UNIVERZITET U BANJOJ LUCIPrirodno-matematiki fakultetKatedra za botaniku

BOJENJE PREPARATA BEZ INKLUZIJE U PARAFIN, GLICERIN ELATINSKI I SKVO PREPARATI

Student: Mentori:

Jelena SamacProf. dr Nada umati

189/12Doc. dr Sinia kondri

Banja Luka, maj 2015.1.UVOD

Svaki presjek, bez obzira na koji nain je napravljen, da li iletom, sjeen na mikrotomu od svjeeg ili fiksiranog materijala, ili je napravljen iz parafinskog kalupa mogue je obojiti i napraviti privremeni ili trajan preparat. Presjeke je mogue obojiti na razliite naine, razliitim bojama. U ovom seminarskom radu bie detaljnije objanjeno na koji nain je mogue bojiti presjeke na razliite naine, kao i postupak pripremanja glicerin elatinskih preparata i skvo preparata. Ciljevi ovog rada jesu: 1. Upoznati studente i uenike sa hemijskim supstancama koje se koriste kao i bojama i njihovim dejstvom prilikom pravljenja preparata, kao i mjerama opreza prilikom koritenja.2.Upoznavanje studenata i uenika sa tehnikama izrade privremenih i trajnih preparata, postupcima pripremanja i nainima bojenja razliitim bojama.3. Ukazati na to da je sa malim materijalnim ulaganjem mogue napraviti biljni preparat.

2.BOJENJE PREPARATA NA MIKROTOMU BEZ INKLUZIJE U PARAFIN

Bilo koji presjek napravljen razliitim tehnikama sjeenja i od razliitog materijala, mogue je obojiti i napraviti privremeni ili trajan preparat. Postoji i tehnika bojenja presjeka od materijala koji nije inkluziran u parafin. Ovakva tehnika zahtjeva da se presjeci napravljeni slobodnom rukom uz pomo ileta ili na mikrotomu od svjeeg biljnog ili fiksiranog materijala sprovedu kroz seriju alkohola i boje na predmetnom ili sahatnom staklu. Tehnika bojenja na predmetnom staklu se koristi ako je u pitanju 1-2 preparata, dok se sahatna stakla koriste ako ih je vie. Proces bojenja preparata zahtjeva da preparati prou kroz serije alkohola i boju, a da se pri tome ne otete ili ne osue. Postoje dva najjednostavnija naina: 1.Presjeci se finom etkicom prebacuju iz jednog u drugo sahatno staklo. Ovakav nain rada zahtjeva pripremu onoliko sahatnih stakala kroz koliko razliitih agenasa materijal prolazi sve do konanog uvoenja u kanade balzam ili neku drugu materiju.2.U toku rada presjeci mogu da ostanu u jednom sudu, samo ako se pipetom izvue ili odlijevanjem ukloni reagens u kome su stajali, i poslije ispiranja dodaje se svjea porcija odgovarajueg reagensa.Ovakva nain rada ne zahvtjeva mnogo materijalnog ulaganja, svega nekoliko reagenasa i ileta, alkohol 95% ili apsolutni, boja po izboru 5-10 g, nekoliko odgovarajuih sudova, litar ksilola, kanada balzam-1 tuba. afranin-vodeno plavo je jedna od estih kombinacija koja se koristi pri ovakvom nainu rada (Slika 1.).

Slika 1. Presjek obojen afranin-vodeno plavo(https://www.google.ba/search?tbm=isch&tbs=rimg%3ACceooRfBgsQ0IjhWej9aVcupyVmpVcKYJTVFjjsfiYofcahFfSgGidJaBDz6uzGiQHFOvhPAXXjL_)

Presjeci napravljeni od fiksiranog materijala odmah se stavljaju u afranin u kome ostaju 10-30 minuta, a ponekad i 24h. Nakon afranina, presjeci se diferenciraju u 50% alkoholu i prenose u boju u vodeno plavo. U boji ostaju do 10 minuta, a zatim se prenose u 95% alkohol. Diferenciranje prebojenih presjeka se vri u zakiseljenom alkoholu. Zakiseljen alkohol predstavlja rastvor 100 ml 95% alkohola sa kap-dvije sone kiseline. Kada se postigne odgovarajui ton boje, presjek se ispere vie puta istim alkoholom. Diferenciranje se vri sve dok se alkohol boji, odnosno dok se ne ispolje jasne razlike u obojenosti tkiva. afranin sva odrvenjena tkiva boji u crveno, a celulozni i drugi ne odrvenjeni zidovi bie plavi do vodeno plavi.Dehidratacija presjeka se vri u apsolutnom alkoholu, koji se vie puta mijenja. Vano je da dehidratacija bude potpuna, inae e se presjeci pri prenoenju u ksiol zamutiti. U ksiolu presjeci ostaju 5-10 minuta. Iz ksiola se presjeci prenose na predmetnu plou i stavljaju u kanade balzam, pokrivaju se pokrovnom ploicom i ostavljaju na suenje nekoliko dana. Nakon suenja trajni preparat je zavren.

3.GLICERIN-ELATINSKI PREPARATI

Glicerinelatinski preparati su trajni preparati napravljeni od svjeeg materijala, bez sprovoenja kroz alkohole, a brzo se pripremaju. Neobojeni preparati se stavljaju u glicerin-elatin, jer u njemu brzo izblijede, osim nekih postojanijih npr.metilensko plavo.

3.1. Pripremanje glicerin elatina

U 6 ml destilovane vode, koja se sipa u vatrostalnu posudu, dodati 1 g elatina. elatin u destilovanoj vodi ostaje nekoliko asova i za to vrijeme bubri. U posudu se jo dolijeva 7 ml hemijski istog glicerina i ubacuje kristali antiseptika. Kao antiseptik se koriste timol i fenol. Zatim se posuda prenosi u vodeno kupatilo i zagrijava. Sadraj u posudi je potrebno vie puta promijeati staklenim tapiem. Poslije otapanja i homogenizovanja glicerin-elatin se profiltrira kroz lijevak u kome se nalazi staklena vata. Na ovaj nain se odstranjuju nepoeljne primjese. Filtriranje se vri u termostatu. Ovakvo pripremljeno ljepilo je veoma postojano i uva se u friideru. Pri korienju glicerin-elatina potrbno je staklenu posudu zagrijavati u vodi sve dok se on ne otopi. Na predmetno staklo se staklenim tapiem prenese kap glicerin elatina i u nju se utapaju napravljeni presjeci, polenova zrna ili neki drugi materijal, pokrivaju se pokrovnim staklom. Kada se glicerin-elatin stegne, dobija se trajan preparat.

4.SKVO PREPARATI

Tehnika skvo preparata (engl. squash-gnjeiti, spljeskati), se koristi u savremenoj mikrobiolokoj tehnici, pri prouavanju procesa elijske diobe, odreivanju broja hromozoma i analize kariotipova (Slika 2.). Skvo preparati su najee privremeni, ali se mogu posebnim postupkom prevesti u trajne. Karakteristika skvo preparata je da se pod mikroskopom posmatra macerirano tkivo. Ova metoda ima iroku primjenu i niz specifinih postupaka.

Slika 2. Prikaz anafaze elijske diobe, jedan od tipova skvo preparata(https://www.google.ba/search?q=squash+preparation&newwindow=1&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=1xVPVfr9Doyv7AbuxgE&ved=0CAgQ_AUoAQ&biw=1517&bih=741&dpr=0.9#imgrc=xm)

4.1. Opti nain pripremanja skvo preparata

Ovi preparati se prave od mladih biljnih organa ije su elije u fazi intenzivne diobe. Materijal je potrebno specijalno obraditi prije fiksiranja, posebno ako se javljaju tekoe u brojanju hromozoma. Najei reaktivi koji se koriste su holoralhidrat, kolhicin, paradihlorbenzol, 8-hidroksihinolin, u poslednje vrijeme se koriste i enzimi (citaza). Pri radu sa ovim reaktivima neophodno je koristiti gumene rukavice. Hloralhidrat se koristi u vidu 0,3 do 1% vodenog rastvora. Materijal u hloralhidratu se dri 1 sat, a zatim se ispira tekuom vodom isto toliko vremena i jo 2 do 4 sata ostavlja u vlanoj komori, pa tek onda fiksira. Ovaj reaktiv se najee koristi u cilju skraivanja hromozoma. Prije samog fiksiranja materijal, na kome ispitujemo broj, raspored i grau hromozoma, obrauje se rastvorom kolhicina u trajanju od 2 sata. Paradihlorbenzol se koristi kao sredstvo za obradu korjenia. Zasien rastvor se dobija rastvaranjaem 5-10 g kristala paradihlorbenzola u 500 ml destilovane vode. Ovaj rastvor se ostavlja u termostat u zatvorenoj posudi 10 do 12 asova na temperaturi od 60C. U ovako pripremljenom rastvoru materijal se dri 2 do 3 sata prije fiksiranja na temperaturi izmeu 12C i 16C.8-hidroksihinolin se upotrebljava kao 0,002 M rastvor pri temperaturi od 10C do 14C. Materijal u njemu provodi 3 sata i nakon ispiranja u tekuoj vodi se fiksira.Glacijalna siretna kiselina i apsolutni alkohol u odnosu 3:1 se koriste za fiksiranje materijala koji se koristi za skvo preparate. Fiksativ Karnoa se takoe koristi za fiksiranje materijala u kome materijal ostaje 2 do 12 asova. Vrijeme fiksiranja se odreuje u zavisnosti od vrste materijala. Poslije fiksiranja objekti se ispiraju u 70% alkoholu. Objekti se poslije fiksiranja maceriraju. Maceriranje se obavlja na razliite naine: prokuvavanjem u boji, 45% glacijalnom kiselinom, 40-50% proprionskom kiselinom, u 1 n sonoj kiselini. Nakon maceracije slijedi bojenje skvo preparata. Za bojenje se koriste razliite boje: acetokarmin, acetorsein, acetolakmoid i metilensko plavo.

4.2.Pripremanje boja

Svaka od predhodno navedenih boja ima razliit postupak pripreme, sa razliitim kiselinama, vremenom uparavanja, koliinom destilovane vode i slino.4.2.1.Acetokarmin1 do 2 g karmina rastvoriti u 45 ml glacijalne siretne kiseline i 55 ml destilovane vode. Rastvor treba da se uparava 30 do 60 minuta. Nakon hlaenja tamno crveni rastvor karmina se profiltrira i odlae u dobro zatvorenu posudu prije upotrebe.4.2.2. Acetorsein1 g orseina ratvoriti u 45 ml vrele siretne kiseline i ostaviti da se ohladi. Nakon hlaenja dodati 55 ml destilovane vode, dobro izmjeati, profiltrirati i boja je spremna za upotrebu. 4.2.3. Acetolakmoid2g lakmoida rastvoriti u 100 ml 45 % siretne kiseline i uparavati do suve supetance. Poslije uparavanja, ponovo dodati siretnu kiselinu do nivoa zapremine na poetku uparavanja. Prije upotrebe neophodno je profiltrirati boju. 4.2.4. Metilensko plavo100 do 500 mg metilensko plavog rastvoriti u 100 ml destilovane vode. Poslije filtriranja boja je spremna za upotrebu.Iz boje se materijal prenosi na predmetno staklo u kap 45 % siretne kiseline ili u hloralhidrat, prekriti pokrovnim staklom i pritisnuti. Pritiskanje se obavlja preko filter papira, obinom gumom za brisanje. Pritisak mora biti takve jaine da se pod njegovim dejstvom tkiva razdvoje na pojedinane elije, ali da se pri tome ne razbije ploica. Na ovaj nain pripremljen je privremeni skvo preparat. Od privremenih preparata je mogue posebnim postupkom dobiti trajni skvo preparat. Jedan od naina za pravljenje takvih preparata predloili su Koneri i Ferajld, a postupak je sljedei: Privremeni skvo preparat postavlja se na povrinu pareta suvog leda 1 do 1,5 minut. Zatim se udalji pokrovno staklo, a na predmetnom ostaje zaljepljen materijal. Ovako pripremljen preparat se sprovodi kroz 96% alkohol, apsolutni alkohol, alkohol-ksiol u odnosu 1:1, ksiol, zatim se materijal stavlja u kanada balzam i pokriva se istim pokrovnim staklom. Potrebno je da preparati ostaju 2 do 5 minuta u svakom od navedenih agenasa.

5.ZAKLJUAK

Na osnovu pregledane literature doneseni su sljedei zakljuci:-Presjeci napravljeni razliitim tehnikama se mogu posebnim postupcima prevesti u privremene ili trajne preparate-Razliiti hemijski reagensi omoguavaju obradu materijala prilikom izrade presjeka-Boje imaju vanu ulogu u bojenju elija i razlikovanju razliitih slojeva biljnog tkiva na preparatu-Glicerin-elatinski preparati se prave u kratkom vremenskom periodu-Skvo privremeni preparati se mogu jednostavnim postupkom uz pomo suvog leda i alkohola prevesti u trajne preparate

6.LITERATURA

Blaeni, J. (1994): Praktikum iz anatomije biljaka sa osnovama mikroskopske tehnike. Nauna knjiga, Beograd.

SADRAJ1.U V O D22.BOJENJE PREPARATA NA MIKROTOMU BEZ INKLUZIJE U PARAFIN33.GLICERIN-ELATINSKI PREPARATI53.1. Pripremanje glicerin elatina54.SKVO PREPARATI64.2.Pripremanje boja74.2.1.Acetokarmin74.2.2. Acetorsein74.2.3. Acetolakmoid74.2.4. Metilensko plavo75.ZAKLJUAK96.LITERATURA10

11