biorremediación de suelos contaminados con el insecticida...

Biorremediación de suelos contaminados con el insecticida cipermetrina

Ana María Gómez Camargo, [email protected]

Dana Alejandra Jaimes Parra, [email protected]

Laura Marcela Tovar Gallego, [email protected]

Trabajo de Grado presentado para optar al título de Ingeniero Ambiental

Asesor: María Consuelo Jaramillo Flórez, Doctor (PhD) en Ciencias Químicas.

Universidad de San Buenaventura Colombia

Facultad de Ingenierías

Ingeniería Ambiental

Medellín, Colombia

2020

Citar/How to cite [1]

Referencia/Reference

Estilo/Style:

IEEE (2014)

[1] A. M. Gómez Camargo, D. A. Jaimes Parra, y L. M. Tovar Gallego,

“Biorremediación de suelos contaminados con el insecticida cipermetrina”,

Trabajo de grado Ingeniería Ambiental, Universidad de San Buenaventura

Medellín, Facultad de Ingeniería, 2020.

Grupo de Investigación (GIMSC).

Línea de investigación en gestión ambiental y de los recursos naturales

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https://co.creativecommons.org/?page_id=13

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Dedicatoria

Ana

Quiero dedicar este trabajo principalmente a mi familia, a mis padres que fueron un apoyo

incondicional, a mis hermanas por la compañía brindada y a Dios que es la luz de mi vida.

Además, a mis compañeras de proyecto Dana y Laura que me enseñaron a trabajar en equipo, la

sinceridad y la tolerancia. Finalmente, a mi novio por el apoyo, la compañía y la fuerza que me

brindó.

Dana

Dedico este trabajo a mi familia por apoyarme en cada paso que doy, en especial a mi madre

por motivarme e incentivarme a salir adelante. Gracias a mis compañeras Ana y Laura por su

paciencia, comprensión y por hacer de este proyecto un momento de integración, unión y

aprendizaje. Pero sobre todo esta dedicatoria es a Martín, hijo mío eres mi fuerza, mi motor,

gracias por llenarme de fortaleza para continuar, por ser mi motivación y alegría constante y

por vivir conmigo este proceso.

Laura

A mi madre y mis hermanas por el acompañamiento, a mi padre por ser mi ejemplo e

inspiración. A mi compañero de vida por su fortaleza y paciencia. A Dana, y Ana por luchar

desde el día uno hasta el final.

Agradecimientos

Agradecemos a la profesora Consuelo Jaramillo, nuestra asesora de trabajo de grado por

compartir su sabiduría y corregir nuestros errores, guiándonos siempre con la mejor actitud y

paciencia para dar lo mejor de nosotras. También agradecemos a nuestros compañeros y

personas cercanas que nos acompañaron en este proceso. Por último, a la Universidad de San

Buenaventura por formarnos como profesionales integrales, con valores y aptitudes que

seguramente marcarán la diferencia en el campo laboral.

TABLA DE CONTENIDO

I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 11

II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA........................................................................... 12

A. Antecedentes ...................................................................................................................... 13

III. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................... 19

IV. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 20

A. Objetivo general ................................................................................................................. 20

B. Objetivos específicos .......................................................................................................... 20

V. HIPÓTESIS ........................................................................................................................ 21

VI. MARCO TEÓRICO ........................................................................................................... 22

A. Definición y aspectos generales ......................................................................................... 22

B. Clasificación de los pesticidas ............................................................................................ 22

C. Cipermetrina ....................................................................................................................... 24

D. Agricultura en Colombia .................................................................................................... 25

E. Técnicas físicas, químicas y biológicas de remediación de suelos contaminados ............. 26

F. Técnicas biológicas de remediación ................................................................................... 27

G. Bioaumentación .................................................................................................................. 27

VII. METODOLOGÍA .............................................................................................................. 28

A. Recolección de la muestra de suelo: .................................................................................. 28

B. Determinación de características físico-químicas del suelo ............................................... 28

1) Contenido de humedad: ................................................................................................... 29

2) Determinación de pH en KCl: ......................................................................................... 29

C. Ensayo de ecotoxicidad ...................................................................................................... 29

D. Aislamiento e identificación de bacterias ........................................................................... 32

E. Técnica de bioaumentación ................................................................................................ 34

F. Evaluación de características físicas, químicas y biológicas del suelo después de la

biorremediación .......................................................................................................................... 35

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................................ 36

A. Recolección de la muestra de suelo .................................................................................... 36

B. Características físicas, químicas y biológicas del suelo ..................................................... 36

1) Contenido de humedad .................................................................................................... 37

2) pH .................................................................................................................................... 38

C. Ensayo ecotoxicidad del pesticida ...................................................................................... 41

D. Identificación de bacterias .................................................................................................. 45

E. Técnica de bioaumentación ................................................................................................ 45


biorremediación .......................................................................................................................... 46

1) pH .................................................................................................................................... 46

2) Porcentaje de germinación y efectos letal y subletal ....................................................... 47

3) Población final de microorganismos ............................................................................... 49

G. Concentración final de pesticida ........................................................................................ 50

IX. CONCLUSIONES ............................................................................................................. 51

X. RECOMENDACIONES .................................................................................................... 52

Referencias ..................................................................................................................................... 53

LISTA DE TABLAS

TABLA I. PESTICIDAS SEGÚN TOXICIDAD AGUDA .......................................................... 23

TABLA II. PESTICIDAS SEGÚN VIDA MEDIA ....................................................................... 23

TABLA III. EJEMPLO DE PESTICIDAS SEGÚN FAMILIA QUÍMICA ................................. 24

TABLA IV. EFECTO LETAL ....................................................................................................... 32

TABLA V. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE HUMEDAD ...................................... 37

TABLA VI. DETERMINACIÓN DE pH EN KCl Y AGUA ....................................................... 38

TABLA VII. DETERMINACIÓN DE LA CONDUCTIVIDAD ................................................. 39

TABLA VIII. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE GERMINACIÓN ......................... 42

TABLA IX. DETERMINACIÓN EFECTO LETAL .................................................................... 43

TABLA X. DETERMINACIÓN EFECTO SUBLETAL .............................................................. 43

TABLA XI. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN EN SUELO CON PESTICIDA ................... 44

TABLA XII. EFECTO LETAL EN SUELO CON PESTICIDA .................................................. 44

TABLA XIII. EFECTO SUBLETAL EN SUELO CON PESTICIDA ......................................... 44

TABLA XIV. AUMENTO POBLACIONAL DE BACTERIAS .................................................. 46

TABLA XV. DETERMINACIÓN DE pH DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN ............... 47

TABLA XVI. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN

........................................................................................................................................................ 47

TABLA XVII. EFECTO LETAL DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN ............................. 48

TABLA XVIII. EFECTO SUBLETAL DEPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN ...................... 48

TABLA XIX. POBLACIÓN FINAL DE MICROORGANISMOS EN SUELO FÉRTIL ........... 49

TABLA XX. POBLACIÓN FINAL DE MICROORGANISMOS EN SUELO ESTUDIO ......... 49

TABLA XXI. CONCENTRACIÓN FINAL DE PESTICIDA ...................................................... 50

LISTA DE FIGURAS

Fig. 1. Diagrama general de la metodología del proyecto ............................................................. 28

Fig. 2. Determinación de toxicidad para cada pesticida ................................................................. 31

Fig. 3. Identificación de microorganismos ..................................................................................... 33

Fig. 4. Técnica de bioaumentación ................................................................................................. 34

Fig. 5. Evaluación de características después de la biorremediación ............................................. 35

Fig. 6. Curva de calibración población de bacterias ...................................................................... 40

Fig. 7. Curva de calibración concentración de pesticida ................................................................ 41

Fig. 8. Observación de bacterias a 100x (Tinción de Gram) .......................................................... 45

BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON EL INSECTICIDA CIPERMETRINA 9

RESUMEN

Los piretroides se encuentran en el grupo de los más potentes pesticidas, siendo la cipermetrina un

insecticida sintético que hace parte de este grupo de piretroides y es considerado moderadamente

toxico. Por el interés de lograr acabar con estas plagas, estos se han empleado de manera indebida

y sin un respectivo control, causando efectos no previstos. Los piretroides son persistentes en el

suelo, esto genera una acumulación del contaminante y sus residuos se incorporan en fuentes

hídricas la mayoría de las veces por lixiviación causando afectación a organismos que no deberían

estar involucrados, así como diferentes ecosistemas con daños directos e indirectos.

Este trabajo de grado tiene como finalidad evaluar la posibilidad de emplear un proceso de

biorremediación usando microorganismos autóctonos del suelo en actividades productivas donde

involucren el uso de pesticidas y lograr la remoción parcial o total de este, mejorando las cualidades

del suelo y la posibilidad de recuperar sus características degradadas por el uso del pesticida. Por

lo que se tomó una muestra de suelo con potencial agrícola para analizar sus características físicas,

químicas y biológicas antes y después de ser expuesto a diferentes concentraciones del insecticida

cipermetrina y posteriormente comparar si las condiciones iniciales del suelo son las favorables

para un uso agrícola, teniendo resultados asertivos.

Además, se realizó un ensayo de ecotoxicidad para determinar el nivel toxicológico del pesticida

en diferentes concentraciones y adicionalmente se calcula su efecto letal y subletal en semillas de

lechuga (Lactuca sativa L). Se hace un aislamiento y una identificación de bacterias autóctonas de

la muestra de suelo con el fin de realizar el proceso de bioaumentación y que sean estas mismas las

que se encarguen de degradar el contaminante presente en el suelo. Según los resultados obtenidos

después de realizar estos procesos, se evidenció que efectivamente aumentó la población

microbiana del suelo y es notoria la disminución en la concentración del contaminante, lo que

indica la capacidad óptima que tienen estas bacterias autóctonas del suelo para lograr degradar los

contaminantes.


ABSTRACT

Pyrethroids are in the group of the most potent pesticides, with cypermethrin being a synthetic

insecticide that is part of this group of pyrethroids and is considered moderately toxic. In the

interests of eradicating these pests, they have been misused and uncontrolled, causing unintended

effects. Pyrethroids are persistent in the soil, this generates an accumulation of the contaminant and

their residues are incorporated in water sources most of the time by leaching causing damage to

organisms that should not be involved, as well as different ecosystems with direct and indirect

damage.

This degree work aims to evaluate the possibility of employing a bioremediation process using

microorganisms indigenous to the soil in productive activities where they involve the use of

pesticides and achieve partial removal or total of this, improving soil qualities and the possibility

of recovering its characteristics degraded by the use of the pesticide. So a soil sample with

agricultural potential was taken to analyze its physical characteristics, chemical and biological

before and after being exposed to different concentrations of the insecticide cypermethrin and then

compare whether the initial soil conditions are favourable for an agricultural use, having assertive

results.

In addition, an ecotoxicity test was carried out to determine the toxicological level of the pesticide

at different concentrations and additionally its lethal and subletal effect in lettuce seeds (Lactuca

sativa L) was calculated. Isolation and identification of bacteria native to the soil sample is carried

out in order to carry out the bioaugmentation process and that are responsible for the degradation

of the contaminant present in the soil. According to the results obtained after these processes, it

was found that the microbial population of the soil actually increased and the decrease in the

concentration of the pollutant is noticeable, indicating the optimal capacity of these native soil

bacteria to degrade pollutants.


I. INTRODUCCIÓN

Evitar, controlar, mitigar o eliminar los impactos ambientales negativos provocados por el uso

inapropiado de pesticidas en cultivos agrícolas es fundamental para garantizar la salud de los

cultivos, la flora y vegetación aledaña, los animales, el ser humano y todo lo que comprende el

medio ambiente. A partir de un interés académico e investigativo se realiza el siguiente trabajo

donde se propone una alternativa de biorremediación de suelos afectados por el mal empleo de

pesticidas, específicamente de tipo cipermetrina. Se abordará la literatura para obtener una línea

base sólida y además, se realizará a nivel de laboratorio un ensayo experimental de bioaumentación

de bacterias autóctonas de una muestra de suelo tomada del municipio de Bello, Antioquia y que

ha sido contaminado previamente con diferentes concentraciones de cipermetrina. Posteriormente,

se busca evaluar la efectividad de remoción de dicho insecticida comparando las características

físicas, químicas y biológicas del suelo antes y después de aplicar la técnica de bioaumentación. El

trabajo está estructurado cronológicamente en el que inicialmente se encuentra la literatura y

bibliografía base que darán el punto de partida para la realización del proyecto, seguido de la

sección metológica y los resultados obtenidos a partir del cumplimiento de ésta. Finalmente, se

encontrará el análisis de los resultados, conclusiones y las recomendaciones que se darán según las

necesidades identificadas.


II. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Al pasar del tiempo, las actividades desarrolladas por el hombre se han convertido en una gran

problemática debido a que no son realizadas de una manera sostenible, ocasionando así la

alteración de los bienes y servicios ecosistémicos. Una de las grandes afectaciones ha sido la

degradación de los suelos debido a la mala planificación del recurso, malas prácticas agrícolas,

sobrecargas, conflictos de uso, entre otros factores que han tenido grandes repercusiones en el buen

desempeño de las distintas especies y los ecosistemas al que pertenecen[1].

Debido a las múltiples actividades antrópicas que se han realizado para solventar las necesidades

infinitas del hombre, se ha usado y explotado los recursos de una forma tan exagerada que ha sobre

pasado el punto de tolerancia que estos poseen. Correa & Rendón, citados por [2], afirman que el

agotamiento de recursos es notorio, que las especies se han visto afectadas, que se han disminuido

las áreas fértiles debido a la contaminación y uso excesivo de agroquímicos, pesticidas, herbicidas

entre otras sustancias utilizadas para aumentar la productividad en los cultivos sin pensar en las

afectaciones directas e indirectas que genera a otras especies y recursos como el agua, el suelo, y

hasta al ser humano.

Todos los recursos naturales son de gran importancia, tanto los renovables y como no renovables.

Entre estos recursos se encuentra el suelo, el cual ha sido reconocido como un recurso natural

renovable. Sin embargo, al paso de los años es notoria la afectación hacia éste debido a las

actividades realizadas por la humanidad que lo han deteriorado a tal punto de no ser capaz de

regenerarse por sí solo debido a la pérdida de sus propiedades resilientes, y si se realiza algún tipo

de intervención en él con el fin de recuperar sus características, conlleva periodos de tiempos muy

largos, así que actualmente se debería considerar el suelo como un recurso natural no renovable

como lo citan en [3]. Además, el suelo cumple un papel fundamental por ser el soporte de toda la

vegetación, nos provee de minerales, es la fuente principal de las actividades económicas del

hombre y tiene una estrecha relación con el recurso hídrico. Por estas razones es importante

establecer límites y hacer un aprovechamiento responsable e implementar técnicas de producción

sostenible o por el contrario, las consecuencias serán de gran magnitud [4]. Es imprescindible

incluir dichas técnicas tales como plantaciones orgánicas, sistemas eficientes de riego, evitar

monocultivos, entre otras y además, se debe hacer siempre los diagnósticos y caracterizaciones


pertinentes para evitar la sobre-explotación del suelo y si se llega a este punto se debe realizar

intervenciones al sitio explotado para evitar una pérdida total de este recurso [5].

Es así como en el presente trabajo de grado se plantea la necesidad de intervenir en el

recurso suelo mediante técnicas de biorremediación que puedan devolver sus características

originales o lo más próximo a ellas y así evitar la degradación de éstos.

A. Antecedentes

En el trabajo propuesto por Urbina Murillo en [6] se define la cipermetrina como un producto

sintético, estructurado por el piretro, con una alta y estable actividad biológica, actuando como

insecticida por ingestión y contacto. Tiene efecto de repelencia y efectivo control sobre variedad

de insectos como Coleóptero, Hemípteros y Lepidópteros en los cultivos. También es usada para

combatir moscas y plagas que atentan con la salud humana. Este pesticida es poco tóxico con los

mamíferos, pero altamente toxico para peces y abejas.

Este producto actúa sobre la membrana nerviosa provocando un bloqueo de la transmisión hasta

los axones de las neuronas teniendo como resultado la muerte. Al tener gran amplitud de usos

puede provocar impactos negativos a otras especies que no están dentro de su propósito. Es por

esto que el autor de este artículo evaluó el desarrollo y supervivencia de larvas de Chrysoperla

externa mediante el efecto de tres tipos de insecticidas: botánico, químico y biológico, resultando

el insecticida químico el más toxico (cipermetrina), produciendo el 100% de la mortalidad en las

larvas.

Cardona et al. afirman que según Organización Mundial de la Salud (OMS), la cipermetrina es

catalogada como “moderadamente peligroso” de clase II y es uno de los insecticidas más usados.

Los autores también mencionan que el uso de este insecticida para el control de plagas en los pastos

de potreros se realiza de forma indiscriminada debido a que no se tiene un control adecuado en la

aplicación, en la dosis y en la formulación, teniendo como consecuencia la presencia de éste en el

organismo humano por efectos de la cadena alimenticia, pues puede ser ingerido por los animales.

Por esta razón, los autores realizan una estandarización de un método analítico por medio de

cromatografía de gases con detector de ionización de llama (CGDILL) y micro extracción en fase


sólida (MEFS) para la cuantificación y extracción de la cipermetrina en pastos donde se obtuvieron

resultados confiables y que garantizan el cumplimiento de los parámetros estimados de un método

analítico [7].

En [8] se cita a Rummenie et al., Capowiez et al. y Manetti et al., quienes manifiestan que la

siembra directa favorece al abastecimiento de los alimentos y al hábitat de algunos organismos.

Igualmente, Clemente et al. , Garavano et al. , Faberi et al, Salvio et al. citados en el mismo artículo,

complementan que las babosas y los bichos bolita ocasionan impactos negativos en los cultivos de

soja, girasol y colza. Debido a esto, los autores de este artículo evalúan el efecto toxico de tres

insecticidas Cipermetrina, Glifosato y Clorpirifos sobre Armadillidium vulgare y Milax gagates,

donde no se obtuvo efectos de mortalidad debido a los tres insecticidas para este último. Por otro

lado, para A. vulgare se obtuvo efectos letales por la exposición a la Cipermetrina y Clorpirifos

pero no con el Glisfosfato.

Urbina Murillo también define en su trabajo la piretrina como un insecticida de origen natural que

extraen de las flores de crisantemo (Chrysanthemum cinerariefolium), han sido utilizadas desde

hace más de 30 años debido a su efectividad y estabilidad. Comparándolo con otros insecticidas de

origen vegetal, estos compuestos tienen alta efectividad y rápida acción contra gran población de

insectos, su baja estabilidad frente a factores ambientales como el aire y la luz limitan su uso en

plagas agrícolas. Este insecticida ha evolucionado a lo largo del tiempo, en un comienzo se conocía

solo el concepto de piretrina y posterior a esto se incorpora el concepto de piretroides, los cuales

son insecticidas sintéticos derivados de las piretrinas pero a pesar de que sus estructuras sean

semejantes, los piretroides al ser sintéticos son más demandados por ser más efectivos y estables

que los de origen natural. Estos contienen propiedades que atacan insectos que se encuentran en

alimentos y en diferentes ambientes que son utilizados por el ser humano. A lo largo de los años

se han realizado variaciones en su forma estructural; viéndolo desde lo farmacológico y

electrofisiológico el DDT y sus derivados son parecidos a los piretroides su diferencia radica en su

estructura [6].

González en [9] menciona que los primeros cambios y variaciones sintéticas que se realizaron para

dar con los primeros piretroides fueron hechos por Staudinger y Ruziclza en Zuricb hace más de


70 años. El primer piretroide activo tenía similitudes con la piretrina I natural, y aun es utilizado

como insecticida doméstico. En el año 1949, Synerbolm continúa con los avances de Staudinger,

esta vez para examinar esteres bencílicos más activos. Luego, en 1950 incrementaron los avances

de crisantematos de metilo, arilo y beteroarilo. Sin embargo, fue solo hasta 1968 cuando los

piretroides son solicitados por las personas para ser utilizados como insecticidas agrícolas ya que

gracias a Ellior y Kato que se encargaron de lograr la obtención de permetrina y cipermetrina, las

cuales presentaban muy buena estabilidad dejaron de ser insecticidas para uso únicamente

doméstico y pudieron ser empleadas en la agricultura. Se han realizado diferentes estudios en donde

se modifica la estructura de estos piretroides y se han encontrado unos más activos que otros, y

otros más fáciles de sintetizar pero con el mismo modo de acción, estos estudios y cambios hacia

los piretoides continúan; sin embargo, en menos proporción [7].

Con respecto al efecto de los plaguicidas en las cadenas tróficas, Urbina Murillo afirma que los

productos químicos para el control de las plagas tienen un efecto negativo para los organismos

benéficos y controladores biológicos, debido a que causa daños directos en organismos expuestos

directa e indirectamente. A pesar de que los pesticidas ofrecen alta especificidad de acción, resultan

efectos indeseables como la resistencia de algunos organismos a estos químicos, además de aportar

la contaminación de las fuentes hídricas, la degradación de la fauna y la flora y la persistencia de

los residuos tóxicos en el ambiente. Frente a la resistencia de los organismos, es necesario aumentar

las cantidades de pesticidas o utilizar compuestos más tóxicos para tener controles más efectivos.

Los insecticidas químicos son capaces de fijarse en las reservas de las especies vegetales y en el

tejido adiposo de los animales, llegando a concentraciones letales que pueden causar daños

fisiológicos y también en la persistencia en el suelo. La disminución de la biodiversidad a causa de

este compuesto conlleva a la proliferación de las especies antagónicas de aquellas extinguidas, y

como consecuencia aparecen nuevas plagas y se generan desequilibrios ecológicos. Entre otros

impactos que deja el mal uso de los pesticidas es la alteración de la velocidad de descomposición

de la materia orgánica en el suelo, afectación del crecimiento de la biomasa y microbial, el

desequilibrio en los ciclos del suelo y la destrucción catalítica de la capa de ozono [6].

Los piretroides son persistentes en el suelo, esto permite su introducción en las cadenas tróficas y

con ello lograr una acumulación progresiva de las sustancias toxicas del plaguicida, afectando la


disponibilidad de los nutrientes que contiene el suelo y así provocando destrucciones masivas de

la biodiversidad. Sin embargo no se han demostrado efectos adversos serios debido a las bajas

dosis de uso [9].

Se han utilizado diversos métodos como los reportados por Hernández et al., en donde emplean

una técnica de superficie de respuesta y el método de extracción asistida por microondas con el fin

de lograr la determinación de los piretroides (deltametrina y cipermetrina) en un suelo de uso

agrícola, arrojando una recuperación mayor al 85 %. Otro método implementado para la

determinación de concentración de pesticida en el suelo es el propuesto por Fernández et al. , en

donde implementa el método de micro extracción en fase sólida obteniendo recuperaciones de

cipermetrina en 98 % y deltametrina en 81 %. Adicionalmente, está el método de Rissato et al. , en

donde se emplea la extracción por fluidos súper-críticos (EFS) para la determinación de plaguicidas

piretroides en suelo agrícola [10]. Los sintéticos frenan la acción de control ejercida por los hongos

entomopatógenos sobre especies de la familia Tetranychidae conllevando a una mayor exposición

de los enemigos naturales [6].

Lynen et al, Ackermann et al, ; Elliot, M., se citan en [11], y nombran la cipermetrina como un

pesticida piretroide, siendo este el más usado para la agricultura del Valle Inferior del rio Chubut

en Argentina. En este mismo artículo, Sastre et al. afirma que este Rio es el recurso hídrico más

importante para la región debido a que es utilizado para el riego agrícola, también por el suministro

de agua potable y la generación de energía eléctrica. Este recurso es un receptor de efectos

negativos debido a drenajes, filtraciones, escurrimientos con residuos. Nyholm y Källqvist

adicionan que en los ecosistemas acuáticos se encuentra el fitoplancton, un eslabón de la cadena

trófica y Prósperi complementa que debido a una alteración de las micro algas por el estrés

toxicológico, se desequilibra todo el sistema. los autores de este artículo se enfocan en la

determinación de la sensibilidad de las micro-algas Chlorella vulgaris, y Scenedesmus

quadricauda al insecticida Cipermetrina, usando el método de bioensayos de toxicidad, resultando

estas dos micro-algas sensibles a este insecticida [11].

Henao, Palacio y Camargo en [12] mencionan que la mayoría de los residuos de plaguicidas se

incorporan en los ecosistemas acuáticos debido a la lixiviación y a la escorrentía, atentando la vida


de los organismos, y provocar desequilibrio en su ADN hasta ocasionar mutaciones, carcinogénesis

y aumentar la carga genética en varias generaciones. Según el Instituto Colombiano Agropecuario

(ICA), la cipermetrina y el diazinon son insecticidas de mayor uso en Colombia. Éste último está

dentro del grupo de los organofosforados y es catalogado como moderadamente toxico en algunas

especies pero altamente toxico para peces. Mientras que la cipermetrina la catalogan como

medianamente toxico y es usada para el control de plagas en los cultivos y como base para el

champú anti-piojos para humanos [13].

En [12] citan a Smith y Stratton, quienes afirman que los piretroides están dentro del grupo de los

insecticidas más potentes, también se cita a Polat et al., Yilmas et al., que se basan en la USEPA

(United States Environmental Protection Agency) para clasificar este insecticida de uso restringido,

siendo este compuesto muy toxico para algunos artrópodos acuáticos y para peces. Considerando

la información anterior, en esta investigación se busca evaluar la cipermetrina y el diazinon,

determinando los efectos genotípicos sobre la tilapia roja, especie altamente cultivada en Colombia.

También, se evalúa el efecto de la exposición a bajos niveles de concentración de ambos

plaguicidas y estimar si el ensayo es una herramienta útil para biomonitoreo de daños genéticos.

Según los resultados se determinó que la cipermetrina es mucho más toxica que el diazinon para la

tilapia roja debido a que los piretroides son muy lipófilicos, siendo de alta absorción por medio de

las branquias, se metaboliza y se elimina de una forma más lenta en los peces que en las aves y

mamíferos. Para ambos plaguicidas, las bajas concentraciones resultan siendo muy letales en la

prolongación del periodo de exposición causando daños genotoxicos, ocasionando una

probabilidad de riesgo para los humanos debido a la generación del cáncer por la obtención de

células con diversas mutaciones provocando a su vez células iniciadoras de carcinogénesis.

Finalmente, Pino, Carvajal, Gallo y Peñuela, evalúan los tratamientos de bioestimulación y

bioaumentación para la remoción de diésel y deducen que la bioaumentación tiene un efecto

positivo en la remoción del hidrocarburo ya que lo remueve en un 41%. Sin embargo, la

bioestimulación con nutrientes y cáscara de banano, tiene un mejor efecto ya que degrada el 93%.

Este último permite el desarrollo de la población microbiana favoreciendo el enriquecimiento del

suelo con nutrientes, generando de esta manera estrategias sostenibles de recuperación. Se

evidencia que el uso de microorganismos nativos en suelos afectados representa una buena


alternativa para disminuir la contaminación generada por compuestos como el diésel, siempre y

cuando se estimule su desarrollo [14]. A su vez, se deben tener en cuenta los cambios en las

condiciones a las que son sometidas las especies bacterianas que van a degradar el compuesto, ya

que alteraciones en humedad, luz, nutrientes pueden generar cambios significativos en su

metabolismo favoreciendo o perjudicando el crecimiento de estas o más especies y se afecta la

velocidad y eficiencia en degradación in o ex situ.


III. JUSTIFICACIÓN

La afectación generada al recurso suelo y a sus ecosistemas debido al uso inapropiado de sustancias

toxicas presentes en agroquímicos como los pesticidas, los cuales tienen la ventaja de controlar

plagas pero a su vez cuentan con la capacidad de penetrar en diferentes organismos. En los sistemas

de producción el uso de pesticidas incrementa ganancias económicas debido a que disminuye la

pérdida de productos y a su vez conlleva a un preocupante estado por la afectación a diversas

especies vegetales y animales, al recurso hídrico, suelo y a la salud humana [15]. Por lo tanto, se

considera que la biorremediación es un tema que incorpora aspectos vitales para seguir con las

actividades cotidianas y productivas. Sin embargo, éste es un procedimiento poco utilizado, por lo

que es necesario investigar con mayor profundidad para mejorar y fomentar la aplicación de

diversos métodos biológicos que sean efectivos para mitigar, solucionar y prevenir el impacto

negativo, implementando técnicas como la bioaumentación de hongos y/o bacterias aisladas desde

el mismo suelo para el tratamiento de insecticidas ampliamente usados como la cipermetrina [16].

La relación que existe entre las plantas y los microorganismos es importante para el desarrollo de

las plantas y la rápida recuperación de los suelos; al usar pesticidas no específicos, la población

microbiana disminuye, por lo tanto, el aumento de los microrganismos permitirá al suelo el

restablecimiento de las características propias, y por ende el crecimiento normal de los cultivos,

por lo anterior, la bioaumentación se convierte en una alternativa prometedora para la recuperación

de los suelos.


IV. OBJETIVOS

A. Objetivo general

Evaluar la efectividad de la biorremediación de suelos contaminados con cipermetrina por medio

de la técnica de bioaumentación a escala de laboratorio

B. Objetivos específicos

Determinar la ecotoxicidad del pesticida usando Lactuca sativa.

Identificar el tipo de bacterias presentes en el suelo a tratar.

Calcular los porcentajes de remoción del pesticida después de aplicar la técnica de

bioaumentación.

Determinar las características fisicoquímicas del suelo contaminado antes y después de la

biorremediación.


V. HIPÓTESIS

Los microorganismos como las bacterias presentes en el suelo tienen la capacidad natural de

remediar altas concentraciones de compuestos químicos y transformarlos en otros más simples, por

lo tanto, son efectivos para la biorremediación de suelos contaminados por el pesticida

cipermetrina, utilizando la técnica de la bioaumentación.


VI. MARCO TEÓRICO

A. Definición y aspectos generales

Según Departamento de Reglamentación de Pesticidas [17], se denomina pesticida a cualquier

sustancia elaborada para controlar, matar, repeler o atraer a un organismo vivo que provoque daño

o pérdidas económicas o que transmita o produzca alguna enfermedad. La importancia y la

necesidad del uso de pesticidas se remontan a la antigüedad y se evidencia durante la “Revolución

verde” en la que la producción de alimentos aumentó considerablemente para así poder abastecer

a la población mundial, la cual tiene un crecimiento continuo [18]. Además, el uso de pesticidas se

emplea en la producción de materias primas y su uso no se limita solamente al sector agrícola sino

que también se extiende hasta algunos ámbitos de la industria como el sector químico[19] y al

sector salud en el que es utilizado para el control de enfermedades como la malaria y el dengue

[20].

El mal manejo de pesticidas tiene consecuencias sobre la salud humana debido a la acumulación

de sustancias nocivas. Sin embargo, su toxicidad depende de la dosis, vía y tiempo de exposición

[21] . La permanencia, transporte o riesgo de los pesticidas en el ambiente depende de muchos

factores como las características medioambientales y factores físico-químicos y además de la

estructura química del pesticida, los cuales pueden ser de tipo orgánico e inorgánico [22].

B. Clasificación de los pesticidas

Los pesticidas se pueden clasificar mediante algunas particularidades tales como: la toxicidad

aguda, definida y clasificada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), citado por [20]

como “la capacidad del plaguicida de producir un daño agudo a la salud a través de una o múltiples

exposiciones, en un período de tiempo relativamente corto” (Tabla 1).


TABLA I. PESTICIDAS SEGÚN TOXICIDAD AGUDA

Clase Toxicidad

Clase IA Extremadamente peligrosos

Clase IB Altamente peligrosos

Clase II Moderadamente peligrosos

Clase III Ligeramente peligrosos

Fuente: Artículo de revisión. Plaguicidas: clasificación, uso, toxicología y medición de la exposición.

La vida media, junto con la persistencia que se clasifican en permanentes, persistentes,

moderadamente persistentes y no persistentes (Tabla 2).

TABLA II. PESTICIDAS SEGÚN VIDA MEDIA

Persistencia Vida media

No persistentes De días hasta 12 semanas

Moderadamente persistente De 1 a 18 meses

Persistente De varios meses a 20 años

Permanentes Indefinidamente

Fuente: Artículo de revisión. Plaguicidas: clasificación, uso, toxicología y medición de la exposición.

Otra de sus clasificaciones es la estructura química y los más destacados pesticidas son los

organofosforados, organoclorados, los carbamatos y las triazinas [23]. Los pesticidas de tipo

organofosforados son altamente tóxicos y se utilizaron en las guerras como gas nocivo y

posteriormente fueron sintetizados para combatir plagas [24]. Las consecuencias sobre la salud

por exposición puede ocasionar hipersecreción bronquial, espasmos de laringe, cefaleas y hasta

provocar un coma o la muerte [25]. La resistencia a la degradación biológica y química y la

liposolubilidad son características de los pesticidas organoclorados [26] ocasionando alteraciones

en el sistema nervioso de los seres humanos y cáncer en algunos animales [27], por ésta razón se

prohíbe su uso en algunos casos [28]. Una intoxicación o afectación se da gracias a la exposición

por medio de diferentes rutas debido a que algunos pesticidas son empleados en múltiples usos,

como es el caso de los carbamatos [29]. Éstos son usados principalmente como fungicidas y

herbicidas y sus efectos sobre los ecosistemas y la salud humana siguen siendo debatidos [30]

(Tabla 3).


TABLA III. EJEMPLO DE PESTICIDAS SEGÚN FAMILIA QUÍMICA

Familia química Ejemplos

Carbamatos Aldicarb, Bendiocarb, Carbaril, Carbofuran, Carbosulfan,

Metiocarb, Metomil, Pirimicarb, Tiodicarb

Organofosfatos Acefato, Clorpirifos, Diazinon, Dimetoato, Fenitrotion, Fention,

Malation, Metamidofos, Monocrotofos, Paration, Pirimifos,

Profenofos, Temefos

Organoclorados

DDT

Piretroides Alletrin, Bifentrina, Ciflutrina, Lambda-Cialotrina,

Cipermetrina, Deltametrina, Fenvalerate, Permetrina, Resmetrina

Neonicotinoides Acetamiprid, Imidacloprid, Nitenpiram, Tiacloprid, Tiametoxam

Fuente: Artículo de revisión. Uso de insecticidas: contexto y consecuencias ecológicas.

El enfoque de este trabajo se basa en el estudio del insecticida Cipermetrina perteneciente a la

familia de los piretroides.

C. Cipermetrina

Los piretroides son insecticidas sintéticos y modificados para obtener una estabilidad en el

ambiente, están clasificados como insecticidas potentes. Tanto los animales como los seres

humanos están expuestos a los piretroides debido a que estos insecticidas son usados en las labores

domésticas para repeler o eliminar los insectos. Los piretroides permanecen días en el aire antes de

que estos sean degradados, también se fijan fuertemente al suelo y no se movilizan en la tierra

debido a que las raíces de las plantas no son capaces de captarlos pero cuando se riega directamente,

su permanencia en la planta puede estar en las frutas, hojas y hortalizas. Los productos de este tipo

utilizan derivados del petróleo como disolvente y en algunas ocasiones compuestos como

carbamatos, organofosforados y otras sustancias integradoras, para aumentar la eficiencia del

efecto de los insecticidas [31]. Los piretroides tienen cuatro generaciones importantes, la

cipermetrina hace parte de la cuarta generación de estos, la cual tiene un mayor efecto ante algunos

parásitos como los que se presentan en las frutas y las verduras [32], este tipo de piretroide es

derivado de la planta del crisantemo [33]. Se representa como el compuesto más utilizado


actualmente y es la molécula que contiene el insecticida cipermetrina [34]. Según Ramsey &

Schofield, citados por [33] la cipermetrina ha sido utilizada en medicina con buenos resultados en

el control de la enfermedad de Chagas, en el tratamiento de la pediculosis y la escabiosis según

Cox, citado por el mismo autor. Según el Instituto Colombiano Agropecuario la cipermetrina es de

los insecticidas de mayor uso en Colombia y se emplea para el control de plagas de cultivos

agrícolas, así como para la elaboración de veneno que actúa en contra de los piojos de los humanos;

algunos productos que contienen cipermetrina están clasificados como “plaguicidas de uso

restringido” por la USEPA debido a su efecto altamente toxico que atenta a la biota acuática [12].

D. Agricultura en Colombia

Según el IGAC [35], Colombia cuenta con aproximadamente 22,1 millones de hectáreas con

vocación agrícola pero únicamente utiliza el 24, 1% del potencial total. El país tiene una gran

ventaja para este sistema productivo debido a la localización intertropical y ecuatorial, a las

temperaturas uniformes durante todo el año y a su geografía variada, incluyendo los diferentes

pisos térmicos, siendo beneficioso para la producción de gran diversidad de productos en varios

departamentos. Los principales productos tropicales para las exportaciones son el cacao y el café

[36]. Éste último, producido en zonas cafeteras como los departamentos de Caldas, Cauca, Quindío,

Tolima, Valle del Cauca, Antioquia y Huila [37], donde se pueden mantener condiciones físico-

químicas de los suelos aptos para los cultivos, como un pH con valores entre 5 y 5,5; un porcentaje

de materia orgánica de 12; fósforo entre 6 y 14 ppm y bases entre 6 y 10 me/100 g [38].

También, en Colombia el produce el mejor cacao debido a su sabor y aroma, este cultivo se

encuentra casi en todas las regiones del país, aunque el departamento con la mayor producción es

Santander [39]. Generalmente los suelos para este cultivo son de buena fertilidad, con buen drenaje

y con valores de pH entre 6.0 y 7.0 [40].

Por otro lado, la conductividad como su nombre lo indica, es la medida de la capacidad que posee

un material de conducir la corriente eléctrica, siendo los valores altos un indicador de que la

corriente fluye más fácil a través del mismo. De este modo, se recomiendan valores por debajo a 1

dS/m en el sustrato para facilitar los procesos de fertilización y además, evitar inconvenientes por

fitotoxicidad en el cultivo [41].


El principal componente para el suelo agrícola es la materia orgánica debido a la participación en

los procesos biológicos, químicos y físicos. También contribuye en la relación con los organismos

y el aporte de los nutrientes al suelo para el desarrollo de buenas características. Los posibles

impactos negativos sobre el suelo debido a esta actividad es la disminución de la actividad

biológica causada por el uso de plaguicidas, excesivo laboreo y la compactación, dando como

consecuencias la disminución de nutrientes, la capacidad de degradar el plaguicida y la capacidad

de reciclar los nutrientes [42].

El uso de los plaguicidas en Colombia genera diversos problemas para la salud humana por falta

de implementos de protección y desconocimiento de estas sustancias. Según la Organización

Mundial de la Salud, entre quinientos mil y un millón de personas se intoxican con plaguicidas,

principalmente en agricultores, obreros y exterminador de plagas [43].

E. Técnicas físicas, químicas y biológicas de remediación de suelos contaminados

Al implementar técnicas de remediación se debe tener en cuenta si se va a realizar in situ o ex situ

debido a que dependiendo de la técnica elegida pueden presentarse cambios significativos

posteriores al proceso que pueden ser negativos y dificultar la recuperación del suelo original.

Según Elwes, las técnicas de remediación se dividen en cuatro categorías: la primera categoría es

la de extracción, en donde se puede realizar un lavado de suelos para disminuir el contaminante,

teniendo presente que tan soluble es este. También por aplicación de vacío a suelos y de esta manera

eliminar los COV´S o ventilación de suelos en donde se unen tanto la extracción con la inyección

del aire ; la segunda categoría es implementación de técnicas químicas, aquí se encuentran procesos

de oxidación en donde se agregan agentes oxidantes al entorno afectado por el contaminante y se

convierte en compuestos más inofensivos para el medio ambiente, y el proceso de deshalogenación

en donde se convierten contaminantes con halógenos es sustancias menos nocivas; en las técnicas

físicas se encuentra la fijación o encapsulamiento que tiene como finalidad acopiar e inmovilizar

los agentes contaminantes y por último se encuentran las técnicas biológicas también conocidas

como técnicas de biorremediación como lo son la bioaumentación, la bioestimulación, la

fitorremediación. Algunas técnicas para remediar suelos contaminados por pesticidas de manera

biológica son la bioestimulación en donde se inyectan líquidos o gases que excitan la actividad de


los microorganismos autóctonos , la bioaumentación en donde se agregan más microorganismos

para que la degradación sea más rápida y eficiente y una técnica que muy conocida que es la

fitorremediación conformada por un conjunto de plantas y microorganismos encargados de

degradar, transformar contaminantes muy tóxicos en menos letales como los metales pesados [44].

F. Técnicas biológicas de remediación

Es un proceso que requiere de enzimas, hongos y/o microorganismos con el objetivo de recuperar

de forma biológica el daño que se ha generado en el entorno natural, este puede llevarse a cabo por

subprocesos como lo son la bioestimulación y la bioaumentación, ambos enfoques se han

implementado en la recuperación de suelos, y se han obtenido resultados exitosos. La

bioestimulación consiste en la adición de nutrientes para favorecer el crecimiento de los

microorganismos con el fin de agilizar el proceso degradativo [45]. Esta técnica tiene ventajas de

fácil operación, construcción y mantenimiento, también es posible aplicar a grandes extensiones

de tierra a costos bajos y buena eficiencia a la hora de remover el contamínate [46].

G. Bioaumentación

La bioaumentación es la adición externa de microorganismos los cuales contribuyen al proceso de

biodegradación de los diferentes contaminantes que se encuentren en el suelo. Independiente del

proceso implementado se deben tener en cuenta tanto factores bióticos como abióticos ya que estos

influyen en el comportamiento y adaptación de los microorganismo y por ende en el proceso

degradativo [47]. Se determina por pruebas de laboratorio con el fin de caracterizar los

microorganismos, incluyendo el estudio, la evaluación y principalmente la capacidad de colonizar

y de disminuir las concentraciones de los contaminantes del suelo [46].


VII. METODOLOGÍA

Para la realización del proyecto de investigación se siguió paso a paso el siguiente diagrama:

A. Recolección de la muestra de suelo:

Se determina que la muestra de suelo se tomará de un sitio con aparente potencial e influencia

agrícola, y que posteriormente será contaminado de manera controlada con diferentes

concentraciones de pesticida tipo cipermetrina a nivel de laboratorio donde se pueda monitorear

las condiciones físicas, químicas y biológicas necesarias para que los resultados sean los más

acertados posible. La cantidad de muestra a tomar será de 10 kilos aproximadamente con los que

bastará para realizar todos los procedimientos que componen este estudio.

B. Determinación de características físico-químicas del suelo

Las características físico-químicas determinadas son: humedad, pH (en agua y KCl) y

conductividad.

Fig. 1. Diagrama general de la metodología del proyecto

Ensayo de

ecotoxicidad

Recolección de la

muestra de suelo

Determinación de

características físico-

químicas del suelo

Aislamiento e

identificación de

microorganismos

Aplicar la técnica de

bioaumentación

Evaluación de las

características del suelo

después de la

biorremediación


1) Contenido de humedad:

Se realiza a partir de la metodología propuesta en el trabajo de [48]. Se inicia tomando 5g de

muestra por triplicado y se deja secando en una estufa a 105°C y luego de 24 horas, se pesan

nuevamente las muestras. Finalmente, el cálculo del porcentaje de humedad se realiza a partir de

la ecuación (1)

%𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 =𝑃𝑠ℎ−𝑃𝑠𝑠

𝑃𝑠ℎ× 100 (1)

Donde,

%Humedad: Porcentaje de humedad en la muestra de suelo

Psh: Peso del suelo húmedo [g]

Pss: Peso del suelo después del secado a 105°C [g]

2) Determinación de pH en KCl:

Se toma una muestra de suelo de 20g por triplicado, se agrega 60mL de KCl 1.0 M a cada una y se

agitan por 15 minutos. Luego, las muestras se dejan reposar por 30 minutos y se hace la medición

del parámetro con un pH-metro a cada muestra.

3) Determinación de pH en agua:

Se toma una muestra de suelo de 20g por triplicado, se agrega 60mL de agua a cada una y se agitan

por 15 minutos. Luego, las muestras se dejan reposar por 30 minutos y se hace la medición del

parámetro con un pH-metro a cada muestra.

4) Determinación de conductividad:

Se toma una muestra de suelo de 20g por triplicado, se agrega 60mL de agua a cada una y se agitan

por 15 minutos. Luego, las muestras se dejan reposar por 30 minutos y se hace la medición de la

conductividad con un pH-metro multiparámetro a cada muestra.

C. Ensayo de ecotoxicidad

El ensayo de ecotoxicidad se hace a partir de la metodología descrita en [49] con el fin de

determinar el nivel toxicológico de cada pesticida en diferentes concentraciones previamente


establecidas: 1%, 0.5%, 0.25%, 0.125% y 0.0625%. Se utilizan semillas de lechuga (Lactuca sativa

L.) por su rápido y fácil crecimiento, las cuales son incubadas dentro de una caja Petri puestas en

4 columnas y 5 filas, se pone un papel filtro en su interior inundado con cada concentración

respectivamente.

Luego de 7 días se cuenta el número de semillas germinadas y se mide la elongación de la radícula

(raíz) y el hipocótilo (tallo) para posteriormente calcular el efecto letal y el efecto subletal.

Luego de realizar este procedimiento, se debe seleccionar la concentración mínima en la que se

muestran efectos tóxicos que alteren la germinación y crecimiento de las semillas y a partir de esta

concentración se seleccionan 2 valores menores (0,04% y 0,02%). Posteriormente se toman 30g de

suelo para cada concentración y se siembran 5 semillas en cada muestra y éstas se hacen por

triplicado. Después de 15 días aproximadamente se determina nuevamente el porcentaje de

germinación y los efectos letal y subletal.


Para el cálculo del efecto letal (toxicidad) se hace la relación del porcentaje de semillas germinadas

con respecto al control negativo y se determina el tipo de la siguiente manera (Tabla IV).

Fig. 2. Determinación de toxicidad para cada pesticida

+ 5mL de

concentración

Ensayo de

fitotoxicidad

Preparación de

concentraciones: 1%,

0.5%, 0.25%, 0.125% y

0.0625%

Temperatura

ambiente, humedad

ambiente y

oscuridad por 7 días.

Contabilizar las semillas

germinadas y medir

longitud de radícula e

hipocótilo.

Calcular porcentaje de

germinación, efecto letal

y subletal.

Seleccionar la

concentración mínima

con efecto tóxico en las

semillas

Se proponen 2

concentraciones por

debajo del valor

seleccionado (0,04% y

0,02%)

En 30g de suelo se

plantan 5 semillas (una

muestra por cada

concentración y por

triplicado)

Calcular porcentaje de

germinación, efecto

letal y subletal


TABLA IV. EFECTO LETAL

Tipo Semillas germinadas

No tóxico >90%

Tóxico 75-90%

Muy tóxico <75%

Fuente: “Evaluación ecotóxica de aguas subterráneas utilizadas para el consumo humano en Cuba”

El efecto subletal entendido como la inhibición en el crecimiento de la raíz se determina mediante

la fórmula (2).

𝐸𝑓𝑒𝑐𝑡𝑜 𝑠𝑢𝑏𝑙𝑒𝑡𝑎𝑙 = 𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)−𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)

𝑀𝑒𝑑𝑖𝑎 (𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙)× 100 (2)

Donde,

Los valores negativos se interpretan como tóxicos, valores positivos como estimulación del

crecimiento y 0 como no tóxico.

D. Aislamiento e identificación de bacterias

El aislamiento e identificación se realiza con el fin de identificar microorganismos nativos

presentes en el suelo y posteriormente determinar cuáles son los más idóneos en el proceso de

bioaumentación debido a que no todos tienen la capacidad de degradar el mismo tipo y cantidad de

contaminante.

Se inicia realizando la siembra de bacterias en agar nutritivo. Luego, el aislamiento se hace

mediante repique de las colonias más abundantes. Finalmente, la identificación de bacterias se

realiza mediante pruebas de tinción [50] en donde, según Scanlan, la bacterias Gram positivas son

las resistentes a la decoloración y presentan una tonalidad azul o morada, mientras que las bacterias

Gram negativas son las que no retienen la tinción con cristal violeta presentando una coloración

rosa o roja [51].


Aislamiento e

identificación de

hongos y bacterias

Tomar una muestra

de suelo previamente

tamizada.

Sembrar en agar

nutritivo 0.1 ml de la

última dilución

Incubar por 7

días a 37° C

Repicar la bacteria

aparentemente más

abundante en el medio de

cultivo.

Incubar por 7

días a 37° C

En condiciones de

asepsia, realizar

diluciones

Identificar el tipo de

bacterias mediante el

método de tinción.

Fig. 3. Identificación de microorganismos

Aislamiento e

identificación de

bacterias


E. Técnica de bioaumentación

La bioaumentación se realiza con el fin de aumentar los microorganismos nativos altamente

capacitados para incrementar y mejorar la eficiencia de degradación del contaminante [47].

Técnica de

bioaumentación

Seleccionar

muestras de suelo

Contaminar las muestras con

cipermetrina en las

concentraciones seleccionadas

Adicionar consorcio de

bacterias repicadas del

mismo suelo con

potencial para

biodegradar el pesticida.

Monitoreo de

población bacteriana

autóctona degradadora

del pesticida.

Monitoreo de los

parámetros fisicoquímicos

y biológicos del suelo (pH,

humedad, contenido de

materia orgánica, entre

otros.)

Determinación

porcentaje de

remoción del pesticida.

Medición de variación de la

concentración de los pesticidas

en el suelo durante el proceso de

biorremediación

Fig. 4. Técnica de bioaumentación



biorremediación

Se realiza una comparación entre el antes y después del proceso de biorremediación según los

resultados de las características físico-químicas del suelo.

Biorremediación

Bioaumentación

Seguimiento y

control

Suelo contaminado

(Características físico-

químicas)

Suelo descontaminado

(Características físico-

químicas)

Fig. 5. Evaluación de características después de la biorremediación


VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A. Recolección de la muestra de suelo

La muestra de suelo fue tomada de la Universidad de San Buenaventura ubicada en el barrio

Salento del municipio de Bello, Antioquia. Ésta es una zona cercana a predios y terrenos con

cultivos de baja extensión e intensidad, aproximación a veredas y diferentes cuerpos de agua. Sin

embargo, también existe la presión urbana. La muestra de suelo se toma en este lugar por fácil

acceso, el entorno y por suposición de características que pueden determinarlo como un suelo con

potencial agrícola. La muestra de suelo recolectada inicialmente no presenta características de

contaminación por algún tipo de pesticida, pues el propósito es realizar una contaminación

controlada en el laboratorio con concentraciones previamente establecidas y así tener un mejor

control de las variables. Además, se determinarán las características físico-químicas reales de éste.

B. Características físicas, químicas y biológicas del suelo

Antes de realizar ensayos para identificar las características físico-químicas de la muestra de suelo,

se identifica visualmente la presencia de insectos y macro invertebrados, los cuales pueden ser

bioindicadores de la calidad del suelo debido a que sus funciones y número poblacional son

Tomado de: Imagen satelital de Google Earth Pro

Tomado de: http://datosabiertos.metropol.gov.co/

Fig. 6. Localización del sitio de muestra en el municipio de Bello

http://datosabiertos.metropol.gov.co/


susceptibles a los cambios ambientales y de las condiciones del suelo con respecto a labores como

la labranza, talas y aplicación de fertilizantes y/o pesticidas en la agricultura [52].

1) Contenido de humedad

En la Tabla V. que se encuentra a continuación, se muestran los valores de porcentaje de humedad

de tres diferentes muestras de suelo: suelo fértil, suelo estudio (objeto de análisis) y el suelo estudio

en presencia de microorganismos.

TABLA V. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE HUMEDAD

Muestra Peso inicial (g) Peso final (g) Humedad (%)

Suelo fértil

1 5 3,02 39,52

2 5 2,87 42,66

3 5 3,14 37,25

Promedio 5 3,01 39,81

Suelo estudio*

1 5 4,47 10,61

2 5 4,48 10,42

3 5 4,50 10,09

Promedio 5 4,48 10,37

Suelo estudio*

con microorganismos

1 5 2,68 46,48

2 5 2,78 44,49

3 5 2,84 43,15

Promedio 5 2,76 44,71

* Suelo estudio hace referencia a la muestra de suelo recolectada en la fase inicial y que será el objeto de análisis en

la investigación.

De lo anterior se puede observar que el porcentaje de humedad tanto del suelo fértil como del suelo

estudio es bajo, pues tienen valores inferior al 50%. Mientras que el suelo estudio en presencia de

microorganismos presenta un porcentaje de humedad del 44,71%, dando un indicio de que la

población de microorganismos favorece la humedad y así mismo, las condiciones del suelo.


2) pH

Los valores promedio de pH medidos en agua y en KCl de los tres suelos se pueden detallar en la

Tabla VI.

TABLA VI. DETERMINACIÓN DE pH EN KCl Y AGUA

Muestra pH KCl pH Agua

Suelo fértil

1 6,23 6,62

2 6,02 6,64

3 5,81 6,33

Promedio 6,02 6,53

Suelo estudio

1 5,82 5,86

2 5,75 5,89

3 5,76 5,9

Promedio 5,78 5,88

Suelo estudio

con microorganismos

1 6,13 6,26

2 6,04 6,16

3 6,03 6,04

Promedio 6,07 6,15

Se observa que los valores promedio de pH medidos tanto en agua como en KCL de las tres

muestras de suelo, están dentro del intervalo óptimo recomendado para cultivos agrícolas o muy

próximos a éste [6-7]. Según Hernández, el suelo puede clasificarse como ligeramente ácido, pues

está en un rango de [6,1-6,5] aproximadamente [53].

3) Conductividad

A partir de un pH-metro multiparámetro se mide los valores de conductividad de las 3 muestras de

suelo, los resultados se muestran en la Tabla VII.


TABLA VII. DETERMINACIÓN DE LA CONDUCTIVIDAD

Muestra Conductividad

(dS/m)

Suelo fértil

1 0,242

2 0,242

3 0,267

Promedio 0,253

Suelo estudio

1 0,83

2 0,588

3 0,792

Promedio 0,737

Suelo estudio

con microorganismos

1 0,53

2 0,616

3 0,867

Promedio 0,671

Las tres muestras presentan valores de conductividad inferiores a 1 dS/m, siendo estos valores

fundamentales ya que facilitan la fertilización del suelo y a su vez evita problemas de fitotoxicidad.

Por medio de los datos obtenidos se pueden tomar decisiones sobre el uso del suelo, y se evidencia

que se encuentran dentro de las condiciones óptimas de cultivo.

4) Curva de calibración: Concentración de microorganismos

La concentración de microorganismos se calcula a partir de la escala Mac Farland [54]. Para esto,

se preparan suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón y se inoculan en tubos de ensayo para

luego medir los valores de turbidez. Con los valores obtenidos se realiza una curva de calibración

con la que se cuantifica la densidad óptica representada por el crecimiento microbiano (Figura 6).


Fig. 6. Curva de calibración población de bacterias

La ecuación de la curva calculada es la siguiente:

𝑌 = 4𝑥10−7𝑋 + 10,851 (3)

Donde, Y es la turbidez (NTU) y X son las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/mL).

Luego de aislar las bacterias del suelo de muestra, se hace un recuento poblacional midiendo en

turbidímetro, obteniendo como resultado un valor de 24,6 NTU y que al despejar X y reemplazar

el valor de la turbidez en Y de la ecuación (3) se obtiene una población bacteriana inicial de 34,373

x106 UFC/mL. Esta concentración de microorganismos se utiliza para la inoculación de las

muestras de suelo con diferentes concentraciones de pesticida.

5) Curva de calibración: Concentración del contaminante:

Se preparan 5 concentraciones de pesticida (0,1%; 0,05%; 0,025%; 0,0125%; 0,00625%) a las que

posteriormente se les mide el valor de absorbancia a 300nm y cuyos valores son usados para

realizar una curva de calibración (Figura 7).

y = 4E-07x + 10,851R² = 0,975

0

200

400

600

800

1000

1200

0,00E+00 1,00E+09 2,00E+09 3,00E+09

Turb

idez

(N

TU

)

N° Células

Curva de Calibración: microorganismos


Fig. 7. Curva de calibración concentración de pesticida

A partir de la ecuación de la curva de la Figura 7, se medirá la concentración del pesticida después

de realizar el proceso de biorremediación y así comparar si se logra una reducción de éste luego de

aplicar la técnica.

La ecuación de la cueva es la siguiente:

𝑌 = 20,96𝑋 + 0,0517 (4)

Donde, Y son los valores de absorbancia y X será el valor de la concentración final del pesticida.

C. Ensayo ecotoxicidad del pesticida

Antes de determinar el porcentaje de germinación (aparición visible de la radícula) de las semillas

en las diferentes concentraciones se puede partir de una hipótesis razonable: a mayor concentración

de pesticida, menor será el porcentaje de germinación, es decir, tiene una relación inversamente

proporcional. Los resultados obtenidos se observan a continuación (Tabla VIII).

y = 20,96x + 0,0517R² = 0,9122

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Ab

sorb

anci

a

Concentración pesticida (%)

Curva de Calibración: pesticida


TABLA VIII. DETERMINACIÓN DEL PORCENTAJE DE GERMINACIÓN

Concentración (%) Porcentaje

Blanco 99

0,0625 90

0,125 73

0,25 87

0,5 67

1 78

Teniendo en cuenta la hipótesis planteada anteriormente, se observa que en el 99% de las semillas

sembradas en la muestra Blanco hubo aparición visible de la radícula, pues ésta no contenía

pesticida que pudiera alterar su ciclo de crecimiento mientras que en las demás muestras se

evidencia una disminución en éste porcentaje debido a que en presencia del pesticida, el

crecimiento de Lactuca sativa L. se ve alterado. Sin embargo, los resultados observados tienen una

discrepancia, pues éstos no tienen una disminución constante sino que en algunas de las

concentraciones se aumenta el valor. Lo anterior puede ser ocasionado por cambio en factores

externos como alteración en las condiciones de humedad o temperatura, lo que genera un

porcentaje de error. A pesar de esto, a partir de los resultados obtenidos se puede decir que la

germinación se ve más afectada en cuanto se incrementa la concentración del pesticida.

Mediante la obtención del porcentaje de semillas germinadas con respecto al control negativo

(efecto letal) y de la inhibición en el crecimiento de la raíz (efecto subletal) se determina el nivel

de toxicidad que se tiene en cada una de las concentraciones de pesticida y cómo es la alteración

de éste en las semillas.

En las siguientes Tablas IX y X se muestran los resultados de la relación del porcentaje de semillas

germinadas con respecto al control negativo (efecto letal) y la inhibición en el crecimiento de la

raíz (efecto subletal) respectivamente:


TABLA IX. DETERMINACIÓN EFECTO LETAL


obtenido

Nivel

0,0625 90 Tóxico

0,125 75 Tóxico

0,25 88 Tóxico

0,5 79 Tóxico

1 68 Muy Tóxico

TABLA X. DETERMINACIÓN EFECTO SUBLETAL

Concentración (%) Valor Nivel

0,0625 -24,04 Tóxico

0,125 -30,18 Tóxico

0,25 6,41 Estimulación del crecimiento

0,5 -22,30 Tóxico

1 -20,01 Tóxico

Por lo anterior, se puede deducir que aún en concentraciones muy pequeñas (0,0625%) el pesticida

objeto de estudio tiene efectos sobre el crecimiento de las plántulas, siendo tóxico como se

comprueba en la determinación del efecto letal y subletal. Es por esto que se selecciona la

concentración de 0,0625% como valor máximo para realizar la prueba de ecotoxicidad, en donde

se toman 2 valores por debajo de la concentración mínima en la que se evidencia efectos en la

germinación (0,04 y 0,02%), se hace nuevamente el procedimiento pero esta vez en 30g de suelo

para cada concentración seleccionada. Finalmente, se obtuvieron los resultados expuestos en las

tablas XI, XII y XIII.


TABLA XI. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN EN SUELO CON PESTICIDA


Blanco 90

0,02 60

0,04 13

0,06 53

TABLA XII. EFECTO LETAL EN SUELO CON PESTICIDA

Concentración (%) Porcentaje obtenido Nivel

0,02 67 Muy tóxico

0,04 15 Muy tóxico

0,06 59 Muy tóxico

TABLA XIII. EFECTO SUBLETAL EN SUELO CON PESTICIDA


0,02 -12,58 Tóxico

0,04 -37,74 Tóxico

0,06 -18,63 Tóxico

Comparando el resultado de este ensayo con el de la ecotoxicidad realizada con las semillas

expuestas solamente al pesticida (sin suelo), se observa que cuando las semillas se encuentran en

suelo contaminado, éste tiene efectos más tóxicos que si se exponen directamente al contaminante.

En la muestra blanco de ambos ensayos el porcentaje de germinación fue del 90%. Sin embargo,

al sembrar las semillas en el suelo contaminado, el efecto letal pasa de ser tóxico a muy tóxico. Lo

anterior es debido a que al sembrar las semillas en el suelo contaminado, hay más variables que

pueden afectar la germinación y crecimiento como el pH, conductividad, entre otros.


D. Identificación de bacterias

Luego de realizar el aislamiento de las bacterias presentes en el suelo, se realizan pruebas

morfológicas y químicas como la tinción de Gram para su identificación, obteniendo el siguiente

resultado:

Fig. 8. Observación de bacterias a 100x (Tinción de Gram)

En la figura 8 se observa que la bacteria aislada se tiñó de color violeta, indicando que el tipo de

bacterias obtenidas son Gram positivas. Estas bacterias están constituidas por una capa gruesa de

peptidoglicano y se cree que esta capa es la encargada de que las bacterias retengan el cristal violeta

de la coloración de Gram [51].

De lo anterior, también se puede evidenciar que las bacterias obtenidas son tipo Bacilos, los cuales

tienen la capacidad de resistir en un entorno hostil por medio de una endospora, siendo una

estructura muy resistente a los agentes fisicoquímicos como a la esterilización y desinfección [55].

E. Técnica de bioaumentación

Se realiza la inoculación de muestras de suelo (estudio y fértil) con 3,9mL de solución de bacterias

con la población anteriormente determinada en cada muestra con el fin de obtener un aumento de

la población bacteriana y de este modo formar diferentes concentraciones de suelo para evaluar

cómo ese aumento en la población de bacterias se ve afectado en presencia del pesticida

cipermetrina en concentración de 0,0625%.


El resultado de la medición en el turbidímetro después de 7 días de la inoculación de las muestras

de suelo es de 28,3 NTU.

Al despejar la X de la ecuación (3) y reemplazando el valor de la turbidez en la Y de esta ecuación,

se obtiene una población bacteriana de 43,6225 x106 UFC/mL.

La comparación de los números poblacionales inicial y final se ven a continuación en la Tabla XIV.

TABLA XIV. AUMENTO POBLACIONAL DE BACTERIAS

Inicial (UFC/mL) Bioaumentación(UFC/mL) Relación

34,373 x106 43,6225 x106 27%

Comparando el resultado obtenido inicialmente en la caracterización del suelo con la medición

luego de la inoculación, se evidencia un aumento de 27 % en la población de bacterias, es decir, se

tienen resultados positivos en el ensayo.


biorremediación

Luego de realizar la bioaumentación de la población de bacterias y llevar a cabo el ensayo de

biorremediación, se determina nuevamente las condiciones físicas, químicas y biológicas para

comparar con las condiciones iniciales y determinar la efectividad del ensayo.

1) pH

Los valores promedio de pH medido en agua de las muestras de suelo fértil y suelo estudio en

diferentes concentraciones se pueden detallar en la Tabla VI.


TABLA XV. DETERMINACIÓN DE pH DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN

Muestra pH Agua

Suelo fértil

Blanco g

Control 8

10% 8,8

50% 8

90% 7,9

Suelo estudio

Blanco 6,5

Control 6,6

10% 7,2

50% 6,9

90% 6,7

Analizando los resultados, se identifica que en el suelo fértil la alteración del pH es mayor que en

el suelo estudio, alejándose del rango óptimo para suelos agrícolas ([6-7]). Mientras que, para el

suelo estudio, el rango de pH óptimo se garantiza en concentraciones de suelo del 50 y 90%.

2) Porcentaje de germinación y efectos letal y subletal

Para el análisis del porcentaje de germinación de las semillas luego de realizar el proceso de

biorremediación, también se tiene presente la hipótesis planteada en el ensayo de ecotoxicidad del

pesticida: a mayor concentración de pesticida, menor será el porcentaje de germinación. En la Tabla

XV se muestra cómo esta hipótesis se cumple nuevamente.

TABLA XVI. PORCENTAJE DE GERMINACIÓN DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN

Concentración suelo inoculado

(%)

Porcentaje

Blanco 90

90 77

50 57

10 23

Se evidencia que a mayor concentración de suelo inoculado, mayor es el porcentaje de

germinación, es decir, tienen una relación directamente proporcional. Pues, para una concentración


de suelo inoculado al 90%, se obtuvo un porcentaje de germinación superior al 50% debido a que

en este suelo hay mayor concentración de bacterias autóctonas que benefician el crecimiento de las

plántulas.

Los resultados del efecto letal y subletal medido después de la biorremediación se pueden visualizar

en las Tablas XVI y XVII, a continuación:

TABLA XVII. EFECTO LETAL DESPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN

Concentración (%) Porcentaje obtenido Nivel

90 86 Tóxico

50 63 Muy tóxico

10 26 Muy tóxico

TABLA XVIII. EFECTO SUBLETAL DEPUÉS DE LA BIORREMEDIACIÓN


90 4,78 Estimulación del

crecimiento


crecimiento


crecimiento

Teniendo en cuenta que la muestra de suelo sin inocular y contaminada con pesticida al 0,0625%,

tiene un porcentaje de 53% de germinación de las semillas y luego de realizar el ensayo de

biorremediación, este porcentaje de germinación lo supera, como es de esperar, la siembra

realizada en el suelo inoculado en concentración de 90% y en menos medida en el suelo inoculado

en concentración de 50%. Además se observa cómo en la tercera muestra, el porcentaje de

germinación fue incluso, menor a la germinación obtenida en el ensayo de ecotoxicidad realizado

con el suelo sin inocular.

De la misma manera, a partir de las anteriores tablas se puede identificar cómo el efecto de

inhibición de la elongación de la raíz se reduce luego de la biorremediación, pasando de niveles

tóxicos a tener efectos de estimulación de crecimiento.


3) Población final de microorganismos

Tomando la ecuación de la curva de calibración de la figura 6, se calcula la población final de

microorganismos, obteniendo los siguientes resultados (Tabla XIX).

TABLA XIX. POBLACIÓN FINAL DE MICROORGANISMOS EN SUELO FÉRTIL

Concentración suelo

fértil (%)

UFC/mL

Relación con respecto a

la población luego de

bioaumentación*

90 170 x106 290%

50 51,14 x106 17%

10 49,9 x106 14%

* La población obtenida en el proceso de bioaumentación es de 43,6225 x106 (UFC/mL)

TABLA XX. POBLACIÓN FINAL DE MICROORGANISMOS EN SUELO ESTUDIO


estudio (%)

UFC/mL


la población luego de

bioaumentación*

90 85,4 x106 96%

50 41 x106 -5,9%

10 29,3 x106 -32%

En las tablas anteriores (XIX y XX) se evidencia que el suelo fértil tuvo un aumento en la población

bacteriana hasta del 290%, debido a que éste suelo tiene una alta cantidad de nutrientes y materia

orgánica y que al adicionar concentración de bacterias, la población final crece de forma acelerada.

En cuanto a los resultados obtenidos para el suelo estudio, se observa que el efecto tóxico del

pesticida persiste, pues hay reducción en la población de microorganismos para las muestras en

concentraciones de 50 y 10% de suelo inoculado. Sin embargo, la población bacteriana es efectiva

en el proceso de biorremediación, obteniendo porcentajes significativos de remoción (ver Tabla

XXI).


G. Concentración final de pesticida

Se toma la ecuación de la curva de calibración realizada en la fase inicial (figura 7) para determinar

la concentración final de pesticida. Los valores de efectividad del proceso de biorremediación se

muestran a continuación en la tabla XXI.

TABLA XXI. CONCENTRACIÓN FINAL DE PESTICIDA


estudio (%)

Concentración final

de pesticida (%)


la concentración inicial

de pesticida*

90 0,018 71%

50 0,023 64%

10 0,037 41%

* La concentración inicial de pesticida es de 0,0625%

Mediante el cálculo de la relación entre la concentración inicial de pesticida y la concentración

final después de realizar el ensayo, se determina que hubo buena remoción del contaminante, pues

el porcentaje de reducción es significativo. Por lo tanto, se confirma la efectividad que tiene este

procedimiento al momento de emplear bacterias como agentes degradadores de pesticidas y

mejorar las condiciones y características de los suelos contaminados.


IX. CONCLUSIONES

Según el ensayo de ecotoxicidad realizado, se puede afirmar que el suelo seleccionado

presenta buenas condiciones que favorecen la germinación y crecimiento de las plántulas

de Lactuca sativa L., pues se obtuvieron porcentajes de germinación superiores a 67%, aun

estando en presencia de pesticida. Sin embargo, a pesar de tener valores altos de

germinación, se evidencia malformaciones y exaltación en la relación entre el crecimiento

de la radícula y/o el hipocótilo, confirmando el nivel tóxico del pesticida.

Evaluando las características físicas, químicas y biológicas del suelo objeto de estudio, se

evidencia que éste presenta condiciones adecuadas para ser un suelo de uso potencial para

actividades agrícolas.

En el proceso de bioaumentación se logra un incremento de la población bacteriana. Sin

embargo, la población obtenida es efectiva en mayor medida cuando se tiene una muestra

con concentración de suelo inoculado del 90% y 10% de suelo contaminado.

Finalmente, se concluye que el proceso de biorremediación, usando la técnica de

bioaumentación de bacterias autóctonas tiene resultados positivos. Sin embargo, es

importante tener en cuenta la proporción entre el suelo contaminado y el suelo inoculado,

la población y tipo de bacterias presentes en el suelo y las características físicas y químicas

que garanticen óptimas condiciones en el suelo para la buena germinación y crecimiento de

las plántulas.


X. RECOMENDACIONES

Para hacer un acercamiento más aproximado del potencial de biorremediación, se

recomienda la medición de las características físicas y químicas no sólo al inicio y al final

del ensayo, sino también en el proceso de bioaumentación de la población bacteriana y así

tener más fuentes de información para confirmar la efectividad del tratamiento.

En próximas investigaciones realizar una identificación más detallada del tipo de bacterias

presente en el suelo contaminado a tratar y además, la identificación de otros

microorganismos que aporten en el proceso de degradación del pesticida. Además,

Determinar tipo de metabolitos luego de la biorremediación para determinar si hubo

degradación o no.

Si se realizan estudios posteriores, llevar a cabo el ensayo con otro tipo de pesticidas para

comparar la efectividad al modificar las características del contaminante.

Analizar alternativas y métodos para garantizar condiciones y factores ambientales óptimos

durante los procedimientos para la obtención de resultados más asertivos.


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