura 31- Microscopia de fluorescência da GEO apresentando imunorreatividade para CNPase e flotilina-1. (A-D) Células tratadas com MβCD 20 mM por 30 minutos e (E-H) células controles. (A e E) Marcação da célula, fixada com paraformaldeído 4%, para o anticorpo monoclonal anti-CNPase, reagido com o anticorpo secundário conjugado a Alexa 488. (B e F) Marcação da célula para o anticorpo policlonal anti-flotilina-1, posterior incubação com anticorpo secundário biotinilado e reação deste com extravidina conjugada a Cy3. (C e G) Marcação do núcleo das células coradas com DAPI. (D e H) Sobreposição das imagens. Notar em D, a distribuição das duas proteínas ao longo do corpo celular (seta). Por vez, em H, a sobreposição das proteínas acontece em alguns pontos da célula (seta). Barra de calibração: 5 µm.

A

B

C

F

E

G

D H

63

5 Discussão

Este trabalho apresenta um estudo de caracterização dos microdomínios lipídicos de

membrana enriquecidos de colesterol e esfingolipídios (lipid rafts) da glia embainhante

olfatória (GEO). Constatamos que os marcadores das lipid rafts se localizam em frações

menos densas do gradiente de sacarose (fração 4-6), quando submetidos à metodologia de dot

blotting e marcação fluorescente para gangliosídeo GM1, proteínas flotilina-1 e caveolina-1.

Esses resultados enquadram-se nos critérios bioquímicos estabelecidos na literatura (Persaud-

Sawin et al., 2009): baixa quantidade de proteína e alta quantidade de colesterol. Do ponto de

vista morfológico, pelo método de contrastação negativa, constatamos que as lipid rafts

formam espontaneamente vesículas, ao passo que frações não-rafts formam aglomerados

macromoleculares de proteínas e/ou lipídios solubilizados pelo detergente Triton X-100.

Foram realizados imunoblottings para moléculas candidatas no envolvimento da migração da

GEO (gangliosídeos 9-O-acetil GD3 e os reconhecidos pelo anticorpo A2B5 e a CNPase),

resultando em marcações positivas nas frações características de rafts. Por fim, a distribuição

e/ou estrutura dos microdomínios lipídicos de membrana da GEO foram alterados, em

decorrência da depleção de colesterol pela droga metil-beta-ciclodextrina (MβCD).

5.1 Diversas metodologias são usadas para o isolamento das rafts

Diferentes metodologias são utilizadas para o isolamento desses microdomínios

lipídicos, sendo que o procedimento tradicional consiste na utilização do detergente não

iônico Triton-X100 a 4ºC. Sabe-se que nesta preparação as lipid rafts flutuam em gradiente de

5 a 30% de sacarose (Brown & Rose, 1992). Outros detergentes como o Tween 20, Lubrol

WX, Brij 58, Brij 96, Nonindet P40 e o CHAPS são também utilizados em diferentes

concentrações para o isolamento das rafts. Schuck e colaboradores (2003) levantaram

evidências de que as rafts preparadas em Triton X-100 ou CHAPS são fortemente

64

enriquecidas em esfingolipídios e colesterol, quando comparadas ao total da membrana. Em

contraste, a extração das membranas com Tween 20, Brij 98 ou Lubrol WX revelaram frações

de menor densidade das membranas com menor enriquecimento dos componentes

tradicionalmente observados em lipid rafts. Rafts preparadas pela solubilização de lisados

celulares com Brij 96 ou Brij 98 mostraram enriquecimento moderado de colesterol e

esfingomielina, a qual está particularmente mais enriquecida em preparados com Triton X-

100 ou CHAPS. Schuck e colaboradores (2003) descrevem ainda que estas diferenças

observadas refletem o grau de seletividade dos detergentes, onde o Triton X-100 e o CHAPS

se mostraram mais seletivos a lipídios não-rafts ao passo que o Tween 20 e o Brij 98 menos

seletivos.

5.2 Membranas resistentes a detergentes da GEO são positivas para marcadores das

lipid rafts

Frações de microdomínios lipídicos isolados por extração de detergentes submetidas a

gradiente de sacarose e a ultracentrifugação são tipicamente enriquecidas em esfingolipídios

saturados, colesterol e gangliosídeos. Por vez, dentre as proteínas consideradas marcadores

das rafts estão proteínas citoplasmáticas, como a flotilina e a caveolina, frequentemente

ancoradas à bicamada lipídica por isoprenilação (Brown & London, 1998, 2000). Essas duas

proteínas, em especial, conferem os microdomínios lipídicos um potencial endocítico

independente de clatrina (Anderson, 1998; Frick et al., 2007). Devido a este potencial,

patógenos como Vibrio cholera utilizam-se dessas estruturas, mais especificamente do

gangliosídeo GM1, como porta de entrada para as células. Dessa forma, a toxina do cólera

vem também sendo utilizada para a identificação das rafts, uma vez que concentram grandes

quantidades de GM1 (Radeva & Sharom, 2004).

As frações do gradiente de sacarose de lisados da GEO, realizado nesse trabalho,

65

revelaram que as frações 4, 5 e 6 apresentaram maior marcação de flotilina-1 e GM1, sendo

portanto, frações rafts (Figuras 14 e 16). A caveolina também mostrou-se concentrada nessas

regiões, embora frações mais pesadas (7, 8 e 9) tenham apresentado uma marcação mais

intensa, com um pico menos pronunciado de flotilina (Figura 18), sugerindo a existência de

microdomínios heterogêneos. Dados da literatura relatam à existência de lipid rafts não

caveolares, as quais podem eventualmente servir como um arcabouço inicial para a formação

de rafts caveolares (revisto por Ikonen, 2001). Dessa forma, a menor concentração de

caveolina nas frações 4, 5 e 6 em relação as frações 7, 8 e 9 pode representar estágios da

transição dinâmica entre microdomínios não caveolares e caveolares, embora estas últimas

frações sejam mais pesadas do que as comumente associadas às rafts. A presença de caveolina

também foi identificada em outras células neurais como astrócitos, oligodendrócitos e

microglia, embora acredite-se que neurônios maduros não as possuam (Cameron et al., 1997).

5.3 Perfil lipídico e dosagem protéica da membrana da GEO confirmam a presença de

lipid rafts

Pudemos observar que lisados da GEO submetidos ao gradiente de sacarose revelaram

que as frações resistentes a detergentes (4, 5 e 6) possuem uma elevada concentração de

colesterol e baixa densidade protéica, com uma razão máxima de 2:1 (respectivamente) na

fração 5 (Figura 21). Essa composição é característica das lipid rafts, como verificado por

Persaud-Sawin et al., 2009. A concentração de proteínas nos revela que apenas 43,58 µg/ml

estão localizadas nos microdomínios lipídicos da GEO. Por vez, dados na literatura são

bastante variáveis quanto à composição protéica, demonstrando uma diferença significativa

dos microdomínios lipídicos de diferentes células. Radeva & Sharom (2004) demonstraram

que em células leucêmicas basofílicas (RBL-2H3), a quantidade protéica não ultrapassava de

20 µg/ml nas frações resistentes a detergente Triton X-100. No entanto, Arvanitis e

66

colaboradores (2005) demonstraram que os microdomínios lipídicos de mielina apresentavam

concentração de proteínas de aproximadamente 300 µg/ml.

O enriquecimento em colesterol das rafts, observado na dosagem de colesterol e pela

análise de lipídio neutro por HPTLC (Figuras 21A e 22A), contribui para a menor fluidez

desses microdomínios lipídicos, o que é importante para a sua funcionalidade como

plataforma de sinalização. Essa funcionalidade é em grande parte atribuída ao recrutamento

seletivo de proteínas as rafts.

Outro ponto importante na análise lipídica é a presença fosfolipídios como:

fosfatidilcolina (PC) e esfingomielina (SM) apresentados nas rafts da GEO (Figura 22C). A

esfingomielina é um tipo de esfingolipídio presente nos microdomínios lipídicos, que age

concentrando moléculas sinalizadoras e também, como precursora de vários lipídios

bioativos. A presença desses fosfolipídios nas frações menos densas do gradiente de sacarose

também é observado em neurônios (Wu et al., 1997).

5.4 As lipid rafts isoladas formam espontaneamente vesículas

Neste trabalho constatamos que as rafts isoladas da GEO formam vesículas de

estrutura unilamelar com diâmetro que varia de 0,09 a 0,17 µm (Figura 20A). Esses

resultados estão de acordo com dados da literatura relatando que rafts isoladas de lisados

celulares de mamíferos formam espontaneamente vesículas com diâmetro variável (0,11-0,24

µm) (Radeva & Sharom, 2004). Essa formação de vesículas, no entanto, pode ser resultado da

ação do detergente, que estaria promovendo a fusão de rafts menores em estruturas de maior

diâmetro, possibilitando a formação das vesículas (Heerklotz, 2002). In situ, as rafts possuem

morfologia planar e incontínua, com interrupções de sua estrutura rígida por regiões de

membrana plasmática normal (Mayor & Maxfield, 1995).

67

5.5 Moléculas candidatas no envolvimento da migração se associam as rafts da GEO

A CNPase é uma proteína periférica da monocamada interna. O significado fisiológico

das relações da CNPase estabelece com o citoesqueleto e com as organelas celulares, assim

como sua função exata não são conhecidas. Alguns trabalhos sugerem que a CNPase associe-

se com a tubulina através das porções hidrofílicas e por meio de seus domínios hidrofóbicos,

desse modo poderia mediar a comunicação dos microtúbulos com a membrana plasmática

(Bifulco et al., 2002). É possível, portanto, que a CNPase esteja envolvida com sinalizações

membrano-esqueletais, incluindo movimentos direcionais. A constatação nesse trabalho de

que a CNPase se localiza preferencialmente em rafts (Figura 23) vai de acordo com dados na

literatura que associam esses microdomínios a eventos de adesão, importantes para migração

celular (Harris & Siu, 2002; Prag et al., 2007). Essa colocalização da CNPase e marcadores de

rafts foi da mesma forma observada em experimentos de caracterização desses

microdomínios lipídicos em oligodendrócitos que, tal como a GEO, são células de

propriedades embainhantes (Kim & Pfeiffer, 1999).

Farrer & Quarles (1999) observaram que os gangliosídeos 9-O-acetil GD3 e os

reconhecidos pelo anticorpo A2B5 são importantes para a migração de precursores de

oligodendrócitos. Sabe-se que o ambiente iônico proporcionado por gangliosídeos como o 9-

O-acetil GD3 é importante para plena ativação de componentes membranares envolvidos na

adesão celular (Mendez-Otero & Santiago, 2003). Além da expressão desses gangliosídeos, in

vitro, foi possível também constatar que a migração da GEO depende ao menos parcialmente

da atividade destes componentes uma vez que, o imunobloqueio dos mesmos levou a uma

redução na migração celular (dados de Santos-Silva e colaboradores não publicados). Desta

forma a migração da GEO parece compartilhar um mecanismo de controle comum com

neurônios e precursores de oligodendrócitos com capacidade migratória (Farrer & Quarles,

1999; Santiago et al., 2001; revisto por Mendez-Otero & Cavalcante, 2003). Desse modo, a

68

concentração desses gangliosídeos nas rafts da GEO, constatada neste trabalho, pode,

portanto, corroborar ainda mais o envolvimento desses microdomínios lipídicos em eventos

de migração e adesão desta célula (Figura 25).

5.6 A depleção de colesterol altera a distribuição de componentes protéicos e lipídicos

das rafts da GEO

A depleção de colesterol da membrana plasmática da GEO por meio da droga metil-

beta-ciclodextrina (MβCD) a 20 mM resulta na redistribuição de componentes enriquecidos

em microdomínios lipídicos (colesterol, gangliosídeo GM1, flotilina-1 e caveolina-1) de uma

forma mais homogênea ao longo do gradiente de sacarose (Figura 28). Algumas das funções

do colesterol na membrana plasmática são proporcionar a menor permeabilidade, bem como

manter o estado líquido ordenado dos microdomínios enriquecidos de esfingolipídios (Alberts

et al., 2002). Desse modo, a depleção de colesterol destruiria as rafts, ao facilitar a dispersão

de seus componentes na membrana plasmática (Zidovetzki & Levitan, 2007) de forma a

redistribuí-los de maneira mais randômica ou internalizando-os. Neste trabalho, a depleção de

colesterol foi na ordem de 22% (Figura 29A), o que pode ser ainda corroborado pela ausência

do material flutuante resistente ao detergente nas frações 4, 5 e 6 do gradiente de sacarose

(Figura 27). Em condições similares, diversos trabalhos obtiveram resultados semelhantes,

confirmando a destruição dos microdomínios lipídicos pela MβCD (Ilangumaran & Hoessli,

1998; DeBruin et al., 2005).

Além dos marcadores convencionais das lipid rafts, diversos componentes celulares

podem ter a sua distribuição afetada pela a destruição das rafts. Essa observação transformou

a MβCD em uma valiosa droga para o estudo da associação espacial/funcional de

componentes celulares a microdomínios de membrana (Cooper et al., 2003). Neste trabalho,

como já discutido, pudemos constatar que a proteína de mielina não-compacta CNPase, os

69

gangliosídeos 9-O-acetil GD3 e os reconhecidos pelo anticorpo A2B5 (G-A2B5) localizam-se

preferencialmente em rafts da GEO. Complementando esses resultados, constatamos que o

uso de MβCD resulta na redistribuição desses componentes de forma semelhante ao que

ocorreu com os marcadores das rafts mencionado anteriormente (Figura 30). Esses dados

ressaltam que os microdomínios lipídicos da GEO requerem de colesterol para sua formação e

função. Da mesma forma que observamos com a CNPase, trabalhos como o de DeBruin e

colaboradores (2005), também demonstraram que proteínas de mielina, além da CNPase, têm

sua distribuição afetada pelo uso de MβCD em oligodendrócitos. Juntos esses dados

evidenciam que as rafts apresentam um importante papel em células embainhantes. Com

relação aos gangliosídeos, sabe-se que o GM1 pode se dispersar na membrana após a

depleção de colesterol (Fujita et al., 2007). Contudo, ainda não existem relatos na literatura a

respeito da redistribuição dos gangliosídeos 9-O-acetil GD3 e os G-A2B5, observada neste

trabalho.

Por meio de ensaios de imunocitoquímicas, pudemos também avaliar o efeito da

depleção de colesterol sobre células individuais (Figura 31). Em uma situação controle,

observamos que a CNPase e a flotilina-1 colocalizam-se em regiões distintas da célula.

Células tratadas, por vez, apresentam um padrão de colocalização distribuída

homogeneamente pela célula. Estes resultados estão de acordo com nossos experimentos de

dot blotting, bem como com os dados de DeBruin e colaboradores (2005), ao demonstrar que

a distribuição espacial da CNPase pode ser afetada pela destruição das rafts.

5.7 Considerações finais

Este trabalho abordou a caracterização das lipid rafts da GEO. Essa célula vem sendo

objeto de muito interesse devido ao seu potencial uso em terapias celulares

neuroregenerativas. Pudemos constatar que as rafts da GEO se localizam nas frações 4, 5 e 6

70

no gradiente de sacarose e que a proteína de mielina não compacta CNPase, os gangliosídeos

9-O-acetil GD3 e G-A2B5 estão localizados nessas regiões (Figura 32). Tal fato indica que

tais componentes devam se associar as rafts, provavelmente em vias de sinalização

membrano-esqueletais. Constatamos ainda que a destruição das rafts resulta não só na

dispersão dos seus marcadores, como também na dispersão da CNPase e dos gangliosídeos

abordados, candidatos no envolvimento da migração da GEO. Dessa forma, esse trabalho

deve contribuir para o melhor entendimento do maquinário celular envolvido em vias de

sinalização membrano-esqueletais da GEO.

Figura 32- Resumo esquemático dos resultados apresentados nesta dissertação. Os microdomínios lipídicos da membrana da glia embainhante olfatória (GEO) pode apresentar colesterol, fosfolipídios (fosfatidilcolina e esfingomielina), esfingolipídios (gangliosídeos GM1, 9-O-acetil GD3 e os G-A2B5) e as proteínas flotilina, caveolina e CNPase.

• Fosfatidilcolina

• Esfingomielina

•Gangliosídeos: GM1,

•9-O-acetil GD3 e os G-A2B5

71

6 Conclusões

As marcações das proteínas flotilina-1 e caveolina-1, e do gangliosídeo GM1

(esfingolipídio) confirmam a presença das lipid rafts na glia embainhante olfatória (GEO);

A análise por M.E.T. revelou que as membranas resistentes a detergente do gradiente de

sacarose da GEO formam vesículas que variam de 0,09 a 0,17 µm de diâmetro;

As frações positivas para marcadores das lipid rafts apresentaram baixa quantidade de

proteína e alta concentração de colesterol, fosfatidilcolina e esfingomielina;

A presença da CNPase (proteína da mielina não-compacta), dos gangliosídeos 9-O-acetil-

GD3 e os reconhecidos pelo anticorpo A2B5 sugerem que as lipid rafts da GEO parecem

estar, pelo menos parcialmente, envolvidas na migração.

A depleção de colesterol por meio da droga metil-beta-ciclodextrina altera a distribuição dos

componentes dos microdomínios lipídicos da GEO.

72

7 Perspectivas

Com o intuito de dar continuidade aos estudos aqui mencionados, serão realizados os

seguintes experimentos:

Análise dos gangliosídeos das lipid rafts por HPTLC ;

Avaliar nas frações do gradiente de sacarose da GEO a expressão das proteínas lipid rafts

(flotilina-1 e caveolina-1) e da CNPase por western blotting;

Experimento com a sonda Laurdan para a verificação de formação de domínios nas células

controle e tratada com metil-beta-ciclodextrina (MβCD);

Experimentos funcionais de bloqueio das células com o uso de MβCD e quantificação da

taxa de migração;

Ensaios com citocalasina D e colchicina para o rompimento da estrutura e organização do

citoesqueleto visando o entendimento da via de sinalização ligada aos gangliosídeos

abordados nesta dissertação e as lipid rafts.

73

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