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9e Journée scientifique

Vendredi, 29 avril 2016 Salle M-‐415 et Hall d’honneur

Pavillon Roger-‐Gaudry, Université de Montréal

CAHIER DES ABRÉGÉS

9e Journée scientifique du GRUM

Vendredi, 29 avril 2016 Salle M-415 et Hall d’honneur

Pavillon Roger-Gaudry, Université de Montréal

Programme 8:30 – 8:55 Accueil et installation des affiches

8:55 – 9:00 Mot de bienvenue Gerardo Ferbeyre, co-directeur, GRUM 9:00 – 10:30 Présentations orales étudiantes 10:30 – 10:50 Pause santé

10:50 – 11:30 Un mort en phase 1 : retour sur la tragédie chez Biotrial (France, janvier 2016) Denis deBlois, co-directeur GRUM

11:30 – 14:00 Lunch et affiches étudiantes

14:00 – 16:45 CONFÉRENCES

Thème: La bioinformatique en découverte de médicaments Using the Bioinformatics Approaches in Drug Discovery to Predict Microbial and Pathogen Evolution

Adrian Serohijos, Assistant Professor, Department of Biochemistry Robert-Cedergren Center in Bioinformatics & Genomics, Faculty of Medicine, University of Montreal

Chemical Biology Informatic Approaches to Identify and Validate New Therapeutic Targets Peter Kutchukian, Associate Principal Scientist, Cheminformatics at Merck, Boston, Massachusetts Accurate Prediction of microRNA::mRNA Regulatory Networks and Rational Design of Efficient and Safe RNAi-based Therapeutics François Major, Professor, Dept of Computer Science and Operations Research, Principal Investigator, Institute for Research in Immunology and Cancer, University of Montreal

16:45 – 17:00 Remise des prix d’excellence, Mot de la fin

Denis deBlois, co-directeur, GRUM Infos :

Tél.: (514) 343-6111 #3624 [email protected]

(PD=stagiaire postdoctoral)

8:55-‐9:00 9e Journée scientifiqueVendredi, 29 avril 2016Pavillon Roger-‐Gaudry

Étudiant Directeur Titre9:00 -‐9:15 PhD DA COSTA, Élodie N. Raynal9:15 -‐ 9:30 PhD HACHANA, Soumaya E. Vaucher/R. Couture9:30 -‐ 9:45 PD IULITA, Florencia H. Girouard9:45 -‐ 10:00 MSc ZAMORANO, Natalia N. Grandvaux10:00 -‐ 10:15 PD SHRESTHA, Buddha R. X. Banquy10:15 -‐ 10:30 PD WU, Xiaotian F. Nekka/J. Li


10:30 -‐ 10:50 Pause (Hall d'honneur)

10:50 -‐ 11:30

11:30 -‐ 12:30 Lunch (Hall d'honneur)

12:30 -‐ 14:00

Étudiant Directeur Titre1 PhD BOULAHYA, Rahma M. Lordkipanidzé2 MSc JACQUES-‐RICARD, Simon N. Raynal3 PhD SAMAMI, Samaneh G. Mayer4 PhD BENABDOUNE, Houda-‐Abir M.Benderdour5 MSc MANSOUR, Ahmed X. Banquy6 Stag ALARIE, Hugo G. Roullin

7 MSc ABRAHAM, Sarah M. J. J. Pelletier

8 MSc MEDJTOH, Amir M. Bouvier

9 MSc VERSHININ, Maria G. Roullin10 Stag NAVARRO LARA, Eva F. Moldovan/X. Banquy

11 MSc DURETTE, Étienne D. deBlois/M. Bouvier

12 PhD HUYNH, David S. Marleau13 PhD HANNAUER, Nicolas X. Banquy14 PhD HARROUN, Scott A. Vallée-‐Bélisle15 PhD PARADIS, Justine M. Bouvier/P. Roux

PhD DA COSTA, Élodie N. Raynal

Measuring the temperature around an enzyme using DNA thermometersA New Inhibitor of the β-‐arrestin/AP-‐2 Endocytic Complex Reveals Interplay Between GPCR Internalization and Signalling

Évaluation par la technologie BRET de l’interaction moléculaire avec le canal potassique hERG responsable des arythmies ventriculaires médicamenteuses

Nanoplatform drug delivery strategy for osteoarthritis treatment

Developing a screening platform by Surface Plasmon Resonance (SPR) for the characterization and discovery of enzyme inhibitors

Développement d'un test sec pour le phenotypage des plaquettes sanguines

PRÉSENTATIONS ORALES (M-‐415)

Fonction et distribution du récepteur B1 des kinines dans la rétine du rat diabétiqueImpact of arterial stiffness on cognitive and cerebrovascular functions

Cibler l'acétylation des histones dans les sarcomes pédiatriques avec la Proscillardine A

Effective and applicable method of lubrication and wear protection

La précision diagnostique des tests de fonction plaquettaire pour détecter l'effet du clopidogrel

Cibler l'acétylation des histones dans les sarcomes pédiatriques avec la Proscillardine A

Nouvelle thérapie épigénétique avec le disulfiram dans le traitement du neuroblastome pédiatriqueE

Prediction of Complex Cellular Responses associated with δ-‐Opioid Receptor activation in HEK293 Cells

Interaction entre le récepteur CD36 et les protéines S100A8/A9 dans l’inflammation aigüe

Theragnostic Dox-‐Loaded nanogels for GBM

The role of resolvin D1 in the regulation of inflammatory and catabolic mediators in osteoarthritis

Auto-‐assemblage de blocs hydrogel fonctionnalisés électrostatiquement

Characterization of new variants in the coding sequence of the human melanocortin 4 receptor found in obese cohort from Quebec population

Mot de bienvenue (M-‐415)Gerardo Ferbeyre, Co-‐directeur GRUM

Role of reversible oxidation in the regulation of the adaptor protein MAVS

Development of a new mouse model of atherosclerosis

Steady-‐state volume of distribution when nonlinearity and peripherial elimination are an issue

CONFÉRENCE: Un mort en phase 1 : retour sur la tragédie chez Biotrial (France, janvier 2016)Denis deBlois, Co-‐directeur GRUM

SESSION AFFICHES ÉTUDIANTES (Hall d'honneur)


14:15 -‐ 16:55

Using the Bioinformatics Approaches in Drug Discovery to Predict Microbial and Pathogen EvolutionAdrian Serohijos, Université de Montréal

Chemical Biology Informatic Approaches to Identify and Validate New Therapeutic TargetsPeter Kutchukian, Merck

Accurate Prediction of microRNA::mRNA Regulatory Networks and Rational Design of Efficient and Safe RNAi-‐based TherapeuticsFrançois Major, IRIC, Université de Montréal

16:55 -‐ 17:00 Remise des prix d'excellence (M-‐415)

Denis deBlois, co-‐directeur -‐ GRUM

Mot de la fin

CONFÉRENCIERS INVITÉS (M-‐415)

!

999eee JJJooouuurrrnnnéééeee sssccciiieeennntttiiifffiiiqqquuueee Présentations orales

1

9h00 – Cibler l’acétylation des histones dans les sarcomes pédiatriques avec la proscillaridine A

Elodie DA COSTA1,2, Gregory Armaos1,2, Simon Jacques-Ricard1,2, Serge McGraw2, Daniel Sinnett2, Noël Raynal1

1Université de Montréal 2CHU Sainte-Justine

Les sarcomes représentent 15% des cancers pédiatriques ayant un taux de survie à 5 ans est de moins de 10%. Les modifications épigénétiques, incluant la méthylation de l’ADN ainsi que les modifications post-traductionnelles des histones, sont responsables de la surexpression d’oncogènes et , à l’inverse, de l’inhibiton de l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons démontré que cibler l’acétylation des histones peut représenter une cible épigénétique spécifique dans les sarcomes pédiatriques. Pour cela, nous avons identifié que la proscillaridine A, un nouveau médicament épigénétique, détient une activité épigénétique et anticancéreuse sur des lignées cellulaires d’ostéosarcomes (U2OS) et de rhabdomyosarcomes (RD). Nos résultats démontrent une baisse spécifique de l’acétylation des résidus lysine de l’histone 3 suite à un traitement de proscillaridine A. Ces effets corrèlent avec une inhibition de l’expression de protéines associées à l’acétylation des histones comme les histones acétylatransférases TIP60 et CBP. Nous avons aussi observe une baisse de l’expression de régulateur de l’acétylation tells que le bromodomaine BRD4 et l’oncogène C-MYC. L’analyse transcriptomique démontre une inhibition des gènes cibles de C-MYC. L’action épigénétique de la proscillaridine A est dépendante de l’activité de la CAMK. La proscillaridine A induit un blocage du cycle cellulaire en G2/M, une réduction du potentiel clonogénique des deux lignées cellulaires (CI50 ≈ 6 nM). La proscillaridine A induit une reprogrammation épigénétique totale de la lignée RD puisque les colonies restantes perdent totalement leurs capacités à proliférer. Ces résultats prometteurs démontrent le potentiel épigénétique et anticancéreux de la proscillaridine A contre les sarcomes pédiatriques. D’autres expériences sont en cours afin de mieux caractériser le mécanisme d’action de la proscillaridine A in vitro et in vivo.

2

9h15 - Fonction et distribution du récepteur B1 des kinines dans la rétine du rat diabétique Soumaya Hachana1,2,3, Réjean Couture2, Elvire Vaucher3

1UDEM

2Département de physiologie moléculaire et intégrative

3Ecole d'optométrie

Le récepteur B1 des kinines(B1R) est absent dans la rétine saine et fortement induit dans la rétinopathie diabétique(RD).B1R contribue à augmenter la perméabilité vasculaire, le stress oxydatif et l'expression des cytokines.Le blocage sélectif du B1R permet d’inverser la majorité des changements pathologiques observés dans les stades précoces du diabète.Les mécanismes sous-jacents et les types cellulaires responsables ne sont toutefois pas connus.Dans cette étude, nous avons étudié la localisation du B1R dans la rétine du rat diabétique, et évalué l’effet d’agoniste ou d’antagoniste du B1R sur son expression, son action sur la perméabilité vasculaire et sa présence sur diverses cellules de la rétine.

Le diabète a été induit par la streptozotocine(STZ).Ce groupe a reçu respectivement un traitement avec un agoniste sous forme d’injection intravitréenne ou un traitement sous forme topique de l’antagoniste de B1R(R-954).La perméabilité vasculaire a été évaluée par la mesure de l’extravasation du bleu d’Evans.L’expression du B1R dans la rétine a été évaluée par RT-PCRquantitative.La localisation du B1R a été déterminée par immunohistochimie.Un double marquage a été utilisé pour la co-localisation du B1R.

Le traitement avec un agoniste surexprime l’ARNm du B1R dans la rétine des rats STZ. La perméabilité vasculaire est aussi augmentée de 30% chez les rats diabétiques par rapport aux rats témoins.Un traitement topique avec un antagoniste du B1R diminue, quant à lui, significativement la perméabilité vasculaire chez les rats STZ.Le double marquage a mis en évidence une co-localisation du B1R et des cellules endothéliales dans la rétine des rats STZ.L’immunohistochimie a montré que le B1R est principalement situé au niveau des couches les plus vascularisées de la rétine.Le marquage est plus fort quand on traite avec l’agoniste du B1R, contrairement à l’absence de marquage chez les rats contrôles ou traités avec R-954.

La stimulation du B1R augmente la pathologie vasculaire dès les premiers stades de la maladie et le blocage du B1R diminue celle-ci. Cette action est due probablement à la localisation du B1R sur les cellules endothéliales. L'application topique du R-954 pourrait représenter une approche prometteuse pour le traitement de la RD.

3

9h30 – Impact of arterial stiffness on cognitive and cerebrovascular functions M. Florencia Iulita1, Diane Vallerand1, Gervais Muhire1, Maud Gratuze2, Frank R Petry2, Emmanuel Planel2, Helene Girouard1

1Université de Montréal 2Université Laval

Arterial stiffness refers to the reduced capability of an artery to dampen pulsatile flow from ventricular ejection. Arterial stiffness is a common condition associated to aging and hypertension, and a strong risk factor for dementia. Despite this well-supported association, the mechanisms linking arterial stiffness to cognitive dysfunction remain elusive. Therefore, this study aimed to examine the effects of arterial stiffness on cognitive function, neurovascular coupling, blood-brain barrier (BBB) permeability and amyloid and tau accumulation in a new murine model of arterial stiffness, based on carotid calcification. Arterial stiffness was induced by the application of a 0.3M CaCl2 –soaked pad on the right carotid (20 min) of C57BL/6 male mice aged 10-12 weeks. Control mice were treated with 0.9% NaCl. Animals were sacrificed 3 weeks after surgery. Results show that in mice with arterial stiffness spatial learning acquisition is initially slower (P<0.05), and that spatial reference memory is significantly impaired (P<0.05). Arterial stiffness also attenuated the cerebral blood flow response to whisker stimulation or to the topical application of the endothelium-dependent vasodilator acetylcholine, monitored by laser-Doppler flowmetry. Preliminary results show no evidence of BBB permeability to sodium fluorescein in this model. Although modest, arterial stiffness led to a shift in the Aβ40/Aβ42 ratio in the frontal cortex (P<0.05) without affecting tau phosphorylation. Analysis of cerebral autoregulation and vascular amyloidosis are underway. These initial results show that arterial stiffness has a negative impact on cognitive and cerebrovascular functions, and should therefore be considered as therapeutic or preventative target to protect the brain.

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9h45 - Role of reversible oxidation in the regulation of the adaptor protein MAVS

Natalia Zamorano1,2, Espérance Mukawera1, Stéfany Chartier1, Nathalie Grandvaux1,2

1CRCHUM

2Université de Montréal

Introduction: MAVS is central to expression of antiviral and proinflammatory cytokines in response to pathogen recognition. Dysregulation of MAVS-dependent pathways are also associated with autoimmune diseases. Oxidative post-translational modifications (ox-PTM) of thiols act as redox switch for signaling. Recent work from our laboratory and others support the idea that ROS derived from the NOX2 NADPH oxidase and mitochondria could act as second messengers to regulate MAVS expression levels and aggregation, a process required for its activation. Our goal is to characterize the function of MAVS ox-PTM on cysteines (Cys). Methods: Silencing of NOX2 or treatment with tempol, a superoxide dismutase mimetic, were performed in A549 cells, in the presence of inhibitors of proteasome, caspases or autophagy degradation pathways. MAVS expression was monitored by immunoblot and qRT-PCR. Analysis of MAVS ox-PTM was studied in response to the diamide thiol-oxidizing agent using maleimide-PEG labeling. Results: NOX2 silencing or treatment with tempol significantly reduce MAVS expression levels. Inhibition of autophagy by 3-methyladenine, but not of proteasome or caspases, restored MAVS expression levels following tempol treatment. Ox-PTMs of MAVS were detected in response to diamide. Conclusion: Our data suggest that cellular superoxide levels are required for MAVS expression through modulation of autophagy-mediated degradation. Moreover, we unveiled direct oxidation of MAVS on Cys residuescysteines. Our current studies are aimed at generating MAVS Cys mutants to determine the impact on oxidation, expression, aggregation and activation.

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10h00 - Effective and applicable method of lubrication and wear protection Buddha R. Shrestha1, Jimmy Faivre1,2, Xavier Banquy1

1Université de Montréal 2Université de Lyon

10 – 15% of adults above 60% have some degree of osteoarthritis. The best treatment is the “viscosupplementation”, a treatment in which a patient is supplied with one of the important synovial fluid (hyaluronic acid) into the joints. The treatment works to a certain degree i.e. is able to reduce the pain due to friction but we definitely need better supplement for its treatment. So the objective of the current work is to find better supplement for the treatment of osteoarthritis.

Surface force apparatus (SFA) is a powerful technique with sub-angstrom resolution in distance and 10 nN resolution in interaction force while sliding the surface. Thus, SFA is used to have the direct insight into interaction force, material and friction at interface.

We found that by precisely controlling the molecular interactions between anti-wear macromolecules and bottle-brush lubricating molecules in the solution state, it is possible to obtain a fluid with excellent lubricating and wear protection capabilities. The reason for this synergistic behavior relies on the subtle interaction forces between the fluid components which allow the confined macromolecules to sustain high loads under shear without rupture. Our results provide rational guides to design such fluids for virtually any type of surfaces.

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10h15 - Steady-state volume of distribution when nonlinearity and peripherial elimination are an issue Xiaotian Wu1, Fahima Nekka1, Jun Li1

1University of Montreal

The model-independent estimation of physiological steady-state volume of distribution (V_{dss,p}), often referred to as non-compartmental analysis (NCA), is historically based on the linear compartmental model structure with central elimination. However the NCA-based V_{dss,nca} cannot be generalized to more complex models. In the current paper, two compartmental models with simultaneous first-order and Michaelis-Menten eliminations are considered. In particular, two indistinguishable models M_1 and M_2, both having central Michaelis-Menten elimination, with first-order elimination exclusively from central or peripheral compartment, are studied. The model-based expressions of V_{dss,M_i} (i=1,2) and their relationships to NCA-based V_{dss,nca} are derived. The impact of non-linearity and peripheral elimination is explicitly delineated in the formulas. Being concerned with model identifiability and indistinguishability issues, a rational way to confine the estimate of V_{dss,p} is suggested.

999eee JJJooouuurrrnnnéééeee sssccciiieeennntttiiifffiiiqqquuueee Présentations par affiche

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1 - La précision diagnostique des tests de fonction plaquettaire pour détecter l'effet du clopidogrel Rahma Boulahya1,2, Marie Lordkipanidzé1,3,4

1Université de Montréal 2Faculté de Médecine

3Institue de Cardiologie de Montréal 4Faculté de Pharmacie

La maladie coronarienne demeure une des causes de mortalité principales dans le monde occidental. L’hyperactivité plaquettaire a été identifiée comme un déterminant important dans la pathophysiologie des syndromes coronariens aigus. Les lignes directrices actuelles recommandent l’utilisation d’une thérapie antiplaquettaire à l’aide d’aspirine et d’un inhibiteur du récepteur P2Y12 à l’ADP (généralement le clopidogrel) pendant au moins 12 mois après un événement coronarien aigu. Or, il a été démontré qu’une importante variabilité de réponse existe à ce médicament.

Quel test de fonction plaquettaire est le mieux adapté pour monitorer les effets antiplaquettaires du clopidogrel demeure débattu. Dans cette analyse, nous avons comparé la précision diagnostique de 5 différents essais de fonction plaquettaire. La précision diagnostique de chaque test et l’impact de ces résultats sur la personnalisation de la thérapie antiplaquettaire sont présentés.

Cette sous-étude inclut 120 patients avec une maladie coronarienne stable. L’étude-mère consistait en un essai randomisé à double aveugle visant à comparer 4 doses de clopidogrel en association avec de l’aspirine. Nous avons mesuré l’efficacité du traitement au clopidogrel à l’aide de l’agrégation par transmission lumineuse (LTA), l’agrégation par impédance électrique, la chute du décompte plaquettaire, le Platelet Function Analyzer (PFA-100®) et le VerifyNow P2Y12®, avant et après l’instauration du traitement au clopidogrel.

Le chevauchement important entre les valeurs avant et après traitement rendait difficile la sélection d’un seuil de réponse optimal. Néanmoins, certains tests avaient une performance diagnostique supérieure à d’autres.

Cette étude nous a permis de faire une comparaison réelle de l’efficacité des tests de fonctions plaquettaires utilisés couramment en clinique. Nous suggérons que le LTA et le VerifyNow P2Y12® seraient préférables aux autres tests de fonction plaquettaire dans le monitoring de l’effet antiplaquettaire du clopidogrel, dans l’optique où un ajustement thérapeutique pourrait être intenté basé sur les résultats de tests de fonction plaquettaire.

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2 – Nouvelle thérapie épigénétique avec le disulfiram dans le traitement du neuroblastome pédiatrique Simon Jacques-Ricard1,2, Gregory Armaos1,2, Elodie DA COSTA1,2, Annie Beaudry2, Noël Raynal1,2


Le neuroblastome pédiatrique est un des cancers extracrâniens le plus fréquent chez les enfants. Malgré une amélioration du taux de survie avec les thérapies actuellement disponibles, les stades avancés de neuroblastome ou en rechute présentent un très mauvais pronostic. De nouvelles approches thérapeutiques doivent donc être développées afin d'augmenter la survie des patients. Une de ces approches est la thérapie par médicaments épigénétiques. Le neuroblastome, comme plusieurs autres cancers pédiatriques, contient plusieurs altérations épigénétiques au niveau de la méthylation de l'ADN et des modifications des histones. Lors d'un criblage de médicaments déjà approuvés par la FDA, nous avons découvert quelques molécules ayant des caractéristiques de médicaments épigénétiques jusqu’alors jamais découvertes. Notre étude cherche donc à démontrer l'efficacité de ces molécules dans le traitement de lignées cellulaires de neuroblastome. Suite à des tests préliminaires, une des molécules approuvées par la FDA s'est démarquée : le disulfiram, un médicament approuvé pour le traitement de l’alcoolisme chronique. Nous avons donc traité des lignées cellulaires de neuroblastomes (IMR-32, N91, SK-N-DZ, SK-N-SH et SK-N-AS ) pendant 48 heures avec du disulfiram à des concentrations pertinentes sur le plan clinique (10nM à 50 µM). Nos résultats démontrent une inhibition de croissance de 50 % (IC50) entre 25 et 100nM pour les lignées cellulaires testées. De plus, après analyse par cytométrie de flux, on observe un blocage du cycle cellulaire en G2/M. Nous avons également observé une diminution du facteur de transcription MYCN ainsi qu’une baisse d’acétylation de plusieurs marques d’histones(H3K9ac, H3K14ac, H3K27ac). Des travaux sont en cours afin de déterminer le mécanisme d’action du disulfiram. Cette recherche permettra d’évaluer l’efficacité du disulfiram dans le traitement du neuroblastome.

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3 - Development of a New Mouse Model of Atherosclerosis Samaneh Samami2,3,4, Teodora Mihalache-Avram3, Eric Rhéaume3,5, Jean-Claude Tardif3,5, Gaétan Mayer4,6,7

1Laboratoires de

2Biologie Moléculaire et Cellulaire

3& Athérosclérose

4Institut de Cardiologie de Montréal Départements de pharmacologie

5& médecine

6Faculté de médecine, Université de Montréal 7Faculté de pharmacie, Université de Montréal

Elevated level of plasma low-density lipoprotein cholesterol (LDLc) accelerates the development of atherosclerosis, a major cause of heart attacks and strokes. Liver LDL receptor (LDLR) is the primary pathway for clearance of LDLc particles. Proprotein convertase subtilisin kexin 9 (PCSK9) is an extracellular ligand of LDLR that induces its degradation in lysosomes, resulting in increased plasma LDLc. Mice lacking PCSK9 are protected from atherosclerosis while its overexpression can induce the formation of plaques in the arterial wall. Therefore, PCSK9 inhibitors could reduce progression of atherosclerosis. No easily accessible animal models have been found yet for studying the effect of PCSK9 inhibition on atherosclerosis, since both LDLR and apolipoprotein E are essential for PCSK9-mediated hypercholesterolemia in mice. Herein, two mouse models were tested: LDLR+/-;Tg(ApoB+/-) (ATX-Hz) mice and C57Bl/6 mice overexpressing the PCSK9-D377Y gain-of-function mutant achieved through a single tail-vein injection of a recombinant adeno-associated virus serotype 8. Mice were fed a western-type diet for 3 months and the formation of atherosclerotic plaques was assessed. Surprisingly, the ATX-Hz mice had no plaques neither in the aortic root nor in the entire aorta indicating that one LDLR allele is sufficient to protect mice against atherosclerosis. After 3-month post-virus injection, C57Bl/6 mice had high plasma PCSK9 levels (46-fold increase), very low hepatic LDLR protein levels and a 4-fold increase in plasma LDLc level. These mice showed large atherosclerotic lesions in the aortic root confirming its suitability as an effective model of atherosclerosis and to study the effect of PCSK9 inhibition on the development of atherosclerosis.

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4 - The role of resolvin D1 in the regulation of inflammatory and catabolic mediators in osteoarthritis Houda-Abir BENABDOUNE1

1Universite de Montreal

INTRODUCTION

Osteoarthritis (OA) is a degenerative joint disease, characterized by cartilage and bone damage as well as increased production of inflammatory and catabolic mediators such as prostaglandin-E2 (PGE2), nitric oxide (NO), metalloproteinase-13 (MMP-13), tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and cathepsin-K. Despite its important consequences, therapeutic modalities for OA are limited to symptomatic treatments. Resolvin-D1 (RvD1) is a derivative of omega-3 fatty acids synthesized during the resolution phase of inflammation. The overall objective of this study is to investigate the anti-inflammatory, anti-catabolic and anti-resorptive role of RvD1 in OA.

METHODS

Post-surgery discarded human OA articular cartilage was obtained from OA patients who underwent total knee arthroplasty. First passage human OA chondrocytes, were treated with IL-1B with or without RvD1 (1-10 uM) for 24 hours. The expression of cyclooxygenase-2 (Cox-2) and inducible NO synthase (iNOS) was determined by western blot and real-time PCR. Levels of PGE2, MMP-13 and NO were measured by EIA, ELISA and Greiss reaction, respectively. To investigate the signaling pathways, p38 MAPK, SAPK/JNK1/2, NF-kB/p65 activation was determined by western blot. To induce osteoclasts (OC) recruitment, RAW264.7 cells were incubated with 50 ng/ml LPS with or without RvD1 (1-10 uM) for 24 hours. OC phenotype markers, namely, TRAP and cathepsin-K were assessed by western blot, enzymatic staining and immunocytochemistry.

RESULTS

Our results show that RvD1 inhibits COX-2 and iNOS expression as well as PGE2, MMP-13 and NO generation. These effects are likely to be attributed to the blocking of the activation of p38 MAPK, SAPK/JNK1/2 and NF-kB/p65. Besides, RvD1 strongly reduces OC recruitment as indicated by the inhibition of TRAP and cathepsin K expression.

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CONCLUSION

Our in vitro results clearly show that RvD1 presents very interesting anti-inflammatory, anti-catabolic and anti-resorptive properties in OA. Additionally, our recent data that are not presented showed a remarkable anti-apoptotic and antioxidant potential of RvD1 in OA chondrocytes. Taken together, these findings suggest that RvD1 may offer a novel and original perspective to make a real contribution to OA therapy.

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5 - Prediction of Complex Cellular Responses associated with δ-Opioid Receptor activation in HEK293 Cells Ahmed Mansour1,2, Karim Nagi1,2, Johanie Charbonneau2, Victoria Lukashova1, Christian Le Gouill1, Michel Bouvier1, Graciela Pineyro1,2

1Université de Montréal 2Ste-Justine Hospital Research Center

Opioid receptor agonists are effective analgesics. Clinically available opioids have been developed for the MOR which are effective in acute but not chronic pain management. MOR agonists also produce severe side effects during treatment like respiratory depression and severe constipation. DOR agonists have been shown to be effective in chronic pain and have an advantage over MORs in that they produce fewer side effects, however they have tendency to produce tolerance. Interestingly, not all DOR agonists produce the same degree of tolerance. The differences have been attributed to the DOR ligands ability to distinctly engage cellular determinants of tolerance such as receptor desensitization, receptor internalization and adenyl-cyclase superactivation. Here we investigated whether simple molecular interactions among DORs and different signaling partners were distinct for different ligands and whether these simple signals were predictive of more complex cellular responses linked to analgesic tolerance. To assess ligand-induced changes in DOR interaction with signaling partners we used BRET-based biosensors for G protein and downstream effector activation and ligand effects were analyzed with operational model. Our results clearly indicate that quantitative treatment of simple signals can be predictive of ligand potential to induce endocytosis and cyclase superactivation but not desensitization. In particular, the potential for endocytosis was correlated with ligand bias to produce b-arrestin (β-arr) recruitment versus G-protein activation, but not by ligand efficiency to recruit β-arr or activate G-proteins. Moreover, ligand potential to produce cyclase superactivation was directly correlated with ability to mobilize Ca+2. This data provides proof of principle that it is possible to extract information from simple signaling results to predict more complex responses associated with in vivo analgesic tolerance.

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6 - Theragnostic Dox-Loaded nanogels for GBM

Hugo Alarie1, Hoda Besheir1, Martin Jutras1, Valérie Gaëlle Roullin1


De nombreux procédés pour la fabrication de nanoparticules polymériques synthétisées à partir de chitosane et d’acide hyaluronique ont été établis. Divers agents ont également pu être encapsulés à l’intérieur de ces vecteurs, dont la doxorubicine, une petite molécule hydrophile utilisée dans le traitement du cancer. Suite à l’encapsulation de doxorubicine dans des nanogels faits par gélation ionique (158 ± 1,5 nm), les taux d’encapsulation (83 ± 17%) et de rendement ont été calculés. Dans cette étude, plusieurs cryoprotectants ont été étudiés afin d’obtenir une reconstitution optimisée ainsi que des caractéristiques (taille, polydispersité, profil de libération, cytotoxicité) identiques à ceux observés avant la lyophilisation.

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7 - Developing a screening platform by Surface Plasmon Resonance (SPR) for the characterization and discovery of enzyme inhibitors Sarah Melissa Jane Abraham1,3,4, Jacynthe L. Toulouse2,3,4, Nathalia Bukar1, Dominic Bastien2, Natalia Kadnikova1, Jean-François Masson1, Joelle N. Pelletier1,2,3,4

1Department of Chemistry, University of Montreal 2Department of Biochemistry, University of Montreal 3PROTEO

4CGCC

The objective of the research is to develop a more sensitive screening method based on a portable Surface Plasmon Resonance (SPR) device, an emerging technology. Our target enzyme is the R67 dihydrofolate reductase (R67 DHFR), which confers bacterial resistance to the antibiotic trimethoprim. Here, the target enzyme is linked to a very thin gold surface with specific plasmonic (optical) properties that are proportional to the mass of bound molecules. This can allow monitoring of binding events to the surface-linked R67 DHFR, and thus permit identification of inhibitors. However, the mass of a typical inhibitor (i.e. 500-1000 g/mol) is too low to result in a significant SPR signal. Therefore, a competitive assay will be developed: a gold nanoparticle carrying a substrate analog will bind the surface-immobilized R67 DHFR, giving a strong SPR signal due to its high mass. Then, upon screening for potential inhibitors, the bound nanoparticles will be displaced from the target enzyme if a molecule provides sufficient affinity. Thus, it is possible to indirectly monitor the binding of an inhibitor to the target. This project aims firstly at testing and validating of the SPR screening approach applied to R67 DHFR, and then applying this methodology to the screening of new inhibitors.</span>

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8 - Characterization of variants in the coding sequence of the human melanocortin 4 receptor found in obese cohort from Quebec population amir medjtoh1, René Patricia1, Vohl M.-C2, huber J.1, Lambert R.1, Gendron P.1, Richard D.2, Michel Bouvier1 1Université de Montréal 2Université Laval

The melanocortin-4-receptor (MC4R) is a G protein coupled receptor, primarily expressed in the brain where it plays a pivotal role in regulating energy balance. Mutations occurring in mc4r gene represent one of the most common causes of severe monogenic obesity in children. More than 50% of mc4r mutations lead to partial or complete retention in the biosynthetic pathway via the cell quality control system. We characterized MC4R-selective cell-permeant molecules (Pharmacological chaperones; PC) that rescue cell surface trafficking and functionnality of misfolded mutant forms. To identify patients that could benefit from a PC-based therapy, a total of 2113 obese patients with a BMI over 40 from Québec population were subjected to genetic screening for variants in the mc4r gene.

Hypothesis: The metabolic regulatory system is sensitive to quantitative variation in MC4R function. Therefore, the use of cell permeable selective ligands being able to increase cell surface expression of intracellularly retained mutant receptor could have a beneficial therapeutic effect.

Methodology: Four MC4R variants were selected and cloned. We transiently transfected them in HEK293T cells to study their membrane targeting by dual-fluorescence flow cytometry and signaling capacity by measuring intracellular cAMP accumulation using a competitive immunoassay based on Homogeneous Time-Resolved Fluorescence technology.

Results: We found in our obese cohort, 15 variants (3 synonymous and 12 misense) localized in the coding sequence, among them 12 were already described in other cohorts and 3 were new ones. Flow cytometry experiments revealed that the four variants selected in this preliminary study, have altered cell surface expression and two of them were not functional. We then tested the action of our lead in vitro PC candidate and found that the treatment with DCPMP were able to recover cell surface expression of the 4 variants and the signaling capacity of the two non-functional ones.

Conclusions: Compound with pharmacological chaperone activity could represent drug lead for the treatment of patients displaying MC4R-linked obesity. Patients harboring PC-rescuable mutations would be then considered as candidates for an eventual PC-based treatment.

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9 - Développement d'un test sec pour le phenotypage des plaquettes sanguines Maria Vershinin1


Ce projet vise à optimiser le procédé de fabrication et d’entreposage d’une plateforme de criblage à haut performance pour le phénotypage de plaquettes sanguines. Ce test permettrait de vérifier le fonctionnement des différentes voies d’activation des plaquettes avec plusieurs agonistes. L’avantage de ce test est l’utilisation d’un petit volume sanguin et le court temps d'analyse.

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10 – Nanoplatform Drug Delivery Strategy for Osteoarthrisis Treatment Eva Navarro Lara1,2, Hourdia Yahi2, Amani Hassan2, Araceli García1, Mathieu Lévesque2, V Gaëlle Roullin1, Xavier Banquy1, Florina Moldovan1,2


Introduction

Osteoarthritis (OA) is a pathology that causes inflammation and degeneration of the cartilage. In Canada, 16% of the population is affected by OA. To date, none of the existing treatments can alter the course of the disease. Our goal is to design a nanoplatform drug delivery strategy to offer a more targeted delivery of the drugs into the joint tissues. We recently identified a combination of biopolymers (chitosan-based bioadhesive nanogels) that can be used to manufacture nanogels (NG). We are currently testing their biocompatibility and plan to use them to deliver novel peptide drugs to treat OA.

Hypothesis

Our hypothesis is that chitosan-based bioadhesive NG will offer a safe delivery nanoplatform for sustained and controlled release of peptide drugs into the articular cartilage.

Aims

The aim was to test the biocompatibility of chitosan-based blank NG in terms of toxicity in vitro, on human joint cells from OA patients and to investigate NG penetration into the human cartilage.

Methods

Blank NG has been generated by the ionic gelation process in citric acid medium. Freeze-dried NG containing 20% sucrose to avoid particle agglomeration were prepared. Human osteoblasts (OB) were derived from patients with OA and cultured in vitro in presence or absence of NG (0-1 mg/mL) for 48 h. Proteins, media and DNA were collected from the OB and tested in vitro: DNA fragmentation, Tunel-apoptosis test, cells viability and Western Blot for MMP3 and Safranin-O staining.

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11 - Évaluation par la technologie BRET de l’interaction moléculaire avec le canal potassique hERG responsable des arythmies ventriculaires médicamenteuses. Etienne Durette1, Christian Le Gouill2, Michel Bouvier2, Denis deBlois1

1Institut de recherche en immunologie et cancérologie, Université de Montréal 2Faculté de pharmacie, Université de Montréal

Le canal Kv11.1, dont l’inhibition occasionne une prolongation de l’intervalle QT, est directement impliqué dans des cas d’effets secondaires cardiotoxiques. Depuis 2006, Santé Canada exige que les nouvelles molécules et leurs métabolites soient évalués en phase préclinique pour le risque d’allongement de l’intervalle QT. La méthode de référence évalue l’électrophysiologie des cardiomyocites en culture lors d’une courte exposition au médicament (<30min). Bien que cette méthode soit la plus fiable actuellement, elle permet seulement d’identifier les molécules qui bloquent directement le passage des ions dans le pore du canal.

La méthode HERG-BRET vise l’identification de molécules susceptibles d’influencer le trafic vésiculaire de Kv11.1 et/ou de bloquer le pore du canal. Pour ce faire, elle évalue le niveau d’expression membranaire de la sous-unité protéique hERG en utilisant le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET). Dans le modèle HERG-BRET, la protéine hERG fusionnée à la luciférase de renilla (donneur d’énergie) est exprimée dans une lignée cellulaire HEK293. Cette même lignée exprime également une protéine verte fluorescente modifiée (accepteur d’énergie) qui est ancrée à la membrane plasmique. L’échange d’énergie entre le donneur et l’accepteur lorsqu’ils sont à proximité (<10nm) est un indice de la localisation membranaire de hERG. Les fluctuations d’expression membranaire de hERG reflètent donc l’effet des molécules sur la translocation de Kv11.1 suite à une exposition prolongée (16h). Les profils d’inhibition de 25 composés ont été comparés aux données disponibles dans la littérature pour la méthode de référence et la méthode alternative hERG-Lite® (Wible et al., 2005): 12 ont été classés comme bloqueurs du pore, 4 comme inhibiteurs du trafic, 1 comme inhibiteur ayant les deux effets mentionnés et 8 n’ont pas pu être classés. Le comportement du biosenseur à l’égard des composés testés suggère que la méthode HERG-BRET, tout comme la méthode hERG-Lite®, ne peut pas être utilisée seule pour évaluer le risque cardiotoxique des médicaments, mais elle peut fournir des informations complémentaires pertinentes quand à la nature de l’interaction entre un composé pharmaceutique et la sous unité hERG.

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12 - Interaction entre le récepteur CD36 et les protéines S100A8/A9 dans l’inflammation aigüe David Huynh1, Diala Harb1, Katia Mellal1, Priscilla Tartatri Pereira2, Pierre Borgeat3, Lucia H Faccioli2, Philippe Tessier3, Huy Ong1, Sylvie Marleau1

1Université de Montréal 2Universidade de São Paulo

3Centre de recherche du CHUQ

Hypothèse: Nos travaux ont montré une réduction de l’accumulation des leucocytes au niveau du tissu enflammé chez des souris prétraitées avec un ligand du récepteur du CD36 chez un modèle d’ischémie-reperfusion des membres inférieurs. Sachant que 1) les polynucléaires neutrophiles (PNN) sont les premiers leucocytes migrant au site inflammatoire et que 2) les PNN expriment fortement les transporteurs d’acide arachidonique (AA) S100A8/A9, nous avons émis l’hypothèse selon laquelle le transport de l’AA au niveau des cellules endothéliales de la microcirculation via une interaction entre les S100A8/A9 et le CD36 serait bloqué par le ligand du CD36.

Méthodologie: Nous avons injecté de l’air stérile par voie sous-cutanée à des souris CD36+/+ et CD36-/- afin de former des poches d’air dorsales. Nous avons ensuite traité les souris avec des anticorps anti-CD36 (50 µg), anti-S100A8/A9 (2 mg) ou IgG non spécifiques par voie intra-péritonéales, de manière concomitante avec un ligand sélectif du CD36, le EP 80317 (300 µg/kg), ou son véhicule par voie intraveineuse. Par la suite, nous avons injecté du LPS (1 µg) ou de la saline 0,9% dans la poche d’air, puis mesuré le nombre de PNN accumulé et l’expression de gènes inflammatoires potentiellement modulée dans la microvasculature 4 heures plus tard.

Résultats: Le traitement avec le EP 80317, l’anticorps anti-CD36, l’anti-S100A8/A9, ou les 2 anticorps ensemble chez les souris CD36+/+ a diminué le nombre de PNN ayant migré dans la poche d’air de 67%, 69%, 71% et 69%, respectivement. Ces effets n’ont pas été observés chez les souris CD36-/-. L’expression des gènes de iNOS et de VCAM-1 dans les cellules endothéliales de la microvasculature a été diminuée de 41% et de 42%, respectivement, suite au traitement avec le EP 80317.

Conclusion: Nos résultats appuient l’hypothèse selon laquelle l’interaction entre le récepteur CD36 et le complexe S100A8/A9 sécrété par les PNN conduit à une amplification de l’inflammation. Les ligands sélectifs du CD36, en inhibant cette interaction, expliquerait, du moins en partie, leurs propriétés anti-inflammatoires.

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Results

DNA extracted from OB cells treated with blank NG (0-1 mg/mL) for 48 h showed no sign of degradation. Cell viability/cytotoxicity (documented by Tunel-apoptosis test LIVE/DEAD® test) were not affected by the exposure to the NG. Protein levels of MMP13 were not affected with increasing concentrations of NG (0-1 mg/mL). In 5-µm tissue sections obtained from cartilage explants of OA cultured in presence or absence of 10 µg/mL NGs for 48 h, we observed NG penetration into the superficial layers of cartilage. NGs were visualized in the degenerative zones of cartilage, where the proteoglycans depletion occurs in OA.

Conclusion

Blank NG-based nanoplatform causes no toxicity in human joint cells and penetrates into the cartilage. Future goals would be the addition of active ingredients to prevent OA.

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13 - Auto-assemblage de blocs hydrogel fonctionnalisés électrostatiquement Nicolas Hanauer1, Xavier Banquy1


Grâce à leur matrice polymérique immobilisant une phase liquide permettant le transport de composés actifs, les hydrogels sont de parfaits matériaux pour la bioingénierie. Les applications in vivo sont limitées par la nécessité d’une chirurgie invasive permettant l’implantation des échafaudages. Le développement de procédés de fabrication simples de matrices injectables auto-assemblables offrirait une solution.

Hypothèse:

Le procédé proposé utilise des blocs hydrogel formant via un procédé d’assemblage dirigé une matrice dont la structure pourra être prédéfinie par la géométrie et la fonctionnalisation des blocs qui la composent. La fonctionnalisation en masse par des polyélectrolytes ou par traitement par des nanogels chargés de blocs nous permettrait d’induire des interactions électrostatiques attractives permettant l’assemblage contrôlé.

Méthodologie:

Les blocs hydrogels sont obtenus par photopolymérisation d’un mélange 2-hydroxyethyl méthacrylate et poly(éthylène glycol)diméthacrylate dans un support d’injection d’épaisseur connue et de photomasques.

Les blocs positifs sont obtenus par ajout de polyethylèneimine avant réaction. Deux types de blocs négatifs ont été obtenus : par ajout d’acide hyaluronique avant polymérisation ou par traitement de blocs positifs par des solutions nanogels NIPAM-acide méthacrylique de différentes tailles, charges et concentrations.

Les tests d’assemblage consistent en une mise en contact aléatoire sur agitateur orbital des blocs en milieu aqueux à salinité contrôlée.

Résultats:

Les deux types de blocs négatifs ont permis l’assemblage avec contacts adhésifs spécifiques entre blocs de charges opposés. Les systèmes nanogels obtenaient de meilleurs assemblages et résistaient mieux à l’assemblage/désassemblage que le système PEI/HA qui résistait mieux à l’augmentation de la salinité. Les différents systèmes nanogels ont permis de mettre en avant le rôle de la taille et de la charge.

Conclusion:

Si les fonctionnalisations électrostatiques utilisées permettent l’assemblage, le contrôle est limité et les assemblages vulnérables. Une étude plus précise des forces

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d’interactions et d’autres types de fonctionnalisations sont envisagées. La taille des blocs ne permettant pas l’injection, un processus de miniaturisation du dispositif est prévu.

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14 - Measuring the temperature around an enzyme using DNA thermometers Scott Harroun1, Arnaud Desrosiers1, David Gareau1, Alexis Vallée-Bélisle1


There has been much research into the evolution of enzymes, but many fundamental questions remain unanswered. For example, how does heat produced at the active site diffuse into the surrounding medium?1 Can the heat released by an enzyme destabilize its structure; in other words, can the enzyme “overheat”? In this project, we propose to use programmable DNA-based nanothermometers (DNA-NTs) recently reported by our group2 to measure local temperature rise in the vicinity of an enzyme. -The stability, and thus melting temperature, of these DNA-NTs can be readily tuned by varying the ratio of G-C to A-T base pairs in the stem. Structures with more G-C base pairing in the stem are found to have higher stability, and thus unfold at higher temperatures.2 By attaching a fluorophore and quencher pair at both extremities of the stem loop, one can thus obtain a library of fluorescent nanothermometers with a specific linear dynamic range spanning 12°C. The 0GC/5AT and 1GC/4AT sequences have melting temperatures near 37 °C, and thus have linear changes in fluorescence in this range. Accordingly, DNA-NTs are anchored onto an enzyme to measure local rise in temperature due to heat released during the enzymatic reaction by monitoring fluorescence variation. Initial results have found that the local change of temperature in the vicinity of the enzyme contrasts with the global temperature of the sample, which remains relatively constant before, during and after the reaction. As a proof-of-concept measurement, our first design involved coupling of biotinylated DNA-NTs to streptavidin alkaline phosphatase (AP). The AP enzymatic reaction for conversion of para-nitrophenylphosphate (pNPP) to para-nitrophenol (pNP) is highly exothermic (ΔH = -43.5 kJ/mol),3 and we have measured local temperature rise during this reaction. More generally, our project proposes to measure local change in temperature to experimentally validate the rate of temperature diffusion, and to determine if enzymes “overheat” when functioning at high rates. Using these thermosensitive nanoswitches attached to enzymes, it may be possible to trigger drug release via local temperature rise around an enzyme.

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15 - A New Inhibitor of the β-arrestin/AP-2 Endocytic Complex Reveals Interplay Between GPCR Internalization and Signalling Alexandre Beautrait1, Justine Paradis1, Brandon Zimmerman2, Sylvain Armando1, Etienne Khoury2, Martin Audet1, Philippe Roux1, Stéphane Laporte2, Michel Bouvier1

1Université de Montréal 2Université McGill

In addition to G protein-coupled receptor (GPCR) desensitization and endocytosis, β-arrestin recruitment to ligand-stimulated GPCRs promotes non-canonical signalling cascades. Distinguishing the respective contributions of β-arrestin recruitment to the receptor and β-arrestin-promoted endocytosis in propagating receptor signalling has been limited by the lack of selective analytical tools. Using a combination of virtual screening and cell-based assays we identified a small molecule that selectively inhibits the interaction between β-arrestin and the β2-adaptin subunit of the clathrin adaptor protein AP-2 without interfering with the recruitment of β-arrestin to the receptor. This selective β-arrestin/β2adaptin inhibitor (Barbadin) blocks agonist-promoted endocytosis of the prototypical β2-adrenergic (β2AR) and V2-vasopressin (V2R) receptors, but do not affect β-arrestin-independent (transferrin) or AP2-independent (endothelin-A) receptor internalization. Interestingly, Barbadin fully blocked V2R-stimulated ERK1/2 activation and blunted cAMP accumulation promoted by both V2R and β2AR supporting the concept of β-arrestin/AP-2-dependent signalling for both G protein-dependent and -independent pathways.

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Cibler l’acétylation des histones dans les sarcomes pédiatriques avec la proscillaridine A

Elodie DA COSTA1,2, Gregory Armaos1,2, Simon Jacques-Ricard1,2, Serge McGraw2, Daniel Sinnett2, Noël Raynal1


Les sarcomes représentent 15% des cancers pédiatriques ayant un taux de survie à 5 ans est de moins de 10%. Les modifications épigénétiques, incluant la méthylation de l’ADN ainsi que les modifications post-traductionnelles des histones, sont responsables de la surexpression d’oncogènes et , à l’inverse, de l’inhibiton de l’expression de gènes suppresseurs de tumeurs. Nous avons démontré que cibler l’acétylation des histones peut représenter une cible épigénétique spécifique dans les sarcomes pédiatriques. Pour cela, nous avons identifié que la proscillaridine A, un nouveau médicament épigénétique, détient une activité épigénétique et anticancéreuse sur des lignées cellulaires d’ostéosarcomes (U2OS) et de rhabdomyosarcomes (RD). Nos résultats démontrent une baisse spécifique de l’acétylation des résidus lysine de l’histone 3 suite à un traitement de proscillaridine A. Ces effets corrèlent avec une inhibition de l’expression de protéines associées à l’acétylation des histones comme les histones acétylatransférases TIP60 et CBP. Nous avons aussi observe une baisse de l’expression de régulateur de l’acétylation tells que le bromodomaine BRD4 et l’oncogène C-MYC. L’analyse transcriptomique démontre une inhibition des gènes cibles de C-MYC. L’action épigénétique de la proscillaridine A est dépendante de l’activité de la CAMK. La proscillaridine A induit un blocage du cycle cellulaire en G2/M, une réduction du potentiel clonogénique des deux lignées cellulaires (CI50 ≈ 6 nM). La proscillaridine A induit une reprogrammation épigénétique totale de la lignée RD puisque les colonies restantes perdent totalement leurs capacités à proliférer. Ces résultats prometteurs démontrent le potentiel épigénétique et anticancéreux de la proscillaridine A contre les sarcomes pédiatriques. D’autres expériences sont en cours afin de mieux caractériser le mécanisme d’action de la proscillaridine A in vitro et in vivo.

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