ɛ–caprolacton und chiralen aminen · biokatalytische synthesen von ɛ–caprolacton und chiralen...

BiokatalytischeSynthesenvon

ɛ–CaprolactonundchiralenAminen

Dissertation

zurErlangungdesDoktorgrades

derNaturwisenschaften

(Dr.rer.nat.)

vorgelegtder

FakultätfürChemiederUniversitätBielefeld

von

AnnaReimer

ausPretorija/Russland

Bielefeld,August2015

Inmemoriam

JAKOBREIMER

AlsDissertationvorgelegtderFakultätfürChemiederUniversitätBielefeld.

Erstberichterstatter: Prof.Dr.HaraldGröger

Zweitberichterstatter: Prof.Dr.NorbertSewald

Die vorliegende Arbeit wurde in der Organischen Chemie der Fakultät für Chemie der Universität

BielefeldunterderLeitungvonProf.Dr.HaraldGrögerimZeitraumvomApril2011bisAugust2015

erstellt.

AnnaReimer,BiokatalytischeSynthesenvonɛ–CaprolactonundchiralenAminen

©August2015

TeiledieserArbeitsindbereitsveröffentlicht:

Posterpräsentation:

AnnaReimer,SvenjaStaudt,UweBornscheuer,UlfMenyes,HaraldGröger,“EstablishingofGCanalytics

forenzymicallycatalysedBaeyer‐Villigerreaction”,7.CeBiTecSymposium,ZentrumfürInterdisziplinäre

Forschung(ZiF),UniversitätBielefeld,17.–19.Dezember2012.

Publikationen:

AnnaReimer,SeverinWedde,SvenjaStaudt,SandySchmidt,DanielaHöffer,WernerHummel,UdoKragl,

UweBornscheuer,HaraldGröger,ProcessDevelopmentThroughSolventEngineeringintheBiocatalytic

SynthesisoftheHeterocyclicBulkChemicalɛ–Caprolactone, J.Heterocyc.Chem.2015,eingereicht.

FlorianUthoff,AnnaReimer,AndreasLiese,HaraldGröger,EnantioselectiveSynthesisofChiralAmines

ThroughEnzymaticResolutionunderSolvent‐freeConditions,Adv.Synth.Catal.2015,eingereicht.

Danksagung

AndieserStellemöchteichalldenendanken,diedurchihrefachlicheundpersönlicheUnterstützung

zumGelingendieserArbeitbeigetragenhaben.

MeinbesondererDankgiltProf.Dr.HaraldGrögerfürdieBetreungmeinerDissertation.Insbesondere

dankeichfürdieBereitstellungderinteressantenThemenunddieHilfsbereitschaft,diekontinuierliche

FörderungunddiefachlichenGespräche.

IchdankeProf.Dr.NorbertSewaldfürdieÜbernahmedesZweitgutachtens.

DerDeutschenBundeststiftungUmwelt (DBU)danke ich fürdie finanzielleFörderungdesProjektes

„Nachhaltige,biokatalytischeOxidationsprozesse“.DerFirmaEnzymicalsAGundderArbeitsgruppevon

Prof.Dr.WernerHummelgiltmeinDankfürdiezurVerfügunggestelltenMonooxygenasenbzw.der

Alkohol‐Dehydrogenase.

EingroßerDankgehörtdenbeidengutenSeelenderArbeitsgruppe:ThomasGeislerundArjaGaestel.

BeidehabenmitIhrerunendlichfreundlichenArteineschöneAtmosphäregezaubert.Niemandkann

einen morgens fröhlicher begrüßen, mit einem Schmunzeln besser die Ruhe bewahren und eine

leckerereFeuerzangenbowlebastelnalsThomas.ArjadankeichfürdiezahlreichenPläuschchenund

Urlaubsimpressionenimmermalwiederzwischendurch.

Des Weiteren danke ich der MS‐Abteilung: Dr. Jens Spross, Sandra Heitkamp (Danke für die ESI‐

Messungen)undHeinz‐WernerPatruck,derbeiHilfe‐Rufen inComputerfragensofortzurStellewar.

Herrn PeterMester danke ich für die superschnellen NMR‐Messungen, die teilweise schon auf den

Serverhochgeladenwaren,bevormandenWegzurückinsLaborgeschaffthatte.FrauBrigitteMichel

dankeichfürdieDurchführungderElementaranalysen.

IchdankedemehemaligenAKMattayfürdiefreundlicheAufnahmeindiewunderbareWeltderOCI.

MeinDankgiltdenehemaligenundaktuellenMitgliedernderArbeitsgruppe:Dr.KaiAltenhöner*Daniel

Bakonyi–ischweiß,wodingGrillsteht,mingJung,unischfühlemicheingeladen!*TobiasBetke*Dr.

SebastianBringmann–dankefürdeinehumorvolleArt*Dr.JensEberhard–einwandelndesLehrbuch,

sprudelndvorIdeen*WilkoGreschner–einVirtouseanderKaffeemaschine*Dr.AnkeHummel–danke

fürdasKorrekturlesen!*Dr.FlorianMay*Dr.RichardMetzner–dankefürdasKorrekturlesenundnoch

vielesmehr(Fünnünününü!)*Dr.MichaelPeter*MatthiasPieper*PhilippRommelmann*Katharina

Tenbrink*Dr.OliverTosic*FlorianUthoff–denichumseineGelassenheitbeneide*SeverinWedde*

Dr.SebastianWiegmann–erkönntedieWeltmitStativstangenundAlufolieretten*sowiesämtlichen

KollegendesAKinErlangen.DankefürdienetteAtmosphäreimLabor,dievielenschönenausufernden

DiskussionenindenPausensowiedieMario‐Kart‐Abende,dieprofessionellenBrauerei‐Besichtigungen

undBoßel‐Hochleistungssport‐Ausflüge,PubQuiz‐Abende,Glühweinmarkt‐Besuchenundnoch vieles

mehr.EswareineschöneZeit!

Dr.SvenjaStaudtdankeichfürdiefreundlicheHilfestellungenundTippsundTricksfürdenEinstiegin

die Thematik. Ich danke Mathilde Brax und Jan‐Phlipp Broschinski für die synthetischen Arbeiten

während ihrerForschungspraktikaundsämtlichenAzubis (DankanEvelynSchulde fürdiehelfende

HandamKolben)undHiWis.DenDoktorandenderOCIIundOCIIIdankeichfürdengemeinsamen

ZeitvertreibwährendderPraktikumsbetreuungimSaal.

Meiner Büro‐Familie, Ramona Bringmann, Dr. Tina Reß und Marc Biermann, danke ich für die

fruchtbarenDiskussionenüberChemie,MSWordsowiedieWeltunddasLeben.„WennausKollegen

Freundewerden“odereinfach:ihrseidmirindiesenJahrensehransHerzgewachsen.Inbesonderem

MaßemöchteichmichbeiTinafürihreFreundschaftbedanken.EsgibtnochvieleschlechteFilmezu

schauen,vielWeinzutrinkenundunendlichvielzubereden–ichfreuemichdarauf!

MeinenFreundenundLiebenaußerhalbderUnidankeichfürihrVerständnis.Ichkonntemichimmer

aufihroffenesOhrundihrenUnterstützungverlassen,auchwennihnennichtimmersoklarwar,was

genauichdainderUnieigentlichsomache.

ZumSchlussdankeichdenfürmichkostbarstenMenschen:ichdankemeinemFreundRobertfürseine

geduldige moralische Unterstützung und seine Liebe. Mein Bruder Viktor danke ich für seine

Ermutigungen und dafür, dass er der beste Bruder ist. MeinerMutter Erna, diemir diese Chancen

ermöglichthat,dankeichaustiefstemHerzenfürdasinmichgesetzteVertrauen.Ohneeuchhätteich

diesenlangenWegnichtgehenkönnen.DANKE!

I

Inhalt

Inhalt....................................................................................................................................................................I

Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................................................IX

1 Einleitung..........................................................................................................................................................1

2 MotivationundZielsetzung.........................................................................................................................3

2.1 EnzymkatalysierteOxidationvonCyclohexanol(1).....................................................................3

2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen.............................................................................5

3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen.............................................................................9

3.1 ChemischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation................................................................................................9

3.1.1 KlassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.................................................................................................9

3.1.2 StandderWissenschaft:klassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation...........................................12

3.1.3 StereoselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation....................................................................................14

3.2 EnzymkatalysierteSynthesen..............................................................................................................15

3.2.1 EnzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.......................................................................................15

3.2.2 BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen.....................................................................................................16

3.2.2.1 Allgemeines...................................................................................................................................................16

3.2.2.2 StrukturundMechanismus...................................................................................................................18

3.2.3 Alkohol‐Dehydrogenasen.......................................................................................................................23

3.2.4 Cofaktor‐Regeneration............................................................................................................................26

3.3 EigeneErgebnisseundDiskussion.....................................................................................................29

3.3.1 Standardreaktion:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuɛ‐Caprolacton(3).........29

3.3.2 EtablierunganalytischerMethoden...................................................................................................30

3.3.2.1 UmsatzbestimmungmittelsNMR‐Analytik....................................................................................30

3.3.2.2 UmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie......................................................................32

3.3.2.3 ErmittlungderRückgewinnungsrate................................................................................................33

3.3.2.4 VergleichderAnalytik‐MethodenanhandderStandard‐Reaktion.....................................36

3.3.2.5 AktivitätsbestimmungmittelsUV/Vis‐SpektroskopieundBRADFORD‐Test.....................37

3.3.2.6 OptimierungderStandardreaktion...................................................................................................39

3.3.3 UntersuchungenmittelsTitrations‐Apparatur.............................................................................43

3.3.4 VerwendungvonAdsorberharzen.....................................................................................................46

II

3.3.5 VariationderSubstrate...........................................................................................................................48

4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen...............................................................................53

4.1 Lipasen............................................................................................................................................................53

4.1.1 Allgemeines..................................................................................................................................................53

4.1.2 StrukturundMechanismus...................................................................................................................54

4.1.3 EnantioselektivitätvonLipasen..........................................................................................................57

4.2 StandderWissenschaft:Aminsynthesen........................................................................................58

4.2.1 KlassischchemischeundchemokatalytischeSynthesen.........................................................58

4.2.2 EnzymkatalysierteSynthesen..............................................................................................................64

4.3 EigeneErgebnisseundDiskussion.....................................................................................................73

4.3.1 ReferenzenundAnalytik........................................................................................................................73

4.3.1.1 SynthesederReferenzverbindungen................................................................................................73

4.3.1.2 Analytik..........................................................................................................................................................75

4.3.2 VorversuchemitsubstituiertenBenzylaminenalsSubstrate................................................79

4.3.2.1 SynthesedesBenzylamids133...........................................................................................................79

4.3.3 EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.............................................................80

4.3.4 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)........................................85

4.3.4.1 Prozessoptimierung..................................................................................................................................86

4.3.4.1.1 EinflussderTemperaturundReaktionszeit..................................................................................86

4.3.4.1.2 VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen..................................................................88

4.3.5 Enzymrecycling...........................................................................................................................................89

4.3.6 VerwendungvonalternativenLipasen............................................................................................90

4.3.6.1 Lipasen‐Screening.....................................................................................................................................90

4.3.6.2 VerwendungderLipasenvonC‐LECTAalsBiokatalysatoren..................................................93

4.3.7 VariationderAcyldonoren....................................................................................................................96

4.3.7.1 VergleichderAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen..................................97

4.3.7.2 VergleichderAcyldonorenbeiverringerterTemperatur.......................................................99

4.3.7.3 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)................100

4.3.8 ReaktionskinetikenderRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

unterschiedlichenAcyldonoren.......................................................................................................102

4.3.9 Substratbreite...........................................................................................................................................107

4.3.9.1 1‐Aminoindan(rac‐130).....................................................................................................................107

III

4.3.9.2 SekundäreAmine....................................................................................................................................112

4.3.10 ɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor......................................................................................................116

4.3.10.1 ChemischeAcylierungmitɛ–Caprolacton(3)............................................................................116

4.3.10.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)......................118

4.3.10.3 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton

(3)...................................................................................................................................................................119

4.3.10.4 EnzymatischeAcylierungvonsekundärenAminenmitɛ‐Caprolacton(3)..................123

5 Zusammenfassung.....................................................................................................................................125

5.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)mittelsCHMO...........................................125

5.2 EnzymatischeRacematspaltungchiralerAmine.......................................................................127

6 Summary.......................................................................................................................................................132

6.1 Enzymaticoxidationofcyclohexanol(1)bymeansofCHMO.............................................132

6.2 Enzymaticresolutionofchiralamines..........................................................................................134

7 ExperimentellerTeil.................................................................................................................................139

7.1 VerwendeteChemikalienundGeräte............................................................................................139

7.2 Synthesen,MethodenundspektroskopischeDaten................................................................142

7.2.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)unterEinsatzvonCHMOund

LK‐ADH........................................................................................................................................................142

7.2.1.1 Standardreaktion:AllgemeineArbeitsvorschrift1(AAV1):Enzymatische

OxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3)...........................................................142

7.2.1.2 Analytik........................................................................................................................................................143

7.2.1.2.1 Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐Spektroskopie..............................................................143

7.2.1.2.2 StabilitätvonUrotropin(51)alsStandard.................................................................................143

7.2.1.2.3 BestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR..............................................................143

7.2.1.3 UmsatzbestimmungmittelsGC.........................................................................................................144

7.2.1.3.1 ErstellenderEichgerade......................................................................................................................144

7.2.1.3.2 BestimmungderDurchschnittsabweichungen..........................................................................144

7.2.1.3.3 BestimmungdesWiederfindungsratemittelsGC.....................................................................145

7.2.1.3.4 BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH...............................146

7.2.1.3.5 EinflussderEnzympellet‐BildungaufdieRückgewinnungsrate......................................146

7.2.1.3.6 VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR...........................................................................147

7.2.1.4 Photometertests......................................................................................................................................148

IV

7.2.1.4.1 BestimmungderEnzymaktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethyl‐

cyclohexanol(53)...................................................................................................................................148

7.2.1.4.2 AllgemeineArbeitsvorschrift2(AAV2):BestimmungderEnzymaktivitätder

CHMO............................................................................................................................................................149

7.2.1.4.3 BVMO‐ScreeningundBRADFORD‐TestzurOxidationvonCyclohexanol(2).................149

7.2.1.4.4 AktivitätsbestimmungderCHMOgegenüberIsophoron(52)...........................................150

7.2.1.5 OptimierungderStandard‐Reaktion..............................................................................................150

7.2.1.5.1 AllgemeineArbeitsvorschrift3(AAV3):Doppeloxidationzuɛ‐Caprolacton(3)

mitoptimierterAufarbeitung............................................................................................................150

7.2.1.5.2 VariationdesLösungsmittels............................................................................................................151

7.2.1.5.3 VariationderReaktionsbedingungen............................................................................................152

7.2.1.6 AllgemeineArbeitsvorschrift4(AAV4):UntersuchungderStabilitätderLk‐

ADHmittelsTitrations‐Apparatur..................................................................................................152

7.2.1.7 VariationdesSubstrates......................................................................................................................153

7.2.1.7.1 3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat.........................................................................153

7.2.1.7.2 Isophoron(52)alsSubstrat...............................................................................................................154

7.2.1.8 VerwendungvonAdsorberharzen..................................................................................................155

7.2.1.8.1 BestimmungderRückgewinnungsrateinAnwesenheitvonXAD‐7und

XAD‐1180...................................................................................................................................................155

7.2.1.8.2 DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7................................155

7.2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminenmittelsLipasen.....................................157

7.2.2.1 AllgemeineArbeitsvorschrift5(AAV5):SynthesevonReferenzverbindungen........157

7.2.2.1.1 SynthesedesDL‐Ethyl‐3‐oxo‐3‐(1‐phenylethylamino)propanoats(rac‐10)..............157

7.2.2.1.2 Synthesedes2‐Phenoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐121)....................................158

7.2.2.1.3 Synthesedes2‐Cyano‐N‐(1‐phenylethyl)‐acetamids(rac‐123).......................................158

7.2.2.1.4 SynthesedesN‐(1‐Phenylethyl)acetamids(rac‐7).................................................................159

7.2.2.1.5 Synthesedes2‐Phenyl‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐126).......................................160

7.2.2.1.6 Synthesedes2‐Methoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐8).........................................161

7.2.2.1.7 SynthesedesEthyl‐3‐((2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)amino)‐3‐oxo‐propanoats

(rac‐129)....................................................................................................................................................161

7.2.2.2 Analytik.......................................................................................................................................................162

7.2.2.2.1 ValidierungderAufarbeitungvonAAV5mittelsNMR‐Analytik.......................................162

V

7.2.2.2.2 BestimmungderEnantiomerenüberschüssedurchchemischeAcylierungdes

resultierendenAmins(S)‐4................................................................................................................163

7.2.2.3 VorversuchezurenzymatischenAcylierungmitBenzylaminenalsSubstrate...........164

7.2.2.3.1 SynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)............................................164

7.2.2.3.2 AnalysedesDiamidsN,N‘‐Dibenzylmalonamid(137)...........................................................165

7.2.2.3.3 AllgemeineArbeitsvorschrift6(AAV6):EnzymatischeAcylierung

substituierterBenzylamine................................................................................................................166

7.2.2.3.4 EnzymatischeSynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133).............166

7.2.2.3.5 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Hydroxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(141)..........166

7.2.2.3.6 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Bromobenzyl)‐N‐ethylmalonamid(145).............167

7.2.2.3.7 SynthesevonN‐(m‐Methoxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(143)........................................168

7.2.2.3.8 BestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester

(9)...................................................................................................................................................................168

7.2.2.3.9 AllgemeineArbeitsvorschrift7(AAV7):Kontrollederchemischen

ParallelreaktionderAcylierungverschiedenerBenzylamine............................................169

7.2.2.3.10 UntersuchungenzurDiamidbildungausgehendvon3‐Methoxybenzylamin

(139).............................................................................................................................................................170

7.2.2.3.11 LösungsmitteleffektderenzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine.....170

7.2.2.4 EnzymatischenRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)..................................171

7.2.2.4.1 Standardreaktion:Racematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

Malonsäurediethylester(9)................................................................................................................171

7.2.2.4.2 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4............................172

7.2.2.4.3 UntersuchungderParallelreaktionderAcylierungvon1‐Phenylethylamin

(rac‐4)..........................................................................................................................................................173

7.2.2.4.4 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)beigeringerer

Enzymbeladung.......................................................................................................................................173


EnzymbeladunginEt2O........................................................................................................................174

7.2.2.5 Enzymrecycling........................................................................................................................................174

7.2.2.6 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonAminen...................................................................175

7.2.2.6.1 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonBenzylamin(134).............................................175

7.2.2.6.2 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138).......................176

7.2.2.6.3 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)...........................177

VI

7.2.2.7 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

alternativenLipasenCAL‐BvonC‐LECTA......................................................................................178

7.2.2.7.1 AllgemeineArbeitsvorschrift9(AAV9):VergleichderAktivitätvonLipasen

vonC‐LECTAmittelsTitrationmitNaOH.......................................................................................178

7.2.2.7.2 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenvonC‐LECTAmittels

enzymatischerSpaltungdesEssigesters5bei20°C..............................................................178

7.2.2.7.3 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenmittelsenzymatischer

SpaltungdesEssigesters5bei60°C..............................................................................................179

7.2.2.7.4 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐Bvon

C‐LECTA.........................................................................................................................................................180

7.2.2.7.5 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐Bvon

C‐LECTA.........................................................................................................................................................180

7.2.2.8 VariationderAcyldonoren.................................................................................................................181

7.2.2.8.1 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren...................181

7.2.2.8.2 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitunterschiedlichen

Acyldonoren..............................................................................................................................................182

7.2.2.8.3 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9)....................183

7.2.2.8.4 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigsäureethylester

(122).............................................................................................................................................................184

7.2.2.8.5 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigsäureethylester(124)...........185

7.2.2.8.6 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester

(111).............................................................................................................................................................185

7.2.2.9 1‐Aminoindan(rac‐130)alsSubstrat...........................................................................................186

7.2.2.9.1 AnalysedesDiamidsN1,N3‐bis(2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)malonamid(129).........186

7.2.2.9.2 BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendder

Aufarbeitung.............................................................................................................................................187

7.2.2.9.3 Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvon

1‐Aminoindan(rac‐130).....................................................................................................................187

7.2.2.9.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Aminoindan(rac‐130)....................188

7.2.2.10 SekundäreAminealsSubstrate........................................................................................................189

7.2.2.10.1 BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149bzw.150.....................................189

7.2.2.10.2 SynthesevonEthyl‐3‐(2‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐151)..............189

7.2.2.10.3 SynthesevonEthyl‐3‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐152)..............190

7.2.2.10.4 EnzymatischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)..............................................190

VII

7.2.2.10.5 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvon

3‐Methylpiperidin(rac‐150).............................................................................................................191

7.2.2.10.6 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150.......................................................191

7.2.2.11 Verwendungvonɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor................................................................192

7.2.2.11.1 BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3)währendderReaktionund

Aufarbeitung..............................................................................................................................................192

7.2.2.11.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)......................193

7.2.2.11.3 VariationderReaktionsbedingungenderenzymatischenAcylierungvon

Benzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3).....................................................................................193

7.2.2.11.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mit

ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................194

7.2.2.11.5 Synthesevon6‐Hydroxy‐N‐(1‐phenylethyl)hexanamid(157)..........................................195

7.2.2.11.6 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................195

7.2.2.11.7 TemperaturabhängigkeitderenzymatischenAcylierungvon

1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)..................................................................196

7.2.2.11.8 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3)..............197

7.2.2.11.9 ReaktionskinetikderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................197

7.2.2.11.10 Synthesevon6‐Hydroxy‐1‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)hexan‐1‐on(155).......................198

7.2.2.11.11 EnzymatischeAcylierungensekundärerAminemitɛ‐Caprolacton(3).........................198

8 Literaturverzeichnis.................................................................................................................................201

IX

Abkürzungsverzeichnis

AAV AllgemeineArbeitsvorschrift

ADH Alkohol‐Dehydrogenase

AD‐H HPLC‐Säule,CHIRALPAK®

Amolysetris‐(3,5‐dimethylphenylcarbamat)

Äq. Äquivalent(e)

atm Atmosphäre,Druckeinheit

BVMO Baeyer‐Villiger‐Monooxygenase

br breit

c Umsatz(conversion)

CAL‐A LipaseAausCandidaantarctica

CAL‐B LipaseBausCandidaantarctica,Novozym435

CH Cyclohexan

CHMO Cyclohexan‐Monooxygenase

δ chemischeVerschiebungin[ppm]

d Dublett

d Küvettendickein[cm]

DBU DeutscheBundesstiftungUmwelt

DBU 1,8‐Diazabicyclo[5.4.0]undec‐7‐en

DC Dünnschichtchromatographie

DCM Dichlormethan

dd dupliziertesDublett

dest. destilliert

DKR dynamisch‐kinetischeRacematspaltung

ε ExtinktionskoeffizientfürNAD(P)Hin[mL.μmol‐1.cm‐1]

E.coli Escherichiacoli

EA Elementaranalyse

EC EinteilungderEnzymeinKlassen(enzymecommission)

EDTA Ethyldiamintetraacetat

ee Enantiomerenüberschuss(enantiomericexcess)

EI Elektronenstoß‐Ionisation

EtOAc Essigester

ESI Elektrospray‐Ionisation

Et Ethyl

etal. undandere(lat.etalii)

Et2O Diethylether

f Probenverdünnungsfaktor

X

FDA US‐Arzeimittelbehörde(USFoodandDrugAdministration)

FMN Flavinmononukleotid

GC Gaschromatographie

GDH Glucosedehydrogenase

ges. gesättigt

h Stunde(n)

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(HighPerformanceLiquidChromatography)

Hz Hertz

i‐PrOH iso‐Propanol

IR Infrarot

i.Vak. imVakuum

J skalareKopplungskonstantein[Hz]

kDa Kilodalton

KM MICHAELIS‐Konstantein[mol/l]

KPi Kaliumphosphatpuffer

Lb‐ADH Alkohol‐DehydrogenaseausLactobacillusbrevis

Lk‐ADH Alkohol‐DehydrogenaseausLactobacilluskefir

M molar,Stoffmengenkonzentrationin[mol/l]

m Multiplett

m‐CPBA meta‐Chlorperbenzoesäure(meta‐chloroperoxybenzoicacid)

Me Methyl

mg Milligramm

MHz Megahertz

min Minute(n)

mL Milliliter

mm Millimeter

mM millimolar,Stoffmengenkonzentrationin[mmol/l]

mmol Millimol

MTBE Methyl‐tert‐butylether

MS Massenspektrometrie

m/z VerhältnisMassezuLadung

μL Mikroliter

NADH,NAD+ Nikotinsäureamid‐Adenin‐Dinukleotid

NADPH,NADP+ Nikotinsäureamid‐Adenin‐Dinukleotid‐Phosphat

n.b. nichtbestimmt

NEt3 Triethylamin

nm Nanometer

NMR KernmagnetischeResonanz(Nuclearmagneticresonance)

org. organisch

XI

PAMO Phenylaceton‐Monooxygenase

PBA Peroxybenzoesäure(peroxybenzoicacid)

PCL Poly‐ε‐caprolacton

PMP para‐Methoxyphenyl‐Schutzgruppe

ppm TeileproMillion(partspermillion)

prim primär

q Quartett

qui Quintett

R Substituent

rac Racemat

rel. relativ

rpm UmdrehungenproMinute(roundsperminute)

RT Raumtemperatur

s Singulett

Sdp. Siedepunkt

sec sekundär

Smp. Schmelzpunkt

spez. spezifisch

T Temperaturin[°C]

t Triplett

t Zeit

TBAI Tetrabutylammoniumiodid

td TripletteinesDubletts

tert Tertiär

THF Tetrahydrofuran

tR Retentionszeit

TMS Tetramethylsilan

TRIS Tris‐(hydroxymethyl)‐aminmethan

U Unitsin[µmolmin‐1]

U/mg Aktivität

U/mL volumetrischeAktivität

UV/Vis Ultraviolett/sichtbar(ultraviolett/visible)

v Volumen

Umrechnungsfaktor

Wellenzahlin[cm‐1]

vmax Maximalgeschwindigkeit

wässr. wässrig

XIII

ˆfv|xÇvx? Åç Ätw? |á Åtwx âÑ Éy Å|áàt~xá?

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JULESVERNE,

AJourneytotheCenteroftheEarth

1 Einleitung

1

1 Einleitung

Die Biotechnologie hat sich zu einer der Schlüssel‐ und Zukunftstechnologien entwickelt. Die

Bezeichnung„weißeBiotechnologie“grenztdieindustrielleBiotechnologievonder„grünen“undder

„roten“Biotechnologieab,diesichmitPflanzenundLebensmittelbefassen,jedochgibtesmitbeiden

BereichenÜberschneidungen.[1]DieweißeBiotechnologiesetztdabeibiotechnologischeMethodenfür

industrielleVerfahrenzurHerstellungvonpharmazeutischenundchemischenProduktenwieAmino‐

säuren,Vitaminen,Antibiotika,Enzymen,MedikamentenundPolymerenein.Bereitsheutebeträgtder

AnteilvonProduktenundVerfahren,dieBiotechnologienutzen,inderchemischenIndustrieetwa5%.

EinAnstiegauf10–20%biszumJahr2025wirderwartet.[2]Etwa80%derWirkstoffeinderProdukt‐

pipeline der Pharmafirmen sind chiral und ein weiterer Anstieg ist sicher. Seit 1992 wird durch

RegularienderUSFoodandDrugAdministration (FDA)unddesEuropeanCommittee forProprietary

MedicinalProductsvorgeschrieben,dassdiephysiologischeWirkungjedesEnantiomerseinesPharma‐

wirkstoffseinzelnuntersuchtwerdenmuss.[4]

Die hervorragenden katalytischen Fähigkeiten von Enzymen zeigen sich in ihrer Vielfalt und Kom‐

plexität.EinGrundfürdasgroßePotentialvonBiokatalysatorenliegtauchdarin,dassdieunendliche

VielfaltderNaturerstansatzweiseentziffertist.MittedesJahres2015sind6759verschiedeneEnzyme

identifiziert und beschrieben worden, wobei etwa 25000 unterschiedliche Enzyme in der Natur

vermutetwerden.[5,6]DurchchemischeModifizierungen,zufälligeMutationenundProteinEngineering

wirdeinegroßeAnzahlanmodifiziertenEnzymenauchfürdieindustrielleAnwendungzurVerfügung

stehen. Zuden etabliertenAnwendungsfeldern vonEnzymen imBereichderweißenBiotechnologie

zählenvorallemdieAgro‐, Lebensmittel‐,Waschmittel‐undTextilchemiesowiedie chemischeund

pharmazeutischeIndustrie.VondenschonbekanntenEnzymenwerdenderzeitgeradeeinmaletwa130

industriellgenutzt.DieUnterteilungvonEnzymenerfolgtinsechsKlassen(EC,enzymecommission)in

AbhängigkeitvonihrenKatalyse‐EigenschafteninderNatur(Tabelle1).[7]

Tabelle1. UnterteilungderEnzymeinEC‐Klassen.[7,8]

Enzymklasse EC FunktioninMikroorganismen

Oxidoreduktasen 1 Reduktionbzw.Oxidation

Transferasen 2 TransfervonAldehyd‐,Keton‐,Acyl‐,Zucker‐,

Phosphoryl‐oderMethylgruppen

Hydrolasen 3 SpaltungoderBildungvonEstern,Amiden,Lactonen,

Lactamen,Epoxiden,Nitrilen,Anhydriden,Glycosiden

Lyasen 4 Addition/EliminierungvonkleinenMolekülen

Isomerasen 5 Isomerisierung,z.B.Racemisierung,Epimerisierung

Ligasen 6 BildungvonC‐C‐,C‐O‐,C‐S‐,C‐N‐Bindungen

1 Einleitung

2

Enzyme lassensichallerdings fürweitmehrReaktionenalsKatalysatoreinsetzenalsvonderNatur

vorgesehenist.BeimVergleichvonchemischenmitenzymatischenReaktionensindvieleVorteileder

Enzymkatalysezuerkennen.TypischerweiseverlaufenenzymkatalysierteReaktionenumeinenFaktor

108 bis 1012mal schneller verglichenmit den nicht‐katalysiertenReaktionen[8,9] und bis zu 107mal

schnelleralschemischkatalysierteReaktionenunterphysiologischenBedingungen.[10]

EnzymatischeUmsetzungenkönnenmeistbeimoderatenBedingungendurchgeführtwerden,während

chemischeReaktionenhäufigErhitzenzumRückflussoderaberHerunterkühlenaufniedrigeTempe‐

raturen erfordern. Metallkatalysatoren, die beispielsweise Platin oder Palladium enthalten, sind oft

teuer und aufwendig in derHerstellung. Im Gegensatz dazu sind vieleMikroorganismen im großen

MaßstabkultivierbarundfürzahlreicheEnzymestehenetablierteExpressionssystemezurVerfügung,

sodassBiokatalysatoren leichtundrelativgünstig ingroßemUmfangerhaltenwerdenkönnen.Aus‐

gehendvoneinemprochiralenkanneinchiralesZentrumerzeugtwerden.Auchkanndurchdiehohe

Chemo‐undRegioselektivitätdermeistenEnzymeaufaufwändigesSchützenundEntschützenvonähn‐

lichenfunktionellenGruppeninnerhalbeinesMolekülsverzichtetwerden.[6,11]

ZudenNachteilenderEnzymezählendieoftmäßigeStereoselektivität,dielimitierteSubstratbreiteund

dierelativgeringeStabilität,dasie in ihrerAktivitätansehrengeMilieubedingungengebundenund

schnelldenaturierbarsind,z.B.durchextremepH‐WerteoderTemperaturen.[12]DabeigibtesinHin‐

blickaufdieStabilitätauchUnterschiedeinnerhalbderBiokatalysatoren.SokönnenmancheEnzyme

lyophilisiertoderinGlycerin‐LösungenebensowieimmobilisiertaufTrägermaterialiendurchauslange

Lagerzeiten ohne größeren Aktivitätsverlust überstehen. DesWeiteren besteht dieMöglichkeit, das

immobilisierteEnzymnachderReaktionabzutrennenundeseinerweiterenUmsetzungzuzuführen.

Auchwird dadurch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln als Reaktionsmedium ermög‐

licht.[13]

AlseinlimitierenderFaktorgaltlangediegeringeVerfügbarkeitvonEnzymeninbenutzerfreundlicher

Form.DurchheterogeneGenexpressionfremderGene innicht‐pathogenenundgutcharakterisierten

OrganismenwieEscherichiacoli (E.coli)oderderBäckerhefe (Sachharomycescerevisiae)kanndiese

Limitierungüberwundenwerden.DieHauptvorteileeiner rekombinantenExpressiongegenüberder

NutzungeinesWildtyp‐Enzymssind,dasseinhöheresExpressionsniveauerreichtwerdenkannunddie

WahrscheinlichkeitderkatabolenVerstoffwechslungdesgebildetenProduktsehergeringist.

Biotransformationen lassen sich in isoliertenEnzymenund in ganzenZellendurchführenundbeide

Biokatalysator‐FormenhabenihreVor‐undNachteile.BeiderVerwendungvonGanzzell‐Katalysatoren

entfallendieIsolationderEnzymesowiedieVerwendungeineszusätzlichenCofaktor‐Regenerations‐

systems.ZudenNachteilenzählendieniedrigeAktivitätundderUmgangmitPathogenen.Außerdem

sinddieseZell‐SystemeaufSubstratebeschränkt,diezumeinendieZellmembrandesMikroorganismus

passierenkönnen,zumanderensolltenimFalleinerFermentationwederSubstratnochProdukttoxisch

für den Organismus sein oder von diesem auf anderemWege umgesetzt werden.[11,14] Andererseits

treten bei isolierten Enzymen, im Gegensatz zu Ganzzell‐Katalysatoren, keine Massentransfer‐

Limitierungen und keinemöglicheNebenproduktbildung durch Übermetabolisierung des Produktes

auf.[15,16] Weitere Vorteile sind die einfachere Aufarbeitung und es kann mit höheren Substrat‐

konzentrationengearbeitetwerden.

2 MotivationundZielsetzung

3


Lactone dienen in der Industrie als wichtige Precursor für die Herstellung von unterschiedlichen

großtechnischenProdukten.[17]AusgehendvonCyclohexanol(1)sollindieserArbeitüberdieZwischen‐

stufe Cyclohexanon (2) die Synthese von ɛ–Caprolacton (3) mittels enzymkatalysierter Oxidation

erfolgen.FürdieDarstellungdesLactons3wirdzumeineneineAlkoholdehydrogenase(ADH)undzum

anderen eine Cyclohexanon‐Monooxygenase (CHMO) als Biokatalysator in einem Eintopf‐Prozess

eingesetzt(Abbildung1).

Die Synthese enantiomerenreiner Amine ist ein wichtiger Bestandteil bei der Entwicklung und

HerstellungneuartigerArzneimittelsowiebeiderOptimierungderSynthesewegebekannterpharma‐

zeutischerWirkstoffe.[18]FürdieDarstellungvon(S)‐AminenmithohenEnantiomerenüberschüssensoll

im Rahmen dieser Arbeit die kinetische Racematspaltung von racemischen Aminen mit Hilfe von

Lipasen als Biokatalysatoren untersucht werden. In Abbildung 1 sind die untersuchten Enzym‐

reaktionenaufgezeigt.

Abbildung1. BiokatalytischeReaktionen:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3)undRacematspaltungvonAminen.

2.1 EnzymkatalysierteOxidationvonCyclohexanol(1)

LactonesindcyclischeEster,vondenenε–Caprolacton(3)dasbekanntesteunddasgrößtekommerziell

erhältlicheist.LactonemitkleinererRinggrößewieβ–Propio‐,γ‐Butyro‐undδ‐Valerolactondienenals

BausteinefürPolyesterfürunterschiedlicheAnwendungen.[19]2003lagdieweltweiteProduktionvon


4

ɛ‐Caprolacton(3)bei40.000‐60.000t/a.[20]Etwa50%desproduziertenLactons3wirddurchRing‐

öffnungspolymerisationzuPolycaprolacton(PCL)verarbeitet,einemaliphatischenPolyester,derbio‐

resorbierbar und nicht toxisch für Organismen ist.[17] PCL ist unter physiologischen Bedingungen

biologischleichtabbaubarundfindetgroßeVerwendungalsBiomaterial‐ImplantatoderalsMatrixfür

Drug‐Delivery‐SystemeundinderTherapiefürKnochenregeneration.[17,21]WeitereAnwendungfindet

ɛ‐Caprolacton 3 als Precursor für die Caprolactam‐Synthese, welches für die Nylon‐6‐Produktion

benötigt wird, sowie in der Synthese von Urethan‐Beschichtungen, Elastomeren, Lösungsmittel‐

VerdünnernundFasern.[22]

Industriell wird Caprolacton (3) im sogenannten UCC‐Prozess (Union Carbide Corporation) durch

OxidationvonCyclohexanon(2)mitPeressigsäurebei50°CundAtmosphärendruckhergestellt.Die

üblichen Selektivitäten liegen bei 90% bezogen auf Cyclohexanon (2) und 85‐90% bezüglich Per‐

essigsäure.[23]DieindustrielleSyntheseweisteinigeökonomischeundauchökologischeNachteileauf.

DurchdieVielzahlderbenötigtenSynthese‐undAufreinigungsschritteistdieAbfallproduktionbeiden

industriellenProzessenenormhoch.ZudembenötigtdieReaktionsführunghoheTemperaturensowie

Trägergase. Erst zu Beginn des Jahres 2014 hat BASF die Preise von Caprolactam und Adipinsäure

aufgrundgestiegenerRohstoffpreiseerhöht.[24]

AusgehendvondeneinleitendenArbeitenvonWILLETSundSTAUDTistdasHauptzieldieserArbeitdie

WegbereitungzurVergrößerungdesReaktionsmaßstabesderOxidationvonCyclohexanol(1)überdie

Zwischenstufe Cyclohexanon (2) zum Produkt ε‐Caprolacton (3) mit elementarem Sauerstoff als

alleinigesOxidationsmittel in einemEintopf‐Prozess (Abbildung2).[25,26]Dabei soll dasHauptaugen‐

merkdieserArbeitaufdemSolvenz‐EngineeringzurVermeidungderProduktinhibierungliegen.

Abbildung2. Enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol (1) zu ɛ–Caprolacton (3) unterEinsatzvonLk‐ADHundCHMO.[26]

DieAlkoholdehydrogenaseausLactobacilluskefir (Lk‐ADH)unddieCHMOausAcinetobactercalcoa‐

ceticus(ECSMo‐1)wurdeninderLiteraturalseffektivsteBiokatalysatorenbeschriebenunddement‐

sprechendindieserArbeiteingesetzt.[25,26]AlseinzigesAbfallproduktdieserOxidationsreaktionwird

Wassererhalten.

An erster Stelle steht in dieser Arbeit die Etablierung einer stabilen Analytikmittels Gaschromato‐

graphie, um für die anschließenden enzymatischen Reaktionen die Umsätzemitmöglichst geringer

Schwankungsbreitezubestimmen.DesWeiterensollendieoptimalenBedingungenfürdieBiokatalyse


5

entwickeltwerden.ZielistdieEntwicklungeineseffizientenVerfahrensdurchVariationvonReaktions‐

zeit, Temperatur undWahl des Lösungsmittels. Auch die Verwendung von Adsorberharzen soll zur

insitu‐Produktentfernunguntersuchtwerden.DiezuoptimierendenParameterderStandard‐Reaktion

desCyclohexanols(1)zumLacton3sindinAbbildung3dargestellt.

Abbildung3. UntersuchungderenzymatischenDoppeloxidation.

2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen

EnantiomerenreineAminesindwichtigeBausteine füreinegroßeAnzahlanArzneimittel,Agro‐und

anderen Spezialchemikalien. Untersuchungen zeigten, dass etwa 40 – 50% der pharmazeutischen

Wirkstoffe chiraleAmineenthalten.[18] InderLiteratur ist diekinetischeRacematspaltungvon race‐

mischenaliphatischenundaromatischenAminenmittelsLipaseninvielfältigerAusführungbeschrie‐

ben.DieLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)wurdedabeialseffektivstesEnzymbeschriebenund

indieserArbeitverwendet.[27–29]DasamhäufigstenverwendeteracemischeAminzurRacematspaltung

istdasModelsubstrat1‐Phenylethylamin(rac‐4),welchesmitAcyldonorenwieEssigsäureethylester(5)

oderMethoxyessigsäurepropylester (6) inorganischenLösungsmittelnumgesetztwurde (Abbildung

4).[30,31]Zwarkönnendieerhaltenen(R)‐Amide,(R)‐7und(R)‐8,unddasresultierende(S)‐Amin(S)‐4

mitsehrhohenEnantiomerenüberschüssenerzieltwerden,jedochliegendieReaktionszeitenbeibiszu

60Stunden.DieReaktionsgeschwindigkeitdieserAcylierungenkannerhöhtwerden,wennAcyldonoren

wie6eingesetztwerden,dieinβ‐PositioneinHeteroatomtragen.DabeiwerdendiebestenErgebnisse

in Bezug auf Reaktionsgeschwindigkeit und Enantioselektivität mit Sauerstoff als Heteroatom

erhalten.[31]

Industriell findetdiekinetischeRacematspaltungvonAminenbereitsAnwendung.EinVerfahrenzur

AcylierungvonAminenwurdevonBASFSEpatentiert.[32]Seit2002wirddieenzymatischeRacemat‐

spaltungvonAminenimMaßstabvon>3500t/aproduziert.[4]


6

Abbildung4. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitbekanntenAcyldonorenunterEinsatzvonCAL‐B.[30,31]

In Vorarbeiten von SIMON hat sich das Malonsäurediethylester (9) als effizientester Acyldonor

dargestellt.[33,34]DabeikonntedasAmid(R)‐10unterdengewähltenStandard‐Reaktionsbedingungen

von80°CReaktionstemperaturnachnur4.5StundenmitvollständigemUmsatznahezuenantiomeren‐

reinerhaltenwerden(Abbildung5).

Abbildung5. Benchmark‐ExperimentzurenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).[33,34]

EinleitendeVersuchevonUTHOFFzeigten,dassdieRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethyl‐

ester (9) auch unter lösungsmittelfreien Bedingungen sehr gute Umsätze und Enantiomerenüber‐

schüssebeiniedrigerenReaktionstemperaturenliefert.[35]ImRahmendieserArbeitsolldieRacemat‐

spaltungmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterlösungsmittelfreienBedingungenweiter

etabliertwerden. Durch die Variation vonwichtigen Parametern, unter anderem vonReaktionszeit,

Temperatur,EnzymbeladungsowieSubstratkonzentration, istdasZieldieserArbeitdieOptimierung

der enzymkatalysierten kinetischen Racematspaltung hinsichtlich hoher Umsätze und Enantioselek‐

tivitäten. Da sich die CAL‐B durch eine Akzeptanz eines breiten Substratspektrums auszeichnet[4],

werdenimRahmendieserArbeitunterschiedlicheAminegetestet.ZusätzlichsollderAcyldonorvariiert

werden. Außerdem sollte der Prozess eine hohe Selektivität und Reaktionsgeschwindigkeit sowie

möglichst quantitative Umsätze aufweisen. Die Verwendung eines lösungsmittelfreien Reaktions‐

systemsisteingroßerSchritthinsichtlichder„grünen“Chemie,dadasorganischeLösungsmitteleinen


7

großen Teil der Abfallmenge einer kinetischen enzymatischen Racematspaltung ausmacht.[36] Die

meistenorganischenMedienhabenverschiedeneNachteile,unteranderemdieToxizitätfürdieUmwelt

sowiepotentielleExplosionsgefahraufgrundihrerFlüchtigkeitundEntflammbarkeit.[37]InderLiteratur

wurdevoneinerverringertenReaktionszeitderRacematspaltung inAbwesenheitvonLösungsmittel

berichtet, was aus ökonomischer Hinsicht vorteilhaft ist.[36] Die zu optimierenden Parameter der

kinetischenRacematspaltungwerdeninAbbildung6amBeispielderRacematspaltungdesAminsrac‐4

mitMalonester9alsStandard‐AcyldonorzumentsprechendenAmid(R)‐10dargestellt.

Abbildung6. UntersuchungderenzymatischenRacematspaltung.

3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen

9

3 EnzymatischeOxidationmittels

Monooxygenasen

3.1 ChemischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation

3.1.1 KlassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation

VONBAEYERundVILLIGERberichtetenimJahre1899mitderRingöffnung„vonKetoneninderTerpen‐

gruppe“.[38]DabeiwurdensieaufBeobachtungenvonCAROaufmerksam,dereinJahrzuvordieOxidation

vonAnilin zuNitrosoaminmitdemstärksten zuderZeit bekanntenOxidationsmittel,H2SO5, durch‐

führte,welcheserauskonzentrierterSchwefelsäureundKalimpersulfatherstellte(Abbildung7).[39]

Abbildung7. SynthesedesCARO’schenReagenz(H2SO5).[39]

DiesesOxidationsmittelwandtenVONBAEYERundVILLIGERaufdieTerpen‐Derivateanund„fanden,dass

dasCARO’scheReagenzeinebensospezifischaufKetonewirkendesMittel ist,welchesgestattet,eine

ReihevonbisherunausführbarenAufgabenspielendleichtzulösen“.[38]Sokonntensieunteranderem

Menthon, Tetrahydrocarvon und Campher in die entsprechenden ε‐Caprolactone überführen

(Abbildung8).

Abbildung8. BAEYER‐VILLIGER‐OxidationvonMenthon(A),Tetrahydrocarvon(B)undCampher(C)mitdemCARO’schenReagenz.[38,40]


10

Sie schlussfolgerten, dass das hypothetisch gebildete Oxidationsprodukt „Syperoxid“, ähnlich einer

BECKMANN‐Umlagerung vonOximen, zu den Lactonen umgewandeltwird.[38] In ihrer Studie zurOxi‐

dation von 13‐ bis 17‐gliedrigen ringförmigen Ketonen mit dem CARO’schen Reagenz untersuchten

RUZICKA und STOLL im Jahre 1928 erstmals den Einfluss von Temperatur und Lösungsmittel.[41] Die

bestenErgebnisseerhieltensiebeiTemperaturenvon50–65°CinEisessig.DieBildungvonOligomeren

alsNebenproduktekonntebeiniedrigenTemperaturenvermiedenwerden.

Die ersten Vorschläge zum Ablauf der Reaktion reichten von dem von VON BAEYER und VILLIGER

vorgeschlagenenDioxiran‐Mechanismus[38]überdieBildungeinesPeroxid‐DimersalsNebenprodukt[42]

biszumWITTIG‐Mechanismus[43]mitderformalenÜbertragungeinesOH+‐TeilchensvoneinerPersäure

11 zumCarbonylsauerstoffdesKetons12.EinenweiterenAnsatz lieferteCRIEGEE1948,alsereinen

nucleophilen Angriff der Persäure 11 auf die Keto‐Funktion postulierte, wodurch das sogenannte

CRIEGEE‐Intermediat13gebildetwird.[44]ImJahre1953schließlichkonntenDOERINGundDORFMANdurch

IsotopenmarkierungsexperimentedieTheorievonCRIEGEEbestätigen,indemsie18O‐markiertesBenzo‐

phenon (12) einer Oxidationmit Persäure11 aussetzten und dadurch die Position desmarkierten

SauerstoffatomsimProdukt14bestimmenkonnten(Abbildung9).[45]

Abbildung9. Isotopenmarkierungsexperimente zur Aufklärung des Mechanismus der BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.[40] Dargestellt sind die nach den oben vorgeschlagenenMecha‐nismenzuerwartendenReaktionsprodukte.

Im Fall der Dioxiran‐Bildung (15) nach VON BAEYER und VILLIGER wurde eine statistische 50:50‐

Verteilung erwartet.[40] Sollte die Reaktion über das CRIEGEE‐Intermediat (13) laufen, somüsste das

markierteSauerstoffatomTeilderKeto‐Funktionsein.TatsächlichenthieltdieCarbonylfunktionzu93%

18O‐Sauerstoff.DasProduktdersäurekatalysiertenAdditioneinerPersäureaneineCarbonylfunktion

wirdallgemeinalsCRIEGEE‐Intermediatbezeichnet.DieseAdditionkannhierbeisowohlSäuren‐alsauch


11

Basen‐katalysiertablaufen.DieSäure‐EinheitfungiertdabeinachdemnucleophilenAngriffalsAbgangs‐

gruppe, während die Carbonylfunktion wieder hergestellt wird und ein Rest (RM) vom Carbonyl‐

KohlenstoffzumpositivpolarisiertenSauerstoffwandert,wodurchderEstererhaltenwird(Abbildung

10). Als klassische organische Persäuren dienen unter anderem m‐Chlorbenzoesäure (m‐CPBA),

TrifluorperessigsäuresowiePeroxybenzoesäure(PBA).

Abbildung10. ReaktionsmechanismusderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationmiteinerPersäure(RM=wan‐dernderRest,RR=verbleibenderRest,RL=Abgangsgruppe).[46]

ImFallderOxidationeinesasymmetrischenKetonswandertamwahrscheinlichstendiejenigeGruppe,

diediepartiellepositiveLadungambestenstabilisierenkann.[40]SokanndieWanderungstendenzim

allgemeinenwiefolgtdefiniertwerden:tert‐Alkyl>Cyclohexyl>sec‐Alkyl>Benzyl>Phenyl>prim‐

Alkyl>Cyclopentyl,Cyclopropyl>Methyl.[46]SinddiebeidenRestegleichoderähnlich,dannwirdein

Gemisch aus beiden möglichen Estern erhalten. Sterische Ansprüche der Reste sowie sie Art der

verwendeten Persäure spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle. Demnachmuss im CRIEGEE‐Inter‐

mediat ein nicht‐bindendes freies Elektronenpaar des Sauerstoffatoms sowie die O‐O‐Bindung anti‐

periplanarzumwanderndenRestRMstehen(Abbildung11).[47]

Abbildung11. Antiperiplanare Anordnung des wandernden Restes im CRIEGEE‐Intermediat (RM=wandernderRest,RR=verbleibenderRest,RL=Abgangsgruppe).[47]

TURNERbeobachtetebereits1950amBeispielderOxidationvonsowohlcis‐alsauchtrans‐1‐Acetyl‐2‐

Methylcyclohexan (17), dass dabei nur das jeweilige cis‐ bzw. trans‐Produkt (18) gebildet wird

(Abbildung12).[48]

Abbildung12. ErsterBeweisderErhaltungderKonfigurationdeswanderndenResteswährendderBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.[48]


12

BERSONundSUZUKIschlugen1959vor,dassdieWanderungdesRestesunddieCarboxylatabspaltung

konzertiert ablaufen und nannten dieses als Grund für die Stereoselektivität der Reaktion.[49] Die

BeobachtungenzurStereoselektivitätderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationwurdenvonMISLOWundBRENNER

bestätigt,indemsiedasoptischaktive3‐Phenyl‐2‐butanon(20)oxidiertenunddabeieineRetentionvon

98% erhielten (Abbildung 13).[50] Die Retention der Stereoinformation macht die BAEYER‐VILLIGER‐

OxidationzueinemwichtigenWerkzeugfürdieasymmetrischeorganischeSynthese.

Abbildung13. Reaktionssequenz zur Bestätigung des Erhalts der Retention des wanderndenKohlenstoffatomsdesoptischaktivenKetons20.[50]

3.1.2 StandderWissenschaft:klassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation

ObwohlmehralseinJahrhundertseitEntdeckungderBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationvergangenist,istein

Ende der Entwicklung derReaktion noch nicht abzusehen. In der Industrie findet die Synthese von

ɛ‐Caprolacton (3) großtechnische Anwendung. Dabei spielten in den letzten Jahrzehnten neben der

OptimierungderReaktionsbedingungenauchUmweltaspekteeineimmerwichtigereRolle.

ImAllgemeinenwerdendiebisherverwendetenPersäureninsituausdenentsprechendenSäurenund

Wasserstoffperoxid (H2O2, 90%) hergestellt,welches jedochwegen der hohen Explosionsgefahr aus

demHandelgenommenwurde.[51,52]Dasheuteerhältliche70%igeH2O2liefertjedochnurPersäurenmit

geringerer Konzentration. Die Verwendung von Persäuren erfordert den Einsatz geeigneter Kataly‐

satoren.KatalytischeVerfahrenhabengegenüberdenbisherangewendetenstöchiometrischenReak‐

tionenmehrereVorteile,wiedieVereinfachungderReaktionsbedingungenunddenEinsatzvonkosten‐

günstigerenReagenziensowieVerringerungderAbfallmenge.AllerdingsfälltalsNebenproduktWasser

an,waszurHydrolysederentstandenenEsterführenkann.VerwendeteKatalysatorenenthaltenunter

anderemKomplexederÜbergangsmetalleMo(VI)[53],Re(V)[54–56],Pt(II)[57],Ni(II)[51,52],Se[58]sowieTi‐

Silicate[59,60].EinBeispielfüreinemetallkatalysierteBAEYER‐VILLIGER‐OxidationistinAbbildung14dar‐

gestellt.


13

Abbildung14. VorgeschlagenerMechanismusderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationdurcheinenRe‐Kata‐lysator(23)amBeispielvonCyclobutanon(25).[56]

Anstelle von Wasserstoffperoxid wird seit 1991 auch elementarer Sauerstoff in Kombination mit

BenzaldehydalsOxidationsmitteleingesetzt,welchesalsMUKAIYAMA‐Systembezeichnetwirdunddas

Keton selbst aktiviert.[61] Die Oxidation kann bei Raumtemperatur durch die Übergangsmetalle

Ni(II)[62,63],Cu(II)[63,64]oderFe2O3[65]katalysiertwerden.AllerdingsistderEinsatzsolcherKatalysatoren

vorwiegendaufdieOxidationvoncyclischenKetonenbeschränktundliefernteilweisenurgeringebis

mäßigeStoffumsätze,waszumTeildurchInaktivierungdesKatalysatorsdurchdenzurentsprechenden

Säure hydrolysierten Ester zurückzuführen ist. 1993wurde vonBOLM undKANEDA gezeigt, dass die

BAEYER‐VILLIGER‐OxidationmitdiesemSystemselbstinAbwesenheiteinesKatalysatorsnochmitguten

Umsätzenverläuft,wobei jedocheinÜberschuss anAldehyd sowiedieVerwendungvonchlorierten

Lösungsmittelnnotwendigist.[63,66]

AlternativeAnsätzewiebeispielsweisederEinsatzvonrecyclisierbarenmesoporösenMaterialien,z.B.

Fe‐MCM‐48[67], Fe‐Porphyrin‐Systemen[68] sowie die Oxidation mit Zinn‐ oder Titan‐haltigen β‐Zeo‐

lithen[60,69,70]undzahlreichenweiterenheterogenenZinn(IV)‐Spezies[71],Hydrocalcite[72],Heteropoly‐

oxometalate[73], organische Ionenaustauscherharze[74] sowie organische Acridinium‐Systeme[75],

konntenmit guten bis sehr guten Umsätzen durchgeführt werden. Um die Bildung vonWasser als

NebenproduktundsomitHydrolysedesgebildetenLactonszuvermeiden,wurdenBis(trimethylsilyl)‐

monoperoxidsulfat[76,77]sowie Peroxodisulfat‐Salze(S2O82‐)[78]alsOxidationsmittelanstellevonH2O2

verwendet,wassowohldieAusbeutealsauchdieReinheitdesProdukteserhöhte.2009wurdedieses

System in Kombination mit ionischen Flüssigkeiten noch weiter optimiert.[77] Auch mit anderen

KatalysatorenfandenionischeFlüssigkeitenbereitsAnwendung.[55,70]UmdenEinsatzvonhalogenierten

Lösungsmitteln zu vermeiden konnten erfolgreich auf Silica‐immobilisierten Persäuren in über‐

kritischen Kohlenstoffdioxid eingesetzt werden.[79] Im Jahr 2011 fand auch Oxon, das Triple‐Salz

2KHSO5.KHSO4.K2SO4, erneut Anwendung in Kombination mit einem Phasentransfer‐Katalysator,

welchesineinemZweiphasensystembereitsnach6Stundenbei40°CguteUmsätzelieferte.[80]

Es sind auchVorschläge veröffentlichtworden, Lactone direkt aus den entsprechenden sekundären

Alkoholenzusynthetisieren.2013verwendetenMENGetal.PerameisensäurealsOxidationsmittelund

konnten beispielsweise ɛ‐Caprolacton (3) nach 65MinutenReaktionszeitmit vollständigemUmsatz

erhalten.[81]AllerdingswirddabeidasSubstratineinerKonzentrationvon0.2MunddieSäureineinem

etwa20fachenÜberschusseingesetzt.DesWeiteren findenbeiderDoppeloxidationvonsekundären

AlkoholenionischenFlüssigkeitenundMikrowellen[82],Nafion‐H®[83]oderorganischeKatalysatoren[84]

Anwendung.JedochsindauchindiesenFällendieUmsätzebeilangenReaktionszeitennurmäßigund

die Verwendung vonPeroxo‐Verbindungen ist vomökologischen Standpunkt aus nachteilig imVer‐


14

gleich zur Enzymkatalyse, bei der eine Zugabe vonweiterenKatalysatoren nicht notwendig ist. Des

Weiteren dient elementarer Sauerstoff bei enzymkatalysierten Oxidationsreaktionen als Oxidations‐

mittel.

3.1.3 StereoselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation

Katalysatorensolltenzusätzlichzu ihrenKatalyseeigenschaftenauchdieFähigkeitbesitzen,enantio‐

selektiveOxidationsreaktionenzukatalysieren.SoberichteteSTRUKULbereits1994voneinerOxidation

mit chiralen Pt(II)‐Komplexen, mit denen unterschiedliche 2‐substituierte cyclische Ketone zu den

entsprechendenLactonenmitee‐Wertenvonbiszu58%umgesetztwerdenkonnten(Abbildung15).[85]

Abbildung15. EnantioselektiveBAEYER‐VILLIGER‐OxidationmitchiralemKatalysator.[85]

SpäterkonntedurchdenEinsatzvonPt(II)‐oderCo(Salen)‐KomplexenundTensiden inWasserder

Enantiomerenüberschussauf90%gesteigertwerden.[86,87]InderheutigenZeitwerdenhoheUmsätze

mit mäßigen bis guten ee‐Werten durch Verwendung von chiralen enantiomerenreinen Organo‐

katalysatoren[88]oderchiralenMetallkomplexenderÜbergangsmetalleCo[87],Cu[89],Pd[90],Pt[91],Zr[92],

Hf[93]oderMg[94]undAl[95]erhalten.

AuspräperativerSichtscheintdennochdieVerwendungchiralerÜbergangsmetallkatalysatorenfürdie

enantioselektiveSynthesevonEsterninmittlererbishoheroptischerReinheitdieeinzigeaussichtsreise

Alternative zur Katalyse durch Enzyme zu sein.[51,52] Der Nachteil der meisten der genannten

Katalysator‐SystemeistjedochdiegeringeSubstratbreite,danurcyclischeKetoneumgesetztwerden

können.DesWeiterenmüssen sieaufwendig synthetisiertwerden, liefernniedrigeUmsätzeunddie

ReaktionenmüsseninorganischenLösungsmittelndurchgeführtwerden.


15

3.2 EnzymkatalysierteSynthesen

3.2.1 EnzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation

DerEinsatzvonEnzymenbietetimVergleichzudenobengenanntenorganischenKatalysatorenviele

VorteileinHinblickaufdieRegio‐,Chemo‐undEnantioselektivität.

1995beschriebROBERTSeinedurchdieLipaseBderCandidaantarctica (CAL‐B)katalysierteBAEYER‐

VILLIGER‐OxidationvoncyclischenKetonen.[96]DieCAL‐BisthierbeijedochnichtdirektanderOxidation

desKetonsbeteiligt,sondernkatalysiertdieBildungeinerPersäure,ausgehendvoneinerlangkettigen

Carbonsäure mit Wasserstoffperoxid. Die eingesetzten 2‐ und 3‐substituierten Cyclopentanone

und‐hexanonewurdensozuracemischenLactonenoxidiert.DiedabeierhaltenenAusbeutenlagenbei

57–73%undwarennurgeringfügigniedrigeralsdieaufklassischemWegerhaltenen.EineAusnahme

stellte jedoch 2‐Oxocyclohexanessigsäure (28) dar, bei der durch intramolekulare BAEYER‐VILLIGER‐

OxidationdasentsprechendeLacton29beieinemUmsatzvon54%einEnantiomerenüberschussvon

21% ee erhalten werden kann (Abbildung 16). Der Grund für die Enantioselektivität der Reaktion

scheintdieetwasschnellereAcylierungdesEnzymsdurcheinsderbeidenEnantiomerezusein,sodass

diePersäureimAnschlussdarandieintramolekulareReaktiondurchläuft.DielangenReaktionszeiten

vonetwaeinerWocheunddasaufwändigeEntfernenderentstandenenSäurebedürfenweitererOpti‐

mierung.

Abbildung16. EnantioselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationvon2‐Oxocyclohexanessigsäure(28)katalysiertdurchLipaseBderCandidaAntarctica(CAL‐B).[96]

Ähnlichverläuftdie2007vonOLIVObeschriebeneOxidation,derzusätzlichdenKomplexUreahydrogen‐

peroxidinEssigester5einsetzte.[97]DerVorteilhierbeiwardieVermeidungderHydrolysedesLactons

durchAbwesenheitvonWasseralsNebenprodukt.EskonntensoLactonemitee‐Wertenvon20‐60%

undUmsätzevon20–50%nachetwazweiTagenerhaltenwerden.

EinenalternativenWeggingenGUIBÉ‐JAMPELetal.,aufbauendauffrühereArbeitenvonKIRK[98],mitder

autokatalytischenOxidationvonKetonen(Abbildung17).[99]DabeisollteWasserstoffperoxidmithilfe


16

vonCarboxyl‐SeitengruppendesEnzymsdieBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationstarten.DasgebildeteLacton3

sollte eine CAL‐B‐katalysierte Perhydrolyse zur Peroxysäure 30 durchlaufen, die wiederum die

OxidationvonweiteremKeton2 katalysierenkann,wodurchein autokatalytischerProzess erhalten

wird. Der niedrige Umsatz von 20% konnte durch Ersatz des klassischen H2O2/H2O‐System durch

Ureaperoxidnach48StundenReaktionszeit65%Umsatzgesteigertwerden.ImFallvonsubstituiertem

CyclohexanonliegendieEnantiomerenüberschüssedererhaltenenLactoneauchhierbeinurzwischen

10und70%ee.

Abbildung17. Lipasenkatalysierte Perhydrolysemit anschließender chemischer BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation mittels Autokatalyse am Beispiel von Cyclohexanon (2) nach GUIBÉ‐JAMPEL.[99]

3.2.2 BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen

3.2.2.1 Allgemeines

HöhereAusbeutenundhöhereEnantiomerenreinheitkönnendurchdenEinsatzvonBAEYER‐VILLIGER‐

Monooxygenasen (BVMOs, EC 1.13.14.x) erzielt werden.[100] Dadurch lässt sich im Gegensatz zu

chemischenoderLipasen‐katalysiertenReaktionenauchdieVerwendungvonWasserstoffperoxidoder

PersäurenalsOxidationsmittelundorganischeLösungsmittelvermeiden,dadieMonooxygenasenmit

molekularemSauerstoffinwässrigemMediumaktivsind.DesWeiterensindsieinderLage,nichtnur

cyclische, sondern auch aliphatische und aromatische Ketone in die entsprechenden Ester umzu‐

wandeln.DieEpoxidierungvonC=C‐Doppelbindungen[101]sowieunteranderemdieSulfoxidation[102],

Phosphoxidation[103], Aminoxidation[104], Boronsäurenoxidation[105] und Selenoxidation[106] können

ebenfallsdurchBVMOskatalysiertwerden.

Die BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen gehören zu einer Superfamilie, die drei Klassen von flavin‐

abhängigen Monooxygenasen umfassen: die sogenannten Flavin‐enthaltenden Monooxygenasen

(FMOs), die N‐hydroxylierenden Monooxygenasen (NMOs) und die BVMOs.[107] Monooxygenasen

werdenanhanddervonihnenbenötigtenCofaktorenunterteilt.MonooxygenasenvomTypIsindFlavin‐

abhängigundbenötigenNADPHalsElektronenquelle,währendEnzymedesTyps IIFMNundNADH


17

brauchen,hauptsächlichHeteroatomeoxidierenundeukaryotischemUrsprungssind.[108]DieTypenIII

und IV von Monooxygenasen sind kupferabhhängige bzw. eisenhaltige Enzyme.[109,110] BVMOs vom

TypOsindeinneuartigerBVMO‐Typ,dieebenfallsFADundNADPHbenötigen.[111]Strukturellunter‐

scheidensiesichjedochvondenBVMOsvomTypI,dasienichtdasfürBVMOscharakteristischekonser‐

vierteSequenzmotiv(vgl.Abschnitt3.2.2.2)besitzenundnur8%ÜbereinstimmungzurPAMOzeigen.

AllebisherkloniertenBVMOsgehörendemTypIan.

Die BVMOs aktivieren reduktiv Sauerstoff (O2) und bauen diesen in ein Substrat ein. Siewerden in

MonooxygenasenundDioxygenaseneingeteilt.[109,110]DabeiführenMonooxygenasen,zudenenauchdie

BVMOs zählen, ein Sauerstoffatom in das Substrat ein; das zweite Sauerstoffatom wird zu Wasser

reduziert(Abbildung18).DioxygenasenhingegeninserierenbeideAtomedeselementarenSauerstoffs

indasSubstrat.

Abbildung18. BAEYER‐VILLIGER‐OxidationeinesKetonskatalysiertdurchBVMO.[112]

Die ersten Anzeichen für eine enzymatische BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation wurden von TURFITT 1948

währendseinenStudienzuSteroid‐SyntheseinPilzenentdeckt.[113]1953konntendieArbeitsgruppen

vonFRIEDundPETERSONinderSynthesevonTestololacton(32),ausgehendvonProgesteron(33),zwei

Reaktionsschrittenachweisen,diedurchdieMonooxygenaseausCyclindrocarponradicolakatalysiert

werden(Abbildung19).[114,115]

Abbildung19. SchematischerSynthesevonProgeston(33)zuTestololacton(32).[116]DiedurchBVMOkatalysiertenSchrittesindmitSternchengekennzeichnet.


18

DieersteVerknüpfungzwischenderLactonisierungvonSteroiden,derbiochemischenOxidationvon

CampherdurcheinBakteriumundder chemischenBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation erstelltenPRAIRIEund

TALALY 1963.[117] Durchweiteremechanistische StudienwurdeNADPH als essenzieller Cofaktor für

dieseArtderOxygenaseidentifiziert.[118]

BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen tretenvorwiegend inMikroorganismenaufundsinddortankata‐

bolischenVorgängenbeteiligt,etwaindenPilzenCylindrocarpon[113–115],Exophiala[119],Xanthobacter[120]

und Aspergillus[121] und in den Bakterien der Gattungen Cormamonas (ehemals Pseudomonas)[122],

Nocardia[100],Rhoddococcus[123],Gordonia[124],Mycobacterium[125]undAcinetobacter[126].Aberauchbei

höherenOrganismensindMonooxygenasenanzutreffen,beispielsweisebeiderSynthesevonSteroiden

undIridoideninPflanzen[127]odervonToxineninSchalentieren[128].InBakterienscheintdienatürliche

RollederMonooxygenaseninderKatalysevoneinemodermehrerenwichtigenSchrittenimoxidativen

Katabolismuszuliegen,währenddieseEnzymeinPilzeneineschwacheRolleimWechselzwischendem

Primär‐unddemSekundärmetabolismusspielen.[129]

3.2.2.2 StrukturundMechanismus

WALSHetal. konnten1988anhandderOxidationvonCyclohexanon (2) zuɛ–Caprolacton (3)durch

CHMOausAcinetobactercalcoaceticusdenMechanismusderReaktionaufklären(Abbildung20).[109,110]

ImerstenSchrittdesMechanismuswirddasenzymgebundeneFlavin(34)durchdenCofaktorNADPH

reduziertundderEnzym‐Cofaktor‐Komplex35gebildet,welchermolekulareSauerstoffbindet.[130]Das

so entstandene C4a‐Peroxyflavin (36) greift, ähnlich wie die Persäure in der chemischen BAEYER‐

VILLIGER‐Oxidation, nucleophil andie CarbonylfunktiondesKetons2 an.[12]DieBildungdesCRIEGEE‐

Intermediats37istdergeschwindigkeitsbestimmendeSchritt.[130]BeideranschließendenUmlagerung

müssen die stereoelektronischenVoraussetzungender antiperiplanarenAnordnung derO‐O‐Einheit

sowiedassynchroneWanderndesRestes,wiebeidemPeroxid‐Mechanismus(Abbildung11,Abschnitt

3.1.1), stimmen. Das C4a‐Hydroxyflavin (38)wird hydrolysiert und das oxidierte Flavin39 für den

nächstenkatalytischenZyklusregeneriert.NADPH,welcheswährendeinesReaktionszyklusalserstes

amEnzymgebundenwirdundmitdemFlavin34reagiert,wirdbiszumletztenSchrittalsNADP+im

aktivenZentrumgehalten.


19

NH

N

NH

N

O

OR

OO

NH

N

NH

N

O

OR

OO

NADP

O

NH

N

NH

N

O

OR

HO

NADP

O

O

N

N

NH

N

O

OR

NADP

O

ON

N

NH

N

O

OR NADP

N

N

NH

N

O

OR

NH

N

NH

N

O

OR

NADP

O2

H2O

O

O

36C4a‐

Peroxyflavin

38C4a‐

Hydroxyflavin

H+

37

1 23

4

56a 4a7

89

9a10

10a

6

O

2

3 3

3

34

35

39

NADPH

NADP

CRIEGEE‐Intermediat

39

NADP

Abbildung20. MechanismusderenzymatischenBAEYER‐VILLIGER‐OxidationamBeispielvonCyclo‐hexanon(2)bezogenaufPAMO.[130]

WALSH et al. untersuchten 1982 die Fähigkeit der CHMO zur Oxidation von Heteroatom‐Verbin‐

dungen.[131] Der ambivalente Charakter des C4a‐Peroxyflavins 36 ist demnach der Grund für die

katalytischeAktivitätgegenüberelektronenreichen,z.B.Ketone,alsauchelektronenarmenSubstraten,

wie Sulfide (Abbildung 21).[116,132] So greift die Schwefelverbindung 40 die C4a‐Peroxy‐Spezies 36

nucleophilan,imUnterschiedzuderOxidationeinesKetons,beiderdasPeroxyflavin36alsNucleophil

agiert.


20

Abbildung21. AmbivalenteReaktivitätderC4a‐Peroxyflavins36gezeigtanderSulfid‐(links)undBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation(rechts).[116,132]

BiochemischeStudienanBVMOssindaufgrundderenrelativgeringenAnzahl,dergeringenStabilität

und/oderderschwierigenAufreinigungsehrrar.[133]DieambestenuntersuchteMonooxygenaseistdie

Cyclohexanon‐Monooxygenase(CHMO,EC1.14.13.22)vomStammAcinetobactercalcoaceticusNCIMB

9871aufgrundihrerkatalytischenundkinetischenEigenschaften.[130]DasEnzymhateineMolekülmasse

vonetwa59kDaundbestehtauseinereinzelnenPolypeptidkette,dieeinMolgebundenesFADenthält,

welchesauchnachderAufreinigungnichtabgetrenntwird.[100] ImAcinetobacter‐Bakterium,welches

natürlich in mariner Umgebung vorkommt, ist es im biologischen Abbau von Cyclohexanol (1), zu

Adipinsäure (41) beteiligt, indem es Cyclohexanon (2) zu ε–Caprolacton (3) oxidiert (Abbildung

22).[112,134] Weitere Oxidation der Adipinsäure (41) durch β‐Oxidation liefert Acetyl‐ und Succinyl‐

CoenzymA.Cyclohexanol (1)selbst isteinAbbauproduktvonCyclohexan,welchesderCHMOsowie

weiterenMonooxygenasenalsKohlenstoffquelledientundzudenüber1000BestandteilenvonErdöl

gehört.[135]DieseCHMOakzeptierthundertevonunterschiedlichenKetonenundweistsomiteinaußer‐

gewöhnlich breites Substratspektrum in Kombination mit einer sehr hohen Regio‐ und Enantio‐

selektivitätauf.[136]

Abbildung22. KatabolischerAbbauvonCyclohexanol(1)zuAdipinsäure(41)imBakteriumAcinetobactersp.[134]

AufgrundderInstabilitätderCHMOwaresallerdingslangeZeitnichtmöglich,eineKristallstrukturdes

Enzymszuerhalten,dieeinenEinblick indie strukturellenDetailsdesEnzymsgebenwürden.2002


21

verglichenFRAAIJEetal.verschiedenesequenziertebakterielleBVMOsundstießendabeiaufeinkonser‐

viertesSequenzmotiv(FxGxxxHxxxW).[107]MitdiesenDatenkonntensiedieSuperfamiliederBVMOs

enthüllen.ZweiJahrespäterveröffentlichtedieselbeGruppeeineKristallstrukturvonderPhenylaceton‐

Monooxygenase(PAMO,EC1.14.13.92)ausThermobifidafusca,einemungewöhnlichstabilenundhitze‐

beständigenEnzym,dasjedochnureinensehrengenSubstratbereichhat(Abbildung23).[137]

Abbildung23. KristallstrukturvonPAMOausThermobifidafusca.[138]DieFAD‐Domäneistgrün,dieNADPH‐Domäneistblau,dasArg337istzentriertdargestellt.

PAMOisteinMonomermiteinerMolekülmassevon62kDa,welchesdieOxidationvonPhenylacetonzu

Phenylessigester katalysiert, undweist eineHomologie von 40.3% zur CHMO vonAcinetobacter sp.

auf.[116,137]DieKristallstrukturwurdemitgebundenemFAD,jedochinAbwesenheitvonCofaktorund

Substrat, aufgeklärt. Für PAMO wurde eine Multidomänen‐Struktur, bestehend aus einer FAD‐

bindendenundeinerNADPH‐bindendenDomäne,vorgeschlagen.DasaktiveZentrumbefindetsichin

direkterNachbarschaftzudenbeidenDomänen.DasFlavinisttiefinderFAD‐Domäneverborgenund

durchVANDERWAALS‐undWasserstoffbrückenbindungenfixiert.DiesesstimmtmitderBeobachtung

überein,dassFADnichtvomEnzymdissoziiert,währendNADP+zwischenderFAD‐undderNADPH‐

Domäne eingekeilt ist. Bemerkenswert ist, dass sich das Sequenzmotiv der BVMO nicht im aktiven

Zentrumbefindet, sondern ineinerSchleife,diediebeidenDomänenverbindet.DasaktiveZentrum

enthält zudem die Aminosäure Arg337, der die Funktion zugeschriebenwird, das negativ geladene

Flavin‐Peroxid‐Intermediat35durchWasserstoffbrückenbindungenzustabilisieren.

Arg337 ist außerdem nicht in einer einzelnen Konformation fixiert, sondern besitzt eine inhärente

Flexibilität.ImLaufedesKatalysezyklusnimmtArg337zweiKonformationenein:die„IN“‐Position,wie

es in der erhaltenenKristallstruktur beobachtetwurde, bei der das Flavin stabilisiertwird, unddie

„OUT“‐Position, inderderCofaktorangrenzendzumFlavinpositioniertwird.DieÜbertragungeines

Hydrid‐IonsvomNicotinamid‐RingzumFADfindetfolglicherstnacheinerKonformationsänderungim

Enzym statt. Mutagenese‐Studien zeigten, dass die Mutation des Arginin‐Restes zu Alanin zu einer


22

vollständigenInaktivierungdesEnzymsführt.[137,139]DieMutationbeeinflusstzwarnichtdieWechsel‐

wirkungendesEnzymsmitdemCofaktor, jedochschaltetesdieFähigkeitaus,Sauerstoff zubinden.

DieseszeigtdieBedeutungdesArginin‐ResteszurStabilisierungdesnegativgeladenenPeroxid‐Flavins

36.

MIRZAetal.löstenschließlicheineKristallstrukturderCyclohexanon‐MonooxygenaseausRhodococcus

sp.vomStammHI‐31(CHMORhodo.)inzweiverschiedenenZuständen,deroffenenunddergeschlossenen

Form,mit FAD undNADP+ auf (Abbildung 24).[140] Diese CHMO ist ein stabiles,monomeres Enzym,

welches ebenfalls FAD‐ und NADPH‐Domänen besitzt und zu 55% identisch mit der CHMO aus

Acinetobactersp.ist.WerdennunbeideKristallstrukturenderCHMORhodo.übereinandergelegt,soergibt

sichein„äquivalentesAtom‐Vektordiagramm“,dasdieVerschiebungderAtompositionenillustriert.[140]

WährenddieFAD‐Domäneunverändertbleibt,rotiertdieNADPH‐unddieHelix‐Domäneumetwa5°

bzw. 3°, was zu einer Verschiebung um 5Å bzw. 2Å von Resten führt, dieweiter entfernt von der

Rotationsachse sind. Durch diese Rotation wird der Cofaktor seitlich näher zum Flavin geschoben,

sodassderbenötigteHydridtransferstattfindenkann.

Abbildung24. KristallstrukturderCHMOvonRhodococcus sp.HI‐31 (links); dieFAD‐Domäne istbeige,dieNADPH‐Domäneistblau,dieLinker‐Regionistgrün,dieflexibleSchleifeistorange,dieHelix‐Domäneistbraun,dasBVMO‐Sequenzmotivistgelbdargestellt.[140]ÄquivalentesVektordiagrammderselbenCHMO(rechts).

Obwohlschonlangebekanntist,dassdieCHMOvonAcinetobactersp.vieleKetonemitguterRegio‐und

Stereoselektivität umsetzen kann,warwenig über ihre Chemoselektivität bekannt.Die Chemoselek‐

tivität ist „die bevorzugte Reaktion eines chemischen Reagenz‘mit einem von zwei odermehreren

unterschiedlichenfunktionellenGruppen“.[141]VoreinigenJahrenwurdebeschrieben,dassdieOxida‐

tionbevorzugtanderCarbonyl‐Funktionstattfindet,wenneineweitereoxidierbareFunktion,beispiels‐

weiseeinAlkenoderThioether,enthaltenist.WALSHschlugvor,dassα,β‐ungesättigteKetonenichtvon

derCHMOumgesetztwerdenkönnen.[109,110]DieseTheoriewurdevonOTTOLINAbestätigt,derzeigte,

dassbeiderchemoselektivenOxidationdesracemischenDiketonsrac‐44dasLacton(S)‐45mit35%

UmsatzinenantiomerenreinerFormerhaltenwurde(Abbildung25).[142]


23

Abbildung25. ChemoselektiveOxidationeinesracemischenDiketonsrac‐44mitCHMOnachOTTOLINA.[142]

ImFalleeineszweifachsubstituiertenCyclohexanon‐RingsnimmtderEnergieunterschiedimmerweiter

ab,jeähnlichersichdiebeidenRestesind.DadurchverschwimmtderEnergieunterschiedderbeiden

möglichenCRIEGEE‐IntermediateundbeideEnantiomerewerdengebildet.[136]

Wieschonbeschriebenwurde,könnenauchheterocyclischeVerbindungenwieThioether(40)durch

Monooxygenasenoxidiertwerden.BefindetsichjedocheineKeto‐FunktioninderselbenVerbindung,so

findeteineOxidationausschließlichdortstatt(Abbildung26).SelbstnachVerlängerungderReaktions‐

zeitkonntekeineOxidationdesHeteroatomsfestgestelltwerden.DiesesErgebnisistbemerkenswert,

danachorganisch‐chemischemProtokollmitm‐CPBAdasHeteroatombevorzugtoxidiertwird.[143]

Abbildung26. CHMO‐katalysierteBAEYER‐VILLIGER‐OxidationvonThioether(40)[109,110](links)undvonheterocyclischemKeton[143](rechts).

3.2.3 Alkohol‐Dehydrogenasen

Dehydrogenasen gehören allgemein zur Klasse der Oxidoreduktasen und haben in der Natur die

Funktion, stereospezifisch prochirale Cabonylverbindungen zu reduzieren.[144] Zur biokatalytischen

Darstellung von sekundären Alkoholen aus Carbonylverbindungen als wichtige Bausteine für die

pharmazeutische Industrie werden in großem Umfang Alkohol‐Dehydrogenasen (ADH) eingesetzt.

Diese treten ineinerVielzahlvon lebendenOrganismenauf, indenensie fürdieEntgiftungundden

Metabolismus von Ethanol und anderen Alkoholen zuständig sind.[145] Diese ADHs sind NAD(P)‐

abhängigundkatalysierendenirreversiblenTransfervonHydridionenvonNAD(P)HaufdieCarbonyl‐

verbindung.

ZudenbekanntestenAlkohol‐Dehydrogenasengehörenunteranderemdiejenigen,dieausHefe,Pferde‐

leberoderThermoanaerobicumbrockiiisoliertwurden.[144]Dieseweisenjedocheinegeringethermische

StabilitätundEnantioselektivitätsowieeinenteilweiseengenSubstratbereichauf,sodassSubstratemit

größeren Seitenketten, beispielsweise Acetophenon, nicht umgesetzt werden können. Verschiedene

Alkohol‐Dehydrogenasenkönnen,inAnalogiezuPRELOGSRegel,einHydrid‐IonvomNAD(P)Hentweder


24

aufdiesi‐oderdiere‐SeiteeinesKetonsübertragen.DarausresultierteinAlkoholmit(R)‐bzw.(S)‐Kon‐

figurationmitindenmeistenFällenhoherEnantioselektivität.[145,146]DerGroßteilderbekanntenADHs

gehört zu den (S)‐selektiven Dehydrogenasen, wie beispielsweise Rhodococcus erythropolis und

Theormoanaerobicumsp.[144,147]DiezuBeginnder1990erJahreentdeckten(R)‐ADHsgehörenzuden

kurzkettigenDehydrogenasen,zudenendieADHausLactobacilluskefir(Lk‐ADH,EC1.1.1.2)zählt.[144]

DieLk‐ADHisteinHomotetramermit251AminosäurenundeinemMolekulargewichtvon26.6kDapro

Untereinheit.[148]AufgrundderstrukturellenÄhnlichkeit(92.1%Identität)zuderADHausLactobacillus

brevis(Lb‐ADH)kanndessenMechanismusaufdieLk‐ADHübertragenwerden.DieAminosäurender

Lk‐ADHwerdenanalogzudenenderLb‐ADHnummeriert.DerkatalytischeMechanismusumfassteine

hochkonservierteTetradebestehendausSer142,Tyr155,Lys159undAsn113.DerTyrosin‐Restnimmt

dabeidiezentralekatalytischeSäurebeiderReduktioneinerCarbonylverbindungein.Erwirdwährend

desReaktionsverlaufsdeprotoniertundmussdurchdaspositivgeladeneLys159stabilisiertwerden.

Ser142hatdieAufgabe,dasSubstratzufixierenundzusätzlichdieLadungdesTyrosin‐Restesauszu‐

gleichen,sodasseinProtonvonzweiBindungspartnerngeteiltwird.DerkonservierteAsn113‐Restsoll

zusammenmitder2‘‐HydroxygruppedesCofaktorsundeinemgleichzeitigamLysin‐undAsparagin‐

RestgebundenemWassermolekül(Wat122)einProtonen‐Übertragungssystembilden.[149]FILLINGetal.

postulierten ein erweitertesProtonen‐Übertragungssystem,welcheseineGruppevonverschiedenen

Wassermolekülen umfasst, die eine hydrophobe Höhle ausfüllen, welche mit Carbonyl‐Sauerstoff‐

atomenbedecktist(Abbildung27).[150]

Abbildung27. NahaufnahmederwichtigstenRestedeserweitertenProtonen‐Übertragungssystemsder Lb‐ADH.[149] Die katalytische Tetrade ist inmagenta undWasserstoffbrücken‐bindungensindgestricheltdargestellt.

DieLk‐ADHenthältzweiMg2+‐Ionen,dieeherstrukturellealskatalytischeEigenschaftenbesitzen,dasie

jeeinekoordinativeBindungzueinemMonomerundelektrostatischeWechselwirkungenausbilden.

Durch Zugabe des Komplexbildners Ethyldiamintetraacetat (EDTA) wurde die Inaktivierung des

Enzymsgezeigt,dasodiequarternäreStrukturdesEnzymsnichtmehrstabilisiertwerdenkann.Durch

ZugabevonMg+‐IonenkanndessenAktivitätzuetwaeinemDrittelwiederregeneriertwerden.[148]Die

Bedeutung der Anwesenheit von zusätzlichen Mg2+‐Ionen in der Reaktionsmischung macht sich im


25

Anstieg der Aktivität der Lk‐ADH bemerkbar, was bedeutet, dass ein Teil der Ionen vom Enzym

dissoziiert.[151]

DavielederSubstratenichtwasserlöslichsind,kanneineZugabevonorganischemLösungsmittelzur

Reaktionsmischungsinnvollsein.LösungsmittelmitlogP‐Werten<3.5könnenjedochsowohldiespezi‐

fischeAktivitätalsauchdieStabilitätdesisoliertenEnzymsverringern.[152]DiehöchsteAktivitätweist

dieLk‐ADHbei50°Cauf,währenddaspH‐OptimumbeipH7fürdieReduktionundbeipH8fürdie

Oxidationliegt.[151]

HUMMELetal.setzten1990erfolgreichdasprochiraleSubstratAcetophenon(46)zu(R)‐Phenylethanol

((R)‐47)mitder(R)‐spezifischenLk‐ADHmiteinerAktivitätvon558U/mLum(Abbildung28).[151]Die

Lk‐ADH akzeptiert ein sehr breites Spektrum an Substraten wie aliphatische, offenkettige Ketone,

2‐oder3‐KetoesterundcyclischeKetonemithoherspezifischerAktivität(100–500U/mg).[153]

Abbildung28. SchemaderLk‐ADH‐katalysiertenOxidations‐sowieReduktionsreaktionen.[151]

AuchwenndieReduktionprochiralerKetonezuchiralenAlkoholenderwichtigsteAnwendungsbereich

derLk‐ADHist,kanndieOxidationsreaktionebenfallsgenutztwerden.SowirddieLk‐ADHbereitszur

enzymatischenRacematspaltungvonracemischenAlkoholen,beispielsweisevon(R)‐und(S)‐Phenyl‐

ethanol, eingesetzt, bei der nur der (R)‐Alkohol zum entsprechenden Keton oxidiert wird.[153] Im

RahmendieserArbeitsolldieLk‐ADHdieOxidationvonCyclohexanol(1)zuCyclohexanon(2)mitdem

kostengünstigeneCofaktorNADP+katalysieren(Abbildung29).DieLk‐ADHbesitztfürdieOxidationdes

Alkohols1einegeringereAktivitätalsfürdieReduktioneinesKetons2,sodassdieWahrscheinlichkeit

derRückreaktionsehrgroßist.AllerdingskanndasGleichgewichtzugunstenderOxidationverschoben

werden,wenndasgebildeteKeton2durchdieCHMOdirektweiterumgesetztwird(vergl.Abschnitt

2.1).

Abbildung29. EnzymatischeOxidationdurchLk‐ADHamBeispielvonCyclohexanol(1)zuCyclo‐hexanon(2).

AufgrundderCofaktor‐AbhängigkeitderLk‐ADHistauchindiesemFalldieAnwesenheiteinesRegene‐

rationssystemsnotwendig.AufverschiedeneSystemewirdinKapitel3.2.4nähereingegangen.


26

3.2.4 Cofaktor‐Regeneration

DieAnwendungvonBVMOsimindustriellenMaßstabistnochnichtvollständigentwickelt.Einesder

größtenHindernisse istdieAbhängigkeitderLk‐ADHsowiederMonooxygenasenvondemCofaktor

NADP+bzw.NADPH,welches instöchiometrischenMengenzurReaktionsführungeingesetztwerden

muss. Aus diesem Grund wurden Systeme zur in situ‐Cofaktor‐Regenerationssysteme entwickelt.

GenerellwerdenzweiunterschiedlicheStrategienzurCofaktor‐Regenerationangewandt(Abbildung

30).[14,154] Zum einen die substratgekoppelte Cofaktor‐Regeneration, die auf einen Alkohol als Co‐

substrat,meist iso‐Propanol,basiert,der inderRückreaktionvonderselbenAlkohol‐Dehydrogenase

zumKeton oxidiertwird und somit den Cofaktor regeneriert. Durch Zugabe eines Überschusses an

CosubstratkanndasGleichgewichtzurProduktseiteverschobenwerden.

Abbildung30. Strategienzursubstrat‐undenzymgekoppeltenCofaktor‐Regeneration.[154]

EinanderesKonzeptnutztdasenzymgekoppeltesRegenerationssystem.DabeiwirdderEinsatzeines

zweiten Enzyms notwendig, welches ein Cosubstrat unter Rückbildung des Cofaktors umsetzt. Die

Reaktionistirreversibel,wodurchdasGleichgewichtebenfallszurProduktseiteverschobenwird.Ein

gutesRegenerationssystemsolltepreiswertsein,keineNebenprodukteproduzierenundnichtmitden

katalytischen Eigenschaften des Enzyms wechselwirken. Klassisch werden als Redox‐Enzym Dehy‐

drogenasen, beispielsweise die Glucose‐ (GDH)[155] und Glucose‐6‐phosphat‐Dehydrogenase

(G6PDH)[131,156] sowiedieFormiat‐[157]oderPhosphit‐Dehydrogenase[158,159] eingesetzt.DieDehydro‐

genasenkönnendabeisowohlalsisoliertesEnzym[158,159]alsauchalsFusionsprotein[160]oderGanzzell‐

biokatalysator[14,161] zusammenmitderBVMOzurReaktionsmischunggegebenwerden.Ganzzellbio‐

katalysatoren, die neben dem rekombinanten produzierenden Enzym ein Cofaktor‐regenerierendes

Enzym coexpremiert enthalten, besitzen weitere Vorteile wie die leichte Handhabbarkeit von Bio‐

transformationen durch Verzicht auf Isolierung und Reinigung von Enzymen sowie die zellinterne

Cofaktor‐Regeneration.GleichzeitigschließensiedasVorhandenseinkonkurrierenderEnzyme,wiees

beiWildtypzellenderFallist,aus.ZubeachtenistsowohlbeiisoliertenEnzymenalsauchbeiGanzzell‐

Systemen die Kompatibilität der beiden Enzymreaktionen, da Inhibierungsreaktionen durch unter‐

schiedlicheReaktandenauftretenkönnen.


27

DiefürdieCofaktor‐RegenerationhäufiggenutzteGDHoxidiertdasCo‐SubstratD‐Glucose(48‐a)und

regeneriert dadurch den Cofaktor NAD(P)+ (Abbildung 31).[155] Durch die spontane Hydrolyse des

entstandenen Gluconolactons (49‐a) zur Gluconsäure (50‐a) ist die Reaktion irreversibel und ver‐

schiebtdasGleichgewichtzurProduktseite.DieGDHistgünstig,kommerziellerhältlichundstabilerals

diemeistenzurRegenerationverwendetenEnzyme.WeitereVorteilederGDHsinddieAkzeptanzvon

NAD+sowievonNADP+undihrehohespezifischeAktivität.

DieG6PDHistähnlicheffizientundwirdebenfallsvielfachverwendet.[16,131,156]SieoxidiertdenZucker

Glukose‐6‐Phosphat (48‐b, G6P) zu Glukonolacton (49‐b), welches spontan zu Glukonsäure (50‐b)

hydrolysiert.EinengroßenNachteildiesesSystemsstellendiehohenKostenfürdasG6P(48‐b)dar.Die

G6PDH wurde bereits in Ganzzellsystemen zusätzlich zur BVMO überexprimiert.[16] Die erhöhte

Verfügbarkeit von NADPH für die Oxidation führt zu einer Verbesserung der Produktion von

ε‐Caprolacton(3).

Abbildung31. CofaktorregenerationmitdemD‐Glucose(48‐a)/GDH‐unddemG6P(48‐b)/G6PDH‐System.[131,155,156]

DieVerwendungderFormiat‐Dehydrogenase(FDH)isteineweiterebekannteMethodeundliefertCO2

alsNebenprodukt.[157]Dadiesesflüchtigist,erfolgtdadurcheineVerschiebungdesGleichgewichtesder

ReaktionzurProduktseite.NachteilediesesSystemssinddiegeringespezifischeAktivitätderFDHsowie

dieAbhängigkeitvonNADHalsCofaktor.

Die Phosphit‐Dehydrogenase (PtxD) katalysiert die Oxidation von Phosphit zu Phosphatmit gleich‐

zeitiger Reduktion vonNAD+ zuNADH (Abbildung 32).[158,159] Anstelle von PtxD kann eineAlkohol‐

Dehydrogenase(ADH)zusammenmitiPrOHzugefügtwerden,umNADP+wiederzuregenerieren.[162]

Dabei wird Aceton gebildet, welches flüchtig ist und das Gleichgewicht zu Gunsten des Produktes

verschiebt.


28

Abbildung32. SchematischeDarstellungfürdenEinsatzvonPhosphit‐Dehydrogenase(PtxD)[158,159](links)undAlkohol‐Dehydrogenase(ADH)[162](rechts)zurCofaktor‐Regeneration.

EineeleganteLösungfürdieCofaktor‐RegenerationstelltenWILLETSetal.vor,indemsieeineCHMOmit

einerisoliertenADHkoppelten(Abbildung33).[163,164]DieADHoxidiertdenAlkoholalsSubstratzum

entsprechendenKeton und reduziertwährenddessendasNADP+ zuNADPH.Anschließendwirddas

Keton durch die Monooxygenase zum Lacton umgewandelt und NADPH verbraucht. Diese Art der

Cofaktor‐RegenerationsollauchindieserArbeitAnwendungfinden.EinweitererVorteildieserReak‐

tionsführungistderEinsatzvonnursehrgeringenMengenderCofaktorenNADP+bzw.NADPH(700€

bzw.2700€/g).[165]

Abbildung33. SchematischeDarstellungdessubstratgekoppeltenRegenerationssystemsausBVMOundADH.[163,164]

NebendenbishererwähntenMethodenzurCofaktor‐RegenerationwurdeninneuererZeitauchphoto‐

chemischeVerfahren beschrieben. Bei dieserArt derCofaktor‐Regeneration dient Ethyldiamintetra‐

acetat(EDTA)alsElektronendonor,welchesunterLichteinwirkungzerfällt.[166]DiesesSystemistaller‐

dingswenigeffizient.DanebengibtesAnsätzefürelektrochemischeVerfahren,diezurZeitjedochnoch

nichtausgereiftsind.[167]


29

3.3 EigeneErgebnisseundDiskussion

DieindiesemTeilderArbeitverwendeteCyclohexanon‐MonooxygenaseausAcinetobactercalcoaceticus

NCIMB9871(CHMO,EC1.14.13.22,HandelsnameECSMO‐1vonENZYMICALSAG)wurdeausschließlich

alsRohextrakteingesetzt.DieverwendetenChargenderAlkohol‐DehydrogenaseausLactobacilluskefir

(Lk‐ADH,EC1.1.1.2,DSM20587)wurdenebenfallsalsRohextrakteingesetztundinGlycerinineiner

1:1‐Mischung(v/v)aufbewahrt.DieBearbeitungdiesesForschungsprojektesfandimRahmendesvon

der„DeutschenBundesstiftungUmwelt“(DBU)gefördertenProjektsstatt.

3.3.1 Standardreaktion:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuɛ‐Caprolacton(3)

Bei der in der Arbeitsgruppe bereits etablierte Doppeloxidation wird Cyclohexanol(1) durch den

BiokatalysatorLk‐ADHinsituzuCyclohexanon(2)unddiesesanschließenddurchdieCyclohexanon‐

Monooxygenasesofortweiterzuɛ‐Caprolacton(3)oxidiert(Abbildung34).[26]DieEnzymaktivitätender

der Lk‐ADHwerden zuvor auf Acetophenon und die der CHMOauf Cyclohexanon (2) als Standard‐

Reagenzbezogen.

Abbildung34. Standard‐ReaktionderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).[26]

BeidieserReaktionbenötigtdieCHMOdieoxidierteCofaktorformNADP+,welchedurchdieLk‐ADHals

Cofaktor‐RegenerationssystemwiederzurreduziertenFormNADPHumgewandeltwird.STAUDTerhielt

denhöchstenproduktbezogenenUmsatz von>97%bei einer Substratkonzentrationvon20mMbei

Raumtemperatur und 24 Stunden Reaktionszeit.[26] Nach aktuellemKenntnisstand ist diese Doppel‐

oxidationdiebisdatoerstebiokatalytischeSynthesevonɛ‐Caprolacton(3)ausgehendvonCyclohexanol

(1).[26,168]


30

3.3.2 EtablierunganalytischerMethoden

Vor Beginn der synthetischen Arbeitenmusste zunächst eine schnelle und robuste Analytik für die

enzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐OxidationzurqualitativenundquantitativenBestimmungderUmsätze

erarbeitetwerden.HierzuwurdezumeineneineNMR‐AnalytikinKombinationmitUrotropin(51)als

externerStandardetabliert.ZumanderenwurdeeineUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie

mittels Eichgeraden validiert sowie die Wiederfindungsraten unter verschiedenen Bedingungen

bestimmt.

3.3.2.1 UmsatzbestimmungmittelsNMR‐Analytik

Zur Bestimmung der Umsätzewurde im Anschluss an die Reaktion extraktiv in EPPENDORF‐Gefäßen

aufgearbeitet.NachEntfernendesorganischenLösungsmittelsuntervermindertemDruckwurdeder

vollständigeReaktionsansatzinNMR‐Röhrchenüberführt.Urotropin(51)dientedabeiinFormeiner

frisch angesetzten Stammlösung (0.17 M in CDCl3, 0.1 mL) als externer Standard. Mittels 1H‐NMR‐

SpektroskopiewurdedasVerhältnisvonProdukt3zumStandard51anhanddererhaltenenIntegrale

ermittelt (Abbildung 35). Das im Spektrum vorhandene Ethylacetat wurde bei der Versuchsdurch‐

führungimRahmendesSolvenz‐ScreeningszugegebenundistfürdieBestimmungdesUmsatzesnicht

vonBedeutung.

Abbildung35. Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐SpektroskopiemitUrotropin(51)alsexternemStandard.


31

ImvorliegendenBeispielwurdederUmsatzwiefolgtanhandderIntegralebestimmt(Gleichung1):

Gleichung1

Des Weiteren kann der produktbezogene Umsatz am selben Beispiel nach folgender Gleichung 2

ermitteltwerden:

Gleichung2

BeidemVergleichderbeidenBestimmungsmethodenfälltjedochauf,dassesgroßeUnterschiedeinden

mithilfe der Gleichungen 1 und 2 ermittelten Umsätzen gibt. Dieses kann mit der Flüchtigkeit der

Komponenten Cyclohexanol (1) und Cyclohexanon (2) während der extraktiven Aufarbeitung mit

anschließendemEntfernendesLösungsmittelsbeivermindertemDruckbegründetwerden,dainAnwe‐

senheiteinesexternenStandardsnurdasVerhältnisderKomponentenuntereinanderbestimmtwerden

kann und nicht der quantitative Umsatz. Es wurde somit, soweit nicht anders angegeben, auf die

BestimmungdesUmsatzesmittelsexternemStandard50zurückgegriffen.

DieStabilitätdesStandardswurdeanschließendermittelt.DafürwurdenUrotropin (51)undCyclo‐

hexanol(1)eingewogenunddasVerhältnisbeiderKomponentensofortunderneutnach24Stunden

LagerzeitbeiRaumtemperaturineinemgeschlossenenGefäßmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt

(Tabelle2).LautEinwaage liegtdasVerhältnisbei1 :0.80 (51/1),nach24Stundenwirddasselbe

Verhältnis beider Komponenten erhalten. Urotropin (51) ist folglich optimal zur Verwendung als

externerStandardgeeignet.

Tabelle2. VerhältnisvonUrotropin(51)undCyclohexanol(1)nachEinwaageundnach24StundenLagerzeitbeiRaumtemperatur.

EintragVerhältnis51 /1

Einwaage

Verhältnis51/1

nach24h

1 1:0.80 1:0.80


32

3.3.2.2 UmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie

Dain1H‐NMR‐SpektroskopienureineGenauigkeitindenIntegralenvon±5%erzieltwerdenkann,soll

eineUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie(GC)etabliertwerden.Dafürwaresnotwendig,

zunächst für jedederKomponentenCyclohexanol (1), Cyclohexanon (2)undɛ‐Caprolacton (3) eine

Eichgeradezugenerieren,wobeibeiderErstellungderMethodendaraufgeachtetwerdensollte,dass

sichdieeinzelnenPeaksnichtüberlagerten.EswurdeeineStammlösungderdreiKomponenten(je1g

Substanz/100mLDCM)hergestellt.DurchVerdünnungderStammlösungauf5mg/mL,2.5mg/mL,

2mg/mL,1.75mg/mL,1.5mg/mL,1.25mg/mLund1mg/mLwurdeeineEichgeradeangefertigt.Ein

BeispielfüreinGC‐ChromatogrammderdreiKomponentenistinAbbildung36dargestellt.ImAnschluss

andieMessungkanndievorhandeneStoffmengesofortbestimmtwerden.

Abbildung36. BeispieleinesGC‐ChromatogrammsderdreiKomponenten1,2und3.

DieSchwankungsbreitederUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographiewurdefürdiedreiKom‐

ponentenCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)undɛ–Caprolacton(3)ermittelt,indemLösungenderdrei

KomponentenunterschiedlicherKonzentrationhergestelltundmittelsGCineinerDreifachbestimmung

vermessenwurden(Tabelle3).DieAbweichungbeträgtdemnachdurchschnittlich0.02–0.07mg/mL

beiunterschiedlichenKonzentrationenvon0.8–2.8mg/mL.SomitkanndieentwickelteMethodezur

UmsatzbestimmungmittelsGCalsetabliertbetrachtetwerden.Allerdingskannauchmitdieservaliden

AnalytikmethodedasProblemdesVerdampfensdereinzelnenKomponentenwährendderAufarbeitung

nicht verhindert werden. Daher wurde in einem separaten Experiment die Rückgewinnungsrate

währendderAufarbeitunguntersucht(Abschnitt3.3.2.3).

Tabelle3. BestimmungderDurchschnittsabweichungderKomponenten1,2und3.

Eintrag Komponente Einwaage[mg]a) Abweichung[%]a)b)

1 1 0.93–2.49 2‐4

2 2 0.81–1.58 1

3 3 1.25–2.75 2‐5a)FürexakteMessdatensieheKapitel7.2.1.3.2.b)angegebensinddieminimalenundmaximalenAbweichungenin%.


33

3.3.2.3 ErmittlungderRückgewinnungsrate

UmdieRückgewinnungsratenvondenKomponenten2und3zuerhalten,wurdedieAufarbeitungder

ReaktionsimuliertunddieRückgewinnungsrateabhängigvonderjeweiligenMethodeaufzweiWegen

ermittelt(Abbildung37).

Abbildung37. SchematischeDarstellungderAufarbeitungsmethodenfürA)dieNMR‐SpektroskopieundB)dieGC.

ZurBestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR‐SpektroskopiewurdenCyclohexanon(2)bzw.

ε‐Caprolacton (3, je 40 mM) in KPi‐Puffer (5 mL) über einen Zeitraum von 24Stunden bei Raum‐

temperatur gerührt. ImAnschlusswurde die jeweilige Lösung extraktiv aufgearbeitet, das Lösungs‐

mittelentferntunddergesamteKolbeninhalt ineinNMR‐Röhrchenüberführt.Mithilfedesexternen

Standards50wurdendieWiederfindungsratenmittelsNMR‐Spektroskopieermittelt,diebeisehrguten

91 – 98% lagen. Dieses entspricht einem Verlust von 9% bei Cyclohexanon (2) und von 2% beim

ɛ‐Caprolacton(3)(Tabelle4).

Tabelle4. RückgewinnungsratederSubstanzen2und3nachsimulierterAufarbeitungnach24hRührenbeiRT.

Eintrag Substanz Rückgewinnungsrate[%] *

1 2 91

2 3 98*ermitteltmittelsNMRmitUrotropin(51)alsStandard.

DieRückgewinnungsratewurdeparallel dazumitderGC‐Methodebestimmt,wobei dasAugenmerk

dabei auf die unterschiedlichenRückgewinnungsratenbei unterschiedlichenKonzentrationen gelegt

wurde.DafürwurdendieKomponenten1,2und3 inverschiedenenKonzentrationen(20–80mM)

eingewogenund für24Stunden inKPi‐Puffer (5mL)gerührt. ImAnschlussandieextraktiveAufar‐

beitungwirddasLösungsmittelentfernt,derKolbeninhaltineinMaßkolbenüberführtunddieserzum

Eichstrichaufgefüllt(Abbildung37,B).DarauswerdendreiProbenentnommenundmittelsFünffach‐

bestimmungmittelsGCvermessen.DieErgebnissesindinAbbildung38aufgezeigt.


34

OH

1

O

2

O

O

3

Abbildung38. RückgewinnungsratederKomponenten1,2und3beiunterschiedlichenKonzentrationen,ermitteltmittelsGC.

MitzunehmenderKonzentrationsteigtdieRückgewinnungsratevon71–80%bei0.1mMaufhervor‐

ragende90–97%beieinerKonzentrationvon0.4mMan.Bemerkenswert istdabei,dassdieRück‐

gewinnungsratenbeiallenKonzentrationenfürCyclohexanol(1)amniedrigstenundfürdasLacton3

amhöchstensind.AuchdiesesErgebnisistmitderFlüchtigkeitderSubstanzenzubegründen,dabei

höherenKonzentrationeninsgesamteingeringererAnteildesSubstratesnotwendigist,umdieAtmo‐

sphäre im Reaktionsgefäß zu sättigen, und somit der Verlust geringer ist. DesWeiteren spielt der

VerteilungskoeffizientdereinzelnenSubstanzenwährendAufarbeitungeinewichtigeRolle.DerlogP‐

Wert ist charakteristisch für jede einzelne Verbindung und somit auch die Effizienz des jeweiligen

Extraktions‐VorgangsauseinerwässrigenPhase.

Die zunächst aus vorhergehenden Arbeiten[26] übernommene Extraktionsmethode in EPPENDORF‐

Gefäßenwurdeoptimiert.AnfangswurdedieoberewässrigePhaseinneueEPPENDORF‐Gefäßeüberführt

unddasEnzym‐PelletmitderorganischenPhase(DCM)zurückgelassen,sodassindennächstenExtrak‐

tionsschrittennurdiewässrigePhaseweiterextrahiertwerdenkonnte(Abbildung39).Beiderneuen

ExtraktionsmethodewirddieuntereorganischePhaseausdemEPPENDORF‐GefäßineinSammelgefäß

gegeben und die zurückbleibende wässrige Phase, die noch das Enzym‐Pellet enthält, erneut mit

Lösungsmittelversetzt.DurchdieseÄnderungwirdeinehöhereRückgewinnungsrateerzielt,danoch

weitereSubstanzausdemPelleterhaltenwerdenkann.SomitkonntediegesamteinderBiotransfor‐

mation eingesetzte Stoffmenge quantitativ zurückerhaltenwerden,während bei der bisherigenAuf‐

arbeitungsmethodenuretwa84%derStoffmengenachgewiesenwerdenkonnten.

0102030405060708090100

20 40 80

71

8490

75

8895

8088

97

Rückgew

innungsrate[%]

c[mM]

Cyclohexanol(1) Cyclohexanon(2) ɛ‐Caprolacton(3)(2)(1) (3)


35

Abbildung39. Alte(A)undneue(B)AufarbeitungsmethodemittelsEPPENDORF‐Gefäßen.DabeiistdiewässrigePhaseinblau,dieorganischePhaseingelbunddasEnzym‐Pelletinorangedargestellt.

WährendderAufarbeitungwirddieinderReaktionsmischungenthalteneLk‐ADHdurchdasorganische

LösungsmitteldenaturiertundbildeteinEnzym‐Pellet,welchesaußerLösungsmittelmolekülenauch

Substrat einschließen kann. Eswurde folglich die Rückgewinnungsrate in Anwesenheit der Lk‐ADH

erneutbestimmtundmitderRückgewinnunginAbwesenheitdesEnzymsverglichen(Abbildung40).

OH

1

O

2

O

O

3

Abbildung40. BestimmungderRückgewinnungsratevonCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)undLacton3inAnwesenheitundinAbwesenheitvonLk‐ADH.DieZentrifugierzeitbetruginallenFällen3x30Minuten.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3

88

73

9390

76

94

Rückgew

innungsrate[%]

Komponente

mitLk‐ADH ohneLk‐ADH


36

DabeiwurdediefürdieStandardreaktiontypischeMengeanEnzymeingesetzt.DieAnwesenheitder

Lk‐ADHwährendderReaktionmitanschließenderBildungdesEnzym‐PelletshathierbeinureineVer‐

ringerungderWiederfindungvon1–3%zurFolge.DieRückgewinnungsratevonɛ–Caprolacton(3)

wurdeauchmitgrößerenEnzymmengenuntersucht.GleichzeitigwurdedieZentrifugierzeitwährend

der Aufarbeitung von 3 x 30min auf 3 x 5Minuten verkürzt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 41

aufgezeigt.

Abbildung41. Bestimmung der Rückgewinnungsrate von ɛ–Caprolacton (3) bei verschiedenenEnzymmengenundbeiunterschiedlichenZentrifugierzeiten.

DieRückgewinnungsratesinktmitsteigendemEnzymgehaltderMischung,wasaufeinenEinschlussvon

Substrat imEnzym‐Pellet hindeutet. Dieses Pelletwirdwahrscheinlichmit zunehmenderDauer des

Zentrifugierens fester und stärker komprimiert, sodass das darin enthaltene Substrat auch durch

mehrfachesWaschennichtherausgespültwerdenkann.Auchkonntefestgestelltwerden,dasssichbei

lang andauernder Zentrifugierzeit Rillen in den EPPENDORF‐Gefäßen bildeten, durch die Teile der

LösungenindieZentrifugeauslaufenkonnten.DieEnzymmengensolltenfolglichmöglichstgeringund

dieZentrifugierzeitkurzgehaltenwerden.

3.3.2.4 VergleichderAnalytik‐MethodenanhandderStandard‐Reaktion

ImAnschlusswurdendiebeidenetabliertenMethoden,die 1H‐NMR‐Spektroskopiemittelsexternem

Standard sowie die Gaschromatographie,mithilfe der erstellten Eichgerade anhand einer Standard‐

Reaktionmiteinanderverglichen(Abbildung42).

0102030405060708090100

0 150 500

6861

20

93

7369

Rückgew

innungsrate[%]

Enzymmenge[µL]

3x30min 3x5min


37

OH

140mM,21µL

O

2insitu

O

O

3

Lk‐ADH(40U,210µL),CHMO(3.82U,20.1µL)NADP+ (1mol‐%,1.57mg),MgCl2 (1mg)

KPi‐Puffer (pH7,50mM,5mL)

Abbildung42. VergleichderAnalytik‐MethodennachextraktiverAufarbeitungimAnschlussaneineReaktion:GCvs.1H‐NMR.

Dabeiistersichtlich,dassbeidendreiKomponentenCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)sowieɛ‐Capro‐

lacton(3)mittelsGCinallenFälleneinhöhererUmsatzbestimmtwerdenkonnte.Dieseskannmitden

in den Methoden selbst vorhandenen Fehlern erklärt werden. Auch reagiert das GC vor allem bei

niedrigerenKonzentrationen,wieesindiesemBeispielbeimEdukt1derFallist,sensibler,daimNMR‐

SpektrumKomponenten niedrigerKonzentration imSignalrauschen untergehen können.DerUnter‐

schiedinderProduktkonzentrationvon6mMbeiɛ‐Caprolacton(3)jedochmussaufandereUrsachen

zurückgeführtwerden.DabeikönnenWägefehleretc.ausgeschlossenwerden,dabeideAnalysenmit

demselbenReaktionsansatzdurchgeführtwordensind.ZudementfälltbeiderGC‐AnalytikderSchritt

desEntfernensdesLösungsmittels,sodassdasteilweiseVerdampfenderSubstratevermiedenwerden

kann.AusdiesemGrundistdieAnalytikmittelsGCdieMethodederWahlfürdieseArbeit.

3.3.2.5 AktivitätsbestimmungmittelsUV/Vis‐SpektroskopieundBRADFORD‐Test

BeiderBestimmungderAktivität einesEnzymsmittelsUV/Vis‐Spektroskopiewirdder vonNADPH

durch Oxidation zu NADP+ bzw. die Bildung von NADP+, welches bei einer anderen Wellenlänge

adsorbiert, in Gegenwart des Substrats bei einerWellenlänge von 340nm zeitlich verfolgt. Aus der

AnfangssteigungdererhaltenenAbsorptionskurvewirddieaufdieKatalysatormenge(inmL)berech‐

0

5

10

15

20

25

30

35

40

1 2 3

2,4 2,0

29,6

0 1,2

23,6

Konzentration[m

M]

Komponente

GC NMR


38

neteAktivitätbestimmtundmittelsGleichung4(Kapitel7.2.1.4.1)berechnet.DadieReagenziennach

demZusammengebengutgeschütteltwerdenmüssen,startetdieMessungmiteinigenSekundenVerzö‐

gerung.AusdiesemGrundistzuerwarten,dassdieermittelteAktivitätetwasgeringeralsdietatsäch‐

licheausfällt. InsolchenFällen isteswichtig,dieEnzymlösungentsprechendzuverdünnen,umeine

LinearitätderMessgeradenderAnfangssteigungzugewährleisten.

Tabelle5. BVMO‐ScreeningzurOxidationvonCyclohexanon(2).

Eintrag BVMOAktivität

[U/mLRohextrakt]Aktivität

[U/mgProtein]RelativeAktivität[%]

1 ECSMo‐01 7.38 3.00 100

2 ECSMo‐03 0.50 0.20 7

3 ECSMo‐05 0.14 0.05 2

DieAktivitätderCHMOwurdeinGegenwartvonCyclohexanon(2,1mM)alsSubstratbestimmt,indem

derVerbrauchdesCofaktorsNADPHzuNADP+beobachtetwird.Diesebeträgtdemnach0.082U/mL.

MithilfeeinesEnzymscreeningsmitdenvonENZYMICALSAGzurVerfügunggestelltenMonooxygenasen

ECS Mo‐03, einer Phenylaceton‐Monooxygenase (PAMO), sowie ECS Mo‐05, einer p‐Hydroxyaceto‐

phenon‐Monooxygenase(HAPMO),mitCyclohexanon(2)alsStandardsubstratsolltendieAktivitäten

mit der von CHMO (ECSMo‐01) verglichenwerden. Da alle drei BVMOs in flüssiger Form erhalten

wurden,kannkeindirekterVergleichdermittelsUV/Vis‐SpektroskopieerhaltenenAktivitäten(U/mL)

erfolgen. Durch einen BRADFORD‐Test wurde im Anschluss der Proteingehalt der einzelnen BVMOs

bestimmtunddarausdieAktivitätpromgProtein(U/mg)ermittelt.DieerhalteneAktivitätderCHMO

(ECSMo‐01)beträgt3.00U/mgundwurdegleich100%gesetzt.ImVergleichdazubeträgtdierelative

AktivitätderECSMo‐03undderECSMo‐05nur7%bzw.2%(Tabelle5).

DadasSubstratspektrumderenzymatischenDoppeloxidationdurchdieCHMOerweitertwerdensoll,

wurdedieEnzymaktivitätgegenüberIsophoron(52,1mM)alsmöglichesweiteresSubstratbestimmt.

DieerhalteneAktivitätwerdenaufdiedesCyclohexanons(2)alsReferenzsubstanzbezogen,welches

gleich100%gesetztwird,umeinerelativeAussageüberdieEnzymaktivitättreffenzukönnen(Tabelle

6).DabeikonnteeineAktivitätderCHMOgegenüberIsophoron(52)vonnur0.003U/mgimVergleich

zurAktivitätgegenüberCyclohexanon(2)von0.101U/mLnachgewiesenwerden.DierelativeAktivität

derCHMOgegenüberIsophoron(52)beträgtdemnachnur3%,wasunterdengegebenenReaktions‐

bedingungeneineschwierigeReaktionsführungist.


39

Tabelle6. BestimmungderAktivitätvonCHMOgegenüberIsophoron(52).

Eintrag Substrat Aktivität[U/mg] RelativeAktivität[%]

1 2 0.101 100

2 51 0.003 3

Die Aktivität der Lk‐ADH wurde gegenüber dem Standard‐Substrat 1‐Phenylethanol (47, 10 mM)

bestimmtundgleich100%relativeAktivitätgesetzt(Tabelle8).AnschließendwurdensowohlCyclo‐

hexanol(1,10mM)alsauch3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(52,10mM)aufgleicheWeisevermessen.

Cyclohexanol(1)besitztdabeieinerelativeAktivitätvon153%(33.0U/mL),wirdalsodemnachvon

derLk‐ADHsehrgutalsSubstratakzeptiert.DieLk‐ADHweistgegenüberdemAlkohol53jedochkeine

Aktivitätauf.EventuellistdieReaktionszeitvon3MinutenindiesemFallnichtausreichend,sodassbei

einerverlängertenReaktionsdauervonbeispielsweise24StundentrotzdemProduktgebildetwerden

kann.

Tabelle7. BestimmungderAktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)imVergleichzu1‐Phenylethanol(47)undCyclohexanol(1).

Eintrag Substrat Aktivität[U/mL] RelativeAktivität[%]

1 47 21.5 100

2 1 33.0 153

3 53 0 0

3.3.2.6 OptimierungderStandardreaktion

EsistinderLiteraturbereitsbekannt,dassbeieinerKonzentrationdesLactons3höherals60mMeine

Inhibierung der CHMO auftritt.[26] Um Produktinhibierungen zu vermeiden, wurden in den letzten

Jahren verschiedene Methoden zur in situ‐Produktentfernung entwickelt, darunter der Einsatz von

Adsorberharzen[169,170],worauf imKapitel 3.3.4 eingegangenwird, sowiedieVerwendungvonZwei‐

phasen‐Systemen.[171–173]HydrophobeLösungsmittel,alsosolchemithohenlogP‐Werten,besitzenim

GegensatzzuhydrophilenSolventiennichtdieFähigkeit,dasamEnzymgebundeneessentielleWasser,

welchesalsSubstrathüllefungiert,zuentfernen,waszueinerVerringerungderEnzymaktivitätführen


40

würde.[174]IneinemzweiphasigenSystembefindensichdasEnzymunddiehydrophilenKomponenten

inderwässrigenPhase,währenddiehydrophobenAnteileinderorganischenPhasevorhandensind.In

der Literatur wurde beschrieben, dass für die BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von benzolgebundenen

Ketonen durch Katalyse durch die Monooxygenasen PAMO und HAPMO höhere Umsätze durch

VerwendungvonverschiedenenorganischenLösungsmittelnineiner5%(v/v)Konzentrationerzielt

werden können.[112] Der Einsatz eines zweiphasigenReaktionsmediums kann auch dazu dienen, die

CHMOzustabilisieren,wennmithohenSubstratkonzentrationengearbeitetwerdensoll.Zudemistauch

bekannt, dass die getesteten Monooxygenasen unterschiedliche organische Lösungsmittel tolerie‐

ren.[172,173]

AusgehendvomStandard‐VersuchausKapitel3.3.2.4wurdezunächstderLösungsmitteleffektunter‐

sucht.Dafür sollte sowohldasorganischeLösungsmittel als auchdieKonzentrationvariiertwerden

(Abbildung 43). Die Bestimmung der Stoffmenge ist bei den gezeigten Reaktionen auf zweiWegen

durchgeführt worden. In den meisten Fällen ist die Stoffmenge mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie mit

Urotropin (51) als externer Standard bestimmtworden. Bei den Reaktionenmit 10% organischem

Lösungsmittel sowie mit Methylcyclohexan‐gesättigtem Puffer wurden die Stoffmengen mittels GC‐

Methodeermittelt.DerUmsatzdesBenchmark‐VersuchsinPuffer(vgl.Kapitel3.3.2.4)wurdeebenfalls

mtitelsGCbestimmtunddientzumVergleich.Dabei istder inKapitel 3.3.2.3bestimmteVerlustder

Substanzenmitbiszu10%proKomponentebeidenhierverwendetengeringenKonzentrationenzu

berücksichtigen.

Zunächst ist ein großer Unterschied der Reaktionen in Puffer und dest. Wasser zu erkennen. Der

geringereUmsatz inWasser istmit einermöglichenVeränderungdespH‐Wertesdesungepufferten

Systemszuerklären,diedurchhydrolytischeSpaltungdesgebildetenLactons3auftretenkann.

Allgemeinkonntegezeigtwerden,dassdieenzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐OxidationauchinAnwesen‐

heit eines organischen Lösungsmittels stattfindet. Zwar liefert dieOxidation in einem zweiphasigen

SystemallgemeingeringereUmsätzealsinreinemPuffer,jedochwirddiesernegativeEffektteilweise

durch eine bessere Löslichkeit des Lactons 3 in dem Lösungsmittel‐Gemisch aufgehoben. Ähnliche

Ergebnisse beschrieben DE GONZALO et al. bei der BVMO‐katalysierten Oxidation von orga‐nischen

SulfideninZweiphasen‐Systemen.[173]BiokatalytischeReaktionenlaufenimAllgemeinenlang‐samabin

LösungsmittelnmitlogP‐Werten<2,mäßigbeilogP‐Wertenzwischen2und4undschnellmithohen

logP‐Wertenvon>4,wasmitdenjeweiligenFähigkeitendesLösungsmittelszusammenhängt,dasdas

EnzymumgebendeessentielleWasserzuentfernen.[175]DerhöchsteUmsatzvon87%konntemit10%

Isooctan (v/v) erzielt werden. Dieses ist nicht weiter überraschend, da Isooctan von den hier ver‐

wendetenLösungsmittelndenhöchstenlogP‐Wertvon4.54besitzt.[176]

DieUmsätzemitjeweils10%(v/v)Methylcyclohexan(logP=3.88)[177]undToluol(logP=2.73)[177]sind

geringer und folgen dem Trend.[177] n‐Heptan hättemit einem logP‐Wert von 4.40[176] jedoch einen

höhererUmsatzähnlichdemvonIsooctanliefernsollen.MäßigeUmsätzevon35–49%wurdenmit

Lösungsmittel‐gesättigtemKPi‐Puffer(pH7,50mM)erhalten.


41

OH

140mM,21µL

O

2insitu

O

O

3

Lk‐ADH(40U,210µL),CHMO(3.82U,20.1µL)NADP+ (1mol‐%,1.57mg),MgCl2 (1mg)

Lösungsmittel‐Gemisch, 5mL

Abbildung43. VariationdesLösungsmittelgemischesbeiderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).Angegeben ist der Umsatz der Komponenten2 und3 sowie die nicht umgesetzteStoffmenge von 1. Die Reaktion in PKi‐Puffer ist in Kapitel 3.3.2.4 im DetailbeschriebenunddienthierzumVergleichalsStandard‐Reaktion.

Gemischemit20bzw.40%(v/v)organischemLösungsmittelliefertenpraktischkeinLacton3.Inder

Literaturwurdebereitsbeschrieben,dassmitanderenMonooxygenasenkeineUmsätzeinAnwesenheit

0 5 10 15 20 25 30 35 40

KPi

dest.Wasser

MTBE‐ges.dest.Wasser

Methylcyclohexan‐ges.KPi

n‐Hexan‐ges.KPi

n‐Heptan‐ges.KPi

EtOAc‐ges.KPi

MTBE‐ges.KPi

KPi/n‐Heptan9:1

KPi/Isooctan9:1

KPi/Methylcyclohexan9:1

KPi/Toluol9:1

KPi/EtOAc6:4

KPi/MTBE6:4

KPi/MTBE8:2

Stoffmenge[mmol]

Lösungsm

ittel‐Gem

isch

Stoffmenge3 Stoffmenge2 Stoffmenge1ɛ‐Caprolacton(3)

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

i

n

n

n

i

Cyclohexanon(2) Cyclohexanol(1)


42

desEssigesters5(logP=0.68)erhaltenwerdenkonnten.[173,175]DiesesistauchhierderFall.FürdieLk‐

ADHscheintdieVerwendungdesEssigesters5alsLösungsmitteljedochkeinHinderniszusein,dennes

konntenbiszu6%desCylcohexanons(2)alsZwischenstufenachgewiesenwerden.Wahrscheinlichlief

dieOxidationvonCyclohexanol(1)zumKeton2soweitab,bisderhinzugegebeneCofaktorvollständig

zuNADPHreduziertwordenistunddieReaktionstagnierte.Esistauchbekannt,dassdieLk‐ADHihre

spezifischeAktivitätundStabilität inAnwesenheitvonorganischenLösungsmittelnmit logP‐Werten

<3.5einbüßt.[153]

Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die Zugabe von 10% Isooctan (v/v), einem

LösungsmittelmithohemlogP‐Wert,zurReaktionsmischungimmernochzuhervorragendenUmsätzen

biszu87%führt.DadieAnsätzestetsnach24Stundenbeendetwordensind,könntehiereineVerlän‐

gerung der Reaktionszeit zu einer quantitativen Reaktion führen. Des Weiteren sollte untersucht

werden, inwiefernunterdiesenBedingungen eineProduktinhibierungauftritt,wennbeiKonzentra‐

tionenvonüber80mMgearbeitetwird.

AnschließendwurdederStandard‐VersuchbeiunterschiedlichenBedingungendurchgeführt.Sowurde

dieMengedesCofaktors,dieMengederLk‐ADHsowiedieReaktionstemperaturvariiert(Tabelle8).

Tabelle8. VariationderReaktionsbedingungenderOxidationvonCyclohexanol(1).

EintragNADP+[mol‐%]

Lk‐ADH

[U]

T

[°C]

Umsatz3

[%]b)

Umsatz2

[%]b)

1a) 1 40 RT 97 3

2 2 40 RT 97 0

3 10 40 RT 61 11

4 1 40 30 48 5

2 1 13 RT 55 3a)Standard‐Reaktion;b)Umsatzbestimmtmittels1H‐NMR‐Spektroskopie,angegebenistderproduktbezogeneUmsatz.

EinevermehrteZugabevonNADP+zurReaktionsmischunghatdemnachkeinenpositivenEinflussauf

denUmsatz.BeieinerErhöhungderCofaktormengeauf2mol‐%wurdenebenfalls97%desLactons3

erhalten.DieZugabevon10mol‐%vonNADP+lieferteimVergleichzurStandard‐Reaktion(Eintrag1)

nurnochetwa2/3desUmsatzes(Eintrag2);dazupassendkonnten11%anCyclohexanon(2)ermittelt

werden.DieseTatsachesprichtdafür,dassdieOxidationvonCyclohexanol(1)zumKeton2durchdie

Lk‐ADHsehrviel schneller abläuftalsdieOxidationvon2 zumLacton3 durchdieMonooxygenase.

Diesesdeutetdaraufhin,dassbeiderverwendetenCofaktor‐KonzentrationderMICHAELIS‐Konstante,


43

der KM‐Wert, überschritten worden ist. Der KM‐Wert gibt diejenige Konzentration an, bei der die

ReaktionsgeschwindigkeitderhalbenMaximalgeschwindigkeitvmaxentspricht.BeiweitererErhöhung

derKonzentrationwirdschließlichvmaxangestrebtundeineSättigungtrittein,daalleaktivenZentren

derEnzymebesetztsind.Esistbekannt,dassNADP+festimEnzyminseinerreduziertenFormgebunden

ist und das sonst labile C4a‐Hydroperoxyflavin (36) der CHMO solange stabilisiert, bis ein Substrat

verfügbar ist.[178] Liegt nun in der Reaktionsmischung ein Überschuss an NADP+ im Vergleich zum

Substrat vor ([S] >KM), sokommt es in solchenFällen zu einer kompetitiven Inhibierungbezüglich

NADPH.DieseArtderHemmungdesEnzymskannjedochdurchErhöhungderSubstratkonzentration

wiederrückgängiggemachtwerden.

Die Erhöhung derTemperatur von 20 °C auf 30 °C führte lediglich zu 48%Umsatz (Eintrag 4). Die

Halbwertszeitder isoliertenCHMObeträgt lautLiteraturbei25°CundpH8.5,demOptimumseiner

katalytischeAktivität,etwaeinenTag[179],sodassdavonausgegangenwerdenkann,dassdiekatalytische

Aktivität der CHMO bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C bereits rapide gesunken ist. Die

MonooxygenasewirdalsdaskritischereEnzymindiesemSystemangesehen,dadieLk‐ADHfür ihre

StabilitätinAnwesenheitvonhydrophobenMoleküleningroßenMolekülenbekanntist.[26]EinWeg,die

CHMOzustabilisieren,istdieImmobilisationaufeinemTräger.

DerEinflussderVerringerungderEnzymmengevonLk‐ADHaufdenReaktionsverlaufwurdeebenfalls

untersucht(Eintrag5),dafürdieReaktiondiezehnfacheMengeanUnitsderAlkoholdehydrogenase

verwendet imVergleichzurCHMOwird.EskonntendemnachauchmitnureinemDrittelderbisher

verwendetenMenge an Lk‐ADH ein immer noch guter Umsatz von 55% Lacton3 erhaltenwerden.

EventuellkönntehiereineVerlängerungderReaktionszeitzueinemvollständigenUmsatzführen,was

zuKosteneinsparungeninHinblickaufdenPreisderAlkohol‐Dehydrogenaseführenkann.

3.3.3 UntersuchungenmittelsTitrations‐Apparatur

Mithilfe der Titrino‐Apparatur kann der Umsatz einer Reaktion bestimmtwerden, indem D‐Glucose

(47‐a)/Glucose‐Dehydrogenase(GDH)beiderReaktion,indiesemFalldieReduktionvonAcetophenon

(46)durchdieLk‐ADH,alsCofaktor‐Regenerationssystemeingesetztwird(Abbildung44).Dabeiwird

D‐Glucose(48‐a)überdieZwischenstufeGluconolacton(49‐a)zuGluconsäure(50‐a)umgewandelt.In

derApparaturwirddieseSäuremitNatronlaugebekannterKonzentrationgegentitriert.NachBeenden

derReaktionkanndirektdieMengeanverbrauchterNaOHabgelesenunddarausderUmsatzermittelt

werden.


44

O

O

O

+

NADPH NADP+

GDH

ADH OH

O

O

+

D‐GlucoseGlucono‐lacton

Glucon‐säure Na‐Gluconat

NaOH

46 3(R)‐473

48‐a 49‐a 50‐a

Abbildung44. OxidationvonAcetophenon(46)durchLk‐ADHinAnwesenheitvonɛ‐Caprolacton(3)mitD‐Glucose(48‐a)/GDHalsCofaktor‐Regenerationssystem.

ZunächstsolltedieInhibierungderLk‐ADHdurchɛ–Caprolacton(3)inunterschiedlichenKonzentra‐

tionenübereinenZeitraumvon24Stundenuntersuchtwerden(Abbildung45).DafürwurdeAcetophe‐

non(4),welchesalsStandardsubstratfürdieLk‐ADHfungiert,zuPhenylethanol((R)‐47)reduziert.

Abbildung45. UntersuchungderInhibierungderLk‐ADHdurchɛ–Caprolacton(3).DieReaktionenbei0.25und1MLacton‐Konzentrationwurdenautomatischnach3.5hReaktionszeitbeendet.

DieProduktkonzentrationenwurdenimAnschlusszumeinenausgehendvonderverbrauchtenMenge

anNatronlaugewährendderReaktionermittelt.ZumanderenwurdendieProduktkonzentrationendes

gebildetenPhenylethanols(R)‐47imAnschlussandieextraktiveAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektro‐

skopiemitUrotropin(51)alsexternemStandardbestimmt.Dabeiistzuerkennen,dassdieerhaltenen

KonzentrationendesAlkohols(R)‐47beietwa16mMkonstantbleiben.FolglichtrittkeineInhibierung

derLk‐ADHdurchdasLacton3auf.DiemittelsTitrino‐ApparaturberechnetenProduktkonzentrationen

desAlkohols(R)‐47sindbeigeringenKonzentrationendesɛ‐Caprolactons(3,0–10mM)zunächstzwar

erhöht,bleibenjedochkonstant.MitsteigenderKonzentrationdesLactons3jedochnimmtauchdievia

TitrinoermittelteProduktkonzentrationzu.DiesesliegtzumTeilanKonzentrationsschwankungender

verwendeten Natronlauge. Außerdem kann die Neutralisation von Enzymbestandteilen durch die

05101520253035404550

0 0.01 0.04 0.1 0.25 1

25 24

30

42

49 50

1916 16 15 16 14

Produktkonzentration[m

M]

ɛ‐Caprolacton(3)[M]

Titrino NMR


45

Natronlauge erfolgen. Zudem kann davon ausgegangen werden, dass hierbei eine hydrolytische

SpaltungdeszugegebenenLactons3zurentsprechendenSäure53stattfindet,dieebenfallsmitNaOH

neutralisiertwird(Abbildung46).DiemittelsTitrino‐ApparaturbestimmtenProduktkonzentrationen

könnensomitnichtalsqualitativeWerteangesehenwerden.

O

O

OH

OHO

3 54

hydrolytischeSpaltung

Abbildung46. HydrolytischeSpaltungvonɛ–Caprolacton(3)zu6‐Hydroxyhexansäure(54).

DieReaktionwurdeinD2OmitanschließenderNMR‐spektroskopischerUntersuchungderwässrigen

Phasedurchgeführt.Mittels1H‐NMR‐SpektroskopiekonntedienahezuvollständigeRückgewinnungdes

eingesetzten Lactons 3 durch Verwendung des externen Standards Urotropin (51) nachgewiesen

werden.IndenSpektrenkonntenzwardiegebildetenwasserlöslichenSalzenichtbelegtwerden,jedoch

konntedieBildungvon6‐Hydroxyhexansäure(54)nachgewiesenwerden,welchedurchhydrolytische

SpaltungdesLactons3entstandenist.Abbildung47zeigteinNMR‐SpektrumeinerBiotransformation,

inderdieHydrolysedesLactons3zurSäure54stattgefundenhat.SosindcharakteristischeSignaleim

aliphatischenBereichdesSpektrums,beispielsweisebei2.16und1.53ppm,vorhanden.DasVerhältnis

desgebildetenLactons3zurentsprechendenSäure54beträgtindiesemFall1.0:2.2.

Abbildung47. NRM‐Spektrumvonɛ‐Caprolacton(3,links)undBeispieleinesNMR‐SpektrumsderHydrolysedesLactons3zurSäure54(rechts).

DadieReaktionsgefäßederTitrino‐ApparaturennurmitParafilmverschlossenwerdenkonnten,istes

nichtunwahrscheinlich,dassüberdenReaktionszeitraumvon24StundeneinTeilderSubstrateauf‐

grundderhohenFlüchtigkeitverdampftist.DiemittelsNMR‐SpektroskopieerhaltenenProduktkonzen‐

trationendesAlkohols (R)‐47 bleibenkonstantbeietwa16mM.DavorallembeidenAnsätzenmit

hohenKonzentrationendesLactons3dasGesamtvolumenanSubstratzunimmt,könnensichFehler


46

durchInhomogenitätderProduktmischungenergeben.Insgesamtlässtsichsagen,dassauchbeihohen

Konzentrationenanɛ–Caprolacton(3)keineProduktinhibierungderLk‐ADHstattfindet.DiesesEnzym

istdemnachfürdieDoppeloxidationvonCyclohexanol(1)übereinenZeitraumvon24Stundensehrgut

geeignet.

3.3.4 VerwendungvonAdsorberharzen

DieerstenVersuche, eineProduktinhibierungwährendderReaktiondurchVerwendungvonAdsor‐

berharzenzuvermeiden,wurdenbereits1997vonELILILLYANDCOMPANYveröffentlicht.[169]DasHarz

wirdzurReaktionsmischungzugegebenundkanndabeialsfestesorganischesLösungsmittelangesehen

werden.Die treibendeKraft hinter derAdsorption ist dieWechselwirkung zwischendenunpolaren

Regionen des zu adsorbierenden Moleküls und der polaren Oberfläche des Harzes. So können viel

höhere Substrat‐ und Produktkonzentrationen erreicht werden, während das Enzym nur geringen

Konzentrationenausgesetztist.

DieindieserArbeitgetestetenHarzeXAD‐7undXAD‐1180sindeinfacheporöse,nicht‐funktionalisierte

Kunststoff‐KügelchenmitgroßenOberflächen,dieausunterschiedlichenPolymerenhergestelltwurden

undsomitverschiedenePartikel‐undPorengrößenbesitzen.XAD‐7 isteinPolyacrylat‐Harzundnur

mäßigpolarundsolltesomitsowohldasSubstratCyclohexanol(1)alsauchdasProdukt3gutbinden.

XAD‐1180isteinunpolares,porösesmakrovernetztesaromatischesPolystyren‐Divinylbenzol‐Polymer.

DieHarzebesitzeneinedurchschnittlichePorengrößevon400bzw.450Å.

ZunächstsolltedieRückgewinnungsratederSubstanzenbeibeidenHarzenXAD‐7undXAD‐1180durch

Simulation der Aufarbeitung untersucht werden, indem das Substrat 1 bzw. das Lacton 3 über

20Stunden bei Raumtemperatur in Puffer zusammen mit dem jeweiligen Adsorberharz gerührt.

Anschließend wird zum einen das Harz abfiltriert und mehrmals mit organischen Lösungsmitteln

gewaschen,zumanderendieorganischePhaseextraktivaufgearbeitet(Tabelle9).DieAufnahmefähig‐

keitderbeidenHarzeXAD‐7undXAD‐1180fürdieSubstrateCyclohexanol(1)undɛ–Caprolacton(3)

liegen abhängig von Substrat, Lösungsmittel und Harz nur bei 2 –20%.Nach der extraktiven

Aufarbeitungkönnennur46bzw.74%vonCyclohexanol(1)bzw.ɛ‐Caprolacton(3)inAnwesenheitvon

XAD‐7 zurückgewonnen werden. Die Verwendung von MTBE anstelle von Dichlormethan als

Extraktionsmittel jedoch führt zu einer drastischen Abnahme der Rückgewinnungs‐rate auf 30%.

EventuellkanndieserUnterschiedmitdenlogP‐Werten(DCM:1.25,MTBE:0.94)begründetwerden,da

dasProdukt3(logP=1.25)[180]alsauchderAlkohol1(logP=1.23)[177]inDCMbesserlöslichist.Die

höchsteRückgewinnungsratevomSubstrat1von89%wurdeinAnwesenheitvon100mgXAD‐1180

mitDCMalsExtraktionsmittelerhalten.


47

Tabelle9. RückgewinnungsratederSubstanzen1bzw.3inAnwesenheitderAdsorberharzeXAD‐7bzw.XAD‐1180.

Eintrag Substanz Harz/[mg] SolvenzRückgewinnungsrate[%]

Harz insgesamt

1 1 XAD‐7/100 DCM 2 46

2 3 XAD‐7/100 DCM 8 68

3 3 XAD‐7/200 DCM 8 74

4 3 XAD‐7/100 MTBE 4 30

5 1 XAD‐1180/100 DCM 20 89

6 1 XAD‐1180/200 DCM 10 41

Da der Fokus bei der Doppeloxidation von Cyclohexanol (1) vor allem bei der Vermeidung der

ProduktinhibierungdurchdasLacton3liegt,wurdendieinAnsatz3verwendetenBedingungenfürdie

imAnschlussdurchgeführteReaktionaus‐gewählt(Abbildung48).

Abbildung48. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.

DasHarzXAD‐7wurdezusammenmitdemCyclohexanol(1)sowiedenrestlichenKomponentenfür

24Stunden gerührt. Der dadurch erhaltene Umsatz beträgt 24% bezüglich des Urotropins (51) als

externerStandard(produktbezogenerUmsatz:48%).DieinsgesamtzurückgewonneneStoffmengealler

dreiKomponentenlagnachderAufarbeitungbeinur50%.DadieReaktionnurzurHälfteablief,istes

wahrscheinlich, dass ein Teil des Cyclohexanols (1) gleich zu Beginn im Harz durch Wasserstoff‐

brückenbindungenundVANDERWAALS‐KräftegebundenwurdeundfürdieReaktiondadurchnichtmehr

zurVerfügungstand.

Eswurde indieserArbeiterstmalsgezeigt,dassdieVerwendungvonHarzenbeiderenzymatischen

DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zumLacton3 istmöglichistundmit48%bereitseinenguten

produktbezogenenUmsatzliefert,derjedochnochweitererOptimierungbedarf.DesWeiterenkönnten

weitereAdsorberharze getestetwerden,derenPorengröße sowiePolaritätnochbesser aufdashier


48

erhalteneProdukt3 zugeschnitten ist.DieVerwendungvonLösungsmittelmithöheren logP‐Werten

(>1.25)könntezueinererhöhtenAusbeutewährendderAufarbeitungführen.

3.3.5 VariationderSubstrate

Alkylsubstituierte Caprolactone sind von großem Interesse für die Synthese von entsprechenden

Polymeren.DieCopolymerisationvonɛ‐Caprolacton (3)mitTrimethylcaprolactonenwurdevonder

FirmaDAICELpatentiert.[22]DurchUmsetzungderdarausentstandenenPolyolemitDiisocyanatewerden

Polyurethane erhalten, die sich durch exzellente Hydrolysebeständigkeit sowie durch hohe mecha‐

nischeStärkeundStabilitätgegenüberhohenTemperaturenundFeuchtigkeitauszeichnen.

Bei der BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von 3,5,5‐Trimethylcyclohexanon (55) entsteht auf chemischem

WegeeineracemischeMischungausdenRegioisomeren3,3,5‐und3,5,5,‐Trimethyl‐ɛ‐caprolacton(56

bzw. 57) (Abbildung 49). In diesem Fall werden vier Produkte gebildet, da es nur einen geringen

energetischenUnterschied der beidenwandernden Kohlenstoffatome gibt.[181] Die Anwesenheit von

Alkylsubstituenten macht sich auch in der längeren Reaktionszeit im Vergleich zur Oxidation von

Cyclohexanon(2)bemerkbar;sosinktdieReaktionsgeschwindigkeitmitsteigenderAnzahlanSubsti‐

tuentenebenfalls.AuchdieLängedesAlkylrestes in3‐PositionhateinenEinflussaufdieGeschwin‐

digkeit.

Abbildung49. ProduktederchemischenundenzymatischenBAEYER‐VILLIGER‐OxidationdesKetonsrac‐55.

IndieserArbeitsollteaußerdemdieMöglichkeitderbiokatalytischenDarstellungdesentsprechenden

Lactonsausgehendvon3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)mithilfederLk‐ADHundderCHMOunter‐

suchtwerden(Abbildung50).


49

Lk‐ADH

NADP+ NADPH

OH

O

O

5340mM

rac‐57

O

55O

O

+

rac‐56

CHMO

Abbildung50. EnzymatischeDoppeloxidationvon3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53).

BeidieserReaktionkonntemittelsNMR‐SpektroskopiejedochkeinUmsatzzudenLactonen56oder57

festgestellt werden. Das 13C‐NMR‐Spektrum zeigt keine für Carbonylfunktionen charakteristischen

SignaleimBereichzwischen170und220ppm,sodassdavonausgegangenwerdenkann,dassweder

dasKeton55nocheinsdermöglichenLactone56bzw.57inderReaktionsmischunganwesendsind.

Dass kein Keton 54 als Zwischenprodukt zu erkennen ist, stimmt mit den Ergebnissen aus den

vorherigenAktivitätsmessungenüberein.ZusätzlichsindallerdingsFremdsignaleindenNMR‐Spektren

zubeobachten,dienichtweiteridentifiziertwerdenkönnen.MöglicherweisewurdegebildetesLacton

zurjeweiligenSäurehydrolysiert.ImGC‐ChromatogrammkannjedocheinneuesSignalmit3%Fläche

gefundenwerden,waseinerKonzentrationvon1.2mMentspricht,wobeiderAlkohol53 sowiedas

Keton 55 aufgrund unterschiedlicher Retentionszeiten ausgeschlossen werden können. Die in

Abbildung50gezeigtenKonzentrationsunterschiedekönnenmitdenUnterschiedenderMessverfahren

begründetwerden.DermittelsNMR‐SpektroskopieerhalteneWertwurdeaufeinenexternenStandard

bezogen,welchernachderAufarbeitunginsNMR‐Röhrchengegebenwurde.IndiesemFallwurdedabei

aufPyridazin(58)alsStandardzurückgegriffen,umeventuelleÜberlagerungenderSignalemitUro‐

tropin(51)imaliphatischenBereichdesSpektrumszuvermeiden.DieviaGCerhaltenenWertewurden

ausdemVerhältniszwischenEdukt53unddenmöglichenProdukten56und57ermittelt.DerVerlust

derSubstanzendurchVerdampfenoderderextraktivenAufarbeitungkanndabeinichtberücksichtigt

werden.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

53 55 56+57

38,8

0 1,2

23,6

0 0Konzentration[m

M]

Komponente

GC NMR


50

So scheint bereits der erste Schritt, die Oxidation durch die Lk‐ADH, nicht stattzufinden. Die

MonooxygenaseausAcinetobactersp.istbekanntfürihrbreitesSubstratspektrumundwurdebereits

zurasymmetrischenOxidationvonsubstituiertenCyclohexanoneneingesetzt,umenantiomerenreine

Caprolactonezuerhalten.[182]Sowirdbei2‐oder4‐alkyliertemCyclohexanondas(R)‐Enantiomermit

hoherSelektivitätgebildet,wobeibeilängerenAlkylrestendieStereoselektivitätzunimmt.Racemische

3‐alkylierte Cyclohexanone liefern jedoch, besonders bei kleinen Alkylresten, ebenfalls beide Regio‐

isomerealsRacemate,dafürdieMonooxygenasekeineelektronischePräferenzexistiert(Abbildung49).

Parallel zu der Untersuchung der Oxidation von Trimethylcyclohexanol 53 sollte die enzymatische

BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von Isophoron (52) untersucht werden. Isophoron (52) wird aufgrund

seinerhervorragendenLösefähigkeitenalsLösungsmittelfürHarze,BindemittelundChemieprodukte

inderLack‐,Druckfarben‐undKlebstoffindustrie eingesetzt.[183] InderLiteratur istnureinFallder

OxidationvonIsophoron(52)beschrieben.RUIZetal.erhielten70%UmsatzzumentsprechendenLac‐

ton59,indemsieHydrocalcitealsOxidationsmittelverwendeten.[184]DabeifindetdieEpoxidierungder

DoppelbindungalsKonkurrenzreaktionstatt.EssindkeineenzymkatalysiertenAnsätzezurOxidation

vonIsophoron(52)bekannt.IndieserArbeitsolltediedirektebiokatalytischeDoppeloxidationvonIso‐

phoron(52)zumLacton59untersuchtwerden,wobeidieLk‐ADHzusammenmitiPrOHalsCofaktor‐

Regenerationssystemdienensollte(Abbildung51).

Lk‐ADH

NADP+ NADPH

O

O

59

O

52

OH O

CHMO

Abbildung51. EnzymatischeOxidationvonIsophoron(51)mittelsGCundNMR‐Spektroskopie.

IndenNMR‐Spektrenkonntennur59%Edukt52inBezugaufdenexternenStandardPyridazin(58)

wiedergefundenwerden,was23.6mMentspricht.ImGegensatzdazukonnteimGC‐Chromatogramm

0,05,010,015,020,025,030,035,040,0

52 59

39,9

0,1

23,6

0Konzentration[m

M]

Komponente

GC NMR


51

der Reaktionsmischung ein neues Signal beobachtet werden, was etwa 0.3% Fläche und 0.12 mM

entspricht. Auch in diesem Fall ist der Unterschied zwischen den erhaltenen Konzentrationen des

Ketons52sehrgroßundaufunterschiedlicheMessver‐fahrenzurückzuführen.EbensowieinAbbildung

50 wurden die via GC erhaltenenWerte durch das Verhältnis zwischen Edukt 52 und Produkt59

bestimmt.AuchindiesemFallwerdenVerlustederSubstanzenwährendderReaktionsführungsowie

Aufarbeitungnichtnäherbetrachtet.

Zwarscheintes,alskönnedieBVMOnahezualleSubstrateumsetzen,diedasaktiveZentrumerreichen,

jedochsind2‐Cyclohexenon‐DerivateAusnahmen,dienichtodernursehrlangsamvonderCHMOunter

denhiergewähltenReaktionsbedingungenumgesetztwerdenkönnen.[109,110]

4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen

53

4 EnantioselektiveRacematspaltungvon

Aminen

4.1 Lipasen

4.1.1 Allgemeines

Lipasen (Triacylglycerol‐Hydrolasen, EC 3.1.1.3) sind in der Natur allgegenwärtig und werden in

verschiedenenPflanzen,TierenundMikroorganismenexprimiert.[185]LipasenmikrobiellenUrsprungs,

hauptsächlichausBakterienundPilzen,repräsentierendieamhäufigstenverwendeteKlasseanEnzy‐

meninbiotechnologischenAnwendungenundinderorganischenChemie.SiefindenEinsatzineinem

breiten Spektrum industrieller Anwendungen, wie beispielsweise in der Lebensmittel‐Technologie,

Waschmittelundchemischen Industriesowie inderbiomedizinischenForschung.[185,186]Diemeisten

Lipasenwerden vonBakterien produziert,wodurch sich deren großtechnischeHerstellung viel ein‐

fachergestaltetunddiesedadurchvonbesonderemkommerziellem Interessesind. IhreEntdeckung

wurdebereits1901vonEIJKMANbeschrieben.[187]

ObwohlbereitseinebeträchtlicheAnzahlanStämmenzurProduktionvonLipasenverwendetwurden,

sind Candida sp., Pseudomonas sp. und Rhizopus sp. die wichtigsten Quellen.[186] Die natürlichen

SubstratederLipasensindlangkettigeTriacylglycerolevomTyp60,dieeinesehrgeringeLöslichkeitin

Wasserbesitzen(Abbildung52).[185]DurchHydrolysewerdenGlycerol(61)sowiedreiÄquivalenteder

entsprechendenFettsäure62erhalten.

Abbildung52. LipasenkatalysierteHydrolyseundSyntheseeinesTriacylglycerols60.[185]

Neben den lipolytischen, d.h. fettspaltenden Eigenschaften, besitzen die Lipasen noch eine ester‐

spaltende Aktivität.[185] Sie katalysieren neben der Hydrolyse und Umesterung außerdem die Alko‐

holyse, Acidolyse, Veresterung und Aminolyse.[186] Die Vorteile der Verwendung von Lipasen sind

vielfältig.DurchbereitsaufgelösteKristallstrukturenkanndaskatalytischePotentialvonLipasendurch


54

molekularbiologische Ansätze wie Protein engineering oder gerichtete Evolution weiter verbessert

werden.[188]LipasenbenötigenkeineteurenCofaktorenundsindchemoselektiv.Siebesitzeneinehohe

Substratbreite und sind hochspezifische Katalysatoren in Hinblick auf Regio‐ und Enantioselekti‐

vität.[189]AufgrunddieserEigenschaftensindLipasendieambreitestenangewendeteGruppevonBio‐

katalysatoren,wasauchdurchdiejährlichdurchschnittlich>1000VeröffentlichungenzudemEnzym

deutlichwird.[190]

LipasenbesitzenzudemdieFähigkeit, zwischendenEnantiomereneines racemischenGemisches zu

unterscheiden, was zu einem Einsatz von Lipasen zur kinetischen Racemattrennung führte. Solche

enantiomerenreinenoder–angereichertenKomponentengewinnen inderSynthesevonpharmazeu‐

tischen,synthetischorganischenundnatürlichenProduktensowieAgrarerzeugnissenimmermehran

Bedeutung.[185]

4.1.2 StrukturundMechanismus

BRADYetal. publizierten1990die ersteKristallstruktur einerLipase ausdemPilzMucormiehei.[191]

Gleichzeitig wurde die Struktur der Lipase aus humaner Pankreas von WINKLER veröffentlicht.[192]

SeitdemwurdennocheinigeweitereLipasenbakteriellenUrsprungsmittelsRöntgenstrukturaufgelöst.

AlledieseLipasenvariierenzwarstarkinderGröße(20–60kDa),habenjedochtrotzrelativgeringer

sequenziellerÜbereinstimmungenalle eineähnlichedreidimensionaleGesamtstrukturmitder soge‐

nanntenα/β‐Hydrolase‐Falte,diealsallgemeinesFaltmuster identifiziertwerdenkonnteundhaupt‐

sächlichausβ‐Faltblätternbestehtundvonα–Helicesflankiertwerden.[187]Solcheineα/β‐Hydrolase‐

FalteisttypischfürEnzyme,diekeineoffensichtlicheSequenzähnlichkeitaufweisen,jedochvoneinem

gemeinsamenVorfahrenabstammen.[187]

Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von unterschiedlichen Lipasen bestätigt deren

KlassifikationalsSerin‐Hydrolasen.[186]DasaktiveZentrumderLipasenenthälteinekatalytischeTriade

bestehend aus Ser‐His‐Asp‐Resten, wobei sich der Serin‐Rest in einem β‐εSer‐α‐Motiv im aktiven

Zentrumbefindet.DiesesMotivbestehtauseinemβ‐Faltblatt,einerSchleifemitSerininderε‐Position

undeinerα–Helix.DerunveränderlicheersteundletzteGlycin‐RestinderConsensus‐Sequenz(Gly‐x‐

Ser‐x‐Gly)diesesMotivsliegeninhelicalerKonformationvor,dieaufgrunddersterischenAnsprüche

diesesMotivskonserviertsind.[187]

Ein unübliches und interessantes Merkmal der Struktur der Lipasen ist, dass das aktive Zentrum

vollständig unter einer deckelartigen Struktur, bestehend aus ein oder zwei α–Helices, verdeckt ist.

DurcheineBewegungdesDeckelswirddasaktiveZentrumfürdasSubstratzugänglich.Diesestruk‐

turelleÄnderungdesProteinswirdbegleitet voneinerweiterenBewegung in einernahegelegenen

Schleife,wodurchdiesogenannteOxyanion‐Höhlefreigelegtwird.EineweitereFolgedieserKonforma‐

tionsänderungenistdieerheblicheVergrößerungderhydrophobenOberflächedesEnzyms,wasinder

Lipid‐Oberflächen‐ErkennungeineRollespielt.[187]

DasaktiveZentrumbestehtausdreiResten:einemSerin‐undeinemCarboxylat‐Rest,diebeidewasser‐

stoffverbrücktzueinemHistidin‐Restsind(Abbildung53).BeidemCarboxylat‐Restkannessichum


55

einen Aspartat‐ oder Glutamat‐Rest handeln. Während der Hydrolyse einer Ester‐Bindung findet

zunächsteinnucleophilerAngriffdesSauerstoffsdesSerin‐RestesaufdasCarbonyl‐Kohlenstoffatom

desEstersstatt,waszuderBildungdestetraedrischenIntermediatesführt(Schritt1).Dieseswirddurch

Wasserstoffbrückenbindungen zu Resten in der Oxyanion‐Höhle stabilisiert. Der Imidazol‐Ring des

Histidinswirdprotoniertunddadurchpositiv geladenunderhöht somitdieNucleophiliederSerin‐

Hydroxygruppe.DiesepositiveLadungwirddurchdienegativeLadungdesSäure‐Restes stabilisiert

(Schritt 2). Das tetraedrische Intermediat wird durch zweiWasserstoffbrückenbindungen zu Amin‐

FunktionenvonResten,die sich inderOxyanion‐Höhlebefinden, stabilisiert.Abschließendwirdder

Alkohol freigesetzt,welcherdanndenAcyl‐Enzym‐Komplexverlässt (Schritt3).Durcheinennucleo‐

philenAngriffeinesHydroxy‐IonswirddieFettsäurefreigesetztunddasEnzymregeneriert(Schritt4).

Abbildung53. DetaillierterMechanismusderHydrolyseeinerEster‐BindungdurcheineLipase.[187]Wasserstoffbrückenbindungenwerdengestricheltdargestellt.

LipasenbesitzendieFähigkeit,anderWasser/Öl‐Grenzflächezuagieren;diesesunterscheidetsievon

denEsterasen.[186]DasKonzeptderPhasengrenzen‐Aktivierung(‘interfacialactivation‘)ergibtsichaus

derAbhängigkeitderkatalytischenAktivitätderLipasenvondemAggregatzustanddesSubstrates,da

lipolytischeSubstrateineinemGleichgewichtzwischenMonomeren,MicellenundemulgiertemZustand

vorliegenkönnen.DieAktivitätderLipasenwirddurchunlöslicheSubstrate,dieeineEmulsionbilden,

erhöht.[193] Diese Erhöhung der Aktivierung wird ausgelöst durch strukturelle Veränderungen am

aktiven Zentrum.Während der Abwesenheit einerWasser/Öl‐Grenzflächewird das aktive Zentrum


56

durcheinenDeckel„geschlossen“.InAnwesenheitvonhydrophobenSubstanzenjedochöffnensichder

DeckelunddasaktiveZentrumundeswirdeinegroßehydrophobeOberflächeexponiert.

AusderHefeCandidaantarcticakonntenzweiLipasen,AundBgenannt,isoliertwerden.[194,195]Wievom

Namenersichtlichist,wurdederStammursprünglichinderAntarktismitdemZielisoliert,Enzymemit

extremen Eigenschaften zu finden.[195] Beide Lipasen unterscheiden sich stark. Die Lipase A ist ein

unspezifisches,thermostabilesundcalciumabhängigesEnzym.DieindieserArbeitverwendeteLipaseB

(CAL‐B)istetwaswenigerthermostabilundnichtcalciumabhängig.ObwohlderoptimalepH‐Bereich

beipH7liegt, istes imwässrigenMediumimBereichvonpH3.5–9 nochstabil.DieCAL‐Bhatein

Molekulargewicht von 33.3kDa und besteht aus 317 Aminosäuren (Abbildung 54). Die Consensus‐

sequenz (Gly‐x‐Ser‐x‐Gly) ist in der CAL‐B nicht vorhanden, da das erste Glycin durch Threonin

ausgetauschtwurde (Thr‐x‐Ser‐x‐Gly). Dadurch ergibt sich eine leicht veränderte Konformation des

Faltblattesundderα–HeliximVergleichzuanderenLipasen.AuchindieserLipaseisteinekurzeα‐Helix

desEnzymsdafürzuständig,alsDeckelzurKontrolledesaktivenZentrumszufungieren.Andersalsdie

meistenLipasenzeigtdieCAL‐BkeineGrenzflächen‐Aktivierung.DieCAL‐Bistnichtsoeffektivbeider

HydrolysevonTriacylglycolenwieandereLipasen,reagiertjedochsehrstereospezifischbeiHydrolysen

oderchemischenSynthesen.[98]

Abbildung54. KristallstruktureinerCAL‐B‐Mutante(links).DiestrukturellenWassermolekülesindalsrotePunktedargestellt(rechts).[11]

DieCAL‐B(Novozym435)istaufeinemmacroporösenPolymer‐Trägerimmobilisiert,deraufMethyl‐

undButylmethacrylesterbasiertunddurchDivinylbenzolquervernetztist.[36]DasImmobilisatbesitzt

einenProteingehaltvonetwa5%(w/w)deslyophilisiertenPulvers,wovonnurca.40%denGehaltder

Lipasedarstellen.[196]


57

4.1.3 EnantioselektivitätvonLipasen

ObwohldiegrobeStrukturunddiekatalytischeTriadederLipasensehrähnlichsindgibtesunterihnen

einengroßenUnterschiedinderSubstratspezifitätundderenAusmaß.[197]EineallgemeineRegelfürdie

Vorhersage der Enantioselektivität wurde von KAZLAUSKAS aufgestellt.[198] Die Regel basiert auf der

GrößederSubstituentenamStereozentrum.MittelsKristallstrukturdesEnzymkomplexesderLipase

ausCandida rugosa wurdemit dem schnell reagierenden (R)‐Ester eines sekundären Alkohols eine

WasserstoffbrückenbindungvomkatalytischenHistidin‐RestzumSauerstoffatomdesEstersgefunden.

DieseWasserstoffbrückenbindungfehltimKomplexdesEnzymszumlangsamreagierenden(S)‐Enan‐

tiomer.Generell gilt zudem,dassdieStereoselektivitätbeiunterschiedlichgroßenSubstituentenam

chiralenKohlenstoffatomhöheristalsbeiSubstituentengleicherGröße.[11,199]

Abbildung55. Schnellreagierendes(a)undlangsamreagierendes(b)EnantiomerindemModelldesaktivenZentrums,abgeleitetvonderKAZLAUSKAS‐Regel.[199]

TriacylglyceridekönnenanallendreiEsterfunktionenoderspezifischnuraneineroderzweiPositionen

gespaltenwerden.LipasenzeigenauchverschiedeneSelektivitätenabhängigvonderKettenlängeder

Ester.[11,199]


58

4.2 StandderWissenschaft:Aminsynthesen

Für die pharmazeutische, agrochemische und feinchemische Industrie ist die Synthese von enantio‐

merenreinen Aminen einwichtiger Bereich der organischen Chemie. Schätzungen zufolge enthalten

40‐50% aller optisch aktiver Wirkstoffe chirale Amine.[18] Zu den klassischen Synthesewegen von

chiralenAminengehörendieasymmetrischeHydrierung[200,201], Aminierung[18],Alkylierung[202]oder

Hydrosilylierung[203]vonIminen,oderdieHydrierungvonEnamiden.[204,205]Außerdemfindenbiokata‐

lytischeAnsätzewiederEinsatzvonTransaminasen[206,207]oderdiekinetischeRacematspaltungvon

racemischen Ausgangsverbindungen[31,208] zunehmend Anwendung. Einige Beispiele sind in den

folgendenAbschnittennäherbeschrieben.

4.2.1 KlassischchemischeundchemokatalytischeSynthesen

Die katalytische asymmetrische Addition von Organometall‐Reagenzien an Imine ist ein wichtiger

Syntheseweg zu optisch aktiven Aminen.[202] Die asymmetrische Addition an C=N‐Bindungen wird

generelldurchVerwendungvonchiralenAuxiliarenoderchiralenLigandenerreicht.Diesesbringtden

Vorteil einer einfachen Trennung der diastereomeren Produkte vor der Abspaltung des chiralen

Auxiliars mit sich. In den letzten Jahrzehnten fand die Addition von Organometall‐Reagenzien in

AnwesenheiteineschiralenLigandenvermehrtAnwendung.DieersteSynthesedieserArtberichtete

TOMIOKA.[202,209]DabeiwirddasgeschützteAmin63mitdemchiralenAminoether‐Liganden(S)‐64um‐

gesetzt(Abbildung56).

Abbildung56. AsymmetrischeAlkylierungdesgeschütztenImins63.[202,209]

Das entstehende Amin (R)‐65 kann mit einen nahezu vollständigen Umsatz von 98% und guten

ee‐Werten von75%erhaltenwerden,wobei derEinsatz von2.6Äquivalenten an (S)‐64 notwendig

waren.Selbstmit 5mol‐%desLiganden(S)‐64wirdimmernochenantiomerenangereichertesAmin

(R)‐65 mit 40%ee beobachtet. Der ee‐Wert kann bei ähnlichen Aminen durch Verwendung des

Bidentat‐LigandenBisoxazalinauf91%gesteigertwerden.[210]AuchDialkylzink‐Verbindungenkönnen

in Anwesenheit von chiralen Liganden zu sehr guten Enantiomerenüberschüssen führen.[202,211] In

neuerer Zeit zeigten auchAllylstannaneundAllylsilane guteErgebnisse.[212] Aufgrundder extremen


59

Reaktionsbedingungen (‐100°C) sind diese Organometall‐katalysierten Reaktionen aus industrieller

Sichtschwierigzurealisieren.

EinederinteressantestenReaktionenderorganischenChemieistlautdemGreenChemistryInstituteof

AmericanChemicalSocietydieasymmetrischereduktiveAminierungvonprochiralenCarbonylverbin‐

dungen.[18]DabeigibteszweiMöglichkeitenderAminsynthese:diedirekteunddieindirektereduktive

Aminierung(Abbildung57).BeiderindirektenAminierungwirddieCarbonylverbindung66miteinem

AminzueinemImin66oderEnaminalsZwischenproduktumgesetzt,welchesisoliertundanschließend

enantioselektivweiterzumchiralenAmin68reduziertwird.EineLimitierungbestehtallerdingsinder

StabilitätdeszuisolierendenZwischenproduktes67.DiedirekteAminierungumgehtdieIsolationdes

Zwischenproduktes,indemdieCarbonyl‐Komponente66direktzumchiralenAmin68reduziertwird.

AlshomogeneKatalysatorendienenPt,Pd,NioderRhmitchiralenP‐Liganden.Veränderungeninder

StrukturderDiphosphin‐LigandensowiedersterischenundelektronischenFaktorenmachensichin

drastischen Abweichungen in Reaktivität und Stereokontrolle bemerkbar. Die Aminierung mit Am‐

moniakalsStickstoff‐DonoristimmernocheinungelöstesProblem.AufdiebiokatalytischeAminierung

wirdinKapitel4.2.2eingegangen.

Abbildung57. IndirekteunddirektereduktiveAminierungvonCarbonylverbindungen66.[18]

Die direkte asymmetrische Aminierung findet in der industriellen Herstellung von (S)‐Metolachlor

((S)‐69)derFirmaSYNGENTA(ehemalsNOVARTIS)Anwendung(Abbildung58).[213,214](S)‐69istderaktive

BestandteilinDUAL®,einemderwichtigstenHerbizide.DurchdiechiraleAchse(Atropisomerie)sowie

das stereogeneZentrumergeben sich für (S)‐69 vierStereoisomere.DieseMischungwird seit 1976

durch Pt‐Katalyse in Anwesenheit von Schwefelsäure mit >20000 t/a produziert. Nachdem 1982

erkanntwurde,dass95%derAktivitätvondenbeiden(1‘S)‐Diastereomerenausgeht,konnte1997eine

enantiomerenangereicherte Form (Handelsname DUAL MAGNUM®) der beiden (1‘S)‐Diastereomere

(90% ee)mit >10000 t/a in den Handel gebracht werden. Dieses führte zu einer Reduzierung der

Umweltbelastungumetwa40%imVergleichzurracemischenMischung.FürdieSynthesedes(S)‐69

wird das sterisch gehinderte Anilin70mitMethoxyaceton (71) umgesetzt. Der Schlüsselschritt der

SynthesevonMetolachlor((S)‐69)istdieIridium‐katalysierteenantioselektiveHydrierungdesImins

72.DeroptimierteProzessverläuftbei50°Cund80barWasserstoff‐Druck.DerKatalysatorwirdinsitu

aus [Ir(COD)Cl]2 unddemFerrocenyl‐Diphosphin‐LigandenXyliPhos (73) generiert. InAnwesenheit


60

vonTBAI(Tetrabutylammoniumiodid)undSäurekann innerhalbvondreiStundeneinvollständiger

Umsatzmitbiszu78%eeerreichtwerden.AnschließendwirddasAmin(R)‐74mitChloracetylchlorid

((R,S)‐75)zum(S)‐69umgesetzt.DiesesisteinsehrschnellerundeffizienterkatalysierterProzessim

gleichzeitiggrößtenMaßstab,derzurzeitinderIndustrieAnwendungfindet.

Abbildung58. EnantioselektiveasymmetrischereduktiveAminierungzurSynthesevon(S)‐Metola‐chlor((S)‐69).[213]

DiekatalytischeasymmetrischeHydrierungvonIminenstellteineweitereMöglichkeitzurSynthesevon

chiralenAminendar,wobeisichzweizähnigePhosphor‐Ligandenamerfolgreichstenbewährthaben.

VieleMethodenderasymmetrischenHydrierung liefernoftmalsnureinegeringeEnantioselektivität

undbenötigendenEinsatzvonSchutzgruppen.ZHANGetal.zeigtendieasymmetrischeHydrierungvon

ungeschützten Iminen 76, die durch Addition von Organometallen an Nitrile 77 isoliert werden

(Abbildung59).[200,201]

Abbildung59. Iridium‐katalysierteasymmetrischeHydrierungdesImins76.[201]

Die Iridium‐katalysierteHydrierungdes Imins76durchdenstarrenundelektronenreichenchiralen

Ferrocen‐Phosphan‐Liganden(S,S)‐78liefertdasAmin(R)‐79insehrgutenUmsätzenvonbiszu99%

und93%ee.DieSperrigkeitdesRestesR2imIminhateinengroßenEinflussaufdieEnantioselektivität


61

derHydrierung.Miteinertert‐Butyl‐GruppeanstelleeinerMethyl‐Gruppesinktderee‐Wertvon99%

auf80%.TrotzdersehrgutenErgebnisseergibtsicheinNachteilinderVerwendungvonKetoiminen

76 als Substrate, dadieseoftmals nur inMischungen vonE/Z‐IsomerenundKeto‐Enol‐Tautomeren

erhaltenwerdenkönnen.

DiereduktiveAminierungvonCarbonylverbindungenzuAminendurchAmeisensäureunterHydrid‐

Übertragung ist als LEUCKART‐WALLACH‐Reaktion bekannt.[215] KADYROV et al. beschrieben 2003 die

asymmetrische reduktive Aminierung von Acetophenon (46) mittels Ruthenium‐Katalyse (80) und

AmmoniumformatalsHydrid‐Donor(Abbildung60).[216]SäurenbeschleunigendieReduktion, jedoch

habensieeinennegativenEinflussaufdieasymmetrischeInduktion.DerEinsatzvonAmmoniakführt

zueinerErhöhungderSelektivität,aberauchzueinerVerringerungderReaktivität.Bei5 ‐10Äqui‐

valentenHCOONH4inNH3/Methanol(15–25%)undTemperaturenvon60–85°Cwurdendiebesten

Enantioselektivitätenerhalten.DasProduktwurdealsfreiesAmin(rac‐4)undinN‐formulierterForm

(81)alsHauptproduktdieserReduktionerhalten.NachHydrolysevon81wirddasAmin(rac‐4)mit

hoher Enantioselektivität (86 – 98% ee) erzielt,wenn ein aromatischesKeton als Edukt verwendet

worden ist. Mit aliphatischen Ketonen konnten unter den gegebenen Bedingungen nur Spuren des

entsprechendenAminsbeobachtetwerden.

Abbildung60. Asymmetrische Aminierung von Acetophenon (46) mittels Ruthenium‐Katalyse(80).[216]

EbenfallsinteressantistdiedreistufigeSyntheseoptischaktiverAmidevonBURKetal.durchenantio‐

selektivekatalytischeHydrierungvonEnamidenmitRhI/DuPhos (S,S)‐82 (Abbildung61).[204,205]Die

EnamidewiederumsinddurchReduktionderOximemitEisenzugänglich.AusgehendvomPinakolon‐

Oxim83wirddasnahezuenantiomerenreineAmid(R)‐85überdenZwischenschrittdesEnamins84

erhalten,wobeinur0.1mol‐%desKatalysatorsbenötigtwird.DasAmid(R)‐85kannanschließendzum

primärenAmin(R)‐86hydrolysiertwerden.NachteilediesesProzessessinddieaufwändigeSynthese

der Enamin‐Vorstufe83, da diese durch Addition von Alkyl‐Grignard an Nitrile hergestelltwerden,

sowiediegeringeAusbeutevon20‐40%desEnamids84.


62

Abbildung61. EnantioselektivekatalytischeHydrierungvonEnamin84mitRhI/(S,S)‐82.[204,205]

Rhodium‐katalysierteasymmetrischeHydrierungsreaktionenvonEnamidenwerdenerfolgreichauch

mit anderenLigandendurchgeführt. In allen Fällenwirdder eigentlicheKatalysator ausderMetall‐

Spezies[Rh(COD)2]BF4unddemjeweiligenLigandeninsituhergestellt.DerPhosphin‐Aminophosphin‐

Ligand (S)‐87 liefert einen quantitativen Umsatz und ee‐Werte bis zu 94% (Abbildung 62).[217] Die

einfacheZugänglichkeitaus(S)‐Phenylethylamin((S)‐4),dieModularität,diesehrguteLuft‐undFeuch‐

tigkeitsstabilitätundderniedrigePreismachendiesenLigandenextremattraktiv.DerPhthalaPhos‐

Ligand(S)‐88enthälteinePhthalsäurediamid‐Einheit,dieguteDonor‐undAkzeptor‐Eigenschaftenzur

AusbildungvonWasserstoffbrückenbindungen,waszusupramolekularenWechselwirkungenzwischen

zwei Liganden, die einem supramolekularen Bidentat‐Liganden bilden, und dem Substrat führt.[218]

DurchVariationverschiedenerEinheitendesLiganden,wiebeispielsweisedemLinker,könnendiese

Eigenschaften weiter angepasst werden. Die Reaktionen laufen ebenfalls mit guten Umsätzen und

ee‐Wertenvon>97%ab.

Abbildung62. ChiralerPhosphin‐Aminophosphin‐Ligand(S)‐87undPhthalaPhos‐Ligand(S)‐88zurasymmetrischenHydrierungvonEnamiden.[217,218]

DerLigand(S)‐89 isteinhocheffizienterpolymergebundenesMonophosphit‐LigandvomBINOL‐Typ,

dereinePEG‐StrukturalsAlkoxyeinheitgebundenhat(Abbildung63).[219]DieProduktederRhodium‐

katalysierten asymmetrischen Hydrierung von Enamiden werden bei Raumtemperatur und 60 bar

WasserstoffdruckmitquantitativemUmsatzmitbereitssehrgutenee‐Wertenvon>96%erhalten.Bei

einer ErhöhungderKatalysatormenge von 0.2%auf 1.0mol%und einerVerringerungdesWasser‐

stoffdruckesaufnur10barkonntedieEnantioselektivitätnochweiterauf>98%gesteigertwerden.Als

Substrate eignen sich außerdem β‐Aminoacrylate, wobei sowohl (E)‐ als auch (Z)‐90 zur entspre‐


63

chendenAminosäure91umgesetztwerdenkönnen.Hierbeiweist(E)‐90einehöhereAktivitätalsdas

(Z)‐Isomer(94%bzw.73%Umsatz)auf, jedochbleibendieEnantiomerenüberschüssemit96%bzw.

97%bei einerKatalysatorbeladungvon0.1mol%etwagleich. SperrigereSubstituentenwiedie iso‐

Propyl‐GruppeführenzuoptimiertenErgebnissen,allerdingswirddabeieineUmkehrderSelektivität

von(S)zu(R)beobachtet.WeitereVorteilevon(S)‐89sinddieleichteZugänglichkeit,Luftstabilität,ein‐

facheAbtrennungsowiedieRecyclisierbarkeitdesKatalysator‐Systems.

Abbildung63. AsymmetrischeRh‐katalysierteHydrierungvonEnamiden90(links)mitdemMono‐phosphit‐Liganden(S)‐89(rechts).[219]

DieMöglichkeiten zur chemischenasymmetrischenSynthese chiralerAmine sind sehr vielfältigund

liefern indenmeistenFällensehrguteUmsätzesowiehoheEnantiomerenreinheiten.DieSynthesen

verlaufenjedochoftmehrstufigunderfordernOrganometall‐KatalysatorenundLiganden,diekosten‐

intensivsindundaufwendighergestelltwerdenmüssen.AuchkönnendieReaktionsbedingungennicht

direktaufandereSubstrateübertragenwerden,sodassjederSchrittindividuelloptimiertwerdenmuss.


64

4.2.2 EnzymkatalysierteSynthesen

ZurbiokatalytischenSynthesevon chiralenAminengibt esunterschiedlicheAnsätzeausgehendvon

prochiralen Carbonylverbindungen oder von racemischen Aminen bzw. Amiden wie die Transami‐

nierung, die Deracemerisierung und die kinetische sowie dynamisch kinetische Racematspaltung

(Abbildung64).

Abbildung64. MethodenzurbiokatalytischenSynthesevonchiralenAminen.[220]

SeitBRAUNSTEIN1939erstmalsvondemTransfereinerAminofunktionzwischeneinerDonor‐Amino‐

säure und einer α–Ketosäure als Akzeptor durch lebendes Gewebe tierischenUrsprungs berichtete,

zähltdieEnzymklassederTransaminasezudenambestenuntersuchtePyridoxalphosphat‐abhängigen

Enzymen.[221]EinvonCELGENEentwickeltesindustriellesVerfahrenzurbiokatalytischenSynthesevon

chiralen Aminen nutzt die Transaminierung. Dabei katalysieren Transaminasen die asymmetrische

ÜbertragungeinerAminofunktionaufeineCarbonylverbindungwieKeton46odereineα‐Ketosäure,

wobei Pyridoxalphosphat 92 als Cofaktor dient, in dem die Aminofunktion sowie das Reduktions‐

äquivalentgespeichertwerden(Abbildung65,A).[207,222]Dasowohl(S)‐alsauch(R)‐selektiveTrans‐

aminasenentwickeltwurden,sindbeideEnantiomerederAminezugänglich.[208]EinprochiralesKeton

46 übernimmt dabei vom Amin‐Donor (S)‐93 eine Aminofunktion. Enantiomerenreines (S)‐4 und

AcetonentstehenmiteinerAusbeutevon>90%.DesWeiterenkanndieReaktionauchimSinneeiner

Racematspaltung geführt werden (Abbildung 65, B). Dabei wird das (S)‐4 in das entsprechende

Acetophenon(46)umgewandelt.AlsAminogruppenakzeptorwerdenAldehydewie94verwendet,aus

demdasAmin95entsteht.DasAmin(R)‐4wirdenantiomerenreinmitmaximal50%Umsatzerhalten.

AllerdingserweistsichdieTrennungderProduktmischungenausderRacematspaltungalsaufwendig.


65

TransaminasenakzeptiereneinbreitesSubstratspektrumanaliphatischenundaromatischenKetonen

undAminen.[208]EinNachteilbestehtallerdingsinderAbhängigkeitdesEnzymsvonwässrigenMedien.

DaherwerdenmithydrophobenReagenzienmeistnurgeringeProduktkonzentrationenerzielt.

Abbildung65. Enantioselektive Transaminierung von Keton rac‐4mit dem Cofaktor Pyridoxal‐phosphat92(A)undRacematspaltung(B).[208]

Die mehrstufige Synthese von Sitagliptin ((R)‐96), einem Wirkstoff zur Behandlung von Diabetes

mellitusTyp2,umfasstunteranderemeineRhodium‐katalysierteasymmetrischeReduktioneinesEn‐

amins.[206,207] Das in Kapitel 4.2.1 beschriebene chomokatalytische Verfahren enthält ein toxisches

SchwermetallalsKatalysator,welchesaufwendigwiederentferntwerdenmuss.AlsAlternativewurde

vonMERCK&Co.undCODEXIS,INC.einbiokatalytischerProzessentwickelt(Abbildung66),der2010mit

demGreen ChemistryAward für eine verbesserte grüne Synthese ausgezeichnetworden ist.[223] Die

ω‐TransaminasekatalysiertdieÜbertragungderAmin‐FunktionsowiedesReduktionsäquivalentesvon

einergünstigenStickstoffquellewie2–Propylamin(rac‐93)aufdasDiketon97.DurchdieFlüchtigkeit

des gebildetenAcetonswirddasGleichgewicht zurProduktseite verschoben.DieReaktionwirdmit

einerhohenSubstratkonzentrationvonbiszu500mMund>40°CReaktionstemperaturdurchgeführt.

Sitagliptin((R)‐96)wirdinnerhalbvon24StundenmiteinemUmsatzvon90–95%undeinemEnantio‐

merenüberschussvon99.5%gewonnen.

Abbildung66. BiokatalytischeSynthesevonSitagliptin((R)‐96)mittelsω‐Transaminase.[206,207]


66

Die Deracemerisierung von racemischen Aminen, wie α–Aminosäuren, wurde kürzlich durch die

KupplungeinerenantioselektivenOxidationmittelseinerD‐spezifischenAminoxidaseundeinerche‐

mischen,nicht‐selektivenReduktiondurchgeführt(Abbildung67).[224]DieserProzessführtsomitzur

Bildung von L‐98 ausgehend vom prochiralen Imin99. Da chirale Amine jedoch nicht von Amino‐

säureoxidasenoxidiertwerdenkönnen,wurdeninneuererZeiteineAminoxidaseausAspergillusniger

als aktiverBiokatalysator identifiziert.[225] Somitkannnuneinbreites Substratspektruman chiralen

Aminenmit guterEnantioselektivitätumgesetztwerden. InallenbekanntenFällen istdiesesEnzym

(S)‐selektiv.AllerdingssindfürAnwendungeningroßemMaßstabnochOptimierungeninHinblickauf

Selektivität,AktivitätundStabilitätnotwendig.

Abbildung67. DeracemerisierungeinerD‐α‐AminosäureD‐98mittelseinerAminoxidase.[224]

ImgroßenMaßstabwerdenLipasenzurbiokatalytischenSynthesevonchiralenAminenherangezogen.

Nach einer Empfehlung von IUPAC ist eine kinetische Racematspaltung wie folgt definiert: „Das

ErreichenvoneinerteilweisenodervollständigenTrennungaufgrundvonunterschiedlichenReaktions‐

geschwindigkeitenderEnantiomereeinesRacematesmiteinemchiralenAgens(Reagenz,Katalysator,

Lösungsmittel, etc).“[226] Im einfachsten Fall einer Racematspaltung regieren die Enantiomere des

SubstratsmiteinemchiralenAgensoderKatalysatorüberzweidiastereomereÜbergangszustände.Die

EnergiendieserÜbergangszuständebestimmendieGeschwindigkeitskonstantenfürdieUmsetzungdes

langsamunddesschnellerreagierendenEnantiomersunddamitdieProduktverteilung.[37]Zwarwurden

vermehrtchemischeKatalysatorenzurRacematspaltunggetestet,allerdingskonntendieErgebnisse,die

mitvielenBiokatalysatorenerzieltwurden,nichtübertroffenwerden.[208]

Anfangder90erJahrenwurdenbeiSHELLersteArbeitenzurenantioselektivenHydrolyseracemischer

AmidemittelsArthrobactersp.durchgeführt,wobeisichdieVerwendungvonganzenZellensowiedie

sehrlangenReaktionszeitenalsnachteiligerwiesen.[227]Mitteder90erJahrewurdenvonderBAYERAG

MethodenzurselektivenHydrolysevonracemischenAcetamidenwie100mitLipaseBausCandida

antarctica (CAL‐B) als Biokatalysator ausgearbeitet (Abbildung 68).[228] Die CAL‐B hat sich, in Form

eines Immobilisats auf einemAcrylamid‐Träger (Novozym435), in einerReihevonArbeiten alsdie

geeignetsteLipaseerwiesen.[27–29]AufgrundunbefriedigenderRaum‐Zeit‐Ausbeuten,43%Umsatznach

sieben Tagen Reaktionszeit, wurde dieser Prozess trotz sehr guter Enantiomerenüberschüssen von

>99.5%technischnichtangewendet.[208]


67

Abbildung68. SelektiveHydrolysedesracemischenAcetamidsrac‐100nachBAYERAG.[228]

Nach einemvonBASFSEpatentiertenVerfahrender enantioselektivenAcylierung, der sogenannten

kinetischen Racematspaltung, von Amin rac‐4 wird in der ersten Stufe nahezu enantiomerenreines

Amin(S)‐4unddasentsprechendeAmid(R)‐102mit>99%eeerhalten.[208]EineBesonderheitstelltder

induktiveEffektderMethoxygruppedar,diedieReaktivitätanderCarbonylfunktionaktiviert.Durch

MolecularModellingeinesÜbergangszustandeskonnteeineWasserstoffbrückenbindungzwischendem

β‐Sauerstoffatom des Esters103 und der Aminofunktion von rac‐4 ermittelt werden.[229,230] Wahr‐

scheinlichstabilisierendieseWechselwirkungsowieinduktiveEffekteundsterischeGründedenÜber‐

gangszustandunderhöhendadurchdieReaktionsgeschwindigkeit.

NachAbtrennungvon(R)‐102durchDestillationoderExtraktionwirddasebenfallsenantiomerenreine

(R)‐4 durch basische Hydrolyse freigesetzt. Die Substratbreite ermöglicht die Racematspaltung von

vielenstrukturellsehrunterschiedlichenAminen.WeitereVorteilediesesProzessessinddieMöglich‐

keit zur Rückführung der unerwünschten Enantiomere durch Racemisierung[231–233] und die Rück‐

gewinnung des Acylierungsmittels[234]. Seit Anfang 2002 produziert BASF SEmit diesem Verfahren

optischaktiveAminemit>3500t/aundistsomitderweltweitführendeAnbieterchiralerAmine.[208]

Abbildung69. Enantioselektive Amidbildung ausgehend von rac‐4 nach BASF SE.[208] BasischeHydrolysevon(R)‐102ergibt(R)‐4.

Bei der Umsetzung von cyclischen Aminoalkoholen[235] und Diaminen (wie (±)‐104)[236,237] wird

ebenfalls CAL‐B als Biokatalysator verwendet. Im Fall des Diamins (±)‐104 können mit Dimethyl‐

Malonester (105) als Acyldonor zwei sequenzielle Acylierungsreaktionen durchgeführt werden

(Abbildung70).[236,237]DabeiwirdzunächstdurchMonoacylierungdasoptischangereicherteMonoamid


68

(R,R)‐106mit 66%Enantiomerenüberschuss unddas nicht umgesetzteAmin (S,S)‐104mit 83%ee

erhalten.DerzweiteAcylierungsschrittistenantioselektiv,wodurchdasDiamid(R,R)‐107mit>99%ee

erzieltwerden.DieCAL‐BzeigtfolglichinbeidenSchrittendiegleichePräferenzinBezugaufdas(R,R)‐

Enantiomer.DiesesErgebnisstehtinEinklangmitderRegelvonKAZLAUSKAS,dadasmonoacylierteAmid

(R,R)‐106 einengrößerensterischenUnterschied indenSubstituentenaufweistalsdas freieDiamin

(±)‐104.[28]

Abbildung70. Lipasen‐katalysierte doppelte Acylierung des Diamins (±)‐104 mit Malonsäure‐dimethylester(105)alsAcyldonor.[236,237]

Die Optimierung der katalytischen Aktivität und Selektivität der CAL‐B kann durch Variation des

LösungsmittelssowiedesAcyldonorserreichtwerden.DaAminesehrguteNucleophilesind,können

hochreaktiveAcyldonorenbereitsdurchspontanenicht‐enzymatischenucleophileSubstitutionzurace‐

mischenAmidenführen.[31]GILetal.zeigtendieAkzeptanzeinesbreitenSubstratspektrumsderCAL‐B

amBeispielderAcylierungvonrac‐108(Abbildung71).[31]Sowohlkurz‐alsauchlangkettigeCarbon‐

säurenundEster,wieLaurinsäure(109)unddessenEster110,wurdendabeialsAcyldonorengetestet,

wobeidieEnantioselektivitätsowiedieReaktionsgeschwindigkeitmitsteigenderKettenlängezunimmt.

AllerdingskanndieserEinflussnichtalsallgemeinerTrendfürLipasenangesehenwerden.Währendmit

simplenEstern,dasbekanntestedavon istEssigester5,nurbiszu91%eeerhaltenwerdenkönnen,

liefertMethoxyessigsäureethylester(111)innur1.5Stunden>99.5%ee,dasAmid(R)‐8allerdingsnur

mit77.4%ee.


69

Abbildung71. EnzymatischeAcylierungvonrac‐108mitunterschiedlichenAcyldonoren.[31]

Ein großerNachteil der kinetischenRacematspaltung ist die LimitierungdesUmsatzes aufmaximal

50%.AusdiesemGrund istdieRacemisierungeinwichtigesHilfsmittel,das inKombinationmitder

biokatalytischenkinetischenRacematspaltungzueinemUmsatzvontheoretisch100%undeinemeffi‐

zienterenGebrauchdes gesamtenRacemates führenkann. EinmöglicherMechanismusderRacemi‐

sierungbestehtauseinerKombinationvonDehydrierungdeschiralenAminsundeinerRe‐Additionvon

WasserstoffandasImin.[231]DesWeiterenistdiebasenkatalysierteRacemisierungdesresultierenden

chiralenAminsmöglich.[238]EinSchlüsselproblemderdynamisch‐kinetischenRacematspaltung(DKR)

istes,Bedingungenzufinden,unterdenenderBio‐undderChemokatalysatoreffizientarbeitenkönnen.

WenndaserwünschteEnantiomerdas(R)‐Produktist,dannistbeidenReaktionsgeschwindigkeitender

einzelnenSchrittefolgendeReihenfolgevorausgesetzt:krac>kR>kS(Abbildung72).[239]

Abbildung72. Schemaderdynamisch‐kinetischenRacematspaltung(DKR).[239]

REETZundSCHIMOSSEKbeschrieben1996dieerstedynamisch‐kinetischeRacematspaltungmitPalladium

aufAktivkohlealsKatalysator,wobeinachfünfTageReaktionszeiteinUmsatzvon64%zumAmidund

ein Enantiomerenüberschuss von 99% erreicht werden konnte.[240] Weitere Ansätze verwendeten

Pd‐Partikel immobilisiert auf Trägern wie BaSO4[241] oder einen Palladium‐Nanokatalysator einge‐

schlosseninAluminiumhydroxid.[242]BÄCKVALLetal.kombiniertendieCAL‐BschließlichineinerZwei‐

stufen‐SynthesemitdemRuthenium‐Katalysator116,derinähnlicherFormbereitserfolgreichbeider

RacemisierungvonAlkoholenVerwendungfindet(Abbildung73).[231]AusgehendvondenAminenrac‐4

und rac‐117werdendieAmide (R)‐7 und (R)‐118nahezuenantiomerenreinmit>98% eeundmit

Umsätzenvon69%bzw.66%erhalten.DieAnwesenheitvonelektronenschiebendenGruppenerhöht


70

dieGeschwindigkeitderRacemisierung.AllerdingserfordertdieseMethodeeineextraktiveTrennung

des(S)‐AminsvomProduktfürdieanschließendeRacemisierung.IndenletztenJahrenwurdenweitere

Katalysatorenentwickelt,beispielsweisedurchModifizierungenvon116[232,233]oderdurchEinsatzvon

MetallenwieIridium[239]oderdemThiyl‐Radikal[243],diehöhereReaktionsgeschwindigkeitenundSelek‐

tivitätenaufweisen.

Abbildung73. DKRausgehendvonrac‐4undrac‐117mitdemRuthenium‐Katalysator116.[231]

InneuererZeitgibtesauchVersuche,dieRacemisiserungbiokatalytischdurchEinsatzvonRacemasen

anstellevonChemokatalysatorendurchzuführen.InderNaturgibteswegenderMehrzahlanstereo‐

spezifischenProzessen nur eine kleineAnzahl anRacemasen.Die ambesten untersuchteMandelat‐

RacemaseausPseudomonasputidaATCC12633istaufgrundderStabilität,demrelativbreitenSubstrat‐

spektrumsowiederCofaktor‐UnabhängigkeiteinattraktiverBiokatalysatorfürRacemisierungenvon

Hydroxy‐Carbonsäuren.[244] Die geringe Aktivität gegenüber nicht‐natürlichen Substraten konnte in

diesemFallbereitsdurchMutationenoptimiertwerden.DieAnwendungdermeistenRacemasen ist

jedochaufAminosäurenundderenDerivatebeschränkt.[238]Dafür jedeSubstratklassediegeeignete

Racemase gefunden und verbessert werden muss steckt die generelle Anwendung von Racemasen

jedochnochindenAnfängen.[11]

TrotzseinesVorteilsalsnicht‐toxischesundnatürlichesLösungsmittel istWasser fürvieleunpolare

organische Substrate ein schlechtes Lösungsmittel. Oft finden Nebenreaktionen statt und die Rück‐

gewinnungderProduktegestaltetsichschwierig.SogehörtdieimVergleichzuWassererhöhteLöslich‐

keitvonunpolarenSubstraten,sowiedieVermeidungderHydrolysedesgebildetenProdukteszuden

Vorteilen der Verwendung von Enzymen in organischen Lösungsmitteln.[245] Dennoch ist die kata‐

lytische Aktivität der Enzyme in organischen Lösungsmitteln häufig um einige Größenordnungen

geringeralsinwässrigenSystemen.DieseslässtsichteilweiseaufdieLimitierungderDiffusionsowie

ÄnderungenderFlexibilitätundDestabilisierungdesEnzymszurückführen.AuchbeiEnzymen,diein

organischenMedienaktivsind,isteinegeringeMengeanWassernotwendig.GenerellsindzweiArten

von Wassermolekülen im Enzym vorhanden. Die Wassermoleküle in der „inneren Klasse“ sind im

InnerendesEnzymsgebundenundspieleneinewichtigeRolleindessenTertiär‐Struktur.DieWasser‐

moleküleder„Kontakt‐Klasse“sindnurschwachanderOberflächedesEnzymsgebundenundkönnen

beigetrocknetenEnzymendreiGew.%odermehrausmachen.[246]Diesekönnenschnelldurchandere

Moleküleausgetauschtwerden,waseinegroßeFlexibilitätdesEnzymszurFolgehat.UnpolareLösungs‐

mitteltauschennureinenTeildieserWassermoleküleausundführensomitzuverringerterFlexibilität,

während polare Lösungsmittel stärker an der Oberfläche binden. Die Verwendung von organischen


71

LösungsmittelnistausmehrerenGründennachteiligfürdenEinsatzinderIndustrie.[247]Siesindmeist

starkflüchtigundderenVerwendungbedarfkostenintensivenNachbehandlungenwieAbdampfenund

Recycling.DesWeiterenführtderEinsatzvonLösungsmitteldurchdiehoheVerdünnungzurVerringe‐

rungderRaum‐Zeit‐Ausbeute.DemnachwäreeinlösungsmittelfreierProzesssowohlausökologischer

undökonomischerPerspektivevongroßemVorteil.

Lösungsmittelfreie Systeme sind hauptsächlich bei der biokatalytischen Acylierung von Alkoholen

bekannt.[248,249]Fürdielipasenkatalysierte,lösungsmittelfreieRacematspaltungvonAminen,indenen

derAcyldonornichtalsLösungsmitteldient,sindstrengeReaktionsbedingungensowieerhöhteTempe‐

raturenundverminderterDrucknotwendig.SobeschriebenKATOetal.,aufbauendaufden früheren

ArbeitenvonHULT, eineder ersten enantioselektiven lipasenkatalysierteAcylierungvonAminrac‐4

durch Reaktion mit Carbonsäuren 119 und 109 in einem lösungsmittelfreien System (Abbildung

74).[250,251]DasGleichgewichtderReaktionwirdzugunstenderBildungderAmide(R)‐120verlagert,

indem das als Nebenprodukt gebildeteWasser kontinuierlich unter niedrigemDruck entferntwird.

AufgrundderViskositätderReaktionsmischungmusstebei55°Cgearbeitetwerden,umeineeffiziente

Durchmischung des Systems zu ermöglichen. Die Acylierung liefert Enantiomerenüberschüsse von

>97%fürdasAmid(R)‐120‐abzw.>99%für(R)‐120‐bbeimäßigenUmsätzenvon32bzw.45%.Kurze

ZeitspäterberichteteGUPTA,dasseinvollständigerUmsatzdurchzusätzlichesErhitzenderReaktions‐

mischungauf90°Cerreichtwerdenkann.[252]AllerdingswerdenhierbeikeineAngabenzurStabilität

desEnzymsgemacht.

Abbildung74. LösungsmittelfreiebiokatalytischeAcylierungvonrac‐4.[250]

KANERVAetal.schließlichführtendielösungsmittelfreieRacematspaltungunterschiedlicherAminemit

äquimolarerMenge an aktiviertenMethoxyesternmittels CAL‐B bei Raumtemperatur durch.[36] Alle

(S)‐Amineund (R)‐AmidekonntenmithoherEnantiomerenreinheit von≥95%erhaltenwerden.Die

größtenUnterschiedezwischenReaktioneninGegenwartoderAbwesenheitvonorganischenLösungs‐

mittelnliegeninderbenötigtenZeit,um50%Umsatzzuerreichen,sowieinderEnzymeffizienz,dastatt

100mgEnzymprommolSubstratindiesemFallnurnoch25mgEnzymbenötigtwurden.Außerdem

konnte die Reaktionstemperatur auf 23 °C gesenkt werden ohne Verluste in den Umsätzen oder

ee‐Wertenzubeobachten.

In der Arbeitsgruppe von GRÖGER wurde Malonsäurediethylester (9) als effizienter Acyldonor in

n‐HeptanalsorganischesLösungsmitteleingesetzt.[33,34]DabeiwurdedasAmid(R)‐10bei80°CReak‐

tionstemperaturnach4.5StundenmitvollständigemUmsatznahezuenantiomerenreinerhalten.[33,34]


72

InderselbenArbeitsgruppewurdeanschließendderMalonester9erfolgreichunterlösungsmittelfreien

Bedingungeneingesetzt.SokonnteineinemgrößeremMaßstabvon50mmoldasAmid(R)‐10beinur

60°Cmit50%Umsatzund99%eeerzieltwerden(Abbildung75).[35]

Abbildung75. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).[35]

DieVerwendungeineslösungsmittelfreienReaktionssystemsisteingroßerSchrittinHinblickaufGreen

Chemistry,dadasLösungsmitteleinengroßenTeildesAbfallsderenzymatischenkinetischenRacemat‐

spaltungausmacht.LimitierungenderlösungsmittelfreienRacematspaltungsindEnzymtoleranzenund

Selektivitäten sowie langsame Reaktionsraten in äquimolaren Reaktionsmischungen. Zudem muss

gewährleistetsein,dassdieSubstrateunterdenReaktionsbedingungenflüssigoderineinanderlöslich

sind.[4]


73

4.3 EigeneErgebnisseundDiskussion

DieindieserArbeitverwendeteLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)wurde,sofernnichtanders

erwähnt,ausschließlichinimmobilisierterForm(Novozym435)eingesetzt.DiesewirdimFolgenden

nuralsCAL‐Bbezeichnet.

4.3.1 ReferenzenundAnalytik

Im Folgenden wurde die enantioselektive Racematspaltung an racemischen Aminen durch die

(R)‐spezifischeCAL‐Buntersucht.UmdieEnantiomerenüberschüssederdarausresultierendenAmide

mittels HPLC bestimmen zu könnenwurden zunächst die entsprechenden Racemate chemisch syn‐

thetisiert. Diese dienten als Referenz zur Identifikation der Signale der Enantiomere im Chromato‐

grammsowiealsVergleichfürdie1H‐und13C‐NMR‐Spektren.

4.3.1.1 SynthesederReferenzverbindungen

DiechemischeAcylierungerfolgteimFallderAmiderac‐10undrac‐121ausgehendvonPhenylethyl‐

aminrac‐4mitdenAcyldonorenMalonsäurediethylester(9)undPhenoxyessigsäureethylester(122)

unterErhitzenzumRückflussfür4bzw.5Stunden(Abbildung76).[253]

Abbildung76. SynthesederReferenzverbindungenrac‐10,rac‐121undrac‐123.[253,254]


74

DieAmiderac‐10undrac‐121wurdemitUmsätzenvon≥81%erhalten,imFallvonrac‐121allerdings

nachchromatographischerAufreinigungnurmiteinerAusbeutevon37%.

ZwarkonntedasCyano‐Amidrac‐123mitdieserVorgehensweisemiteinemUmsatzvon39%erhalten

werden, jedoch gelang die Produkttrennung ausgehend von der braunen Reaktionsmischung nicht.

Stattdessen wurde das Amin rac‐4 mit Cyanessigsäureethylester (124) für 24 Stunden bei Raum‐

temperaturgerührt(Abbildung76).[254]DasAmidrac‐123konntemiteinerAusbeutevon36%isoliert

werden.TrotzdesgeringenUmsatzeswurdekeineweitereOptimierungzurSynthesevorgenommen.

FürdieSynthesedesAcetamidsrac‐7ausgehendvonrac‐4unddemAcyldonorEssigsäurevinylester

(125)war jedocheineErhöhungderTemperaturauf60 °Cnotwendig (Abbildung77).BeiderAcy‐

lierung wurde ein Umsatz von 95% erzielt, weswegen auf weitere Aufreinigungsschritte verzichtet

wordenist,dadieerhalteneReinheitausreichendwar,umeineMethodefürdieHPLCzuetablieren.

Abbildung77. SynthesedesRacematesrac‐7alsReferenzverbindung.

EineweitereSynthesewurdefürdieDarstellungderAmiderac‐126undrac‐8herangezogen,dieaus‐

gehend von rac‐4 mit einem Acyldonor, 2‐Phenylacetylchlorid (127) bzw. 2‐Methoxyacetylchlorid

(128),undeinerHilfsbase,wieTriethylaminoderPiperidin,bei0–20°Cerhaltenwurden(Abbildung

78).[255,256] Die Synthese der Amide rac‐126 und rac‐8 gelangmit quantitativenUmsätzen undAus‐

beutenvon80%(rac‐126)bzw.95%(rac‐8)nachextraktiverAufarbeitung.

Abbildung78. SynthesederRacematerac‐126undrac‐8alsReferenzverbindungen.[255,256]


75

Die Synthese des Aminoindan‐Amids rac‐129 benötigteweit längere Reaktionszeiten als die bisher

beschriebenen Synthesen. Das Aminoindan rac‐130 wurde zusammen mit dem Malonester 9 und

1,8‐Diazabicyclo[5.4.0]undec‐7‐en(DBU)inDCMfürdreiTagebei40°Cgerührt(Abbildung79).[257]Das

Amidrac‐129konntemiteinerAusbeutevon17% isoliertwerden.ZusätzlichzumProduktrac‐129

konntedurchsäulenchromatographischeAufreinigungdasentsprechendeDiamid131alsNebenpro‐

duktmit9%Ausbeuteisoliertwerden.

Abbildung79. SynthesedesAminoindan‐Amidsrac‐129.[257]

4.3.1.2 Analytik

Um eine genaue Umsatzbestimmung mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie etablieren zu können, wurde

zunächstdieAufarbeitungvalidiert.Dafürwurdeeine1:1‐MischungausMalonsäurediethylester(9)und

rac‐4 eingewogen und das genaue Verhältnis mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Nach an‐

schließender Aufarbeitung analog der Allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 (AAV 6, Abschnitt 7.2.2.3.3)

erfolgteerneuteineBestimmungdesVerhältnissesmittels1H‐NMR‐Spektroskopie.Diedabeierhaltenen

AbweichungenlagennachdreifacherBestimmungzwischen1–4%undsomitmitdurchschnittlich2%

im akzeptablen Bereich. Im Rahmen von Messunsicherheit kann dieser Wert toleriert werden. Es

konntenauchkeineProdukteeinerHydrolyse‐Reaktionbeobachtetwerden.

Die produktbezogene Bestimmung des Umsatzes mithilfe der 1H‐NMR‐Spektroskopie erfolge nach

Gleichung 2. In Abbildung 80 ist beispielhaft ein Spektrum einer Acylierung bei 60°C Reaktions‐

temperaturund4.5StundenReaktionszeitgezeigt.AnhandderambestenisoliertenIntegraledesAmids

(R)‐10 bei5.15ppmunddesMalonats9 bei3.36ppmkonnte indiesemFall einproduktbezogener

Umsatzvon42%ermitteltwerden.DadurchVariationderSignaleSchwankungenderUmsätzemitbis

zu2%auftretenkönnen,wurdenfürdieUmsatzbestimmungimmeraufdiegenanntenSignalezurück‐

gegriffen.


76

Abbildung80. Beispiel der Umsatzbestimmung der Acylierung von rac‐4mit Diethylmalonat (9)mittels1H‐NMR‐Spektroskopie.

Zur Bestimmung der Enantiomerenreinheit des bei der Racematspaltung des Amins rac‐4 mit dem

Malonester9erhaltenenAmids(R)‐10wurdemithilfedeszuvorsynthetisierteRacematrac‐10eine

geeigneteHPLC‐Methodeentwickeltundetabliert(Abbildung81).

Abbildung81. HPLC‐ChromatogrammdesAmidsrac‐10(gemessenanAD‐H‐Säulemitn‐Heptan/i‐PrOH(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:tR=16.63min(R),26.70min(S),ee‐Wert:0%.

Deree‐WertdesbeieinerRacematspaltungnichtumgesetztenAmins (S)‐4 kannmittelsHPLCnicht

ermitteltwerden.AusdiesemGrundwurdeimAnschlussaneineenzymatischeRacematspaltungvon


77

rac‐4diegesamteReaktionsmischungohnevorherigeAufarbeitungmitAcetanhydrid(132)umgesetzt,

sodasseineAcylierungdesnicht‐umgesetztenAmins(S)‐4erfolgenkann(Abbildung82).DasAcetamid

(S)‐7 wurde dabei quantitativ erhalten. Mithilfe des zuvor dargestellten Racemates rac‐7 konnte

ebenfallseineHPLC‐Analytiketabliertwerdenundderee‐WertdesAmins(S)‐7somitermitteltwerden.

Dieserbeträgt<0.2%ee.

Abbildung82. ChemischeAcylierungdesresultierendenAmins(S)‐4.DieBerechnungdesee‐Wertesvon(S)‐4erfolgtemithilfedesProgramms„Enantioselectivity“durchAngabedesUm‐satzeszumAmid(R)‐10unddessendetektiertenee‐Wertes.[258]

Derermittelte ee‐WertdesAmins (S)‐4 von88%stimmtemitdemee‐Wert,dermittelsUmsatzder

enzymatischenAcylierungunddenee‐WertendeserhaltenenAmids(R)‐4berechnetwurden,bisauf

2%Differenzsehrgutüberein,sodassdieEnantiomerenüberschüssederSubstrateimFolgendennur

berechnet worden sind. Die Berechnung der Selektivität sowie der E‐Werte kannmithilfe des Pro‐

gramms„Enantioselectivity“derUniversitätGrazerfolgen(Abbildung83).[258]


78

Abbildung83. SelektivitätsbestimmungderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonester9,bestimmt

mitdemProgramm„Enantioselectivity“.[258]

DerE‐WertdientalsMaßfürdieEnantioselektivitäteinesSystems,derdieSelektivitätderkinetischen

Racematspaltung mit dem Umsatz und dem Enantiomerenüberschuss in Verbindung setzt. Die

BerechnungerfolgtnachfolgenderGleichung3:[11]

E=ln[1‐C (1+eep)]

ln[1‐C (1‐eep)]=

ln[1‐C (1‐ees)]

ln[1‐C (1+ees)]Gleichung3

InderLiteraturfindensichverschiedeneRichtwerte,abwanneineRacematspaltungeffizientistundin

großem Maßstab durchgeführt werden könnte.[11] Als Faustregel gilt, dass Racematspaltungen mit

E‐Werten<15 inakzeptabel sind fürpraktischeAnwendungen.E‐Werte zwischen15–30werdeals

moderatbisgutundbeiWerten>30alsexzellentangesehen.E‐Wertevon>200jedochkönnennicht

genaubestimmtwerdenaufgrundvonUngenauigkeiten,diedurchBestimmungenderee‐Werten,z.B.

durchdieHPLC,entstehen,daindiesemBereichselbsteinesehrkleineAbweichungderee‐Werteeine

signifikante Änderung des E‐Wertes zu Folge hat. Aufgrund dieser Schwankungenwird imRahmen

dieserArbeitdieGenauigkeits‐GrenzederE‐Werteals100definiertundgrößereE‐WertealsE>100

angegeben.

eeS[%]oeeP[%]x

eep:97%eeS:86%E‐Wert:183Umsatz:47%

Selektivität

Umsatz[%]


79

4.3.2 VorversuchemitsubstituiertenBenzylaminenalsSubstrate

4.3.2.1 SynthesedesBenzylamids133

ZurdetailliertenEtablierungvonMethodenderAnalytikundUmsatzbestimmungsolltezunächstein

Modelsubstrat zum Einsatz kommen, das keine Stereoinformation trägt. Dafür wurde sowohl das

einfachstearomatischeAmin,Benzylamin(134),alsauchsubstituierteDerivateausgewählt.Inmeta‐

PositionsubstituiertearomatischeAminedienenalsAusgangsstoffefürdieSynthesepharmazeutischer

Wirkstoffe. Beispiele dafür sind Rivastigmin (135)[259,260] oder das Calcimimeticim136[261], die zur

Behandlung der Alzheimerschen Krankheit bzw. zur Therapie von Hyperparathyroidismus, einer

RegulationsstörungderNebenschilddrüse,eingesetztwerden(Abbildung84).

Abbildung84. Beispiele für pharmazeutische Wirkstoffe mit meta‐substituierten aromatischenAminen:Rivastigmin(135)[259,260]unddasCalcimimeticum136[261].

FüreinevollständigeAnalytikwurdedieseAcylierungsreaktionzunächstchemisch,d.h.beimErhitzen

zumRückfluss für3Stunden,durchgeführt(Abbildung85).[253]DabeikonntenebendemBenzylamid

133,dasmit48%Ausbeuteisoliertwurde,dieBildungdesentsprechendenDiamids137beobachtet

werden. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung wurde das Diamid 137 mit 20% Ausbeute

isoliert.DieBildungdiesesNebenproduktes137kanndurchschrittweiseZugabedesAcyldonorszur

Reaktionsmischungunterdrücktwerden.

Abbildung85. ChemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitMalonsäurediethylester(9).[253]

ImAnschlusswurdederVerlustderSubstanzen134und9währendderAufarbeitungbestimmt,indem

diese eingewogen und bei unterschiedlichen Drücken bei einer Badtemperatur von 40 °C gerührt

wurden.DiejeweiligenVerlustewurdenimAnschlussmittelsAuswaageermittelt(Abbildung86).Ein

großerVerlustanbeidenSubstanzen134und9währendderAufarbeitungmachtdiegenaueBestim‐

mungeinesproduktbezogenenUmsatzesunmöglich.DerVerlustderbeidenKomponenten134und9


80

istabhängigvondenDampfdrücken(0.6bzw.1.3hPa)derKomponenten.[262]SomitkannderVerlust

desAmins134beimErhöhendesDruckesvon230auf550mbarbeieinerRührdauervon120Minuten

von69%aufnurnoch12%gesenktwerden.DainderRegelaberRührzeitenvonunter30Minutenfür

dieAufarbeitungausreichenkanndermittelsAuswaageermittelteVerlustvon<3%fürbeideKompo‐

nentenvernachlässigtwerden.DerproduktbezogeneUmsatzwird,sofernnichtandersangegeben,in

dieserArbeitaufdenAcyldonorMalonsäurediethylester(9)bezogen.

Abbildung86. VerlustderSubstanzen134und9währendderAufarbeitung.

4.3.3 EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine

ZurUntersuchungdesEinflusseseinesSubstituenteninmeta‐Positionwurdenunterschiedlichsubsti‐

tuierteBenzylamine134und138–140mitMalonsäurediethylester(9)undCAL‐BalsBiokatalysator

lösungsmittelfreiumgesetzt (Abbildung87).BeiallenAcylierungsreaktionenwurden,mitAusnahme

desm‐Hydroxybenzylamins(138),nahezuvollständigeUmsätzeerzielt.DasAmin138istimGegensatz

zudenMethoxy‐undBromo‐substituiertenBenzylaminen139und140einkristallinerFeststoff,der

sichnurzueinemgewissenAnteil imMalonester9 löst.EineVerlängerungderReaktionszeitwürde

hierbeizueinemhöherenUmsatzführen.AllerdingskonntebeiderAcylierungdesHydroxyamins138,

welche nicht in lösungsmittelfreier Umgebung durchgeführt werden kann, neben der Bildung des

Produktes 141 auch die Bildung des entsprechenden Diamids 142 mit einem Umsatz von 17%

beobachtetwerden.DajeweilsnureinTeildesm‐Hydroxybenzylamins(138)gelöstinderReaktions‐

mischungvorliegtunddasentstandeneAmid141mitdemMalonester9gutmischbarist,istdieWahr‐

scheinlichkeiteinerzweitenAcylierungsehrgroß.

DieBildungdesentsprechendenDiamidskonntebeidenAcylierungsreaktionenderAmine134bzw.

139und140mit9bzw.5%nachgewiesenwerden.DieAnwesenheiteineselektronenziehendenSubsti‐

tuenteninmeta‐PositionscheintdemnacheinenpositivenEinflussaufdenUmsatzzuhaben.Alleindie

schlechteLöslichkeitdesHydroxyamins138istfürdessensehrniedrigenUmsatzverantwortlich.Durch

0102030405060708090100

0 0,5 1 1,5 2

Verlust[%

]

Zeit[h]

112,230mbar 112,550mbar 9,230mbar 9,550mbar 134,230mbar 134,550mbar 9,230mbar 9,550mbar


81

dieInhomogenitätderMischungwirddieBildungeinesEnzym‐Substrat‐Komplexesverhindert,wasder

geschwindigkeitsbestimmendeSchrittderAcylierungist.

NH2CAL‐B

NH

O

O

O

R R

134 (R=H)138 (R=OH)139 (R=OMe)140 (R=Br)

9,1Äq.

NH

O

NH

OR R+

80°C4.5h

133 (R=H)141 (R=OH)143 (R=OMe)145 (R=Br)

137 (R=H)142 (R=OH)144 (R=OMe)146 (R=Br)

Abbildung87. EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.

DurchAcylierungendesBenzylamins(134)sowiedersubstituiertenAmine139und140unterden

bisherverwendetenReaktionsbedingungen,jedochinAbwesenheitderLipaseCAL‐B,wurdeaufeine

möglicheparallelablaufendechemischeReaktiongetestet(Abbildung88).Dabeizeigtesich,dassmit

den substituierten Aminen 139 und 140 auch in Abwesenheit der Lipase Acylierungsreaktionen

stattfinden,da7%bzw.8%desentsprechendenAmids143und145nachgewiesenwerdenkönnen.Die

BildungdesDiamidsläuftnurmitdemMethoxy‐substituiertenAmin139miteinemUmsatzvon2%ab.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

134 138 139 140

91

38

95 95

917

5 5

35

84 81

Umsatz[%

]/Ausbeute[%]

Amin

UmsatzAmid UmsatzDiamid AusbeuteAmid


82

NH2ohneCAL‐B

NH

O

O

O

R

R

134 (R=H)139 (R=OMe)140 (R=Br)

9,1Äq.

NH

O

NH

O

R R

+60°C4.5h

133 (R=H)143 (R=OMe)145 (R=Br)

137 (R=H)144 (R=OMe)146 (R=Br)

Abbildung88. Vergleichzwischenenzym‐undunkatalysierterAcylierungvonBenzylaminen.

Im Anschluss sollten die Bedingungen zur Diamidbildung ermittelt werden. Aufgrund der Inhomo‐

genitätderReaktionsmischungwurdeanstellevon3‐Hydroxybenzylamin(138)dasMethoxy‐substi‐

tuierte Amin 139 sowie Malonsäurediethylester (9) in verschiedenen Äquivalenten eingesetzt

(Abbildung89).Dabeiistersichtlich,dassmitnur0.6ÄquivalentenMalonester9,alsoeinemdeutlichen

ÜberschussanAmin143,biszu32%desDiamids144gebildetwerden.BeieinemleichtenÜberschuss

an Acyldonor 9 jedoch entstehen bei der Acylierung nur noch etwa 3% des Diamids. Die Neben‐

reaktionen zumDiamidkönnen somitdurch einen leichtenÜberschuss anAcyldonor9 unterdrückt

werden.

0102030405060708090100

130 133 134

07 8

0 0 2

91 95 95

9 5 5

Umsatz[%

]

Amin

Amid[%] Diamid[%] Amid,enzymkatalysiert[%] Diamid,enzymkatalysiert[%]

133 137 138134 139 138


83

NH2

NH

O

O

O

O

O

143

NH

O

NH

O

O O

144

+60°C,4.5h

139

9 (0.6‐1.2Äq.)

CAL‐B(40mg/mmol)

Abbildung89. UntersuchungderDiamidbildungamBeispielvonAmin139.

EswurdenVersuchezurProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungsubstituierterAmine138,

139und140durchgeführt.DabeiwurdezumeinennacheinempassendenorganischenLösungsmittel

fürdieAcylierungdesHydroxyamins138gesuchtundzumanderendieMöglichkeitderReduktionder

Reaktionstemperaturgetestet(Tabelle10).InderLiteraturfinden1,4‐Dioxan[236]sowien‐Heptan[33,34]

als LösungsmittelAnwendung.Bei der enzymatischenAcylierungvonBromamin140werdendabei

75%bzw.76%Umsatzbei60°CReaktionstemperaturerzielt(Einträge1und2).Inlösungsmittelfreier

Umgebungjedochkonntensehrgute91%UmsatzzumAmid145erreichtwerden.Einenähnlichsehr

gutenUmsatzvon93%konntebeiderAcylierungvonAmin140erhaltenwerden.Dabeikonntedie

Reaktionstemperaturvon80°Cauf60°Cherabgesetztwerden,wasausökonomischerSichtvonVorteil

ist.

Aufgrund der geringen Löslichkeit des Hydroxyamins 138 im Malonester 9 ist es notwendig, die

AcylierunginorganischemLösungsmitteldurchzuführen,umeinhomogenesSystemzugewährleisten.

Eswurden Lösungsmittel unterschiedlicher Polaritätmit logP‐Werten zwischen ‐0.34 und4.50 ver‐

wendet. Der produktbezogene Umsatzwird aus dem Verhältnis des Integrals des Produktes zu der

Summe der Integrale von Edukt, Produkt sowie eventuellen Zwischenprodukten ermittelt (vgl.

Gleichung2,Kapitel3.2.2.1).DabeiwurdemitdempolarenTHF(logP=0.46)[177]dasbesteErgebnismit

75%produktbezogenemUmsatzerhalten.EbenfallsguteErgebnissevon51%bzw.50%liefertenMTBE

(logP=0.94)[177]bzw.derAcyldonor9(logP=0.90)[263]selbst,wobeiletztererbeieinerReaktionstem‐

0102030405060708090100

0.6 1.0 1.2 1.5

53

9184

79

32

93 1

Umsatz[%

]

Acyldonor9 (Äq.)

Amid121[%] Diamid122[%]143 144


84

peraturvonnur60°Ceingesetztwordenist.BeideVariantenbietenVorteile,denndasMTBEistauf‐

grundseineshohenDampfdruckeseinfachausdemReaktionsgemischzuentfernen,währendMalon‐

säurediethylester(9)nachDestillationeinerweiterenAcylierungsreaktionzugeführtwerdenkönnte.

EineweitereBesonderheitzeigtsichbeiderVerwendungvonDiethylether(logP=0.89)[177]alsLösungs‐

mittel,dadasHerabsenkenderTemperaturvon60°CaufRaumtemperaturmitgleichzeitigerVerlän‐

gerungderReaktionsdauerauf24StundendengleichenUmsatzvon30%liefert.DiesesstehtinEinklang

mitBeobachtungenvonDITRICH,dermitMethoxyacetat6alsAcyldonormitCAL‐BinDiethyletherbei

Raumtemperaturüber24StundenReaktionszeitdasentsprechendeAmidenantiomerenreinmitvoll‐

ständigem Umsatz erzielen konnte.[30] Dieses zeigt deutlich die hohe Aktivität der CAL‐B in einem

breitenTemperaturbereich.

Tabelle10. VersuchezurProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungmeta‐substituierterBenzylamine.

Eintrag Amin T[°C] t[h] Solvens logP Umsatz[%]

1 140 60 4.5 1,4‐Dioxan ‐1.10a) 75

2 140 60 4.5 n‐Heptan 4.50 b) 76

3 140 60 4.5 ‐ ‐ 91

4 139 60 4.5 ‐ ‐ 93

5 138 80 4.5 MTBE 0.94b) 51

6 138 80 4.5 THF 0.46b) 75

7 138 80 4.5 2‐Me‐THF 1.00c) 70

8 138 80 4.5 MeCN ‐0.34b) 43

9 138 80 4.5 i‐PrOH 0.28b) 22

10 138 60 4.5 n‐Heptan 4.50b) 45

11 138 60 4.5 EtOAc 0.73b) 41

12 138 60 4.5 Malonester 9(100Äq.) 0.90 c) 50

13 138 60 4.5 Et2O 0.89b) 30

14d) 138 RT 24 Et2O 0.89b) 30

15 138 RT 24 EtOH ‐0.24a) 5Datenentnommenaus:a)LAANEetal.[175];b)SANGSTERetal.[177];c)BestimmtdurchAdvancedChemistryDevelopment(ACD/Labs)SoftwareV11.02[263];d)Zugabevon1.5ÄquivalenteMalonsäurediethylester(9).


85

4.3.4 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)

In der Literatur ist die enzymatischeRacematspaltung von aliphatischen und aromatischenAminen

durchunterschiedlicheAcyldonoreninAnwesenheitvonorganischenLösungsmittelnbereitsvielfach

beschrieben worden. Häufig finden dabei Acyldonoren wie langkettige Säuren sowie deren Ester

Anwendung,dieallerdingssehrlangeReaktionszeitenfüreinenvollständigenUmsatzbenötigen(vgl.

Kapitel4.2.2).[31]WeiterehäufigverwendeteAcyldonorensindEssigester5oderMethoxyesterwie6

bzw.111(Abbildung90).[30,31]Zwarwerdendiedabeierhaltenen(R)‐AmidemitsehrhohenEnantio‐

merenüberschüssenerhalten,allerdingsliegendieReaktionszeitenauchhierbeinochbei15bzw.60

Stunden.DurchEinsatzeinesHeteroatomsinβ‐PositiondesAcyldonorskanndieReaktionsgeschwin‐

digkeiterhöhtwerden,wobeidiebestenErgebnissemitO‐Substituentenerhaltenwerden.[31]

DieRacematspaltungracemischerAmineunterlösungsmittelfreienBedingungenfindeterstseitBeginn

diesesJahrhundertsBeachtung.[36,250–252]ZudenerstenenantioselektivenlipasenkatalysiertenAcylie‐

rungendesPhenylethylaminsrac‐4inAbwesenheitvonorganischenLösungsmittelnzählendieReak‐

tionenmitCarbonsäuren(119oder109)[250,252]oderMethoxyestern(6oder111)[36]alsAcyldonoren.

ImFallderCarbonsäurenistzurGleichgewichtseinstellungeinverringerterDrucknotwendig,während

mitMethoxyesternbereitsbeiRaumtemperaturgearbeitetwerdenkann.Methoxyestersinddurchdas

Heteroatominβ–PositionaktivierteAcyldonoren.

Abbildung90. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitunterschiedlichenAcyldonoreninAbwesenheitvonorganischenLösungsmitteln.[36,250]

Der indieserArbeitsgruppebereits erfolgreich etablierteAcyldonorMalonsäurediethylester (9) soll

unterlösungsmittelfreienBedingungenalsStandard‐Acyldonordienen.[33–35]Ausgehendvondenvoran‐

gegangenArbeitensolltesielösungsmittelfreiAcylierungvonrac‐4weiteroptimiertundinHinblickauf

weiteremöglicheAcyldonorenuntersuchtwerden,DerWeiterensollenweiteremöglicheLipasenauf

ihre Fähigkeit zur solvenzfreien Acylierung von rac‐4 getestet und die Kinetiken dieser Reaktionen

geprüftwerden.

(111)


86

4.3.4.1 Prozessoptimierung

4.3.4.1.1 EinflussderTemperaturundReaktionszeit

ZunächstsolltederEinflussderTemperaturbeieinerReaktionsdauervon4.5StundeninHinblickauf

UmsatzundEnantioselektivitätuntersuchtwerden(Abbildung91).ZuBeginnwurdediezuvorinder

Arbeitsgruppe[33] etablierte Syntheseroute zur Racematspaltung des 1‐Phenylethylamins (rac‐4)mit

Malonester9 inMTBEalsorganischesLösungsmittelzumVergleichmitspäterenReaktionendurch‐

geführt.Dabeiwurdebei80°CReaktionstemperaturdasAmid(R)‐10miteinemUmsatzvon42%und

92%eeerhalten,waseinerEnantioselektivitätvon48entsprichtundmitdemLiteraturwert[33]über‐

einstimmt. Dieselbe Reaktion wurde im Anschluss in Abwesenheit von organischen Lösungsmittel

durchgeführt,wobei46%UmsatzzumAmid(R)‐10mit96%ee(E>100)erzieltwerdenkonnten.Auch

dieseWertepassenzudeninderArbeitsgruppeerhaltenenErgebnissen.[35]SelbsteineVerringerung

derReaktionstemperatur auf 0°C lieferte dasAmid (R)‐10 enantiomerenreinmit 24%Umsatz,was

einersehrgutenEnantioselektivitätvon>100entspricht..DieCAL‐Barbeitetfolglichineinembreiten

Temperaturbereichhochselektiv.

NH2

O

O

O

O

+

CAL‐B(40mg/mmol)

0‐80°C,4.5h

9,1Äq.

HN

O O

O NH2

+

rac‐4 (S)‐4(R)‐10

Abbildung91. EinflussderReaktionstemperaturbeiderRacematspaltungvonrac‐4.

InfolgedieserErgebnisseausAbbildung91wurdedieReaktionenbei60°Cund40°C,alsKompromiss

zwischenhohenUmsatzundhohemEnantiomerenüberschuss,inHinblickaufVerlängerungderReak‐

tionsdaueruntersucht.DabeisinddiebereitsdurchgeführtenRacematspaltungenbei4.5Stundenzum

Vergleich im Diagramm aufgetragen (Abbildung 92). Eine Verlängerung der Reaktionszeit auf acht

0102030405060708090100

80°C,MTBE,125mM

80°C 60°C 40°C 20°C 0°C

42 46 42 45 41

24

92 96 97 9990

99

Umsatz[%

]/ee(R)‐10[%]

Reaktionsbedingungen

Umsatz[%] ee(R)‐10[%]ee(R)‐10


87

Stundenbei60 °CTemperatur lieferteeine leichteErhöhungdesUmsatzes, jedochwurdeeinetwas

verringerter ee‐Wert von 89% (E = 39) beobachtet. Bei 24 StundenReaktionszeit konnte dasAmid

(R)‐10nahezuenantiomerenreinmit50%Umsatzerhaltenwerden.Diesesentsprichteinersehrguten

Enantioselektivität von>100.Ähnliche Ergebnissewurden imFall derRacematspaltungenbei 40°C

erzielt.WährenddasAmid(R)‐10nach4.5StundenReaktionszeitmit45%Umsatzund95%eeerhalten

wurden,konntebeisechsStundenReaktionsdauerkeineUmsatzsteigerungundeinetwasgeringerer

ee‐WertdesAmids(R)‐10von85%(E=27)erreichtwerden.DieserrelativniedrigeEnantiomeren‐

überschussistungewöhnlich,dainderLiteraturbereitsdieenantiomerenreineSyntheseunterschied‐

licher Amide bei Raumtemperatur und 24Stunden Reaktionszeit beschrieben worden ist.[30] Fehler

währendderReaktionsführungsowiebeiderAuswertungderHPLC‐Chromatogrammekönnenausge‐

schlossenwerden.

Abbildung92. EinflussderReaktionszeitbeiderRacematspaltungvonrac‐4bei60°C(links)und40°C(rechts).

Um parallel ablaufende chemische Acylierungsreaktionen von rac‐4mitMalonsäurediethylester (9)

ausschließenzukönnenwurdenAcylierungeninAbwesenheitvonCAL‐BalsBiokatalysatorbeiunter‐

schiedlichen Temperaturen durchgeführt. Dabei wurde in allen Fällen eine chemische Acylierung

ausgeschlossen, damittels 1H‐NMR‐Spektroskopie hierbei keine Produktbildung beobachtetwerden

konnte.DiemitfortschreitenderReaktionszeitsinkenderee‐Wertbei40°Ckanndemzufolgenichtmit

chemischablaufendenParallelreaktionenbegründetwerden.

DieenzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitdemMalonester9kannineinemsehrbreitenTempe‐

raturbereichvon0 – 80 °Cmit sehr gutenEnantiomerenüberschüssenund folglich auch sehr guten

Selektivitätendurchgeführtwerden.DabeiwirdderUmsatzinAbwesenheiteinesorganischenLösungs‐

mittels leichtgesteigert.DamildeReaktionsbedingungensowohlausökonomischerSichtalsauch in

HinblickaufEnzymstabilitätvorteilhaftsind,wurden60°CReaktionstemperaturund4.5Stundenals

Standard‐Bedingungen gewählt. Alle weiteren lösungsmittelfreien Racematspaltungen von rac‐4

wurdenimFolgendenunterdiesenReaktionsbedingungendurchgeführt.

0102030405060708090100

4.5 8 24

42 46 50

9789

94

Umsatz[%

]/ee(R)‐10[%]

Reaktionszeit[h]

Racematspaltung60°C

Umsatz[%] ee[%]

0102030405060708090100

4.5 6

45 46

9585

Umsatz[%

]/ee(R)‐10[%]

Reaktionszeit[h]

Racematspaltung40°C

Umsatz[%] ee[%]ee(R)‐10 ee(R)‐10

Reaktionszeit[h]


88

4.3.4.1.2 VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen

NachdemdieoptimaleReaktionstemperaturauf60°CunddieReaktionsdauerauf4.5Stundenfestgelegt

wordensind,wurdedielösungsmittelfreieenzymatischeRacematspaltungdesAminsrac‐4mitMalon‐

ester9alsAcyldonormitbestehendenindustriellenProzessenverglichen(Tabelle11,Eintrag1).Nach

einerPatentanmeldungvonBASFSEwirdeinaromatischesracemischesAminmitMethoxyester111

(1.5Äq.) und2mg/mmolCAL‐Bbei20 °Cumgesetztunddas entsprechendeAmid (R)‐8mit hoher

Enantiomerenreinheit erhalten.[264] Die Übertragung dieser Vorschrift auf die Racematspaltung mit

Malonsäurediethylester(9)alsAcyldonorliefertejedochnur25%Umsatzmit95%ee(Eintrag2).Der

bestimmteguteE‐Wertvon53liegtjedochdeutlichunterdenunterStandard‐Bedingungenerhaltenen

Wert. Der Unterschied in den Enantioselektivitäten von >100 und 53 kannmit der geringeren ver‐

wendeten Enzymmenge sowie niedrigeren Reaktionstemperatur und die dadurch etwas geringere

AktivitätderLipasebegründetwerden.DesWeiterenistderMethoxyester104alsAcyldonorstärker

aktiviertalsdasMalonat9.DurchVerlängerungderReaktionszeitkönnteauchindiesemFalleinvoll‐

ständigerUmsatzunddadurcheinehöhereEnantioselektivitäterreichtwerden.

Tabelle11. VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen.

Eintrag Ester(Äq.)

CAL‐B[mg/mmol]

SolvensTemperatur

[°C]

Umsatz

[%]

eeP[%]

eeS

[%]a)E

1b)c) 9(1) 40 ‐ 60 42 96 70 >100

2d) 9(1) 2 ‐ 20 25 95 n.b. 53

3d) 9(1.5) 10 Et2O 20 48 95 88 >100

4d) 111(1.5) 10 Et2O 20 52 95 99 >100a)Bestimmtmittels„Enantioselectivity“[258];b)DarstellungdiesesVersucheserfolgtebereitsinAbbildung91undisthierzumVergleichaufgeführt;c)Reaktionszeit:4.5h;d)Reaktionszeit:24h;n.b.=nichtbestimmt.

DITRICHetal.setztenrac‐4mitMethoxyessigsäurepropylester(6)beiRaumtemperaturinDiethylether

um, wobei 10mg/mmol CAL‐B verwendet wurden.[30] Dabei wird das entsprechende Amid nach

24StundenReaktionszeitmit46%Umsatzenantiomerenrein(E>100)erhalten.BeiderReproduktion

dieserReaktionmitdemAcyldonor104konnten52%UmsatzzumAmid(R)‐8sowiesehrgute95%ee

(E>100)erreichtwerden(Eintrag4).DurchErsatzdesAcyldonors111durchdenMalonester9wurde

unter den gleichen Bedingungen ebenfalls ein sehr guter Umsatz von 48% erzielt (Eintrag 3). Der

EnantiomerenüberschusswurdefürdasAmid(R)‐10auf95%eebestimmt,wasebenfallseinerEnan‐

tioselektivitätvon>100entspricht.ZwarwirdnachdieserVorschriftnureinViertelderindieserArbeit

eingesetztenEnzymmengevon40mg/mmolbeiRaumtemperaturverwendet,allerdingsistderEinsatz


89

vonDiethyletheralsLösungsmittelnotwendig.DesWeiterenwirdfüreinenvollständigenUmsatzzum

(R)‐AmideineReaktionszeitvon24Stundenbenötigt,wasausökonomischerSichtunvorteilhaftist.

BeiderRacematspaltungvonrac‐4unterdenindieserArbeitgewähltenlösungsmittelfreienReaktions‐

bedingungenmitdemMalonester9alsAcyldonorkonnteeinesehrguteEnantioselektivitätvon>100

erreichtwerden,dieinderselbenGrößenordnungderbestehendenindustriellenProzesseliegt.Durch

Up‐ScalingzugrößerenMaßstäbenkönntedieAufarbeitungdannmittelsDestillationerfolgen,sodass

kein organisches Lösungsmittel für extraktive Aufarbeitung mehr benötigt würde. Der im Rahmen

dieser Arbeit gewählte Syntheseweg stellt folglich eine sehr gute Alternative zu den bestehenden

industriellenProzessendar.

4.3.5 Enzymrecycling

Im Rahmen eines Enzymrecyclings wurde die Aktivität und die Stabilität der CAL‐B aus Candida

antarcticagetestetwerden.DurchFiltration,WaschenundTrocknenwardieRückgewinnungderLipase

imAnschlussaneineReaktionsehreinfachinderHandhabung.DerVerlustderCAL‐BbeiderReinigung

sowiedurchmechanischeBelastungwährenddesReaktionsablaufswurdedurcheinenentsprechend

größeren Reaktionsaufbau gering gehalten. In vorhergehenden Versuchen von SIMON konnte bei

starkemmechanischen Rühren ein starker Enzymabrieb beobachtet werden, der durch Rührenmit

<200rpmverringertwerdenkonnte.[33]DasEnzymrecyclingwurdeunterStandardbedingungendurch‐

geführt,indemdasracemischeAminrac‐4zusammenmitdemMalonester9unddieCAL‐Bbei60°C

gerührtwird(Abbildung93).

DieAuswertungderErgebnissedeutetaufeinestarkeAbnahmederAktivitätundauchderStabilitätder

CAL‐BwährendderZyklisierungsversuchedurchInaktivierunghin.SokonnteschonimzweitenZyklus

des Recyclings nur noch 30% Umsatz anstelle der 43% des ersten Zyklus erreicht werden. In den

folgendenZyklen(Zyklus3und4)sankderUmsatzweiterauf25%bzw.20%Umsatz.ImfünftenZyklus

konnten24%UmsatznurdurchVerlängerungderReaktionszeitaufübersechsStundenerzieltwerden.

AuchwenneinstetigerAbfall inderAktivitätderCAL‐Bzuerkennenist,bleibtdieStereoselektivität

konstanthoch.InallenFällen,mitAusnahmedeszweitenZyklus(81%ee),konntenguteEnantiomeren‐

überschüssevon>88%undsomitE‐Wertevon>13erreichtwerden.

InderLiteratursowieineinerDoktorarbeitdiesesArbeitskreisessinderfolgreicheRecyclingprozesse

derCAL‐BbeiderRacematspaltungvonAmineninAnwesenheitvonLösungsmittelnsowieinlösungs‐

mittelfreierUmgebungbeschriebenworden.[33,36]DabeiwurdengleichbleibendhoheUmsätzemitsehr

gutenee‐WertenfürdieerstenZyklenerhalten,bevoreinleichterRückgangderUmsätzezubeobachten

war.DierapidesinkendenUmsätzeinderRecycling‐VersuchsreiheimRahmendieserArbeitinlösungs‐

mittelfreiem Milieu deuten auf eine verringerte Aktivität der CAL‐B hin. In der Tat wurde dieses

PhänomenauchvonderArbeitsgruppeumKANERVAbeiderlösungsmittelfreienRacematspaltungvon

rac‐4mitMethoxyester6 beobachtet.[36]DesWeiterenwurdebeobachtet,dassdieLipasebeimehr‐

facherAnwendungbeihöherenTemperaturenteilweisevonTrägermaterialabgelöstwird.[33]


90

NH2

O

O

O

O

+

CAL‐B(40mg/mmol)

60°C,4.5h

9,1Äq.

HN

O O

O NH2

+

rac‐4 (S)‐4(R)‐10

Abbildung93. EnzymrecyclingamBeispielderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonester9.

Die CAL‐B kann somit zwar durch Immobilisierung stabilisiert werden, allerdings eignet sich diese

LipasenichtfürRecyclingreaktionenunterdenindieserArbeitgewähltenlösungsmittelfreienStandard‐

bedingungen,damitjedemZykluseinbeträchtlicherVerlustanUmsatzeinhergeht.Allerdingskonnte

gezeigtwerden,dassnurderVerlustderAktivitätdieMöglichkeitdesRecyclingsbeeinträchtigt,dadie

Enantiomerenüberschüssestets>81%betrugen.

4.3.6 VerwendungvonalternativenLipasen

4.3.6.1 Lipasen‐Screening

ObwohldieCAL‐BdieamhäufigstenverwendeteLipaseistundauchbereitsgroßtechnischAnwendung

findet,[27–29]sindauchandereProzessebekannt,diealternativeLipasenbenutzen.AlsBeispielseihier

dieRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitMethoxyessigsäureseternwie111vonBASF

SEgenannt,inderdieLipaseausBurkholderiaplantariierfolgreicheingesetztwird.[229]IndieserArbeit

solltensomitalleinderArbeitsgruppevorhandenenLipasenaufihreFähigkeituntersuchtwerden,die

entsprechenden Acylierungsreaktionen zu katalysieren. Als einfachstes Substrat wurde zunächst

Benzylamin(134)eingesetzt,daskeinStereozentrumbesitztundsomitzueinemvollständigenUmsatz

zumAmid133führensollte(Abbildung94).InallenScreening‐AnsätzenwurdeMTBEalsLösungsmittel

verwendet,dadasHydoxy‐Amin138 als festeKomponente zueiner inhomogenenMischung führen

würde.NebenderimmobilisiertenCAL‐BausCandidaantarctica(Novozym435)liefertendie immo‐

0102030405060708090100

1 2 3 4 5

43

3025

20 24

92 89 87 90 94

Umsatz[%

]/ee[%]

Zyklus

Umsatz[%] ee[%] (R)‐10


91

bilisierteundlyophilisierteLipasenCAL‐B(beidevonC‐LECTA)einennahezuvollständigenUmsatzzum

Amid133(89%bzw.94%).WeitereLipasenführtenzuniedrigenUmsätzenimBereichvon15‐22%.

Beachtlichisthierbei,dassdieLipasenL5,GC4,R10,AY30sowieCE5undD20(allevonAMANO)alle

ungewöhnlichhoheUmsätze zumDiamid137 zeigten.Dieseskannals Indiz füreine sehr langsame

Acylierungsreaktion gesehenwerden, in der die zweite Acylierungmit größererWahrscheinlichkeit

abläuft als die gewünschte einfache Reaktion zumAmid133. Eventuell spielt die durch den ersten

AcylierungsschrittschonentstandeneNähedesAmids133zuraktivenSeitederLipaseeinewichtige

Rolledabei.

NH2

O

O

O

O NH

O

O

O

+60°C,3h

134 91Äq.

133

Lipase(40mg/mmol)

Abbildung94. Lipasen‐ScreeningmitBenzylamin(134)alsSubstrat.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

CAL‐B(Novozym435)

Toyobo

Hogpancreas(Fluka)

L„Amano“5

Rhizopusniveus(Fluka)

L.P.L.„Amano“100S

GC„Amano“4

R„Amano“10

AY„Amano“30

NConc(Amano)

AP6(Amano)

PSimmobilisiertaufToyonite‐200‐P(Amano)

PSimmobilisiertaufDiatomite(Amano)

M‐AP10(Amano)

F‐AP15(Amano)

R10(Amano)

CE„Amano“5

D„Amano“20

AK„Amano“

AYS„Amano“

PS„Amano“SD

CAL‐Bimmobilisiert(c‐LEcta)

CAL‐Blyophilisiert(c‐LEcta)

Umsatz[%]

Lipase

UmsatzAmid113[%] UmsatzDimer114[%]

CE„AMANO“5

D„AMANO“20

AK„AMANO“AYS„AMANO“

PS„AMANO“SDCAL‐Bimmobilisiert(C‐LECTA)

CAL‐Blyophilisiert(C‐LECTA)

R10(AMANO)F‐AP15(AMANO)

M‐AP10(AMANO)

AP6(AMANO)

NConc(AMANO)AY„AMANO“30

R„AMANO“10

GC„AMANO“4L.P.L.„AMANO“100S

L„AMANO“5

Rhizopusniveus(FLUKA)

Hogpancreas(FLUKA)

PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)

PSimmob.Diatomite(AMANO)

133 137


92

DieobengenanntenLipasenwurdenimAnschlussinderAcylierungdesHydroxy‐Amins138eingesetzt

(Abbildung95).UnterdenhierverwendetenReaktionsbedingungenkonntenmitderCAL‐B(Novozym

435)nurmaximal52%Umsatzerreichtwerden.Weiterhin liefertendie immobilisiertenLipasenPS

(AMANO)unddieCAL‐B(C‐LECTA)moderateUmsätzevon47%bzw.44%.MitderlyophilisiertenLipase

vonC‐LECTAkonntennoch18%UmsatzzumHydroxy‐Amid141erzieltwerden.Auffälligist,dassbei

derVerwendungderLipasePS,dieaufdemkeramischenTrägerToyonite‐200‐Pimmobilisiertist,kein

Diamid142alsNebenproduktgebildetwordenist.

NH2

O

O

O

O NH

O

O

O

+

1380.2M

91Äq.

141

LipaseHO HO

(40mg/mmol)

60°C,3hMTBE

Abbildung95. Lipasen‐ScreeningmitHydroxy‐Amin138alsSubstrat.

DieselbenLipasenwurdenschließlichfürdieAcylierungdesracemischen1‐Phenylethylamins(rac‐4)

verwendet(Abbildung96).NurdieCAL‐B(Novozym435)sowiedieimmobilisierteLipasevonC‐LECTA

(46%bzw.45%)zeigteneinensehrgutenUmsatz.MitderlyophilisiertenLipasevonC‐LECTAkonnte

nocheinUmsatzvon12%erzieltwerden.AlleweiterenLipasenzeigtenkeineAktivitätinHinblickauf

dieAcylierungdes racemischenAmins rac‐4. DieBildungdes entsprechendenDiamidswurde nicht

beobachtet.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

CAL‐B(Novozym435)

L„Amano“5

GC„Amano“4

CE„Amano“5

R„Amano“10

D„Amano“20

AY„Amano“30

PSimmobilisiertaufToyonite‐200‐P(Amano)

CAL‐Bimmobilisiert(c‐LEcta)

CAL‐Blyophilisiert(c‐LEcta)

Umsatz[%]

Lipase

UmsatzAmid118[%] UmsatzDimer119(%)


CAL‐Bimmobilisiert(C‐LECTA)

PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)

AY„AMANO“30

D„AMANO“20

R„AMANO“10

CE„AMANO“5

GC„AMANO“4

L„AMANO“5

141 142

CAL‐B(Novozym435)


93

O

O

O

O

+

(R)‐10rac‐40.2M

91Äq.

NH2HN

O

O

OLipase

(40mg/mmol)

60°C,3hMTBE

Abbildung96. Lipasen‐Screeningmit1‐Phenylethylamin(rac‐4)alsSubstrat.

In einem breit angelegten Lipasen‐Screening wurden alle vorrätigen Enzyme an der gewünschten

Acylierungsreaktion getestet. Die LipaseB ausCandidaantarctica erwies sich als das einzige aktive

Enzymbei der Racematspaltung des Amins rac‐4. Dabeiwurden die besten Ergebnissemit den auf

unterschiedlicheTrägerimmobilisierteLipasenerhalten.DieEnzymaktivitätenderbeidenLipasenvon

C‐LECTAwurdenimFolgendendirektmitdervonCAL‐B(Novozym435)verglichen.

4.3.6.2 VerwendungderLipasenvonC‐LECTAalsBiokatalysatoren

Mit den beiden Lipasen aus Candida antarctica der Firma C‐LECTA, insbesondere die auf einen

Metacrylat‐TrägerimmobilisierteLipase,konntensehrgutebzw.mäßigeUmsätzeerzieltwerden(vergl.

Abschnitt4.3.6.1).ZunächstwurdendieEnzymaktivitätendieserbeidenLipasenmitdenenderCAL‐B

(Novozym 435) verglichen. Dabei wurdemit Essigester 5 gesättigter KPi‐Puffer zusammenmit der

jeweiligenLipasebeiRaumtemperaturaneinerTitrationsapparaturumgesetzt.DiebeiderSpaltung

entstandene Essigsäure wurde mit NaOH gegentitriert und das erhaltene Volumen der Lauge zur

BerechnungderrelativenAktivitätderLipaseeingesetzt.DieAktivitätderCAL‐B(0.855U/mg)wurde

dabeigleich100%gesetzt(Tabelle12).ImVergleichdazukonntebeiderimmobilisiertenLipasevon

C‐LECTA,mitder imRahmendesLipasen‐Screenings(Abschnitt4.3.6.1)einUmsatzvon45%beider

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

CAL‐BCandidaantarctica(Novozym435)

L„Amano“5

GC„Amano“4

CE„Amano“5

R„Amano“10

D„Amano“20

AY„Amano“30

PSimmob.aufToyonite‐200‐P(Amano)

CAL‐Bimmob.(c‐LEcta)

CAL‐Blyo.(c‐LEcta)

Umsatz[%]

Lipase

Umsatz[%]

L„AMANO“5

GC„AMANO“4

CE„AMANO“5

R„AMANO“10

D„AMANO“20

AY„AMANO“30

PSimmob.AufToyonite‐200‐P(AMANO)

CAL‐Bimmobilisiert(C‐LECTA)


CAL‐B(Novozym435)

(R)‐10


94

Acylierungvonrac‐4erhaltenwurde,nureinerelativeAktivitätvonnur68%nachgewiesenwerden.

Von der lyophilisierte Lipase von C‐LECTA wurde nur 1/20 der Enzymmenge eingesetzt. Die dabei

ermittelterelativeAktivitätdieserLipasebetrug2000%.AufgrunddesniedrigenUmsatzesimRahmen

desLipasen‐ScreeningsistdiesesErgebnisüberraschend.

Tabelle12. EnzymkatalysierteSpaltungdesEssigesters5mitunterschiedlichenLipasenbei20°C.

Eintrag LipaseEnzym

[mg/mmol]

Steigung

[mL/sec]

Aktivität

[U/mg]

Rel.Aktivität

[%]

1 Novozym435 20 0.0057 0.855 100

2 C‐LECTAimmobilisiert 20 0.0039 0.585 68

3 C‐LECTAlyophilisiert 1 0.0057 17.100 2000

DieenzymatischeSpaltungdesEssigesters5durchdieCAL‐B(Novozym435)sowiedieimmobilisierte

und lyophilisierte Lipasen von C‐LECTA wurden im Anschluss bei 60 °C an der Titrationsapparatur

durchgeführt(Tabelle13).DabeiwurdeerneutdieAktivitätderCAL‐B(Novozym435)gleich100%

gesetzt.Diemittels immobilisierterLipase(C‐LECTA)erhaltenerelativeAktivitätgleichtmit69%den

WerteninTabelle12(Eintrag2).


Eintrag LipaseEnzym

[mg/mmol]

Aktivität

[U/mg]

Rel.Aktivität

[%]

1 Novozym435 20 3.180 100

2 C‐LECTAimmobilisiert 20 2.190 69

3 C‐LECTAlyophilisiert 1 31.800 1000

Bei der lyophilisierten CAL‐B von C‐LECTA konnte eine relative Aktivität von 1000% nachgewiesen

werden. Dieses entspricht der Hälfte desWertes bei einer Temperatur von 20 °C und lässt darauf

schließen, dass die nicht‐immobilisierte CAL‐B bei höherenTemperaturen an Stabilität einbüßt.Die

erhöhteStabilitätvielerEnzymedurchImmobilisierungistinderLiteraturoftmalsbeschrieben.[13]Auch

in denProduktinformationsblätternderFirma C‐LECTAwirdder immobilisiertenCAL‐B einehöhere

Thermostabilitätzugewiesen.[265]


95

DadiebeidenLipasenvonC‐LECTAhohebzw.sehrhoheAktivitäteninHinblickaufdieenzymatische

Esterspaltung aufweisen, sollte im Folgenden die enzymatische Racematspaltung von rac‐4 unter

Standardbedingungenuntersuchtwerden.DiejeweiligeEnzymmengewurdedafürentsprechendandie

ermittelterelativeAktivitätangepasst.

DieAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitderimmobilisiertenCAL‐BvonC‐LECTAwurdezum

einen lösungsmittelfreiundzumanderen inAnwesenheitvonMTBEalsLösungsmitteldurchgeführt

(Tabelle14).Zwar führtendabeibeideAcylierungsreaktionen zu einemvollständigenUmsatz, aller‐

dingskonntenurinAbwesenheitvonLösungsmitteln(Eintrag1)sehrguteee‐Wertevon96%(E=194)

erreichtwerden.ImGegensatzdazuwurdeninAnwesenheitvonMTBEnur84%eeundeinguterE‐Wert

von29erzielt (Eintrag2).Die immobilisierteLipasevonC‐LECTA stellt somit einweitereswichtiges

WerkzeugzurDarstellungenantiomerenreinerAmineinlösungsmittelfreierUmgebungdar.

Tabelle14. EnzymatischRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.

Eintrag MTBE[mL] Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 0 52 96 96 194

2 0.5 49 84 81 29a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258].

ParallelzuderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐BvonC‐LECTA

wurdedieTrennungderEnantiomeremithilfederlyophilisiertenCAL‐B,ebenfallsvonC‐LECTA,unter‐

sucht.AuchindiesemFallwurdedieEnzymmengeandieermittelterelativeAktivitätangepasst.

Die Racematspaltung von rac‐4 durch die lyophilisierte CAL‐B wurde zunächst unter Standard‐

bedingungeninAbwesenheitvonLösungsmittelndurchgeführt(Tabelle15,Eintrag1).Dabeiwurdenur

eingeringerUmsatzvon9%erzielt,jedochmiteinemgutenEnantiomerenüberschussvon81%(E=1).

Mitder fünffachenEnzymmengekonnte sowohlderUmsatzauf26%als auchder ee‐Wert auf91%

gesteigertwerden.DiesesentsprichteinerexzellentenEnantioselektivitätvon29.EineVerlängerung

derReaktionszeitauf24Stundenmit4mg/mmolCAL‐BliefertenureinenetwashöherenUmsatzvon

19%, jedoch war hierbei der Enantiomerenüberschuss mit 74% (E = 8) nicht zufriedenstellend

(Eintrag3). Eventuell hat in diesem Fall bei der langen Reaktionsdauer eine parallel chemische

Acylierungstattgefunden,sodassderee‐Wertdadurchsinkt.InteressanterweisewurdebeieinerReak‐

tionstemperaturvon20°Cbei24StundenReaktionsdauernahezudasidentischeErgebnisderReaktion

unterStandardbedingungenerhalten.AuchdieDurchführungderRacematspaltunginAnwesenheitvon

MTBEalsLösungsmittelliefertenur7%Umsatzmit87%ee(Eintrag5).DieZugabevonWasserzuder

ansonstenlösungsmittelfreienSyntheseführtenurzueinemUmsatzvon6%.AufeineBestimmungdes

EnantiomerenüberschussesistindiesemFallaufgrunddesniedrigenUmsatzesverzichtetworden.


96

Tabelle15. EnzymkatalysierteRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.

Eintrag CAL‐B[mg/mmol]

T[°C] t[h] Umsatz[%] ee[%] E

1 4 60 4.5 9 81 10

2 20 60 4.5 26 91 29

3 4 60 24 19 74 8

4 4 20 24 6 80 10

5a) 4 60 4.5 7 87 2

6b) 4 60 4.5 6 n.b. n.b.a)Zugabevon0.5mLMTBE;b)Zugabevon10µLdest.Wasser;n.b.=nichtbestimmt.

Insgesamt ist festzustellen, dass die enzymatischeRacematspaltung des Amins rac‐4 unter lösungs‐

mittelfreienBedingungentrotzdersehrhohenrelativenAktivitätderlyophilisiertenCAL‐BimVergleich

zudenbeidenimmobilisiertenLipasen(Novozym435unddieCAL‐BvonC‐LECTA)nichtzuzufrieden‐

stellendenErgebnissenführt.AlleindieErhöhungderEnzymmengeumdasFünffache(20mg/mmol

anstellevon4mg/mmolunterStandardbedingungen)lieferteeinenmäßigenUmsatzmithoherEnan‐

tiomerenreinheitundEnantioselektivitätvon29(Eintrag2).DieVerwendungeinerhohenEnzymmenge

istdemnachsinnvoll,umNebenreaktionenzumDiamidzuunterdrücken.AusökonomischerSichtist

dieseArtderReaktionsführungjedochnichtratsam.

4.3.7 VariationderAcyldonoren

BeiderRacematspaltungvonAminenistdieWahldesAcyldonorsvongroßerBedeutung.Hochreaktive

Acyldonoren, wie beispielsweise Enolester, können Carbonyl‐Verbindungen freisetzen, die dann

wiederummitderAminfunktionzueinemIminreagierenkönnten.[31]AufgrundderhohenNucleophilie

desAminsführendiesespontanen,nicht‐enzymatischenAcylierungsreaktionensomitzueinerverrin‐

gertenEnantioselektivität.SehrguteErgebnissewurdeninderLiteraturmitAcyldonorenerhalten,die

inβ–PositioneinHeteroatom,meistensSauerstoff,tragen,wieMethoxyessigsäureethyl‐oder–propyl‐

ester (111 bzw.6,Abbildung4).DieAnwesenheiteinesHeteroatomshateineerhöhteAktivitätdes

Carbonyl‐KohlenstoffszurFolge.[229]InderArbeitvonSIMONwurdeschließlichMalonsäurediethylester

(9) als sehr effizienter Acyldonor gefunden.[33,34] Aufgrund des sehr breiten Substratspektrums der

CAL‐BkanneineVielzahlanAcyldonorenverwendetwerden.EineAuswahlanAcyldonorenwurdebei

derenzymatischenRacematspaltungvonAminrac‐4unterlösungsmittelfreienBedingungeneingesetzt

unddieErgebnissederAcylierungmiteinanderundmitMalonsäurediethylester(9)alsStandard‐Acyl‐

donorverglichen.BeidenuntersuchtenAcyldonorenhandeltessichumPhenoxyessigsäureethylester


97

(122), Phenylessigsäureethylester (147), Methoxyessigsäureethylester (111), Cyanessigsäureethyl‐

ester(124)undEssigsäurevinylester(125).DieausgewähltenAcyldonorensindinAbbildung97dar‐

gestellt.

Abbildung97. AlternativeAcyldonoren.

4.3.7.1 VergleichderAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen

Bei der enzymatischen Racematspaltung von 1‐Phenylethylamin (rac‐4) unter Standard‐Reaktions‐

bedingungenbei60°CReaktionstemperatursolltendieAktivitätenderAcyldonorenausAbschnitt4.3.5

untereinander verglichenwerden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 98 graphisch dargestellt. Es ist

ersichtlich,dassbeiderAcylierungdesAminsrac‐4bereitsnach4.5StundenReaktionszeitmitdem

Standard‐AcyldonorMalonsäurediethylester(9)46%Umsatzsowiesehrgute98%eeerhaltenwurden.

DiesesentsprichteinemexzellentenE‐Wertvon>200.

DerAcyldonorPhenoxyessigester122lieferte51%Umsatzmit65%ee(E=9).EineVerringerungder

Reaktionstemperaturvon60°Cauf40°C lieferteeinähnlichesErgebnis,da49%UmsatzzumAmid

(R)‐121sowie67%ee(E=10)erreichtwordensind.TrotzdergutenUmsätzesinddieseWertefüreine

effizienteRacematspaltungnichtausreichend.

Der Cyanoester124 wurde in der Literatur bereits als Acyldonor für die Synthese von Zytostatica

beschrieben,jedochnurmittelsChemokatalyse.[266]BeiderenzymatischkatalysiertenAcylierungliefert

der Acyldonor124 einen guten Umsatz von 45%. Allerdings können dabei nur 10% ee beobachtet

werden,demnachisteineRacematspaltungauchmitdiesemDonornichterfolgreich.MitMethoxyessig‐

ester111konntennach4.5StundenReaktionszeitzwarnurmäßige25%UmsatzzumAmid(R)‐8erzielt

werden, jedoch lagderEnantiomerenüberschuss erfreulicherweise bei 92%.Dieses entspricht einer

sehrgutenEnantioselektivitätvon33.AllgemeinwerdenmitMethoxyessigesternbeiderAcylierungvon

AmineninderLiteraturvollständigeUmsätzeerhalten.[30]SosetztenDITRICHetal.dasAminrac‐4mit


98

Methoxyessigsäurepropylester(6)mit46%UmsatzzumAmid(R)‐8enantiomerenrein(E>100)um.

DieseEnantioselektivitätenkönnenimRahmendieserArbeitundauchbeivorherigenAcetylierungs‐

reaktioneninorganischemLösungsmittelinnerhalbderArbeitsgruppe[33,34]nichtmehrerreichtwerden.

DerGrunddafürkannunterandereminderViskositätdeslösungsmittelfreienSystemsunddesdadurch

verminderten Transportprozesses innerhalb der Reaktionsmischung liegen. Es sollte im Anschluss

überprüftwerden, inwiefern eineVerlängerungderReaktionszeit eine SteigerungdesUmsatzes zur

Folgehat.

R O

OR'+

NH2NH R

O

rac‐4

CAL‐B(40 mg/mmol)

Acyldonor, 1 Äq.

+

NH2

(S)‐4

60 °C, 4.5 h

9 (R = CH2COOEt, R' = Et)122 (R = CH2COPh, R ' = Et)147 (R = CH2Ph, R' = Et)111 (R = CH2OMe. R' = Et)124 (R = CH2CN, R' = Et)125 (R = CH3, R' = CHCH2)

(R)‐10 (R = CH2COOEt)(R)‐121 (R = CH2COPh)(R)‐126 (R = CH2Ph)(R)‐8 (R = CH2OMe)(R)‐123 (R = CH2CN)(R)‐7 (R = CH3)

(R)‐Amid

Abbildung98. VergleichderalternativenAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen.

EnttäuschendeErgebnisseliefertendieRacematspaltungenvonrac‐4mitPhenylessigester147sowie

Vinylester 125. Mit dem Acyldonor 147 konnten nur 15% Umsatz zum Amid (R)‐126 beobachtet

werden.DieseskannmitdemfehlendenHeteroatominβ‐Positionunddiedadurchbedingtegeringere

AktivitätdesEsters147begründetwerden.[31]VermutlichwirktsichdieKettenlängedesDonors147

negativ auf die SelektivitätdesEnzymsaus.Der ee‐Wert dieserAcylierungsreaktionbeträgt für das

Amid(R)‐12653%miteinerinakzeptablenEnantioselektivitätvon4.DerAcyldonor147imdemnach

ungeeignetfüreineenzymatischeAcylierungdesAminsrac‐4.DieAcylierungmitdemVinylester125

liefertbeiebenfallsnur16%UmsatzzumAmid(R)‐7jedochnur10%ee.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

9 122 147 111 121 125

4351

15

25

45

16

96

65

53

92

10 10Umsatz[%

]/ee[%]

Acyldonor

Umsatz[%] ee[%]


99

UnterdengewähltenStandard‐ReaktionsbedingungenkonntefolglichmitMalonsäurediethylester(9)

alsAcyldonorder besteUmsatz unddie höchsteEnantiomerenreinheit von96%erzieltwerden. Im

AnschlussandieseVersuchsreihewurdendieAcylierungsreaktionenmitPhenoxy‐oderVinylessigester

(122bzw.125)beiverringerterTemperaturdurchgeführtunddieErgebnissemiteinanderverglichen.

4.3.7.2 VergleichderAcyldonorenbeiverringerterTemperatur

DiealternativenAcyldonorenwurdenauchbeiverringerterTemperaturvon40°CmitdemAminrac‐4

umgesetztunddieErgebnissemiteinanderverglichen.DasHerabsetzenderReaktionstemperaturkann

sich,besondersbei starkaktiviertenAcyldonorenwie122 und124, als vorteilhaft erweisen,dadie

Reaktionendannlangsamerundsomitselektiverablaufenkönnten.AlsStandard‐Acyldonordientehier‐

beiwiederMalonsäurediethylester(9).DieErgebnissesindinAbbildung99graphischdargestellt.

R O

O

R'+

NH2NH R

O

rac‐4

CAL‐B(40 mg/mmol)

Acyldonor, 1 Äq.

+

NH2

(S)‐4

40 °C, 4.5 h


(R)‐10 (R = CH2COOEt)(R)‐121 (R = CH2COPh)(R)‐126 (R = CH2Ph)(R)‐8 (R = CH2OMe)(R)‐123 (R = CH2CN)(R)‐7 (R = CH3)

(R)‐Amid

Abbildung99. VergleichderalternativenAcyldonorenbeiverringerterReaktionstemperatur.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

9 122 147 111 124 125

34

49

4

3140

17

95

67

82

11

22

Umsatz[%

]/ee[%]

Acyldonor

Umsatz[%] ee[%]


100

Der Malonester9 liefert bei 40 °C Reaktionstemperatur mit 34% Umsatz und sehr hoher Enantio‐

merenreinheitvon96%einensehrgutenE‐Wertvon80.DiesesistfüreineeffizienteRacematspaltung

einhervorragendesErgebnis.MitPhenoxyessigester122alsAcyldonorwurdenzwarsehrgute49%

Umsatz erzielt, jedoch konnten nur mäßige 67% ee beobachtet werden. Dieses entspricht einer

Enantioselektivitätvon10undist,ebensowiebei60°C,nichtzufriedenstellend.

Der Methoxyessigester 111 lieferte zwar einen leicht erhöhten Umsatz von 31% im Vergleich zur

Acylierungbei60°C,allerdingskonnteeinleichtesAbsinkendesee‐Wertesvon92%auf82%bei40°C

(E=14)detektiertwerden.AucheineweitereVerringerungderTemperaturauf20°Cführtenochzu

guten31%Umsatz,allerdingsnurmitmäßigen71%ee(E=8).DieniedrigenEnantiomerenüberschüsse

desAmids(R)‐8beiVerringerungderReaktionstemperaturaufnurnoch71%eeweichendeutlichvon

deninderLiteraturbeiRaumtemperaturerhaltenenWertenmitAcyldonor6ab(>99%ee,E>100).[30]

Eine Verringerung der Selektivität der CAL‐B bei niedrigeren Temperaturen kann demnach ausge‐

schlossenwerden.

UnveränderteErgebnisse (40%Umsatzmit11%eezumAmid(R)‐123) imVergleichzudenAcylie‐

rungsreaktionenbei60°CwurdenmitCyanoessigester124erhalten.UnterdenhierverwendetenReak‐

tionsbedingungenisteineRacematspaltungmitdiesemDonornichtmöglich.MitVinylessigester125

konntenauchbei40 °CReaktionstemperaturnur17%Umsatzerzieltwerden.FüreineguteDurch‐

mischungderdickflüssigenReaktionsmischungwarindiesemFalldieZugabevonMTBEalsLösungs‐

mittelnotwendig.Deree‐Wertbeträgthierbei22%.DiesesentsprichteinemE‐Wertvon2undistnicht

ausreichendfürdieRacematspaltung.EbenfallsnegativeErgebnissemit4%Umsatzwerdenmitdem

Phenylessigester147 als Acyldonor erhalten. Auf eine Bestimmung des Enantiomerenüberschusses

wurdeindiesemFallverzichtet.

EshatsichfolglichauchbeiverringerterReaktionstemperaturvon40°CMalonsäurediethylester(9)als

dergeeignetsteAcyldonorerwiesen,sowohlinHinblickaufdenUmsatzalsauchaufdieEnantiomeren‐

reinheitderRacematspaltung.MitdenAcyldonorenMalonester9,Phenoxyessigester122,Cyanessig‐

ester124sowiedemMethoxyessigester111wurdenimFolgendenKinetikenderRacematspaltungdes

Aminsrac‐4unterlösungsmittelfreienStandard‐Bedingungenuntersucht.

4.3.7.3 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)

In den beiden vorangegangenen Abschnitten sind teilweise ungewöhnlich niedrige Enantiomeren‐

überschüsse erhaltenworden.Dieses sollte daraufhin näher untersuchtwerden, indemdie entspre‐

chendenAcylierungsreaktionenvonrac‐4 zwarunterStandard‐Bedingungen, jedoch inAbwesenheit

derLipaseCAL‐Bdurchgeführtwurden(Abbildung100).

SowohlmitdemCyanessigester124,alsauchinnochstärkeremMaßemitdemVinylessigester125,

findenunkatalysierteAcylierungsreaktionenstatt.DieseserklärtdiesehrniedrigenEnantiomerenüber‐

schüsse,dieindenAbschnitten4.3.7.1und4.3.7.2beschriebenwordensind.SokonnteninAbwesenheit

der CAL‐B bei 60 °C und 4.5StundenReaktionszeit bereits 33%Umsatz zum entsprechenden race‐

mischenAmidrac‐123mit3%ee(E=1)erhaltenwerden.DurchVerringerungderTemperaturauf


101

40°CkanndiechemischeReaktionzueinemGroßteilunterdrücktwerden,danurnoch12%Umsatz

ermitteltwerden.

R O

OR'+

NH2HN R

O

rac‐4 Acyldonor, 1 Äq.

20 ‐ 60 °C4.5 h


rac‐10 (R = CH2COOEt)rac‐123 (R = CH2COPh)rac‐126 (R = CH2Ph)rac‐8 (R = CH2OMe)rac‐123 (R = CH2CN)rac‐7 (R = CH3)

Abbildung100. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4.

ImFalledesVinylessigesters125könnenbei60°CReaktionstemperaturbiszu93%desAmidsrac‐8

erreichtwerden.DieGeschwindigkeitderchemischenAcylierungkannwährendderReaktionsführung

mit und ohne Lipase beobachtet werden, da bereits nach wenigen Minuten eine Braunfärbung zu

erkennenist.Dieses istmiteinererhöhtenReaktivitätdesEsters125zubegründenunderklärtden

relativniedrigenUmsatzvon16%inAbschnitt4.3.7.1,derdurchenzymatischeAcylierungdesAmins

rac‐4 erhaltenwurde. Obwohl der Vinylester125 bereits erfolgreich zur Acylierung von Alkoholen

unter lösungsmittelfreien Bedingungen[248] eingesetzt worden ist, eignet er sich nicht zur Racemat‐

spaltungvonrac‐4.

Wird mit stark aktivierten Acyldonoren gearbeitet, so lässt sich die chemische Acylierung durch

VerringerungderReaktionstemperaturzueinemgewissenTeilvermeiden.Allerdingsmussinsolchen

Fällen die vorhandeneAktivität der CAL‐B bei entsprechendenTemperaturen bestimmtwerden, da

dieseihrTemperaturoptimumbei60–80°Chat.[195]

40°C60°C

0102030405060708090100

9 122 147 111 122 125

0 0 0 0

12

81

0 0 0 2

33

93

Umsatz[%

]

Acyldonor

40°C 60°C


102

4.3.8 ReaktionskinetikenderRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

unterschiedlichenAcyldonoren

Um die Effizient der unterschiedlichen Acyldonoren effektiv miteinander vergleichen zu können,

wurdendieAnfangsgeschwindigkeitenkinetischerRacematspaltungendieserAcyldonorenmiteinander

undmitMalonsäurediethylester(9)alsStandard‐Acyldonorverglichen.

DieReaktionskinetikenderAcylierungsreaktionendesAminsrac‐4wurdenunterdenStandard‐Reak‐

tionsbedingungen durchgeführt. Dabei wurden die Reaktionen nach der entsprechenden Zeit abge‐

brochenundaufgearbeitet,wasgenerellzukleinerenAbweichungendurchWägefehlernführenkann.

WeitereFehlerquellensinddieSchwankungsbreitenbeiderAuswertungder1H‐NMR‐Spektrensowie

derHPLC‐Chromatogramme.DerUmsatzwirdbeidiesenAcylierungsreaktioneninBezugaufdasAmin

rac‐4bestimmt,dadieFlüchtigkeitderAcyldonorennichtuntersuchtwordenist.

AlsVergleichfürdiealternativenAcyldonorendientedieReaktionskinetikderAcylierungvonrac‐4mit

Malonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterlösungsmittelfreienBedingungen(Abbildung101).Es

ist ein steterAnstiegdesUmsatzesmit der Zeit zu erkennen bis nach 24 Stunden ein vollständiger

Umsatzerreichtwird.DieEnantiomerenüberschüssefürdasAmid(R)‐10liegenbeidiesenAcylierungs‐

reaktionenimmer>94%ee.EineAusnahmestelltdabeiderReaktionmitachtStundenReaktionszeitan,

beidernur89%eebeobachtetwerdenkönnen.DieseAbweichungkannnichtaufFehlerwährendder

Reaktionsführungbegründetwerden.

Die Kinetik der Racematspaltung von rac‐4 mit Malonsäurediethylester (9) wurde in vorherigen

ArbeitenimArbeitskreis[33]bereitsuntersucht,allerdingsbeieinerReaktionstemperaturvon80°Cund

inAnwesenheit vonn‐Heptanals Lösungsmittel.Dabei konnte ebenfalls eine schnelleReaktionsrate

festgestelltwerden,wobeidervollständigeUmsatzbereitsnachdreiStundenerreichtwurde.Allerdings

warderEinsatzvon200mg/mmolCAL‐B,alsoderfünffachenMengedesimRahmendieserKinetik‐

studieverwendetenEnzyms,fürdieVersuchsreihenotwendig.


103

Abbildung101. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).

Bei der Verwendung von Phenoxyessigsäureethylester (122) als Acyldonor bei der enzymatischen

RacematspaltungdesAminsrac‐4 inAbwesenheitvonLösungsmittelnwurdenmoderateErgebnisse

erzielt(Abbildung102).SowerdenhierbeizwarbereitsnacheinerMinuteReaktionszeit30%Umsatz

zumAmid(R)‐121undeinEnantiomerenüberschussvon79%eeerreicht,waseinemE‐Wertvon12

entspricht. Nach zehn Minuten liegt der Umsatz schon bei 41%, allerdings sinkt hierbei der Enan‐

tiomerenüberschussauf72% (E=10). ImVerlaufderReaktion jedoch steigtderUmsatzweiter an,

sodassbei24StundenReaktionsdauer58%Umsatzerhaltenwerden.Deree‐WertliegtindiesemFall

bei61%,waseinerEnantioselektivitätvon9entspricht.DiesesistfüreineeffizienteRacematspaltung

nichtausreichend.DerbeilängererReaktionsdaueransteigenderUmsatzundsinkendeEnantiomeren‐

reinheit ist ein Indiz dafür, dass eine parallel ablaufende chemische Acylierung stattfindet. Sollte

Phenoxyessigester122alsAcyldonorEinsatzfinden,sowürdedasbesteErgebnismitderimRahmen

dieserArbeitverwendeteEnzymmengebereitsnachzehnMinutenReaktionszeiterzieltwerden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Umsatz[%

]/ee(R)‐10[%]

Resktionszeit[h]

Umsatz[%] ee(R)‐10[%]ee(R)‐10


104

Abbildung102. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigester122.

DieKinetikderRacematspaltungdesAminsrac‐4mitCyanessigester124alsAcyldonorunterlösungs‐

mittelfreien Bedingungen ist in Abbildung 103 dargestellt. Zwar werden hierbei bereits nach einer

Minute20%Umsatzerreicht,allerdingssteigtdieserimVerlaufderReaktionnursehrlangsamweiter

an. Nach 4.5 Stunden Reaktionszeit können dennoch 42%Umsatz erzieltwerden. Bei einer Verlän‐

gerung der Reaktionsdauer auf 24 Stunden liegt der Umsatz bei 65%, was für eine theoretische

Racematspaltungmitmaximal50%UmsatzzumAmid(R)‐123nachteiligist.DieEnantiomerenüber‐

schüssedieserAcylierungenliegenbeihöchstens12%ee,waseinerEnantioselektivitätvon1entspricht.

Diesessprichtdafür,dassdieenzymatischeAcylierungnichtenantioselektivverläuft.Vielmehrstimmt

esmit den in Abschnitt4.3.7.3 erhaltenen Ergebnissen überein. Demnachwird in Abwesenheit von

CAL‐B 33% Umsatz zum Amid 123 mit 3% ee erzielt. Die Lipase selbst hat folglich in dieser

Versuchsreihe mit Cyanessigester124 als Acyldonor keinen Einfluss auf die Racematspaltung. Der

DonoristsomitfürdiekinetischeRacematspaltungnichtgeeignet.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Umsatz[%

]/ee(R)‐121[%]

Reaktionszeit[h]

Umsatz[%] ee(R)‐117[%]ee(R)‐121

(R)‐121122,1Äq.


105

Abbildung103. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigester124.

DieVersuchsreihezurBestimmungderKinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigester

111alsAcyldonorzumentsprechendenAmid(R)‐8wurdeebenfallsunterlösungsmittelfreienBedin‐

gungen durchgeführt (Abbildung 104). Hierbei ist zu erkennen, dass die Reaktionmit nur geringer

Geschwindigkeitverläuft,daderUmsatzsehr langsamvon16%nacheinerMinuteReaktionszeitauf

33%nach24Stundenansteigt.DerEnantiomerenüberschussbeträgtnacheinerMinuteReaktionsdauer

72%,waseinerEnantioselektivitätvon7entspricht.ImLaufederReaktionüber24Stundenbleibtder

ee‐Wert konstant bei etwa 76 – 83% ee. Auch hierbei findet wahrscheinlich eine konkurrierende,

parallelablaufendeunkatalysierteAcylierungdesAminsrac‐4statt,dadasMethoxyessigester111in

β–Positionstarkaktiviertist.EinAbfalldesEnantiomerenüberschussesbeierhöhtenTemperaturenmit

demEster111wurdeauchvonKANERVAbeobachtet.[36]DerhöchsteE‐Wertvon16wirdsomitnach

24StundenReaktionsdauererreichtwird,wobeiderUmsatzallerdingsjedochnurbei33%liegt.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Umsatz[%

]/ee(R)‐123[%]

Reaktionszeit[h]

Umsatz[%] ee[%]ee(R)‐123


106

Abbildung104. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigester111.

BeidemdirektenVergleichderhiergewähltenAcyldonorenwirddeutlich,dassMalonsäurediethylester

(9)eineSonderstellungeinnimmt(Abbildung105).DabeiwurdedasAmid (R)‐10nach4.5Stunden

Reaktionszeitmit42%Umsatzund95%ee(E>100).ZwarkonntenmitdemPhenoxyessigester122

bereitsnachzehnMinutenReaktionszeit43%Umsatzerhaltenwerden,allerdingssteigtdiesernach

4.5Stundenauf57%an.DiesesliegtdeutlichüberdemmaximalenUmsatzeinerkinetischenRacemat‐

spaltungvon50%undhateineverringerteEnantiomerenreinheitundsomitauchEnantioselektivität

(E=18)zurFolge.DerinderLiteraturhäufigverwendeteMethoxyessigester111weistzuBeginnder

ReaktioneinehoheReaktionsrateauf,allerdingsstagniertdiesebereitsnachetwa30Minuten.Nach

4.5StundenkanndasAmid(R)‐8mit22%Umsatzund92%ee(E=31)beobachtetwerden.Eventuell

ist die Carbonylfunktion des Esters 111 durch die aktivierte Methoxy‐Funktion zu reaktiv für

Acylierungsreaktion in lösungsmittelfreien Systemen. Daher wäre ein Einsatz des Esters 111 in

größerenMaßstäbennichtbefriedigend.

Ein Vergleich der Racematspaltungenmit denAcyldonoren9 und124 zeigt zunächst ein ähnliches

Verhalten,allerdingswirdnurmitMalonsäurediethylester(9)einvollständigerUmsatzmitsehrguten

EnatiomerenüberschüssenundexzellentenE‐Wertenvon>100erreicht.DieCyano‐FunktionimEster

124hatdemnacheinenzustarkaktivierendenEinflussaufdieCarbonylfunktionundsomitauchaufdie

Reaktionsrate,dahierbeinach4.5Stundenzwar48%UmsatzzumAmid(R)‐123erzieltwerden,jedoch

beträgtderEnantiomerenüberschussbei10%ee(E=1).FürRacematspaltungeninlösungsmittelfreien

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Umsatz[%

]/ee(R)‐8[%]

Reaktionszeit[h]



107

SystemenistMalonsäurediethylester(9)folglichderAcyldonorderWahlundwirdalsStandard‐Acyl‐

donoreingesetzt.

RO

O R'+

NH2HN R'

O

rac‐4

CAL‐B(40 mg/mmol)

9 (R = Et, R' = CH2COOEt)122 (R =Et, R' = CH2OPh)124 (R = Et, R' = CH2CN)111 (R = Et, R' = CH2OMe)

(R)‐10 (R' = CH2COOEt)(R)‐121 (R' = CH2OPh)(R)‐123 (R' = CH2CN)(R)‐8 (R' = CH2OMe)

60 °C, 4.5 h

Abbildung105. VergleichderAcyldonorennach4.5StundenReaktionszeit.

4.3.9 Substratbreite

4.3.9.1 1‐Aminoindan(rac‐130)

1‐(R)‐Aminoindan ((R)‐130) ist ein wichtiger Metabolit des Antiparkinson‐Medikaments Rasagilin

(148)undkanngleichzeitigalsBausteinfürdieSynthesediesesWirkstoffesdienen(Abbildung106).

(R)‐130selbstbesitztzusätzlichneuroprotektiveEigenschaften.

NH2HN

149Rasagilin

(R)‐148

NH2

rac‐148

Abbildung106. RetrosynthesevonRasagilin(148),ausgehendvon(R)‐130.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

43

5748

22

96

68

10

92107

16

1

31

Umsatz[%

]/ee[%]/

E‐Wert

Amid

Umsatz[%] ee[%] E‐Wert

(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

(R)‐130 rac‐130


108

Einmöglicher Syntheseweg ausgehend von (R)‐130 beginntmit der Racematspaltung der Vorstufe

rac‐130,die inderLiteraturbereitsmehrfachsowohlaufchemischemalsauchenzymatischemWeg

beschriebenwurde.[30,31,68,242,267]Dabeikonnten,insbesonderebeiderRacematspaltungmittelsCAL‐B,

bereitssehrguteErgebnisseinHinblickaufUmsatzundEnantioselektivitäterzieltwerden.Sokonnten

DITRICH et al. das entsprechende Amid mit 1.5 Äquivalenten Methoxyacetat 6 als Acyldonor nach

24StundenbeiRaumtemperaturmit92%Umsatz(bezogenauf50%maximalenUmsatz)und>98%ee

erhalten.[30]AuchdieAcylierungmitCarbonsäurenliefertdasjeweiligeAmidmit>99%ee.[31]Durcheine

dynamisch‐kinetischeRacematspaltungmithilfederCAL‐BundeinesPd‐KatalysatorsmitEthylacetat5

alsAcyldonorkonntePARKdasentsprechendeAmidenantiomerenreinmit88%Umsatzerhalten.[242]

ZuBeginnderArbeitenmitAminoindan(rac‐130)wurdeauchdieseRacematspaltunginHinblickauf

parallelablaufende,spontanechemischeAcylierungsreaktionenuntersucht.DafürwurdedieAcylierung

vonrac‐130mitMalonsäurediethylester(9)beiunterschiedlichenTemperaturenundReaktionszeiten

löungsmittelfrei zum entsprechenden Amid rac‐129 umgesetzt (Abbildung 107). Bei 60 °C und

24StundenReaktionsdauerwurdederhöchsteUmsatzvon9%erzielt.EineErhöhungauf80 °Cbei

4.5StundenReaktionsdauerliefertenoch8%Umsatz,währendbei20°Cnurnoch2%erhaltenwurden.

Unter den im Rahmen dieser Arbeit gewählten Standard‐Reaktionsbedingungen von 60 °C und

4.5StundenReaktionsdauerwurdennur4%UmsatzzumAmidrac‐129erzielt.ImRahmenderenzy‐

matischenAcylierungsinddieAuswirkungendiesesErgebnissesvernachlässigbar.

O

O

O

O+

9, 1 Äq.rac‐130

NH

O

O

O

NH2rac‐129

T, t

Abbildung107. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐129.

ImAnschlussandieBestimmungenderdurchunkatalysierteParallelreaktionenerhaltenenUmsätze

solltedieenzymatischeRacematspaltungvonrac‐130mitMalonsäurediethylester(9)unterStandard‐

Bedingungen durchgeführt und in Hinblick auf optimale Reaktionsbedingungen untersuchtwerden.

Dafür wurde die Racematspaltung von rac‐130 zunächst in Abhängigkeit von der Temperatur bei

0

2

4

6

8

10

80°C,4.5h 80°C,24h 60°C,4.5h 60°C,24h 20°C,24h

4

8

3

9

1

Umsatz[%

]


Umsatz[%]


109

4.5StundenReaktionsdaueruntersucht.DieErgebnisse sind inAbbildung108graphischdargestellt.

Dabeiistersichtlich,dassbeiderRacematspaltungkeinTrendderAbhängigkeitvonderTemperatur

hinsichtlich des Umsatzes vorliegt. So werden bei 80 °C Reaktionstemperatur 39% Umsatz erzielt,

währendbei20°Cnoch43%Umsatzerhaltenwerden.DieEnantiomerenüberschüsseliegendabeifür

dasAmidrac‐129imBereichvonnur73‐79%ee.DieRacematspaltungvonrac‐130mitdemMethoxy‐

ester6wurdevonBASFSEmithoherEnantiomerenreinheitsowohldesAmids(R)‐129alsauchdes

Amins(S)‐130durchgeführt.[30]KANERVAetal.führtendieAcylierung,ebenfallsmitdemMethoxyester

6,unterlösungsmittelfreienBedingungenbei23°CmithoherEnantioselektivitätdurch,wobeibereits

nacheinerStunde39%Umsatzerzieltwordensind.[36]BeidenindieserArbeitgewähltenReaktions‐

bedingungen spielt die Wahl des Acyldonors sowie die Abwesenheit von Lösungsmitteln eine ent‐

scheidendeRolle.

O

O

O

O+

9, 1 Äq.rac‐130

NH

O

O

O

NH2

(R)‐129

CAL‐B(40 mg/mmol)

T, 4.5 h

Abbildung108. Racematspaltungvonrac‐130inAbhängigkeitderTemperaturbei4.5h.

DieReaktionsdauerwurdeunterdensonstgleichbleibendenBedingungenauf24Stundenverlängert,

umdenEinflussderReaktionszeit zuüberprüfen (Abbildung109).Dabeiwirdbei 80 °CReaktions‐

temperatureinUmsatzvon42%erreicht,wasnureineleichteSteigerungzudemWertvon39%bei

4.5Stunden Reaktionszeit ist. Der Enantiomerenüberschuss für das Amid (R)‐129 ist mit 97% ee

(E>100)sehrgut.Allerdingswurdebereitsbeschrieben,dassbiszu8%desAmids(R)‐129bei80°C

und24StundenReaktionsdaueraufchemischemWegegebildetwird.DieEnantiomerenüberschüsse

derAcylierungennehmen jedochmitweitersinkenderTemperaturab,sodassdasAmid(R)‐129bei

40°Czwarnochmit50%Umsatzund90%ee,bei20°Cjedochnurnocheinee‐Wertvon54%detektiert

werdenkann.DieseniedrigeEnantioselektivität istüberraschend,dadieArbeitsgruppeumKANERVA

sehrguteErgebnissemitderCAL‐BinHinblickaufEnantioselektivitätbei23°CReaktionstemperatur

erhaltenhat.[36]

0102030405060708090100

80 60 20

3949

6673

7973

Umsatz[%

]/ee(R)‐129[%]

Reaktionstemperatur[°C]



110

DasbesteResultatwurdebei24StundenReaktionsdauersomitbei60°CReaktionstemperaturerzielt

(E>100).DasAmid(R)‐129wurdehierbeinahezuenantiomerenreinerhalten.Diesesistungewöhnlich,

danach4.5StundenReaktionszeitbereitseinee‐Wertvon79%beobachtetwerdenkonnte(Abbildung

108). Obwohl es sich bei den beiden Acylierungen um eigenständige Reaktionen handelt können

technischeFehlerausgeschlossenwerden.WährendderLagerungdesAminsrac‐130isteineÄnderung

dereigentlichfarblosenVerbindungzueinergelbensichtbargewesen.Mithilfeder1H‐NMR‐Spektro‐

skopiekonntegezeigtwerden,dassneueFremdsignalesowohlimaromatischenalsauchaliphatischen

Bereich des Spektrums vorhanden sind, die jedoch nicht weiter zugeordnet werden können. Diese

beobachteten Verunreinigungen sollten jedoch keine Auswirkung auf die Enantiomerenüberschüsse

haben.

O

O

O

O+

9, 1 Äq.rac‐130

NH

O

O

O

NH2

(R)‐129

CAL‐B(40 mg/mmol)

T, 24 h

Abbildung109. Racematspaltungvonrac‐130inAbhängigkeitderTemperaturbei24h.

NachdemdieStandardreaktions‐Bedingungenvon60°Cund4.5StundenfürdieenzymatischeRacemat‐

spaltungvonrac‐130zwarzueinemgutenUmsatzvon39%,jedochnurzueinemmäßigenEnantio‐

merenüberschussvon79%eeführten,solltenimAnschlussdaranweitereVariablen,wiedieAnzahlan

Äquivalenten des Acyldonors 9 oder die Zugabe von MTBE zum Reaktionsgemisch zur besseren

DurchmischungderKomponenten,getestetwerden(Abbildung110).Dieunterdenlösungsmittelfreien

StandardreaktionsbedingungenerhaltenenErgebnissedienendabeialsVergleichsreaktion.

DurchZugabevon1.5ÄquivalentendesMalonesters9kanneinnahezuvollständigerUmsatzmitsehr

hoherEnantiomerenreinheiterzieltwerden,waseinersehrgutenEnantioselektivitätvon61entspricht.

AlsVergleichwurdedieRacematspaltunginMTBEalsLösungsmitteldurchgeführt,die41%Umsatzmit

mäßigen70%ee(E=9)lieferte.EineVerlängerungderReaktionszeitauf24Stundenliefertebessere

Ergebnisse mit 52% Umsatz und 85% ee (E = 40). Eine Erhöhung der Menge an Acyldonor 9 auf

0102030405060708090100

80 60 40 20

42 4450

45

97 9890

54

Umsatz[%

]/ee(R)‐129[%]

Reaktionstemperatur[°C]



111

5Äquivalente, ebenfalls in MTBE, führte zu 63% Umsatz zum Amid (R)‐129 und 76% ee. Dieses

entspricht einerEnantioselektivität von14und ist für eine effizienteRacematspaltungungenügend.

Allerdings spielt bei 24StundenReaktionszeit die spontane chemischeAcylierung von rac‐130 eine

tragendeRolle.

AuchbeidiesenAcylierungsreaktionensinddiegroßenSchwankungenderEnantioselektivitätennicht

aufFehlerwährendderDurchführungsowiederMessungenmittelsHPLCzuerklären.

O

O

O

O+

9, 1 ‐ 5 Äq.rac‐130

NH

O

O

O

NH2

(R)‐129

CAL‐B(40 mg/mmol)

60 °C, 4.5 ‐ 24 hMTBE

Abbildung110. VariationvonReaktionsbedingungenderAcylierungvonrac‐130.

ZusätzlichwurdederVerlustdesAminoindans(rac‐130)währendderAufarbeitungermittelt.Dabei

wurdenach15MinutenRührenbei550mbarund40°CnureinVerlustvon3%ermittelt,wasnochim

akzeptablenBereichliegt.

DiegezeigtenAcylierungsreaktionensindübereinenlängerenZeitraummitunterschiedlichenChargen

desAminsrac‐130durchgeführtworden.ZwarwareinFarbunterschiedvonfarblosbisgelbsowohl

zwischendenChargenals auchwährendderLagerung zu erkennen, jedoch sind inallen aufgenom‐

menen1H‐NMR‐SpektrendiegleichenPeaksvonVerunreinigungenmit<1–3%vorhanden.Somitkann

eineZersetzungdesEduktesrac‐130ausgeschlossenwerden.

Insgesamtlässtsichfolgern,dassbeiderenzymatischenRacematspaltungdesAminoindans(rac‐130)

dieVerwendungeinesleichtenÜberschussesdesAcyldonors9zueinemvollständigenUmsatzundsehr

guten91%ee(E=61)führt.Diesesscheintzunächstnachteiligzusein,allerdingskannderMalonester

9beigrößerenReaktionsansätzendestillativvomRohproduktabgetrenntund inweiterenRacemat‐

spaltungeneingesetztwerden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1Äq.9 1.5Äq.9 1Äq.9,MTBE 5Äq.9,MTBE,24h

1Äq.9,MTBE,24h

46 49 46

63

52

79

91

7076

83

Umsatz[%

]/ee(R)‐129[%]


Umsatz[%] ee[%]

9, 9, 9,

ee(R)‐129


112

4.3.9.2 SekundäreAmine

Enantiomerenreine Amine sind wichtige Bausteine für pharmazeutische Wirkstoffe und Agro‐

chemikalien.EssindjedochnurwenigeMethodenzurRacematspaltungsekundärerAminebekannt.Der

StandderWissenschaftistdabeiaufChromatographiemitchiralenstationärenPhasenoderklassische

RacematspaltungdurchBildung vonDiastereomerenpaarenbeschränkt. SekundäreAmine reagieren

aufgrundihrerstarkenNucleophilliemitdenAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen,wie

niedrige Temperaturen und Konzentrationen, meist nicht. Die Schwierigkeit bei der Acylierung

cyclischer sekundärer Amine liegtwahrscheinlich in der großen Anzahl an potentiellen Übergangs‐

zuständen sowie an denmöglichen Konformationen, die energetische sehr ähnlich sind.[268] Bei der

RacematspaltungfindendabeiklassischLipasenausCandidarugosa[239]sowiedieCAL‐AausCandida

antarctica[28,269]Anwendung.

In dieser Arbeit sollten zunächst die Referenzverbindungen der ausgehend von 2‐ bzw. 3‐Methyl‐

piperidin(149bzw.150)synthetisiertwerden,umeineMethodefürdieHPLCzufinden.ImAnschluss

daransolltedieenzymatischeAcylierungmitMalonsäurediethylester(9)untersuchtwerden.

Die chemische Acylierung erfolgt im Fall der sekundären Amine 149 und 150mit dem Acyldonor

Malonsäurediethylester(9)unterErhitzenzumRückflussfür3Stunden(Abbildung111).[253]DieAmide

rac‐151 und rac‐152 wurde mit Umsätzen von 56% bzw. 63% erhalten. Die isolierten Ausbeuten

betrugendabei41%fürrac‐151und42%fürrac‐152,wasfürdieAnalytikjedochausreichendwar.

Abbildung111. SynthesederRacematerac‐151undrac‐152alsReferenzverbindungen.[253]

AnschließendkonntefürdieAmideeinegeeigneteMethodefürdieHPLCetabliertwerden.InAbbildung

112isteincharakteristischesHPLC‐ChromatogrammamBeispielvonrac‐152dargestellt.Deree‐Wert

desRacematesrac‐144beträgt<0.2%.


113

Abbildung112. HPLC‐ChromatogrammdesracemischenAmidsrac‐152(gemessenanAD‐H‐Säulemitn‐Heptan/i‐PrOH(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:tR=18.29min(R),19.68min(S),ee‐Wert:0%).

Durch Rühren bei vermindertem Druck konnte der Verlust der sekundären Amine 149 und 150

ermitteltwerden(Abbildung113).

NH

149

NH

150

Abbildung113. VerlustdersekundärenAmine149und150.

So wird mit kontinuierlicher Rührdauer ein größerer Verlust der Komponenten beobachtet. Nach

15MinutenwirdbeidemAmin149einVerlustvon64%undbei150von27%bestimmt.Infolgedessen

sollte während der Reaktionsführung besonders bei höheren Temperaturen auf ein dicht ver‐

0

20

40

60

80

100

5 10 15

21

43

64

615

27Verlust[%

]

Rührdauer[min]

Verlust142[%] Verlust138[%]Verlust149 Verlust150

(R)‐152Flächenintegral:

50.1%

(S)‐152Flächenintegral:

49.9%


114

schlossenes Reaktionssystem geachtet werden. Die Bestimmung des Umsatzes sollte aufgrund der

FlüchtigkeitderAmine149und150inBezugaufdenjeweiligenAcyldonorgeschehen.

Im Anschluss an die chemische Acylierung der sekundären Amine 149 und150 wurden die enzy‐

matischeRacematspaltungmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterStandardbedingungen,

abweichend davon jedoch mit 24 Stunden Reaktionsdauer, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in

Abbildung114graphischdargestellt.

N

O O

O

O

O O

O+

CAL‐B(40 mg/mmol)

60 °C, 24 h

9, 1 Äq.

R1

NH

R2R1

R2

149: R1 = H, R2 = Me150: R1 = Me, R2 = H

151: R1 = H, R2 = Me152: R1 = Me, R2 = H

Abbildung114. EnzymatischeAcylierungungdersekundärenAmine149und150.

DieAcylierung desAmins rac‐149mitMalonsäurediethylester (9) gelang unter den hier gewählten

Bedingungen nicht. Sterische Gründe könnten in diesem Fall eine wichtige Rolle spielen, da das in

2‐PositionmethylierteAmin149einenschlechtenZugangzuderAmino‐Funktionbietet.MitdemAmin

rac‐150konnten15%UmsatzzumAmid152erreichtwerden.Derermittelteee‐Wertbetrugnur10%,

waseinerEnantioselektivitätvon1entspricht.

ImAnschlussandieAcylierungsreaktionenunterStandard‐ReaktionsbedingungensolltenVersuchezur

OptimierungderenzymatischenAcylierungvon3‐Methylpiperidin (rac‐150) inHinblickaufUmsatz

bzw. Enantioselektivität durchgeführt werden. Dabei wurden die Reaktionstemperatur sowie die

EnzymmengeunddieZugabevonMTBEalsLösungsmittelvariiert(Tabelle16).Sokonntemitsinkender

Temperatur einAnstiegdesUmsatzes von5%bei 80 °C auf 19%bei 40 °C festgestelltwerden.Die

VerlängerungderReaktionsdauerauf48StundenführtenurzueinemleichtenAnstiegdesUmsatzesauf

22% (Eintrag 6). Die Enantiomerenüberschüsse liegen dabei in allen Fällen bei 10%, was einer

Enantioselektivität von <2 entspricht. Die Zugabe von MTBE zur Reaktionsmischung bei 60 °C

(Eintrag3) führtezueinerVerdopplungdesUmsatzesauf34%, jedochkaumzueinerErhöhungdes

ee‐Wertes.DiezusätzlicheErhöhungderEnzymmengeauf80mg/mmolliefertedasAmid152in75%

Umsatz,aberauchindiesemFalllagderee‐Wertnurbei18%.ZwargelingeineRacematspaltungvon

rac‐150mitderLipaseCAL‐Bnicht,jedochkannauchindiesemFalldieLipasealsBiokatalysatorfür

0

5

10

15

20

149 150

0

15

10

Umsatz[%

]/ee[%]

Amin

Umsatz[%] ee[%]


115

die Darstellung des racemischen Amids rac‐152 dienen, da hierbei auf das Erhitzen zumRückfluss

verzichtetwerdenkann.

Tabelle16. ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐150.

Eintrag MTBE[mL] T[°C] Umsatz[%] ee[%] E

1 ‐ 80 5 10 <2

2 ‐ 60 15 10 1

3 0.1 60 34 13 <2

4a) 0.1 60 75 18 2

5 ‐ 40 19 11 <2

6b) ‐ 40 22 10 <2a)CAL‐B:80mg/mmol,b)Reaktionsdauer:48h.

ZusätzlichzumVersuchderProzessoptimierungwurdedieparallelablaufendechemischeAcylierung

des sekundären Amins 150 bei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen untersucht (Tabelle 17).

DabeikonntebeiallenTemperaturendieBildungdesAmidsrac‐152mitbiszu9%Umsatzbei60°C

und 24 Stunden Reaktionszeit beobachtet werden. Die ee‐Werte betrugen erwartungsgemäß <1%.

DiesesErgebnisweichtvonderchemischenAcylierungmitrac‐4alsAminab(vergl.Abschnitt4.3.4.1.1),

beiderkeinUmsatzzumentsprechendenAmiderhaltenwurde.DieseswirdmitderstärkerenNucleo‐

philiedessekundärenAminsrac‐150begründet.

Tabelle17. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150.

Eintrag T[°C] t[h] Umsatz[%] ee[%] E

1 80 24 5 n.b. n.b.

2 60 24 9 0 0

3 40 48 6 <1 1n.b.=nichtbestimmt.


116

4.3.10 ɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor

4.3.10.1 ChemischeAcylierungmitɛ–Caprolacton(3)

In dem ersten Teil dieser Arbeit (vergl. Abschnitt 3.3) wurde die enzymatische Herstellung von

ɛ‐Caprolacton (3) beschrieben. Im Folgendenwurde nun die Fähigkeit des Lactons3 zur Racemat‐

spaltung vonAminenwie 1‐Phenylethylamin (rac‐4) näher untersucht. Dafürwurden dieReferenz‐

verbindungenchemischhergestelltsowiedieStabilitätdesLactons3ermittelt.ImAnschlusswurdedie

enzymatischeAcylierungderAminedurchgeführtundderTemperatureffektuntersucht.

Als Vorbereitung der Acylierungsreaktionen wurde zunächst die Stabilität von ɛ–Caprolacton (3)

untersucht. Dazuwurde das Lacton3 in An‐ undAbwesenheit der CAL‐B bei 60 °C für 24 Stunden

gerührt(Tabelle18). ImFallderCAL‐BerfolgtzusätzlicheineAufarbeitungnachAAV6.DieAnsätze

wurdenmittels1H‐NMR‐Spektroskopieuntersucht.

Tabelle18. BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3).

Eintrag Bedingungen Verhältnis3/146

1 RührenohneCAL‐B 100:0

2RührenmitCAL‐Bund

AufarbeitungnachAAV61:77

So wird nach 24 Stunden Rühren in Abwesenheit der Lipase nur das reine Lacton 3 im 1H‐NMR‐

Spektrumerhalten.InAnwesenheitderCAL‐BmitanschließenderAufarbeitungmittelsFiltrationund

SpülenmitorganischenLösungsmittelnwerdenjedochnurnochSpurendesLactons3gefunden.Den

größtenAnteilderMischungmachtdieentsprechendeHydroxysäure54aus,diedurchdieSpaltungdes

Lactons3gebildetwird.FürdieSpaltungdesLactons3kanndiebereitsinSpurenvorhandeneSäure54

undzumanderendieLipaseselbstverantwortlichsein..FürdieReaktionsführungistdiesesjedochnicht

vonNachteil,dainderLiteraturCarbonsäurenbereitsmehrfacherfolgreichalsAcyldonoreneingesetzt

wordensind.[250,251]

DiechemischeAcylierungdesAminsrac‐4mitdemAcyldonorɛ‐Caprolacton(3)erfolgtunterErhitzen

zumRückflussfür4Stunden(Tabelle19,Eintrag1).[253]DasAmidrac‐147wurdedabeimit62%Umsatz

erhalten, was für die Analytik jedoch ausreichend war. Zusätzlich wurden auf gleichem Wege

AcylierungsreaktionendersekundärenAmine142und143durchgeführt(Eintrag2und3).Dieent‐

sprechendenAmidekonntendabeinurmitgeringenUmsätzenvon7bzw.17%erhaltenwerden.


117

Tabelle19. ChemischeAcylierungsreaktionenmitɛ–Caprolacton(3).[253]

180 °C, 4 h

rac‐4

3,1 Äq.

153

O

O

NH2OH

O

4HN

oder

NH

R1

149 (R1 = H, R2 = Me)150 (R1 = Me, R2 = H)

oder

N

R1

O

OH4

+

R2R2

154 (R1 = H, R2 = Me)155 (R1 = Me, R2 = H)

Eintrag Amin Umsatz[%]

1 rac‐4 62

2 149 7

3 150 17

Anschließend konnte für dasAmid rac‐153 eine geeigneteMethode für dieHPLC gefundenwerden

(Abbildung115).DasAmid153wurdealsRacematmit0%eeerhalten.DieEtablierungeinerHPLC‐

MethodefürdieAmide154und155gelangnichtaufgrunddergeringenSubstanzmengenicht.

Abbildung115. HPLC‐Chromatogrammvonrac‐153(gemessenanAD‐H‐Säulemitn‐Heptan/i‐PrOH(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:tR=32.21min(R),39.69min(S),ee‐Wert:0%).

OH

O

4HN


50.1%

(R)‐153Flächenintegral:

49.9%


50.1%


118

4.3.10.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)

ImAnschlussandieBestimmungderStabilitätdesLactons3solltezunächstdessenAktivitätuntersucht

werden,bevorVersuchezurSelektivitätdurchgeführtwerden.DafürwurdedieseszunächstmitBenzyl‐

amin(134)alsModel‐SubstratunterStandardbedingungenenzymatischumgesetzt(Abbildung116).

DaessichbeidemAmin134nichtumeineracemischeVerbindunghandelt isthiervoneinemvoll‐

ständigen Umsatz auszugehen. Im 1H‐NMR‐Spektrum konnte allerdings nur ein Umsatz von 46%

bezogenaufdasAmin130nachgewiesenwerden.AuchindiesemFallistetwaeinDritteldesLactons3

zur Säure54 gespaltenworden.Wird der Umsatz zumAmid156 auf die Summeder Integrale des

Lactons3 und der Säure54 bezogen, so ergibt sich ein Umsatz von 44%.Während der Reaktions‐

führungundderAufarbeitungtrittdemnachkeinVerlustderKomponentenauf.

Abbildung116. EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(130)mitɛ‐Caprolacton(3).

Durch Variation der Temperatur sollte die enzymatische Acylierung in Hinblick auf eine mögliche

Umsatzsteigerung untersuchtwerden (Tabelle 20). Sowurden bei 80 °C Reaktionstemperatur 51%

UmsatzzumAmid156erreicht.DurchZugabevonMTBEalsorganischesLösungsmittelbei80°Ckonnte

eineUmsatzsteigerungauf65%erzieltwerden.Erfreulicherweisekonntenbereitsbei20°CReaktions‐

temperatur nach 4.5 Stunden 57% Umsatz erhalten werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine

Erhöhung der Temperatur auf 80 °C keinen positiven Einfluss auf die enzymatische Acylierung des

Benzylamins134hat.

Tabelle20. Prozessoptimierung der enzymatischen Racematspaltung von Benzylamin (134) mitɛ‐Caprolacton(3).

Eintrag MTBE[mL] T[°C] t[h] Umsatz[%]

1 ‐ 80 4.5 51

2 0.5 80 4.5 65

3 ‐ RT 4.5 57

Die parallel ablaufende chemische Acylierung des Amins 134 mit dem Lacton 3 wurde bei unter‐

schiedlichen Temperaturen untersucht (Tabelle 21). Bei 80 °C Reaktionstemperatur können in Ab‐

wesenheitderLipasenoch30%UmsatzzumAmiderzieltwerden.MitsinkenderTemperatursinktder


119

Umsatz, bis schließlich bei 0 °C nur noch 3% Amid156 gebildet werden. Durch Verlängerung der

Reaktionszeitauf24Stundenbei20°C(Eintrag4)werdennoch53%Umsatzerhalten.

Tabelle21. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ–Caprolacton(3).

Eintrag T[°C] t[h] Umsatz[%]

1 80 4.5 30

2a) 60 4.5 69

3 RT 4.5 12

4 RT 24 53

5 0 4.5 3a)VerwendungeineraltenChargeanɛ–Caprolacton(3).

DurchVerwendungeinerälterenChargedesLactons3(Eintrag2),inderlaut1H‐NMR‐Spektroskopie

bereits17%desLactons3währendderLagerungzurentsprechendenSäure54gespaltenwordensind,

konnten bei 60 °C und 4.5 Stunden Reaktionszeit 69% Umsatz zum Amid 156 erhalten werden.

CarbonsäurenwerdenseltenalsAcyldonorenverwendet,daeinereversibleSalzbildungmitdemAmin

stattfindet.[250] Dieses unreaktive Salz ist nicht mehr für die Bildung des Acyl‐Enzym‐Komplexes

vorhanden.SomitstehtnureinTeilderSäurealsAcyldonorzurVerfügung,waszueinerverringerten

Reaktionsgeschwindigkeitführt.UnaktiviterteCarbonsäurenbenötigenfolglicheinKupplungsreagenz

zurAktivierungundhäufigdrastischeReaktionsbedingungen,ummiteinemAmineineAmid‐Bindung

zubildenunddieBildungdesentsprechendenSalzeszuvermeiden.[270]DieWahrscheinlihckeiteiner

Acylierungsreaktions durch die Säure54 als Acyldonor ist unter den verwendeten Reaktionsbedin‐

gungendemnach sehr gering.DurchdieWahl einermöglichstkurzenReaktionsdauerundniedriger

TemperaturkanndieunkatalysierteAcylierungdesAmins134somitunterdrücktwerden.Dascyclische

Lacton3 ist,eventuelldurchdieRingspannung,sehrstarkaktiviert,sodassbeidenfolgendenAcylie‐

rungendesracemischenAminsrac‐4aufeineVermeidungderchemischenAcylierunggeachtetwurde.

4.3.10.3 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)

ZunächstwurdedieMöglichkeiteinerparallelzuderenzymatischenablaufendechemischeAcylierung

des Amins rac‐4 mit dem Lacton 3 untersucht. Dazu wurden die beiden Komponenten bei unter‐

schiedlichenTemperaturenfür4.5StundeninAbwesenheitderLipasegerührt.DieErgebnissesindin

Abbildung117graphischdargestellt.Sokannbei80°CnocheinUmsatzzumAmid157von10%erzielt

werden.MitsinkenderTemperaturnimmtauchderUmsatzab,bisbei0°CkeinAmid157mehr im

1H‐NMR‐Spektrumdetektiertwerdenkann.


120

+0 ‐ 80 °C, 4.5 h

rac‐4 3,1 Äq. rac‐157

O

ONH2OH

O

4HN

Abbildung117. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3).

DieenzymatischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonorwurde imAnschlussbei

unterschiedlichen Temperaturen und Reaktionszeiten untersucht (Abbildung 118). Mit sinkender

TemperaturnimmtderUmsatzbei4.5StundenReaktionsdauerab.Sowirdbei80°CeinUmsatzvon

49%erzielt,währendbei20°Cnoch26%UmsatzzumAmid157erhaltenwird.Zusätzlichwurdeder

Effekt der Verlängerung der Reaktionsdauer bei 60 °C untersucht. Dabei wurde mit andauernder

ReaktionszeiteineleichteSteigerungdesUmsatzesvon41%bei4.5Stundenauf45%beiachtStunden

beobachtet. Die ee‐Werte aller Acylierungsreaktionen zum Amid rac‐157 betrugen hierbei 0%. Des

WeiterenkönnenbeieinemenzymatischenAnsatzbiszu10%desentstandenenAmids157bei80°C

Reaktionstemperaturundbiszu4%bei60°CparallelaufchemischemWegemit0%eegebildetwerden.

Diesesbedeutet,dassdieLipasedasLacton3nichtspezifischumsetzenkannundeineRacematspaltung

desAminsrac‐4durchdasLacton3demnachnichtmöglichist.DieDarstellungdesAmidsrac‐157sollte

hierbeijedochmitvollständigemUmsatzablaufen,dadiefürdieRacematspaltungtypischeGrenzevon

maximal50%UmsatzimFalldesLactons3alsAcyldonornichtrelevantist.DasLacton3eignetsich

allerdings sehr gut zur Synthese von Amiden. Diese Art der Acylierung kann eventuell als Starter‐

ReaktionfürdiePolymerisationdesLactons3zuPolycaprolacton(PCL)dienen.[271]

0102030405060708090100

80 60 40 20 0

104 2 1 0

Umsatz[%

]

Temperatur[°C]

Umsatz[%]


121

+T, t

rac‐4 3,1 Äq. rac‐157

O

O CAL‐B(40 mg/mmol)

NH2OH

O

4HN

Abbildung118. TemperaturabhängigkeitderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton3.

ImAnschlusswurdedieReaktionskinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton

(3)untersucht.DafürwurdendieAcylierungenunterStandard‐Reaktionsbedingungendurchgeführt.

DieErgebnissesindinAbbildung119graphischdargestellt.Es istzuerkennen,dassdieReaktionzu

Beginnmit einer relativ niedrigen Geschwindigkeit startet, da nach zwei Stunden erst 20%Umsatz

erreichtwordensind.DanachverläuftdieAcylierungnahezulinear,bisnach24Stunden65%Umsatz

zumAmid157erhaltenwerden.Dieee‐WertedieserAcylierungsreaktionenbetrageninallenFällen0%,

was in Analogie zu den Ergebnissen in den Abschnitten 4.3.10.3 steht. Da die Reaktion nur zum

racemischenProdukt157führt,solltehierbeimitlängererReaktionsdauerallerdingseinvollständiger

Umsatzerzieltwerden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

80°C,4.5h,MTBE

60°C,4.5h 60°C,6h 60°C,8h 40°C,4.5h 20°C,4.5h,MTBE

4941 43 45

25 26

0 0 0 0 0 0Umsatz[%

]/eerac‐157[%]


Umsatz[%] ee[%]eerac‐157


122

Abbildung119. ReaktionskinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitdemLacton3.

Zwar gelingt mit ɛ–Caprolacton (3) als Acyldonor keine Racematspaltung des Amins rac‐4, jedoch

beschleunigtdieAnwesenheitderCAL‐BdieAcylierungsreaktionbei60°Cund4.5StundenReaktions‐

dauerumdaszehnfache.SowerdenohneCAL‐B4%UmsatzzumRacemat157erhalten(vgl.Abbildung

118), während in Anwesenheit des Biokatalysators 41% Umsatz erzielt werden können. Da keine

Nebenprodukte gebildet werden, erfolgt die Aufreinigung durch Abtrennen der nicht‐umgesetzten

Edukte.DieSynthesevonracemischenAmidenkannsomitmittelsEnzymkatalysebereitsbeiniedrigen

TemperaturenohneweitereZugabevonZusätzenerfolgen.WirdbeispielsweiseeineCarbonsäureals

Acyldonoreingesetzt,soistdieZugabevonDicyclohexylcarbodiimid(DCC)alsKondensationsprodukt

beihohenTemperaturennotwendig(Abbildung120).BeiderVerwendungvonEsternalsAcyldonoren

ist,wieimAbschnitt7.2.2.1beschrieben,dasErhitzenzumRückflusserforderlich.

Abbildung120. ChemischeAmidbildungmitDCC.

Die Bildung eines Amids mit ɛ–Caprolacton (3) als Acyldonor mittels Lipasen‐Katalyse kann als

Initiationsreaktion für die Polymerisation zum Polycaprolacton (PCL) dienen, was in der Literatur

bereits mit anderen Lipasen beschrieben wurde. Im Anschluss an den Kettenstart findet dann das

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 25

Umsatz[%

]/eerac‐157[%]

Reaktionszeit[h]

Umsatz[%] ee[%]eerac‐157


123

KettenwachstumdurchringöffnendePolymerisationstatt,wasebenfallsdurchdieLipasekatalysiert

werdenkann.[271]

4.3.10.4 EnzymatischeAcylierungvonsekundärenAminenmitɛ‐Caprolacton(3)

Im Anschluss an die chemische Darstellung der Amide 154 bzw. 155 wurden die entsprechenden

sekundären Amine 149 und 150 enzymatisch unter Standard‐Reaktionsbedingungen umgesetzt

(Tabelle22). SokonntemitbeidenAminennur9%Umsatzzuden jeweiligenAmiden154und155

erzieltwerden.DieAcylierungsreaktionendersekundärenAmine149und150liefernunterlösungs‐

mittelfreienBedingungensomitungenügendeUmsätzevon7bzw.9%.DurchZugabevonMTBEzudem

Reaktionsgemisch(Eintrag3)zurbesserenDurchmischungderKomponentenkonnteeineSteigerung

desUmsatzesauf18%erreichtwerden.DieenzymatischeAcylierungderin2‐Positionsubstituierter

sekundärerAminegelingtdemnachnicht.

Tabelle22. EnzymatischeAcylierungdersekundärenAmine149und150mitɛ‐Caprolacton(3).

Eintrag Amin MTBE[mL] Umsatz[%]

1 149 ‐ 7

2 150 ‐ 9

3 150 0.1 18

5 Zusammenfassung

125

5 Zusammenfassung

ZielderArbeitwares,effizienteundnachhaltigeSyntheseroutenvonɛ–Caprolacton(3)undchiralen

Aminenzuetablieren.InnerhalbdieserArbeitkonntezumeinendieenzymatischeDoppeloxidationvon

Cyclohexanol(1)zumLacton3unterVerwendungderCHMOausAcinetobactercalcoaceticussowiedie

Lk‐ADHausLactobacilluskefirerfolgreichdurchgeführtwerden.DieSynthesewurdeinBezugaufihre

Effizienz optimiert. Zum anderen stand besonders die enzymatische Racematspaltung von chiralen

AminendurchdieVerwendungvonLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)ineinemlösungsmittel‐

freienSystemimFokusderUntersuchungen.

5.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)mittels

CHMO

DiezweistufigebiokatalytischeOxidationvonCyclohexanol(1)zuε–Caprolacton(3)mittelsADHaus

LactobacilluskefirsowieeinerCyclohexanon‐MonooxygenaseausAcinetobactercalcoaceticusüberdas

insitu‐gebildeteCyclohexanon(2)alsZwischenstufewurdeeingehenduntersucht.

EinleitendwurdenzweiMethodenzurzuverlässigenUmsatzbestimmungetabliert,dieVerwendungvon

Urotropin(51)alsexternerStandardfür1H‐NMR‐SpektroskopiesowiedieAnalytikmittelserstellter

EichgeradedurchGaschromatographie.BeimVergleichderbeidenMethodenhatsichgezeigt,dassdie

GC‐MethodehöhereUmsätzeundgeringereSchwankungsbreitenliefert,dadieseMethodebesonders

bei geringen Konzentrationen sensibler reagiert und der Schritt des Entfernens des Lösungsmittels

entfällt.AusdiesemGründenwardieAnalytikmittelsGCdieMethodederWahl.

AnschließendwurdendieRückgewinnungsratendereinzelnenSubstanzenbestimmt.Diesesindsowohl

von der eingesetzten Enzymmenge als auch von der Zentrifugierzeit während der Aufarbeitung

abhängig.Bei steigenderKonzentrationdesSubstratsCyclohexanol (1)wurdeeinAnstiegderRück‐

gewinnungsratevon71–80%auf90–97%beobachtet.ZusätzlichkonntediezuvorimArbeitskreis

verwendete Extraktionsmethodemittels EPPENDORF‐Gefäßen optimiert und dadurch der Verlust der

Substanzenverringertwerden.

ZunächstwurdediespezifischeAktivitätderhierverwendetenCHMObezüglichCyclohexanon(2)als

SubstratbestimmtundmitweiterenBVMOs,ECSMo‐03undECSMo‐05vonENZYMICALSAG,verglichen.

Dazuwurden zum einen die volumetrischen Aktivitätenmittels Photometertest bestimmt und zum

anderen BRADFORD‐Tests durchgeführt, um den jeweiligen Proteingehalt der Enzyme zu ermitteln.

Dadurch konnten die spezifischen Aktivitäten der drei Monooxygenasen berechnet werden. Die

spezifischeAktivitätderCHMOwurdegleich100%relativeAktivitätgesetzt.DiebeidenBVMOsECS

Mo‐03 und ECS Mo‐05 wiesen spezifische Aktivitäten von 0.2 U/mg bzw. 0.05 U/mg auf. Dieses

5 Zusammenfassung

126

entsprichtrelativenAktivitätenvon7%bzw.2%.FolglichsinddiebeidenMonooxygenasennichtfähig,

Cyclohexanon(2)effektivzuoxidieren.

DesWeiterenwurdedieAktivitätderEnzymegegenüberdenReferenz‐Substanzensowiegegenüber

weiterenSubstratenphotometrischbestimmt.DieCHMOwiesbezüglichCyclohexanon(2)eineAktivität

von0.082U/mL,wasgleich100%relativerAktivitätgesetztwurde.GegenüberdemSubstratIsophoron

(52)besitztdieCHMOeinerelativeAktivitätvonnur3%.SokonntebeiderbiokatalytischenOxidation

von Isophoron(52) mit dem D‐Glucose (48‐a)/GDH‐Regenerationssystem kein Umsatz festgestellt

werden. Unter den in dieser Arbeit gewählten Reaktionsbedingungen ist diese Aktivität nicht aus‐

reichendfüreineökonomischsinnvolleOxidation.

DieAktivitätderLk‐ADHwurdegegenüberdemStandard‐Substrat1‐Phenylethanol(47)bestimmtund

gleich 100% relative Aktivität gesetzt. Im Vergleich dazu wurde gegenüber Cyclohexanol (1) und

3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)einerelativeAktivitätvon153%bzw.0%bestimmt.Währendsich

Cyclohexanol(1)demnachhervorragendalsSubstratfürdieOxidationdurchdieLk‐ADHeignet,liefert

die enzymatischeDoppeloxidationdesdreifachmethyliertenAlkohols53 unter den Standard‐Reak‐

tionsbedingungenkeinLacton56oder57.

ImAnschlusswurdedieStandard‐Reaktion inHinblickaufProduktinhibierungderCHMOoptimiert,

indemunterschiedlicheorganischeLösungsmittelineinemZweiphasensystemgetestetwurden.Dabei

zeigtesicheinGemischausKPi‐Pufferund10%Isooctan(v/v)alsbestesLösungsmittel.Dieseslieferte

einensehrgutenUmsatzvon87%(Abbildung121).AllgemeinkönnenmitLösungsmittelnmithöheren

logP‐WertenauchhöhereUmsätzeerzieltwerden.

Abbildung121. EnzymatischeDoppeloxidationvonCyclohexanol(1)mit10%(v/v)Isooctan.

AußerdemwurdensowohlderEinflussderMengenderLk‐ADHunddesCofaktorssowiederReaktions‐

temperatur untersucht. Bei der Erhöhungder Cofaktormenge von 1 auf 10mol‐% sinkt derUmsatz

dabei um einDrittel. Einen noch stärkeren negativen Einfluss haben die Verringerung der Lk‐ADH‐

Mengevon40auf13UsowiedieErhöhungderReaktionstemperaturvonRTauf30°C.

Eskonntenachgewiesenwerden,dassselbstbei sehrhohenProduktkonzentrationenvon1Mkeine

ProduktinhibierungderLk‐ADHauftritt.AllerdingswurdemittelsTitrino‐Apparaturdiehydrolytische

SpaltungdesLactons3zurentsprechendenSäure54beobachtet.

Dieinsitu‐ProduktentfernungmittelsAdsorberharzengelangmitdenfürdieseArbeitgewähltenHarzen

nicht.AuchdieRückgewinnungsratederSubstanzenausdenHarzendurchextraktiveAufarbeitungist

5 Zusammenfassung

127

mitmaximal74%nurmäßig.EventuellkanndurcheinScreeningweitererHarzeeinfürdiesesSystem

effizienteresgefundenwerden.

5.2 EnzymatischeRacematspaltungchiralerAmine

Als einleitende Versuche zur Racematspaltung wurden enzymatische Acylierungsreaktionen substi‐

tuierter Benzylamine mit Malonsäurediethylester (9) als Standard‐Acyldonor in Abwesenheit von

organischen Lösungsmitteln durchgeführt (bildung 122). Als Biokatalysator fand die immobilisierte

Lipase B aus Candida antarctica (CAL‐B, Handelsname: Novozym 435) Anwendung, die sich in der

Literatur als hochselektives Enzym erwiesen hat.[27–29] Die zuvor in der Literatur[33–35] verwendeten

Benchmark‐Bedingungen konnten dabei optimiert werden. So wurde die Reaktionstemperatur von

80°Cauf60°Cbei4.5StundenReaktionszeitinlösungsmittelfreierUmgebunggesenkt,ohneVerluste

beimUmsatzzubeobachten(Abbildung122).

NH2CAL‐B

NH

O

O

O

R R

134 (R=H)138 (R=OH)139 (R=OMe)140 (R=Br)

9,1Äq.

NH

O

NH

OR R+

80°C4.5h

133 (R=H)141 (R=OH)143 (R=OMe)145 (R=Br)

137 (R=H)142 (R=OH)144 (R=OMe)146 (R=Br)

Abbildung122. EnzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine.

Diese Reaktionsbedingungen wurden als Standard‐Reaktionsbedingungen definiert. Es zeigte sich

zudem,dassdieAnwesenheiteineselektronenziehendenSubstituenteninmeta‐Positioneinenleichten

positivenEinflussaufdenUmsatzhat.AllerdingskonnteeineparallelablaufendechemischeAcylierung

zumentsprechendenAmidmitbiszu8%nachgewiesenwerden.DieBildungderDiamide,bestehend

0102030405060708090100

134 138 139 140

91

38

95 95

917

5 5

35

84 81

Umsatz[%

]/Ausbeute[%]

Amin

UmsatzAmid[%] UmsatzDiamid[%] AusbeuteAmid[%]

5 Zusammenfassung

128

ausMalonsäurediethylester(9)undzweiÄquivalentensubstituiertenBenzylamins,wurde innahezu

allenFällennachgewiesen.DurchEinsatzeinesleichtenÜberschusses(1.2Äquivalente)anMalonester

9konntedieBildungausgehendvonMethoxy‐Amin139nahezuunterdrücktwerden.Dabeiistaller‐

dings ein leichter Abfall des Umsatzes von 91% auf 82% zu beobachten. Bei der Verwendung des

Hydroxy‐substituiertenBenzylamins134warjedochaufgrunddeshohenSchmelzpunktesderEinsatz

vonLösungsmittelnnotwendig,umdieHomogenitätderMischungzugewährleisten.Vondenunter‐

suchtenunterschiedlichenLösungsmittelnliefertenTHF(75%Umsatzbei80°CReaktionstemperatur)

und2‐Methyl‐THF(70%Umsatzbei80°C)diebestenErgebnisse.

DieenzymatischeRacematspaltungvonracemischenAminenunter lösungsmittelfreienBedingungen

konnteanschließendanhanddesSystemsaus1‐Phenylethylamin(rac‐4)undMalonsäurediethylester

(9) zum enantiomerenreinen Amid rac‐10 untersucht werden (Abbildung 123). Dabei wurde der

EinflussvonTemperaturundReaktionsdauersowiederEnzymbeladunguntersuchtunddieReaktions‐

kinetik unter den optimierten Bedingungen dokumentiert. Das Amid rac‐10 konnte dabeimit 42%

Umsatzundmit97%Enantiomerenreinheiterhaltenwerden,waseinerexzellentenEnantioselektivität

von>100entspricht.EineVerlängerungderReaktionszeitauf24Stundenbei60°CReaktionstempe‐

ratur führte zu einemvollständigenUmsatz zumAmid (R)‐10mit 98%ee. Eine parallel ablaufende

chemischeAcylierungwurdebeirac‐4mitdemMalonester9alsAcyldonornichtbeobachtet.

Abbildung123. EnzymatischeRacematspaltung(Benchmark‐Reaktion).

EinVergleichdiesesVerfahrensmitbestehendenindustriellenProzessen[30,264]zeigte,dassdieRacemat‐

spaltung des chiralen Amins rac‐4 unter den in dieser Arbeit gewählten lösungsmittelfreien Bedin‐

gungenEnantioselektivitätendergleichenGrößenordnungliefert.WährenddasinderLiteratur[30]ver‐

wendeteMethoxyessigester11152%Umsatzund95%ee(E>100)lieferte,gelangdieRacematspal‐

tungunterdengleichen inder IndustrieverwendetenBedingungenmitMalonester9 alsDonordas

Amid (R)‐10 mit 48% Umsatz und ebenfalls 95% ee (E>100). Die Racematspaltung unter den im

Rahmen dieser Arbeit gewählten Bedingungen lieferte eine Enantioselektivität von >100. Die

verwendete größere Enzymmenge und höhere Temperatur wird folglich durch Vermeidung von

Lösungsmittel und viel kürzererReaktionszeit ausgeglichen.Der in dieserArbeit etablierte lösungs‐

mittelfreieProzessstelltsomiteinesehrguteAlternativezubestehendenVerfahrendar.

Bei den anschließend durchgeführten Recyclingversuchen der Racematspaltung von rac‐4 mit

Malonester9durchdie immobilisiertenCAL‐B (Novozym435)konnteeindeutlicherAbfalldesUm‐

satzesimVerlaufderRecyclingschrittebeobachtetwerden(Abbildung124).NachdemzweitenRecyc‐

lingschritt wurden nur noch 30% und im dritten bis fünften Durchgang nur 20‐24% Umsatz zum

5 Zusammenfassung

129

entsprechenden Amid (R)‐10 gefunden. Die ee‐Werte der einzelnen Durchgänge blieben allerdings

konstant hoch. Dieses Verhalten ist auf die Instabilität des Biokatalysators in lösungsmittelfreier

UmgebungzurückzuführenundstehtinAnalogiezurLiteratur.[36]

Abbildung124. Enzymrecycling.

In einembreitenEnzym‐Screening aus23Lipasenkonnte sowohldie CAL‐BausCandidaantarctica

(Novozym435) als auch zwei Formender CAL‐Bder Firma C‐LECTA, in immobilisierter und lyophi‐

lisierterForm,alsdieeffektivstenLipasenbeiderAcylierungderBenzylamine134und138sowieder

Racematspaltungvonrac‐4nachgewiesenwerden.BeiTitrationsuntersuchungenwiesendieLipasen

vonC‐LECTA68%bzw.1000%relativeAktivitätinBezugaufNovozym435auf.BeipräparativenVer‐

suchenjedochzeigtenurdieimmobilisierteLipasevonC‐LECTAsehrguteErgebnisse(52%Umsatz,96%

ee).Die lyophilisierteCAL‐B lieferteunteroptimiertenBedingungen(5facheEnzymmenge)nur26%

Umsatz.DieimmobilisierteCAL‐BvonC‐LECTAstelltsomiteinweiteresWerkzeugzurenzymatischen

RacematspaltungvonAminendar.

DieUntersuchungzurVerwendungalternativerAcyldonorenerfolgteinHinblickaufeineVerbesserung

derRacematspaltungmitderimmobilisiertenCAL‐B(Novozym435).DieunterStandard‐Bedingungen

enzymatisch dargestellten Amide wiesen sehr unterschiedliche Enantiomerenüberschüsse auf. So

konntenurmitdemliteraturbekannten[229]Methoxyessigester11192%eeerzieltwerden.Racemat‐

spaltungenmitweiterengetestetenAcyldonorenführtenzuee‐Wertevon10–65%,sodassdieseunter

dengewähltenStandard‐BedingungeneineeffizienteRacematspaltungnicht stattfindet.Beiden teil‐

weisesehrreaktivenAcyldonorenkonnteeineparallelablaufendechemischeAcylierungnachgewiesen

werden.SowurdemitVinylessigester125inAbwesenheitderLipasebereitsbei40°C81%Umsatzzum

entsprechendenracemischenAmiderzielt.DurchdieseHintergrundreaktionenwerdendieee‐Werte

derRacematspaltungenverringert.DasbereitsinderArbeitsgruppeetablierte[33,34]undindieserArbeit

alsStandard‐AcyldonorverwendeteMalonsäurediethylester(9)stelltesichauchinlösungsmittelfreier

UmgebungalsdereffektivsteDonordar.

ZumdirektenVergleichderAcyldonorenuntereinanderwurdenReaktionskinetikenderenzymatischen

Acylierungvonrac‐4unterlösungsmittelfreienStandard‐Bedingungenaufgenommen(Abbildung125).

0102030405060708090100

1 2 3 4 5

43

3025

20 24

92 89 87 90 94

Umsatz[%

]/ee[%]

Zyklus


5 Zusammenfassung

130

Phenoxyessigester122zeigtzwareinenschnellenReaktionsverlauf, jedochwerdennach24Stunden

68%Umsatzerhalten.Diesesübersteigtden theoretischenUmsatzeinerRacematspaltungvon50%.

Methoxyessigester111weistzuBeginnderReaktioneinehoheReaktionsrateauf,allerdingsstagniert

diese bereits nach etwa 0.5 Stunden. Die Acyldonoren 9 und 124 zeigen zunächst ein ähnliches

Verhalten,allerdingswirdnurmitMalonsäurediethylester(9)einvollständigerUmsatzmitsehrguten

EnatiomerenüberschüssenundE‐Wertenvon>100erreicht.FürRacematspaltungeninlösungsmittel‐

freienSystemenistMalonsäurediethylester(9)folglichderAcyldonorderWahl.

RO

O R'+

NH2HN R'

O

rac‐4

CAL‐B(40 mg/mmol)



60 °C, 4.5 h

Abbildung125. VergleichderAcyldonorennach4.5StundenReaktionszeit.

ZurUntersuchungdesSubstratspektrumswurden1‐Aminoindan(rac‐130)undsekundäreAminemit

Malonsäurediethylester(9)enzymatischumgesetzt.DieRacematspaltungvon1‐Aminoindan(rac‐130)

führte unter lösungsmittelfreien Bedingungen zu 49% Umsatz und 79% ee. Eine Verlängerung der

Reaktionszeit lieferte das Amid (R)‐129 bei Temperaturen von 80 °C bzw. 60 °C nahezu enantio‐

merenrein.DurchEinsatzvon1.5ÄquivalentendesMalonesters9konnten91%eeerhaltenwerden,

waseinemgutenE‐Wertvon61entspricht.DieenzymatischeAcylierungdersekundärenAminegelang

nurmitAmin150,wobeiunterStandard‐BedingungeneinUmsatzvon15%mitnur18%eeerzielt

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

43

5748

22

96

68

10

92107

16

1

31

Umsatz[%

]/ee[%]/

E‐Wert

Amid


(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

5 Zusammenfassung

131

werden konnte. Unter den gewählten Bedingungen konnte eine effiziente Racematspaltung nicht

erreichtwerden.

AlsweitererAcyldonor sollte das zuvor enzymatisch synthetisierte ɛ–Caprolacton (3) dienen.Dabei

konnte inallenFällennurgeringeUmsätzeundauchnur racemischeGemischedesentsprechenden

Amidserhaltenwerden.Somit istdasLacton3keingeeigneterAcyldonor.Allerdingskanndieenzy‐

matische Amidbildung als Startreaktion für die Polymerisation zum Polycaprolacton (PCL) genutzt

werden.

Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die lösungsmittelfreie Racematspaltung vergleichbar ist mit

Reaktionen in organischenMedien.DerUnterschied zwischen lösungsmittelfreienAcylierungen und

ReaktioneninLösungsmittelnliegeninderbenötigtenZeit,um50%Umsatzzuerreichen,sowieinder

benötigtenEnzymmenge.BesondersmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorundderLipaseBaus

Candidaantarctica(CAL‐B,Novozym435)konntenbeiderRacematspaltungchiralerAminewierac‐4

undrac‐130inAbwesenheitvonorganischenLösungsmittelnsehrguteErgebnissebei60°CReaktions‐

temperaturinnur4.5Stundenbzw.24StundenReaktionszeitimFallvonrac‐130erzieltwerden.

6 Summary

132

6 Summary

Theaimofthisworkwastoestablishefficientandsustainablesynthesisroutesofɛ‐caprolactone(3)

andchiralamines.Inthisthesistheenzymaticdoubleoxidationofcyclohexanol(1)tolactone3byusage

of CHMO from Acinetobacter calcoaceticus as well as Lk‐ADH from Lactobacillus kefir has been

successfully carried out. The synthesis was optimized in regard of its efficiency. In particular the

enzymaticresolutionofchiralaminesbyusageoflipaseBfromCandidaantarctica(CAL‐B)inasolvent‐

freesystemwasinthefocusofresearch.

6.1 Enzymaticoxidationofcyclohexanol(1)bymeansof

CHMO

Thetwo‐stepbiocatalyticoxidationofcyclohexanol(1)toɛ–caprolactone(3)performedbymeansof

ADHfromLactobacilluskefirandcyclohexanone‐monooxygenasefromAcinetobactercalcoaceticusvia

theintermediatestateoftheinsitu‐formedcyclohexanone(2)hasbeenexaminedindetail.

For a reliable determination of the conversion two methods have been developed first, the use of

urotropine(51)asanexternalstandardfor1H‐NMRspectroscopyandamethodofanalysisbyuseofa

createdstandardcurveviagaschromatography.Ithastobetakenintoaccountwhencomparingboth

methodsthattheGCmethodprovideshigherconversionsandlowerrangeoffluctuationbecausethis

method issensitiveathigherconcentrationsand themeasureof removingthesolvent iseliminated.

ThereforeanalysisviaGCisthemethodofchoice.

Afterwardstherecoveryratesoftheindividualsubstanceshadtobedeterminedwhicharedependent

ontheusedamountofenzymeaswellasthetimeofcentrifugationduringthework‐upprocedure.At

growingconcentrationofthesubstratecyclohexanol(1)anincreasedrecoveryratefrom71–80%to

90–97%isobserved. InadditionthebeforehandusedmethodofextractionviaEPPENDORFvialshas

beenimprovedandthusreductionofthelossfactorofthesubstanceswasachieved.

ThespecificactivityofthehereinusedCHMOwithregardtocyclohexanone(2)assubstratehasbeen

determinedandcomparedwithotherBVMOs,ECSMo‐03andECSMo‐05fromENZYMICALSAG.Therefore

firstlythevolumetricactivityhasbeendeterminedviaphotometertestsandsecondlyaBRADFORDtest

hasbeenperformedtoidentifytheproteincontentoftheenzymes.Inthiswaythespecificactivityof

thesemonooxygenasescouldbecalculated.ThespecificactivityoftheCHMOisrepresentedas100%.

TheothertwoBVMOs,ECSMo‐03andECSMo‐05,showed0.2U/mgand0.05U/mgspecificactivity,

whichcorrespondsto7%and2%relativeactivity,respectively.Thusbothothermonooxygenasesare

notcapableofoxidizingcyclohexanone(2)effectively.

6 Summary

133

Inadditiontheactivityoftheenzymeshavebeenassayedphotometricallywithregardtothebenchmark

substanceaswellasfurthersubstrates.TheCHMOshowedanactivityof0.082U/mLregardingcyclo‐

hexanone(2),whichisrepresentedas100%.Towardsthesubstrateisophorone(52)theCHMOshowed

anactivityofjust3%.Sonoconversioncouldbedetectedbythebiocatalyticoxidationofisophorone

(52) with the D‐glucose (48‐a)/GDH‐regeneration system. Under the terms used in this work this

activityisnotsufficientforaneconomicallyreasonableoxidation.

The activity of the Lk‐ADHhas been determinedwith regardof thebenchmark substrate 1‐phenyl‐

ethylethanol(47)andrepresentedas100%relativeactivity.Comparedtothistherelativeactivitywith

regard to cyclohexanol (1) and 3,3,5‐trimethylcyclohexanol (53) has been set at 153% and 0%,

respectively.Cyclohexanol(1)isanextremelywell‐suitedsubstrateforoxidationbyLk‐ADH.However,

theenzymaticdoubleoxidationofthethreefoldmethylatedalcohol53providesnolactone56or57

underthebenchmarkreactionconditions.

Thisresultsarefollowedbytheoptimizationofthebenchmarkreactioninviewofproductinhibitionof

theCHMObytestingdifferentorganicsolventsinatwo‐phasesystem.Itwasfoundthatthebestsolvent

isamixtureofKPi‐bufferand10%isooctane(v/v),whichledtoaconversionof87%(Scheme1).With

organicsolventswithhigherlogP‐values,ingeneral,higherconversionscanbeachieved.Besidesboth

the influenceof the amountof theLk‐ADHandof the cofactor aswell as the temperaturehasbeen

investigated.The conversionhas fallenbyone thirdby increasing theamountof cofactor from1 to

10mol‐%.ThereductionoftheamountofLk‐ADHfrom40to13Uandtheriseofthetemperaturefrom

RTto30°Chadanevenstrongernegativeimpact.

Scheme1. Enzymaticdoubleoxidationofcyclohexanol(1)with10%(v/v)isooctane.

Itwasdemonstratedthatevenwithveryhighproductconcentrationof1Mnoproductinhibitionofthe

Lk‐ADH appeared.However, by use of theTitrino titration apparatus the hydrolytic cleavage of the

lactone3tothecorrespondingacid53couldbeobserved.

Theinsitu‐productremovalviaadsorberresinsdidnotsucceedunderthechosenconditions.Alsothe

recovery rates fromthe resinsbymeansof extractive recycling ismodestwithamaximumof74%.

Eventuallyamoreefficientsystemcanbefoundbyscreeningoffurtherresins.

6 Summary

134

6.2 Enzymaticresolutionofchiralamines

As initiating tests for the resolution of amines, enzymatic acylation reactions of substituted

benzylamineswithdiethylmalonate (9) as standardacyl donorhavebeenperformed in absence of

organicsolvents(Scheme2).The immobilized lipaseB fromCandidaAntarctica (CAL‐B, tradename:

Novozym435)isusedasbiocatalyst,whichhasprovedtobeahighlyselectiveenzyme.[27–29]Theformer

usedbenchmarkconditions[33–35]couldbeoptimized.Thereactiontemperaturecouldbereducedfrom

80°Cto60°Cat4.5hoursofreactiontimeinasolvent‐freeenvironmentwithoutanylossofconversion.

Theseconditionsweredefinedasstandardreactionconditions(Scheme2).

NH2CAL‐B N

H

O

O

O

R R

134 (R=H)138 (R=OH)139 (R=OMe)140 (R=Br)

9,1eq.

NH

O

NH

OR R+

80°C4.5h

133 (R=H)141 (R=OH)143 (R=OMe)145 (R=Br)

137 (R=H)142 (R=OH)144 (R=OMe)146 (R=Br)

Scheme2. Enzymaticacylationofsubstitutedbenzylamines.

It has been shown furthermore, that there is a positive effect on the conversion by the presence of

electron withdrawing substituents inmeta position. However, parallel chemical acylation reactions

towards the accordingly amide up to 8% has been proven. By using the hydroxy‐substituted

benzylamine134theusageofsolventsisnecessarytoensurehomogeneityofthemixtureduetothe

highmeltingpointof theamine.Of thesolvents investigatedTHF(75%conversionat80°Creaction

temperature) and 2‐methyl‐THF (70% at 80 °C) showed the best results. The formation of diamids

consistingofdiethylmalonate(9)andtwoequivalentsofsubstitutedbenzylaminecouldbeprovenin

nearlyallcases.Byusageofaslightexcessofmalonate9theformationofthediamidecouldbealmost

suppressed.However,aslightdecreaseoftheconversionfrom91%to82%hasbeendetected.

0102030405060708090100

134 138 139 140

91

38

95 95

917

5 5

35

84 81

conversion[%

]/yield[%

]

amine

conversionamide conversiondiamide yieldamide

6 Summary

135

Theenzymaticresolutionofracemicaminesinasolvent‐freeenvironmentwasinvestigatedbymeans

ofthesystemof1‐phenylethylamine(rac‐4)anddiethylmalonate(9)towardsamiderac‐10(Scheme

3).Therebytheinfluenceoftemperatureundreactiontimeaswellasenzymeloadingwasexaminedand

thereactionkineticsatoptimizedconditionsweredocumented.Theamiderac‐10wasobtainedwith

42%conversionand97%enantiomericpurity,meaninganexcellentenantioselectivityof>100.Exten‐

sionofthereactiontimeto24hoursat60°Cgavecompleteconversionwith98%ee.Aparallelchemical

acylationreactionofrac‐4andmalonate9asacyldonorhasnotbeendetected.

O

O

O

O+

(R)‐10rac‐4 9

NH2HN

O

O

O

CAL‐B

T,tsolvent‐free

1.0eq.

40mg/mmol

42%conversion97%ee

60°C,4.5h

Scheme3. Enzymaticresolution(benchmark‐reaction).

Acomparisonofthisprocedurewithexistingindustrialprocesses[30,264]showed,thattheresolutionof

thechiralaminerac‐4undersolvent‐freeconditionschosenforthisworkprovidesvaluesofenantio‐

selectivity in the same range of magnitude. Methoxy acetate 111 used in literature[30] led to 52%

conversionand95%ee(E>100)whereastheresolutionwithmalonate9asdonorsucceededwith48%

conversionandalso95%ee(E>100)underthesameconditions.Theresolutionunderconditionsused

in this thesis led to enantioselectivity of >100. The used increased amount of enzyme and higher

temperaturearebeingcompensatedbyavoidanceoforganicsolventsandshorterreactiontimes.The

techniqueestablishedhereconstitutesaverygoodalternativetoexistingindustrialprocesses.

Enzymerecyclingexperimentsbymeansof resolutionofrac‐4withmalonate9 by the immobilized

CAL‐Bshowedasignificantdropofconversionduringtherecyclingsteps(Scheme4).

Scheme4. Enzymerecycling.

0102030405060708090100

1 2 3 4 5

43

3025

20 24

92 89 87 90 94

conversion[%

]/ee(R)‐10[%]

cycle

Umsatz[%] ee[%]conversion ee(R)‐10

6 Summary

136

After the second recycling step, only 30% conversion and in the following recycling steps, merely

20‐ 24% conversion towards the amide (R)‐10 could be detected. The ee‐values of the resolution

reactionsremainedconstantlyhighthough.Thisbehaviorisduetotheinstabilityofthebiocatalystina

solvent‐freeenviron‐mentandisanalogoustoliterature.[36]

Inabroadlipasescreeningfrom23lipasesCAL‐BfromCandidaantarctica(Novozym435)aswellas

two forms of CAL‐B, received from C‐LECTA in immobilized and lyophilized form, have been

demonstratedasthemosteffectivelipasesbytheacylationofbenzylamines130and132aswellasthe

resolutionofrac‐4.TitrationinvestigationsofthelipasesfromC‐LECTAshowed68%and1000%relative

activityregardingNovozym435,respectively.Inpreparativeexperimentsonlytheimmobilizedlipase

fromC‐LECTAoffered very good results (52%conversion, 96%ee).The lyophilizedCAL‐Bdelivered

merely26%conversionunderoptimizedconditions(fivefoldamountofenzyme).Thustheimmobilized

CAL‐BfromC‐LECTApresentsanimportanttoolforenzymaticresolutionofchiralamines.

Theexaminationoftheusageofalternativeacyldonorsoccurredwithregardtotheimprovementofthe

resolution by the immobilized CAL‐B. The amides, which were enzymatically synthesized under

standardconditions,presentedverydifferentenantiomericratios.Soonlywithmethoxyacetate111

knownfromliterature[229]92%eecouldbeachieved.Resolutionwiththeothertestedacyldonorsledto

ee‐valuesof10–65%.Thusthesedonorsdonotleadtoefficientresolutionundertheconditionschosen

inthisthesis.Incaseofveryreactiveacyldonors,parallelrunningchemicalacylationreactionswere

proven.Sowithvinylacetate125at40°Calready81%conversiontotherespectiveracemicamidewas

receivedinabsenceoflipase.Duetothisbackgroundreactiontheee‐valuesoftheenzymaticresolution

arebeingdecreased.Diethylmalonate(9),alreadyestablishedinthisworkinggroup[33–35]andusedas

standardacyldonor in this thesis, represented itselfas themosteffectiveacyldonor in solvent‐free

environmentalso.

Forthedirectcomparisonoftheacyldonorsamongthemselvesreactionkineticsoftheresolutionof

rac‐4undersolvent‐freeconditionsweremeasured(Scheme5).Phenoxyacetate118presentedafast

reaction process but after 24 hours 68% conversion were achieved, which surpasses the theoretic

conversion of a resolution of 50%.Methoxy acetate111 exhibited a very high reaction rate at the

beginningwhichstagnatedalreadyafter0.5hours.Theacyldonors9and124showedsimilarbehavior,

butjustdiethylmalonate(9)ledtocompleteconversionandveryhighenantiomericratio(E>100).For

resolutionreactionsinsolvent‐freesystemdiethylmalonate(9)istheacyldonorofchoice.

6 Summary

137

RO

O R'+

NH2HN R'

O

rac‐4

CAL‐B(40 mg/mmol)



60 °C, 4.5 h

Scheme5. Comparisonofacyldonorsafter4.5hreactiontime.

Fortheexaminationofthesubstratespectrum1‐aminoindane(rac‐130)andsecondaryamineswere

reactedwithmalonate9.Theresolutionofrac‐130ledto49%conversionand79%eeundersolvent‐

free conditions after 4.5 hours reactions time. By enhancing the reaction time to 24 hours nearly

enantiomericpureamide(R)‐129couldbeobtained.Theenantiomericpuritycouldalsobeincreased

to91%throughusageof1.5equivalentsofmalonate9,representingagoodenantioselectivityof61.The

enzymatic acylation of secondary amines partly succeeded with amine 150, whereby just 15%

conversionand18%eecouldbeachievedunderstandard‐conditions.Underthesechosenconditions

resolutionofsecondaryaminesfailed.

ɛ‐Caprolactone(3),previouslyenzymaticallysynthesized,shouldbeemployedaspossibleacyldonor.It

isnotsuitedasacyldonorduetolowconversionsandracemicmixturesoftherespectiveamidereceived

in all cases. However, the enzymatic formation of amide can be used as starting reaction for

polymerizationtopolycaprolactone(PCL).

Theresultsobtainedshowedthecomparabilityofthesolvent‐freeresolutionwithreactionsinorganic

media.Thedifferencesbetweensolvent‐freeacylationreactionsandreactionsinorganicsolventsresult

fromthetimeneededtoachieve50%conversionaswellfromtheamountofenzymeneeded.Especially

withdiethylmalonate(9)asacyldonorandlipaseBfromCandidaantarctica(CAL‐B,Novozym435)

resolutionofchiralamineslikerac‐4andrac‐130verygoodresultsat60°Creactiontemperaturein

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

43

5748

22

96

68

10

92107

16

1

31

conversion[%

]/ee[%]/

E‐value

amide


(R)‐10 (R)‐121 (R)‐123 (R)‐8

conversion E‐value

6 Summary

138

just4.5hoursreactiontimeand24hoursfortheaminerac‐130,respectively,havebeenachievedin

absenceoforganicsolvents.

7 ExperimentellerTeil

139


7.1 VerwendeteChemikalienundGeräte

AutomatischesTitrationssystem:

TitrationenwurdenaufeinemTitroLinealphaPlusderFirmaDIANALYTICSdurchgeführt.AlsTitrier‐

lösungdienteverdünnteNaOH‐Lösung(0.1M).DieSpektrenwerdenmitderTitriSoft2.73Softwarevon

SCHOTTINSTRUMENTSaufgenommenundbearbeitet.

Chemikalien:

DieverwendetenkäuflichenChemikalienwurden,wennnichtandersvermerkt,vonACROSORGANICS®,

ALFAAESAR®,FLUKA®,FLUOROCHEMLTD.UNIT.®,MERCK®,ROTH®,SIGMA‐ALDRICH®bezogenundohne

weitereReinigungeingesetzt.DasLösungsmittelMTBEwurdealsHochschulspendevonEVONIKDEGUSSA

GMBHzurVerfügunggestellt.AlleweiterenverwendetenLösungsmittelwurdenvonVWRCHEMICALS®,

FISHERCHEMICAL®,ROTH®undAPPLICHEM®bezogenundwarenfürReaktionenundAnalytikvonp.a.

Qualität.DeuterierteLösungsmittelstammenvonDEUTERO.

Dünnschichtchromatographie(DC):

Dünnschichtchromatogrammewerdenmit MERCK DC‐Folien, Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie (F245),

durchgeführt.DieDC‐FolienwerdennachdemEntwickelnmitIoddampfangefärbt.DieDetektionerfolgt

mittelsUV‐Licht.

DC‐MS‐Spektrometrie:

DC‐MS‐KopplungenwurdenamZQ2000(Normalphase;Eluens: iPrOH)miteinerESI‐Ionenquelleder

FirmaWATERS durchgeführt.DieDatenwurdenmitder SoftwareMestReNova (MESTRELABRESEARCH,

Version7.0.2‐8636)ausgewertet.

Elementaranalyse(EA):

ElementaranalysenwurdenaneinemEuroEAElementaranalysatordurchgeführt.

EnzymeundCofaktoren:

DieBAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen(BVMO)ECS‐MO01sowieECS‐MO03undECS‐MO05wurden

freundlicherweise von der ENZYMICALS AG zur Verfügung gestellt. Die Alkohol‐Dehydrogenase aus

Lactobacillus kefir (Lk‐ADH, DSM 20587) wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W.HUMMEL

(FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH) entwickelt und zur Verfügung gestellt. Die Cofaktoren NAD(P)H und

NAD(P)+wurdenvonORIENTALYEASTerworben.CandidaantarcticaLipaseB(CAL‐B)inimmobilisierter


140

Form(Novozym435)wurdevonSIGMAALDRICH®käuflicherworben.CAL‐BinlyophilisierterFormund

immobilisiertaufeinemMethacrylat‐TrägerwurdevonC‐LECTAGMBHzurVerfügunggestellt.

ESI‐MS:

ESI‐MassenspektrenwerdenmitdemEsquire3000derFirmaBRUKERDALTONIKmitIonenfalleundESI‐

Quelleaufgenommen.DieProbenwerdendirektmiteinerautomatischenSpritzeeingeführt.Stickstoff

dient als Zerstäuber‐ und Trockengas undwird durch den Stickstoffgenerator NGM 11 von BRUKER

generiert. Zur Kühlung der Ionenfalle dient Helium. Die Spektren werden mit der BRUKER Daltonik

esquireNT4.0esquireControlSoftware(V6.04)aufgenommenundmitderDataAnalysisSoftware2.0

bearbeitet.

Gaschromatographie(GC):

UmsatzbestimmungenerfolgtenaneinemGC‐2010vonSHIMADZUmiteinemAutoinjektorAOC‐20ivon

SHIMADZUundeinerRt‐βDEXm‐SäulevonRESTEK.AlsTrägergasdienteStickstoff(100kPa).DieSäule

weisteineLängevon30mundeinenInnendurchmesservon0.25mmauf.DieSpektrenwerdenmitder

Software GCsolution Analysis (Version 2.41.00) von SHIMADZU aufgenommen und mit der Software

GCsolutionPostrun(Version2.41.00)bearbeitet.

Methode:Startbei70°C,mit7.5°C/minauf110°C,mit25°C/minauf220°C.

HPLC:

DieChromatogrammewerdenmiteinemGerät,bestehendausfolgendenBausteinenderFirmaJASCO,

aufgenommen:PumpenPU‐2080Plus,automatischerRückdruckreglerBP‐2080Plus,Säulenthermostat

CO‐2060Plus,Multiwellenlängen‐DetektorMD‐2010PlusundAutosamplerAS‐2059Plus.DieTrennung

derProbenerfolgtemitSäulenvonDAICELChiralpak®(AD‐H).DieChromatogrammewurdenmitder

GalaxyChromatographyDataSystemSoftwareaufgenommenundausgewertet.

IR‐Spektroskopie:

IR‐spektroskopischeMessungenwurdenaneinemNicolet308FT‐IR‐SpektrometerderFirmaTHERMO

ELECTRON CORPORATION durchgeführt undmit der Software Omnic (Version 2.11) aufgenommen. Die

AbsorptionwirdinWellenzahl in[cm‐1]angegeben.

NMR‐Spektroskopie:

Die 1H‐ und 13C‐NMR‐Spektrenwurden an einemBRUKER DRX‐500 oder BRUKER Advance500NMR‐

SpektrometerbeiRaumtemperaturaufgenommen.DiechemischeVerschiebungδ[ppm]der 1H‐und

13C‐Spektren werden, sofern nicht anders angegeben, in Relation zur normierten chemischen Ver‐

schiebungdesverwendetenpartiellundeuteriertenLösungsmittelsangegeben(CDCl3δ=7.26ppm).

DieSpin‐Multiplizitätenwerdenalsbr(broad),s(Singulett),d(Dublett),dd(dupliziertesDublett), t

(Triplett), td(TripletteinesDubletts),q(Quartett),qui (Quintett)undm(Multiplett)angegeben.Die

erhaltenenDatenwurdenmit der SoftwareMestReNova (MestrelabResearch, Version 8.1.0‐11315)

ausgewertet.


141

UV/Vis‐Spektroskopie:

UV/Vis‐spektroskopischeMessungenwurden an einemV‐630 von JASCOundan einemUV‐2450der

FirmaSHIMADZUdurchgeführt.DieerhaltenenDatenwurdenmitderSoftwareSpectraManager(Version

2.008.04)ausgewertet.


142

7.2 Synthesen,MethodenundspektroskopischeDaten

7.2.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)unterEinsatzvonCHMOund

LK‐ADH

7.2.1.1 Standardreaktion:AllgemeineArbeitsvorschrift1(AAV1):Enzymatische

OxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3)

Abbildung126. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3).[26]

In einem 10 mL‐Rundkolben wird Rohextrakt der CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus (3.82U,

bezogenaufCyclohexanon(2))inKPi‐Puffer(pH7.0,50mM,5mL)aufgenommenundgutgeschüttelt.

Cyclohexanol(1,0.2mmol,20.0mg),MgCl2(1mM),undLk‐ADH(40U,Rohextrakt/Glycerin1:1(v/v),

bezogen auf Acetophenon) werden zugegeben. Das Gemisch wird für 20 min bei Raumtemperatur

gerührt.DurchZugabevonNADP+(1mol‐%,1.57mg)wirddieReaktiongestartetunddieMischungfür

einebestimmteZeitbeiRaumtemperaturgerührt.Anschließendwerdendie5mLzuje0.7mLaufsieben

1.5mL‐EPPENDORF‐Gefäße verteilt und jeweilsmit 0.7mL DCM versetzt. Durch 30min Schütteln im

Thermomixer wird das Zweiphasensystem extrahiert. Die Phasentrennung wird durch 30 min

Zentrifugieren bei 13000 rpm erreicht.Die überstehendewässrigePhasewird abgenommenund in

siebenneueEPPENDORF‐Gefäßegegeben.DieExtraktionmitanschließenderPhasentrennungwirdnoch

zweimalwiederholt.DieorganischenPhasenwerdenineinem25mL‐Rundkolbenüberführtunddas

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900mbar und 40 °C Badtemperatur entfernt. Der

produktbezogeneUmsatzwirdmithilfeder1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.

ProduktbezogenerUmsatz:>97%.

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.75(m,4H,H‐4,H‐5),1.84(2H,H‐3),2.62

(t,3J=6.5Hz,2H,H‐2),4.21(t,3J=4.5Hz,2H,H‐6).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):23.22(C‐3),29.25(C‐5),29.57(C‐4),34.85(C‐2),

69.60(C‐6),176.52(C‐1).

DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenen

Wertenüberein.[272]


143

7.2.1.2 Analytik

7.2.1.2.1 Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐Spektroskopie

FürdieUmsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐SpektroskopiewirdUrotropin(51)alsexternerStandard

verwendet. Dazuwird der gesamte Reaktionsansatz im Anschluss an die Aufarbeitung in ein NMR‐

RöhrchengegebenundfrischangesetzteUrotropin‐Stammlösung(51,0.17MinCDCl3,0.1mL)sowie

CDCl3(0.7mL)zugegeben.DerUmsatzwirdinBezugaufdasSingulettsignaldesStandards50bestimmt.

7.2.1.2.2 StabilitätvonUrotropin(51)alsStandard

Zur Bestimmung der Stabilität des externen Standards Urotropin (51) werden Cyclohexanol (1,

0.2mmol,21µL)sowieUrotropin(51,0.1mLder0.17M‐StammlösunginCDCl3)zusammenmitCDCl3

in ein NMR‐Röhrchen gegeben und sofort vermessen. Das Verhältnis beider Komponenten wird

bestimmt.Nach24hbeiRTwirddieselbeProbeerneutvermessenunddasVerhältnisbeiderKompo‐

nentenmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle23aufgelistet.

Tabelle23. BestimmungderStabilitätvonUrotropin(51)über24h.

EintragVerhältnis51 /1

eingewogen

Verhältnis51/1

nach24

1 1:0.80 1:0.80

7.2.1.2.3 BestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR

Zur Bestimmung der Rückgewinnungsrate der Substanzen wird die Aufarbeitung simuliert. Dazu

werdenCyclohexanon(2,0.2mmol,20.7µL)bzw.ɛ–Caprolacton(3,0.2mmol,21.1µL)inKPi‐Puffer

(pH7,50mM,5mL)gelöstundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungdurchExtraktionerfolgtanalog

der AAV 1. Zur Bestimmung der Substanzmenge mittels 1H‐NMR‐Analytik wird Urotropin (51) als

Standard (0.1mL der 0.17M‐Stammlösung in CDCl3) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24

aufgelistet.


144

Tabelle24. RückgewinnungsratederSubstanzennachsimulierterAufarbeitung.

Eintrag Substanz Rückgewinnungsrate[%]

1 2 91

2 3 98

7.2.1.3 UmsatzbestimmungmittelsGC

7.2.1.3.1 ErstellenderEichgerade

VordemErstelleneinerEichgeradenwurdezunächsteineMethodeamGaschromatographenerstellt,

dieeineguteTrennungderSubstanzenerlaubt. ImAnschlusswurdeeineStammlösung(10g/l)von

Cyclohexanol (1),Cyclohexanon (2)undɛ–Caprolacton (3)hergestellt.Dafürwurden je1gderdrei

Substanzeninein100mL‐fassendenMaßkolbeneingewogen,mitDCMbiszumEichstrichaufgefülltund

sehrgutgeschüttelt.AusgehendvondieserStammlösungwurdeeineVerdünnungsreihedurchgeführt,

sodass Lösungen der Konzentrationen von 5 g/l, 2.5 g/l, 2.0 g/l, 1.75 g/l, 1.5 g/l, 1.25 g/l, 1.0 g/l

hergestelltwerdenkonnten.VonderStammlösungsowievondenweiterenLösungenwurdenjeweils3

Probenfläschchen abgefüllt und doppelt am Gaschromatographen vermessen. Aus den erhaltenen

WertenwurdemithilfedesProgrammsderMittelwertgebildetunddieEichgeradeerstellt.

7.2.1.3.2 BestimmungderDurchschnittsabweichungen

Zur Bestimmung der durchschnittlichen Abweichungen der zuvor erstellten Eichgerade werden

unterschiedlicheMengenderSubstanzen1,2und3ineinen100mL‐Maßkolbeneingewogenundmit

DCM aufgefüllt. Davon werden jeweils drei Proben abgefüllt und mittels Gaschromatographie ver‐

messen.DieErgebnissesindinTabelle25aufgelistet.


145

Tabelle25. BestimmungderDurchschnittsabweichungenbeiGC‐Messungen.

Eintrag Substanz Einwaage[mg/mL]

Stoffmenge

erhalten[mg/mL]

Abweichung

[mg/mL]/[%]

1

2

3

1 2.39 2.49 0.10/4

2 0.81 0.82 0.01/1

3 1.78 1.85 0.07/4

4

5

6

1 1.25 1.28 0.03/2

2 1.40 1.42 0.02/1

3 1.25 1.28 0.07/2

7

8

9

1 0.93 0.96 0.03/3

2 1.58 1.60 0.02/1

3 2.75 2.89 0.14/5

10 3 2.45 2.45 0/0

7.2.1.3.3 BestimmungdesWiederfindungsratemittelsGC

DieKomponenten1,2und3werdeninverschiedenenKonzentrationen(0.1–0.4mmol)eingewogen

undinKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)für24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.

Der Rückstand wird nach Entfernen des Lösungsmittels in einen Maßkolben gegeben und auf den

Eichstrich aufgefüllt.Davonwird eineProbeabgefülltunddie SubstanzmengemittelsGaschromato‐

graphie bestimmt. Jede Messung wird fünfmal durchgeführt und daraus der Durchschnittswert

ermittelt.DieErgebnissesindinTabelle26aufgelistet.

Tabelle26. BestimmungderWiederfindungsratewährendderAufarbeitung.

Eintrag Substanz Stoffmenge[mmol] Wiederfindung [%]

1 1 0.1 71

2 2 0.1 75

3 3 0.1 80

4 1 0.2 84

5 2 0.2 88

6 3 0.2 88

7 1 0.4 90


146

Eintrag Substanz Stoffmenge[mmol] Wiederfindung[%]

8 2 0.4 95

9 3 0.4 97

7.2.1.3.4 BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH

DieKomponenten1,2und3(0.2mmol)werdeneingewogenundinKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)

zusammenmitLk‐ADH(0‐40U,0‐141µL)für1hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogder

AAV1.DerRückstandnachEntfernendesLösungsmittelswirdineinen25mL‐Maßkolbengegebenund

davon drei Proben abgefüllt. Die Substanzmenge wird mittels Gaschromatographie bestimmt. Jede

MessungwirddreimaldurchgeführtunddarausderDurchschnittswertermittelt.DieErgebnissesindin

Tabelle27aufgelistet.

Tabelle27. BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH.

Eintrag Substanz Lk‐ADH Wiederfindung[%]

1 1 ‐ 88

2 1 + 90

3 2 ‐ 76

4 2 + 73

5 3 ‐ 94

9 3 + 93

7.2.1.3.5 EinflussderEnzympellet‐BildungaufdieRückgewinnungsrate

ZurUntersuchungderEinflussesderPellet‐BildungaufdieRückgewinnungsratewerdenɛ‐Caprolacton

(3,0.2mmol,22.8mg)undLk‐ADH(0–500µL)inKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)für10minbeiRT

gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1,mitderAbweichungderZentrifugierzeittzwischen

5–30Minuten.DieSubstanzmengevon3wirdanschließendmittelsGaschromatographiebestimmt.Die

ErgebnissesindinTabelle28aufgelistet.


147

Tabelle28. EinflussderPellet‐BildunginAnwesenheitvonLk‐ADH.

Eintrag Lk‐ADH[µ] t[min] Rückgewinnungsrate[%]

1 0 3x30 68

2 150 3x30 61

3 500 3x30 20

4 0 3x5 93

5 150 3x5 73

6 500 3x5 69

7.2.1.3.6 VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV1.DazuwirdCHMO(3.82U,20.1mg),Cyclohexanol(1,0.2mmol),

MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(40U,210.5µL)undNADP+(1mol%,1.57mg)eingesetztundinKPi‐Puffer

(pH7,50mM,5mL)für24hgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DerRückstandwird

nach Entfernen des Lösungsmittels in einen Maßkolben gegeben und auf den Eichstrich aufgefüllt.

DavonwerdendreiProbenabgefülltundperGCvermessen.DerrestlicheInhaltderGC‐Gläschenwird

mit der restlichen Lösung zusammengegeben und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei

900mbarund40°CBadtemperaturentfernt.DergesamteReaktionsansatzwirdimAnschlussandie

AufarbeitungineinNMR‐RöhrchengegebenundfrischangesetzteUrotropin‐Stammlösung(51,0.17M

inCDCl3,0.1mL)sowieCDCl3(0.7mL)zugegeben.DerUmsatzwirdinBezugaufdasSingulettsignaldes

Standards50bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle29aufgezeigt.

Tabelle29. VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR

Eintrag Substanz Umsatzvia GC[%] UmsatzviaNMR[%]

1 1 6 0

2 2 5 3

3 3 74 59


148

7.2.1.4 Photometertests

7.2.1.4.1 BestimmungderEnzymaktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethyl‐

cyclohexanol(53)

DieEnzymaktivitätderLk‐ADHwirdspektroskopischanalogeinerarbeitsgruppeninternerVorschrift

spektroskopischbeieinerWellenlängevon340nmdurchMessungdesVerbrauchsvonNADPHdurch

Oxidation zu NADP+ in Gegenwart eines Substrates bestimmt. Dafürwerden in eine 3mL fassende

Küvette 2880 µL der Substratlösung (10mMbis 2M in KPi‐Puffer (pH 7, 50mM)) und 60 µL einer

NADPH‐Lösung (12.5mM in KPi‐Puffer (pH 7, 50mM)) gegeben und gut geschüttelt. Abschließend

werden60µLderentsprechendverdünntenLk‐ADH‐Lösung(Rohextrakt)zugegeben.DieLösungwird

nocheinmalgutgeschütteltunddieMessungsofortgestartet.Eswurdeüber3MinutenjedeSekunde

einMesspunktaufgenommen.ZurBerechnungdervolumetrischenEnzymaktivitätwirddieAnfangs‐

steigungderAbsorptionskurve in folgendeGleichung4eingesetzt.DieErgebnissesind inTabelle30

aufgezeigt.

Gleichung4

U/mL: volumetrischeEnzymaktivität∆E340nm

t: Anfangssteigung/‐abnahmederAbsorptionskurve[min‐1]

Vg: GesamtvolumenderProbe[mL]

f: VerdünnungsfaktordesRohextraktes

Vp: Enzymvolumen[mL]

ɛ: molarerExtinktionskoeffizientmL

mM∙cm

d: SchichtdickederKüvette[cm]

IndieserArbeitsindd=1cmundɛ=6.3mL

mM∙cm.

Tabelle30. BestimmungderAktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)imVergleichzu1‐Phenylethanol(47)undCyclohexanol(1).

Eintrag Substrat Aktivität[U/mL] RelativeAktivität[%]

1 47 21.5 100

2 1 33.0 153

3 53 0 0


149

7.2.1.4.2 AllgemeineArbeitsvorschrift2(AAV2):BestimmungderEnzymaktivitätder

CHMO

Die Enzymaktivität der CHMO (ECSMo‐01)wird nach einer Vorschrift der ENZYMICALSAG bei einer

Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in

GegenwartvonCyclohexanon(2)alsSubstratbestimmt.DazuwerdenStammlösungendesSubstrats

Cyclohexanon(2,100mMinDMF)undeineNADPH‐Lösung(125mMindest.Wasser)hergestellt.Es

werden2670µLdesTRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderSubstratlösungund

3µLderNADPH‐Lösung ineineKüvettepipettiertunddurchSchüttelngutvermischt.Anschließend

werden300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnochein

weiteresMal gutdurchmischtunddieMessunggestartet. Eswirdüber3Minuten jedeSekundeein

Messpunkt aufgenommen. Zur Berechnung der volumetrischen Enzymaktivität wird die Anfangs‐

steigungderAbsorptionskurvenachGleichung5berechnet.

Gleichung5

U/mL: volumetrischeEnzymaktivität∆E340nm

t: Anfangssteigung/‐abnahmederAbsorptionskurve[min‐1]

f: VerdünnungsfaktordesRohextraktes

ɛ: molarerExtinktionskoeffizientmL

mM∙cm

d: SchichtdickederKüvette[cm]

IndieserArbeitsindd=1cmundɛ=6.3mL

mM∙cm.

Aktivität:0.082U/mg.

7.2.1.4.3 BVMO‐ScreeningundBRADFORD‐TestzurOxidationvonCyclohexanol(2)

Die Enzymaktivitäten der BVMOs ECSMo‐03 und ECSMo‐05 (ENZYMICALSAG) sollen photometrisch

analog zur AAV 2 bestimmt werden. Dazu werden Stammlösungen des Substrats Cyclohexanon (2,

100mMinDMF)undeineNADPH‐Lösung(125mMindest.Wasser)hergestellt.Eswerden2670µLdes

TRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderentsprechendenSubstratlösungund3µL

derNADPH‐LösungineineKüvettepipettiertunddurchSchüttelngutvermischt.Anschließendwerden

300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnocheinweiteres

MalgutdurchmischtunddieMessunggestartet.Eswirdüber3MinutenjedeSekundeeinMesspunkt

aufgenommen. Zur Berechnung der Enzymaktivitätwird die Anfangssteigung der Absorptionskurve

nachGleichung5berechnet.DieErgebnissesindinTabelle31aufgezeigt.


150

Tabelle31. BVMO‐ScreeningzurOxidationvonCyclohexanon(2).

Eintrag BVMO Aktivität[U/mL] Aktivität[U/mg] RelativeAktivität[%]

1 ECSMo‐01 7.38 3.00 100

2 ECSMo‐03 0.50 0.20 7

3 ECSMo‐05 0.14 0.05 2

7.2.1.4.4 AktivitätsbestimmungderCHMOgegenüberIsophoron(52)

Die Enzymaktivität der CHMO soll photometrisch gegenüber Isophoron (52) als Substrat bestimmt

werden.AbweichendvonderAAV1wirddieAktivitätnacheinerVorschriftderFirmaENZYMICALSAG

dargestellt.DazuwerdenStammlösungenderSubstrateCyclohexanon(2)undIsophoron(52,100mM

in DMF) und eine NADPH‐Lösung (125 mM in dest. Wasser) hergestellt. Es werden 2670 µL des

TRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderentsprechendenSubstratlösungund3µL

derNADPH‐LösungineineKüvettepipettiertunddurchSchüttelngutvermischt.Anschließendwerden

300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnocheinweiteres

MalgutdurchmischtunddieMessunggestartet.Eswirdüber3MinutenjedeSekundeeinMesspunkt

aufgenommen. Zur Berechnung der Enzymaktivitätwird die Anfangssteigung der Absorptionskurve

nachGleichung5berechnet.DieErgebnissesindinTabelle32aufgezeigt.

Tabelle32. Bestimmung der Aktivität von CHMO gegenüber Isophoron (52) im Vergleich zuCyclohexanon(2).

Eintrag Substrat Aktivität[U/mg] Aktivität[%]

1 2 0.101 100

2 52 0.003 3

7.2.1.5 OptimierungderStandard‐Reaktion

7.2.1.5.1 AllgemeineArbeitsvorschrift3(AAV3):Doppeloxidationzuɛ‐Caprolacton(3)mit

optimierterAufarbeitung

Zur Optimierung der Aufarbeitung wird die Synthese analog der AAV 1 (siehe Abbildung 126)

durchgeführt.DazuwerdenCHMO(3.82U,68.2mg)inKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL),Cyclohexanol(1,

0.2mmol, 22.0mg),MgCl2 (1mM) sowie Lk‐ADH (40 U, 210.5 µL) undNADP+ (1mol‐%, 1.57mg)

eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.Anschließendwerdendie5mLzuje1mLauffünf2mL‐EPPEN‐

DORF‐Gefäßeverteiltundjeweilsmit1mLDCMversetzt.Durch30minSchüttelnimThermomixerwird


151

dasZweiphasensystemextrahiert.DiePhasentrennungwirddurch5minZentrifugierenbei13000rpm

erreicht.DieuntereorganischePhasewirdabgenommenunddiezurückbleibendewässrigePhasesowie

dasdenaturierteEnzymwerdenerneutmitje1mLDCMversetzt.DieExtraktionmitanschließender

Phasentrennung wird noch zweimal wiederholt. Die organischen Phasen werden in einem 50mL‐

MaßkolbenüberführtundderKolbenbiszurEichmarkemitDCMaufgefüllt.EswerdendreiProben‐

fläschchenabgefülltundderUmsatzmittelsGaschromatographiebestimmt.

Umsatz:74%ɛ‐Caprolacton(3),20%Cyclohexanon(2),10%Cyclohexanol(1).

7.2.1.5.2 VariationdesLösungsmittels

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenjeweilsCHMO(3.82U,20.1mg),Cyclohexanol

(1,0.2mmol),MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(40U,210.5µL)undNADP+(1mol‐%,1.57mg)eingesetzt

und für 24 h bei RT gerührt. Als Lösungsmittel dient zum einen mit organischem Co‐Solventien

versetzterKPi‐Puffer(pH7,50mM)bzw.dest.Wasser.ZumanderenwirdKPi‐Puffer(pH7,50mL)bzw.

dest.WassermitdemCo‐Solvenz(je10mL)für24hbeiRTund1200rpmgerührtumeinegesättigte

wässrigePhasezuerhalten.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieUmsätzezu2und3sowie

die Stoffmenge des nicht umgesetzten Edukts 1 werden entweder mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie

bestimmtundaufdenStandardUrotropin(51)bezogenoderviaGCermittelt.DieErgebnissesindin


Tabelle33. VariationdesLösungsmittelgemischesbeiderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).

Eintrag Lösungsmittel‐GemischStoffmenge3[mmol]

Stoffmenge2[mmol]

Stoffmenge1[mmol]

1a) KPi/MTBE8:2 1.6 1.2 18.4

2a) KPi/MTBE6:4 0.4 0.8 28.0

3a) KPi/EtOAc6:4 0 2.4 27.6

4b) KPi/Toluol9:1 23.6 3.2 8.4

5b) KPi/Methylcyclohexan9:1 25.6 2.0 2.4

6b) KPi/Isooctan9:1 34.8 2.0 2.0

7b) KPi/n‐Heptan9:1 26.0 2.0 4.4

8a) MTBE‐ges.KPi 13.2 1.2 3.6


152

Eintrag Lösungsmittel‐GemischStoffmenge3[mmol]

Stoffmenge 2[mmol]

Stoffmenge1[mmol]

9a) EtOAc‐ges.KPi 0 2.8 24.4

10a) n‐Heptan‐ges.KPi 14.0 1.2 3.2

11a) n‐Hexan‐ges.KPi 19.6 0.8 0

12a) Methylcyclohexan‐ges.KPi 28.0 1.2 0

13a) MTBE‐ges.dest.Wasser 0.8 2.0 32.0

14a) dest.Wasser 14.0 1.2 6.8a)UmsatzbestimmtmittelsNMR‐SpektroskopiemitUrotropin(51)alsStandard;b)UmsatzbestimmtmittelsGC.

7.2.1.5.3 VariationderReaktionsbedingungen

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenCHMO(3.82U,20.1mg) inKPi‐Puffer(pH7,

50mM,5mL),Cyclohexanol(1,0.2mmol),MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(13–40U,70.2‐210.5µL)und

NADP+(2‐10mol‐%)eingesetztundfür24hbeiRT–30°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogder

AAV1.DieproduktbezogenenUmsätzewerdenmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgeb‐

nissesindinTabelle34aufgelistet.

Tabelle34. VariationderReaktionsbedingungenderOxidationvonCyclohexanol(1).

EintragNADP+[mol‐%]

Lk‐ADH

[U]

T

[°C]

Umsatz3

[%]

Umsatz2

[%]

1 2 40 RT 97 3

2 10 40 RT 61 11

3 1 40 30 48 5

4 1 13 RT 55 3

7.2.1.6 AllgemeineArbeitsvorschrift4(AAV4):UntersuchungderStabilitätderLk‐ADH

mittelsTitrations‐Apparatur

Abbildung127. UntersuchungderStabilitätderLk‐ADHinAnwesenheitvonLacton3.

IneinerTitrino‐ApparaturwerdenAcetophenon(46,20mM,21μL),ε‐Caprolacton(3,10mM–1M)

sowieD‐Glucose(48‐a,100mM,180.1mg)in10mLdest.Wassergegeben.Anschließendwerden1mg


153

MgCl2,40U/mmolLk‐ADHund40U/mmolGlucosedehydrogenase(GDH)„AMANO2“zugegebenunddie

ReaktionmitZugabevonNADP+(1mol%,1.57mg)alsCofaktorfür24hgestartet.

D‐Glucose(48‐a)dienthierbeialsRegenerationsmediumfürdeneingesetztenCofaktor,derdurchdie

VerwendungvonGDHzumbenötigtenNADPHreduziertwird.D‐Glucose(48‐a)selbstwirdzunächstin

Gluconolacton(49‐a)umgewandelt,welchesirreversibelzurGluconsäure(50‐a)gespaltenwird.Durch

Zugabe von Natronlauge (0.2 M) wird die gebildete Säure zum Natriumgluconat neutralisiert. Die

verbrauchteMengeanNatronlaugegibtAuskunftüberdenUmsatzderReaktion.

DurchZugabevon15mLDCMwirddieReaktionbeendet.EswirdimScheidetrichterausgeschütteltund

dieorganischePhaseabgetrennt.Anschließendwirdnochzweimalmitje15mLDCMextrahiert.Das

organische Lösungsmittel wird bei 900 mbar und 40°C Badtemperatur am Rotationsverdampfer

entfernt. DerUmsatzwird ebenfallsmittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt und auf den Standard

Urotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle35aufgezeigt.

Tabelle35. UntersuchungderStabilitätvonLk‐ADHinAnwesenheitvonLacton3.

Eintrag Keton46

[M]

Lacton3

[M]

Produktkonzentration

viaTitrino[%]

ProduktkonzentrationviaNMRa)[%]

1 0.02 0 25 19

2 0.02 0.01 24 16

3 0.02 0.04 30 16

4 0.02 0.10 42 15

5b) 0.02 0.25 49 16

6b) 0.02 1.00 50 14

7b) 0 0.25 0 0a)UmsatzbestimmtmittelsUrotropin(51)alsexternerStandard;b)automatischerAbbruchderReaktionnach3.5h.

7.2.1.7 VariationdesSubstrates

7.2.1.7.1 3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat

Abbildung128. Doppeloxidationvon3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53).


154

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenjeweilsCHMO(3.82U,20.1mg),3,5,5‐Trimethyl‐

cyclohexanol (53, 0.2mmol), MgCl2 (1mM) sowie Lk‐ADH (40 U, 210.5 µL) und NADP+ (1mol‐%)

eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieKonzentrationen

derKomponentenwird sowohlmittels 1H‐NMR‐Spektroskopie, bezogenaufdenStandardUrotropin

(51),sowiemittelsGaschromatographiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle36aufgelistet.

Tabelle36. 3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat.

Eintrag AnalytikKonzentration53

[mM]Konzntration 55

[mM]Konzentration56/57

[mM]

1 1H‐NMR 28.4 0 0

2 GC 38.8 0 1.2

7.2.1.7.2 Isophoron(52)alsSubstrat

Abbildung129. OxidationvonIsophoron(52)mitLk‐ADHalsRegenerationssystem.

Ineinem10mL‐RundkolbenwirdRohextraktderCHMO(3.82U,20.1mg)inKPi‐Puffer(pH7.0,50mM,

5mL)aufgenommenundgutgeschüttelt. Isophoron (52, 0.2mmol,27.6mg),MgCl2(1mM),Lk‐ADH

(40U,Rohextrakt/Glycerin1:1(v/v))sowiei‐PrOH(1.25ml)werdenzugegeben.DasGemischwirdfür

20minbeiRaumtemperaturgerührt.DurchZugabevonNADP+(1mol‐%,1.57mg)wirddieReaktion

gestartet und dieMischung für eine bestimmte Zeit bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung

erfolgtanalogderAAV1.DieKonzentrationwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmtundaufden

StandardUrotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle37aufgelistet.

Tabelle37. Isophoron(52)alsSubstrat.

Eintrag Analytik Konzentration52[mM] Konzentration59[%]

1 1H‐NMR 23.6 0

2 GC 39.9 1


155

7.2.1.8 VerwendungvonAdsorberharzen

7.2.1.8.1 BestimmungderRückgewinnungsrateinAnwesenheitvonXAD‐7undXAD‐1180

ZurBestimmungderRückgewinnungsratewerdenCyclohexanol(1)bzw.dasLacton3(0.2mmol)in

KPi‐Puffer (pH 7, 50mM)mit XAD‐7 bzw. XAD‐1180 (100 – 200mg) für 20 h bei RT gerührt. Die

Harzkügelchenwerdenabfiltriertundzunächstmitdest.Wasser(3x20mL)undanschließendmitDCM

bzw.MTBE(3x20mL)gewaschenunddiePhasengetrennt.DiewässrigePhasewirdmitDCMbzw.

MTBE (3 x 20 mL) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint und das Lösungsmittel bei

900mbarund40°Centfernt.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmtundaufden

StandardUrotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle38aufgelistet.

Tabelle38. BestimmungderRückgewinnungsrate inAnwesenheitderAdsorberharzeXAD‐7bzw.XAD‐1180.

Eintrag Substanz Harz/[mg] Solvenz Rückgewinnung [%]

1 1 XAD‐7/100 DCM 46

2 3 XAD‐7/100 DCM 68

3 3 XAD‐7/200 DCM 74

4 3 XAD‐7/100 MTBE 30

5 1 XAD‐1180/100 DCM 89

6 1 XAD‐1180/200 DCM 41

7.2.1.8.2 DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7

Abbildung130. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.

Die Synthese erfolgt analog der AAV 1. Dazu werden CHMO (3.82 U, 20.1mg), Cyclohexanol (1,

0.2mmol),XAD‐7 (100mg),MgCl2 (1mM)sowieLk‐ADH(40U,210.5µL)undNADP+ (1mol‐%) in

KPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalog


156

derAAV1.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐SpektroskopiebestimmtundaufdenStandardUrotropin

(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle39aufgelistet.

Tabelle39. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.

Umsatz3[%] Umsatz2[%]ZurückgewonneneStoffmenge

1+2+3[%]

24 3 50


157

7.2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminenmittelsLipasen

7.2.2.1 AllgemeineArbeitsvorschrift5(AAV5):SynthesevonReferenzverbindungen

Zumjeweiligenrac‐AminwirdderentsprechendeAcyldonor(1Äq.)gegebenundfürdieangegebene

Reaktionszeit zum Rückfluss (Ölbad auf 180 °C) erhitzt (Abbildung 131).[253] Der produktbezogene

Umsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DasRohproduktwirdmittelsSäulenchromato‐

graphieaufgereinigt,umdasisolierterac‐Amidzuerhalten.

Abbildung131. SynthesederReferenzverbindungen.[253]

7.2.2.1.1 SynthesedesDL‐Ethyl‐3‐oxo‐3‐(1‐phenylethylamino)propanoats(rac‐10)

Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 2.7mmol, 327.3mg)wird

Malonsäurediethylester (9, 15.1mmol,2.4g)gegebenund für4hzumRückflusserhitzt.DieAufrei‐

nigungerfolgtmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc2:1).DasAmidrac‐10wirdals

farbloserFeststofferhalten.

Umsatz:85%;Ausbeute:71%(448.6mg,1.9mmol).

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t,3J=7.1Hz,3H,H‐14),

1.51(d,3J=6.9Hz,3H,H‐9),3.32(d,3J=4.9Hz,2H,H‐11),4.19(q,

3J=7.2Hz,2H,H‐13),5.15(q,3J=7.2Hz,1H,H‐7),7.24–7.36(m,

5H,Har),7.50(m,1H,H‐8).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):14.16(C‐14),22.22(C‐9),41.21(C‐11),

49.04 (C‐7),61.69 (C‐13),126.19 (C‐1,C‐5),127.46 (C‐3),128.80

(C‐2,C‐4),143.16(C‐6),164.12(C‐10),169.83(C‐12).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210nm, flow:

0.8mL/min,tR=16.9min(R),26.7min(S),ee‐Wert:0%.

IR (ATR): (cm‐1) = 3276.0, 3064.4, 2977.5, 2930.4, 2359.4, 1735.8, 1642.7, 1541.0, 1448.4, 1367.9,

1152.8,1031.6,943.8,761.0,698.3,613.8,537.9.

MS(ESI):m/z(%)=258.1(100)[M+Na]+,356.3(3),437.3(5),493.2(31)[2M+Na]+.

EA(C13H17NO3):berechnet:C:61.95%,H:8.98%,N:6.57%,O:22.50%;gefunden:C:61.08%,H:8.99%,

N:6.47%,O:23.46%.

DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[273]


158

7.2.2.1.2 Synthesedes2‐Phenoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐121)

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,61.0mg)wird

Phenoxyessigsäureethylester(122,0.5mmol,90.6mg)gegebenundfür5hzumRückflusserhitzt.Die

AufreinigungerfolgtmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc3:2).DasProduktwirdals


Umsatz:81%,Ausbeute:37%(47.2mg,0.18mmol).

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.56(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),

4.51(d,3J=6.0Hz,2H,H‐11),5.24(qui,3J=7.5Hz,1H,H‐7),6.79

(br,1H,H‐8),6.92(d,3J=8.5Hz,2H,Har),7.03(t,3J=7.5Hz,1H,

Har),7.27–7.36(m,5H,Har),7.50(m,1H,H‐8).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 21.96 (C‐9), 48.43 (C‐7), 67.51

(C‐11), 114.86 (Car), 122.30 (Car), 126.24 (Car), 127.61 (Car),

128.85 (Car), 129.92 (Car), 142.80 (C‐5), 157.26 (C‐12), 167.44

(C‐10).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow:


IR(ATR):(cm‐1)=3269.9,3062.6,3970.0,2929.9,

MS(ESI):m/z(%)=278.1(80)[M+Na]+,410.7(12),533.1(100)[2M+Na]+.

DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.

7.2.2.1.3 Synthesedes2‐Cyano‐N‐(1‐phenylethyl)‐acetamids(rac‐123)

Abbildung132. SynthesedesCyano‐Amidsrac‐123.[254]

Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,59.8mg)wirdCyanessigsäureethylester(124,0.5mmol,

57.7mg) zugegebenund für24hbeiRTgerührt (Abbildung132).[254]DasRohproduktwirdmittels

Säulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc2:3)aufgereinigt.DasProduktwirdalsfarbloserFest‐

stofferhalten.


HN

OO

rac‐117C16H17NO2

M=255.31g/mol

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1012

11

13

14

1516

17


159

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.56(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),3.35

(d,3J=2.5Hz,2H,H‐11),5.12(qui,3J=7Hz,1H,H‐7),6.29(br,1H,H‐

8),7.29–7.38(m,5H,Har).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 21.60 (C‐8), 26.04 (C‐11), 50.12 (C‐7),

114.85 (C‐13), 126.27 (Car), 128.01 (Car), 129.02 (Car), 141.99 (C‐5),

160.09(C‐10).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8

mL/min,tR=17.14min(R),21.38min(S),ee‐Wert:0%.

IR (ATR): (cm‐1) = 3275.3, 3064.8, 2966.1, 2919.9, 2357.5, 2341.2, 2256.4, 1644.8, 1550.2, 1445.2,

1355.0,1241.6,1195.0,1106.6,934.9,748.5,684.3,597.8,587.6,528.2.

MS (ESI): m/z (%) = 211.0 (100) [M+Na]+, 316.2 (4), 353.3 (13), 399.1 (52) [2M+Na]+, 437.2 (6),

569.2(3).

EA (C11H12N2O):berechnetC:70.19%,H:6.43%,N:14.88%,O:8.50;gefunden:C:70.53%,H:6.66%,

N:3.93%,O:6.69%.


7.2.2.1.4 SynthesedesN‐(1‐Phenylethyl)acetamids(rac‐7)

Abbildung133. Acylierungvonrac‐4mitEssigsäurevinylester(125).

Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,59.8mg)wirdEssigsäurevinylester(125,0.5mmol,57.7mg)

zugegebenundfür4.5Stundenbei60°Cgerührt.DasRohproduktwird indest.H2O(0.5mL)aufge‐

nommenundmitDCMextrahiert.DasProduktwirdalsgelbesÖlerhalten.

Umsatz:95%.

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.49(d,3J=6.9Hz,3H,H‐9),1.98(s,3H,

H‐11),5.13(qui,3J=7.2Hz,1H,H‐7),5.71(br,1H,H‐8),7.25–7.36(m,5H,

Har).

13C‐NMR (500MHz,CDCl3):21.82 (C‐9),23.56 (C‐11),48.91 (C‐7),114.85

(C‐13), 126.32 (C‐6, C‐5), 127.49 (C‐2), 128.78 (CC‐1, C‐3), 143.28 (C‐5),

169.25(C‐10).

HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,

tR=27.39min(R),37.85min(S),ee‐Wert:0%.

IR(ATR):(cm‐1)=3733.9,3278.5,2974.9,2358.8,2340.8,1646.2,1541.3,

1473.4,1447.8,1370.5,1296.7,1274.5,1209.7,1138.5,1028.3,728.9,638.2,519.8.499.2.


160

MS(ESI):m/z(%)=186.0(100)[M+Na]+,393.3(15),556.3(5).


7.2.2.1.5 Synthesedes2‐Phenyl‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐126)

Abbildung134. Acylierungvonrac‐4mit2‐Phenylacetylchlorid(127).[255]

Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4, 2mmol,0.24g),gelöstinDCM(2.5mL),wirdNEt3(4mmol,0.57mL)

gegebenundfür10Minutenauf0°Cgekühlt(Abbildung134).[255]2‐Phenylacetylchlorid(127,2mmol,

0.27mL)wirdzugetropftundfür21hbeiRaumtemperaturgerührt.Ammoniumchlorid‐Lösungwird

zugegeben und die Phasen werden getrennt. Die wässrige Phase wird mit ges. Natriumhydrogen‐

carbonat‐Lösung(3x)gewaschen,dievereintenorganischenPhasenwerdenmitDCM(3x)extrahiert

und überMgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittelwird i.Vak. entfernt. Das Produktwird als farbloser

Feststofferhalten.

Umsatz:>99%,Ausbeute:80%(0.38g,1.61mmol).

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.40(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),

3.58(s,2H,H‐11),5.12(qui,3J=7.0Hz,1H,H‐7),5.61(br,1H,H‐8),

7.18–7.37(m,12H,Har).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):21.92(C‐9),44.04(C‐11),48.86(C‐7),

126.07(C‐1,C‐5),127.42(C‐3),127.49(C‐15),128.75(C‐2,C‐4),

129.16 (C‐16, C‐14), 129.51 (C‐17, C‐13), 135.01 (C‐13), 143.17

(C‐6),170.13(C‐10).


0.8mL/min,tR=24.14min(R),3.51min(S),ee‐Wert:<1%.

IR(ATR):(cm‐1)=3317.6,3057.3,3014.9,2973.3,2910.0,2359.1,

1716.3,1646.0,1525.6,1493.8,1450.1,1341.8,1243.2,1209.1,1130.6,1072.0,1027.5,952.6,905.7,

756.4,692.8,532.2.

MS (ESI):m/z (%) = 262.1 (81) [M+Na]+, 303.2 (13), 379.4 (100), 437.3 (57), 502.2 (7) [2M+Na]+,

559.4(7).

EA (C16H17NO): berechnet C: 80.30%, H: 7.16%, N: 5.85%, O: 6.69; gefunden: C:68.55%, H: 6.23%,

N:3.93%,O:8.43%.



161

7.2.2.1.6 Synthesedes2‐Methoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐8)

Abbildung135. Acylierungvonrac‐4mit2‐Methoxyacetylchlorid(128).[256]

Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 1.25 mmol, 161.8µL) wird bei 0°C Piperidin (1.05 Äq., 103.8µL)

zugegeben(Abbildung135).[256]Eswirdmit2‐Methoxyacetylchlorid(128,1.1Äq.,131.5µL)versetzt

undfür1hunterEisbadkühlunggerührt.DaserhaltenefarbloseÖlwirdinDCMaufgenommenunddie

Phasenwerdengetrennt.DieorganischePhasewirdmitHCl(1M,2x),mitges.Natriumchlorid‐Lösung

(2x)sowiemitges.Natriumhydrogencarbonat‐Lösung(2x)gewaschenundüberMgSO4getrocknet.Das

Lösungsmittelwirdi.Vak.entfernt.DasProduktwirdalsfarbloserFeststofferhalten.

Umsatz:>99%,Ausbeute:95%(227.8mg,1.18mmol).


(s,3H,H‐12),3.90(d,3J=10.5Hz,2H,H‐11),5.18(qui,3J=7.0Hz,1H,

H‐7),6.75(br,1H,H‐8),7.25–7.28(m,1H,Har),7.31–7.37(m,4H,Har).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):21.97(C‐9),48.14(C‐7),59.21(C‐12),72.03

(C‐11), 126.24 (Car), 127.49 (Car), 127.78 (Car), 143.01 (C‐5), 167.71

(C‐10).


0.8mL/min,tR=13.09min(R),17.47min(S),ee‐Wert:<1%.

IR (ATR): (cm‐1) = 3342.7, 2971.0, 2931.3, 2828.6, 1650.5, 1521.7,

1454.9,1208.0,1112,0,1018.2,977.9,766.0,701.1,663.4,614.5,571.8,537.5,501.7.

MS(ESI):m/z(%)=216.0(100)[M+Na]+,217.0(13),409.2(8)[2M+Na]+.


7.2.2.1.7 SynthesedesEthyl‐3‐((2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)amino)‐3‐oxo‐propanoats

(rac‐129)

Abbildung136. SynthesedesAminoindan‐Amidsrac‐129.[257]


162

Zu1‐Aminoindan(130,1.0mmol,132.5mg)werdenMalonsäurediethylester(9,1.0mmol,159.0mg)

undDBU (0.5mmol, 78.0mg) in DCM (0.2mL) gegeben und bei 40 °C für 3 d gerührt (Abbildung

136).[257] Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Rohprodukt wird mittels

Säulenchromatographie(LaufmittelCH/EtOAc1:4)aufgereinigtumdasisolierteProduktzuerhalten.


1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t, 3J=7.1Hz,3H,

H‐15),1.84(m,1H,H‐2),2.62(m,1H,H‐1),2.88(m,1H,H‐2),

3.00 (m, 1H, H‐2), 3.37 (d, 3J = 2.2 Hz, 2H, H‐12), 4.19 (q,

3J=7.2Hz,2H,H‐14),5.51(q,3J=7.8Hz,1H,H‐9),7.20–7.30

(m,4H,Har).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):14.19(C‐15),30.39(C‐1),34.08

(C‐2), 41.42 (C‐12), 54.89 (C‐9), 61.71 (C‐14), 124.12 (C‐4),

124.92(C‐7),126.92(C‐5),128.11(C‐6),143.00(C‐8),143.48

(C‐3),164.96(C‐11),169.58(C‐13).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8 mL/min, tR=21.89 min (R),

28.47min(S),ee‐Wert:0%.

IR (ATR): (cm‐1) = 3269.9, 3069.2, 2990.9, 2961.8, 2847.6, 2358.0, 1732.4, 1640.2, 1548.9, 1457.6,

1409.5,1363.8,1228.4,1148.2,1023.2,749.1,587.1,539.3.

MS(ESI):m/z(%)=270.1(100)[M+Na]+,315.2(3),437.2(3),517.1(5)[2M+Na]+.

EA(C14H17NO3):berechnetC:68.00%,H:6.93%,N:5.66%;gefunden:C:68.58%,H:6.96%,N:5.77%.


7.2.2.2 Analytik

7.2.2.2.1 ValidierungderAufarbeitungvonAAV5mittelsNMR‐Analytik

ZurValidierungderAnalytikwerdenMalonsäurediethylester(9)undrac‐10imVerhältnis1:1einge‐

wogen. Mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie wird das Verhältnis beider Komponenten bestimmt. An‐

schließend erfolgt eine Aufarbeitung analog der AAV6, indem filtriert undmit DCM undMTBE (je

10mL)gespültwird.DasVerhältnisderbeidenKomponentenwirderneutmittels 1H‐NMR‐Spektro‐

skopieermittelt.DieErgebnissesindinTabelle40dargestellt.


163

Tabelle40. ValidierungderAufarbeitungvonAAV6mittels1H‐NMR‐Analytik.

EintragVerhältnis9/rac‐10

vorAufarbeitung

Verhältnis9/rac‐10

nachAufarbeitung

Abweichung

[%]

1 1:0.98 1:0.99 1

2 1:1.02 1:1.06 4

3 1:1.04 1:1.05 1

7.2.2.2.2 BestimmungderEnantiomerenüberschüssedurchchemischeAcylierungdes

resultierendenAmins(S)‐4

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,60.1mg)werden

Malonsäurediethylester (9, 0.5mmol, 80.1mg) und CAL‐B (40mg/mmol) gegeben und für 24h bei

60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV5. ImAnschlusswirddergesamteReaktions‐

ansatzzusammenmitAcetanhydrid(132,0.5mmol,47.7µL)für6hbeiRTinChloroformgerührt.Das

Lösungsmittelwirdi.Vak.entfernt.MittelsHPLCwerdendieee‐WertedesAmids(R)‐10bestimmt.Der

ee‐WertdesAmids(S)‐7wurdeebenfallsmittelsHPLCdetektiertundmitdemberechnetenWertfür

(S)‐4verglichen.DieErgebnissesindinTabelle41aufgelistet.

Tabelle41. BestimmungdesEnantiomerenüberschussesdesresultierendenAmins(S)‐4.

ee‐Wert(S)‐10detektiert ee‐Wert(S)‐4 berechnet ee‐Wert(R)‐7detektiert

97% 90% 88%


164

7.2.2.3 VorversuchezurenzymatischenAcylierungmitBenzylaminenalsSubstrate

7.2.2.3.1 SynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)

Abbildung137. ChemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitMalonsäurediethylester(9).[253]

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]ZuBenzylamin(134,10.0mmol,1.07g)wirdMalonsäure‐

diethylester(9,10.0mmol,1.60g)gegebenundfür3hzumRückflusserhitzt.DieAufreinigungerfolgt

mittels Säulenchromatographie (Laufmittel: CHCl3/Aceton 85:15). Das Amid133 wird als farbloser

kristallinerFeststofferhalten.

Umsatz:49%,Ausbeute:48%(1.22g,4.82mmol).

1H‐NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.28 (t, 3J = 7.0 Hz, 3H,

H‐13),3.36(s,2H,H‐10),4.20(q,3J=7.0Hz,2H,H‐12),4.49(d,

3J=5.5Hz,2H,H‐7),7.28–7.35(m,5H,Har),7.45(br,1H,H‐8).

13C‐NMR (500MHz,CDCl3):14.17 (C‐13),41.21 (C‐10),43.69

(C‐7),61.74(C‐12),127.63(C‐3),127.82(C‐2,C‐4),128.83(C‐1,

(113)C‐5),138.00(C‐6),156.02(C‐9),169.68(C‐11).

IR (ATR): (cm‐1) = 3280.4, 2977.4, 1732.2, 1638.7, 1551.2,

1499.2,1453.8,1364.9,1284.0,1214.7,1149.2,1027.7,749.5,

670.4,580.4.

DC‐MS(ESI):m/z(%)=244.9(93)[M+Na]+,260.0(19)[M+K]+,465.0(100)[2M+Na]+,466.0(19),906.2

(13).

MS(ESI):m/z(%)=222.0(10)[M]+,244.0(100)[M+Na]+,260.0(34)[M+K]+,465.0(78)[2M+Na]+,

466.1(15),906.3(12).

EA(C17H18N2O2):berechnetC:65.14%,H:6.83%,N:6.33%;gefunden:C:65.37%,H:7.20%,N:6.52%.

DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[273,277]


165

7.2.2.3.2 AnalysedesDiamidsN,N‘‐Dibenzylmalonamid(137)

Abbildung138. BildungdesDiamids137alsNebenprodukt.

BeiderchemischenAcylierungdesBenzylamins(134)mitMalonsäurediethylester(9)analogderAAV

5(Abschnitt7.2.2.3.1)entstehtdasgewünschteBenzylamid133(Abbildung138).[253]AlsNebenprodukt

wirddabeidasentsprechendeDiamid137erhalten,welchesdurchSäulenchromatographie(Laufmittel

CHCl3/Aceton85:15)isoliertundalsfarbloserFeststofferhaltenwird.


1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):3.23(s,2H,H‐10),

4.44(d,3J=6.0Hz,2H,H‐7+H‐13),7.18(br,2H,H‐8+

H‐12),7.25–7.34(m,10H,Har).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 43.17 (C‐10), 43.76 (C‐7,

C‐13), 127.68 (C3, C‐17), 127.81 (C‐2, C‐4, C‐18, C‐16),

128.85(C‐1,C‐5,C‐19,C‐15),137.80(C‐6,C‐14),167.25

(C‐9,C‐11).

IR (ATR): (cm‐1) = 3279.4, 3062.5, 2359.1, 1654.6, 1623.7, 1541.3, 1452.2, 1354.0, 1243.0, 1225.9,

1026.3,716.8,691,9,604.3.

DC‐MS (ESI):m/z (%)=305.0 (100) [M+Na]+, 306.0 (15), 320.0 (27) [M+K]+, 587.0 (73) [2M+Na]+,

588.1(20),967.3(24).

MS (ESI): m/z (%) = 102.1 (100), 116.1 (68), 118.1 (30), 305.0 (35) [M+Na]+, 321.0 (10) [M+K]+,

587.0(15)[2M+Na]+,685(17),764.3(31).




166

7.2.2.3.3 AllgemeineArbeitsvorschrift6(AAV6):EnzymatischeAcylierungsubstituierter

Benzylamine

Abbildung139. EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.

ZusubstituiertemBenzylamin (134,138 ‐140, 0.5–2.5mmol)werdenMalonsäurediethylester (9,

1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei80°Cfür4.5hbei200rpmgerührtoderimThermo‐

Schüttlerbei300rpmgeschüttelt(Abbildung139).DieLipasewirdabfiltriert,mitDCMundMTBE(je

10–40mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmithilfevon1H‐NMR‐

Spektroskopiebestimmt.DasProduktwirdmittelsSäulenchromatographieisoliert.

7.2.2.3.4 EnzymatischeSynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.ZuBenzylamin(134,0.5mmol,53.6mg)werdenMalonsäure‐

diethylester(9,0.5mmol,81.3mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundbei80°Cfür4.5h

erhitzt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV2.DasProdukt133wirdineinerMischungmitdem

Diamid137erhalten.

Umsatz:91%133+9%137.

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t,3J=7.0Hz,3H,H‐

13),3.36(s,2H,H‐10),4.20(q, 3J=7.0Hz,2H,H‐12),4.48(d,

3J=5.5Hz,2H,H‐7),7.28–7.35(m,5H,Har),7.45(br,1H,H‐8).

Die analytischenDaten stimmenmit denVergleichsdaten aus

Abschnitt7.2.1.1undderLiteraturüberein.[277]

7.2.2.3.5 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Hydroxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(141)

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.Zu3‐Hydroxybenzylamin (138, 1.0mmol,123.8mg)werden

Malonsäurediethylester (9, 1.0mmol, 162.5mg) und CAL‐B (40mg/mmol, 40mg) gegeben und bei

80°C für 4.5h gerührt. Die Aufreinigung erfolgtmittels Säulenchromatographie (Laufmittel: CHCl3/

Aceton3:2).DasProduktwirdalsfarbloserFeststofferhalten.


167

Umsatz:38%,Ausbeute:35%+17%(136).

1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.26(t,3J=7.5Hz,3H,

H‐14),3.36(s,2H,H‐11),3.80(s,3H,H‐7),4.18(q,3J=7.0

Hz,2H,H‐13),4.46(d,3J=5.5Hz,2H,H‐8),6.75–6.81(m,

3H,Har),7.18(t,3J=7.5Hz,1H,Har),7.61(br,1H,H‐7).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.07 (C‐14), 41.12 (C‐11),

43.66 (C‐8), 61.89 (C‐13), 114.80 (C‐3), 114.96 (C‐1),

119.31 (C‐4), 129.94 (C‐4), 139.18 (C‐6), 156.91 (C‐2),

166.03(C‐10),169.42(C‐12).

IR (ATR): (cm‐1) = 3291.6, 2980.8, 2358.9, 1720.8, 1646.4, 1588.9, 1541.5, 1455.3, 1368.9, 1330.2,

1194.0,1154.6,1020.6,946.9,866.2,780.6,731.5,694.3.

MS(ESI):m/z(%)=260.0(100)[M+Na]+,497.1(52).

EA(C13H16NO3):berechnetC:60.75%,H:6.37%,N:5.90%;gefunden;C:59.24%,H6.86%,N:5.83%.


7.2.2.3.6 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Bromobenzyl)‐N‐ethylmalonamid(145)

Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Brombenzylamin (140, 2.5 mmol, 468.5mg) werden

Malonsäurediethylester(9,2.5mmol,404.1mg)undCAL‐B(40mg/mmol,200mg)gegebenundbei

80°C für 4.5 h gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel:

CHCl3/Aceton85/15).DasProdukt137wirdinFormvonkristallinenNadelnerhalten.

Umsatz:95%,Ausbeute:81%.


H‐13),3.37(s,2H,H‐10),4.20(q,3J=7.0Hz,2H,H‐12),4.46

(d,3J=6.0Hz,2H,H‐7),7.18–7.23(m,2H,Har),7.39–7.44

(m,2H,Har),7.55(br,1H,H‐8).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.19 (C‐13), 41.07 (C‐10),

42.97 (C‐7), 61.86 (C‐12), 122.85 (C‐2), 126.39 (C‐5),

130.37(C‐3+C‐4),130.76(C‐1),140.43(C‐6),165.17(C‐9),

169.72(C‐11).

IR (ATR): (cm‐1) = 3234.5, 3059.8, 2973.5, 2360.5, 2341.5, 1745.7, 1635.4, 1551.8, 1416.9, 1329.3,

1275.8,1234.8,1143.8,1071.7,1030.9,994.6,786.5,683.5.

MS(ESI):m/z(%)=322.0(95),324.0(100)[M+Na]+,393.3(4),437.2(6).

EA(C13H16NO3):berechnetC:48.02%,H:4.70%,N:4.67%;gefunden:C:47.71%,H4.79%,N:4.67%.


NH

141C12H15NO4

M = 251.28 g/mol

1

2

3

4

5

67

8

9

1011

12

13HO

O

O

O

14

NH

145C13H16BrNO3

M = 314.18 g/mol

1

2

3

4

5

6

7

8

910

11

12

13

BrO

O

O


168

7.2.2.3.7 SynthesevonN‐(m‐Methoxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(143)

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.Zu3‐Methoxybenzylamin(139,2.5mmol,345.5mg)werden

Malonsäurediethylester (9, 2.5mmol,403.4mg)undCAL‐B (40mg/mmol,200mg)gegebenundbei

80°C für 4.5h gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel:

CHCl3/Aceton85/15).DasProdukt138wirdinFormvonkristallinenNadelnerhalten.

Umsatz:95%,Ausbeute:84%.


H‐14),3.36(s,2H,H‐11),3.80(s,3H,H‐7),4.20(q,3J=7.0

Hz,2H,H‐13),4.46(d,3J=5.5Hz,2H,H‐8),6.81–6.84(m,

2H,Har),6.87–6.88(d,3J=7.5Hz,1H,Har),7.25(t,3J=8.0

Hz,2H,Har),7.55(br,1H,H‐7).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.18 (C‐14), 41.20 (C‐11),

43.65 (C‐8), 55.37 (C‐7), 61.76 (C‐13), 113.08 (C‐1),

113.43 (C‐3), 120.03 (C‐5), 129.88 (C‐4), 139.58 (C‐6),

160.00(C‐2),165.01(C‐10),169.70(C‐12).

IR (ATR): (cm‐1) = 3229.5, 3056.8, 2978.2, 2361.0, 2341.5, 1748.1, 1635.5, 1597.8, 1553.4, 1453.1,

1325.2,1276.3,1134.6,1037.7,879.5,792.2,737.6,669.9,570.0.

MS(ESI):m/z(%)=322.0(95),324.0(100)[M+Na]+,393.3(4),437.2(6).

EA(C13H17NO4):berechnetC:62.14%,H:6.82%,N:5.57%;gefunden;C:61.96%,H7.04%,N:5.63%.


7.2.2.3.8 BestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester(9)

ZurBestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester(9)währendderAuf‐

arbeitungwirdeinebekannteMenge derSubstanzenübereinenbestimmtenZeitraumbei230bzw.

550mbarund40°Cgerührt.DurchAuswaagewirdderVerlustderSubstanzenbestimmt.DieErgeb‐

nissesindinTabelle42aufgelistet.

NH

143C13H17NO4

M = 251.28 g/mol

1

2

3

4

5

67

8

9

1011

12

13O

O

O

O

14


169

Tabelle42. Bestimmung des Verlusts von Benzylamin (134) und Malonsäurediethylester (9)währendderAufarbeitung.

Eintrag SubstanzZeit

[min]

Verlust[mg] Verlust[%] Verlust[mg] Verlust[%]

230mbar 550mbar

1 134 0 0 0 0 0

2 134 15 1.1 10 0 0

3 134 30 1.8 17 0.5 3

4 134 60 2.9 28 1.2 7

5 134 120 7.2 69 2.1 12

6 9 0 0 0 0 0

7 9 15 0.4 1 0.1 0

8 9 30 0.7 2 0.1 0

9 9 60 1.3 3 0.5 1

10 9 120 4.0 9 0.9 2

7.2.2.3.9 AllgemeineArbeitsvorschrift7(AAV7):Kontrollederchemischen

ParallelreaktionderAcylierungverschiedenerBenzylamine

ZusubstituiertemBenzylamin(134,139bzw.140,0.25‐0.5mmol)wirdMalonsäurediethylester(9,

1Äq.)gegebenundbei80°Cfür4.5hgerührt.EswirdanalogderAAV6filtriert,mitDCMundMTBE(je

10–40mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektro‐

skopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle43aufgelistet.

Tabelle43. ParallelablaufendechemischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.

Eintrag Amin UmsatzAmid[%] UmsatzDiamid[%]

1 134 0 0

2 140 7 0

3 139 8 2


170

7.2.2.3.10 UntersuchungenzurDiamidbildungausgehendvon3‐Methoxybenzylamin(139)

Zu3‐Methoxybenzylamin(139,0.1mmol)werdenanalogderAAV2Malonsäurediethylester(9,0.6–

1.5mmol)undCAL‐B(40mg/mmol)zugegebenundfür4.5hbei80°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgt

analogderAAV6.DieUmsätzewerdenmittels1HNMR‐Spektroskopieermittelt.DieErgebnissewerden

inTabelle44aufgelistet.

Tabelle44. Untersuchungen zurBildungdesDiamids144 bei der enzymatischenAcylierung von3‐Methoxybenzylamin(139).

EintragMalonsäurediethylester(9)

[mmol]UmsatzAmid143

[%]

UmsatzDiamid144

[%]

1 0.6 53 32

2 1.0 91 9

3 1.2 84 3

4 1.5 79 1

7.2.2.3.11 LösungsmitteleffektderenzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine

Die enzymatischeAcylierung substituierter Benzylamine (0.5mmol)mitMalonsäurediethylester (9,

1Äq.)undLipaseCAL‐B(40mg/mmol)wurdebeiunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.

DieSynthesemitanschließenderAufarbeitungerfolgteanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle

45aufgelistet.


171

Tabelle45. EinleitendeVersuchezurProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine.

Eintrag Amin T[°C] t[h] Solvens logP Umsatz[%]

1 140 60 4.5 1,4‐Dioxan ‐1.10a)/‐0.30

75

2 140 60 4.5 n‐Heptan 4.50b) 76

3 140 60 4.5 ‐ ‐ 91

4 139 60 4.5 ‐ ‐ 93

5 138 80 4.5 MTBE 0.94b) 51

6 138 80 4.5 THF 0.46b) 75

7 138 80 4.5 2‐Me‐THF 1.00c) 70

8 138 80 4.5 MeCN ‐0.34b) 43

9 138 80 4.5 i‐PrOH 0.28b) 22

10 138 60 4.5 n‐Heptan 4.50b) 45

11 138 60 4.5 EtOAc 0.73b) 41

12 138 60 4.5 Malonester 9(100Äq.) 0.90c) 50

13 138 60 4.5 Et2O 0.89b) 30

14d) 138 RT 24 Et2O 0.89b) 30

15 138 RT 24 EtOH ‐0.24a) 5Datenentnommenaus:a)LAANEetal.[175];b)SANGSTERetal.[177];c)BestimmtdurchAdvancedChemistryDevelopment(ACD/Labs)SoftwareV11.02[263];d)Zugabevon1.5ÄquivalentenMalonsäurediethylester(9).

7.2.2.4 EnzymatischenRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)

7.2.2.4.1 Standardreaktion:Racematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

Malonsäurediethylester(9)

Abbildung140. Racematspaltungvonrac‐4mitMalonester9.

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,5.0mmol,604.1mg)werden

Malonsäurediethylester(9,5.1mmol,810.6mg)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundfür4.5hbei


172

80°C und 200 rpm gerührt (Abbildung 140). Die Aufarbeitung erfolgt analog der AAV6. Durch

AufreinigungmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc2:1)wirddasProduktrac‐10als



1H‐NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.28 (t, 3J = 7.0 Hz, 3H,

H‐14),1.51(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),3.31(d,3J=5.0Hz,2H,H‐11),

4.19(q,3J=7.5Hz,2H,H‐13),5.15(qui,3J=7.0Hz,1H,H‐7),7.24

–7.28(m,1H,Har),7.31‐7.36(m,5H,Har),7.47(m,1H,H‐8).

HPLC:AD‐H‐Säule,95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm, flow:


DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteratur

undinAbschnitt7.2.2.1.1angegebenenWertenüberein.[279]

7.2.2.4.2 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4

Die enzymatische Racematspaltung von 1‐Phenylethylamin (rac‐4) mit Malonsäurediethylester (9,

1Äq.) und Lipase CAL‐B (40 mg/mmol) wurde in Analogie zu AAV 6 mit unterschiedlichen

Reaktionsbedingungen untersucht. Die Synthese erfolgte analog der AAV 6. Die Ergebnisse sind in



Eintrag T[°C] t[h] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%] a) E

1b) 80 4.5 42 92 67 48

2 80 4.5 46 96 82 >100

3 60 4.5 42 97 70 >100

4 60 8 46 89 76 39

5 60 24 50 94 94 >100

6c) 40 4.5 45 99 81 >100

7 40 6 46 85 72 27

8 20 4.5 41 90 63 36

9c) 0 4.5 24 99 n.b. >100a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258];b)Zugabevon0.4mLMTBE;c)präperativeDurchführungderVersuchedurchT.Geisler.


173

7.2.2.4.3 UntersuchungderParallelreaktionderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)

DieSynthesenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)wird

Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbeiRT–60°Cfür4.5hgerührt.Eswird,analogderAAV

6,filtriert,mitDCMundMTBE(je10mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatz

wirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle47aufgelistet.

Tabelle47. NegativkontrollederRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).

Eintrag T[°C] Umsatzrac‐10[%]

1 60 0

2 40 0

3 RT 0


Enzymbeladung

Abbildung141. Enzymatische Racematspaltung von rac‐4 mit Malonsäurediethylester (9) beigeringererEnzymbeladung.[264]

Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 0.49 mmol, 59.8 mg) werden Malonsäurediethylester (9, 0.49 mmol,

79.1mg)undCAL‐B(2mg/mmol,1mg)gegebenundfür24hbeiRTund200rpmgerührt.[264]Das

EnzymwirdabfiltriertundanalogderAAV6mitDCMundMTBE(je10mL)gespült.DieLösungsmittel

werdeni.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.

Umsatz:25%.

HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(CO2/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=21.38min(R),34.97min(S),

ee‐Wert:>95%.


174


EnzymbeladunginEt2O

Abbildung142. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4beigeringererEnzymbeladunginEt2O.[30]

Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,1.25–2.5mmol)werdenderentsprechendeEster9oder111(1.5Äq.)

undCAL‐B(10mg/mmol)gegebenundinEt2O(5–10mL)für24hbeiRTgerührt(Abbildung142).[30]

Das Enzym wird abfiltriert und analog der AAV 6 mit DCM und MTBE (je 10 mL) gespült. Die

Lösungsmittelwerdeni.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Die


Tabelle48. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitgeringererEnzymbeladunginEt2O.[30]

Eintrag Ester Umsatz[%] ee[%] E

1 9 48 95 >100

2 111 52 95 >100

7.2.2.5 Enzymrecycling

Das Enzymrecycling wird analog der AAV 6 durchgeführt. Dazu werden 1‐Phenylethylamin (rac‐4,

5mmol)undMalonsäurediethylester(9,5mmol)zusammenmitderCAL‐B(40mg/mmol)für4.5hbei

60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DiezurückerhalteneCAL‐Bwirdgetrocknet

undimnächstenZykluseingesetzt.DieErgebnissesindinTabelle49aufgelistet.


175

Tabelle49. Enzymrecycling.

Eintrag Zyklus Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 1 43 90 68 39

2 2 30 81 35 13

3 3 25 87 n.b. 19

4 4 20 90 n.b. 26

5b) 5 24 94 n.b. 45a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258];b)Reaktionsdauer:6,5h;n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.6 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonAminen

7.2.2.6.1 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonBenzylamin(134)

Das Screeningwird analog derAAV6 durchgeführt.DazuwerdenBenzylamin (134, 0.5mmol) und

Malonsäurediethylester(9,0.5mmol)zusammenmitderjeweiligenLipase(20mg)inMTBE(0.3mL)

für3hbei60°CineinemThermomix‐Schüttlerbei300rpmgeschüttelt.DieAufarbeitungerfolgtanalog

derAAV6.DieErgebnissesindinTabelle50aufgelistet.

Tabelle50. Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvonBenzylamin(134).

Eintrag

Lipase

Umsatz

Amid133

[%]

Umsatz

Diamid137

[%]

Gesamtumsatz

[%]

1 CAL‐B(Novozym435) 89 10 >99

2 Toyobo 11 3 14

3 Hogpancreas(FLUKA) 12 3 15

4 L„AMANO“5 17 6 20

5 Rhizopusniveus(FLUKA) 6 1 7

6 L.P.L.„AMANO“100S 6 1 7

7 GC„AMANO“4 22 10 32

8 R„AMANO“10 19 9 28

9 AY„AMANO“30 17 6 23

10 NConc(AMANO) 6 4 10


176

Eintrag

Lipase

Umsatz

Amid133

[%]

Umsatz

Diamid137

[%]

Gesamtumsatz

[%]

11 AP6(AMANO) 6 1 7

12PSimmob.aufToyonite‐200‐P

(AMANO)15 3 18

13 PSimmob.aufDiatomite(AMANO) 4 <1 5

14 M‐AP10(AMANO) 5 <1 5

15 F‐AP15(AMANO) 6 <1 6

16 R10(AMANO) 12 1 13

17 CE„AMANO“5 18 7 25

18 D„AMANO“20 22 11 33

19 AK„AMANO“ 13 3 16

20 AYS„AMANO“ 8 1 9

21 PS„AMANO“SD 11 3 15

22 CAL‐Bimmob.(C‐LECTA) 89 11 >99

23 CAL‐Blyo.(C‐LECTA) 94 6 >99

7.2.2.6.2 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138)

Das Screening wird analog der AAV 6 durchgeführt. Dazu werden 3‐Hydroxybenzylamin (138,

0.1mmol) und Malonsäurediethylester (9, 0.1mmol) zusammen mit der jeweiligen Lipase

(40mg/mmol,4mg)inMTBE(0.3mL)für3hbei60°CineinemThermomix‐Schüttlerbei300rpm

geschüttelt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle51aufgelistet.

Tabelle51. Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138).

Eintrag Lipase

Umsatz

Amid141

[%]

Umsatz

Diamid142

[%]

Gesamtumsatz

[%]

1 CAL‐B(Novozym435) 52 12 60

2 L„AMANO“5 0 0 0

3 GC„AMANO“4 0 0 0

4 CE„AMANO“5 0 0 0

5 R„AMANO“10 0 0 0

6 D„AMANO“20 0 0 0

7 AY„AMANO“30 0 0 0

8 PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)

47 0 47


177

Eintrag Lipase

Umsatz

Amid141

[%]

Umsatz

Diamid142

[%]

Gesamtumsatz

[%]

9 BSA 0 0 0

10 CAL‐Bimmob.(C‐LECTA) 44 3 47

11 CAL‐Blyo.(C‐LECTA) 18 <1 18

7.2.2.6.3 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)

DieSynthesenwerdennachAAV6durchgeführt.Dafürwerden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.1mmol)

und Malonsäurediethylester (9, 0.1mmol) zusammen mit der jeweiligen Lipase (4 mg) in MTBE

(0.3mL) für3hbei60 °C ineinemThermomix‐Schüttlerbei300 rpmgeschüttelt.DieAufarbeitung

erfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle16aufgelistet.DieErgebnissesindinTabelle52

aufgelistet.

Tabelle52. Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4).

Eintrag Lipase Umsatz[%]

1 CAL‐B(Novozym435) 46

2 L„AMANO“5 0

3 GC„AMANO“4 0

4 CE„AMANO“5 0

5 R„AMANO“10 0

6 D„AMANO“20 0

7 AY„AMANO“30 0

8 PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO) <1

9 CAL‐Bimmob.(C‐LECTA) 45

10 CAL‐Blyo.(C‐LECTA) 13


178

7.2.2.7 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitalternativen

LipasenCAL‐BvonC‐LECTA

7.2.2.7.1 AllgemeineArbeitsvorschrift9(AAV9):VergleichderAktivitätvonLipasenvon

C‐LECTAmittelsTitrationmitNaOH

ZurBestimmungderEnzymaktivitätwirdPuffer(KPi,pH7,10mM)mitEssigester5gesättigt,indem

PufferundEsterfür1hbeiRTgerührtundanschließenddiePhasengetrenntwerden.Zunächstwird

alsReferenzdieAktivitätderCAL‐B(Novozym435)bestimmt.AnschließendwerdendiebeidenLipasen

vonC‐LECTA,immobilisiertaufeinemMethacrylat‐Trägersowielyophilisiert,vermessen.Dazuwerden

20mgEnzymin5mLPuffervorgelegtundgegebenenfallsaufdieentsprechendeTemperaturerwärmt.

VorBeginnderMessung istderpH‐WertdesEnzym‐enthaltenenPufferszuprüfenundmithilfeder

wässr.NaOH‐Lösung(0.05M)neueinzustellen.DurchZugabevon5mLdesEtOAc‐ges.Pufferswirddie

Titrationgestartet.Gemessenwird1MinutejedeSekunde,wobeiderVerbrauchanwässr.NaOH‐Lösung

beobachtetunddieAnfangssteigungbestimmtwird.Diesekannamgenauestenbestimmtwerden,wenn

derKurvenverlaufzuBeginnderMessungübermehrereSekundenkonstantist.Gegebenenfallsmuss

dieMengedesimmobilisiertenEnzymsreduziertbzw.dieLösungderlyophilisiertenCAL‐Bverdünnt

unddieMessungentsprechendwiederholtwerden.FürdieBerechnungderEnzymaktivitätwirddie

AnfangssteigungderTitrationmitwässr.NaOH‐Lösung(0.1M)verwendet.DieBerechnungderEnzym‐

aktivitäterfolgtnachfolgenderGleichung6:

Gleichung6

U/mg: Enzymaktivität

M: MolaritätderNaOH[µmol/mL]

: AnfangssteigungdesKurvenverlaufs[mL/sec]

f: Umrechnungsfaktor[sec/min]

m: MengederLipasein5mLPuffer[mg]

IndieserArbeitsindM=50µmol/mLundf=60sec/min.

7.2.2.7.2 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenvonC‐LECTAmittels

enzymatischerSpaltungdesEssigesters5bei20°C

Die Spaltung des Essigesters 5 zu Essigsäure und Ethanol mit der immobilisierten sowie der

lyophilisiertenCAL‐BvonC‐LECTAwirdanalogderAAV7bei20°Cdurchgeführt.AlsReferenzdientdie

CAL‐BvonSIGMAALDRICH(Novozym435).DiefürNovozym435erhalteneAktivitätvon855U/gwirdals


179

100%definiertunddiejeweilsgemessenenAktivitätenderLipasenwerdenaufdiesenWertbezogen.

DieErgebnissesindinTabelle53aufgelistet.


Eintrag LipaseEnzym

[mg/mmol]

Steigung

[mL/sec]

Aktivität

[U/mg]

Rel.Aktivität

[%]

1 Novozym435 20 0.0057 0.855 100

2 C‐LECTAimmobilisiert 20 0.0039 0.585 68

3 C‐LECTAlyophilisiert 1 0.0057 17.100 2000

7.2.2.7.3 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenmittelsenzymatischerSpaltung

desEssigesters5bei60°C

Die Spaltung des Essigesters 5 zu Essigsäure und Ethanol mit der immobilisierten sowie der lyo‐

philisiertenCAL‐BvonC‐LECTAwirdanalogderAAV5bei60°Cdurchgeführt.AlsReferenzdientdie

CAL‐B von SIGMA ALDRICH (Novozym435). Die für CAL‐B Novozym 435 bestimmte Aktivität von

3.180U/mgwirdals100%definiertunddiejeweilsgemessenenAktivitätenderLipasenwerdenauf

diesenWertbezogen.DieErgebnissesindinTabelle54aufgelistet.


Eintrag LipaseEnzym

[mg/mmol]

Aktivität

[U/mg]

Rel.Aktivität

[%]

1 Novozym435 20 3.180 100

2 C‐LECTAimmobilisiert 20 2.190 69

3 C‐LECTAlyophilisiert 1 31.800 1000


180

7.2.2.7.4 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐Bvon

C‐LECTA

NachderAAV6werden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)undMalonsäurediethylester(9,0.5mmol)

zusammenmit immobilisierterCAL‐BvonC‐LECTA(2.190U/mg,29.0mg)undMTBE(0‐0.5mL)für

4.5hbei60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieErgebnissesindinTabelle55

aufgelistet.

Tabelle55. Enzymkatalysierte Racematspaltung von rac‐4 mittels immobilisierter CAL‐B vonC‐LECTA.

Eintrag MTBE[mL] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%]a) E

1 0 52 96 96 194

2 0.5 49 84 81 28a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258].

7.2.2.7.5 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐Bvon

C‐LECTA

NachderAAV6werden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)undMalonsäurediethylester(9,0.5mmol)

zusammenmitlyophilisierterCAL‐BvonC‐LECTA(31.8U/mg,2‐10mg)für4.5‐24hbei20‐60°C

gerührt.GegebenenfallserfolgtnocheineZugabevonMTBE(0–0.5mL)unddest.Wasser(10µL).Es

erfolgtkeineweitereAufarbeitung.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Vorder

Bestimmungdesee‐WertesmittelsHPLCwirddielyophilisierteCAL‐BmittelsSpritzenfilterabfiltriert.

DieErgebnissesindinTabelle56aufgelistet.


181

Tabelle56. EnzymkatalysierteRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.

Eintrag CAL‐B[mg] T[°C] t[h] Umsatz [%] ee[%] E

1 2 60 4.5 9 81 10

2 10 60 4.5 26 91 29

3 2 60 24 19 74 8

4 2 20 24 6 80 10

5a) 2 60 4.5 7 87 2

6b) 2 60 4.5 6 n.b. n.b.a)Zugabevon0.5mLMTBE;cb)Zugabevon10µLdest.Wasser;n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.8 VariationderAcyldonoren

7.2.2.8.1 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren

Abbildung143. Vergleich von alternativenAcyldonorendurch enzymatischeRacematspaltung vonrac‐4.

Der Vergleich der alternativenAcyldonoren erfolgt analog der AAV 6. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4,

0.5mmol)wirdder entsprechendeAcyldonor (1Äq.) gegeben und bei RT – 60 °C für 4.5 h gerührt

(Abbildung 143). Die Aufarbeitung erfolgt nach der AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐

Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle57aufgelistet.


182

Tabelle57. VergleichderalternativenAcyldonorenmittelsRacematspaltungvonrac‐4.

Eintrag Acyldonor T[°C] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%]a) E

1 122 60 51 65 68 9

2 122 40 49 67 64 10

3 147 60 15 53 n.b. 4

4 147 40 4 n.b. n.b. n.b.

5 111 60 25 92 n.b. 33

6 111 40 31 82 37 14

7 111 RT 29 71 30 8

8b) 111 RT 51 87 91 45

9 124 60 45 10 8 1

10 124 40 40 11 7 1

11c) 125 60 16 10 n.b. 1

12c) 125 40 17 22 n.b. 2a)bestimmtmittels„Enantioselectivity“[258];b)Reaktionszeitt=24h,nachAAV4:CAL‐B=10mg/mmol,Et2O=4mL/mmol;c)Zugabevon0.5mLMTBE;n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.8.2 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitunterschiedlichen

Acyldonoren

Abbildung144. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren.

DieReaktionenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)wird

derentsprechendeAcyldonor(1Äq.)gegebenundbeiRT‐60°Cfür4.5hgerührt(Abbildung144).Der

Umsatzwird,ohnevorherigeAufarbeitung,mittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnisse

sindinTabelle58aufgelistet.


183

Tabelle58. ParallelablaufendeAcylierungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren.

O

OO

O

ON

O

O

O

O

O

OO

122

124

147

125

111

Eintrag Acyldonor T[°C] Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 122 60 0 ‐ ‐ ‐

2 122 40 0 ‐ ‐ ‐

3 147 60 0 ‐ ‐ ‐

4 147 40 0 ‐ ‐ ‐

5 111 60 2 n.b. n.b. n.b.

6 111 40 0 ‐ ‐ ‐

7 124 60 33 3 1 1

8 124 40 12 5 n.b. 1

9 125 60 93 0 13 1

10 125 40 81 0 4 1a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.8.3 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenMalonsäure‐

diethylester(9,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.Die

AufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle59aufgelistet.

Tabelle59. KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).

Eintrag t[min] Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 1 15 97 n.b. 78

2 5 26 95 n.b. 54

3 10 30 94 40 48

4 20 32 95 45 61

5 30 33 97 48 >100


184

Eintrag t[min] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%]a) E

6 45 36 97 55 >100

7 60 37 98 58 >100

8 120 41 97 67 >100

9 180 46 98 83 >100

10 270 43 96 70 >100

11 480 45 89 73 37

12 1440 49 98 94 >100

a)Bestimmtmittels„Enantioselectivity“[258];n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.8.4 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigsäureethylester(122)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenPhenoxy‐

essigsäureethylester (122,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°C für1min–24h

gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle60aufgelistet.

Tabelle60. KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigester122.

Eintrag t[min] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%]a) E

1 1 30 79 34 12

2 5 43 74 56 12

3 10 41 73 51 11

4 20 42 71 51 10

5 30 47 71 63 11

6 45 49 64 61 8

7 60 50 62 62 8

8 120 52 64 69 9

9 180 51 65 67 9

10 270 57 68 90 16

11 480 51 69 72 12

12 1440 56 61 78 9a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt.


185

7.2.2.8.5 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigsäureethylester(124)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenCyanessig‐

säureethylester(124,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.

DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle61aufgelistet.

Tabelle61. Kinetik der enzymatischen Racematspaltung von rac‐4 mit Cyanessigsäureethylester(124).

Eintrag t[min] Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 1 21 2 n.b. 1

2 5 27 4 n.b. 1

3 10 18 2 n.b. 1

4 20 20 4 n.b. 1

5 30 21 3 n.b. 1

6 45 29 2 n.b. 1

7 60 27 7 n.b. 1

8 120 29 0 n.b. 0

9 180 41 10 7 1

10 270 48 10 9 1

11 480 51 12 12 1

12 1440 65 2 4 1a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt

7.2.2.8.6 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester(111)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenMethoxy‐

essigsäureethylester(111,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°C für1min–24h

gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle62aufgelistet.


186

Tabelle62. KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester(111).

Eintrag t[min] Umsatz[%] ee[%] E

1 1 16 72 7

2 5 17 74 8

3 10 17 76 9

4 20 16 77 9

5 30 18 79 9

6 45 19 78 10

7 60 18 78 10

8 120 24 79 11

9 180 19 72 7

10 270 22 92 31

11 480 27 77 10

12 1440 33 83 16

7.2.2.9 1‐Aminoindan(rac‐130)alsSubstrat

7.2.2.9.1 AnalysedesDiamidsN1,N3‐bis(2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)malonamid(129)

Abbildung145. BildungdesDiamids131alsNebenprodukt.

Bei derReaktiondes1‐Aminoindans (rac‐130)mitMalonsäurediethylester (9, 1Äq.) alsAcyldonor

analogderAAV6entstehtdasgewünschteIndan‐Amid(rac‐129,Abbildung145).AlsNebenprodukt

wirddabeidasentsprechendeDiamid131erhalten,welchesdurchSäulenchromatographie(Laufmittel:

CH/EtOAc1:4)isoliertwerdenkann.DasDiamid131wirdalsfarbloserFeststofferhalten.


187


1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.89(m,2H,H‐2

+H‐22),2.57(m,2H,H‐1+H‐23),2.90(m,2H,H‐2+

H‐22), 3.02 (m, 2H,H‐1+H‐23), 3.27 (s, 2H,H‐12),

5.14(q,3J=7.8Hz,2H,H‐9+H‐15),7.21–7.31(m,8H,

Har),(t,3J=7.5Hz,2H,H‐10+H‐14).

13C‐NMR(500MHz,CDCl3):30.36(C‐2+C‐22),33.82

(C‐1+C‐23),43.31(C‐12),54.90(C‐9+C‐15),124.11

(C‐4+C‐20),124.89(C‐5+C‐19),126.86(C‐6+C‐18),

128.11(C‐7+C‐17),142.81(C‐8+C‐16),143.41(C‐3+C‐21),167.24(C‐11+C‐13).

MS(ESI):m/z(%)=357.2(100)[M+Na]+,691.2(30)[2M+Na]+.



7.2.2.9.2 BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitung

ZurBestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitungwerden49.6mg

derSubstanzeingewogenundübereinenbestimmtenZeitraumbei550mbargerührt.DurchAuswaage

wirdderVerlustvonrac‐130bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle63aufgelistet.

Tabelle63.BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitung.

Eintrag Zeit[min] Verlustrac‐130[mg] Verlustrac‐130[%]

1 0 0 0

2 5 0.33 0.7

3 10 1.12 2.3

4 15 1.44 2.9

7.2.2.9.3 Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvon

1‐Aminoindan(rac‐130)

Die enzymatischeRacematspaltungvon1‐Aminoindan (rac‐130)mitMalonsäurediethylester (9,1–

5Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungen

untersucht.DieSyntheseerfolgteanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle64dargestellt.


188

Tabelle64. Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐130.

Eintrag 9(Äq.) T[°C] t[h] Umsatz[%] eeP [%] eeS [%]a) E

1 1 80 4.5 39 73 47 10

2 1 80 24 42 97 70 >100

3 1 60 4.5 49 79 79 20

4 1 60 24 44 98 77 >100

4 1.5 60 4.5 49 91 87 61

5b) 5 60 24 63 76 n.b. 12

6b) 1 60 4.5 46 70 60 10

7b) 1 60 24 52 83 92 40

8 1 40 24 50 90 90 58

9 1 RT 4.5 43 67 51 8

10 1 RT 24 45 54 44 5a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];b)Zugabevon0.2mLMTBE;n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.9.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Aminoindan(rac‐130)

DieSynthesenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.Zu1‐Aminoindan(rac‐130,0.22mmol)wird

Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbeiRT–60°Cfür4.5–24hgerührt.Eswird,analogder

AAV6, filtriert,mitDCMundMTBE(je10mL)gewaschenunddieLösungsmittel i.Vak.entfernt.Der

Umsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle65aufgelistet.



1 80 24 8

2 80 4.5 4

3 60 24 9

4 60 4.5 3

5 RT 24 1


189

7.2.2.10 SekundäreAminealsSubstrate

7.2.2.10.1 BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149bzw.150

Zur Bestimmung des Verlusts von 2‐Methyl‐ bzw. 3‐Methylpiperidin (149 bzw. 150) während der

Aufarbeitung werden 43.7 bzw. 41.2 mg der Substanzen eingewogen und über einen bestimmten

Zeitraum bei 550 mbar gerührt. Durch Auswaage wird der Verlust der Substanzen bestimmt. Die


Tabelle66. BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149und150.

Eintrag Amin Rührzeit[min] Verlust[mg] Verlust [%]

1 149 5 9.2 21

2 149 10 18.7 43

3 149 15 28.2 64

4 150 5 2.6 6

5 150 10 6.0 15

6 150 15 11.1 27

7.2.2.10.2 SynthesevonEthyl‐3‐(2‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐151)

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]Zu2‐Methylpiperidin(149,1mmol,99.8mg)wirdDiethyl‐

Malonester (9, 1mmol, 161.2mg) gegebenund für 3 h bei 180°C erhitzt.DerUmsatzwirdmittels

1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Produkt rac‐151 wird mittels Säulenchromatographie (Lauf‐

mittel:EtOAc)isoliert.



–1.30(t,3J=7.0Hz,3H,H‐11),1.35–1.47(m,2H,H‐3),1.52–1.69

(m,2H,H‐2),2.69(td,3J=13.5Hz,1H,H‐4),3.16(td,3J=13.5Hz,1H,

H‐4),3.43(s,2H,H‐8),3.48(m,1H,H‐5),4.19(q,3J=7.0Hz2H,H‐10),

4.49(m,1H,H‐1),4.90(m,1H,H‐1).

13C‐NMR (500MHz, CDCl3): 14.22 (C‐11), 18.66 (C‐6), 25.46 (C‐3),

26.13(C2),29.71(C‐4),36.68(C‐8),41.96(C‐1),61.41(C‐10),164.46

(C‐9),167‐96(C‐7).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8mL/min, tR=18.29 min (R),

19.68min(S),ee‐Wert:0%.


190

IR (ATR): (cm‐1) = 2935.4, 2864.0, 2357.9, 1733.0, 1634.9, 1437.3, 1367.5, 1319.5, 1239.4, 1149.7,

1032.0,850.0,608.6.

MS(ESI):m/z(%)=236.0(100)[M+Na]+,277.1(10),449.2(23)[2M+Na]+.

EA(C14H17NO3):berechnetC:61.95%,H:8.98%,N:6.57%,O:22.50%;gefunden:C:61.08%,H:8.99%,

N:6.47%,O:23.46%.

DiespektroskopischenDatensindlautSciFinderinderLiteraturbeschriebenworden.[280]

7.2.2.10.3 SynthesevonEthyl‐3‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐152)

Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 3‐Methylpiperidin (150, 1 mmol, 99.6 mg) wird

Malonsäurediethylester(9,1mmol,159.8mg)gegebenundfür3hbei180°Cerhitzt.DerUmsatzwird

mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Rohprodukt wird mittels Säulenchromatographie

(LaufmittelCH/EtOAc1:4)aufgereinigtumdasisolierteProduktzuerhalten.



–1.18(m,1H,H‐11),1.40–1.73(m,2H,H‐3),1.80–1.84(m,1H,H‐2),

2.30(dd,3J=12.5Hz,10,5Hz,1H,H‐4),2.62(td,3J=12.5Hz,3.0Hz,

1H,H‐4),2.69(dd,3J=13.5Hz,10.5Hz,1H,H‐4),2.97–3.03(m,1H,

H‐8),3.55–3.66(m,1H,H‐5),4.38–4.45(m,1H,H‐1).

13C‐NMR (500MHz, CDCl3): 14.26 (C‐11), 18.93 (C‐6), 21.11 (C‐2),

24.74(C‐4),30.90(C‐3),32.89(C‐8),41.52(C‐1),54.00(C‐5),60.44

(C‐10),164.20(C‐7),171.19(C‐9).

HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=19.11min(R),21.01min

(S),ee‐Wert:0%.

IR (ATR): (cm‐1) = 2929.0, 2852.3, 2360.1, 2341.4, 1733.0, 1603.5, 1440.1, 1366.8, 1316.8, 1266.2,

1224.5,1157.9,1139.5,1030.7,969.2,851.8,667.6,578.6.

MS(ESI):m/z(%)=214.0(5),236.1(100)[M+Na]+,277.1(3),449.2(97)[2M+Na]+.

DiespektroskopischenDatensindlautSciFinderinderLiteraturbeschriebenworden.[280]

7.2.2.10.4 EnzymatischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)

Abbildung146. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐150.


191

Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Methylpiperidin (150, 0.5 mmol, 47.4mg) werden

Malonsäurediethylester(9,0.5mmol,79.6mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundbei60°C

für 24 h erhitzt. Die Aufarbeitung erfolgt analog zur AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐

Spektroskopiebestimmt.

Umsatz:15%.


(S),ee‐Wert:10%.

DieanalytischenDatenstimmenmitdenVergleichsdatenausAbschnitt7.2.2.10.3überein.

7.2.2.10.5 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvon3‐Methylpiperidin

(rac‐150)

DieenzymatischeRacematspaltungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)mitMalonsäurediethylester(9,1

–5Äq.)undLipaseCAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktions‐

bedingungenuntersucht.DieSyntheseerfolgteanalogderAAV6.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐

Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle67dargestellt.


Eintrag MTBE[mL] T[°C] Umsatz[%] eeP [%] eeS[%]a) E

1 ‐ 80 5 10 n.b. <2

2 ‐ 60 15 10 n.b. 1

3 0.1 60 34 13 7 <2

4b) 0.1 60 75 18 54 2

5 ‐ 40 19 11 n.b. <2

6c) ‐ 40 22 10 n.b. <2a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];b)CAL‐B:80mg/mmol;c)Reaktionsdauer:48h,;n.b.=nichtbestimt.

7.2.2.10.6 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150

Die Synthesenwerden analog der AAV 6 durchgeführt. Zu 3‐Methylpiperidin (150, 0.5mmol)wird

Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbei40–80°Cfür24‐48hgerührt.DerUmsatzwird

ohneweitereAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle68

aufgelistet.


192



1 80 24 5 n.b. n.b.

2 60 24 9 <1 1

3 40 48 6 <1 1n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.11 Verwendungvonɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor

7.2.2.11.1 BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3)währendderReaktionund

Aufarbeitung

ɛ‐Caprolacton(3)wirdübereinenZeitraumvon24hbei60°CinAnwesenheitundohneCAL‐Bgerührt.

BeiAbwesenheitvonCAL‐BwirddirekteineNMR‐Probeentnommen.BeimAnsatzmitEnzymerfolgt

zusätzlich eine Aufarbeitung analog AAV 6. Das Verhältnis von ɛ–Caprolacton(3) zum Zersetzungs‐

produkt 6‐Hydroxyhenxansäure (54) wirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse

sindinTabelle69aufgelistet.

Tabelle69. BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3).

Eintrag Bedingungen Verhältnis3/54

1 RührenohneCAL‐B 100:0

2RührenmitCAL‐Bund

AufarbeitungnachAAV61:77


193

7.2.2.11.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)

Abbildung147. EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3).

DieSyntheseerfolgtnachderAAV6.ZuBenzylamin(134,1mmol,105.7mg)werdenɛ–Caprolacton(3,

1mmol,113.7mg)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundfür24hbei60°Cgerührt(Abbildung147).

DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.

Umsatz:>99%.

1H‐NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.38 – 1.44 (m, 2H,

H‐12),1.55–1.60(m,2H,H‐13),1.66–1.72(m,2H,H‐11),

2.23(t,3J=7.5Hz,2H,H‐14),3.63(t,3J=6.5Hz,2H,H‐10),

4.43(d,3J=5.7Hz,2H,H‐7),5.84(br,1H,H‐8),7.28–7.35

(m,5H,Har).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 172.95 (C9), 138.45 (C6),

128.85 (C2 + C4), 127.97 (C1 + C5), 127.66 (C3), 62.68

(C14),43.75(C7),36.69(C10),32.39(C14),25.50(C12),25.40(C13).

IR (ATR): (cm‐1) = 3406.0, 3234.6, 3062..7, 2925.6, 2856.9, 1732.4, 1626.8, 1540.7, 1449.6, 1361.0,

1233.1,1058.3,1025.0,1006.8,989.6,792.1,739.7,708.2,615.6,592.8,508.4.

MS(ESI):m/z(%)=244.0(100)[M+Na]+,358.2(76),425.3(4),465.2(28)[2M+Na]+,579.1(4).

EA(C14H17NO3):berechnetC:68.00%,H:6.93%,N:5.66%;gefunden:C:61.23%,H:8.96%,N:6.83%.


7.2.2.11.3 VariationderReaktionsbedingungenderenzymatischenAcylierungvon

Benzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)

Die enzymatische Acylierung von Benzylamin (134)mit ɛ‐Caprolacton (3,1Äq.) und Lipase CAL‐B

(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.Die

Synthese erfolgte analog der AAV 6. Der Umsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die

ErgebnissesindinTabelle70dargestellt.


194

Tabelle70. ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonBenzylamin (134)mitɛ‐Caprolacton(3).

Eintrag MTBE[mL] T[°C] t[h] Umsatz[%]

1 0 80 4.5 51

2 0.5 80 4.5 65

3 0 RT 4.5 57

7.2.2.11.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mit

ɛ‐Caprolacton(3)

DieSynthesenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.ZuBenzylamin(134,0.5mmol)wirdɛ‐Capro‐

lacton (3, 1 Äq.) gegeben und bei verschiedenen Temperaturen und Reaktionszeiten gerührt. Der

UmsatzwirdohneweitereAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesind

inTabelle71aufgelistet.

Tabelle71. ParallelablaufendeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ–Caprolacton(3).


1 80 4.5 30

2 60 4.5 69

3 RT 4.5 12

4 RT 24 53

5 0 4.5 3


195

7.2.2.11.5 Synthesevon6‐Hydroxy‐N‐(1‐phenylethyl)hexanamid(157)

Abbildung148. Synthesevon157ausgehendvonrac‐4.[253]

Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 2.5mmol, 303.4mg)wird

ɛ‐Caprolacton (3,2.5mmol,288.1mg)gegebenundfür4hauf180°Cerhitzt(Abbildung148).Der

UmsatzwirdohneweitereAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.

Umsatz:62%.

1H‐NMR (500MHz,CDCl3): δ (ppm):1.34–1.42 (m,3H,

H‐13), 1.49 (d, 3J = 6.9Hz, 2H,H‐9), 1.54 – 1.60 (m,2H,

H‐12), 1.61 – 1.71 (m, 2H,H‐14), 2.19 (t, 3J=7.4Hz, 2H,

H‐15),3.63(t,3J=6.6Hz,2H,H‐11),5.14(p,3J=7.2Hz,1H,

H‐7),5.70(br,1H,H‐8),7.25–7.35(m,5H,Har).

HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm,

flow: 0.8 mL/min, tR=32.21 min (R), 39.69 min (S),

ee‐Wert:0%.

DiespektroskopischenDatensindinderLiteraturnichtbekannt.

7.2.2.11.6 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ‐Caprolacton(3)

Abbildung149. EnzymatischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3).

Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 5.0 mmol, 0.61 g) werden

ɛ‐Caprolacton(3,4.9mmol,0.56g)undCAL‐B(40mg/mmol,200mg)gegebenundfür4.5hbei80°C

gerührt (Abbildung 149). Die Aufarbeitung erfolgt analogAAV 6. DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐

Spektroskopiebestimmt.DieAufreinigungerfolgtmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CHCl3/

Aceton7:3).DasProdukt157wirdalsfarbloserFeststofferhalten.


HN

O

157C14H21NO2

M = 235.33 g/mol

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1011

12

13

14OH

1516


196

1H‐NMR (500MHz,CDCl3):δ (ppm):1.36–1.42 (m,3H,

H‐13),1.49(d,3J=6.9Hz,2H,H‐9),1.54–1.60

(m,2H,H‐12),1.64–1.70(m,2H,H‐14),2.19(t,3J=7.4Hz,

2H, H‐15), 3.63 (t, 3J=6.5Hz, 2H, H‐11), 5.14 (p,

3J=7.2Hz,1H,H‐7),5.73(br,1H,H‐8),7.25–7.35(m,5H,

Har).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 21.84 (C‐9), 25.36 (C‐13),

25.42(C‐12),32.33(C‐14),36.70(C‐11),48.73(C‐7),62.50

(C‐15),126.26(C‐1+C‐5),127.41(C‐3),128.73(C‐2+C‐4),143.38(C‐6),172.27(C‐10).


(S),ee‐Wert:0%.

IR (ATR): (cm‐1) = 3270.5, 3062.7, 2929.3, 2859.9, 2360.1, 2341.3, 1731.2, 1540.1, 1448.9, 1374.9,

1277.9,1209.4,1129.5,1051.0,1020.7,908.7,759.6,703.5,539.7.

MS(ESI):m/z(%)=258.1(100)[M+Na]+,493.2(47)[2M+Na]+.

EA(C14H21NO2):berechnetC:70.46%,H:9.00%,N:5.95%,O:16.60%;gefunden:C:70.01%,H:9.27%,

N:5.99%,O:14.73%.

DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeneninAbschnitt7.2.2.11.5überein.

7.2.2.11.7 TemperaturabhängigkeitderenzymatischenAcylierungvon1‐Phenylethylamin

(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)

DieenzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4,1mmol)mitɛ‐Caprolacton(3,1Äq.)und

CAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.

DieSyntheseerfolgteanalogderAAV6.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Die

ErgebnissesindinTabelle72dargestellt.

Tabelle72. ProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).


1 80 4.5 51 0 <1

2a) 80 4.5 49 0 <1

3 60 4.5 41 0 <1

4 60 6 38 0 <1

5 60 8 45 0 <1

6 40 4.5 25 3 1

7 RT 4.5 26 4 1a)Zugabevon0.5mLMTBEnach1h.

HN

O

157C14H21NO2

M = 235.33 g/mol

1

2

3

4

5

6

7

8

9

1011

12

13

14OH

1516


197

7.2.2.11.8 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3)

Die Synthesenwerden analog der AAV 6 durchgeführt. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 1mmol)wird

ɛ‐Caprolacton(3,1Äq.)gegebenundbei0–80°C für4.5hgerührt.DerUmsatzwirdohneweitere

Aufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle73aufgelistet.

Tabelle73. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).

Eintrag T[°C] Umsatz[%] ee[%]

1 80 37 0

2 60 4 n.b.

3 40 2 n.b.

4 RT 1 n.b.

5 0 0 n.b.n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.11.9 ReaktionskinetikderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit

ɛ‐Caprolacton(3)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV11.ZuPhenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenɛ‐Caprolacton

(3,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.DieAufarbeitung

erfolgtanalogderAAV7.DieErgebnissesindinTabelle74aufgelistet.

Tabelle74. KinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).


2 5 2 n.b. n.b.

3 10 3 n.b. n.b.

4 20 7 0 0

5 30 6 <2 1

6 45 7 0 0

7 60 12 0 0


198


8 120 20 0 1

9 180 22 0 1

10 270 41 0 1

11 360 38 0 1

11 480 45 0 1

12 1440 65 0 1n.b.=nichtbestimmt.

7.2.2.11.10 Synthesevon6‐Hydroxy‐1‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)hexan‐1‐on(155)

Abbildung150. ChemischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(150)mitɛ‐Caprolacton(3).[253]

DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.[253]Zu3‐Methylpiperidin(150,1mmol,99.6mg)wirdɛ‐Capro‐

lacton(3,1mmol,115.5mg)gegebenundfür4hbei180°Cgerührt(Abbildung150).DieAufarbeitung

erfolgtanalogAAV6.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.

Umsatz:17%.

1H‐NMR (500MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.90 (d, 3H, 3J=6.7Hz,

H‐6),1.07–1.16(m,3H,H‐10),1.34–1.46(m,H2,H‐3),1.51–

1.71(m,6H,H‐9,H‐11,H2),2.21(t,3J=12.1Hz,2H,H‐8),2.52

– 2.59 (m, 2H, H‐5), 2.93 (t, 3J=12.5Hz, 2H, H‐4), 3.73 (d,

3J=13.6Hz,2H,H‐1),4.39–4.44(m,2H,H‐12).

13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 19.00 (C‐6), 22.45 (C‐2), 24.50

(C‐10), 25.49 (C‐9), 28.31 (C‐4), 31.56 (C‐11), 31.83 (C‐3),

34.03(C‐8),46.61(C‐1),52.31(C‐5),62.05(C‐12).

DC‐MS(ESI):m/z(%)=214.1(99)[M]+,236.2(40)[M+Na]+,427.2(20)[2M]+,449.2(1)[2M+Na]+.

MS(ESI):m/z(%)=236.1(9)[M+Na]+,350.3(100),464.3(59)[2M+K]+,578.3(10).

DiespektroskopischenDatensindinderLiteraturnichtbekannt.

7.2.2.11.11 EnzymatischeAcylierungensekundärerAminemitɛ‐Caprolacton(3)

DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.ZudemAmin(149bzw.150,0.5mmol)werdenɛ‐Caprolacton

(3,0.5mmol,57.3mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundinMTBE(0‐0.1mL)für24hbei


199

60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogAAV6.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopie

bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle75aufgelistet.

Tabelle75. EnzymatischeAcylierungderAmine149und150mitɛ‐Caprolacton(3).

Eintrag Amin MTBE[mL] Umsatz[%]

1 149 0 7

2 150 0 9

3 150 0.1 18

8 Literaturverzeichnis

201


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ɛ–caprolacton und chiralen aminen · biokatalytische synthesen von ɛ–caprolacton und chiralen...

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