c. introduÇÃo e objetivos · (valentová et al., 2001). o chá feito a partir das folhas, as...

C. Introdução e objetivos 3

C. INTRODUÇÃO E OBJETIVOS 1. INTRODUÇÃO GERAL .............................................................................................................3

1.1. Família Asteraceae ................................................................................................................5 1.2. Lactonas sesquiterpênicas (LSTs).........................................................................................6 1.3. Tricomas glandulares ..........................................................................................................16

2. OBJETIVOS...............................................................................................................................18 3. BIBLIOGRAFIA........................................................................................................................19 1. INTRODUÇÃO GERAL

Este trabalho envolve três temas que serão apresentados em diferentes capítulos. Estes

temas compreendem: i) o estudo fitoquímico de uma planta medicinal da família Asteraceae;

ii) o desenvolvimento de um método analítico com validação das análises empregadas; iii) o

estudo de atividades biológicas relativas ao processo inflamatório.

O estudo fitoquímico foi realizado com a planta Smallanthus sonchifolius (Poepp. &

Endl.) H. Robinson, tribo Heliantheae, uma erva perene endêmica na região Andina. A planta

é popularmente conhecida como yacón e é cultivada por causa de suas raízes tuberosas que

são reserva de inulina, um polímero de frutose. O yacón vem conquistando o mercado

internacional (Zardini, 1991), sendo cultivado na Itália, França, Alemanha, EUA, República

Tcheca, Rússia, Japão e Brasil (Valentová et al., 2001). A batata do yacón, nome referente às

suas raízes tuberosas, é comercializada na Europa em feiras livres como alimento funcional e

suplemento alimentar, especialmente para idosos, diabéticos e mulheres no climatério

(Valentová et al., 2001). O chá feito a partir das folhas, as quais também são comercializadas

em algumas farmácias, é usado como agente antiglicêmico. Estudos comprovaram que o

extrato aquoso das folhas aumenta a concentração de insulina em ratos normais e diabéticos

(Aybar et al., 2001). Além disso, o extrato aquoso também reduz a produção de glicose em

hepatócitos através das vias de gliconeogênese e de glicogenólise (Valentová et al., 2003),

além de atuar de forma similar à insulina (Valentová et al., 2004). Os principais metabólitos

secundários presentes nas folhas de yacón são as lactonas sesquiterpênicas (LSTs), as quais já

vem sendo investigadas quanto à atividade antidiabética (Inoue et al., 1995). E em razão do

crescente uso deste vegetal, não apenas por sua atividade antiglicêmica, o intuito aqui foi

isolar os principais metabólitos em quantidades suficientes para avaliação de outras atividades

biológicas, como por exemplo, aquelas relacionadas ao processo inflamatório e à

citotoxicidade.

Na área da química analítica, foi desenvolvido um método baseado em cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) acoplada ao detetor de raios de diodo (DAD) para a


detecção e quantificação da LST de maior concentração nos extratos glandulares de folhas de

S. sonchifolius. Esta substância, denominada enidrina, também apresenta atividades

biológicas. Enquanto a maioria dos métodos para a quantificação de LSTs foi desenvolvida

para extratos preparados a partir do material vegetal pulverizado, a proposta deste trabalho foi

quantificar esta LST em diversos extratos de lavagem foliar, assim como nos tricomas

glandulares. Desta forma, o método pode ser utilizado como um procedimento para o controle

de qualidade químico de yacón e de seus preparados. A técnica de microamostragem de

tricomas glandulares, inicialmente desenvolvida como ferramenta para estudos

quimiotaxonômicos e investigações fitoquímicas de espécies da tribo Heliantheae (Spring,

1991), serviu como base para o desenvolvimento do método aqui apresentado. Esta técnica já

havia sido implementada e vem sendo utilizada em nosso laboratório há alguns anos (Da

Costa et al., 2001; Schorr et al., 2002).

Para dar continuidade aos estudos das atividades biológicas das LSTs (Garcia-Piñeres,

2003; Lindenmeyer et al., 2004; Rüngeler et al., 1999; Siedle et al., 2003), foram avaliados

diferentes aspectos envolvidos no processo inflamatório. As LSTs exercem sua ação

antiinflamatória in vitro por meio da inibição do fator de transcrição NF-κB (Castro et al.,

2000; Lyss et al., 1998; Schorr et al., 2002). Esta proteína serve como um regulador central da

resposta imune e inflamatória. O mecanismo de ação das substâncias inibidoras do NF-κB

pode ser em parte esclarecido ao avaliar o efeito destas substâncias ativas na expressão gênica

dependente de NF-κB. Para isso, uma das técnicas disponíveis avalia a expressão gênica de

uma enzima exógena e facilmente detectável, como a luciferase, que consiste de um reporter

gen assay. A outra técnica é para o estudo da síntese de uma citocina endógena, neste caso da

interleucina-8 (IL-8) (Lindenmeyer, 2004).

Os neutrófilos constituem outro componente importante na resposta inflamatória e

imune (Burg e Pillinger, 2001), os quais liberam enzimas como a elastase, a qual facilita a

migração de células para os sítios inflamatórios (Witko-Sarsat et al., 2000). Porém, o excesso

de elastase provoca várias doenças, como artrite reumatóide e doenças pulmonares (Witko-

Sarsat et al., 2000). Na busca por inibidores da secreção enzimática, otimizou-se um método

(Johansson et al., 2002) para o uso de microplacas de 96 poços. Também foram realizados

estudos com o objetivo de compreender e evitar a estimulação basal dos neutrófilos, que

ocorre mesmo na ausência de qualquer adição de estímulo.

Uma vez que os efeitos de várias LSTs sobre a ativação do NF-κB (Lyss et al., 1999;

Schorr et al., 2002), sobre a ativação gênica para a produção de luciferase e de IL-8

(Lindenmeyer, 2004), bem como suas ações na liberação de elastase já haviam sido


investigados (Siedle et al., 2003), resolveu-se empregar estes métodos para análise de LSTs

ainda não estudadas anteriormente. Além disto, também foram avaliados dois produtos

fitoterápicos, o gel de Arnica montana e o extrato seco de Harpagophytum procumbens.

Finalmente, também se decidiu iniciar o estudo com alcalóides.

O gel de Arnica montana (Asteraceae) é um produto de uso tópico para tratamento de

processos inflamatórios (Klaas et al., 2002), sendo as LSTs os seus principais princípios

ativos. Harpagophytum procumbens (Pedaliaceae), mais conhecida por “garra-do-diabo”, é

uma planta sul africana também empregada por suas propriedades antiflogísticas. Os

alcalóides avaliados são metabólitos secundários isolados de Isatis tinctoria L. (Brassicaceae),

importante na produção do corante índigo blue e na medicina tradicional, também em função

das suas propriedades antiinflamatórias.

1.1. Família Asteraceae

Esta família de plantas superiores é apresentada com mais detalhes a seguir, uma vez

que as LSTs aqui investigadas foram todas isoladas de seus representantes e que duas de suas

espécies (Smallanthus sonchifolius e Arnica montana) são objeto de estudo nos capítulos

subseqüentes.

A família Asteraceae ou Compositae é uma das maiores das angiospermas, possuindo

1.535 gêneros e aproximadamente 23.000 espécies, arranjadas em 4 subfamílias e 17 tribos

(Bremer, 1994). Como representantes importantes da família pode-se citar o girassol,

Helianthus annus, de grande importância agrícola e econômica; a camomila, Matricaria

chamomilla, empregada como antiespasmódico; a equinácea, Echinacea angustifolia ou E.

purpurea, muito utilizadas na Europa e EUA por suas atividades imunoestimulantes; a arnica,

Arnica montana, como antiinflamatório; o yacón, Smallanthus sonchifolius (Zardini, 1991),

usado na medicina popular como antidiabético; a Neurolaena (Passreiter et al., 1995) e a

Tithonia (Rüngeler et al., 1998), entre outras, todas elas com diversas atividades biológicas.

Além dos aspectos farmacológicos, ecológicos e comerciais, a química de Asteraceae

tem sido empregada na investigação de aspectos taxonômicos (Spring e Buschmann, 1994).

Até 1990, aproximadamente 7.000 constituintes haviam sido isolados de apenas 5.000

espécies da família (Bohlmann, 1990; Bohlmann e Zdero, 1990).

Em Asteraceae há a ocorrência de diferentes tipos de terpenóides, poliacetilenos,

flavonóides, cumarinas, benzofuranos, derivados de p-hidróxiacetofenonas e de

fenilpropanóides (Alvarenga et al., 2001; Bohlmann, 1990; Bohlmann e Zdero, 1990;


Heywood et al., 1977). Os poliacetilenos formam um importante grupo, mas não aparecem

nas tribos Barnadesieae, Liabeae, Plucheeae, Gnaphalieae e Heliantheae (Alvarenga et al.,

2001).

As substâncias aromáticas mais abundantes são p-hidróxiacetofenonas preniladas. São

acumuladas especialmente nas tribos Eupatorieae, Heliantheae, Astereae, Gnaphalieae,

Calenduleae e Senecioneae, mas não são comuns em Inuleae e são raras em outras tribos

(Bohlmann, 1990; Bohlmann e Zdero, 1990).

Em muitas famílias vegetais, os aminoácidos são os precursores de todos os tipos de

alcalóides, além dos derivados de fenilpropanóides. Em Asteraceae, mais especificamente na

tribo Senecioneae, apenas a ornitina leva à biossíntese de alcalóides pirrolizidínicos, a única

classe encontrada na família, a qual também ocorre na tribo Eupatorieae (Anke et al., 2004).

A fenilalanina é precursora dos fenilpropanóides, que originam, por exemplo, as cumarinas e

os flavonóides, dentre várias outras classes. As cumarinas estão concentradas em algumas

tribos, como Eupatorieae, Astereae, Anthemideae, Lactuceae (Bohlmann, 1990; Bohlmann e

Zdero, 1990).

Dentre os diterpenóides, os do tipo caurano estão presentes em Heliantheae e são

menos comuns em Eupatorieae, Asteraceae e Inuleae. O tipo pimarano é mais freqüente em

Calenduleae, Heliantheae e Eupatorieae. Os labdanos caracterizam Eupatorieae e Astereae,

mas também estão presentes em Heliantheae e Inuleae. Os clerodanos são mais comuns em

Astereae e Eupatorieae (Bohlmann, 1990; Bohlmann e Zdero, 1990).

Entre os sesquiterpenóides, as LSTs são apresentadas com mais detalhes a seguir.

1.2. Lactonas sesquiterpênicas (LSTs)

As LSTs foram isoladas das famílias Asteraceae, Apiaceae, Burseraceae,

Magnoliaceae, Lauraceae e Hepaticae (Spring, 1989). Esta classe de micromoléculas é

considerada marcador químico da família Asteraceae, de onde a grande maioria de

substâncias com enorme variedade estrutural foi isolada (Seaman, 1982). A tabela A1

apresenta a distribuição das LSTs na família Asteraceae.


Tabela A1. Classificação das tribos de Asteraceae e distribuição de esqueletos de LSTs. Tribo Subfamília Gêneros Espécies LSTs Tipos de Esqueletos de LSTs

Barnadesieae Barnadesioideae 9 92 0 0 Mutiseae Cichorioideae 76 318 83 Ger Eud Gua Ele Cardueae Cichorioideae 83 2513 216 Ger Eud Gua Ele

Lactuceae Cichorioideae 98 2486 107 Ger Eud Gua Vernonieae Cichorioideae 98 1346 495 Ger Gua Ele Cad

Liabeae Cichorioideae 14 159 55 Ger Eud Gua Arctoteae Cichorioideae 16 139 24 Ger Eud Gua

Inuleae Asteroideae 38 480 392 Ger Eud Gua PGua Xan SPGua SEud Plucheeae Asteroideae 28 220 8 Eud

Gnaphalieae Asteroideae 181 1728 24 Ger Eud Gua Calenduleae Asteroideae 8 113 0 0

Astereae Asteroideae 174 2846 12 Eud Gua Ere Anthemideae Asteroideae 109 1737 818 Ger Eud Gua Ele PGua SPGua Cad Qin Chr Senecioneae Asteroideae 120 3247 96 Xan Bak Ere SEre FEre SFEre Pgua

Helenieae Asteroideae 110 835 374 Ger Eud Gua PGua SPGua NoPsi NHle NeHle Xan Heliantheae Asteroideae 189 2449 1297 Ger Eud Gua Ele Xan PGua Ere SEud SPGua Eupatorieae Asteroideae 170 2396 460 Ger Eud Gua Ele SGer PGua Tri Dis Xan SPGua

Total 3 1535 23104 4461

Ger: germacranolido; Eud: eudesmanolido; Gua: guaianolido; PGua: pseudoguaianolido; SPGua: secopseudoguaianolido; Xan: xantanolido; Ere: eremofilanolido; Ele: elemanolido; NeHle: neohelenanolido; Bak: bakkenolido; SEud: secoeudesmanolido; SEre: secoeremofilanolido; SGer: secogermacranolido; FEre: furanoeremofilanolido; NoHle: norhelenanolido; Cad: cadinanolido; SFEre: secofuranoeremofilanolido; NoPsi: norpsilotropin; Tri: trixikingolido; Chr: chrymoranolido; Dis: disyhamifolido; FEud: furanoeudesmanolido; RFEre: furanoeremofilanolido rearranjado; Bou: bourbonolido; Qin: qinghaosu.

As LSTs são produzidas a partir dos precursores pirofosfato de isopentenila (IPP) e

seu isômero pirofosfato de dimetilalila (DMAPP). Estas unidades de isopreno são produzidas

por meio de duas vias biossintéticas. A via do ácido mevalônico (MVA), que envolve

unidades de acetil coenzima A (acetil-CoA), e a via da triose/piruvato, que envolve piruvato e

gliceraldeído-3-fosfato, como mostra a figura A1 (Adam et al., 1998).

Na via do mevalonato, duas unidades de acetil-CoA sofrem condensação do tipo

Claisen, cujo produto sofre condensação aldólica com mais uma unidade de acetil-CoA,

formando o hidróximetilglutaril coenzima A (HMG-CoA). Este é então reduzido para formar

o MVA. O pirofosfato de MVA sofre descarboxilação originando o IPP, que pode isomerizar-

se a DMAPP (Adam et al., 1998).

Na via da triose/piruvato ocorre a condensação entre piruvato e gliceraldeído-3-

fosfato, seguido por redução e outras reações posteriores até a formação de IPP (Adam et al.,

1998).


O

O

HO

O

OP

OH

O

HO

OHOHHO

HO

IPPOPP

OPO

OH

OH

-CO2

NADPH

OH

OPP-Citidina

OH

HO

OH

OPP-Citidina

OH

PO

-CO2, -H2O

H

Acetil-CoA

Acetil-CoA

NADP

ATP

SCoA

O

OPP

OHO

O

H

SCoA

OOH

O

HO

SCoA

OO

OH

OHO

HO

OPPIPP

MVA

MVA-PP

acetil-CoA

acetoacetil-CoA

HMG-CoA

*

* *

*

*

*

* *

*

* *

*

*

*

*

*

*

*

*

1-desóxi-xilulose-5-P

piruvatogliceraldeído-3-P

*

*

[1-13C]-glicose

+

*

*

*

4-(citidina-5'-difosfato)-2-C-metil-eritritol

*

*

2-fosfo-4-(citidina-5'-difosfato)-2-C-metil-eritritol

Figura A1. Biossíntese de pirofosfato de isopentenila (IPP) por meio das vias do ácido mevalônico (MVA)

e da triose/piruvato. A glicose inicial foi marcada com 13C, assinalado por * (Adam et al., 1998). HMG-CoA: hidróximetilglutaril coenzima A; Acetil-CoA: acetil coenzima A; NADPH: fosfato de dinucleotídeo

nicotinamida adenina reduzido; ATP: trifosfato de adenosina.


A figura A2 mostra que a condensação tipo “cabeça-cauda” de duas unidades de

isopreno (IPP e DMAPP), desencadeada por um ataque nucleofílico do par de elétrons do IPP

ao −CH2OPP do DMAPP, formando o pirofosfato de geranila (GPP). A posterior adição de

mais uma unidade de IPP ao GPP forma o pirofosfato de farnesila (FPP), que após ciclização

via ataque nucleofílico intramolecular origina o germacreno A (ciclodecadieno), o precursor

de todas as LSTs (Bouwmeester et al., 2002; DeKraker et al., 1998; DeKraker et al., 2002).

Figura A2. Biossíntese do (+) − germacreno A por meio de condensação de unidades de isopreno. IPP: pirofosfato de isopentenila; DMAPP: pirofosfato de dimetilalila.

DMAPP

IPP

H

HR

OPP

H

PPO

OPP

HS

HR

IPP

OPP

HS

-OPP

Mg2+

OPP

DMAPP

OPP

+ IPP-OPPδ+

δ−

geranil-PP (GPP)

(E-E)-farnesil-PP (FPP) (+)-germacreno A

(+)-germacreno Asintase

GPP sintase FPP sintase


Uma oxidação regioespecífica e a incorporação de um grupo hidroxila direcionam a

lactonização. A lactonização pode ocorrer em C6 ou C8 e formar as cis- ou trans-lactonas. A

ligação entre C7 e C11 é sempre orientada β. Por isso, se a lactonização ocorrer em α no C6

ou no C8, a γ-lactona formada é denominada trans. A figura A3 mostra a formação do anel

trans-lactônico nos carbonos C6 e C8.

Figura A3. Lactonização para formação de 6α,12 e 8α,12-germacrolidos. De acordo com os passos biossintéticos, que implicam em estágios evolutivos ou

biogenéticos, as LSTs foram classificadas quanto à especialização de esqueleto. Os

[O]

1211

13

OOH

6

1211

13

OCoASOH

[O]

1211

138

OCoAS

OH

-H2O -H2O

O

O

O

[O]

O

6α,12-germacrolido 8α,12-germacrolido

(+)-germacreno A (+)-germacreno A - ácido carboxílico

6

8


precursores são considerados menos especializados do que seus derivados, os quais por sua

vez necessitam de mais passos reacionais para serem formados, ou seja, são biogeneticamente

mais complexos (Emerenciano et al., 1986; Seaman, 1982) como mostra a figura A4.

O

O

O

O

O

O

O

O

OPP

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

germacrolido

heliangolido

melampolido

germacradienolido

(E-E)-farnesyl-PP

elemanolido

eudesmanolido

guaianolido

dysihamifolido

secogermacranolido

trichosalviolido

germacreno A

I II

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

III IV

secoeudesmanolido

eremofilanolido

chrymoranolido

pseudoguaianolido

bourbonolido

xantanolido

norpsilotropin

secopseudoguaianolido

secopseudoguaianolido

neohelenanolido

norhelenanolido

Figura A4. Níveis de especialização de esqueletos de LST, I é menos especializado que IV (Seaman, 1982).


O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OHOH

O

O

OHO

O

O

OHO

O

[O]

[O]

+H2O

-H2O

furanoeliangolido

heliangolido

[O]

3

10

3

10

310

3

10

3

10

3

10

O germacrolido apresenta duas insaturações nas ligações 1(10) e 4(5), sendo

denominado 1(10),4-ciclodecadieno. Os isômeros referentes a estas duas insaturações é que

estabelecem os tipos de LST da classe dos germacranolidos. Assim, os quatro isômeros

trans,trans, cis,trans, trans,cis e cis,cis são denominados respectivamente germacrolido,

melampolido, heliangolido e o cis,cis-germacradienolido (Fig. A5).

Figura A5. Isômeros de germacranolido.

Na seqüência serão apresentados os tipos de LSTs representados neste trabalho.

O heliangolido, quando possui uma ligação éter entre C3 e C10 e um grupo cetona em

C1, passa a possuir um anel do tipo furano, sendo também chamado de furanoeliangolido

(Fig. A6).

Figura A6. Formação do furanoeliangolido a partir do heliangolido.

O

O

O

O

O

O

O

O

110

45

110

45

110

4 5

1 10

4 5

germacrolido (trans,trans) melampolido (cis,trans) heliangolido (trans,cis) germacradienolido (cis,cis)


O

O

O

O

O

R

O

H

X

O

O

O

O

OOH

R

eremantolidoO

O

O

O

furanoeliangolido

[O]

C8-esterificação

O

Ogermacrolido

Rearranjo de Cope

O

Oelemanolido

H

A partir do furanoeliangolido é formado o eremantolido (Fig. A7), originalmente

isolado de espécies de Eremanthus, tribo Vernonieae. Os eremantolidos caracterizam

especialmente a subtribo Lychnophorinae (Vichnewski et al., 1999). Uma vez que um de seus

representantes é objeto de estudo deste trabalho, na figura A7 é apresentada a proposta de

biossíntese para eremantolidos.

Figura A7. Formação do eremantolido a partir do furanoeliangolido.

Uma das substâncias estudadas é uma LST do tipo elemanolido. Os elemanolidos são

formados por rearranjo de Cope a partir de um germacrolido, como é proposto na figura A8.

Figura A8. Formação do elemanolido a partir do 6α,12-germacrolido.


Um aspecto importante na biogênese de LSTs é a ciclização de germacrolidos ou de

germacreno A para produzir esqueletos um pouco mais complexos. Os representantes mais

comuns são os guaianolidos e os eudesmanolidos, que ainda dão origem a vários outros tipos

de LSTs. Seguindo ainda o padrão de anéis de cinco e sete membros dos guaianolidos,

aparecem os pseudoguaianolidos, sendo os ambrosanolidos e os helenanolidos os mais

comuns. A figura A9 apresenta a biogênese dos helenanolidos, uma vez que um de seus

representantes mais conhecidos, a helenalina, é objeto de estudo deste trabalho. A proposta

para a biossíntese dos helenanolidos sugere que o processo inicia-se a partir de germacrolido

cis-lactonizado na posição 8. Há inicialmente a formação de guaianolido e após a epoxidação

no C4-C5 e posterior migração de uma metila de C4 para C5, forma-se o helenanolido.

Figura A9. Formação do helenanolido a partir da cis-lactona 8β,12-germacrolido.

As LSTs oxigenadas em C8 possuem, nesta posição, uma estereoquímica que

caracteriza algumas das tribos de Asteraceae. Vale lembrar que esta posição muitas vezes

encontra-se esterificada com ácidos de baixo peso molecular, como por exemplo, o angélico,

tíglico e metacrílico. Por exemplo, a grande maioria dos ésteres em C8 de LSTs das tribos

Heliantheae e Eupatorieae estão orientados na posição β, ao passo que os das tribos Cardueae

e Vernonieae estão orientados em α (Bohlmann, 1990; Bohlmann e Zdero, 1990).

6β,12-germacrolido H

[O]

O

HOH

1

5

O

O

O

O

O

O

H

O

OO

H

helenanolido(pseudoguaianolido)

trans-guaianolido


O

OS

H

R O

OH

S R

As LSTs possuem diversas atividades biológicas, como antimicrobiana, antitumoral,

antiinflamatória, atuam no sistema nervoso central, no sistema cardiovascular e são

alergênicas, dentre outras atividades (Picman, 1986; Rodriguez et al., 1976; Schmidt, 1999).

Formam a classe de metabólitos responsáveis pelas ações, por exemplo, da Arnica montana

(arnica), utilizada como antiinflamatório tópico no mundo todo. A atividade antiinflamatória

dá-se por modulação do processo de fosforilação oxidativa, agregação plaquetária e liberação

de histamina e serotonina, além da inibição do mediador central da inflamação, o NF-κB.

Todas essas atividades são atribuídas à presença de um grupamento carbonílico α,β-

insaturado. Esta sub-estrutura, ou farmacóforo, ocorre em γ-lactonas com grupo metilênico

exocíclico em α à carbonila, e também em sub-estruturas análogas presentes em alguns ésteres

conjugados presentes no C8, como o tiglato, angelato ou metacrilato. Esse tipo de sub-

estrutura presente no anel lactônico reage com grupos nucleofílicos, principalmente resíduos

de sulfidrila de cisteína no DNA, através da adição tipo Michael conforme figura abaixo

(Rüngeler et al., 1999).

Figura A10. Mecanismo da adição tipo Michael envolvendo a reação de um grupamento sulfidrila de um aminoácido em γ-lactonas com metileno exocíclico em α à carbonila.


1.3. Tricomas glandulares

Existem cerca de 300 tipos de tricomas no reino vegetal, porém em Asteraceae

existem, entre muitos outros, tricomas capitados, que formam um globo na ponta das células

apicais. Estes tricomas ditos glandulares são produtores e armazenadores de substâncias,

principalmente as LSTs. Os tricomas glandulares são formados em estágios iniciais do

desenvolvimento da folha, mas a biossíntese de LSTs só é iniciada após a irradiação de luz e,

uma vez formadas, a densidade de glândulas diminui com o início da expansão foliar (Spring,

1989; Spring, 1991). Estas estruturas não apenas acumulam e estocam substâncias, mas as

posicionam aparentemente como a primeira linha de defesa contra predadores na superfície da

planta. Normalmente as glândulas são facilmente rompidas ao toque, liberando seu conteúdo,

mas quando as folhas estão secas elas podem ser removidas inteiras, pois apenas a base do

tricoma se rompe. As glândulas podem ser amarelas ou brancas, embora todas transparentes (Fig.

A11). Aproximadamente 90 % dos táxons da subtribo Helianthinae, a maior da tribo Heliantheae,

possuem estas estruturas nos apêndices das anteras e 30 a 40 % não as possuem nas folhas e

estames. Dependendo da planta, possuem diâmetro de aproximadamente 20 a 80 µm (Spring,

1991).

apêndices da antera de flor superfície inferior de folha

Figura A11. Fotografias de tricomas glandulares nos apêndices das anteras de uma flor e na superfície inferior de uma folha. As duas primeiras fotografias foram feitas através de microscopia de varredura por O. Spring e a terceira pelo método convencional através de estereomicroscópio por K. Schorr. Os órgãos foram retirados

de espécies de Viguiera (Helianthinae, Heliantheae, Asteraceae).


Os constituintes químicos de glândulas de plantas coletadas e devidamente

armazenadas há 30 ou 40 anos atrás não apresentam sinais de degradação, o que se explica

por meio da hipótese da ação de antioxidantes, como por exemplo, dos flavonóides, também

presentes nas glândulas. Qualitativamente o conteúdo glandular é o mesmo para glândulas de

diferentes partes do vegetal, como folhas, caules e flores (Spring, 1991).

Por meio de uma técnica denominada “microamostragem de tricomas glandulares”

(Spring, 1989; Spring, 1991) é possível realizar análise rápida do conteúdo glandular sem

necessidade de isolamento dos metabólitos. A técnica consiste em coletar as glândulas

manualmente sob estereomicroscópico com auxílio de agulha ou pinça. Os tricomas secos

aderem facilmente à ponta da agulha permitindo seu carregamento até o solvente para

dissolução, como por exemplo, metanol ou acetonitrila. Em contato com o solvente a cutícula

glandular se rompe e o seu conteúdo extravasa. Esta solução pode então ser rapidamente

analisada por meio de CLAE, por exemplo. Os parâmetros cromatográficos obtidos para cada

pico do cromatograma, como tempos de retenção relativos a um padrão em diferentes

sistemas de fases móveis, absorção na região do UV e relação entre as intensidades de

absorção em dois comprimentos de onda, podem ser comparados a substâncias previamente

conhecidas para identificação imediata do pico (Da Costa et al., 2001).

A vantagem da localização de LSTs nos tricomas glandulares é que proporciona a

otimização dos estudos quimiotaxonômicos reduzindo custos, tempo de análise e consumo de

material (Spring, 1991; Spring e Buschmann, 1994). Esta técnica pode ser empregada em

escala preparativa, porém com algumas adaptações. Como a etapa de isolamento requer uma

quantidade maior de amostra, opta-se pela lavagem rápida da superfície do material vegetal

com solvente de polaridade intermediária, como por exemplo, o diclorometano, no intuito de

solubilizar um número grande de tricomas glandulares e evitar extração de outros materiais.

Outras formas de variação da técnica incluem análise por meio de CCDC, obtenção de

cromatogramas em outros comprimentos de onda na região do UV, uso de gradientes de fases

móveis e reações específicas, como a adição do tipo Michael com L-cisteína.

A microamostragem de tricomas glandulares permite a caracterização indireta das

LSTs, proporcionando determinação uniforme, rápida e eficiente de seu perfil químico. Por

esse motivo propõe-se aqui um modelo de método de controle de qualidade de plantas

baseado na análise de tricomas glandulares, o que reduz tempo e facilita o processo,

principalmente no que concerne ao preparo de amostra.


2. OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho resumem-se em:

1. isolamento e identificação estrutural de metabólitos secundários presentes em

tricomas glandulares, especialmente LSTs, de Smallanthus sonchifolius

(Asteraceae);

2. desenvolvimento de um método baseado no emprego dos tricomas glandulares

e validação das análises cromatográficas em CLAE, com vistas ao controle de

qualidade das folhas do material vegetal íntegro;

3. otimização de um método para a avaliação de mecanismos de ação relativos à

atividade antiinflamatória no que concerne à secreção de elastase por

neutrófilos;

4. aplicação de métodos adicionais para a avaliação de atividades biológicas de

LSTs isoladas de plantas da família Asteraceae, como S. sonchifolius, de dois

produtos fitoterápicos, como o gel de Arnica montana (Asteraceae) e o extrato

seco de Harpagophytum procumbens (Pedaliaceae), e de alcalóides isolados de

Isatis tinctoria (Brassicaceae).


3. BIBLIOGRAFIA

Adam, K.P.; Thiel, R.; Zapp, J.; Becker, H., 1998. Involvement of the mevalonic acid

pathway and the glyceraldehyde-pyruvate pathway in terpenoid biosynthesis of the

liverworts Ricciocarpos natans and Conocephalum conicum. Archives of

Biochemistry and Biophysics. 354: 181-187.

Alvarenga, S.A.V.; Ferreira, M.J.P.; Emerenciano, V.P.; Cabrol-Bass, D., 2001.

Chemosystematic studies of natural compounds isolated from Asteraceae.

Characterization of tribes by principal component analysis. Chemometrics and

Intelligent Laboratory Systems. 56: 27-37.

Anke, S.; Niemuller, D.; Moll, S.; Hansch, R.; Ober, D., 2004. Polyphyletic origin of

pyrrolizidine alkaloids within the Asteraceae. Evidence from differential tissue

expression of homospermidine synthase. Plant Physiology. 136: 4037-4047.

Aybar, M.J.; Riera, A.N.S.; Grau, A.; Sanchez, S.S., 2001. Hypoglycemic effect of the water

extract of Smallantus sonchifolius (yacon) leaves in normal and diabetic rats. Journal

of Ethnopharmacology. 74: 125-132.

Bohlmann, F., 1990. Chemistry of the Heliantheae (Compositae). Plant Systematics and

Evolution. 67-75.

Bohlmann, F.; Zdero, C., 1990. Systematics and evolution within the Compositae seen with

the eyes of a chemist. Plant Systematics and Evolution. 171: 1-14.

Bouwmeester, H.J.; Kodde, J.; Verstappen, F.W.; Altug, I.G.; de Kraker, J.W.; Wallaart, T.E.,

2002. Isolation and characterization of two germacrene A synthase cDNA clones from

chicory. Plant Physiology. 129: 134-144.

Bremer,K., 1994. Asteraceae - cladistics and classification. Timber Press. Portland, Oregon.

Burg, N.D.; Pillinger, M.H., 2001. The neutrophil: function and regulation in innate and

humoral immunity. Clinical Immunology. 99: 7-17.


Castro, V.; Rungeler, P.; Murillo, R.; Hernandez, E.; Mora, G.; Pahl, H.L.; Merfort, I., 2000.

Study of sesquiterpene lactones from Milleria quinqueflora on their anti-inflammatory

activity using the transcription factor NF-kappa B as molecular target.

Phytochemistry. 53: 257-263.

Da Costa, F.B.; Schorr, K.; Arakawa, N.S.; Schilling, E.E.; Spring, O., 2001. Infraspecific

variation in the chemistry of glandular trichomes of two Brazilian Viguiera species

(Heliantheae; Asteraceae). Journal of the Brazilian Chemical Society. 12: 403-407.

DeKraker, J.W.; Franssen, M.C.; Joerink, M.; de Groot, A.; Bouwmeester, H.J., 2002.

Biosynthesis of costunolide, dihydrocostunolide, and leucodin. Demonstration of

cytochrome p450-catalyzed formation of the lactone ring present in sesquiterpene

lactones of chicory. Plant Physiology. 129: 257-268.

DeKraker, J.W.; ranssen, M.C.; e Groot, A.; onig, W.A.; ouwmeester, H.J., 1998. (+)-

Germacrene A biosynthesis . The committed step in the biosynthesis of bitter

sesquiterpene lactones in chicory. Plant Physiology. 117: 1381-1392.

Emerenciano, V.P.; Kaplan, M.A.C.; Gottlieb, O.R.; Bonfanti, M.R.M.; Ferreira, Z.S.;

Comegno, L.M.A., 1986. Evolution of sesquiterpene lactones in Asteraceae.

Biochemical Systematics and Ecology. 14: 585-589.

Garcia-Piñeres,A.J., 2003. Tese/Diss.: Contribution to the elucidation of the anti-

inflamatory activity of sesquiterpene lactones. Fakultät für Chemie, Pharmazie und

Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg.

Heywood,V.A.; Harborne,J.B.; Turner,B.L., 1977. The biology and chemistry of the

Compositae. Acad. Press. London.

Inoue, A.; Tamogami, S.; Kato, H.; Nakazato, Y.; Akiyama, M.; Kodama, O.; Akatsuka, T.;

Hashidoko, Y., 1995. Antifungal melampolides from leaf extracts of Smallanthus

sonchifolius. Phytochemistry. 39: 845-848.


Johansson, S.; Goransson, U.; Luijendijk, T.; Backlund, A.; Claeson, P.; Bohlin, L., 2002. A

neutrophil multitarget functional bioassay to detect anti-inflammatory natural

products. Journal of Natural Products. 65: 32-41.

Klaas, C.A.; Wagner, G.; Laufer, S.; Sosa, S.; Della, L.R.; Bomme, U.; Pahl, H.L.; Merfort,

I., 2002. Studies on the anti-inflammatory activity of phytopharmaceuticals prepared

from Arnica flowers. Planta Medica. 68: 385-391.

Lindenmeyer,M.T., 2004. Tese/Diss.: Untersuchungen zum molekularen

Wirkmechanismus der antiinflamatorischen Aktivität von Sesquiterpenlactonen.

Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenchaften der Albert-Ludwigs-

Universität Freiburg.

Lindenmeyer, M.T.; Garcia-Piñeres, A.J.; Castro, V.; Merfort, I., 2004. Sesquiterpene

lactones inhibit luciferase but not beta-galactosidase activity in vitro and ex vivo.

Analytical Biochemistry. 328: 147-154.

Lyss, G.; Knorre, A.; Schmidt, T.J.; Pahl, H.L.; Merfort, I., 1998. The anti-inflammatory

sesquiterpene lactone helenalin inhibits the transcription factor NF-kappa B by

directly targeting p65. Journal of Biological Chemiytry. 273: 33508-33516.

Lyss, G.; Schmidt, T.J.; Pahl, H.L.; Merfort, I., 1999. Anti-inflammatory activity of Arnica

tincture (DAB 1998) using the transcription factor NF-kappa B as molecular target.

Pharmaceutical & Pharmacological Letters. 9: 5-8.

Passreiter, C.M.; Wendisch, D.; Gondol, D., 1995. Sesquiterpene lactones from Neurolaena

lobata. Phytochemistry. 39: 133-137.

Picman, A.K., 1986. Biological-activities of sesquiterpene lactones. Biochemical

Systematics and Ecology. 14: 255-281.

Rodriguez, E.; Towers, G.H.; Mitchell, J.C., 1976. Biological activities of sesquiterpene

lactones. Phytochemistry. 15: 1573-1580.

Rüngeler, P.; Castro, V.; Mora, G.; Goren, N.; Vichnewski, W.; Pahl, H.L.; Merfort, I.;

Schmidt, T.J., 1999. Inhibition of transcription factor NF-kappa B by sesquiterpene


lactones: a proposed molecular mechanism of action. Bioorganic & Medicinal

Chemistry. 7: 2343-2352.

Rüngeler, P.; Lyss, G.; Castro, V.; Pahl, H.; Merfort, I., 1998. Study of three sesquiterpene

lactones from Tithonia diversifolia. on their anti-inflammatory activity using the

transcription factor NF-kappa B and enzymes of the arachidonic acid pathway as

targets. Planta Medica. 64: 558-593.

Schmidt, T.J., 1999. Toxic activities of sesquiterpene lactones: structural and biochemical

aspects. Current Organic Chemistry. 3: 577-608.

Schorr, K.; Garcia-Piñeres, A.J.; Siedle, B.; Merfort, I.; da Costa, F.B., 2002. Guaianolides

from Viguiera gardneri inhibit the transcription factor NF-kappa B. Phytochemistry.

60: 733-740.

Seaman, F.C., 1982. Sesquiterpene lactones as taxonomic characters in the Asteraceae.

Botanical Review. 48: 121-595.

Siedle, B.; Gustavsson, L.; Johansson, S.; Murillo, R.; Castro, V.; Bohlin, L.; Merfort, I.,

2003. The effect of sesquiterpene lactones on the release of human neutrophil elastase.

Biochemical Pharmacology. 65: 897-903.

Spring, O., 1989. Microsampling: an alternative approach using sesquiterpene lactones for

systematics. Biochemical Systematics and Ecology. 17: 509-517.

Spring,O., 1991. Trichome microsampling of sesquiterpene lactones for the use of systematic

studies. In Recent advances in Phytochemistry, Modern Phytochemical Methods.

Plenum Press. New York. Ed. 1. 319-345.

Spring,O.; Buschmann,H., 1994. A chemotaxonomic survey of sesquiterpene lactones in the

Helianthinae (Compositae). In Compositae: systematics. Proceedings of the

International Compositae Conference. Kew, UK. Ed. 1. 307-311.

Valentová, K.; Cvak, L.; Muck, A.; Ulrichová, J.; Simanek, V., 2003. Antioxidant activity of

extracts from the leaves of Smallanthus sonchifolius. European Journal of Nutrition.

42: 61-66.


Valentová, K.; Frcek, J.; Ulrichová, J., 2001. Yacon (Smallanthus sonchifolius) and maca

(Lepidium meyenii), traditional Andean crops as new functional foods on the European

market. Chemicke Listy. 95: 594-601.

Valentová, K.; Moncion, A.; de Waziers, I.; Ulrichová, J., 2004. The effect of Smallanthus

sonchifolius leaf extracts on rat hepatic metabolism. Cell Biology and Toxicology.

20: 109-120.

Vichnewski, W.; Skrochy, C.A.; Nasi, A.M.T.T.; Lopes, J.L.C.; Herz, W., 1999. 15-

Hydroxyeremantholide B and derivates from Eremanthus arboreus. Phytochemistry.

50: 317-320.

Witko-Sarsat, V.; Rieu, P.; Descamps-Latscha, B.; Lesavre, P.; Halbwachs-Mecarelli, L.,

2000. Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects. Laboratory

Investigation. 80: 617-653.

Zardini, E., 1991. Ethnobotanical notes on yacon, Polymnia sonchifolia (Asteraceae).

Economic Botany. 45: 72-85.

c. introduÇÃo e objetivos · (valentová et al., 2001). o chá feito a partir das folhas, as...

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