Persaratan dalam Melakukan Pengambilan Sampel1 . Sampel untuk pemeriksaan histopatologi harus segar, artinya jaringandiambil secepat mungkin setelah hewan mati. Keterlambatan pengambilanjaringan, terlebih dalam suhu lapangan yang panas, mengakibatkanjaringan cepat menjadi busuk.2 . Apabila di dalam kelompok hewan yang mati masih ada hewan lain yangsedang sakit, maka dianjurkan untuk mengambil sampel dari hewantersebut. Pada jaringan yang mengalami perubahan maka diambil jaringanpada perbatasan antara jaringan yang sakit (mengalami perubahan) denganjaringan yang sehat.3 . Ukuran jaringan yang diambil sekitar 1 cm3. Jaringan tersebut harus segeradifiksasi. Potongan jaringan yang terlalu besar mengakibatkan jaringanyang terletak di dalamnya tidak terfiksasi dengan serripurna, sehingga dapatmembusuk.4. Jika jaringan berupa tulang, maka perlu dilunakkan terlebih dahulu dalamlarutan dekalsifikasi dengan perbandingan antara jaringan dan larutan 120 dengan waktu perendaman selama 24 jam.Meredam Jaringan dengan Larutan Buffered Neutral Formalin(BNF) 10%Biasanya dilakukan dengan cara merendam jaringan di dalam zat-zatkimia yang berfungsi sebagai bahan pengawet agar terhindar dari pencernaanjaringan oleh enzim-enzim (otolisis) atau bakteri dan untuk melindungi struktur fisik sel. Bahan pengawet yang rutin digunakan adalah larutan Buffered NeutralFormalin (BNF) 10% dengan pH berkisar antara 6.5 - 7.5. pH ideal adalah7.0.Untuk membuat 1 liter BNF 10% yaitu dengan menimbang garamNaH2PO4 . H2O sebanyak 4,0 gram, dan Na2HP04 . 2H20 sebanyak 6,5 gramlarutkan dengan akuades 1 liter kemudian tambahkan 100 ml formaldehyde(37%-40%.)Agar fiksasi jaringan dengan larutan tersebut berlangsung sempurna,maka perbandingan antara organ dan larutan yaitu 1 : 10, sedangkan lamanyafiksasi minimal 2 hari.Larutan dekalsifikasi yaitu larutan yang berfungsi untukmenghilangkan garam-garam kalsium dari jaringan tulang sebelumpemotongan sehingga tulang menjadi lunak, selain itu juga untuk memudahkanpemotongan. Dekalsifikasi hanya bisa dilakukan apabila jaringan difiksasidengan sempurna. Larutan dekalsifikasi dapat dibuat dengan cara mencampurasam format sebanyak 160 ml dengan formalin teknis sebanyak 100 ml,kemudian larutan tersebut ditambahkan akuades sebanyak 1 .740 ml, larutantersebut siap untuk digunakan dengan perbandingan antara jaringan danlarutan 1 : 20 dengan waktu perendaman selama 24 jam.Setelah jaringan organ yang berada di dalam larutan fiksatif matang,jaringan ditiriskan pada saringan selanjutnya dipotong menggunakan pisauscalpel dengan ketebalan 0,3 - 0,5 mm dan disusun ke dalam tissue cassette,kemudian sejumlah tissue cassette dimasukkan ke dalam keranjang khusus(basket) .Keranjang (basket) yang di dalamnya berisi jaringan organ,dimasukkan ke dalam mesin processor otomatis (Gambar 1). Selanjutnyajaringan mengalami proses dehidrasi bertahap dengan putaran waktu sebagaiberikut : ethanol 70% (2 jam) ethanol 80% (2 jam) aethanol 90 % (2jam) a ethanol absolute (2 jam)a ethanol absolute (2 jam) xylol (2 jam)xylol (2 jam) parafin cair (2 jam) aparafin cair(2jam).Selanjutnya keran-jang yang berisi tissue cassette dikeluarkan untuk dilakukanproses berikutnya. 3 . VakumSetelah proses dehidrasi dilakukan, kemudian dilanjutkan denganpenghilangan udara dari jaringan dengan menggunakan mesin vakum yang didalammya terdapat tabung untuk menyimpan keranjang yang diisi parafin cairdengan temperatur (59 - 60°C) di vakum selama 30 menit. Keranjang diangkat,

tissue cassette dikeluarkan dan disimpan pada temperatur 60° C untuksementara waktu sebelum pencetakan dilakukan dengan parafin cair.4 . Mencetak blok parafinCetakan dari bahan stainles steel dihangatkan di atas api Bunsen, lalu ke dalamsetiap cetakan dimasukkan jaringan sambil diatur dan sedikit ditekan .Sementara An ditempat lain telah disiapkan parafin cair dalam tempat khusus,sehingga dicapai suhu 60°C. Parafin cair tersebut dituangkan ke dalam jaringansampai seluruh jaringan terendam parafin . Parafin dibiarkan membeku di atasmesin pendingin (Gambar 2 .). Selanjutnya blok parafin dilepas dari cetakandan disimpan difreezer (-20°C) sebelum dilakukan pemotongan.5. Memotong blok jaringanTemu Teknis Fungsional Non Peneliti 1001

Gambar 1 . Mesin Processor OtomatisBlok parafn yang mengandung jaringan, kemudian dipotong denganmenggunakan mesin mikrotom (Gambar 3) dengan ketebalan berkisar 3 - 4pm.Potongan tersebut diletakkan secara hati-hati di atas permukaan airdalam waterbath bersuhu 46° C . Pada kesempatan ini bentuk irisan dirapikan,kemudian diletakkan di atas kaca obyek yang telah diolesi ewith, yang berfungsi sebagai bahan perekat . Kaca obyek dengan jaringan di atasnyadisusun di dalam rak khusus dan dimasukkan ke dalam inkubator bersuhu 60°Csampai preparat siap untuk diwamai .D15!'E NSIrJV ' V(-AlAO(,HVO CONSOLE CONSOLE CCwSOIE

PERSIAPAN LARUTAN UNTUK PEWARNAANLarutan hematoksilinTimbang serbuk hematoksilin I gram, potasium aluminium sulfatsebanyak 50 gram dan sodium iodate ( Na 103 ) sebanyak 0,2 gram dilarutkandalam 1 liter akuades menggunakan alat pengaduk (stirer) dengan sedikitdipanaskan, kemudian disimpan satu malam dalam temperatur ruangan.Keesokkan harinya larutan tersebut ditambahkan asam sitrat (C6H807)sebanyak 50 gram dan chloral hydrate (CZH3CL30Z) sebanyak 50 gram. Larutandipanaskan dan diaduk selama 5 menit, kemudian didinginkan dan disaring .Larutan akan stabil selama 1- 2 tahun dalam botol berwama gelap padatemperatur ruangan.

Larutan eosinTimbang serbuk eosin Y sebanyak 7,5 gram, erythrosin sebanyak 7,5gram dan calcium chlorida sebanyak 2,5 gram dilarutkan dalam akuades 1 literkemudian disaring . Larutan akan stabil selama 6 - 12 bulan dalam botol gelappada temperatur ruangan.

Larutan pembiruLithium carbonat sebanyak 1,5 gram dilarutkan dengan akuades 1 literdan diaduk hingga homogen.Temu Teknis Fungsional Non Peneliri 2001

Gambar 3. Mesin MikrotomPROSES PEWARNAAN HEMATOKSILIN DAN EOSINPreparat yang akan diwarnai diletakkan pada rak khusus clandicelupkan secara berurutan ke dalam larutan dengan waktu sebagai berikut" Xylol 3 menit" Xylol 3 menit" Ethanol absolute 3 menit" Ethanol absolute 3 menit" Ethanol 90% 3 menit" Ethanol 80% 3 menit" Bilas dengan air keran 1 menit" Larutan hematoksilin 6-7 menit" Bilas dengan air keran 1 menit" Larutan pembiru 1 menit" Air keran 1 menit" Larutan eosin 1 - 5 menit

" Bilas dengan air keran 1 menitHASIL DAN PEMBAHASANPreparat diangkat satu persatu dari larutan xylol dalam keadaan basah,diberi satu tetes cairan perekat ( DPX ) dan selanjutnya ditutup dengan kacapenutup. Hasil pewarnaan dapat dilihat di bawah mikroskop .Hasil pewarnaan hematoksilin dan eosin (H&E) dapat dilihat pada(Gambar 4). Dari hasil pewarnaan yang dilakukan pada jaringan otot rangkakerbau terlihat dengan jelas bahwa inti sel berwarna biru sedangkan ototberwarna merah muda sampai merah.Proses pembiruan dalam hematoksilin akan merubah warna merahkecoklatan dari hematoksilin menjadi biru kehitaman, dimana akan terlihatlebih jelas setelah dilakukan counter stain dengan eosin yang berwarna merahmenjadi merah muda. Proses ini akan terjadi dalam air keran yang bersifatalkali atau juga dapat dibantu dengan penambahan garam lithium carbonat yangmenjadikan air lebih bersifat alkali .162Gambar 4. Otot rangka kerbau, inti sel berwarna biru (a), Otot berwarna merahmuda sampel merah (b), Pewarnaan H & E 40 xTemu Teknis Fungsionai Non Penelui 2001

" Ethanol 80 % 10 celupan" Ethanol 90 % 10 celupan" Ethanol absolute 10 celupan" Ethanol absolute 1 menit" Xylol 3 menit" Xylol 3 menit" Xylol 3 menit.

Dengan menggunakan prosedur penggunaan waktu yang standar, tidakmenjamin akan mendapatkan hasil yang baik. Pengaturan waktu dalam prosespewarnaan ini sangat penting . Karena ketepatan waktu akan dipengaruhi olehtipe dari tiap jaringan yang diproses, sehingga penggunaan waktu bisa berubahsesuai dengan kebutuhan