Bioprozesstechnik 2 - Biotechnologie am Beispiel ausgewählter Prozesse mit industriellem Potenzial

Trends und Techniken moderner Biotechnologie im Labor- und Prozessmaßstab einschließlich der Aufarbeitung

• Ethanol• Aminosäuren• Sekundärmetabolite

- Antibiotika• Rekombinante

(therapeutische) Proteine

• Glykobiotechnologie• Tierische Zellkultur

und Bioreaktoren-Antikörper

• Mikro- und High-Throughput Prozesstechnologien

Literaturangaben

Doran P. M. (1995) Bioprocess Engineering Principles, Academic Press

Blanch H.W. and Douglas S. Clark (1996) Biochemical Engineering,

Marcel Dekker, New York

Rehm H.-J. and Reed G. (1996) Biotechnology 2nd edition, VCH

Weiterführende Bücher

Belter P. A. et al. (1988) Bioseparations, J. Wiley

Garcia A.A. et al. (1999) Bioseparation Process Science, Blackwell

Science

Subramanian G., Editor (1998) Bioseparation and Bioprocessing Vols. I

and II, VCH

Bailey J. E. and Ollis D. F. (1986) Biochemical Engineering

Fundamentals, 2nd edition, McGraw-Hill

Godfrey T. and West S., Editors (1996) Industrial Enzymology, Stockton

Press

Buchholz K. and Kasche V. (1997) Biokatalysatoren und Enzymtechno-

logie, VCH

Bioprozesstechnik und Aufarbeitung hängen stark vom Volumen, Preis und der Anwendungssparte des biotechnologi-schen Produktes ab.

Abbildung: Preise (links) sowie Marktvolumina (rechts) von typischen Produkten aus biotechnologischen Prozessen.

Abbildung: Aufstellung der industriellen Arbeitsbereiche, die zu den Produktionskosten eines biotechnologischen Produktes signifikant beitragen.

Abbildung: Prozessoptimierung muss immer eine Kostenanalyse des gesamten Prozesses beinhalten. Verbesserungen sollten vor allem den oder die kostenbestimmenden Schritte betreffen. Versuchen Sie Beispiele für die einzelnen Blöcke zu finden.

Abbildung: Korrelation zwischen Produktkonzentration im Bioreaktor vor der Aufarbeitung und Produktpreis. Häufig besteht hier ein inverser Zusammenhang, der jedoch nicht als allgemeingültig betrachtet werden darf. Der Produktpreis ist natürlich von zusätzlichen Faktoren abhängig, zum Beispiel, wie viele Firmen stellen das Produkt her.

Abbildung: Biotechnologische Prozesse unterscheiden sich stark hinsichtlich des Prozessmaßstabes und der Produktkonzentration im Bioreaktor. Die Multiplikation von Bioreaktorarbeitsvolumen (oder volumetrischer Produktionsrate) und Produktkonzentration ergibt die Produktionsrate. Die Prozessökonomie hängt allgemein vom Produktpreis und der Produktionsrate ab. Prozesse im kleineren Maßstab eignen sich daher eher für Produkte mit hohem Wert und hoher Wertschöpfung.

Abbildung: Biotechnologische Produkte unterscheiden sich in ihren Eigenschaften, und diese Unterschiede können für die Aufarbeitung genutzt werden: Größe (siehe Abbildung); elektrostatische Ladung; Hydrophobizität; Löslichkeit; bestimmte chemische Gruppen bzw. charakteristische Anordnung chemischer Gruppen.

Abbildung. Zusammenfassung von Aufarbeitungstechniken gruppiert nach Größe der zu reinigenden Komponente und treibender Kraft in der Separation.

Abbildung. Typen von Membranen für die Filtration von Proteinen und niedermolekularen Substanzen. Wichtig ist ein gute Trennschärfe der Membran. Folgende Parameter charakterisieren die Membranfiltration, wobei C die Konzentra-tionen (z.B. des zu isolierenden Proteins) sind:Selektivität S = CPermeat / CFiltrat

Rückhaltung R = 1 - S

Abbildung. Querstrom- oder Tangentialflussfiltra-tion; Darstellung von Konzentrationspolari-sation (oben) sowie Gelpolarisation (unten).

Abbildung. Prinzip der Elektrodialyse zur Aufarbeitung von geladenen (zumeist niedermolekularen) Verbindungen. Das Verfahren ist geeignet, Salze entweder anzureichern (Konzentrat) oder abzureichern (Diluat). Kationenaustauschermembranen sind unlösliche Polyanionen; Anioneaustauschermembranen sind unlösliche Polykationen.

Ethanol

Mengenmäßig das wichtigste biotechnologische Produkt ( 30 x 109 L/a; 1996) - seit mehr als 3000 Jahren

Rohstoff für die chemische Industrie, Treibstoff für Motoren, alkoholische Getränke

Ethanolproduzenten: Brasilien (≈ 45%), U.S.A (≈ 15%)

Andere Produkte: Zitronensäure (4.5 x 105 t/a), Bäckerhefe (3 x 105 t/a), Glutaminsäure (2.7 x 105 t/a), Antibiotika (3 x 104 t/a), Biopolymere (1 x 104 t/a)

Geschätztes Marktvolumen aller Biotech-Produkte ≤ 100 x 109 US $/a

Ethanol steht in Konkurrenz zu anderen petrochemischen Produkten - Konkurrenzsituation vom Ölpreis abhängig

Preis 0.35 US $/L in Europa, vergleichbar mit Methyl-tert-butylether oder tert-Butylalkohol

Produktionskosten (basierend auf 30 000 m3 Jahres-kapazität): 0.15 US $/L, davon Chemikalien (≈ 6%), Energie (≈ 50%), Personal (≈ 16%), Anlagekosten (≈ 22%)

Glucose (C6H12O6) 2 Ethanol (C2H5OH) + 2 CO2

Theoretisch, berücksichtigend Verluste durch Wärme- und Nebenproduktbildung: 0.61 L Ethanol aus 1 kg Glucose

Bei 94% Effizienz einer Produktionsanlage - 1.75 kg Zucker pro L Ethanol

Break-even Preis (BESP) für den Rohstoff (Zucker, C-Quelle) ergibt sich aus dem Quotienten von:

(Verkaufspreis - Herstellungspreis)/benötigte Menge

BESP = (0.35 $ - 0.15 $)/ 1.75 kg = 0.11 US $/kg

Mögliche Rohstoffe– Melassen (als Nebenprodukt der Zuckerrüben- und

Zuckerrohrverarbeitung; Milchzuckermelasse; Kornmelasse)– Stärke und ihre Hydrolysate– Saccharose– Lactose– Öle und Fette, n-Alkane, Molke, diverse Ablaugen aus der

Papier- und Zellstofftechnologie

Lokale Verfügbarkeit der Rohstoffe ist ein wichtiges Selektionskriterium (z.B. Lactose)

Alternative Rohstoffe - Abfallprodukte aus Land- und Forstwirtschaft / Lignocellulose

Abbildung: Enzymatische Konversion von Stärke mit dem (teilweisen) Ziel der Aufbereitung des Substrates Glucose für Bioprozesse. Die Konversion von Stärke ist ein Musterbeispiel für den erfolgreichen großtechnischen Einsatz von Enzymen.Die 1,4-glykosidische Hauptkette wird durch Amylasen statistisch gespalten, wodurch die Löslichkeit des Polysaccharids erhöht wird. Weitere Enzyme bewerkstelligen den Abbau von 1,6 Bindungen oder spalten Maltoseeinheiten von der Kette. DE, Dextrinäquivalent bezogen auf reine Glucose (100%)

‘

Melasse ist ein Restprodukt der Herstellung von Rohr- oder Rübenzucker und stellt ein hervorragendes Substrat für mikrobielle Prozesse (z.B. Hefe) dar.

Abbildung: Schematische Darstellung des Aufarbeitungsprozesses von Zuckerrüben oder Zuckerrohr zur Herstellung von Saccharose.Die Saccharose ist ein sehr stabiles, nicht-reduzierendes Disaccharid (-D-Glucopyranosyl--D-Fructofuranosid), welches bei Hitzebehandlung keine Bräunungsreak-tionen eingeht. Mikroorganismen, die die Saccharose als C-Quelle verwerten, hydrolysieren die glykosidische Bindung des Disaccharids durch Invertasen. Die Aufbereitung der Saccharose durch enzymatische Spaltung mit isolierter Invertase wurde versucht, ist aber zumeist zu teuer. Melasse, als Mutterlauge der Kristallisation von Saccharose, eignet sich gut und ist billig.

‘

Melassenzusammensetzung (aus Zuckerrüben)• Trockensubstanz ≈ 80%• Saccharose 60%• N-Komponenten 20%

freie Aminosäuren Pyrrolidoncarbonsäuren

• Wachstumsfaktoren (mg/kg) Biotin (0.1), Folsäure (0.2) Vitamin B Komplex (B1: 1; B2: 0.4; B6: 5) Nikotin/Pantothensäure (40 - 50 / 60 - 100) Inositol (6000)

Medienzusatz für die Hefeproduktion (Biotin / Inositol in g/t)•bei Melasse; 0.26 / kein Zusatz; bei Glucosesirup: 0.40 / 800•Zusätze machen bis zu 20% der Substratkosten aus

Vorbehandlung zur Eliminierung von Inhibitoren (Pyrazole, Phenole etc.) - Koagulation/Flockulierung/Dekantierung oder Zentrifugation

Melasse ist ein relativ hochwertiges komplexes Substrat!

Lignocellulose / Biomasse als Substrat für die Produktion von Ethanol

•Abfallstoffe aus Land-und Forstwirtschaft (Stroh, Mais-stängel, Holzschnitzel, usw.); städtischer und industriellerAbfall (z.B. Zeitungspapier, u.ä.)

•Etwa 75 % Kohlenhydratpolymere (Cellulose, Hemicellu-lose) und ≈ 25% Lignin (aromatische Grundstruktur, Etherbindungen) (siehe Abbildung hinten)

•Cellulose - lineares Homopolysaccharid mit einem Polyme-risationsgrad von etwa 5000; -1,4 verknüpfte D-Glucose-Einheiten; kristalline, fibrilläre Struktur, die gegen Abbau sehr resistent ist.

•Die Hydrolyse von Cellulose in Glucose erfolgt in der Naturdurch extrazelluäre Cellulasen (Endoglucanasen, Cellobio-hydrolasen, und -Glucosidasen)

Abbildung: Schematischer Aufbau von Lignocellulose aus pflanzlicher Biomasse (links) sowie chemische Struktur von Lignin als Bestandteil von Lignocellulose. Dargestellt sind die Fasern von Cellulose, die den Kern der Struktur bilden, sowie Xylan (Hemicellulose, präzipitiertes Xylan) und Lignin, welche die Fasern gleichsam vernetzen. Der Biosyntheseprozess, welcher zur komplexen Struktur von Lignocellulose führt, ist nicht in allen Einzelheiten geklärt. Das Produkt ist jedoch mechanisch sehr stabil und chemisch äußerst resistent. Vor allem Lignin wird in der Natur nur sehr langsam (vor allem durch Pilze) abgebaut, wobei radikalische Prozesse beteiligt sein dürften. Die Polysaccharide Cellulose und Hemicellulose werden hydrolytisch gespalten.

A

B

Abbildung: Bakterien bewerkstelligen den Abbau von Cellulose durch ein sogenanntes Cellulosom, ein Multiproteinkomplex, in dem enzymatisch aktive Proteine an Strukturproteine gebunden sind. Der gesamte Komplex ist in der Zellwand von (zumeist anaeroben) Eubakterien wie Clostridien oder ruminalen Bakterien verankert und erlaubt, dass sich die ganze Zelle an das unlösliche Cellulose-Substrat anheftet. Die bakteriellen Enzyme eignen sich weniger für eine Hydrolyse von Cellulose, ermöglichen aber teilweise die direkte Konversion von Cellulose in biotechnologische Wertstoffe. Überlegen Sie, welche das sein könnten!

•Die Struktur von Xylan ist sehr heterogen und eine Reihevon individuellen Enzymaktivitäten ist für den vollstän-digen Abbau nötig - Endoxylanase, Acetylxylanesterase,-Xylosidase, L-Arabinofuranosidase, ...

• Lignin ist ein phenolisches Polymer, an dessen AbbauOxidoreduktasen beteiligt sind (Oxidasen, Peroxidasen sowie Enzyme, welche reversible Polymersierungsreaktionen katalysieren). Man postuliert einen Radikalmechanismus, ist aber derzeit nicht in der Lage, Lignin kontrolliert in vitro abzubauen.

• Für biotechnologische Zwecke sollte Lignocellulose möglichst rasch und in hohen Ausbeuten in lösliche Zucker, idealerweise Monosaccharide abgebaut werden.

• Die Grundstruktur von Lignocellulose bedingt, dass der Angriff durch Enzyme oder Mikroorganismen nur erschwert möglich ist.

• Die Verzuckerung von pflanzlichen Rohstoffen erfordert daher in aller Regel eine mechanische (Mahlen), chemische (verdünnte Säure; 1% H2SO4) oder thermische (Dampf; Dampfexplosion) Vorbehandlung, um (1) die Struktur aufzulockern und Lignin abzutrennen, (2) Hemicellulosen ganz oder partiell abzubauen; und (3) die Cellulosefasern aufzuweichen, um sie für die enzymatische Hydrolyse besser verfügbar zu machen.

•Ein weiterer Aspekt betrifft die Enzymkosten und eine allfällige Rückgewinnung der Cellulasen.

Kinetics of enzymatic cellulose degradation

• Several features are clearly different from steady state enzyme kinetics in homogeneous solution:– the substrate is insoluble, and – to be active, the enzyme must adsorb to the surface of the substrate.

Kinetically, this implies:

Michaelis - Menten kinetics for homogeneous solutions v = Vmax [S] / (Km + [S]), where [S] is the substrate concentration.

Vmax = kcat [Etot]

Modified enzyme kinetics for conversion of cellulosev = kcat [Eads], where is the adsorbed enzyme concentration.

[Eads] = [Etot] [S] / (Kads + [S]), if the concentration of binding sites [S] is

varied, and[Eads] = [S] [E] / (K’ads + [E]), if the free enzyme concentration is varied at a

fixed concentration of binding sites.Questions: What is the meaning of v, Vmax, kcat, and Km? What are the physical dimensions of the kinetic parameters? How are they determined?

Kinetics of enzymatic cellulose degradation

Enzyme concentration

Arbitrary rate

homogeneous case

heterogeneous case with enzyme adsorption

Conclusions for cellulose conversion • The ratio of enzyme and substrate concentrations is a relevant parameter

to optimize the conversion.• Efficient utilization of enzyme activity added to a given substrate

concentration must consider the saturation behaviour described by curve A. • The substrate not just the enzyme is a target to improve the efficiency of

cellulose hydrolysis.

A

B

Questions: How could the “cellulase” and it substrate be improved to be more “active”?

Biotechnological applications of the cellulose-binding domain in a fusion protein approach

Levy I. & Soseyov O. (2002) Biotechnol.Adv. 20, 191

Question: What other protein fusions providing extra affinity do you know of?

Kommerzielle Cellulasen • Quellen: Trichoderma reesei; Aspergillus niger; teilweise

rekombinant, wobei die heterologe Genexpression wieder in Pilzen

durchgeführt wird, weil Bakterien sich als Wirte nicht eignen.

• Zusammensetzung: Gemisch individueller Aktivitäten; keine

Reinenzyme; stabilisierende Zusätze (Lactose, Salze, Glycerin);

meist Lösungen, eventuell sprühgetrocknete Präparationen

• Anwendungen: Hydrolyse von Rohstoffen für die Herstellung von

Bioethanol; Detergenzien und Pulver für Geschirrspüler;

Oberflächenbehandlung von Textilien; Futtermittelzusatz für die

verbesserte Verwertung von Rohstoffen durch Nutztiere.

• Hersteller: Novo Industries (Dänemark); Genencor (U.S.A.);

Enzymproduktion direkt vor Ort.

Abbildung: Schematische Darstellung der Herstellung von Cellulasen (oberes Bild) sowie Einsatz der Enzyme zur Hydrolyse von cellulosehälti-gem Material, in diesem Fall Altpapier. Die Enzymproduktion erfolgt durch mikrobielle Biotechnologie und in Form extrazellulärer Proteine. Die Aufarbeitung erfordert daher lediglich Abtrennung des Pilzmycels gefolgt von einer Konzentrierung durch Ultrafiltration. Für die Hydrolyse wird Papier zerkleinert und einem Bioreaktor zudosiert. Die Konversion erfolgt typischerweise in 10 - 24 Stunden. Überlegen Sie, wie Enzym

wiederverwendet werden könnte.

Produktion von Ethanol durch mikrobielle Fermentation

• Hefen (Saccharomyces sp.) werden als Produktionsorganismen bevorzugt. Für Hefe spricht die hohe Rate der Verwertung von Hexosezuckern sowie die hohe Ethanoltoleranz und die geringe Sensitivität gegen Inhibitoren. Überlegen Sie, welche Inhibitoren das sein könnten.

Abbildung: Metabolis-mus von Hefe unter aeroben und anaeroben Bedingungen. Überlegen Sie, wie die Bilanz für zelluläre Energiepools (ATP) sowie Redoxkofak-toren (NADH, NADPH) unter Fermentationsbedingungen ausfällt und welche Probleme daraus resultieren können. Was sind Nebenprodukte der alkoholischen Gärung?

Abbildung: Bakterielle Produzenten von Ethanol als mögliche Alternative zu Hefe.Das Gram-positive Bakterium Zymomonas mobilis ist einer der interessantesten Organismen und zeichnet sich durch hervorragende Ethanoltoleranz aus, was durch die spezielle Zusammensetzung der Lipide seiner Zellmembran erklärt werden kann. Thermophile Organismen haben Potenzial für die Anwendung in der Ethanolproduktion. Überlegen Sie, welche Vorteile eine hohe Wachstumstemperatur mit sich bringt (Sauerstoff; Sterilität; Substrat; Aufarbeitung)

Diskontinuierliche Produktion (Batchtechnologie)

Abbildung: Charakterisierung des mikrobiellen Wachstums anhand einer Darstellung des Zeitverlaufs (oben) sowie der spezifischen Wachstumsraten in den einzelnen Phasen (unten).

Wiederholen Sie die Grundbegriffe der Monod Kinetik für ein oder mehrfache Substratlimitierung. Überlegen Sie, wie die Lag-Phase und die Absterbephase in die formalkinetische Beschreibung des Wachstums inkludiert werden kann.Was sind typische Werte für die maximale Wachstumsrate von Hefen und Bakterien, und in welchem Größenordnungsbereich liegen die Monod Konstanten?Wie lässt sich aus dem Wert der Wachstumsrate die Verdopplungszeit eines Organismus berechnen?Wie lässt sich die Zeitdauer des Batches berechnen, wenn Sie die Anfangs- und Endkonzentration an Biomasse vorgeben?

Abbildung: Konzept der metabolischen Ertragskoeffizienten für mikrobielle Prozesse.Basierend auf einer Elementaranalyse der mikrobiellen Zelle kann eine allgemeine Formel für Biomasse abgeleitet werden, welche häufig entspricht:CH1.8 O0.5 N0.2.

Das mittlere Molekulargewicht der Zelle ist daher etwa 24.6.

Wiederholen Sie, was Sie über Massenbilanzen in biotechnologischen Prozessen gehört haben.Wiederholen Sie Begriffe wie maximale Produktausbeute (auf Basis einer stöchiometrischen Gleichung) sowie

theoretischer Sauerstoffbedarf.

• Diskontinuierlicher Ethanolprozess (36-48 h, 10-30 °C, pH 4.5; 10 bis 16 % w/v Produkt)

+ einfache Prozeßführung- geringe Produktivität (Recycle jedes Batches dauert lange!!)ttotal = tbatch + tdown

tdown = tharvest + tpreparation + tlag preparation = Reinigung, Sterilisation, ...

Abbildung: Vergleich zweier mikrobieller Ethanolproduzenten am Beispiel charakteristischer Parameter, die den Prozess beschreiben.

Prozessverbesserungen

Abbildung: Zweistufiges Verfahren zur Herstellung von Ethanol aus Melasse mit integrierter Zellrückführung.Melasse wird für die Fermentation aufbereitet (Fällung von Inhibitoren) und in den ersten Bioreaktor gepumpt. Die Restkonzentration im 1. Reaktor ist etwa 10-fach der im 2. Reaktor. Die Zellkonzentration ist in beiden Reaktoren etwa gleich.

Prozessverbesserungen

Kinetische Überlegung für den 2-Stufenprozess• Im Steady State gilt die Beziehung: µ = D wobei D die Verdünnungsrate

(mit der Dimension einer reziproken Zeit ) darstellt. D leitet sich für

konstantes Reaktorvolumen aus dem Verhältnis von Flussrate F und

Volumen V ab. • Wenn die Biomassekonzentration in beiden Reaktoren gleich ist, aber

gilt, dass µ1 > µ2, so muss das Volumen des 2. Reaktors größer gewählt, da

bei konstanter Flussrate D2 < D1, wenn V2 > V1.

• Grundsätzlich gilt, dass die Produktivität (g Produkt pro Liter Volumen

und Reaktionsstunde) in 2-stufigen Prozessen immer größer ist als in 1-

stufigen Verfahren. Auch das benötigte Gesamtvolumen ist im 2-stufigen

Prozess immer kleiner. In anderen Worten, die Konversion des Substrates

ist bei gleicher Gesamtreaktionsdauer in 2 Stufen immer höher als in nur 1

Stufe.

Prozessverbesserungen

Abbildung: Darstellung einer Umsetzung in 2 konsekutiven Rührkessel-reaktoren. In unserer Betrachtung ist der zusätzliche Zufluss im 2. Reaktor nicht relevant. In manchen Prozessen werden aber im 2. Reaktor neue Substrate (oder ähnliches) zudosiert, sodass F2o > 0.

Prozessverbesserungen

Abbildung: Darstellung einer Bioreaktion mit Zellrückführung ( < 1). Die Rezyklierung kann durch teilweise Rückführung des Volumensstromes mit oder ohne Anreicherung der Zellen ( > 1) durch Filtration oder durch Zentrifugalkräfte (Zyklon, etc.) erfolgen.

Kontinuierliche Prozesse mit Zellrück-führung erlauben höhrere Flussraten und schaffen damit höhere Produktivitäten. Die kritische Verdünnungsrate im Falle des Recycle-Reaktors ist gegenüber dem konventionellen kontinuierlichen Rührkessel um den Faktor1 / (1 + - )erhöht, wobei gilt: = Fr /F und = Xr/X.Index r steht für Rücklauf.

Prozessverbesserungen

Abbildung: Graphischer Vergleich eines konventionellen Chemostats mit einem kontinuierlichen Rührkesselreaktor mit Zellrückführung. Die Daten zeigen, dass sowohl die kritische Verdünnungsrate als auch die Produktivität durch Zellrückführung markant gesteigert werden kann.

Die Abbildung zeigt die typische Analyse von kontinuierlichen Reaktoren als Funktion der Verdünnungsrate. Oberhalb der kritischen Verdünnungsrate Dcrit

kann kein Fließgleichgewicht mehr erreicht werden und die Zellkonzentration geht zurück (“Auswaschbedingungen”). Die Produktivität Qx nimmt

steigendem D bis zu Dcrit zu.

Prozessverbesserungen

• Einsatz von immobilisierten Zellen• Einkapselung in Kügelchen aus Calcium Alginat, oder durch Bindung an

makroporöse Träger aus Glas oder Kunststoff• Spherische Partikel werden durch die Rührung in Suspension gehalten. • Annahme: Die Konzentration der immobilisierten Zellen im Bioreaktor

(Xim) bleibt konstant und die durch Wachstum gebildeten neuen Zellen

werden ins Medium abgegeben und auch ausgewaschen.

• Die Massenbilanz ergibt:

- FX + µXV + µXimV = 0

D = µ (1 + Xim/X)

• Bei Verwendung von immobilisierten Zellen kann der Chemostat unter

Bedingungen von D > µ betrieben werden!!

Prozessverbesserungen

Abbildung: Theoretischer Vergleich von Chemostaten mit und ohne Verwendung von immobilisierten Zellen. Der Parameter T stellt einen

Effektivitätsfaktor dar, welcher im Regelfall zwischen 0 und 1 liegt. Der Index T steht für Transport. T berücksichtigt, dass

immobilisierte Zellen weniger aktiv sein können als Zellen in Suspension, deshalb weil der physikalische Transport von und zur gebundenen / eingekapselten Zelle langsam sein kann.

Prozessverbesserungen

Abbildung: Produktivitätsvergleich für 3 Verfahren zur Herstellung von Ethanol. Der größere operative Aufwand für die Durchführung der kontinuierlichen Fermentation führt dazu, dass trotz der theoretischen Vorteile häufig mit einfacher Batchtechnologie gearbeitet wird.

Die zusätzlichen Kosten für die Immobilisierung der Zellen waren im Fall der Ethanolfermentation prohibitiv. Die Vorteile bezogen auf die Produktivität sind jedoch eindeutig.

Fermentation von Pentosezuckern

• Gesamtpotential für U.S.A. - 2.45 Milliarden Tonnen Biomasse könnten zu 270 Milliarden Gallonen an Ethanol umgesetzt werden (ungefähr 200% des derzeitigen U.S. Bedarfs). Aristidou & Penttilä (2000) Curr Opin Biotechnol 11, 187-198

• Pentoseverwertung ist für die Konversion von Lignocellulose ökonomisch sehr wichtig - der Zuckerpreis für die Ethanolproduktion muss jedoch im Bereich von 0.1 $/kg liegen.

• Typische Rohstoffe (Weizenstroh, Weich- und Hartholz, Abfälle aus der Baumwollherstellung etc.) enthalten bis zu 30 Gewichtsprozent Pentosen (D-Xylose, L-Arabinose).

• Saccharomyces cerevisiae kann Xylose nicht verwerten.

• Anforderung an den Mikroorganismus - hohe Ausbeute und Produktivität,breite Substratspezifität, hohe Ethanoltoleranz, hohe Inhibitortoleranz.

Xylose-vergärende Hefen in der Natur - Pichia stipitis, Candida shehatae, Candida tenuis, Pachysolen tannophilus; einige wenige Bakterien

Fermentation von Pentosezuckern

• In der Natur werden 2 Routen der mikrobiellen Xylosever-wertung gefunden.

Abbildung: Xylosemetabolismus in Hefen und Pilzen sowie in Bakterien. Die 2-stufige oxidoreduktive Konversion von Xylose zu Xylulose in Eukaryonten wird durch einstufige Isomerisierung in Prokaryonten ersetzt. Nach ATP-abhängiger Phosphorylierung an der 5-OH tritt D-Xylulose 5-Phosphat in den Pentosephosphatweg ein und wird von dort konventionell verwertet.

• In Bakterien findet man häufig das Problem, dass die Enzyme

für die eigentliche Ethanolsynthese fehlen oder ungenügend

aktiv sind:

Pyruvat-Decarboxylase (PDC)

Alkohol-Dehydrogenase (ADH)• Natürlich Xylose vergärende Hefen produzieren zwar

Ethanol, allerdings in schlechten Ausbeuten und mit einer

Reihe von Nebenprodukten (Xylit, Glyzerin, Azetat) sowie mit

geringer Produktivität. Überlegen Sie, woher im Stoffwechsel die Nebenprodukte

kommen.

• Abhilfe kann durch Metabolic Engineering erreicht werden.

Im wesentlichen wird darunter die Neueinbringung oder

Modifikation von metabolischen Wegen für biotechnolo-

gische Zwecke verstanden.

Exkurs - Metabolic Engineering– Definition: The directed improvement of product formation or cellular

properties through the modification of specific biochemical reaction(s) or the introduction of new one(s) with the use of recombinant DNA technology

– Einbringen neuer Stoffwechselleistungen (z.B., die Assimilierung von Xylose durch Saccharomyces cerevisiae)

– Erzielen eines höheren Flusses durch einen bestimmten Schritt, oder eine Sequenz von Schritten

• Erhöhung der Expression des relevanten Gens oder der Gene– Anzahl der Genkopien

– Steigerung der Transkriptionsrate über Promotoraktivität oder die Transkriptionsmaschinerie

– Problem ist dabei die oft geringe Korrelation zwischen produzierter mRNA und translatiertem, aktiven Protein

• Verbesserung der kinetischen Eigenschaften des relevanten Enzyms– Änderung der Spezifität für Substrate und Kofaktoren

– Änderung der Umsetzungszahl (steigern) und/oder der Michaelis Konstante (erniedrigen) für das physiologische Substrat

– Methoden dazu sind: Einsatz von Orthologen aus anderen Organismen; ortsspezifische Mutagenese; gerichtete Evolution; Herstellen von Mosaikgene (gene shuffling)

– Ausschalten von Konkurrenzschritten

• Inaktivierung der relevanten Gene

Metabolic Engineering

A P

k1 k2 k3

knet = (k1-1 + k2

-1 + k3-1)-1

• Optimierung des Flusses muss die Abhängigkeit der Nettogeschwindig-keitskonstante (knet) von den individuellen Geschwindigkeitskonstanten (1. Ordnung) der Einzelschritte berücksichtigen.• Die relativen Enzymkonzentrationen für die Schritte 1 bis 3 sind ebenfalls zu berücksichtigen.

A

k1

k2

P1

P2

dA/dt = (k1 + k2 ) AdP2/dt = k2 A

• Optimierung des Flusses in Richtung P2 (z.B. Pyruvat zu Ethanol im Falle von heterofermentativen Organismen)

Escherichia coli

Abbildung: Metabolic Engineering von E. coli für die Fermentation von Hexose und Pentosezuckern. Problem ist eine wenig aktive PDC mit ungünstigen kinetischen Parametern (= hoher Km Wert für Pyruvat). Um die Reaktion am Verzweigungspunkt Pyruvat in Richtung Ethanol zu “ziehen”, wurden Gene für PDC und ADH aus Zymomonas mobilis in E. coli exprimiert.

Zymomonas mobilis

• Stöchiometrie der Xyloseverwertung

3 Xylose + 3 ADP + Pi 5 Ethanol + 5 CO2 + 3ATP + 3 H2O

• Vorteile von Z. mobilis sind die hohe Etanoltoleranz (größer als bei Hefe),

die hohe Ausbeute (97% der Theorie) sowie die Bildung von wenig

Biomasse. Es ergibt sich eine mögliche Ausbeute von 0,51 g Ethanol / g

Xylose.

• Z. mobilis hat GRAS Status und besitzt ein sehr aktives System von PDC-

ADH sowie einen effektive Zuckertransport durch die Zellmembran. Man

vermutet, dass in Hefe der Transport von Zucker in die Zelle geschwin-

digkeitslimitierend ist.

• Nachteil ist, dass der natürliche Organismus keine Xylose verwerten kann.

• Die Lösung dazu war die Expression der Gene für Xyloseisomerase,

Transaldolase und Transketolase aus E. coli. Zhang et al. (1995) Science 267, 240 ff.

Abbildung: Metabolic Engineering von Z. mobilis für die Xyloseverwertung. Entscheidend sind die Schritte der Xyloseassimilierung (Xyloseisomerase; Xylosereduktase und Xylitdehydrogenase) sowie Schritte des nicht oxidativen Pentosephosphatweges (PPP) für die reversible Umwandlung von phosphorylierten Zuckerbausteinen. Beachten Sie die katabole und anabole Rolle des PPP in diesem Fall.

Saccharomyces cerevisiae

• Tradition und Erfahrung in der Alkoholindustrie sprechen für diesen

Organismus.

• Ein Problem war lange Zeit, dass heterologe Genexpression von

Xyloseisomerase aus Bakterien zu weitgehend inaktivem Enzym führte.

• Alternativ dazu kann der Xylosestoffwechsel aus Pichia stipitis in S.

cerevisiae implementiert werden (siehe Abb. hinten).

• Die unterschiedlichen Spezifitäten von Xylosereduktase (NADPH und

NADH) und Xylitdehydrogenase (NAD+) führen zu einer Imbalanz der

Redoxcoenzyme. NADH wird formal auf Kosten von NADPH akkumuliert.

Ohne Atmungskettenphosphorylierung (anaerobe Bedingungen!) kann

NADH nur mangelhaft reoxidiert werden. Eine Möglichkeit wäre daher,

den Bioreaktor kontrolliert bei sehr niedrigen O2 Konzentrationen zu

belüften, was in der Praxis jedoch schwierig ist.

• Die Konsequenz ist, dass Xylitol wird unter Sauerstofflimitierung ins

Medium ausgeschieden wird und damit YEtOH/Xylose stark sinkt .

Abbildung: Bilanz der Verwertung von Xylose durch S. cerevisiae. Die initiale Reduktion der Xylose durch XR mit NADPH, bei gleichzeitiger Verwendung von NAD+ durch XDH, führt zur Produktion von Xylit.

Alternativen

•Redirektion des metabolischen Flusses in Richtung oxidativer

PPP-Weg (Regeneration von NADPH für Xylosereduktase).

• Einbringen von Enzymen mit veränderter Coenzymspezifität

in den Zentralmetabolismus (Glycerinaldehyd 3-Phosphat

Dehydrogenase)

•Änderung der Coenzymspezifität von Xylosereduktase

(Spezifität mit NADH) oder Xylitoldehydrogenase (Spezifität

mit NADP+) durch Protein Engineering.

•Heterologe Redoxzyklen mit dualer Coenzymspezifität (z.B.

Stoffwechsel der Aminosäure Glutamat).

•Heterologe Gene für Transhydrogenasen (NADPH + NAD+ in

NADP+ + NADH).