biotransformación de limoneno a a-terpineol por medio del penicillium digitatum

8/17/2019 Biotransformación de limoneno a a-terpineol por medio del penicillium digitatum

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BIOTRANSFORMACIÓN

MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY

PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)-

TERPINEOL

PRESENTADO POR:

JUAN RICARDO RINCÓN

CHRISTIAN SUAREZ

MAYRA ALEJANDRA URIBE

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FÍSICO – QUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA2016


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BIOTRANSFORMACIÓN

MICROBIAL BIOTRANSFORMATION OF (R)-(+)- LIMONENE BY

PENICILLIUM DIGITATUM DSM 62840 FOR PRODUCING (R)-(+)-

TERPINEOL

PRESENTADO A:

MICROBIOL. MABEL JULIANA QUINTERO

PRESENTADO POR:

JUAN RICARDO RINCÓN

CHRISTIAN SUAREZ

MAYRA ALEJANDRA URIBE

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

FACULTAD DE INGENIERÍAS FÍSICO – QUÍMICAS

ESCUELA DE INGENIERÍA QUÍMICA2016


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1 INTRODUCCIÓN

En los últimos años los procesos de biotransformación han adquirido una

importancia creciente a nivel mundial, debido a la posibilidad de obtener un

producto natural de alto valor agregado y de forma inocua para el medio

ambiente (Castellanos, 2007). Actualmente la generación de productos

aromáticos a través de procesos biotecnológicos ha aumentado

considerablemente, debido a que las legislaciones de USA y Europa han

definido como “sustancias naturales” únicamente a las que pueden producirse

por procesos físicos, enzimáticos o microbianos a partir de precursores

aislados de la naturaleza. Esta clasificación ha originado una competencia en

el mercado, ya que los compuestos etiquetados como “naturales” presentan

alta demanda, mientras que otros compuestos producidos por métodos

químicos, a pesar ser denominados como “idénticos al natural” son menos

apreciados por los consumidores. Mundialmente numerosos procesos

comerciales emplean enzimas o microorganismos como catalizadores, lo que

demuestra la importancia de las reacciones de biotransformación aplicadas a la

industria (Maróstica & Pastore, 2006)

La biotransformación implica una serie de reacciones limitadas, que se pueden

llevar a cabo por medio de sistemas biológicos, denominados biocatalizadores,

en donde una molécula precursora es convertida en otra diferente (Garcia , et

al., 2004). Los biocatalizadores, en la mayoría de los casos, funcionan

correctamente bajo condiciones suaves de reacción, poseen alta actividad

catalítica y permiten una mayor regio y estereoselectividad. Cuando se utilizan

con microorganismos completos puede haber una menor selectividad, debido a

que las células contienen diferentes grupos de enzimas capaces de transformar

el sustrato, sin embargo la selectividad puede ser alterada variando el medio,

adicionando solventes orgánicos o inhibidores de enzimas no deseadas, entre

otros. La quiralidad también es importante en perfumería ya que el olor y el

sabor dependen de la conformación absoluta del estereoisómero presente

(Castellanos, 2007) Los terpenos representan un grupo abundante de

sustancias quirales que pueden ser transformadas en componentes bioactivos

de gran valor tales como saborizantes, fragancias y fármacos el R-(+)-


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limoneno es el monoterpeno monocíclico que se encuentra más ampliamente

distribuido en la naturaleza (de Caravalho & da Fonseca, 2006), constituyendo

cerca de un 90% del aceite de la cascara de naranja, lo que lo convierten en un

precursor abundante y barato para la síntesis de productos químicos finos; el

α-terpineol, uno de los derivados oxigenados del R-(+)-limoneno, es un alcohol

estable y es aplicado principalmente en productos para el hogar, cosméticos,

pesticidas y como parte de productos aromatizantes (Lemos, et al., 2010). En

este trabajo se profundizara en los temas relacionados con la

biotransformación por medio de un análisis al artículo Microbial

Biotransformation of (R)-(+)-Limonene by Penicillium digitatum DSM 62840 for

Producyng (R)-(+)-α-Terpineol (Prieto, et al., 2011)


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TABLA DE CONTENIDO

1 Introducción ................................................................................................. 3

2 Fundamentación ......................................................................................... 5

3 objetivos en la investigación ........................................................................ 7

3.1 Objetivo general .................................................................................... 7

3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 7

4 Estudios relacionados ................................................................................. 9

5 Marco teórico ............................................................................................ 10

5.1 BIOTRANSFORMACIÓN .................................................................... 10

5.2 LIMONENO ......................................................................................... 11

5.3 Penicillium digitatum............................................................................ 12

5.4

Terpineol ............................................................................................. 13

6 MATERIALES Y MÉTODOS USADOS ..................................................... 15

6.1 Microorganismo, medio de cultivo y reactivos ..................................... 15

6.2 Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio

sólido 15

6.3 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato ............................. 16

6.4 Preparación de la suspensión de esporas .......................................... 17

6.5 Cinética de crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM

62840 en medio líquido ................................................................................ 17

6.6 Proceso general de biotransformación de (R)-(+)-limoneno a escala de

laboratorio ..................................................................................................... 18


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6.6.1 Efecto del tipo de medio de cultivo .............................................. 18

6.6.2 Efecto del pH ................................................................................ 19

6.6.3

Evaluación de las fases de crecimiento durante labiotransformación del limoneno ................................................................ 19

6.6.4 Efecto de la concentración del sustrato ........................................ 19

6.6.5 Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno ............................................ 20

6.6.6 Extracción, identificación y cuantificación de (R)-(+)-limoneno y α-

terpineol durante la biotransformación del limoneno ................................. 20

7 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ............................... 22

7.1 Crecimiento microbiano de Penicillium digitatum DSM 62840 en medio

sólido 22

7.2 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato ............................. 23

7.3 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN DEL (R)-

(+)-LIMONENO ............................................................................................. 25

7.3.1 Efecto del tipo de cultivo ............................................................... 25

7.3.2 Efecto del pH ................................................................................ 26

7.3.3 Evaluación de las fases de crecimiento ........................................ 29

7.3.4 Efecto de la concentración del sustrato ........................................ 30

7.3.5 Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la capacidad de

biotransformación ...................................................................................... 32

8 CONCLUSIONES ..................................................................................... 35

9 Bibliografía ................................................................................................ 36


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2 FUNDAMENTACIÓN

La implementación de biotransformación en procesos industriales representa

una alternativa económica, con una buena fuente de disponibilidad y de fácil

obtención en materias primas, requisitos necesarios para asegurar la

rentabilidad de los productos procesados, además los productos obtenidos a

través de la bioconversion de sustratos por microorganismos pueden ser

clasificados como naturales, condición que se está imponiendo cada vez más

entre los consumidores (Schrader, et al., 2004); sin embargo, las bajas tasas

de producción hacen que no se haya materializado en una opción aceptable a

escala industrial, y por esto es conveniente profundizar la investigación en este

tópico.

3 OBJETIVOS EN LA INVESTIGACIÓN

3.1 Objetivo general

Determinar las características químicas que optimizaran la producción de α-

terpineol en un cultivo de Penicillium digitatum DSM 62840 teniendo como

sustrato el (R)-(+)-limoneno.

3.2 Objetivos específicos

Determinar el medio de cultivo sólido que permita la mayor tasa de

crecimiento para la pre-incubación de la solución de esporas de P.

digitatum DSM 62840.

Determinar la concentración del sustrato que permita una mayor

producción de α-terpineol, y que a su vez presente un efecto inhibitorio

mínimo en el crecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840.

Evaluar el medio de cultivo liquido de P. digitatum DSM 62840 en la

producción de α-terpineol.

Evaluar el pH del medio de cultivo para optimizar la producción de α-

terpineol.

Determinar la fase de crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840

en la que se presente la mayor tasa de producción de α-terpineol.


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Analizar el posible efecto inductor del (R)-(+)-limoneno en el P.

digitatum DSM 62840.

Cuantificar la biotransformación obtenida en la investigación.


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4 ESTUDIOS RELACIONADOS

Aunque no se tiene una evidencia clara en todos los casos, las

biotransformaciones de R-(+)-limoneno en las que intervienen hongos y

levaduras al parecer inician por la acción de la P-450 monooxigenasa. En la

bioconversión de R-(+)-limoneno a α-terpineol realizada por Penicillium

digitatum DSM 62840 primero se pensó en una hidratasa como catalizador, lo

cual hubiese favorecido un proceso biocatalítico ya que no habría sido

necesario ningún cofactor. Sin embargo más adelante se encontró que el

primer paso de la reacción era la epoxidación del doble enlace presente en los

carbonos C8-C9, luego se afirmó que la reacción debía implicar un

“rompimiento reductor del epóxido, pero no se proporcionaron mayores detallessobre las enzimas implicadas (Duetz, et al., 2003). La formación de un

terpineol se informó por primera vez en un resumen de un simposio realizado

por Kraidman en 1969. La cepa utilizada fue Cladosporium sp. T12, pero no se

compartieron mayores detalles experimentales (Duetz, et al., 2003) y no parece

haberse realizado un seguimiento de esta cepa. Desde el 2001 en trabajos

realizados por Demyttenarae, et al., 2001 se comenzó a utilizar cepas de P.

digitatum DSM 62840, encontrando que estas transformaban el R-(+)-limonenoprincipalmente, per o no exclusivamente a α-terpineol. Un trabajo interesante

fue el realizado por Demyttenaere et al. 2001 con más de 60 cepas de hongos

que produjo la formación de 1,2-dioles y R-(+)-limoneno en donde una de las

cepas usada para la obtención de α-terpineol fue el P. digitatum con la cual

obtuvo un rendimiento del 100% luego de ocho horas. En los últimos años se

han estudiado otros microorganismos para la producción de α-terpineol tales

como: Fusarium oxysporum 152B, con el cual se obtuvo una concentración decerca de 4(g/L) en un tiempo de 48 horas y con una eficiencia de extracción del

36% (Molina, et al., 2015), además se puede encontrar la literatura

correspondiente con la optimización de ciertos parámetros, tales como: efectos

de la composición del medio, la presencia de un co-sustrato y la concentración

del sustrato (Lemos, et al., 2008); también se han utilizado células de

Sphingobium sp. Obteniendo una producción de aproximadamente 10-12(g/L)

luego de 72 horas, con una selectividad de cerca del 80% y con una tasa

máxima de producción cercana a 0.25(gh-1/L) (Lemos, et al., 2010), entre otros.


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5 MARCO TEÓRICO

5.1 BIOTRANSFORMACIÓN

Según Mariano García en su libro biotecnología alimentaria, unabiotransformación se puede llevar a cabo por cualquiera de los siguientes

métodos:

Mediante el uso de células en crecimiento. En este caso la molécula

precursora se incorpora al medio de cultivo desde la inoculación o bien

durante el transcurso de etapas posteriores en donde el crecimiento

celular aún no ha terminado.

Mediante el uso de células cosechadas. La primera etapa de este

método consiste en permitir un crecimiento celular abundante en un

medio de cultivo especial, llamado de crecimiento. Después estas

células se separan por centrifugación o filtración para incorporarlas a un

segundo medio; el de biotransformación, que contiene los precursores.

Un ejemplo de este tipo de procesos es el uso de esporas microbianas

como biocatalizadores.

Mediante el uso de células inmovilizadas. Aquí es necesario producir lascélulas en un medio apropiado, para después separarlas e

inmovilizarlas. Esto último puede realizarse con el uso de cualquiera de

las siguientes técnicas: atrapamiento en polímeros porosos, adsorbiendo

a los microorganismos sobre la superficie de soportes insolubles,

induciendo ligaduras covalentes a los soportes o bien induciendo una

agregación física o química.

Mediante el uso de enzimas purificadas. En algunos casos es necesarioemplear enzimas con un alto nivel de purificación, esto puede deberse a

que o bien hay una buena difusión, apropiada de las moléculas

precursoras a través de la membrana microbiana, o que el producto de

la transformación no se difunda una vez producido. Una condición

indispensable para recurrir a este tipo de método es que la enzima debe

separarse y purificarse con cierta facilidad o bien estar disponible en

forma comercial. El uso de estas enzimas debe puede ser en su formalibre o también inmovilizada.


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Mediante el uso de sistemas multifase. En el caso de los precursores y

productos, al menos uno de ellos, insoluble en agua pero lipofílicos, por

lo general se trabaja en dos fases, una acuosa que contiene la enzima o

los microorganismos y un solvente no miscible en agua.

Mediante el uso de sistemas de multiconversión. Para el caso en el que

la biotransformación requiera de dos o más pasos secuenciales.

5.2 LIMONENO

El limoneno posee una estructura química similar a los principales compuestos

oxigenados usados en la industria de los biosabores (carveol, carvona, alcohol

perílico, terpineol, etc.) En su estructura presenta un centro quiral y diez

átomos de carbono, de los cuales seis pertenecen a un ciclo, lo que lo clasifica

como un monoterpeno monocíclico (Bicas , et al., 2010). La presencia de

enlaces dobles entre los carbonos C1-C2 y C8-C9, lo que hace más probable la

oxidación (hidroxilación) en las posiciones alílicas (C3, C6) y la epoxidación en

los dobles enlaces por razones de estabilidad y reactividad química, sin

embargo puede oxidarse en carbonos menos reactivos. Debido a que la

reactividad en los metilos y metilenos alílicos es muy similar, se pefiere el uso

de biocatalizadores, ya que estos no see ven afectados por la selectividad

(Castellanos, 2007). En la Figura 1. Se indican los posibles sitios de oxidación

y algunos de los compuestos oxidados más importantes.

Como se ha indicado anteriormente la mayor parte de los aceites esenciales de

la naranja están constituidos por limoneno (Tackenberg, et al., 2014), lo que

hace del limoneno, gracias a su amplia distribución en la naturaleza, un

precursor abundante y económico en la síntesis de productos de químicos

finos. (Castellanos, 2007) Uno de los principales productos obtenidos luego de

su biotransformación es el α-terpineol, el cual es un monoterpeno oxigenado de

importante uso comercial, sin embargo la biotransformación de limoneno a α-

terpineol como producto principal presenta algunos inconvenientes tales como:

inestabilidad química, alta volatilidad y alta citotoxidad tanto de los precursores

como de los productos, además de baja tasa de solubilidad de los solutos y


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bajas tasas de transformación (Schewe, et al., 2006). El uso de sistemas

bifásicos ha demostrado ser una excelente técnica, ya que aumenta los

rendimientos de la recuperación de productos y disminuye las perdidas por

volatilización mediante la reducción del sustrato. (Lemos, et al., 2010)

Figura 1. Principales compuestos derivados del (R)-(+)-limoneno

5.3 Penicillium digitatum

Es un hongo mesófilo causante de cerca del 90% de las cosechas de cítricos,

hiere la superficie de los cítricos y crece en forma de filamentos (Shukui, et al.,

2016), se clasifica como un hongo necrotrófico patógeno (Marcet-Hauben, et

al., 2012), se reproduce asexualmente por la producción de conidias, además

tiene un gran parecido morfológico con el P. itallicum, pero se diferencian por la

forma cilíndrico-elíptica en las conidias del P. digitatum (Stolk, et al., 1990), tal

como se ve en la Figura 1.


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Figura 2. Naranja en descomposición debido a Penicillium digitatum(izquierda) y conidias del P. digitatum vistas desde el microscopioelectrónico de barrido (derecha)

Tomada de: http://img.interempresas.net/fotos/446212.jpeg

Desde hace varios años se tiene conocimiento que el P. digitatum DSM 62840

que se encuentra en la cáscara de naranjas descompuestas tiene la capacidadde transformar el (R)-(+)-limoneno rápidamente a α-terpineol (Yoshiaki &

Yoshinori, 2016),como se ve en la , además se sabe de la formación de

epóxidos como sustancias intermedias en las reacciones de biotransformación

por especies de Penicillium (Borges, et al., 2009).

Figura 3. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno a α-terpineol por P.digi tatum

5.4 Terpineol

El terpineol es el monoterpeno que constituye una gran parte de los aceitesesenciales de las plantas (Maróstica & Pastore, 2007), en la industria es usado

principalmente en perfumería, productos de limpieza, productos cosméticos,

como saborizante y como fungicida (Bathia, et al., 2008). Sus propiedades

quirales se traducen sobre todo es sus características aromáticas: el (R)-(+)-α-

terpineol tiene un olor típicamente floral, mientras que el (S)-(-)-α-tiene el olor

característico de las coníferas (Maróstica & Pastore, 2007). Como fungicida

tiene efecto en una amplia variedad de especies de hongos, entre las que se


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incluye Penicillium (Pinto, et al., 2014). Algunos estudios han reportado que el

terpineol puede inducir cambios morfológicos importantes en el Penicillium

digitatum que pueden inhibir el crecimiento micelar (Guo-xing, et al., 2015)

Figura 4. Aplicaciones del α-terpineol en la industria


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6 MATERIALES Y MÉTODOS USADOS

6.1 Microorganismo, medio de cultivo y reactivos

Penicillium digitatum DMS 62840 se obtuvo de la colección demicroorganismos y cultivos de células (DSMZ) en Alemania (Braunschweig).

Se utilizaron tres medios de cultivo solidos: PDA, agar papa dextrosa; MEA,

agar extracto de malta; y se usaron materiales puros para preparar algunos de

los medios de cultivo complejos. Medio de cultivo YGA, el cual contenía 3.0 g/L

de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de malta, 20 g/L de glucosa, 1.0 g/L

de peptona bacteriológica y 20 g/L de agar; además se usaron tres medios de

cultivo en estado líquido: YMPG, que contenía 5.0 g/L de extracto de levadura,

10 g/L de extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 5.0 g/L de peptona

bacteriológica; MYB, que contenía 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de

extracto de malta, 10 g/L de glucosa y 10 g/L de peptona bacteriológica y el

medio YG, que contenía 3.0 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de extracto de

malta, 20 g/L de glucosa y 1.0 g/L de peptona bacteriológica. Los medios de

cultivo se compraron en OXOID (Hampshire, Inglaterra), mientras que el (R)-

(+)-limoneno (98%) y α-terpineol (98%) se compraron en Merck (Darmstadt,

Alemania).

6.2 Crecimiento microbiano de Penici l l ium digi tatum DSM 62840 en

medio sólido

Penicillium digitatum DSM 62840 creció en los medios de cultivo PDA, MEA y

YGA, los cuales fueron descritos anteriormente, a una temperatura de 23°Cdurante 10 días, en los tres casos el diámetro de la colonia fue medido en

orden con el fin de determinar la cinética de crecimiento de los

microorganismos. La tasa de crecimiento radial (mm/h) se determinó según el

método descrito por (Trinci, 1969), el cual consiste en hacer un seguimiento de

las etapas de crecimiento de la colonia y la germinación de esporas con el fin

de fotografiar el crecimiento del cultivo en una cámara de cultivo o portaobjetos

bajo el microscopio (Figura 5 y Figura 6) en intervalos de 15 minutos y a

temperatura constante, para después registrar el diámetro de las colonias en


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dos direcciones separadas por ángulos rectos con un ShadowMaster tomando

la media de por lo menos seis repeticiones, las tasas de crecimiento se

calculan con las medidas realizadas en intervalos de nueve horas, mientras

que las colonias crecen a un ritmo constante. El mayor tamaño de crecimiento

del cultivo microbiano fue seleccionado de acuerdo a los valores para las tasas

de crecimiento radial y este valor fue usado para el mantenimiento del

microorganismo. Todas las pruebas fueron realizadas tres veces.

6.3 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato

Diferentes concentraciones (0 a 280 mM) de (R)-(+)-limoneno se añadieron enel medio PDA antes de realizar la gelificación, en todos los casos la dispersión

de (R)-(+)-limoneno fue llevada a cabo por medio de agitación. Después los

medios de cultivo se inocularon con 20 μL de esporas en suspensión (1 x 107

esporas/mL). El crecimiento microbiano (a una temperatura de 23°C) se

controló por medio de la medición del cambio en el diámetro de las colonias

luego de 8 días. Los porcentajes de inhibición se calcularon usando la

ecuación 1, donde Dt es el diámetro medio de la colonia de hongos usadacomo testigo y Dp es el diámetro promedio de las colonias de hongos de

prueba. Los resultados fueron usados para realizar graficas de inhibición. La

concentración más pequeña del (R)-(+)-limoneno que inhibía el crecimiento del

P. digitatum fue llamada concentración de mínima inhibición (CIM), y la

concentración que inhibía el 100% de crecimiento fue llamada concentración

letal (CL)

Figura 5. Crecimiento del cultivo en cámara

ℎó (%) = −

∗ 100

1


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Tomada de (Trinci, 1969) modificada

Figura 6. Crecimiento del cultivo en portaobjetos para observarse bajo elmicroscopio

Tomada de (Trinci, 1969) modificada

6.4 Preparación de la suspensión de esporas

Las esporas que habían sido previamente seleccionadas en medio sólido de

nuevo se suspendieron en 10 mL de solución salina con 0.85% NaCl y 0.1%

Tween 80 (por lo general las superficies de las placas son limpiadas de forma

periódica con detergentes y/o desinfectantes, los cuales tienen actividad

antimicrobiana y pueden inhibir el crecimiento del cultivo, para lo cual es

necesario usar un medio de cultivo que contenga Tween 80, el cual neutraliza

compuesto fenólicos, aldehídos y amonios cuaternarios, así se evitaninterferencias en la lectura e interpretación de resultados), se hizo un recuento

del número de células (N) por mL en una cámara de Neubauer obteniéndose

que la concentración inicial fue de 1x107 esporas/ml

6.5 Cinética de crecimiento microbiano de Penici l l ium d igi tatum DSM

62840 en medio líquido

El Penicillium digitatum DSM 62840 creció en frascos equipados con tapones

de teflón de 22 mL que contenían 5 mL de YMPG, MYB o YG, según fuese el

caso, en medio líquido a una temperatura de 27°C y agitación de 150 rpm

usando un agitador orbital (Heidolph, Vibramax 100, Schwabach, Alemania). El

medio fue inoculado con 50 µL de esporas en suspensión. La concentración

de la biomasa fue determinada a través del método de células en peso seco,

tomando muestras cada 24 h durante 15 días.


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6.6 Proceso general de biotransformación de (R)-(+)-limoneno a escala

de laboratorio

Los ensayos se llevaron a cabo en de frascos equipados con tapones de teflón

de 22 mL, los cuales contenían 5 mL del medio de cultivo líquido estéril. El

medio de cultivo fue inoculado con 50 μL esporas en suspensión y se pre-

incubaron a 27 °C por 72 horas y con una agitación de 150 rpm utilizando un

agitador orbital. Después de la pre-incubación el (R)-(+)-limoneno puro se

añadió en concentraciones específicas, que fueron establecidas para cada

experimento que se iba a llevar a cabo. La biotransformación microbiana se

monitorizo durante todo el experimento. Al mismo tiempo se realizaron dos

controles: biomasa en blanco (esporas suspendidas en el medio de reacción

sin sustrato) y sustrato en blanco (medio de reacción y sustrato sin suspensión

de esporas). Los productos de la reacción y el sustrato restante fueron

extraídos y analizados por medio de cromatografía de gases y espectrometría

de masas, la bioconversion fue evaluada en todos los casos por medio de la

ecuación 2.

6.6.1 Efecto del tipo de medio de cultivo

Los experimentos de biotransformación fueron llevados a cabo en medio de

cultivo líquido, usando YMPG, YG o MYB disueltos en 0.1 M en un buffer (pH

3.5) de citrato-fosfato y bajo las condiciones ambientales que fueron descritas

anteriormente. El (R)-(+)-limoneno fue añadido con una concentración de 14.7

mM. La cinética de la transformación microbiana fue monitoreada luego de 0,

24, 48,72 y 96 h después de añadir el sustrato. El medio de cultivo con el valor

más alto en la bioconversion fue seleccionado para evaluar los parámetros debiotransformación adicionales.

(%) = − ()

()∗ 100

2


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6.6.2 Efecto del pH

El efecto del pH en la biotransformación del limoneno fue estudiado disolviendo

el medio de cultivo MYB en un buffer de citrato-fosfato de 0.1 M para los

siguientes valores de pH: 3.0, 3.5, 4.5 y 6.0. Los ensayos fueron llevados a

cabo en 22 mL de frascos equipados con tapón de teflón que contenían 5 mL

de medio líquido estéril. El medio de cultivo fue inoculado con 50 μL de

esporas en suspensión y fue pre-incubado a 27°C por 72 h con una agitación

de 150 rpm utilizando un agitador orbital. El (R)-(+)-limoneno fue añadido con

una concentración de 14.7 mM. La transformación microbiana fue monitoreada

0 y 48 h después de añadir el sustrato. El medio de cultivo con los valores más

altos en la bioconversion y concentración específica del producto deseado fueseleccionado para los parámetros adicionales de la biotransformación.

6.6.3 Evaluación de las fases de crecimiento durante la

biotransformación del limoneno

Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapón de teflón

de 22 mL, que contenían 5 mL del medio liquido MYB (pH 3.5). El medio decultivo fue inoculado con 50 μL de esporas en suspensión pre-incubadas a

27°C por 24, 72, 120, 168 y 216 h de acuerdo con las fases: lag; exponencial

temprana, exponencial media y exponencial final y las fase estacionaria, con

una agitación de 150 rpm utilizando un orbital agitador, una vez el P.digitatum

alcanzaba la fase correspondiente, (R)-(+)-limoneno fue añadido al medio de

cultivo (pH 3.5) con una concentración final de 14.7mM. La cinética de la

transformación microbiana para cada bioconversión fue monitoreada 0, 24, 48 y96 h después de la reacción. La fase de crecimiento con la mayor

bioconversion fue seleccionada para evaluar parámetros adicionales.

6.6.4 Efecto de la concentración del sustrato

Diferentes concentraciones de (R)-(+)-limoneno (5-100) mM fueron usadas.

Los ensayos fueron llevados a cabo en frascos equipados con tapón de teflón


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de 22 mL en medio de cultivo líquido MYB (pH 3.5). El medio de cultivo fue

inoculado con 50 μL de esporas en solución y pre-incubadas a 27ºC durante 72

h (fase exponencial temprana) con una agitación de 150 rpm. (R)-(+)-limoneno

fue añadido con una concentración final de 5-100 mM. La transformación

microbiana fue monitoreada luego de 0 y 48 h de añadir el sustrato. La

concentración óptima fue seleccionada de acuerdo a ambos requisitos: alta

bioconversion y alta especificidad.

6.6.5 Efecto inductivo de (R)-(+)-limoneno

Con el objetivo de determinar un posible efecto inductivo del sustrato, los

experimentos de biotransformación fueron llevados a cabo inoculando el medio

MYB (pH 3.5) con 50 μL de esporas en solución las cuales fueron obtenidas

previamente de un cultivo de crecimiento en presencia del inductor ((R)-(+)-

limoneno 14.7 mM). Las biotransformaciones fueron llevadas a cabo por 72 h a

27ºC Y 150 rpm, con (R)-(+)-limoneno 14.7 mM en el medio de cultivo, y

fueron monitoreados luego de 0, 8, 24 y 48 h.

6.6.6 Extracción, identificación y cuantificación de (R)-(+)-limoneno y α-

terpineol durante la biotransformación del limoneno

Los productos y sustratos restantes de la biotransformación fueron extraídos en

dos ocasiones con acetato de etilo (2 x 2.5 mL) seguido por una centrifugación

a 4000 rpm durante 5 min. La fase orgánica fue recogida y secada con anhidrode Na2SO4 y a continuación se concentró con una corriente de N2.

Posteriormente se añadieron 3 μL de n-tetradecano (estándar interno) y se

diluyo a 1 mL. El sustrato y los productos oxigenados fueron identificados y

cuantificados con una cromatografía de gases junto a un espectrómetro de

masas. La temperatura fue programada a 45ºC y mantenida por 10 min, luego

la temperatura se aumentó a una velocidad de 3ºC/min hasta alcanzar los

220ºC, manteniendo esta temperatura final durante 30 min. La identificación de

los compuestos se llevó a cabo mediante la comparación de los espectros de


21/38

masa de las muestras con los con los siguientes espectros de los compuestos

de la base de datos ADAMS: NSB 75K, 138K NIST 05 y Wiley. Las

concentraciones de limoneno y α-terpineol en cada extracto fueron

cuantificadas por curvas de calibración individuales, usando las relaciones de

área de picos vs relaciones de cantidades de referencia de las muestras

auténticas. La eficiencia de recuperación de producto en la extracción líquido-

líquido de acetato de etilo fue previamente determinada para cinco

extracciones diferentes con cantidades conocidas de α-terpineol y limoneno en

un medio de crecimiento celular fresco y en un caldo de cultivo envejecido. Se

extrajeron las cantidades de referencia, y las cantidades extraídas de α-

terpineol y limoneno fueron previamente determinadas. Cada prueba fue

realizada tres veces y se calculó la tasa promedio de recuperación.


22/38

7 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

7.1 Crecimiento microbiano de Penici l l ium digi tatum DSM 62840 en

medio sólido

Se comparó el crecimiento del microorganismo en los tres medios de cultivo

mencionados anteriormente: PDA, MEA y YGA, como se puede observar en la

Figura 7. la tasa de crecimiento del P. digitatum en los medios de cultivo PDA

y YGA durante toda la evaluación fue muy parecida, mientras que la tasa de

crecimiento en el medio de cultivo de YGA, fue muy lenta en la mayoría del

tiempo monitoreado, aunque en la parte final de la evaluación el diámetro de

las colonias en los tres medios de cultivos observados fue muy similar, lo cual

hace pensar en un tiempo de fase lag bastante mayor en el medio YGA que en

los otros cultivos observados; como se mencionó en la metodología, para la

evaluación de los parámetros restantes se utilizó el medio de cultivo con el

mayor valor en la en la tasa de crecimiento del radio en la colonia del P.

digitatum DSM 62840, el cual se obtuvo en el medio PDA con una tasa de

crecimiento de (0.35 ± 0.01 mm/h).

Figura 7. Cinética de crecimiento de P. digitatum DSM 62840 endiferentes medios de cultivo en placas de agar a 23ºC

Tomada de: (Prieto, et al., 2011) modificada


23/38

7.2 Evaluación de la actividad antifúngica del sustrato

Con el objetivo de determinar la inhibición del (R)-(+)-limoneno en el

crecimiento del cultivo de P. digitatum DSM 62840 la concentración del

sustrato vario entre 0 y 280 mM. La actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno

en el cultivo de P. digitatum en medio de cultivo PDA se muestra en la Tabla 1

y como se puede observar el valor de la concentración de 0.73 mM

corresponde a la mínima concentración de inhibición (MIC), mientras que la

concentraciones por encima de 257 mM fueron consideradas como

concentraciones letales (CL). Este efecto puede ser atribuido a la toxicidad del

(R)-(+)-limoneno, además en la Figura 8 se puede observar como la relación

entre la tasa de crecimiento del cultivo y la concentración de (R)-(+)-limonenopresenta una tendencia inversamente proporcional, por lo que en la

investigación se hizo necesario el uso de la ecuación 1 para calcular el

porcentaje de inhibición. Se encontró que la concentración de (R)-(+)-

limoneno que producía una inhibición promedio correspondía a 14.7 mM,

además este valor también correspondía con un cambio abrupto en la tasa de

crecimiento del radio en el cultivo, tal como se observa en la Tabla 1.

Tabla 1 Actividad inhibitoria del (R)-(+)-limoneno en el medio de cultivoPDA para el P. digitatum DSM 62840 a 23ºC

Concentración de limoneno

(mM )

Porcentaje de

inhibición (%)TCR (mm/h)

0 0 0.47 ± 0.01

0.73 4 0.41 ± 0.02

1.46 6.7 0.41 ± 0.02

3.65 13.3 0.41 ± 0.02


24/38

7.35 17.3 0.40 ± 0.02

14.7 22.7 0.31 ± 0.02

25 28.2 0.30 ± 0.07

36.75 30.7 0.27 ± 0.04

73.4 34.7 0.23 ± 0.05

88.08 40 0.17 ± 0.02

110.1 46.7 0.13 ± 0.03

132.12 58.7 0.12 ± 0.02

185.5 80 0.09 ± 0.03

220.2 85.3 0.08 ± 0.01

256.9 100 0.00 ± 0.00

280 100 0.00 ± 0.00


25/38

Figura 8. Relación entre la concentración del (R)-(+)-limoneno y elcrecimiento del P. digitatum DSM 62840 en medio PDA a 23ºC

7.3 EVALUACIÓN DEL PROCESO DE BIOTRANSFORMACIÓN DEL (R)-

(+)-LIMONENO

7.3.1 Efecto del tipo de cultivo

Los medios de cultivos que fueron usados en la investigación conteníancompuestos nutritivos similares con concentraciones diferentes, para los

medios MYB y YG el (R)-(+)-limoneno era transformado solo en α-terpineol. No

obstante, luego de 48 h de reacción la concentración de (R)-α-terpineol fue

aproximadamente 3 veces más alta en el medio de cultivo MYB (1,585 ± 19,59

mg/L) que en YG, como se muestra en la Figura 9, en el medio de cultivo

YMPG los productos de la biotransformación solo aparecieron luego de 96 h y

se encontró que únicamente se había formado trans-carveol, lo que lleva aconcluir que el medio de cultivo puede afectar tanto la especificidad como la

concentración de los productos.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 1 2 3 4 5 6

T a s a d e c r e c i m i e n t o d e l r a d i o e n l a c o l o n

i a

( m m / h )

Concentración de (R)-(+)-limoneno (mM)

Efecto de la concentración del sustrato en el cultivo de P.

digitatum DSM 62840


26/38

Figura 9. Efecto del medio de cultivo en la producción de α-terpineol apartir de (R)-(+)-limoneno por P. digit atum DMS 62840. Condiciones delmedio de cultivo: pH 3.5, Temperatura 27ºC 150 rpm

Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada

En 48 h el contenido de α-terpineol fue de 880,6 ± 2,64 (mg de α -terpineol / g

de célula seca). Una posible explicación para el tiempo y el producto obtenido

en el medio de cultivo YG puede ser que la cantidad de la glucosa presente en

el medio fue suficiente para la alimentación del P. digitatum, ya que como todos

los hongos tiene como fuente de carbono la glucosa, lo que se traduciría en la

producción de trans-carveol como un metabolito secundario. Tal como se

indicó en la metodología y de acuerdo a los resultados el medio de cultivo MYB

fue utilizado para la evaluación de los parámetros adicionales.

7.3.2 Efecto del pH

El efecto del pH en la capacidad de biotransformación del P. digitatum fue

evaluado para diferentes valores de pH en el medio de cultivo MYB las células

de P. digitatum mostraron especificidad hacia la producción de (R)-(+)-

limoneno para valores de 3.0 y 3.5 en el pH, como se puede observar en la

Tabla 2, mientras que para niveles de pH mayores a 4.5 la especificidad

disminuyo debido a la formación de otros productos, sin embargo la producción

de α-terpineol fue mayor en todos los casos, valores de pH mayores a 4.5

promovían la formación de otros compuestos oxigenados por medio de

reacciones de hidroxilación, isomerización oxidación y ruptura cíclica en

diferentes carbonos de (R)-(+)-limoneno como se muestra en la Figura 10


27/38

Tabla 2. Metabolitos producidos durante la biotransformación de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DSM 62840 a diferentes niveles de pH en mediode cultivo MYB luego de 48 h de reacción

Concentración (mg/L)

pH de la biotransformación

3 3.5 4.5 6

Limoneno restante

1061 ±

67.1

439.1 ±

28.2 530.6 ± 21.9

1641 ±

39.5

α-Terpineol982 ±40.5

1537 ±34.9 1352 ± 23.2

288.1 ±20.7

Linalool n.d1 n.d 27.8 ± 1.3 28.6 ± 2.0

Trans- p-menta-2,8-dien-1-ol n.d n.d 23.6 ± 1.5 23.9 ± 1.5

cis- p-menta-2,8-dien-1-ol n.d n.d 19.5 ± 0.9 42.9 ± 2.1

trans-carveol n.d 66.9 ± 3.4 20.1 ± 1.2 30.1 ± 1.9

cis-carveol n.d n.d 42.1 ± 1.9 32.2 ± 1.6

Carvona n.d n.d 27.3 ± 1.0 23.0 ± 1.2

Concentración total de

productos 98 ± 40.5

1604 ±

37.3

1512.4 ±

31.03

468.8 ±

19.7

1 n.d: no detectado


28/38

Figura 10. Productos de la biotransformación de (R)-(+)-limoneno porPenicillium digitatum DSM 62840 obtenidos en pH 4.5 y 6.0 en medio decultivo MYB a una temperatura de 27ºC y a 150 rpm

Para valores de pH entre 4.5 y 6.0 se presentan derivados oxigenados que no

se habían encontrado durante la investigación, ni habían sido reportados en la

literatura para la biotransformación de (R)-(+)-limoneno, lo que puede sugerir

que para valores ligeramente ácidos de pH se ve favorecida la producción de

metabolitos secundarios, además del producto principal, el cual solo es posibleobtener a través del rompimiento en el enlace de los carbonos 8 y 9 del

epóxido obtenido. Tal como se muestra en la Tabla 2 y de acuerdo con la

metodología de la investigación el valor de pH con el cual se obtuvo la mayor

concentración del producto principal (α-terpineol) fue usado para la evaluación

de los parámetros adicionales.


29/38

7.3.3 Evaluación de las fases de crecimiento

Para estos experimentos se añadió limoneno en diferentes fases de

crecimiento del cultivo, la biotransformación fue monitoreada cada 24 h durante

96 h, la tasa más alta de producción de α-terpineol (1667 ± 49,70 mg/L) fue

obtenida, tal como se esperaba en la fase temprana de crecimiento

exponencial la producción de α-terpineol fue bastante mayor que en las otras

fases de crecimiento como se muestra en la Figura 11, además durante las

primeras 48 h todas las cantidades de α-terpineol crecieron con bastante

rapidez, también en estas 48 primeras horas la producción de α-terpineol fue

muy parecida en la fase lag y en la fase estacionaria y para el final de las 48 h

las cantidades obtenidas en los productos en las fases lag, estacionaria y

exponencial final fue muy similar y luego de 48 h los productos obtenidos en

todas las fases se mantuvieron constantes

Figura 11. Efecto de la adición de limoneno en diferentes fases decrecimiento de Penicillium digitatum DSM 62840 en la concentración de α-terpineol. Condiciones del cultivo: medio de cultivo MYB, temperatura27ºC, pH 3.2 y 150 rpm

Tomada de (Prieto, et al., 2011) modificada

Es necesario señalar que si bien la biotransformación de (R)-(+)-limoneno a α-

terpineol ocurre principalmente en la fase exponencial y que en la Figura 11

se puede observar un cambio abrupto entre la fase exponencial inicial y final

(50-60%), pero no se encontraron registros en la literatura que permitieran una


30/38

transición entre la fases de crecimiento exponencial inicial, media y final, por lo

que la fase exponencial media no fue mostrada en la Figura 11

7.3.4 Efecto de la concentración del sustrato

En la mayoría de los casos altas concentraciones de disolventes orgánicos

pueden llegar a ser tóxicos para sistemas biológicos, por lo que se probaron

concentraciones del sustrato que variaron en un rango de 10-100 mM con el

objetivo de optimizar la bioconversion del (R)-(+)-limoneno a α-terpineol y como

se puede ver en la Tabla 3 las concentraciones entre 10 y 15 mM favorecen la

formación del producto principal mientras que concentraciones más elevadas

no solo afectan la obtención de α-terpineol, sino que también la especificidad,

lo que traduce en la aparición de otros productos que pueden observarse en la

Figura 12

Tabla 3 Producción de metabolitos durante la biotransformación de (R)-(+)-limoneno, usando P. digitatum DSM 62840, en medio MYB a 27ºC, 150rpm y pH 3.5

Concentración de (R)-(+)-limoneno (mM)

Sustrato y

productos (mg/L)10 15 30 50 75 100

Limonenorestante

964.7 ±40.70

317 ±25.50

2319 ±44. 67

4866 ±56.98

7432 ±50.82

10566 ±57.89

α-Terpineol357 ±

15.34

1537 ±

34.95

1039 ±

37.36

634 ±

26.26

697 ±

23.75

496 ±

18.84

Otros productos 067 ±

3.43

484 ±

16.26

704 ±

19.97

1477 ±

24.73

1745 ±

32.23


31/38

Además los resultados concuerdan con el valor obtenido en la concentraciónde limoneno que permitía una tasa de crecimiento del Penicillium digitatum

DSM 62840 en el medio de cultivo PDA que a su vez producía un valor

aceptable en el porcentaje de la inhibición por parte del sustrato al P. digitatum,

por lo que se puede afirmar que en este caso la concentración del sustrato se

encuentra fuertemente relacionada con la tasa de crecimiento del cultivo y con

la biotransformación del sustrato al producto principal, además de corroborar

que el α-terpineol es un metabolito primario del P. digitatum DSM 62840

En la Figura 12 se muestran los productos de la biotransformación a una

concentración de 10 mM (B) y 100 mM (A) y se puede notar que con una

concentración de 10 mM la producción de α-terpineol es mucho mayor que una

concentración de 100 mM del sustrato, además con 10 mM no se presenta la

obtención en grandes cantidades de otros productos tales como: cis / trans

carveol, carvona, 1,2 - diol limoneno, cis- p-ment-2,8-dien-1-ol, fenil etanol

(picos 5, 6,7, 8, 9 y 12, respectivamente), β-pineno, sabineno, mirceno (picos 1,

2 y 3), y dos no identificados (Picos 11 y 14) que aparecen a una concentración

de limoneno de 100 mM, y en general luego de concentraciones del sustrato

mayores a 30 mM.

Biotransformación

total

357 ±

15.34

1604 ±

37.33

1523 ±

29.98

1338 ±

22.28

2174 ±

20.76

2241 ±

31.19

Biotransformación (%)

26.20 ±

1.13

75.21 ±

1.71

25.42 ±

0.91

9.31 ±

0.39

6.82 ±

0.23

3.64 ±

0.14


32/38

Figura 12 Cromatograma obtenido en la biotransformación de (R)-(+)-limoneno por Penicillium digitatum DSM 62840 en medio de cultivo MYB a27ºC, 150 rpm y pH 3.5. A: limoneno 100 mM; B: limoneno 15 mM

Tomada de (Prieto, et al., 2011)

7.3.5 Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la capacidad de

biotransformación

La adición previa del (R)-(+)-limoneno al medio de cultivo utilizado en lainvestigación (MYB) produjo un aumento en la producción de α-terpineol del

14.58%, de acuerdo con el control realizado luego de 48 h (a partir de 48 h la

producción de α-terpineol decae considerablemente), como se puede observar

en la Tabla 4 y en las figuras Figura 13 y Figura 14, los resultados sugieren

que las enzimas involucradas en la biotransformación son inducidas por el (R)-

(+)-limoneno, ya que en presencia del limoneno la concentración obtenida de α-

terpineol y por tanto la bioconversion aumentan, además algunos estudios handeterminado que la enzima involucrada es una monooxigenasa cytochromo P-

450 (Tan, et al., 1998)


33/38

Tabla 4. Biotransformación de (R)-(+)-limoneno por P. digitatum DSM62840 de acuerdo con la presencia y ausencia de un inductor

Tiempo(h)

Concentración (mg α-

terpineol/L)

Bioconversión del limoneno

(%)

sin inductor con inductor sin inductor con inductor

0 0.00 0.00 0.00 0.00

8 492 ± 10.90 763 ± 15.90 24.07 ± 0.53 37.34 ± 0.78

24 1154 ± 18.81 1308 ± 22.21 56.47 ± 0.92 64.00 ± 1.09

48 1585 ± 19.51 1835 ± 42.43 77.40 ± 1.32 89.79 ± 2.66

Figura 13. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la producción de α-terpineol por Penici l l ium digi tatum DSM 62840

0.00

1000.00

2000.00

0 10 20 30 40 50 60 C o n c e n t r a c i ó n d e α -

t e r p i n e o l ( m g / L )

Tiempo (h)

Efecto inductivo del sustrato en en la producción de α-

terpineol

sin inductor

con inductor


34/38

Figura 14. Efecto inductivo del (R)-(+)-limoneno en la bioconversion de(R)-(+)-limoneno por Penici l l ium digi tatum DSM 62840

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

0 10 20 30 40 50 60

B i o c o n v e r s i ó n ( % )

tiempo (h)

Efecto inductivo del sustrato en la bioconversión

sin inductor

con inductor


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8 CONCLUSIONES

Los resultados de la investigación llevados a cabo por (Prieto, et al., 2011) paraobtener la mayor cantidad de α-terpineol a partir de (R)-(+)-limoneno por

Penicillium digitatum DSM 62840 fueron: medio de cultivo líquido MYB a pH

3.5 inoculado con esporas inducidas y crecidas en el inicio de la fase

exponencial, con una concentración de limoneno de 14.7 mM, el sustrato se

transformó de manera específica a (R)-(+)-α-terpineol. La máxima

concentración alcanzada fue de 1835 (mg/L), además se determinó que el

limoneno tenía un efecto inductor en el Penicillium digitatum DSM 62840, con elque se alcanzó una tasa de biotransformación del 89.79%


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