应用 ce-lif 方法分析重组人 1型单纯疱疹...

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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2020,40(1) ·37·

应用 CE-LIF 方法分析重组人 1 型单纯疱疹病毒的 DNA 限制酶酶切片段 *

李响 1，胡金盼 1，李永红 1，任挺钧 2，陈泓序 2，周勇 1**，饶春明 1**

（1. 中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室，北京 100050；2. CE & Biopharma Sciex，北京 100026）

摘要　目的：建立毛细管电泳 - 激光诱导荧光（CE-LIF）检测方法，对重组人 1 型单纯疱疹病毒（rHSV-1）的

DNA 限制性酶切片段进行分析。方法：以 rHSV-1 为研究对象，用核酸提取仪提取其 DNA，以 DNA 限制性内

切酶 Nde Ⅰ酶切，以 SYBRTM Gold nucleic acid 作为荧光标记物，利用 CE-LIF 实现分离检测，通过 DNA ladder计算片段大小。CE-LIF 条件：采用涂层毛细管（有效长度 30 cm，总长度 40 cm，内径 100 µm），3.45 kPa 压力

进样 3 s；毛细管分离温度设为 25 ℃，毛细管分离电压为 -7 kV，分离时间 40 min；LIF 检测器的激发波长及发

射波长分别为 488 nm 和 520 nm。结果：新建方法可以对 8 个目标酶切片段分离检测，各片段峰迁移时间的

RSD（n=6）均小于 0.35%，片段峰 1~7 校正峰面积百分比的 RSD（n=6）均小于 5.6%，方法精密度良好。通过

DNA ladder 回归方程，对 DNA 酶切产物进行片段大小的计算，各片段大小计算结果 RSD（n=6）均小于 5.8%，

且与琼脂糖凝胶电泳法测得结果相一致。结论：本研究建立的 rHSV-1 的 DNA 限制酶酶切片段 CE-LIF 分析

法自动化程度高，灵敏度高，重复性好，试剂消耗及环境污染小，适用于 rHSV-1 的鉴别分析。

关键词：重组人 1 型单纯疱疹病毒；DNA 限制酶酶切；荧光标记；激光诱导荧光检测；毛细管电泳

中图分类号：R 917　　　文献标识码：A　　　文章编号：0254-1793（2020）01-0037-06doi：10.16155/j.0254-1793.2020.01.05

Analysis of DNA restriction enzyme fragments of recombinant human herpes simplex virus type 1 by capillary electrophoresis

with laser-induced fluorescence detection*

LI Xiang1， HU Jin-pan1， LI Yong-hong1， REN Ting-jun2， CHEN Hong-xu2，

ZHOU Yong1**， RAO Chun-ming1**

（1. National Institutes for Food and Drug Control， Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality and

Standardization of Biotech Products， Beijing 100050， China； 2. CE & Biopharma Sciex， Beijing 100026， China）

Abstract　Objective： To analyze the DNA restriction fragments of recombinant human herpes simplex virus type

　　 *　国家科技重大专项课题资助项目（2018ZX09733002-005）”

　　**　通信作者　饶春明　Tel：（010）67095380；E-mail：[email protected]　　　　　　　　　周　勇　Tel：（010）67095684；E-mail：[email protected] 　　　　第一作者　李　响　Tel：（010）67095586；E-mail：[email protected]　　　　　　　　　胡金盼　Tel：（010）67095359；E-mail：[email protected]

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药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2020,40(1)·38·

1（rHSV-1） by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence （CE-LIF） detection. Methods： The DNA of rHSV-1 was extracted by nucleic acid extractor and digested by DNA restriction endonuclease Nde Ⅰ. SYBRTM gold nuclear acid was used as fluorescent dye. The labeled DNA fragments were separated and detected by CE-LIF and their sizes were calculated based on DNA ladder. The CE-LIF was operated with a coated fused silica capillary tube （effective length： 30 cm； total length： 40 cm； internal diameter： 100 µm） under 25 ℃，-7 kV for 40 min. The sample was injected under 3.45 kPa for 3 s. The excitation wavelength and emission wavelength were 488 nm and 520 nm separately. Results： This method could separate and detect eight target fragments. RSD of the peak migration time of each fragment was less than 0.35%（n=6）， and the RSD of the corrected peak area percentage of fragment peak 1-7 was less than 5.6%（n=6）， indicating good precision of the method. The sizes of DNA fragments were calculated by regression equation of DNA ladder. For each fragment， RSD was less than 5.8%

（n=6）， and the calculated size was consistent with the result of agarose electrophoresis. Conclusion： The CE-LIF method established in this study has the advantages of high automation， high sensitivity， good repeatability， low reagent consumption and environmental pollution， which is suitable for the identification and analysis of rHSV-1 vector of gene therapy drugs.Keywords： rHSV-1； DNA restriction enzyme digestion； fluorescent labeling； laser-induced fluorescence detection； capillary electrophoresis

基因治疗是目前生物治疗领域的热点之一，基

因治疗药物分为非病毒载体（如质粒等）和病毒载体

（如腺病毒等）2 类，以病毒为载体的基因治疗药物因

为其可以高效率地导入而占据了绝对主导地位［1-3］，

为保障基因治疗药物的安全性和有效性，必须研究建

立质量控制分析方法和质量标准。鉴别作为关键质

量属性，在基因治疗药物的质控中是不可或缺的，基

因治疗药物的鉴别通常从核酸水平和蛋白质水平进

行。在核酸水平常采用限制性酶切图谱分析等方法，

对载体及目的基因进行酶切和琼脂糖电泳分离分析

鉴定。毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是

近几年发展快速的一种新的分离分析技术，与传统电

泳方法相比，具有自动化程度高，分辨率高，重复性

好，灵敏度高，试剂消耗少，环境污染小等特点［4-6］，

在蛋白质、多肽、核酸等分离分析领域有着越来越多

的应用［7-9］。

本文以重组人 1 型单纯疱疹病毒（rHSV-1）为研

究对象，利用 Nde Ⅰ限制性内切酶将其特异性酶切为

大小、数量不同的 DNA 片段，通过荧光标记，采用激光

诱导荧光（laser induced fluorescence， LIF）检测器，研

究建立了毛细管电泳的分离分析方法，对该基因治疗

药物载体进行了限制性酶切图谱的鉴别分析。

1　仪器与试药

1.1　仪器　PA800 Plus 毛细管电泳系统（Sciex 公

司）；32 Karat 软件， Version 10.0（Sciex 公司）；激

光诱导荧光检测器（Sciex 公司），激发波长 488 nm，检测波长 520 nm。DU800 紫外分光光度计

（BeckmanCoulter 公司）；H2O3 金属浴温控系统（金

银杏生物科技公司）；FLX96 核酸提取仪（Thermo 公

司）；TRANSSONIC460 超声波清洗仪（Elma 公司）。

1.2　试剂和样品　核酸提取试剂盒（北京万泰

生物药业股份有限公司），内含 DNA 提取液 1~6；

dsDNA1000 分析试剂盒（Sciex 公司），内含 CE 筛分

介质，DNA 涂层熔融石英毛细管（内径 100 µm，Sciex公司）；SYBRTM Gold nucleic acid（Invitrogen 公司）；

超纯水（Milli-Q Labsystem， Millipore 公司）。Nde I限制性内切酶及限制性内切酶缓冲液（TAKARA 公

司），琼脂糖（BIOWEST 公司）；DL15000 DNA Marker（TAKARA 公司）。本研究用 rHSV-1 为中国食品药

品检定研究院重组药物室检验留样。 2　方法与结果

2.1　样品的处理　取 3 块 96 孔深孔板，在第 1 块 96孔深孔板每孔中加 600 μL DNA 提取液 1；向第 2 块

深孔板每孔中加 500 μL DNA 提取液 2、10 μL DNA提取液 6 和 20 μL DNA 提取液 5；向第 3 块深孔板每

孔中加 500 μL DNA 提取液 3；取样品 400 μL，加至

第 1 块深孔板中，共加 9 孔。在核酸提取仪上按照

试剂盒说明书设置程序，至最后一步洗脱前停止程



序，回收第 3 块深孔板中样品孔的混悬液，置于磁力

架上吸附混悬液中磁珠，小心吸除上清，将磁珠室温

静置 15 min 充分晾干后加入超纯水 60 μL，于 55 ℃

震摇 5 min 后，置磁力架上，上清即为提取后病毒核

酸，经紫外分光光度仪于 260 nm 波长处检测，质量浓

度为 64 μg·mL-1。取病毒核酸 42 μL，加入限制性内

切酶（Nde Ⅰ）和限制性内切酶缓冲液各 3 μL ，轻弹

混匀，5 000 r·min-1 离心 5 s 后，于 37 ℃孵育 15 min后即得样品酶解液，可用于琼脂糖电泳，取样品酶解

液 50 μL，加入超纯水 84 μL，混匀，取 10 μL，再加入

超纯水 90 μL，混匀，即得供试品溶液，质量浓度为

2 μg·mL-1；取超纯水 42 μL，按提取后的病毒核酸处

理方法同法处理，即得空白品溶液。

取 1 支 CE 筛分介质，加入超纯水 20 mL，在室

温下搅拌 24 h，保证其充分溶解。再加入 SYBRTM Gold nucleic acid 2 μL，充分混合均匀，用超声波清洗

仪 460 Hz 超声 5 min 去除气泡，即得 CE 筛分介质

溶液。

2.2　实验条件的优化及建立　影响毛细管电泳分离

DNA 片段的因素有很多，如分离胶浓度、进样电压、

毛细管长度等，为得到最优实验条件，本研究对筛分

介质溶液浓度、进样条件、分离电压、分离温度及毛细

管长度对各片段峰分离度的影响分别进行了比较，

结果见图 1~5，样品片段峰 1 与峰 2 的分离度表示

为 R1-2，峰 2 与峰 3 的分离度表示为 R2-3，依次类推，

样品各片段峰分离度依次记为 R1-2、R2-3、R3-4、R4-5、

R5-6、R6-7、R7-8。分离度按美国药典 USP 的计算公式，

即 R1-2=2（t2-t1）/（W2-W1），其中 t1 和 t2 是峰 1 和峰

2 的迁移时间，W1 和 W2 是峰 1 和峰 2 的峰宽。分离

度可由仪器软件直接计算得到，实验结果显示，在筛

分介质浓度为 3.5% 时，各峰分离度最好。降低进样

压力或减少进样时间可以提高分离度，但导致信号降

低，高分离电压虽然可以缩短峰迁移时间，但是过快

的迁移会导致分离度的降低，综合选择分离电压为

-7 kV。分离温度能够影响筛分介质的粘稠度，同样

对分离效果也产生影响，这些都需要综合考量选择。

研究比较了 30 cm 有效长度和 40 cm 有效长度的毛

细管对分离效果的影响，结果表明 2 种长度的毛细管

分离效果相差不大，故本实验采用分离时间更短的

30 cm 有效长度的毛细管。

通过比较，综合考虑分离度、迁移时间以及信号

响应值，确立的实验条件为采用有效长度为 30 cm 的

涂层毛细管，分离温度设为 25 ℃，样品储存温度设为

10 ℃ ；压力进样，进样压力设为 3.45 kPa ，进样时间

3 s；毛细管分离电压为 -7 kV，分离时间 40 min；检

测器为 LIF，激发波长及发射波长分别为 488 nm 和

520 nm；用超纯水做空白品，实验图谱见图 6。

图 1　不同浓度的筛分介质下样品的分离度折线图

Fig. 1　Resolution turning curve gram of sample under different concentrations of separation medium

图 2　不同分离电压下样品的分离度折线图

Fig. 2　Resolution turning curve gram of sample under different separation voltages

图 3　不同进样条件下样品的分离度折线图

Fig. 3　Resolution turning curve gram of sample under different injection conditions



图 4　不同分离温度下样品的分离度折线图

Fig. 4　Resolution turning curve gram of sample under different separation temperatures

图 5　不同长度的毛细管中样品的分离度折线图

Fig. 5　Resolution turning curve gram of sample under different capillary lengths

1~8. 样品各片段峰（peak of each fragment of the sample）

a. 样品的 CE-LIF 图（CE-LIF of sample）　b. 空白品的 CE-LIF 图（CE-LIF of blank）

A. 样品和空白品的 CE-LIF 图（CE-LIF of sample and blank）　B. 样品和 DNA ladder（1~15 kbp）的琼脂糖电泳图（agarose electrophoresis of sample and DNA ladder）　 C. DNA ladder 的 CE-LIF 图（CE-LIF of DNA ladder）　D. DNA ladder 的片段大小拟合曲线（fragment size fitting curve of DNA ladder）图 6　样品、空白品和 DNA ladder 的 CE-LIF 图与琼脂糖电泳图

Fig. 6　CE-LIF and agarose electrophoresis of sample， blank and DNA ladder



2.3　线性关系考察　取供试品溶液通过改变进样压

力和进样时间，由 SCIEX 的软件计算得到进样体积

分别为 0.89、2.67、4.45、7.42、14.85 nL，样品进样量

范围为 1.78~29.7 pg，在该范围内各校正峰面积 Y 与

进样量 X 线性相关，峰 1~7 的 R2 均大于 0.993 2，线

性关系良好。结果见表 1。

表 1　线性关系考察

Tab. 1　Validation of linearity 峰号

（peak No.）线性方程（linear equation） R2

1 Y=1 080.7X-525.88 0.998 8

2 Y=1 569.3X-729.54 0.999 2

3 Y=3 396.9X-1 257.6 0.999 4

4 Y=2 301.8X-1 124.1 0.998 8

5 Y=2 205.2X-1 654.7 0.996 8

6 Y=2 135.4X-1 099.4 0.998 9

7 Y=1 817.2X-2 100.3 0.993 2

8 Y=905.6X+986.09 0.960 2

2.4　精密度试验　取供试品溶液，重复进样 6 针，考

察方法精密度，各峰迁移时间的 RSD 均小于 0.32%，

峰 1~7 校正峰面积百分比的 RSD 均小于 5.6%，各

峰的片段大小计算结果 RSD 均小于 5.8%，精密度良

好。统计结果见表 2。

2.5　样品稳定性试验　将供试品溶液在 10 ℃下

分别放置 0、2、4、8、12、24 h 后进样分析，表现出

较好的稳定性。其各个峰迁移时间的 RSD 均小于

0.50%，校正峰面积百分比的 RSD 均小于 5.8%，结果

见表 3，供试品溶液 24 h 内稳定性良好。

2.6　CE 结果与琼脂糖电泳结果的比较　通过 DNA ladder DL 15000，由 32 Karat 分析软件拟合曲线方程：

Y=aX3+bX2+cX+d（其中 Y 为片段分子大小，X 为片

段迁移时间，a=4.955×10-7，b=-0.002 8，c=5.239，d=-3 284，R2=0.998 8）计算各片段大小。DNA ladder 结

果见图 6。采用传统的琼脂糖电泳的方法［10］检测出 7条带，结果见图 6，将琼脂糖电泳结果经过灰度扫描分

析后，与 CE 方法的结果相一致，比较结果见表 4。

表 2　精密度试验结果（n=6）

Tab. 2　Results of precision test

峰号

（peak No.）

迁移时间

（migration time）

校正峰面积百分比

（corrected peak area ratio）

片段大小

（fragment size）

均值（mean）/min RSD/% 均值（mean）/% RSD/% 均值（mean）/kbp RSD/%1 33.82±0.10 0.31 7.51±0.18 2.5 4.87±0.26 5.32 34.54±0.11 0.31 10.66±0.49 4.6 7.20±0.42 5.83 34.80±0.10 0.30 22.66±0.70 3.1 8.25±0.47 5.74 35.41±0.11 0.30 14.64±0.25 1.7 11.47±0.63 5.55 35.64±0.11 0.30 13.68±0.48 3.3 12.91±0.72 5.66 35.84±0.11 0.31 13.66±0.38 2.8 14.29±0.79 5.57 36.40±0.47 0.30 10.03±0.57 5.6 20.33±1.04 5.18 36.76±0.12 0.32 7.11±0.88 12.4 22.19±1.15 5.2

表 3　稳定性试验结果（n=6）

Tab. 3　Results of stability test

峰号

（peak No.）

迁移时间

（migration time）

校正峰面积比

（corrected peak area ratio）

均值

（mean）/minRSD/

%均值

（mean）/%RSD/

%

1 33.53±0.17 0.50 7.35±0.30 4.0

2 34.23±0.17 0.49 11.46±0.17 1.4

3 34.49±0.17 0.48 25.38±0.70 0.56

4 35.09±0.17 0.49 16.22±0.61 3.8

5 35.32±0.17 0.48 13.08±0.21 1.6

6 35.51±0.17 0.49 13.43±0.31 2.3

7 36.25±0.17 0.47 7.67±0.34 4.5

8 36.40±0.15 0.41 5.42±0.31 5.8

表4　CE方法与琼脂糖电泳方法对DNA片段大小的测定结果比较

Tab. 4　Comparison of the test results of DNA fragments by

CE and agarose electrophoresis

峰号

（peak name）

大小（size）/kbp

CE琼脂糖电泳

（agarose electrophoresis）

1 4.87 4.642 7.20 6.723 8.25 8.064 11.47 11.455 12.91 12.856 14.29 14.437 20.33 20.438 22.19 —



3　讨论

rHSV 是常用的基因治疗药物载体之一，分为 2个血清型（rHSV-1、rHSV-2）。目前用于基因治疗

的载体主要为 rHSV-1 型，该类病毒颗粒较大，是双

链 DNA 病毒［11-12］，对此类病毒载体结构的鉴别主要

采用限制酶酶切图谱的方法，通过对酶切产物进行琼

脂糖凝胶电泳检测，与理论酶切位点、酶切片段大小

比较，确认重组病毒载体结构是否与预期改造结果一

致，但由于分离技术的原因，一些过大或过小的酶切

片段无法有效分离检出，因此在限制性酶切图谱鉴别

上，通常采用酶切后与对照品酶切产物比较的方法，

通过电泳分析，以确认酶切图谱与对照品酶切图谱

是否一致。本研究对象 rHSV-1 经 Nde Ⅰ酶切，理论

上可获得 13 个特定大小的 DNA 片段，片段大小从

51 bp 到 26 629 bp 不等，跨度较大，虽然从实际分离

的结果看 CE 和琼脂糖电泳尚无法全部顾及，但从实

验结果看 CE 的分离效果要优于琼脂糖电泳。

本研究所采用的 CE 筛分介质为商品化的试剂，

是一种亲水高分子聚合物溶液，易于毛细管的填充，

每次进样更新分离介质非常方便。目前对于 DNA 在

高分子溶液中的分离机理还不很清楚，被广泛接受

的一种理论是爬行理论假说［13］，该假说认为高分子

聚合物溶液如同很多根管道，如线团一样的 DNA 片

段像蛇一样在这些管子中爬行穿过，在电场力作用

下 DNA 片段的淌度与电场强度平方成正比，与其大

小成反比。这种高分子介质的浓度，以及分离条件如

电压、温度等都会对 DNA 电泳迁移产生重要影响，低

浓度的筛分介质无法形成有效的筛网，造成分离度的

降低，高电压虽然可以提高电泳速度，缩短迁移时间，

但是会降低分离度，而低电压由于电泳速度缓慢，条

带更容易扩散，也会降低分离度。本研究通过多实验

条件的优化，研究建立了 rHSV-1 的限制性酶切图谱

CE-LIF 分离分析方法，测定结果与琼脂糖电泳结果

相符合，CE-LIF 方法精密度好，灵敏度高，试剂消耗

少，环境污染少，自动化程度高，适用于该类基因治疗

产品的酶切片段的鉴别检测。

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（本文于 2019 年 11 月 17 日收到）

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