biomarqueurs de génotoxicité chez dreissena polymorpha

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Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissenapolymorpha : indicateurs de la pression chimique

urbaine et variabilité naturelle des lésions de l’ADNCécile Michel

To cite this version:Cécile Michel. Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pressionchimique urbaine et variabilité naturelle des lésions de l’ADN. Sciences de l’environnement. UniversitéPierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. Français. �tel-00703238�

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https://hal.archives-ouvertes.fr

Université Pierre et Marie Curie Paris VI

Ecole Doctorale Géosciences et Ressources Naturelles

Thèse Doctorale Spécialité "Ecotoxicologie"

Présentée par

Cécile Michel

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'Université Pierre et Marie Curie

Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pression chimique urbaine et variabilité naturelle

des lésions de l'ADN

Soutenue le 19 décembre 2011

Membres du Jury:

Rapporteurs: Mme Paule Vasseur, Professeur, Université de Metz Rapporteur Mr Jean-Luc Ravanat, Directeur de Recherche au CEA, Grenoble Rapporteur Examinateurs: Mme Bénédicte Morin, Maître de Conférences Université Bordeaux 1 Examinateur Mr Jean-Marie Mouchel, Professeur, Université Paris VI Examinateur Mr Sébastien Lemière, Maître de Conférences Université Lille 1 Examinateur Mme Catherine Gourlay-Francé, Chargée de Recherche, Cemagref Examinateur Mme Françoise Vincent-Hubert, Chargée de Recherche, Cemagref Directrice de thèse

Thèse préparée au sein du Cemagref d'Antony Unité Hydrosystèmes et Bioprocédés

Université Pierre et Marie Curie

Paris VI Ecole Doctorale Géosciences et Ressources Naturelles

Thèse Doctorale Spécialité "Ecotoxicologie"

Présentée par

Cécile Michel

Pour obtenir le grade de

Docteur de l'Université Pierre et Marie Curie

Biomarqueurs de génotoxicité chez Dreissena polymorpha : indicateurs de la pression chimique urbaine et variabilité naturelle

des lésions de l'ADN

Soutenue le 19 décembre 2011

Membres du Jury:

Rapporteurs: Mme Paule Vasseur, Professeur, Université de Metz Rapporteur Mr Jean-Luc Ravanat, Directeur de Recherche au CEA, Grenoble Rapporteur Examinateurs: Mme Bénédicte Morin, Maître de Conférences Université Bordeaux 1 Examinateur Mr Jean-Marie Mouchel, Professeur, Université Paris VI Examinateur Mr Sébastien Lemière, Maître de Conférences Université Lille 1 Examinateur Mme Catherine Gourlay-Francé, Chargée de Recherche, Cemagref Examinateur Mme Françoise Vincent-Hubert, Chargée de Recherche, Cemagref Directrice de thèse

Thèse préparée au sein du Cemagref d'Antony Unité Hydrosystèmes et Bioprocédés

V

Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l’unité Hydrosystèmes et Bioprocédés du

Cemagref d’Antony. Je tiens à remercier Cécile Loumagne, Sophie Morin et Valérie Dansin de m’avoir accueillie dans l’unité. Je remercie aujourd’hui Didier Pont, Nathalie Camus et Elisabeth Riant qui ont pris leur succession.

Je remercie également la Région Ile de France pour le soutien financier ayant permis la réalisation de ce travail de thèse, ainsi que le programme de recherche PIREN-Seine.

Je remercie Marie-Hélène Tusseau-Vuillemin de m’avoir accueillie dans son équipe EXPER au début de ma thèse, ainsi que Catherine Gourlay-Francé qui a pris sa succession dans l’équipe, devenue BELCA. Je remercie aussi Catherine pour ses conseils et sa gentillesse.

A l’origine de ce travail de thèse, je remercie particulièrement Françoise Vincent-Hubert ma Directrice de thèse. Au cours de ces trois ans de thèse, j’ai eu la chance de bénéficier de ses conseils avisés et de son soutien. Je remercie Françoise pour sa disponibilité, sa patience, son soutien et sa gentillesse. Merci de m’avoir permis de vivre ces trois années de thèse qui ont été très enrichissantes tant professionnellement que personnellement.

Je tiens à adresser ma profonde reconnaissance à Paule Vasseur et Jean-Luc Ravanat d’avoir accepté d’être rapporteurs de ce travail de thèse. Je remercie également Bénédicte Morin, Catherine Gourlay-Francé, Jean-Marie Mouchel et Sébastien Lemière d’avoir accepté d’être membres du jury.

Je remercie également Michel de Méo, Alain Devaux, Alain Geffard, Catherine Gourlay-Francé et Christophe Minier, membres de mon comité de pilotage de thèse.

Je tiens à remercier Michel de Méo de m’avoir accueillie à deux reprises dans son laboratoire pour me dévoiler les secrets du test d’Ames et fait découvrir les calanques de Marseille.

Merci à l’équipe de VNF de Commercy de nous avoir aidé à pêcher les moules nécessaires à nos expériences.

Je tiens à remercier l’ensemble de l’équipe EXPER/BELCA, avec qui ces trois années de thèse resteront inoubliables…

Mes premiers remerciements s’adressent à Aurélie qui a été d’une aide imparable au cours de mes manips. Merci pour toutes ces heures passées à pêcher par tous les temps, d’avoir trouvé des solutions à tous nos problèmes techniques rencontrés sur le terrain, d’avoir passé tant d’heures dans les différentes salles noires (avec cette superbe lumière rouge !) pour les manips de tests comète et micronoyaux qu’on a pu réaliser, de m’avoir aidée pour les lectures de lames et tout ce que j’oublie ! Je te remercie aussi pour toutes les soirées parisiennes (resto, apéro, Peña …) et les week-ends en Normandie, Haute-Savoie, Disney, Astérix … Un grand merci à toi !

Je remercie ensuite Lise et Adeline qui ont maintenant terminé leurs thèses et à qui je souhaite un avenir brillant et beaucoup de réussite. Je garde un excellent souvenir de nos colloques en Suède et en Espagne qui étaient suivis de quelques jours de vacances pour découvrir de nouvelles régions ! Je remercie également Julien pour son aide et ses corrections d’anglais pour les articles ! Merci à Adeline et Gregou pour les petites soirées Ignyssoises et les bons petits plats (et merci à Jean-Jacques pour la trouss !)! Ce fut un très grand plaisir !

Un grand merci à Emma pour sa gentillesse, sa joie de vivre, son soutien et son aide, notamment pour la relecture de ma thèse. Merci de m’avoir fait découvrir les danses médiévales, les soirées Folk et le nia ! En espérant refaire d’autres soirées Irlandaises ! Je te souhaite plein de réussite pour ta thèse et toutes les activités que tu entreprends.

VI

Merci beaucoup à Jérem de m’avoir initiée à la pêche aux gammares et fait découvrir la fameuse butte de Doue ! Merci à Jérem et Karine pour le petit week-end à Bruxelles !

Merci à Matthieu d’avoir été là pour le début et la fin de ma thèse ! Merci à toi pour ta bonne humeur et ton aide pour les analyses chimiques ! Bonne chance pour la suite !

Je remercie également Marine pour les analyses chimiques, mais aussi sa bonne humeur et sa joie de vivre! Je te souhaite une bonne continuation pour la suite !

Merci également à Amélie, pour son aide et sa gentillesse. Merci à toi et Eric pour les bons moments passés à Hong Kong ! Que de souvenirs…

Un grand merci au Dr Chapleur, Belca par adoption, pour les pauses thé et toutes les petites soirées pasta ! Je te souhaite un bon courage pour la dernière ligne droite de ta thèse !

Merci à Violaine pour sa sympathie et sa bonne humeur. Je te souhaite bon courage pour ta thèse!

Je remercie Cécile (la Mirande) qui reste une Belcate dans nos cœurs ! Merci pour ta bonne humeur, ton énergie! Merci aussi à toi et Mathieu pour les soirées japonaises et les soirées basques !

Un grand merci à Clémence pour sa gentillesse et les sorties Ladurée ! Je te remercie aussi pour la relecture de ma thèse et ton avis critique !

Je remercie François pour sa gentillesse et sa bonne humeur permanente ! Je te remercie également de m’avoir fait connaître ta région et ses habitants ;-) Bonne continuation et bon courage pour ta thèse !

Merci à Damien pour sa gentillesse et toutes ses connaissances qui ont provoqué de longues discussions aux pauses thé!

Merci à Pauline pour sa bonne humeur et les nombreux fous rires! Merci à Amélie et à Juliette que j’ai encadrées pendant leur stage et qui ont contribué à ce

travail de recherche.

Je tiens aussi à remercier les personnes avec qui j’ai partagé mon bureau durant ces trois années. Je commence par Hocine, que je remercie pour sa sympathie et son aide précieuse en conseils informatiques ! Merci à Coco et Chloé pour leur bonne humeur et qui ont rendu ce bureau très vert ! Enfin, merci à Louise et Hajer pour leur gentillesse.

Je remercie également mes amis de Metz pour leur soutien et d’avoir été là pour mes week-ends sur Metz. Merci à Béné et Micka, Mimie et Pierrick, Eric et Julian et Let.

Vient maintenant le moment de dire merci à mes coraillettes, pour ces week-ends passés dans les régions de chacune ! Merci à Virginie, Pauline, Sam Sam, Fanny, Gess, Katouche, Oriane et Natacaha !

Je remercie également ma famille qui a toujours été présente à mes côtés et qui est toujours prête à tout pour me faire rire ! Merci à Roland et Kiki, Coco et Jojo et Elise et Gautier. Un très grand merci à ma mamy qui me prépare de bons petits plats pour mes retours aux sources !

Un grand merci à ma maman pour son soutien et ses encouragements. Merci de me changer les idées chaque fois que je rentre à Metz !

Mes derniers remerciements s’adressent à Vincent, je te remercie pour tout ce que tu fais pour moi et pour nous…

VII

Résumé

Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de substances chimiques dans l'environnement. Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l’eau, il est nécessaire d'évaluer l'impact de la contamination chimique sur les milieux aquatiques afin d'établir un diagnostic de l'état écologique des masses d'eau. Les biomarqueurs de génotoxicité permettent l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'ADN et comme indicateurs prédictifs d’effets au niveau populationnel.

L'objectif général de cette thèse est de développer un biomarqueur de génotoxicité

sensible et précoce des effets de la contamination chimique urbaine sur Dreissena polymorpha. Dans ces travaux, nous avons utilisé le test comète, permettant de mesurer les cassures de brins d'ADN et les sites alcali-labiles. Nous avons couplé ce test à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives (hOGG1) afin d’améliorer sa significativité, par la recherche de lésions oxydatives, telle que la 8-oxodG, impliquée dans le vieillissement cellulaire et la cancérogénèse. La formation d'oxydation de l'ADN a été mise en évidence par le test comet-hOGG1 appliqué à des cellules de branchies de moules exposées au BaP et au Cd. La réparation des lésions oxydatives induites par le BaP s'est avérée plus rapide que celles induites par le Cd. D'autre part, la variabilité naturelle de certains biomarqueurs de génotoxicité tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et le nombre d'adduits à l'ADN, a été étudiée dans le but d'éliminer ce biais dans de futures études de biomonitoring. Les résultats des études in situ ont permis de mettre en évidence une induction de lésions oxydatives sur les moules transplantées sur les sites urbains du bassin de la Seine. De plus, ces travaux montrent que la technique de transplantation des moules n'induit pas de modification du statut biologique des organismes, ni de variation de l'expression du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence de micronoyaux. Enfin, la comparaison de l'expression des biomarqueurs de génotoxicité entre le printemps et l'automne montre que ces deux saisons sont favorables aux études de biomonitoring par la transplantation de dreissènes.

Mots clés : Biomarqueurs de génotoxicité, Oxydation de l’ADN, Comet-hOGG1,

Transplantation, Variabilité naturelle.

IX

Abstract:

Human activities are responsible of the introduction of a large number of chemical contaminants in the environment. In order to assess the ecological status of water bodies, it becomes necessary to assess the impact of chemical contamination in the aquatic environment. The use of genotoxicity biomarkers allows the evaluation of the impact of chemical contaminants on the DNA integrity as predictors of effects at the population level.

The main objective of this work was to develop a sensitive biomarker of early genotoxic

effects of chemical contamination in Dreissena polymorpha caged in urban area. We used the comet assay, to measure DNA strand breaks and alkali-labile sites. We have coupled this assay with a specific endonuclease of oxidative DNA damage (hOGG1) to enhance the significance of the comet-hOGG1 assay, by the oxidative DNA damage detection, such as 8-oxodG, involved in cellular aging and carcinogenesis. The DNA oxidation formation has been demonstrated by the comet assay applied to mussel gills cells exposed to BaP and Cd. The oxidative DNA damage induced by BaP exposure were faster repaired than in mussels exposed to Cd. Then, the intrinsic variability of some genotoxicity biomarkers such as the level of DNA strand breaks, the micronuclei frequency and the number of DNA adducts, was assessed in order to eliminate this parameter in future biomonitoring studies. Results obtained in field studies showed the oxidative DNA damage induction in caged zebra mussels in urban sites of the Seine river basin. In addition, these studies showed that the mussels transplantation did not induce change either in the biological status of organisms or changes in the DNA strand break levels and micronuclei frequency. Finally, the comparison of the expression of genotoxicity biomarkers between spring and autumn showed that these two seasons are favorable to biomonitoring studies by the transplantation of Dreissena polymorpha.

Keywords: Genotoxicity biomarkers, DNA oxidation, Comet-hOGG1, Caging, Intrinsic

variability.

XI

Table des matières

Remerciements............................................................................................................................................. V

Liste des abréviations ............................................................................................................................. XIII

Liste des figures ........................................................................................................................................ XV

Liste des tableaux...................................................................................................................................XVII

Liste des publications et communications aux colloques ................................................................. XIX

Introduction Générale ............................................................................................................................ - 1 -

Chapitre I .................................................................................................................................................. - 5 -

1. Contamination chimique du bassin de la Seine et présentation des sites d'étude ........ - 7 -

1.1. Localisation et présentation du bassin de la Seine ....................................................... - 7 - 1.2. Contamination de la Seine ............................................................................................... - 7 - 1.3. Micro-contaminants présents dans la colonne d'eau ................................................... - 8 -

2. Utilisation des biomarqueurs pour l'évaluation de la qualité biologique du milieu

aquatique ............................................................................................................................................ - 15 -

2.1. Définition et description des biomarqueurs ............................................................... - 17 - 2.2. Utilisation d’espèces sentinelles en biomonitoring .................................................... - 18 -

3. Sources, effets et outils de détection des altérations du matériel génétique ............... - 19 -

3.1. Sources de génotoxiques................................................................................................ - 20 - 3.2. Dommages de l'ADN .................................................................................................... - 21 -

4. Biomarqueurs de génotoxicité adaptés aux organismes aquatiques ............................. - 28 -

4.1. Le test comète ................................................................................................................. - 29 - 4.2. Détection des adduits encombrants par la méthode du post-marquage au phosphore 32 et utilisation en biomonitoring .............................................................................................. - 34 - 4.3. Test micronoyaux ........................................................................................................... - 37 - 4.4. Voies de réparations des lésions de l'ADN................................................................. - 39 -

5. La moule zébrée, un organisme utilisé en biomonitoring ............................................. - 43 -

5.1. Présentation de Dreissena polymorpha ............................................................................. - 43 - 5.2. Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène ............................ - 47 -

PARTIE A : Intérêt de la détection des lésions oxydatives Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection des lésions oxydatives ............ - 55 -

Publication 1: Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to models contaminants

Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives ........................................................... - 65 -

Publication 2: Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants

XII

PARTIE B : Etude de la réponse génotoxique exprimée par D. polymorpha in situ Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ .................... - 91-

Publication 3: Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha

Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ........... - 121 -

Publication 4: Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination

Chapitre VI : Discussion générale .................................................................................................... - 145 -

1. Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha ....................................... - 148 -

1.1. Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha .............................................................. - 148 - 1.2. Utilisation des cellules branchiales ............................................................................ - 149 - 1.3. Test comète couplé à hOGG1 .................................................................................. - 149 - 1.4. Conclusions .................................................................................................................. - 151 -

2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des lésions

induites par le BaP et le Cd .......................................................................................................... - 151 -

2.1. Exposition de Dreissena polymorpha au BaP ............................................................... - 151 - 2.2. Exposition de Dreissena polymorpha au Cd ................................................................. - 153 - 2.3. Conclusions .................................................................................................................. - 154 -

3. Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un niveau

basal du taux de cassures à l’ADN .............................................................................................. - 155 -

3.1. Vérification de l’absence d’impact dû à la transplantation .................................... - 155 - 3.2. Etablissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN ........................................... - 155 - 3.3. Variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité ......................................... - 156 - 3.4. Conclusions .................................................................................................................. - 159 -

4. Détection des dommages oxydatifs en milieu naturel ................................................ - 160 -

Conclusions et perspectives .............................................................................................................. - 163 -

Bibliographie ....................................................................................................................................... - 167 -

Annexe ................................................................................................................................................. - 193 -

XIII

Liste des abréviations

8-oxodG 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine

A Adénine

ADN Acide DésoxyriboNucléiques

AchE AcéthylcholinEstérase

BaP Benzo(a)Pyrène

BER Réparation par Excision de Bases

BET Bromure d’EThidium

C Cytosine

Cd Cadmium

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DCE Directive Cadre Européenne sur l’Eau

DGT Diffusive gradient in thin film (gradient de diffusion en couche mince)

Fpg Formamidopyrimidine DNA-glycosylase

G Guanine

GST Glutathion-S-transferase

hOGG1 human 8-OxoGuanine DNA N-Glycosylase 1

IBGN Indice Biologique Global Normalisé

MMS MéthylMethane Sulfonate

MN Micronoyaux

NER Réparation par Excision de Nucléotide

NQE Normes de Qualité Environnementales

OTM Olive Tail Moment

PCB PolyChloroBiphényle

ROS Espèces Réactives de l’Oxygène

T Thymine

UDPGT Uridine DiPhosphateGlucuronosylTransferase

US EPA Environmental Protection Agency américaine

UV Ultraviolet

XV

Liste des figures

Figure 1: Carte du bassin de la Seine ....................................................................................... - 7 -

Figure 2: Sources de pollution dans un bassin versant ............................................................. - 8 -

Figure 3: Les 16 HAP prioritaires définis par l’US-EPA ........................................................ - 10 -

Figure 4: Teneurs en HAP dissous à 8 dates réparties au cours de l’année 2005. ................... - 11 - Figure 5 : Concentrations médianes (µg/l) en cadmium, cuivre, cobalt et nickel dissous totaux et

labiles en amont et aval de Paris ............................................................................................ - 13 -

Figure 6 : Schéma de synthèse des effets écotoxicologiques .................................................. - 16 - Figure 7: Principaux types de dommages à l'ADN causés par des agents exogènes ou endogènes,

ainsi que les voies de réparations associées ........................................................................... - 21 -

Figure 8: Diversité des altérations de l’ADN en termes de lésions et de mutations ................ - 22 -

Figure 9: Schéma des différentes formes de ROS .................................................................. - 24 - Figure 10: Formation de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) et formation de la

transversion G vers T ........................................................................................................... - 25 -

Figure 11: Liaison de la 8-oxodG à la cytosine ou à l'adénine ................................................ - 26 -

Figure 12: Schéma de formation des micronoyaux ................................................................ - 27 -

Figure 13: Photo de noyaux endommagés et d'un noyau non endommagé .......................... - 29 -

Figure 14: Etapes du test Comète en condition alcaline ........................................................ - 30 -

Figure 15: Paramètres de quantification des dommages à l'ADN .......................................... - 30 -

Figure 16: Couplage du test comète avec une endonucléase .................................................. - 33 -

Figure 17: Principe de la méthode de post-marquage au 32P de l'ADN ................................ - 35 -

Figure 18: Autoradiographies des profils en adduits .............................................................. - 36 - Figure 19: Anomalies nucléaires dans des cellules branchiales de moules zébrées révélées par le

test MN ................................................................................................................................ - 37 -

Figure 20: Mécanisme de la voie de réparation NER ............................................................ - 40 -

Figure 21: Voie de réparation BER ....................................................................................... - 42 -

Figure 22: Dreissena polymorpha ............................................................................................... - 43 -

Figure 23: Anatomie de la dreissène ...................................................................................... - 45 -

Figure 24: Cycle de vie de Dreissena polymorpha ....................................................................... - 47 -

XVII

Liste des tableaux

Tableau I: Liste des principaux métaux à activité génotoxique testés par les tests d'Ames et

Chromotest sans activation métabolique ............................................................................... - 14 -

Tableau II: Exemples de biomarqueurs (poissons, invertébrés et péryphiton). ...................... - 16 -

Tableau III: Biomarqueurs biochimiques et cellulaires courants en écotoxicologie pour une

recherche d'exposition et/ ou d'effet. ................................................................................... - 18 -

Tableau IV: Historique de l’invasion de Dreissena polymorpha .................................................. - 44 -

XIX

Liste des publications et communications aux colloques

Publications:

Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells, exposed to model contaminants, Mutation

Research, (in press)

Cécile Michel and Françoise Vincent-Hubert

Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha,

soumise à Aquatic Toxicology

Cécile Michel, Adeline Bourgeault, Catherine Gourlay-Francé, Frédéric Palais, Alain Geffard

and Françoise Vincent-Hubert

Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and

the water chemical contamination soumise à Environmental Science and Pollution Research

Cécile Michel, Amélie Châtel, Emmanuelle Uher, Marine Perret, Matthieu Combe, Aurélie

Germain, Catherine Gourlay-Francé and Françoise Vincent-Hubert

Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay

in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants (en preparation)

Cécile Michel, Aurélie Germain, Emmanuelle Uher, Françoise Vincent-Hubert

Congrès:

Communications orales:

Comet assay on adult zebra mussel and on embryos of the snail Potamopyrgus antipodarum: stability

of DNA strand breaks, DNA oxidation and gene expression analysis (ICAW, Kusadası, Turquie -

2011)

Cécile Michel, Amélie Châtel, Messika Revel, Jeanne Garric, Catherine Gourlay-Francé,

Françoise Vincent-Hubert

Interest of using the comet-hOGG1 assay to measure DNA oxidation in Dreissena polymorpha in

the Seine river basin (ISTA 15, Hong Kong, Chine (résumé O-2)

XX

Cécile Michel, Emmanuelle Uher, Aurélie Germain, Catherine Gourlay-Francé, Françoise

Vincent-Hubert (2011)

Posters:

Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to model contaminants (14th

ISTA, Metz, France, 2009, résumé P32)

Cécile Michel et Françoise Vincent-Hubert

Detection of specific oxidative DNA damage in gill cells of Dreissena polymorpha with the comet

assay and OGG1 enzyme (SETAC Europe, Göteborg, Suède, 2009, résumé WE 268)


Determination of seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in Dreissena polymorpha (SETAC,

Seville, Espagne, 2010, résumé MO 283)

14th International Symposium on Toxicity Assessment, Metz, France - August 30 to September 4


Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by hOGG1-comet assay

in Dreissena polymorpha (SETAC Europe, Milan, Italie, 2011, résumé TU 204)

Jérémie Lebrun, Cécile Michel, Françoise Vincent-Hubert

Introduction Générale

Introduction générale

- 1 -

Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de

substances chimiques dans l'environnement. La contamination chimique de l'environnement est

issue des activités industrielles, agricoles et urbaines. Quel que soit le compartiment initial

d'introduction des contaminants, une fraction importante est entraînée très loin de leur point

d'émission par la circulation atmosphérique et hydrique. Le compartiment aquatique se retrouve

être le réceptacle final de toutes ces sources de pollution. Parmi les principaux contaminants

présents dans l'environnement, on distingue d'une part les composés organiques tels que les

hydrocarbures, les polychlorobiphényles et les pesticides et d'autre part les métaux. Depuis peu, la

présence de polluants « émergeants » regroupant les produits pharmaceutiques et les alkyphénols

a été mise en évidence.

La Directive Cadre Européenne sur l’Eau (DCE) datée du 23 octobre 2000 (directive

2000/60) impose aux pays membres d’améliorer l’état écologique des masses d’eau et d’atteindre,

en 2015, le bon état écologique des différents milieux sur tout le territoire européen. La première

étape de ce travail était d'établir le bilan de l’état écologique des masses d'eaux en termes de

variables physiques, chimiques et biologiques. L’amélioration de l’état de cours d’eau fixée dans la

Directive passe par l’élaboration de programmes de réduction des rejets, qui nécessitent de définir

des normes de concentrations et/ou de flux de polluants rejetés, adaptées à la sensibilité du

milieu aquatique récepteur. Dans ce but, il est fondamental de connaître l’impact de la

contamination du milieu aquatique à court et à long terme sur les organismes aquatiques.

Actuellement, la qualité des masses d'eau est définie à la fois par la mesure des concentrations des

contaminants chimiques présents dans l'eau et par leur comparaison aux normes de qualité

environnementales : NQE ou par l'état écologique apprécié par l’Indice Biologique Global

Normalisé (IBGN) qui consiste à étudier la composition des peuplements d’invertébrés

benthiques vivant sur divers habitats dans les cours d’eau. Cependant, les mesures chimiques et

l'évaluation de l'IBGN ne permettent pas de mesurer le risque chimique d'une exposition

chronique des organismes aquatiques aux contaminants présents dans l'eau.

L’écotoxicologie est la discipline scientifique qui étudie le comportement et les effets des

polluants sur la structure et le fonctionnement des écosystèmes ainsi que leur impact sur le vivant

à différentes échelles spatiales et temporelles. Cette discipline allie la chimie de l’environnement,

la toxicologie et l’écologie. L'étude des effets induits par les contaminants chimiques au niveau

des organismes repose sur l'utilisation de marqueurs biologiques, ou biomarqueurs.


- 2 -

C’est au début des années 1980 que la notion de biomarqueur a été définie. Les biomarqueurs

sont des changements structuraux ou fonctionnels observables et/ou mesurables à divers niveaux

d’organisation biologique (moléculaire, biochimique, cellulaire, physiologique ou

comportementale), qui révèlent l’exposition présente ou passée d’un individu à au moins une

substance chimique (Lagadic et al., 1997). Ce sont des outils mis en œuvre pour établir un

diagnostic de risque environnemental. L'utilisation de biomarqueurs de génotoxicité permet

l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'acide

désoxyribonucléique (ADN) et sert d’indicateur prédictif d’effets au niveau populationnel.

Objectif de la thèse et démarche scientifique

Dans ce contexte, l'objectif général de ce travail de thèse est d'utiliser le test comète,

comme biomarqueur de génotoxicité de la contamination chimique et de lui donner plus de

significativité en le couplant à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives,

telle que la 8-oxodG. Nous avons donc adapté le test comet-hOGG1 pour Dreissena polymorpha

dans le but de rechercher si les moules transplantées en milieu contaminé présentent une

augmentation de la 8-oxodG.

Le premier objectif est d'adapter le test comet-hOGG1 à Dreissena polymorpha et de

rechercher si le BaP et le Cd induisent des lésions oxydatives lors de l’exposition des dreissènes

en laboratoire. Nous avons ensuite déterminé quelle était la stabilité des lésions oxydatives dans le

temps afin d'évaluer les capacités de réparation des oxydations par les dreissènes. Pour y parvenir,

nous avons suivi le devenir de ces lésions lors d’une phase de dépuration dans des moules

exposées auparavant à des contaminants modèles.

Le deuxième objectif est de rechercher s'il existe une variabilité naturelle de biomarqueurs

de génotoxicité (cassures de l'ADN, formation de micronoyaux) afin d’éliminer ce biais lors de

futures études in situ. La réponse génotoxique exprimée par des dreissènes transplantées sur des

sites urbains du bassin de la Seine a ensuite été mesurée afin de rechercher l'impact potentiel de la

pression chimique du milieu urbain. Nous avons plus précisément recherché l'impact de la

contamination en HAPs sur le taux de cassures de l'ADN, le niveau de bases oxydées, le taux

d'adduits à l'ADN et de micronoyaux.


- 3 -

Organisation du mémoire

Ce travail de thèse est divisé en six chapitres. Le premier chapitre comprend la synthèse

bibliographique et l’état de l’art des connaissances. Cette partie débute par la présentation du

bassin de la Seine et sa contamination. Les biomarqueurs de génotoxicité y sont présentés comme

indicateurs précoces des effets de la pression chimique des milieux aquatiques. Certains types de

lésions de l’ADN mesurées en biomonitoring et les tests utilisés pour les mettre en évidence

seront expliqués. Le modèle biologique utilisé lors de ces travaux, Dreissena polymorpha y sera

présenté à travers son cycle de vie et son utilisation dans les études de biomonitoring.

Les quatre chapitres suivants sont séparés en deux parties :

La partie A regroupe les travaux réalisés en laboratoire. Cette partie est constituée par le

chapitre II qui comprend la mise au point in vitro et in vivo de la détection des lésions oxydatives

de l’ADN par le test comet-hOGG1. Le chapitre III porte sur l’application de ce test sur des

moules exposées in vivo à des contaminants modèles tels que le BaP, le Cd et le MMS dans le but

d’étudier la stabilité des lésions oxydatives dans le temps lors d'une phase de dépuration.

La partie B regroupe les travaux réalisés sur le terrain. Le chapitre IV présente l'étude les

variations naturelles des biomarqueurs de génotoxicité exprimés lors d'une transplantation de

dreissènes sur des sites urbains du bassin de la Seine au cours de l’hiver, du printemps et de l’été.

Le chapitre V présente les résultats de la mesure du taux d'adduits à l'ADN et la mesure

d'oxydation de l'ADN, par l'application du test comet-hOGG1, afin de déterminer si la pression

chimique du milieu urbain induit une oxydation de l'ADN lors d'une transplantation de

dreissènes au printemps et à l’automne.

L’ensemble des résultats obtenus lors de ces travaux sera discuté et confronté aux

données de la littérature dans le chapitre VI.

Chapitre I

Synthèse bibliographique et état de l’art


- 7 -

1. Contamination chimique du bassin de la Seine et présentation des sites d'étude

1.1. Localisation et présentation du bassin de la Seine

Le bassin de la Seine (Figure 1) est irrigué par la Seine et ses affluents (Marne, Yonne,

Oise principalement). Aujourd'hui, cette zone du territoire Français qui s'étend sur 78600km²

(Viennot et al., 2009), est habitée par 16 millions de personnes, concentrées sur seulement 2% de

cette superficie (Blanchard et al., 2007), soit 200 habitants au km² correspondant au double de la

moyenne nationale (Billen et al., 2009). Cet espace est également très marqué par l’homme et une

urbanisation importante s’est progressivement mise en place autour des grands cours d’eau.

L'essor de l'industrialisation et de l'urbanisation au cours de ces deux derniers siècles a marqué le

cœur du bassin de la Seine (Mouchel et al., 1998). La densité des forêts sur le bassin est faible mais

celle de l’agriculture est très forte.

Figure 1 : Carte du bassin de la Seine

1.2. Contamination de la Seine

La forte densité de population entraine l'augmentation des niveaux de contamination en

métaux et contaminants organiques, issus des eaux usées domestiques et industrielles ainsi que de

PARIS


- 8 -

l'activité agricole (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et al., 1999; Tusseau-

Vuillemin et al., 2007; Thévenot et al., 2009) (Figure 2).

Figure 2 : Sources de pollution dans un bassin versant

La caractéristique de la pollution urbaine est la faible concentration en contaminants. Le

terme de micropolluant désigne des substances présentes à l'état de trace (concentrations de

l’ordre du μg/L ou du ng/L) dans le milieu aquatique et susceptibles d'induire des effets toxiques

à faible dose. L’ensemble des micropolluants est très hétérogène et regroupe les métaux trace, et

certaines molécules organiques. L’ensemble des organismes aquatiques est exposé à cette

contamination dissoute par contact direct et par la respiration. Des travaux datant des années

1980, ont montré que la contamination des organismes par les métaux et plus récemment pour

les hydrocarbures dépendait généralement, non pas de la quantité globale en micropolluant, mais

de la fraction « libre », c’est à dire non associée à des particules. Cette fraction est

malheureusement assez délicate à mesurer car elle se trouve en équilibre chimique dynamique

avec les autres formes du contaminant, à des niveaux de concentration très faibles. C’est cette

fraction labile qui présente un intérêt dans l’étude de l’impact de la contamination chimique de

l’eau sur les organismes.

1.3. Micro-contaminants présents dans la colonne d'eau

La contamination de l'eau par les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les

métaux lourds est caractéristique de la pollution urbaine du bassin de la Seine qu’elle parvienne à


- 9 -

la rivière par voie atmosphérique, par ruissellement ou rejet direct. L'évaluation de la

contamination chimique du milieu aquatique repose sur deux types d'échantillonnage.

Premièrement, l'échantillonnage ponctuel qui consiste à prélever l'eau à un instant t. Ce type de

prélèvement permet d’étudier d’une part les contaminants en phase dissoute et d’autre part les

contaminants adsorbés sur les particules. Ce type d'échantillonnage ne permet pas le suivi dans le

temps de la contamination chimique du milieu et ne permet pas d'observer des évènements de

contamination très ponctuels. Deuxièmement, l'échantillonnage intégratif, consiste à immerger

des échantillonneurs passifs sur une période de temps donnée (de plusieurs jours à plusieurs

mois) qui sont ensuite retirés pour analyse chimique. Ce type d'échantillonnage intègre la

contamination sur l’ensemble de cette période, et permet de ne doser que les composés présents

sous la forme dissoute et libre contenus dans la phase dissoute, réputés biodisponibles et

potentiellement contaminants pour les organismes.

1.3.1. Micro-contamination organique

Contrairement aux métaux qui sont naturellement présents dans la croûte terrestre, de

nombreux contaminants organiques, aussi appelés xénobiotiques (molécules étrangères aux êtres

vivants), sont uniquement issus de processus de synthèse chimique. Le groupe des micropolluants

organiques est composé de plusieurs familles de molécules parmi lesquelles on retrouve les

Polychlorobiphényles (PCB), les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP), les pesticides

organochlorés (DDT, atrazine), les dioxines… De par leurs caractéristiques chimiques communes

(hydrophobie, solubilité, persistance) qui leur confèrent des « traits de comportement » similaires

dans l’environnement, ces composés sont bien connus pour leur toxicité.

Ces micropolluants sont décelés dans l'environnement à de très faibles concentrations

(<1µg/L), très inférieures à celles générant des effets toxiques immédiats sur les êtres vivants.

Cependant, il existe une suspicion d'effets cancérigènes, mutagènes, tératogènes et perturbateurs

endocriniens chez les organismes aquatiques qui sont exposés de manière continue à des

mélanges de contaminants. La diversité, la quantité, la mobilité, la persistance et la toxicité de ces

composés rendent difficile leur détection et la prédiction de leurs effets sur les êtres vivants et

l'ensemble de l'écosystème.

Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) sont une famille de composés

chimiques constitués d'atomes de carbone et d'hydrogène, dont la structure des molécules


- 10 -

comprend au moins deux cycles aromatiques fusionnés. Les molécules sont planes, rigides et non

polaires. La famille des HAP regroupe de nombreuses substances qui diffèrent entre elles par leur

nombre de cycles benzéniques et leurs positions respectives. La Figure 3 présente les seize HAP

principalement étudiés et recherchés dans l’environnement car déclarés comme substances

prioritaires par l’Environmental Protection Agency américaine (US EPA).

Dans l’environnement, les HAP sont majoritairement issus des activités humaines. Les

HAP d’origine pyrolytique sont formés et émis lors de la combustion incomplète de n’importe

quelle matière organique dont le bois et les matières fossiles (essence, fuel, charbon).

Figure 3 : Les 16 HAP prioritaires définis par l’US-EPA

(HAP entourés : 6 HAP cancérogènes)

1.3.1.1. Niveaux de contamination actuels en HAP dans la Seine

Des données de HAP ont pu être acquises dans une carotte de sédiments échantillonnée à

l’aval du bassin de la Seine, à proximité de Poses. Elle a pu être datée et les profils d’HAP

montrent un pic (90mg/kg de matière en suspension) vers 1960, cohérent avec l’utilisation de

charbon en France (Chevreuil et al., 2009). Ce profil témoigne également des progrès significatifs

accomplis au cours des trois dernières décennies. En effet, à partir de 1980 les teneurs sont

beaucoup plus faibles (5mg/kg de matière en suspension).


- 11 -

La comparaison des teneurs en HAP mesurées sur deux stations avant et après

l’agglomération parisienne : Saint-Jean-les-deux-Jumeaux à l’amont de Meaux sur la Marne, et

Andrésy à l’aval de la station de traitement des eaux usées Seine-Aval en Seine, confirme que les

différences amont/aval sont relativement faibles (Figure 4). Elles sont plus fortes pour les HAP

les plus légers, mais ne dépassent par un facteur 2 à 3 selon les dates.

Figure 4 : Teneurs en HAP dissous à 8 dates réparties au cours de l’année 2005. Saint-Jean-de-deux-Jumeaux (en Marne, à l’amont de Meaux) et à Andrésy (Seine).

1.3.1.2. Bioaccumulation et toxicité des HAP envers les organismes aquatiques

Le caractère hydrophobe des HAP, lié à leurs noyaux aromatiques, favorise leur

accumulation dans les tissus lipidiques des organismes vivants. Une partie des HAPs

bioaccumulés peut être éliminée après leur biotransformation qui les rend hydrophiles et facilite

leur élimination. Les mollusques ont une capacité à biotransformer les HAP inférieure aux

vertébrés (Mitchelmore et al., 1998). La transformation des composés organiques se fait

généralement en deux phases. La phase I, dite de fonctionnalisation, augmente le caractère polaire

des molécules par des réactions d’oxydation (formation d’époxyde et de diols). A l’issue de cette

première phase, le composé formé peut être plus toxique que le composé initial. La phase II, dite

de conjugaison, correspond à l’association des molécules à l’acide glucuronique, un groupement

glutathion ou sulfate permettant leur élimination. La phase I comprend une famille d’enzymes

appelée cytochrome P450, dont l’isoforme P450IA présente une spécificité pour les HAP

(Benson and Di Giulio 1992). Les systèmes enzymatiques de type P450 produisent des radicaux

oxydants qui peuvent s’attaquer à d’autres molécules dans la cellule, ce qui constitue un premier

danger. Les métabolites oxydés et polaires peuvent ensuite être évacués par différents

mécanismes. La phase II fait également intervenir plusieurs enzymes, comme la glutathion-S-

transférase (GST), l’uridine diphosphate glucuronosyltransférase (UDPGT) et la sulfotransférase.


- 12 -

Etant donné l’affinité des systèmes enzymatiques de phase I et II pour les composés organiques,

leur utilisation a été proposée comme biomarqueur d’exposition ou de défense. Ce sont surtout

les enzymes de phase I (Cytochrome P450) qui sont les plus utilisées (Amiard-Triquet et al., 1999;

Wong et al., 2000).

Toxicité du BaP

Les métabolites polaires de certains HAP, tel que le BaP, peuvent interagir avec des

molécules très importantes dans les cellules comme l’ADN. On observe alors la formation

d’adduits sur l’ADN, ce qui peut aboutir à des mutations et, à terme, au développement de

cancers. Les adduits commencent à se former lorsque le système d’évacuation des métabolites est

dépassé par une quantité trop importante de HAP et la formation d'un trop grand nombre de

métabolites. Binelli et al. (2008) a d’ailleurs observé la capacité rapide de la dreissène à

transformer le BaP en métabolite actif par une rapide augmentation du taux de cassures à l’ADN

(0,1 ; 2 ; 10µg/L). Siu et al. (2004) a également observé un effet dose-réponse du taux de cassures

à l’ADN sur les hémocytes de la moule Perna vidis (0,3 ; 3 ; 30µg/L). Lors de l’étape de

transformation du BaP, il peut y avoir formation d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pouvant

aussi altérer l’ADN. Akcha et al. (2000) ont observé une oxydation de l’ADN sur Mytilus

galloprovincialis ainsi qu’une réparation de ces lésions.

1.3.2. Micro-contamination métallique

Les métaux présents dans le milieu aquatique peuvent être issus de l'altération chimique et

de l'érosion mécanique des roches superficielles ou des apports atmosphériques d'aérosols

naturels. La présence des métaux dans le bassin de la Seine provient dès le XIXème siècle des

usines mais également de l’usage et du recyclage de matériaux contenant des métaux (piles en Ni

et Cd, accumulateurs en Pb …), et des métaux utilisés dans les constructions (canalisations en Pb,

encres et peintures à base de Cd, toitures en Zn et tubes en Cu). Les rejets liquides et les déchets

solides sont traités et mis en décharges sécurisées. Le rendement épuratoire des métaux est

d’environ 50% (Pereira-Ramos and Carru 1988), du fait de leur caractère non biodégradable.

1.3.2.1. Contamination métallique actuelle dans le bassin de la Seine


- 13 -

Tusseau-Vuillemin et al. (2007) ont réalisé l’étude de la contamination de la Seine par la

mesure des métaux totaux, dissous et labiles (Figure 5). Les mesures de la contamination

chimique ont été réalisées par des échantillonnages directs par prélèvement d’eau, pour mesurer la

fraction de métaux totaux dissous, et par la technique des DGT, pour une mesure des métaux

dissous plus intégrative dans le temps. Ces résultats montrent que la contamination chimique des

métaux augmente progressivement de l’amont vers l’aval et reflète probablement l’accumulation

des décharges issues des eaux usées industrielles et domestiques et des eaux usées traitées, ainsi

que du ruissellement diffus de l’eau.

Figure 5 : Concentrations médianes (µg/l) en cadmium, cuivre, cobalt et nickel dissous totaux et labiles en amont et aval de Paris Concentrations en métaux totaux dissous obtenues après filtration (barres oranges) et labiles obtenus par DGT (barres rouges), mesurées sur plusieurs semaines sur 6 sites du bassin de la Seine. Les barres verticales noires représentent la variabilité temporelle entre 2002 et 2004. Les lignes horizontales vertes montrent que le cuivre et le cobalt sont parfois supérieurs aux normes de qualité environnementales. Amont de Paris: Theil: bassin forestier ; Guérard: bassin agricole, forestier et domestique ; Meaux et Saint-Maurice: bassin agricole et impacté par l’urbanisation. Aval de Paris: Chatou: zone industrielle ; Andrésy: aval de la décharge d’effluents de la station d’épuration Seine-Aval.

1.3.2.2. Toxicité des métaux

Certains métaux rencontrés dans l'environnement sont considérés comme des éléments

essentiels à la vie (fer, cuivre, zinc …), mais peuvent s'avérer toxiques aux trop fortes

concentrations. Les métaux non essentiels ne possèdent aucun rôle biologique connu et sont


- 14 -

considérés comme toxiques dès qu'ils sont présents dans l’environnement, entraînant des effets

biologiques délétères pour les organismes à de très faibles concentrations (mercure, argent,

cadmium et plomb) (Mason and Jenkins 1995). Parmi les métaux retrouvés dans l'environnement,

les métaux lourds tels que le cadmium, le chrome VI, le cuivre, le mercure, le nickel et le zinc

sont connus pour être potentiellement génotoxiques (Tableau I), mais seule la mutagénicité du

chrome VI a clairement été démontrée (Itoh and Shimada 1997). Il induit des cassures simples

brins et des pontages protéine-ADN (Witmer et al., 1989). Les autres métaux pourraient agir de

façon indirecte par l'intermédiaire de la production d'espèce réactives de l'oxygène (ROS) ou

encore par l'inhibition des systèmes de réparation de l'ADN (ex du cadmium).

Test d'Ames SOS Chromotest Règlementation

Chrome + + US-EPA

Cadmium - + DCE, OSPAR, US-EPA

Cuivre - + US-EPA

Mercure - + DCE, OSPAR, US-EPA

Nickel - + DCE, US-EPA

Zinc - + US-EPA

(+) positif au test (-) négatif au test

Tableau I : Liste des principaux métaux à activité génotoxique testés par les tests d'Ames

et Chromotest sans activation métabolique

Toxicité du cadmium

Le cadmium (Cd) étant un élément toxique largement répandu dans l’environnement,

nous l’avons choisi comme métal représentatif de la contamination urbaine du bassin de la Seine.

Aucune fonction biologique de ce métal n’est connue et il tend à être un cation divalent

relativement stable dans les organismes. Les mécanismes de génotoxicité de ce métal restent

encore flous, mais plusieurs hypothèses sont avancées. Le Cd pourrait produire des dommages à

l’ADN en créant des cassures simple brin (Hassoun and Stohs 1996) si les concentrations en Cd

sont très importantes (40µM) (Ochi and Ohsawa 1983; Misra et al., 1998), ou indirectement par la

production de radicaux libre (Zhong et al., 1990), l’inhibition des enzymes de réparation de

l’ADN (Hartwig 1998) ou par la réduction du taux de glutathion (Shimizu et al., 1997). L’effet du

Cd sur l’intégrité nucléaire et la réparation de l’ADN des cellules de branchies de Mytilus edulis a

été étudié et montre l’inhibition des deux mécanismes majeurs de défense qui sont l’apoptose et

des systèmes de réparation de l’ADN (Pruski and Dixon 2002). La production de ROS a été mise


- 15 -

en évidence sur Mytilus edulis par Emmanouil et al. (2007), chez Mytilus galloprovincialis par Gomez-

Mendikute et Cajaraville (2003) et chez Dressiena polymorpha par Vincent-Hubert et al. (2011).

2. Utilisation des biomarqueurs pour l'évaluation de la qualité biologique du

milieu aquatique

La recherche des polluants présents dans l’environnement aquatique ne peut pas être

exhaustive compte tenu de la grande diversité des polluants. Les recherches sur les biomarqueurs,

se sont développées depuis ces vingt dernières années dans le but d'étudier les changements au

niveau du comportement, de la physiologie, de la biochimique, de l'intégrité structurelle de

l'ADN, de l'expression et de la structure génomique chez les organismes aquatiques. Ces

biomarqueurs constituent un indicateur précoce des perturbations induites par la contamination

environnementale au sein de populations. L’approche écotoxicologique basée sur les

biomarqueurs mesurés sur les individus relie le fait que des changements apparaissent aux faibles

niveaux de l’organisation biologique avant d’affecter la communauté. Parmi les effets induits par

les activités anthropiques et/ou les paramètres environnementaux observés au niveau des

organismes, on retrouve les perturbations endocriniennes, les effets neurotoxiques, génotoxiques,

reprotoxiques, immunotoxiques, etc (Figure 6). Parmi ces différentes classes d’effets, plusieurs

biomarqueurs peuvent être mesurés et sont représentés dans le Tableau II. L’induction de

cassures de l’ADN, la formation d’adduits ou de micronoyaux témoignent d’un effet

génotoxique. Les variations des niveaux d’acétylcholinestérase (AchE) sont des marqueurs

d’effets neurotoxiques.


- 16 -

Figure 6 : Schéma de synthèse des effets écotoxicologiques (Poisson et al., 2011)

Tableau II : Exemples de biomarqueurs (poissons, invertébrés et péryphiton).


- 17 -

2.1. Définition et description des biomarqueurs

Les biomarqueurs sont des paramètres biologiques mesurant le comportement, la

physiologie, la biochimie, l’intégrité cellulaire, l’expression et la structure génomique des

organismes (Lagadic et al., 1997). Ils sont des indicateurs soit du statut normal, soit de

changements au sein des individus d’une population étudiée.

2.1.1. Les biomarqueurs d’exposition aux polluants chimiques

Parmi les biomarqueurs, on distingue les biomarqueurs d’exposition (Tableau III). Parmi

ces derniers, l’induction de la synthèse des métallothionéines, protéines soufrées de faible poids

moléculaire capables de fixer les ions métalliques, est typique de la pollution métallique (Hamer

1986). L’induction de ces métallothionéines correspond à un mécanisme adaptatif détoxifiant,

induisant la liaison de ces protéines aux métaux lourds et les empêchant ainsi d’interférer avec les

enzymes dont ils perturberaient l’activité. Les dommages à l’ADN, tels que les cassures de brins

ou la formation d’adduits à l’ADN et de micronoyaux constituent eux aussi des biomarqueurs

d’exposition. Ainsi, l’induction ou l’inhibition des protéines de transport membranaire permettant

de transporter les métabolites ou les xénobiotiques est un biomarqueur d’exposition.

2.1.2. Biomarqueurs d’effets

Les biomarqueurs d’effets diagnostiquent un dépassement, pouvant être transitoire, des

capacités de régulation de l’organisme entraînant des conséquences sur la viabilité (cellules, tissu,

individu). Quelques exemples sont présentés dans le Tableau III. Parmi les biomarqueurs d’effet,

on retrouve les dommages à l’ADN résultant de l’effet génotoxique de certains contaminants, la

diminution de la stabilité membranaire ou encore l’induction ou l’inhibition des enzymes

antioxydantes.


- 18 -

Tableau III : Biomarqueurs biochimiques et cellulaires courants en écotoxicologie pour

une recherche d'exposition et/ou d'effet. (Vasseur and Cossu-Leguille 2003)

2.2. Utilisation d’espèces sentinelles en biomonitoring

Les tests de toxicité réalisés en laboratoire ne prennent pas en compte l’influence des

multiples paramètres de l’environnement intervenant en conditions naturelle comme par exemple

la température, les conditions d’oxygénation, les interactions entre les polluants et les facteurs du

milieu (Smolders et al., 2004). La surveillance biologique de l’environnement, ou

« biomonitoring », a pour objectif d’intégrer l'ensemble de ces paramètres en utilisant les espèces

sentinelles comme outil et de fournir des informations complètes sur les effets de la

contamination chimique du milieu.


- 19 -

Les espèces sentinelles:

Les organismes sentinelles prélevés dans un milieu doivent être représentatifs de ce milieu

et remplir plusieurs conditions pour pouvoir refléter les effets d’une exposition de faible intensité

mais sur une longue période. Une espèce sentinelle doit ainsi être sédentaire sur la zone d’étude

afin que les biomarqueurs étudiés soient directement corrélés avec le niveau de pollution du site.

La taille de la population doit être suffisante pour éviter que les prélèvements réguliers

n’impactent la structure et la densité de la population. Les organismes sentinelles doivent aussi

avoir une aire de dispersion large et connue permettant la comparaison des résultats entre les

sites. Afin d’étudier les effets chroniques de la contamination chimique du milieu, la longévité de

ces organismes doit être suffisamment longue, de l’ordre de plusieurs années. Ces organismes

doivent également présenter une résistance aux polluants afin que les niveaux d’expression des

biomarqueurs soient détectables. Bien que résistantes aux contaminants, les espèces sentinelles

doivent présenter une certaine sensibilité face aux contaminants afin de permettre l'établissement

de relations dose/effet. Enfin, la biologie de l’espèce doit être suffisamment connue pour

différencier le signal du bruit de fond.

3. Sources, effets et outils de détection des altérations du matériel génétique

L’ADN est le support universel de l'hérédité contenant l'information génétique des êtres

vivants. Il assure le fonctionnement cellulaire des organismes et permet à la cellule de rester

réactive aux messages de son environnement. La molécule d'ADN assurant la transmission des

informations aux générations peut transmettre des informations erronées voire "toxiques" issues

de son altération.

Les perturbations de la molécule d'ADN peuvent être provoquées par une activité

endogène, c'est-à-dire propre à l'organisme, ou par un agent exogène. L'activité endogène, liée

aux activités cellulaires, peut conduire à une mauvaise incorporation de bases, des dépurinations

et des dépyrimidations qui correspondent à des pertes de bases par hydrolyse de la liaison β-N-

glycosidique, conduisant à des changements de séquences si la réparation est incorrecte, des

désaminations ou des erreurs de méthylation. Les effets induits par les agents exogènes

conduisent à des mésappariements ou à la perte de matériel génétique (liaisons covalentes

entrainant des dimères de thymine, addition de molécules exogènes formant des adduits,

production de lésions oxydatives, cassures simple/double brin, désamination et élimination de

bases, pontages covalents entre chaînes appariées).


- 20 -

Les contaminants présents dans l'environnement présentent un intérêt d'étude particulier car

ils peuvent interagir directement ou indirectement avec le matériel génétique et ainsi conduire à la

transmission d'informations incorrectes pouvant entrainer des perturbations à plusieurs niveaux

tels que le cycle cellulaire, la croissance et la différenciation.

3.1. Sources de génotoxiques

Les composés génotoxiques sont par définition des agents physiques ou chimiques capables

d'induire des modifications génétiques dans les cellules vivantes (Wurgler and Kramers 1992) de

manière directe ou indirecte (par l'intermédiaire de métabolites). Les dommages à l'ADN peuvent

avoir plusieurs origines (Figure 7):

– Radiations ionisantes : au contact du milieu biologique les photons issus des radiations

peuvent interagir avec les noyaux mais surtout avec les électrons des atomes du milieu, en leur

cédant une partie de leur énergie. Lorsque le photon ou l’électron libéré secondairement transfère

toute ou une partie de son énergie à un atome appartenant à une macromolécule organique de la

cellule (protéines, lipides, sucres, acides nucléiques…), celle-ci passe par un phénomène

d’excitation ou d’ionisation. Les rayonnements de haute énergie et la radioactivité naturelle de la

terre ou de source anthropique provoquent la formation de molécules excitées et ionisées

entraînant des dommages, directs ou indirects, à l’ADN à l'origine de cassures double brin

(Frankenberg-Schwager 1990).

– Rayonnements ultraviolets : les photoproduits issus des rayonnements ultra-violet (UV) sont

principalement des liaisons covalentes entre des pyrimidines adjacentes, mais aussi des liaisons

entre les protéines d'ADN (Love et al., 1986). Les UV-C et UV-B induisent la dimérisation des

bases pyrimidiques (T, C) qui sont des lésions très létales et mutagènes (Ravanat et al., 2001).

- Composés chimiques : Certains composés chimiques présents dans le milieu aquatiques

peuvent avoir des effets génotoxiques. Citons par exemple les HAP qui induisent des adduits à

l'ADN, les métaux qui induisent de manière générale des cassures de brin de l'ADN ainsi que des

pontages protéine-ADN. Le Cd est aussi capable d'induire des oxydations de l'ADN par une

induction de la production d'espèces radicalaires.


- 21 -

Figure 7 : Principaux types de dommages à l'ADN causés par des agents exogènes ou

endogènes, ainsi que les voies de réparations associées (d'après (Hoeijmakers 2001))

3.2. Dommages de l'ADN

Les lésions de l'ADN sont classées par catégories de dommages (Figure 8). On retrouve

les lésions primaires, représentant le premier stade suivant l’action d’un agent génotoxique. Ces

lésions correspondent aux adduits de l'ADN, aux pontages et aux cassures simple brin. Ensuite,

on retrouve les mutations géniques telles que les additions, les délétions ou substitutions de bases

induites par les composés mutagènes. La dernière catégorie rassemble les dommages

chromosomiques. On retrouve ensuite des mutations chromosomiques dites qualitatives, qui

vont modifier les chromosomes dans leur structure par des cassures double brin, des

réarrangements ou des translocations. Ces effets sont dits clastogènes contrairement aux effets

aneugènes induisant des erreurs de répartition de chromosomes entiers lors des divisions


- 22 -

cellulaires. Ces erreurs résultent de l’absence des kinétochores, des centrosomes, de la tubuline ou

de la lamina.

Figure 8 : Diversité des altérations de l’ADN en termes de lésions et de mutations

(Orsière et al., 2005)

3.2.1. Cassures simple et double brin de l'ADN

La cassure simple brin de l'ADN, représentée sur la Figure 7, résulte de la rupture sucre-

phosphate générée directement par les agents endommageant l’ADN. Ce type de lésion est

réparée grâce aux enzymes de la voie de réparation par excision de bases (BER) qui reconstituent

le brin lésé à partir du brin opposé qui sert de matrice (Figure 21, voir le paragraphe 4.4.1.2.).

La cassure double brin correspond à une cassure des deux brins de la molécule d'ADN à

la même position ou bien à des positions très proches. Ces lésions peuvent être induites par de

nombreux facteurs (radicaux libres, peroxydes) ou des radiations comme les rayons gamma et les

rayons X. Les cassures double brin sont considérées comme la forme la plus toxique des

dommages de l’ADN. Difficiles à réparer, elles sont cytotoxiques et peuvent être à l’origine de

mutations et de mort cellulaire. Elles peuvent également entraîner la perte de fragments d’ADN

et provoquer ainsi, au cours du processus de réparation, l’appariement de chromosomes

non homologues conduisant à la perte ou à l’amplification des chromosomes.

Les pathologies associées aux cassures de brins de l'ADN sont le vieillissement cellulaire

et les maladies neurodégénératives (Toyokuni et al., 1997; Katyal and McKinnon 2008; Kumari et

al., 2008).

3.2.2. Les adduits encombrants de l'ADN


- 23 -

Les adduits encombrants de l'ADN résultent de la liaison covalente d'un métabolite sur

un nucléotide (Pfohl-Leszkowicz A. 1994; Guengerich 2001; Wogan et al., 2004; Jeffrey and

Williams 2005). Les groupements nucléophiles de l’ADN constituent les sites privilégiés d'action

des composés génotoxiques. Certains agents mutagènes, tels que les HAP et les amines

aromatiques sont capables de réaliser ce type de lésion. La grande taille des adduits entraîne une

modification de la structure spatiale de l'ADN, provocant au voisinage de l'adduit une

perturbation de la reconnaissance par l'ADN polymérase impliquée dans le processus de

réplication.

La présence d'adduits est souvent impliquée dans l'initiation de la cancérogénèse (Reddy

and Randerath 1987).

3.2.3. Les oxydations de l'ADN

3.2.3.1. Induction des dommages oxydatifs par les ROS

L'oxygène moléculaire est indispensable au fonctionnement cellulaire mais il est aussi

source de ROS telles que le peroxyde d'hydrogène, le radical superoxyde, l'oxygène singulet,

l'oxyde nitrique et le peroxynitrite. Ces ROS sont formées de manière continue dans les cellules

des organismes vivant en aérobie, lors des processus physiologiques, métaboliques et lors des

réactions biochimiques. Le stress oxydant se définit dans l'organisme comme étant le résultat d’un

déséquilibre dans la balance entre les ROS et les systèmes de défense antioxydants en faveur des

ROS, avec pour conséquence l’apparition de dégâts pour la cellule. Ces dommages sont le résultat

de l'oxydation des macromolécules telles que l'ADN, les protéines et les lipides.

La molécule d'oxygène est à l'état fondamental un biradical puisqu'elle comporte deux

électrons célibataires de spins parallèles sur son orbitale externe. Cette configuration lui confère

une très grande stabilité et prévient l'addition directe d'une paire d'électrons. Sous réserve d'un

apport d'énergie suffisant, la molécule d'oxygène peut acquérir un électron supplémentaire par

appariement avec l'un de ses électrons célibataires. Cette réduction monovalente de l'oxygène se

produit dans les mitochondries et aboutit à la génération d'une espèce radicalaire simple, le radical

superoxyde (O2●−). Celui-ci peut, en présence d'ions hydrogène H+, céder son électron libre à une

autre molécule d'O●−2 et donner ainsi naissance au peroxyde d'hydrogène (ou eau oxygénée,

H2O2). Ce dernier ne possédant pas d'électron célibataire n'est pas un radical libre mais en

présence de fer, métal essentiel présent dans les cellules du vivant, il peut se décomposer par la


- 24 -

réaction de Fenton et donner naissance à un radical hydroxyle ●OH. Le radical hydroxyle peut

aussi se former par la réaction d'Haber-Weiss (Figure 9). Ce radical hydroxyle est extrêmement

réactif et toxique envers la plupart des structures organiques, engendrant des lésions qui

contribuent au vieillissement cellulaire (Zahn et al., 1987) et au cancer (Kasai 1997).

Les oxydations de l'ADN sont associées au vieillissement cellulaire (Harman 1956) et peuvent

même réduire la fertilité masculine (Shen and Ong 2000). L'oxydation de l'ADN est aussi associée

à des maladies telles que les hépatites et la maladie d'Alzheimer, d'Huntington et de Parkinson

(Cooke et al., 2003), ainsi qu’à des maladies auto-immunes et des lésions de l'aorte (Olinski et al.,

2002).

Figure 9 : Schéma des différentes formes de ROS


- 25 -

3.2.3.2. Oxydation de la Guanine

La Guanine est le site privilégié de nombreux oxydants (Cadet et al., 1999) du fait de son faible

potentiel hydrogène. Le site Carbone 8 de la guanine est le plus facilement oxydable (Steenken

and Jovanovic 1997) et correspond donc à la première cible de la modification oxydative (Cadet et

al., 2002), conduisant à la formation de la lésion 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG)

(Figure 10). La lésion 8-oxodG est considérée comme une lésion pré-mutagène et correspond à

un marqueur d'oxydation (Floyd et al., 1986; Kasai et al., 1986).

Figure 10 : Formation de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) et formation de la transversion G vers T

Lors de la réplication de l'ADN, la guanosine oxydée tourne parfois sur le squelette sucre-

phosphate, présentant l'azote en position 7 pour la liaison avec la base complémentaire de l'autre

brin. Cet arrangement imitant la thymine, provoque l'insertion de l'adénosine à la place de la

cytosine dans le brin complémentaire (Figure 11). Dans un cycle ultérieur de réplication de

l'ADN, la thymine est placée dans le brin qui est produit à partir du modèle contenant l'adénosine

conduisant à une transversion (passage d'une base purique à une base pyrimidique) de G vers T.


- 26 -

Figure 11 : Liaison de la 8-oxodG à la cytosine ou à l'adénine

Cette substitution de pyrimidine par une purine peut avoir trois types d'effets induisant des

mutations : silencieuses, faux-sens ou non-sens. La mutation silencieuse ne modifie pas la

séquence d'une protéine grâce à la redondance du code génétique ou parce que la mutation

touche une région non codante de l'ADN, ou un intron. Cette mutation n'a aucune conséquence

sur le phénotype car le nouveau triplet code le même acide aminé que le triplet original. La

mutation faux-sens est une mutation ponctuelle se traduisant par le changement d'un nucléotide

par un autre. Cette modification de nucléotide entraîne une modification de l'acide aminé codé

ayant une répercussion en termes de fonction de la protéine produite par le gène. Enfin, la

mutation non-sens correspond au changement d'un nucléotide provocant le remplacement d'un

codon spécifiant un acide aminé par un codon stop. Cela entraîne la production d'une protéine

tronquée.

3.2.4. Les Micronoyaux

L'exposition à certains agents génotoxiques peut induire des cassures chromosomiques ou un

dysfonctionnement du fuseau mitotique, qui est normalement impliqué dans la répartition du

matériel génétique de la cellule mère, de façon égalitaire entre les deux cellules filles, au moment

de la transition entre la métaphase et l'anaphase de la mitose. Ce dysfonctionnement ou la perte

d'un fragment de chromosomes entraînent la formation de micronoyaux (Figure 12).


- 27 -

Les micronoyaux sont associés aux cancers (Liou et al., 1999) et aux maladies

neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer et de Parkinson ainsi que dans le

vieillissement cellulaire (Migliore et al., 2011)

Figure 12 : Schéma de formation des micronoyaux (Fenech 1997)


- 28 -

4. Biomarqueurs de génotoxicité adaptés aux organismes aquatiques

Depuis le début des années 1980, l'étude de la génotoxicité du milieu aquatique s'est

développée suite à l'observation d'une part (i) de cancers dans des populations de poissons ou de

mollusques en milieu marin ou d’eau douce (Mix 1986; Black and Baumann 1991; Wolowicz et al.,

2005), et d'autre part (ii) à la persistance de composés chimiques ayant des propriétés mutagènes

et cancérigènes. Les biomarqueurs de génotoxicité présentent un intérêt dans les études d'impact

de la contamination du milieu aquatique, sur des espèces sentinelles en milieu marin (Parry et al.,

1976) et en eau douce (Prein et al., 1978; Alink et al., 1980). L'étude des dommages à l’ADN a été

proposée comme étant un outil adapté à l’évaluation des propriétés génotoxiques des polluants

environnementaux et à la détection de leur présence dans le milieu naturel (Hebert and Luiker

1996; Nunn et al., 1996; Shugart 2000).

On peut citer quelques travaux ayant montré l'intérêt de biomarqueurs de génotoxicité.

Certains auteurs suggèrent que la détection de mutations dans la séquence des gènes promoteurs

ou suppresseurs de tumeurs d'organismes aquatiques issus de milieux pollués par des HAPs

(Wirgin and Waldman 1998; Vincent-Hubert 1999; Cachot et al., 2000; Vincent-Hubert 2000),

pourrait fournir un marqueur génétique sensible et précoce d’une exposition à certaines classes de

polluants génotoxiques cancérigènes (notamment les HAPs). De nombreux travaux réalisés en

milieu naturel ont souligné l'intérêt d'analyser la formation d'adduits à l'ADN en tant que

biomarqueur d'exposition à des composés génotoxiques mutagènes et cancérigènes présents dans

l’écosystème aquatique (Shugart and Theodorakis 1994; Stein et al., 1994; Livingstone et al., 2000;

Shugart 2000). De même, les cassures simple et double brins de l’ADN constituent un outil

adapté au biomonitoring environnemental. Les atouts de cet outil sont l’absence de spécificité des

cassures de brin pour un génotoxique donné, la sensibilité des diverses techniques de détection et

leur application à de nombreux types cellulaires d’invertébrés et vertébrés marins et dulçaquicoles.

(Shugart 1990; Nacci et al., 1996; Devaux et al., 1998; Mitchelmore and Chipman 1998;

Livingstone et al., 2000; Shugart 2000). Flammarion et al. (2002) ont pu mettre en évidence une

corrélation entre le niveau de cassures à l’ADN de chevaines (Leuciscus cephalus) capturés dans la

Moselle et la concentration en BaP dans les sédiments des sites étudiés. Rajaguru et al. (2003)

observent un fort taux de cassures à l’ADN chez des carpes exposées aux échantillons d’eau

prélevés en aval des rejets urbains et industriels (essentiellement d’industries textiles et de

tanneries) alors que les prélèvements d’eau les plus éloignés des sources de la contamination

induisent un taux plus faible de lésions génétiques. Le potentiel mutagène et génotoxique du


- 29 -

milieu aquatique peut aussi être évalué in vitro par l’utilisation de test bactériens tels que les tests

d’Ames, Umu et SOS chromotest (Houk 1992; White et al., 1996; Claxton et al., 1998).

4.1. Le test comète

4.1.1. Historique et principe du test

Les premiers dommages à l'ADN ont été observés en 1978 (Rydberg and Johanson 1978) sur

cellules de mammifères lysées et incluses dans l'agarose. Par marquage à l'acridine orange, les

dommages double brin à l'ADN ont été mesurés à l'aide d'un photomètre en rapportant la

quantité d'ADN double brin (fluorescent en vert) à la quantité d'ADN simple brin (fluorescent en

orange).

C'est en 1984, que le premier test comète impliquant une électrophorèse sur microgel en

condition neutre fut développé (Ostling and Johanson 1984). Ce test est basé sur le principe de la

charge négative portée par l'ADN qui, sous influence du courant de migration, se déplace vers

l'anode. Durant l’électrophorèse, la présence de cassures permet à l'ADN de migrer et le noyau

prend donc la forme d'une comète. On distingue une partie contenant de l'ADN non

endommagé, appelée tête de la comète et une partie plus allongée, contenant l'ADN fragmenté

ayant migré, constituant la queue de la comète (Figure 13).

Figure 13 : Photo de noyaux endommagés et d'un noyau non endommagé

En 1988, le développement de la méthode à pH alcalin (pH>13) a permis la détection des

cassures simple brin, double brins, ainsi que des sites alcali-labiles (Singh et al., 1988)

contrairement au pH neutre qui ne permet de détecter que les cassures double brin. C'est la

méthode alcaline du test qui est maintenant utilisée dans les études de génotoxicité. Le principe

du test comète est illustré sur la Figure 14.


- 30 -

Figure 14 : Etapes du test Comète en condition alcaline Les cellules isolées sont incluses dans de l'agarose et déposées sur lame de microscope préalablement recouverte d'un gel d'agarose. L'étape suivante constitue la lyse des organites cellulaires et des membranes cellulaire et nucléaire. Le déroulement de l'ADN se fait par rupture des liaisons hydrogènes. La migration de l'ADN se fait sous un champ électrique. Les lames sont ensuite neutralisées à pH7, puis déshydratées afin de les conserver jusqu'à leur observation. Après coloration au Bromure d'EThidium (BET), les noyaux fluorescents sont observés au microscope à fluorescence relié à un logiciel permettant de quantifier l'ADN présent dans la queue de la comète par rapport à la quantité présente dans la tête de la comète.

Les résultats du test comète peuvent être exprimés de plusieurs manières: la distance de

migration de l’ADN, l'intensité de fluorescence de la tête et la queue de la comète ainsi que la

distance entre le centre de gravité de chacune d'elle. Parmi les paramètres les plus utilisés, on

retrouve le tail DNA qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la comète, le Tail

Moment, et l'Olive Tail Moment qui correspond au pourcentage d'ADN dans la queue de la

comète multiplié par la distance séparant les centres de la queue et de la tête (Figure 15).

Figure 15 : Paramètres de quantification des dommages à l'ADN


- 31 -

4.1.2. Applications, avantages et limites du test comète

Ce test est utilisé en recherche fondamentale afin d'étudier la réparation de l'ADN (Collins

2004), les mécanismes de génotoxicité (Hartmann et al., 2004) ou appliquée dans de recherche en

biomonitoring chez l'Homme (Kopjar and Garaj-Vrhovac 2001) et les animaux (Mitchelmore et

al., 1998; Pavlica et al., 2001; Dixon et al., 2002; Akcha et al., 2004; Frenzilli et al., 2004; Frenzilli et

al., 2009). Ce test possède l'avantage de pouvoir être appliqué sur n'importe quel type de cellule

eucaryote d'organisme exposé à un environnement génotoxique (Collins et al., 1997; Cotelle and

Férard 1999; Dixon et al., 2002; Dhawan et al., 2009), sans avoir besoin de connaitre son

caryotype. Il s'effectue sur un nombre de cellules relativement faible (environ 1000 cellules par

lame). Ce test est moins coûteux que d'autres méthodes telles que les aberrations

chromosomiques et l'échange de chromatides sœurs (Dhawan et al., 2009).

Ce test de génotoxicité nécessite un travail de rigueur en l'absence de lumière afin d'éviter la

création de cassures supplémentaires induites par les rayons lumineux, pouvant provoquer un

biais dans les résultats. La principale précaution méthodologique de ce test est l'étape de

dissection des tissus (branchies, glande digestives,…) ou la dissociation cellulaire provocant

d'éventuelles altérations supplémentaires de l'ADN et entraînant un biais de la mesure par une

augmentation du taux de cassures à l’ADN. La validation préalable de la technique de dissociation

permet d'écarter ce biais.

Une limite de ce test est l'absence de standardisation du protocole et de l'expression du taux

de cassures à l'ADN, rendant difficile la comparaison des résultats entre les laboratoires.

Cependant, des efforts ont été faits dans le but de définir une standardisation du test. Des études

ont observé des différences significatives inter-laboratoires pouvant provenir des différences de

temps de dénaturation de l'ADN (20 à 40min), du voltage lors de la migration (0,76 à 1,6V/cm),

du temps d'électrophorèse (20 à 30min) ou encore du courant (260 à 300mA) (Azqueta et al., ;

Forchhammer et al., ). Ces études ont établi la liste des paramètres pouvant induire des variations

et proposé une optimisation du test. Cependant le protocole doit être adapté à chaque type

cellulaire.

4.1.3. Test comète modifié

Le test comète a été modifié afin de détecter des lésions oxydatives. Après l'étape de lyse

cellulaire, les lames sont incubées avec des ADN-glycosylases telles que formamidopyrimidine


- 32 -

DNA glycosylase (Fpg) et endonucléase III (Endo III), de façon à créer des cassures

supplémentaires spécifiques de certaines lésions (Figure 16). La formamidopyrimidine DNA-

glycosylase (Fpg), une enzyme extraite d'Escherischia coli, est impliquée dans la voie de réparation

de l'ADN par excision de bases. L'enzyme Fpg est spécifique des purines oxydées telles que 8-

oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) (Gedik et al., 2005), 2,6- diamino-4-hydroxy-5-

formamidopyrimidine (FaPyGua), 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FaPyAde) et d'autres

purines à cycle ouvert (Dušinská and Collins 1996; Karakaya et al., 1997). L'enzyme endo III

reconnait les pyrimidines oxydées incluant la thymine glycol et l'uracile glycol (Collins et al., 1993;

Dizdaroglu 2005).

Le couplage du test comète avec ces endonucléases (Fpg ou Endo III) permet de créer des

cassures supplémentaires au niveau des bases oxydées, augmentant la sensibilité du test en le

rendant plus informatif. Cette augmentation du taux de dommages à l'ADN est due aux coupures

créées par les endonucléases, au niveau des bases puriques et pyrimidiques oxydées (ESCODD

2003). Cependant, des travaux ont démontré que le test comète couplé à Fpg détecte en plus des

bases oxydées des dommages alkylants, des sites abasiques et divers adduits de purines à cycle

ouvert (Speit et al., 2004). Il est donc nécessaire d'interpréter ces résultats avec précautions.


- 33 -

Figure 16 : Couplage du test comète avec une endonucléase (Vasseur et al., 2008) Plusieurs DNA glycosylases ont la capacité de créer des sites abasiques en cassant la liaison sucre-

phosphate, qui est ensuite réparée par des enzymes de la voie de réparation BER. Chez E. Coli,

Fpg possède entre autre une spécificité pour la lésion 8-oxodG, possédant une activité lyase dans

les étapes successives d'élimination, laissant une cassure simple brin (Bhagwat and Gerlt

1996).

La 8-oxodG est souvent utilisée comme biomarqueur d'exposition aux radiations ionisantes ou

aux UV (Spitz et al., 2004), aux métaux lourds ou à certains agents organiques chez les organismes

vertébrés supérieurs (Shen and Ong 2000; Olinski et al., 2002; Cooke et al., 2003). En revanche,

peu d’études ont été menées sur les organismes aquatiques in vitro ou in vivo. Quelques travaux ont

été réalisés sur la moule (Akcha et al., 2000; Akcha et al., 2000) et sur certaines espèces de

poissons (Akcha et al., 2003; Malins et al., 2006). Les lésions oxydatives de l'ADN sont détectées

par HPLC-ED (Floyd et al., 1986; Kasai et al., 1986), par le test comet-Fpg (Gielazyn et al., 2003)

ou par le test ELISA (Scott and Eaton 1997).


- 34 -

Plus tard, il a été démontré que l'enzyme humaine analogue de Fpg, la 8-hydroxyguanine

DNA-glycosylase humaine (hOGG1) est spécifique de la détection de la 8-oxodG (Smith et al.,

2006). Le test comet-hOGG1 a donc été mis au point sur des cellules de lymphome de souris, et

comparé aux tests comet-Fpg et Endo III. Les résultats montrent une spécificité de l'enzyme

hOGG1 face aux dommages oxydatifs. Ce test a été adapté pour la détection de dommages

oxydatifs dans les cellules de fibroblastes humains (Cooke et al., 2008) ainsi que dans les cellules

d'adénocarcinomes pulmonaires humains (Park et al., 2008). Cette dernière étude montre aussi

que le niveau de dommages oxydatifs détectés par le test comet-hOGG1 est du même ordre de

grandeur que ceux mesurés par l'analyse en spectrométrie de masse couplée à de la

chromatographie liquide à ionisation, indiquant la bonne sensibilité du test comet-hOGG1.

4.2. Détection des adduits encombrants par la méthode du post-marquage au phosphore

32 et utilisation en biomonitoring


La présence d’adduits à l'ADN a été démontrée dès 1987 par Dunn et al. (1987) dans le foie

des poissons-chats (Ictalurus nebulosus) capturés dans des effluents contaminés. Varanasi et al.

(1989) ont observé une corrélation entre le niveau d’adduits à l’ADN de foie chez une sole, le

niveau de composés aromatiques fluorescents dans la bile et le niveau de contamination des

sédiments par les HAP sur les sites de capture. Une corrélation entre le taux d'adduits à l'ADN et

la concentration en Benzo[a]pyrène dans les particules en suspension a été observée chez les flets

prélevés dans la Seine (Vincent-Hubert 1999; Beliaeff and Burgeot 2002). Plus récemment, une

étude (Akcha et al., 2003; Akcha et al., 2004) sur des limandes prélevées en Baie de Seine a mis en

évidence la présence d’adduits HAP dans l’ADN. Au cours de cette étude, des différences

qualitatives dans les profils d’adduits obtenus ont été observées en fonction de l’âge et du sexe

des individus analysés. Enfin, la persistance des adduits et leur stabilité dans le temps (plusieurs

mois chez le poisson) constituent un avantage pour leur utilisation comme biomarqueur (Sikka et

al. 1990).

La détection des adduits à l’ADN par la méthode du post-marquage au phosphore 32 est une

méthode extrêmement sensible, permettant de mettre en évidence le caractère génotoxique d’une

substance (Figure 17). Elle permet d'atteindre une sensibilité de 1 adduit par 1010 nucléotides

(Reddy and Randerath 1986). Une corrélation entre l'exposition aux HAP et l'augmentation du


- 35 -

taux d'adduits a été montrée dans différents travaux menés sur des poissons, confirmant l’intérêt

de la mesure des adduits à l'ADN (Varanasi et al., 1989; Stein et al., 1994; Ericson et al., 1999). La

détection des adduits à l'ADN est d’ailleurs recommandée par le Conseil International pour

l'Exploration de la Mer.

Figure 17 : Principe de la méthode de post-marquage au 32P de l'ADN

L’ADN est extrait et purifié, puis hydrolysé en désoxyribonucléosides 3' monophosphate par une endonucléase (nucléase de Staphylocoque) et une exonucléase (Phosphodiestérase de rate). A cette étape, le milieu réactionnel contient un mélange de nucléotides normaux et modifiés, les nucléotides modifiés étant les adduits. On procède ensuite à une étape de sélection des adduits, qui est classiquement appelée "enrichissement à la nucléase P1", qui consiste à couper le phosphate des nucléotides normaux en 3’ par l’activité 3’phosphatasique de la nucléase P1. Il s’agit d’une déphosphorylation sélective des désoxyribonucléotides normaux. La configuration structurale de l’adduit, protégeant la liaison du phosphate en 3’, permet sa conservation dans les adduits. Un marquage enzymatique spécifique des adduits est réalisé. Seuls les 3’P-nucléotides sont substrats de la polynucléotide kinase T4, qui a pour propriété de transférer un phosphate radioactif en position γ de l’ATP sur la position 5’ du nucléotide. Ainsi, seuls les adduits sont marqués. Les nucléosides normaux ne pouvant pas être phosphorylés n’interfèrent donc pas sur le marquage. La migration sur plaque de couche mince de polyéthylèneimine cellulose, dans des solvants aqueux salins, permet de séparer les nucléosides normaux et l’excès de phosphate inorganique du ou des différents adduits. Ceux-ci permettent la migration des substances hydrophiles, alors que les adduits qui sont hydrophobes, restent au point d’origine ou migrent


- 36 -

légèrement suivant leur degré d’hydrophobicité. Les adduits sont ensuite séparés par chromatographie bidimensionnelle échangeuse d’anions, sur plaque de couche mince de polyéthylèneimine cellulose. Les adduits sont visualisés par autoradiographie des plaques et quantifiés grâce au Bioimager (Figure 18).

Figure 18 : Autoradiographies des profils en adduits (d’après Châtel (2011)) Adduit issus de glandes digestives de D. polymorpha (moules exposées à 1µg/L de BaP, comparé

aux moules contrôles. Le témoin positif correspond à un extrait d'ADN de souris ayant reçu une dose de BaP).

4.2.2. Applications, avantages et limites du test

Les adduits se forment en 24-48h et représentent donc un biomarqueur précoce (Collier

and Varanasi 1991). De plus on retrouve une bonne relation entre la teneur en HAP et le taux

d’adduits chez des espèces sédentaires (Collier et al., 1993). La technique permet d’évaluer

l’impact génotoxique environnemental sans connaissance à priori de l’identité des polluants

présents. La technique est bien standardisée et la même expression du taux d’adduits à l’ADN est

utilisée pour tous les auteurs, en nanomoles d’adduits par mole de nucléotides soit en nombre

d’adduits pour 109 nucléotides. Cette même expression du taux d’adduits à l’ADN constitue un

avantage pour la comparaison entre les études, contrairement à l’expression du taux de cassures à

l’ADN par le test comète. Cependant, l’application de ce test n'est possible que dans les

laboratoires équipés pour l’utilisation des molécules radiomarquées.


- 37 -

4.3. Test micronoyaux


L’observation des micronoyaux en tant qu’indicateur de génotoxicité est apparue dans les

années 1940, mais c’est dans les années 1970 que ce test a été développé sur un grand nombre

d’organismes (Godet et al., 1993). Un micronoyau est défini dans le « Glossary of Genetics and

Cytogenetics » de Rieger (1968) comme « un petit noyau surnuméraire séparé du noyau principal

de la cellule, formé pendant la télophase mitotique ou méiotique et constitué de chromosomes

entiers ou de fragments acentriques d’ADN résultant de modifications structurales, spontanées

ou expérimentales des chromosomes ».

Suite à l’action de substances clastogènes et/ou aneugènes, des micronoyaux peuvent

apparaître dans le cytoplasme des cellules. Le test MN est basé sur le comptage de micronoyaux

pour 1000 cellules. Outre la détection de micronoyaux, ce test permet aussi la détection d'autres

types d'aberrations nucléaires indiquant des dysfonctionnements cellulaires (Figure 19): les

cellules binucléées sont dues au blocage de la cytodiérèse ou à la fusion cellulaire (Rodilla 1993),

les noyaux bourgeonnants sont dus à l'élimination de l'ADN amplifié (Miele et al., 1989; Shimizu

et al., 1998; Shimizu et al., 2000) ou encore à l'élimination des complexes de réparation de l'ADN

(Haaf et al., 1999). En plus de ces anomalies, ce test permet la détection des cellules apoptotiques

(Izquierdo et al., 2003).

Figure 19 : Anomalies nucléaires dans des cellules branchiales de moules zébrées révélées par le test MN

A: Cellule présentant un micronoyau - B: Cellule présentant un noyau bourgeonnant - C: Cellule binucléée - D: Cellule en apoptose. (Photos Vincent-Hubert F. et Michel C.)

Principe du test: Les cellules sont fixées dans de l'éthanol/acide acétique durant 20 min à température ambiante puis déposées sur lames de microscope et laissées sécher à température ambiante durant 12h. Les lames sont rincées, colorées au DAPI puis montées en tampon PBS – glycérol 33%. La lecture des lames s'effectue en fluorescence afin de déterminer la fréquence en micronoyaux selon les critères d'acceptation des micronoyaux (Kirsch-Volders et al., 2003). Une cellule doit répondre à des critères définis pour être considérée comme micronucléée (Fenech et


- 38 -

al., 2003; Kirsch-Volders et al., 2003). Le diamètre d'un micronoyau doit mesurer entre le sixième et le tiers du diamètre du noyau et en être physiquement séparé (un point de jonction marginal est toléré s'il subsiste une claire délimitation des frontières nucléaires). Le micronoyau doit être d’aspect et de coloration équivalents à ceux du noyau principal.

4.3.2. Application du test micronoyaux en biomonitoring

Le test des Micronoyaux (MN) met en évidence les effets mutagènes potentiels de composés

toxiques. Contrairement au test Comète, révélant des lésions primaires de l’ADN, le test MN met

en évidence des effets plus stables et irréversibles, qui requièrent une division cellulaire pour

apparaître. Le test de détection des micronoyaux est largement utilisé en écotoxicologie chez la

dreissène (Mersch et al., 1996; Mersch and Beauvais 1997; Klobucar et al., 2003; Le Goff et al.,

2006; Binelli et al., 2008). Mersch et al. (1997) l'ont utilisé pour évaluer la génotoxicité de l'eau

douce et ont conclu que le taux d'induction des micronoyaux chez les dreissènes, que ce soit in

vivo ou in vitro, est similaire (<10‰) (Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011),

voire légèrement supérieurs à ceux obtenus avec des bivalves marins, tels que Mytilus edulis,

Crassostrea gigas et Mytilus galloprovincialis. Chez la dreissène le niveau basal du taux de MN se situe

entre 0,5 et 2,75‰ (Pavlica et al., 2000).

La sensibilité de la mesure de la fréquence des micronoyaux est dépendante de l’index

mitotique. En effet, un index mitotique faible peut expliquer l’absence ou la faible induction de

micronoyaux (Wrisberg et al., 1992; Mersch et al., 1996) ou par un taux de division

physiologiquement bas du tissu étudié. L’âge des organismes et leur stade de développement sont

à prendre en compte. On peut cependant soulever le fait que la fréquence des micronoyaux est

relativement faible, ne dépassant pas 10‰ chez la dreissène (Mersch and Beauvais 1997;

Bourgeault et al., 2010). Ce test permet de traduire l’exposition à des substances aneugènes, c’est-

à-dire des substances induisant un effet dans le nombre de chromosomes, indétectable par le test

comète.


- 39 -

4.4. Voies de réparations des lésions de l'ADN

4.4.1. Réparation de l’ADN

4.4.1.1. La voie NER

La réparation par excision de nucléotides (NER), représentée sur la Figure 20, prend en charge

les lésions volumineuses comme les dimères de pyrimidines ou les adduits volumineux qui

entraînent une distorsion au niveau de la double hélice d'ADN. Il existe deux voies, l’une couplée

à la transcription (TCR pour Transcription coupled repair) qui répare spécifiquement les lésions

induites au niveau des brins transcrits de gènes actifs et l’autre générale (GGR pour Global

Genome Repair), plus lente, qui répare des lésions dans l’ensemble du génome (Van Hoffen et al.,

2003). Ces deux voies ne diffèrent qu'au niveau de l’étape de reconnaissance de la lésion. Pour la

voie GGR, la reconnaissance des dommages passe par le complexe protéique XPChHR23B qui

va également avoir pour rôle de recruter les protéines nécessaires à la poursuite de la réparation.

En ce qui concerne la voie TCR, la reconnaissance est assurée par les protéines CS (Cockayne

Syndrome protein CSA et CSB). Une fois le dommage identifié, les deux voies font intervenir le

facteur de transcription TFIIH dont les sous-unités XPB et XPD ont une activité hélicase et vont

séparer les deux brins du complexe. La protéine RPA assure la stabilité de ce complexe. Le brin

endommagé va ensuite être incisé de chaque côté de la lésion par les endonucléases XPG à

l’extrémité 3’ et XPF associée à ERCC1 au niveau de l’extrémité 5’. Ceci conduit à l’excision d’un

fragment d’ADN simple brin de 25-30pb contenant la lésion. La resynthèse du brin excisé est

assurée par L’ADN polymérase δ ou ε associée au facteur de processivité PCNA. La ligation du

double brin d’ADN est enfin réalisée par la ligase I.


- 40 -

Figure 20 : Mécanisme de la voie de réparation NER (Hoeijmakers 2001)

4.4.1.2. La voie BER

La voie BER (Figure 21) prend principalement en charge de petites lésions qui entraînent

une modification chimique de l’ADN sans conséquence au niveau de la distorsion de la double


- 41 -

hélice, comme les méthylation, les bases oxydées de l'ADN telles que la 8-oxodG, les cassures

simple brins et les sites AP. Cette voie est initiée par une ADN glycosylase qui catalyse l’hydrolyse

de la liaison N-glycosidique entre la base endommagée et le squelette sucre-phosphate ce qui

libère la base générant un site AP. Ce site est clivé par une 5’AP endonucléase qui hydrolyse la

liaison phosphodiester en 5’ du site abasique, générant un groupement 3’OH libre nécessaire à

l’élongation du brin d’ADN néosynthétisé. La resynthèse du brin d’ADN peut se faire par deux

voies différentes :

- Une voie de resynthèse courte dans la laquelle l’ADN pol, associée à XRCC1, incorpore un à

deux nucléotides en même temps qu’elle excise le 5’desoxyribose phosphate (dRp) généré lors de

la coupure par l’endonucléase.

- Une voie de resynthèse longue qui fait intervenir les ADN pol δ et ε associées au PCNA. Dans

cette voie, 5 à 7 nucléotides sont incorporés, générant une zone de recouvrement avec l’ancien

brin d’ADN, les ADN pol n’ayant pas d’activité dRpase. Ce brin est alors éliminé par une flap

endonucléase (FEN1) afin que l’étape de ligation puisse s’opérer.

La ligation du brin est réalisée par le complexe ADN ligase III-XRCC1 pour la voie

courte et l’ADN ligase I-XRCC1 pour la voie longue.


- 42 -

Figure 21: Voie de réparation BER (Hoeijmakers 2001)

Contribution des voies BER et NER dans la réparation des lésions induites par les HAP :

Les adduits du BaP sont réparés par la voie NER. Cependant la réparation des lésions

induites par d’autres HAP est moins bien connue. Dans une étude in vitro réalisée avec un système

cellulaire, Braithwaite el al. (1998) ont mis en évidence que la NER était la voie principale de

réparation des lésions induites par 6 HAP dihydrodiol époxyde mais il semblerait que la voie BER

intervienne dans la réparation des sites AP dans les cellules traitées avec le benz[a]anthracene-

trans-8,9-dihydrodiol-10,11-epoxide et le chrysene-trans-1,2-dihydrodiol-3,4-epoxide.


- 43 -

5. La moule zébrée, un organisme utilisé en biomonitoring

5.1. Présentation de Dreissena polymorpha

5.1.1. Origine, anatomie et écologie de l'espèce

Dreissena polymorpha, plus communément appelée moule zébrée, est un mollusque bivalve

d'eau douce, originaire de l'ancienne mer Sarmate (la mer Noire, la mer Caspienne et la mer

d'Aral) dont la coquille présente des zébrures (Figure 22). Elle est aujourd'hui largement répandue

en eau douce dans les eaux stagnantes comme les lacs et les étangs, ou dans les cours d'eau

européens et notamment sur l'ensemble du réseau fluvial français et transatlantique, où elle est

considérée comme un organisme invasif.

Selon Pallas (1771) la classification de Dreissena polymorpha est la suivante :

Figure 22 : Dreissena polymorpha

Elle mesure de 20 à 30mm de long et possède une forme triangulaire caractéristique. Elle vit

fixée ventralement par un byssus, filament qui se solidifie dans l'eau pour permettre sa fixation

sur un substrat dur. Fixée aux coques des bateaux ou transportée dans les eaux de ballasts, elle a

progressivement envahi les écosystèmes d'eau douce d'Europe et d'Amérique du nord (Tableau

IV).

Règne : Animal

Embranchement : Mollusque

Classe : Bivalve

Ordre : Veneroida

Famille : Dreissenidae

Genre : Dreissena

Espèce : polymorpha

http://fr.wikipedia.org/w/index.php?title=Dreissena&action=edit&redlink=1


- 44 -

Tableau IV : Historique de l’invasion de Dreissena polymorpha

Année de détection Localisation

1803 Canal Dniepr-Bug

1824 Est de l’Angleterre

1826 Bas Rhin

1833-1866 France

1878 Hongrie

1885-1886 Allemagne

1887 Pays-Bas

1963 Cuba

1985-1989 USA et Canada

1997 Irlande

2001 Espagne

Les individus se regroupent en grappe sur des substrats durs (pierres, chaînes, coques des

bateaux, moules autochtones, …). Cette capacité d'attachement et de regroupement en grappe

fait de la dreissène un organisme relativement nuisible. En effet, en se fixant en grappe sur les

bivalves autochtones, le poids des dreissènes provoque l'enfouissement des autres organismes

dans la vase et donc leur asphyxie. Une autre particularité qui révèle la nuisance de cette espèce,

est qu'elle assure un rôle indispensable dans le cycle de vie d'un vers parasite (Bucephalus

polymorphus) qui s'enkyste dans le corps de certains poissons et provoque des lésions presque

toujours mortelles (ex.: sandre). Enfin, les moules zébrées s'accrochent aux grilles des conduites

d'eau ou se développent dans les tuyaux, empêchant ensuite le passage de l'eau dans les

canalisations.

5.1.2. Anatomie de la moule zébrée

L'anatomie de la moule zébrée a été décrite par Yong et Campbel (1968) et Morton

(1969). La coquille comme son nom l'indique présente des zébrures de couleurs crème et brune.

La coquille de la dreissène présente une forme triangulaire caractéristique avec une face ventrale

aplatie et une face postérieure bombée (Figure 23). La dreissène possède deux courts siphons

séparés. Le siphon inhalant présente une ouverture relativement large et comprend de très petits

tentacules en périphérie de son ouverture. Le siphon exhalent est conique, dirigé de manière


- 45 -

postéro-dorsale s'ouvre de manière moins importante que le siphon inhalant, et ne possède pas

de petites tentacules. Le troisième siphon fusionné directement au manteau porte des papilles

irrégulièrement espacées et incolores. Le manteau de la dreissène se trouve dorsalement au-dessus

du siphon exhalent, entre les siphons exhalent et inhalent, ventralement entre le siphon et

l'ouverture pour le pied et à l'avant de l'ouverture pour le pied. L'ouverture prévue pour le pied

permet l'extension du pied et la formation du byssus. Le système musculaire de la dreissène est

composé d'un large muscle adducteur situé postéro-dorsalement. Les muscles rétracteurs

postérieurs sont attachés à la coquille sur une ligne parallèle à la frontière postéro-dorsale et avant

le muscle adducteur postérieur. Un petit muscle situé entre les éléments antérieurs constitue le

muscle rétracteur byssal postérieur (Morton 1993).

Figure 23 : Anatomie de la dreissène (Morton 1993)

Face dorsale

Face ventrale


- 46 -

5.1.3. Cycle de vie et reproduction de la dreissène

La période de reproduction de la dreissène s'étend de juin à octobre en fonction de la

température de l'eau. Le développement gonadique intervient lorsque la température de l'eau

atteint 12°C. La période de fraie se produit entre la fin du printemps et le début de l'été (Mackie

1991; Garton and W.R. Haag 1992; Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001;

Juhel et al., 2003). Chez les dreissènes, on distingue les organismes mâles des femelles. Les ovules

et les spermatozoïdes sont libérés dans l'eau en très grande quantité. Une femelle peut pondre 40

000 à 1 million d'œufs par an.

Le cycle de vie de la dreissène (Ackerman et al., 1994) débute par la fertilisation extérieure des

gamètes qui sont relargués dans la colonne d'eau (Figure 24). Le diamètre des œufs est compris

entre 40 et 96 µm. Après la fertilisation et les étapes de blastulation et de gastrulation, une larve

trochophore se développe (57-121µm). Le trochophore nage librement et devient un veliger en

développant un velum, c'est-à-dire un organe larvaire de nutrition et de locomotion. La

possession d'un velum caractérise toute la suite des stades larvaires comme les veligers. Deux à

neuf jours après la fertilisation, les veligers sécrètent une coquille en forme de D, non ornementée

à partir de la glande de coquille, mesurant entre 70 et 160µm. Durant les deux derniers jours de

cette période, une seconde coquille plus ornementée appelée prodissoconche II est sécrétée par le

tissu du manteau. Ce veliger ou véliconche (120-280 µm ; 2-24j après fertilisation) est le dernier

stade de nage libre et se retrouve dans le plancton. Lors de la phase de croissance accrue de

nouveaux organes tels que le pied se développent donnant lieu à un pédiveliger (167-300 µm ;

>10j après fertilisation). D'autres changements interviennent, impliquant les filaments branchiaux

qui se forment dans la cavité du manteau, mais qui n'atteindront pas la maturité. Au contraire, le

pied bien développé est utilisé pour la nage près du fond de l'eau. Entre 18 et 90 jours après la

fertilisation, le pédiveliger va secréter un byssus sur une surface appropriée. Une fois fixé, il va

pouvoir subir une métamorphose pour devenir postveliger ou une moule plantigrade (>158-

500µm ; 6-47 j après fertilisation). Les principaux changements morphologiques sont la perte du

velum, le développement des branchies et de la bouche ainsi que la sécrétion du dissoconche, ou

coquille adulte. Le pied grandit et il y a une réorientation dans la cavité du manteau. Ces

développements transforment le plantigrade en juvénile qui, en grandissant et en atteignant la

maturité sexuelle lors de la première année, deviendra adulte.


- 47 -

Les moules zébrées ont une croissance relativement élevée au cours de leurs trois

premières années de vie, elles deviennent sexuellement matures durant leur première année et

atteignent une taille finale de la coquille de 3,5 à 5 cm. Leur fort taux d'énergie allouée à la

reproduction (74 à 90%) par rapport à la corbicule (5 à 15%) (McMahon 2002) et la petite taille

de leurs œufs leur permettent une très forte fécondité. La densité de cette espèce se situe entre 7

000 et 114 000 individus/m².

Figure 24 : Cycle de vie de Dreissena polymorpha

5.2. Application des biomarqueurs de génotoxicité chez la dreissène

La recherche d’indicateurs biologiques de la qualité des écosystèmes aquatiques a conduit

les chercheurs, depuis les années 1980, à définir les espèces répondant au mieux aux critères

d'organismes sentinelles (voir partie 2.2.). Les bivalves filtreurs (comme la moule marine Mytilus

edulis) sont largement utilisés en biomonitoring marin et leur utilisation s'avère relativement

concluante (Wrisberg et al., 1992; Wang and Fisher 1997; Rank et al., 2005; Magni et al., 2006). La

moule d'eau douce est un organisme modèle très proche de la moule marine. En effet, son cycle

de développement l'apparente davantage aux mollusques bivalves marins déjà bien connus (par

leur comportement, leur taille et leur morphologie), avec une phase larvaire libre et une phase


- 48 -

adulte fixée comme Mytilus edulis. La moule zébrée est un organisme filtreur caractérisé par un

fort taux de filtration, évalué à 1L/jour par moule (Fisher et al., 1999). La moule zébrée accumule

donc les contaminants directement de la colonne d'eau et du matériel particulaire. La dreissène

résiste relativement bien aux perturbations du milieu et a une longue durée de vie (4 à 7 ans)

(McMahon 2002).

La sensibilité aux agents génotoxiques a été montrée à plusieurs reprises chez la dreissène

(Mersch and Beauvais 1997; Le Goff et al., 2006). Pavlica et al. (2000) ont ainsi détecté une

induction de micronoyaux et de cassures à l'ADN par le pentachlorophénol. Le Goff et al. (Le

Goff et al. 2006) ont démontré la capacité de la dreissène à métaboliser le BaP par la mise en

évidence d’adduits à l'ADN. L'étude de l'induction des dommages à l'ADN par des expositions à

des génotoxiques a été réalisée avec du triclosan (Binelli et al., 2009), du BaP (Binelli et al., 2008;

Vincent-Hubert et al., 2011), ou du cadmium (Vincent-Hubert et al., 2011). Ces études décrivent

les effets induits par une exposition d'organismes à des contaminants mais aucune n'a étudié

l'évolution du taux de cassures à l'ADN lors d’une phase de dépuration des organismes et de ce

fait ne permettent pas d'estimer la stabilité dans le temps des lésions induites à l'ADN.

Afin d'optimiser l'utilisation de cette espèce comme bioindicateur, plusieurs outils

d'évaluation de la réponse génotoxique des organismes face à la contamination du milieu ont été

utilisés. Parmi ces tests, on retrouve le test comète (Pavlica et al., 2001), le test des micronoyaux

(Mersch et al., 1996; Mersch and Beauvais 1997) et la détection des adduits (Le Goff et al., 2006).

Mersch relevait les avantages à utiliser la dreissène comme bioindicateur in situ (Mersch and

Beauvais 1997) en notant que l'induction de micronoyaux (MN) dans les hémocytes était

proportionnelle à la contamination du milieu. En 2000, les premiers résultats du test comète

réalisé in vitro et in situ sur des hémocytes de moules zébrées (Pavlica et al., 2001) confirment

l'intérêt de ce test notamment dans l'évaluation la génotoxicité en eau douce. Les lésions détectées

par ce test sont les cassures de brins d'ADN ainsi que les sites alcali-labiles induits par l'action de

composés génotoxiques (directs ou indirects).

Dans la seconde moitié des années 1990 les recherches visant à évaluer l'utilisation de la

dreissène comme bioindicateur de la qualité des eaux douces se sont multipliées. Plusieurs types

cellulaires de dreissènes tels que les cellules de la glande digestive (Le Goff et al., 2006), de

l'hémolymphe (Mersch et al., 1996; Bourgeault et al., 2010; Vincent-Hubert et al., 2011) ou des

branchies (Mersch et al., 1996; Vincent-Hubert et al., 2011) ont été utilisés pour la mesure de

biomarqueurs de génotoxicité. Le taux d’induction de micronoyaux par exposition à des


- 49 -

génotoxiques de référence s'est révélé plus élevé dans les cellules branchiales que dans les cellules

hémocytaires (Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011). En effet, par rapport aux

autres types de cellulaires, les branchies sont en contact continu avec les contaminants dissous.

Une partie des cassures de brins mesurée par le test comète résulte des coupures issues de la

réparation des dommages à l'ADN. De ce fait, il serait intéressant de donner plus de

significativité à ce test en mesurant des lésions spécifiques de l'ADN par l'utilisation

d'endonucléases spécifiques des dommages oxydatifs (Speit et al., 2004; Smith et al., 2006;

Emmanouil et al., 2008). Certaines études de mesure des dommages oxydatifs par la méthode

d’HPLC-EC ont été réalisés sur Mytilus galloprovincialis (Akcha et al., 2000), sur Perna perna (de

Almeida et al., 2003) et ou Unio tumidus (Charissou et al., 2004). Le test comète couplé à une

endonucléase détectant les oxydations de l'ADN deviendrait plus spécifique et permettrait

d'étudier et de mesurer l'induction de dommages oxydatifs.

5.2.1. Biomonitoring par la méthode de transplantation de dreissènes

L'utilisation de la dreissène comme bioindicateur de la contamination du milieu aquatique

a été développée par des études réalisées sur des moules encagées sur des sites contaminés ou de

référence (Mersch and Johansson 1993; Mersch and Beauvais 1997; Klobucar et al., 2003;

Bourgeault et al., 2010; Guerlet et al., 2010; Palais et al., 2011). Cette méthode de transplantation,

utilisant des organismes échantillonnés sur un site de référence puis encagés sur des sites d'étude

permet de limiter les biais expérimentaux. En effet, lors du prélèvement, les organismes

sélectionnés sont de la même taille, donc du même âge, et sont issus d'une même population. Il

s'agit donc d'un groupe d'individus homogène pouvant à priori réagir de façon similaire lors de la

transplantation, fournissant une réponse génotoxique plus fiable.

Les tests comète et MN ont été utilisés en parallèle sur des hémocytes de moules zébrées

(Klobucar et al., 2003). Les résultats montrent un taux de dommages corrélé aux niveaux de

pollution des sites d'étude. Cependant aucune étude n'a été menée pour déterminer si la

transplantation pouvait avoir un impact sur les dreissènes que ce soit sur leur état physiologique

ou sur la réponse génotoxique. En effet, la technique d'échantillonnage et la mise en cage sur un

site contaminé sont autant de paramètres pouvant perturber les organismes et modifier le lien

potentiel entre la contamination chimique du milieu et les effets biologiques.


- 50 -

5.2.2. Facteurs influençant la réponse génotoxique

5.2.2.1. Les facteurs abiotiques

Lorsque les températures de l'eau deviennent inférieures à 4°C, comme en hiver, les moules

sont en situation de "dormance", c'est-à-dire que leur rythme de vie est fortement ralenti ainsi que

leur taux de filtration (Herman 2010) qui passe de 40,7mL/mg/h à 4mL/mg/h (Fanslow et al.,

1995). A cette diminution du taux de filtration est associée la diminution d’exposition aux

contaminants. Une autre étude (Fisher et al., 1999) a démontré que la toxicité d'un milieu

augmente avec l'augmentation de la température de l'eau. En effet, il serait possible que

l'augmentation des températures, favorisant l'activité de filtration, augmente l'exposition aux

contaminants. Une étude réalisée sur la palourde Pisidium amnicum (Heinonen et al., 2002) montre

que l'accumulation de bisphénol A est plus importante lorsque la température de l'eau augmente

(de 2 à 8°C). On retrouve aussi des variations saisonnières chez Mytilus galloprovincialis (Bodin et

al., 2004) avec une diminution du taux d'adduits en hiver, une augmentation du taux de

micronoyaux en été (Pavlica et al., 2008) et une augmentation du taux d'adduits chez Mytilus edulis

en hiver (Skarphéinsdóttir et al., 2005).

5.2.2.2. Facteurs biotiques

L'activation de la période de reproduction semble augmenter la sensibilité des organismes

face aux contaminants (Blaise et al., 2002). En effet, lors de période de pré-ponte correspondant à

la maturation des gonades, une augmentation du taux d'adduits à l'ADN a été observée sur

Mytilus galloprovincialis transplantée en Méditerranée (Bodin et al., 2004) et sur Mytilus edulis dans

l'océan Atlantique (Skarphéinsdóttir et al., 2005).

Cette période correspond à une augmentation de l'activité de filtration (Bourgeault et al., in

prep) conduisant à une augmentation de l'exposition des organismes aux contaminants.

Compte tenu de ces observations, il est important de prendre en compte et d’approfondir

l’étude de l’influence de la variabilité naturelle des biomarqueurs dans l’interprétation de la

réponse génotoxique de Dreissena polymorpha.

Partie A

- 53 -

Partie A: Intérêt de la détection des lésions oxydatives

La partie A regroupe l'étude des lésions oxydatives de l'ADN réalisée en laboratoire sur

Dreissena polymorpha par le test comète couplé à l’endonucléase hOGG1. Cette partie se divise en

deux chapitres, le chapitre II, dans le quel nous présenterons l'étude de la l'adaptation du test

comet-hOGG1 à Dreissena polymorpha et le chapitre III, qui se compose de l'étude de la réparation

des lésions oxydatives après exposition de dreissènes au BaP et au Cd.

La détection des lésions oxydatives de l'ADN est généralement réalisée par la méthode

d'HPLC-EC ou par le test comet-Fpg ou le test comet-endo III. Cependant, l'étude de Smith et al.

(2006) a démontré que l'enzyme hOGG1 reconnaissait plus spécifiquement la 8-oxodG que

l’enzyme Fpg. En effet, en plus des oxydations, l'enzyme Fpg détecte la 2,6-diamino-4-hydroxy-5-

formamidopyrimidine (FaPyGua), la 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FaPyAde) et d'autres

purines à cycle ouvert (Dušinská and Collins 1996; Karakaya et al., 1997). Afin d'augmenter la

significativité du test comète, et de déterminer si la pression chimique du milieu urbain induit des

dommages oxydatifs, nous avons développé le test comète couplé l'enzyme hOGG1. La

détection des lésions oxydatives de l'ADN par le test comète couplé à l'enzyme hOGG1 n'avait

jamais été réalisée chez des espèces aquatiques.

Dans le chapitre II, nous avons mis au point le test comet-hOGG1 chez la dreissène. Ce

chapitre se compose d'une publication "Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells

exposed to model contaminants" parue dans Mutation Research (in press). L'étude présente les

résultats de la mise au point du test comet-hOGG1 sur cellules de branchies de moules exposées

in vitro au peroxyde d'hydrogène et au BaP. Plusieurs tampons de l'enzyme hOGG1 ont été

testés pour sélectionner celui qui semblait rendre le test plus sensible possible, en détectant le

plus fort taux d'oxydation de l'ADN. Des expositions au MMS (agent alkylant) ont également été

réalisées dans le but de vérifier l'absence de cassures supplémentaires créées par hOGG1 dans le

test comète modifié. Ce test a ensuite été appliqué sur des moules exposées in vivo à du BaP afin

de rechercher les niveaux d'oxydation induits par ce composé.

Dans le chapitre III, nous avons recherché la présence de lésions oxydatives sur des

moules exposées durant 24h à des composés modèles de la pollution urbaine (BaP et Cd) puis

mesuré la stabilité de ces lésions dans le temps en plaçant les moules en milieu propre pendant six

jours (phase de dépuration). Ce chapitre se compose d'une publication en préparation "Study of

DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1 assay in

Partie A

- 54 -

Dreissena polymorpha exposed to model contaminants". Nous avons cherché à voir si ce type de

lésion était réparé rapidement et si leur niveau revenait au niveau basal à la fin de la période de

dépuration.

Chapitre II

Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives

Chapitre II : Mise au point du test comet-hOGG1 et détection de lésions oxydatives

- 57 -

Publication 1: Detection of 8-oxodG in Dreissena polymorpha gill cells exposed to

model contaminants.

Résumé

Les biomarqueurs de génotoxicité sont mesurés sur différents organismes sentinelles présents

dans l’environnement aquatique pour surveiller l’impact de la pollution de l’eau sur les organismes

aquatiques. La première étape de la détection des lésions oxydatives (8-oxodG) sur des

organismes exposés à des contaminants chimiques consistait à optimiser le couplage du test

comète avec l’enzyme hOGG1 par l’exposition à H2O2. Nous avons d’abord mis en évidence, par

l’utilisation du test comet-hOGG1 et comet-Fpg, que l’exposition in vitro de cellules branchiales

de moules à du benzo(a)pyrène (BaP 98,4nM) induit une augmentation du taux de cassures à

l’ADN par rapport au test comète seul, indiquant une induction d’oxydation de l’ADN. En

revanche, l’augmentation du taux de cassures à l’ADN par rapport au test comète seul, après

exposition au méthylméthane sulfonate (MMS 33µM), n’est induite qu’avec le test comet-Fpg.

L’exposition au MMS, composé induisant des lésions alkylantes, confirme que hOGG1 ne

détecte pas les dommages alkylants. L’enzyme hOGG1 semble être plus spécifique des

dommages oxydatifs, tels que la 8-oxodG que l’enzyme Fpg. Ensuite, comme nous l’avons

observé in vitro, l’exposition de Dreissena polymorpha à du BaP (24,6 et 98,4nM) augmente le taux

d’oxydation de l’ADN des branchies de moules. On retrouve de la même manière, une

augmentation du taux de sites sensibles à Fpg après l’exposition des moules au MMS (240µM).

Ces résultats montrent que le test comet-hOGG1 détecte les lésions oxydatives induites in vitro

par le H2O2 et in vivo par le BaP. Ce test comète modifié sera utilisé par la suite pour détecter des

lésions oxydatives (8-oxodG) sur des moules transplantées sur des sites d’étude.

Mots clés

Lésion oxydative, moule zébrée, test comète, Fpg, hOGG1


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Chapitre III

Etude de la réparation des lésions oxydatives

Chapitre III : Etude de la réparation des lésions oxydatives

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Publication 2: Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA

damage by comet-hOGG1 assay in Dreissena polymorpha exposed to model

contaminants

Résumé

Les bivalves d’eau douce sont considérés comme de bons indicateurs de la pollution

environnementale. Le test comète permet la détection des dommages à l’ADN tels que les

cassures de brins et les sites alcali-labiles sur plusieurs types cellulaires. La lésion oxydative

majoritaire, la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-déoxyguanosine (8-oxodG), est associée aux transversions de

G vers T et peut être détectée par le test comète couplé à l’enzyme humaine de réparation des

oxydations de l’ADN, hOGG1, impliquée dans la voie de réparation par excision de bases.

Le but de cette étude est de mesurer l’induction des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1

dans les cellules de branchies de moules et de déterminer leur stabilité. Nous avons exposé des

moules pendant 24h à du BaP (7, 12 et 18µG/L) et du Cd (3, 32 et 81µg/L) et avons mesuré les

oxydations de l’ADN à 6 et 24h d’exposition, puis durant 6 jours de dépuration des moules. Cette

étude met en évidence l’induction rapide de cassures de brins et de lésions oxydatives, dès 6h

d’exposition au BaP selon une relation dose-réponse. Le taux basal de dommages à l’ADN est

retrouvé après 2 jours de dépuration, indiquant une réparation efficace de l’ADN. Le Cd induit

des cassures de brins et des lésions oxydatives, mesurées par le test comet-hOGG1, dès 6h

d’exposition. La plus forte concentration de Cd induit la plus forte induction de 8-oxodG mais

son induction est plus lente qu’avec les autres concentrations de Cd. Cette étude révèle que le test

comet-hOGG1 est un test sensible de détection de la 8-oxodG dans les moules exposées à des

contaminants oxydatifs.

Mots clés Moule zébrée, test comet-hOGG1, stress oxydatif, biomarqueur


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Study of DNA lesions stability and detection of oxidative DNA damage by comet-hOGG1

assay in Dreissena polymorpha exposed to model contaminants

Cécile Michel, Françoise Vincent-Hubert

CEMAGREF

Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés

1 rue Pierre-Gilles de Gennes

CS 10030

92761 Antony Cedex

Corresponding author: [email protected]

Tel: +33 0(1) 40 96 61 21

Fax: +33 0(1) 40 96 61 99

mailto:[email protected]


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ABSTRACT: Freshwater bivalve molluscs are considered as effective indicator of

environmental pollution. The comer assay, allows the detection of DNA damage like the strand

breaks and alkali-labile sites in different types of individual cells. The main oxidative lesion, 8-

oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG), which is associated in many pathological

processes causes misreading of DNA and contributes to G- to T- transversion can be detected by

the comet assay coupled with a human DNA repair enzyme hOGG1, involved in base excision

repair. The aim of this study is to use the comet-hOGG1 assay in gill cells of Dreissena polymorpha

to quantify 8-oxodG and to determine their stability. Mussels were exposed during 24h to B[a]P

and Cd and DNA damage levels were measured during 6 days. This study shows that B[a]P

induced DNA damage, with a dose/response relation, and also 8-oxodG. The basal level of

DNA damage was reached after 2 days of depuration, indicating an effective DNA repair. Cd

induced 8-oxodG 6h after the beginning of the exposure. The level of 8-oxodG is higher with the

higher Cd concentration but it was detected later. This study revealed that the comet-hOGG1

assay is sensitive enough for the measurement of 8-oxodG in exposed mussels.

Keywords: zebra mussel, comet-hOGG1 assay, oxidative stress, 8-oxodG, biomarker


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Introduction

Freshwater bivalve molluscs have long been considered as effective indicators of

environmental pollution. Dreissena polymorpha, also called zebra mussel (Pallas, 1771), is a filtering

freshwater bivalve, largely used for biomonitoring in lakes and rivers (Binelli et al., 2001; Guerlet et

al., 2007; Bacchetta and Mantecca 2009; Bourgeault et al., 2010). Binelli et al. (2007) have studied

three different biomarkers (acetylcholinesterase (AChE), ethoxy resorufin-O-deethylase (EROD)

and DNA strand breaks) in zebra mussels and have concluded that the prevalence of DNA strand

breaks was the strongest discrimination factor between sites.

The alkaline comet assay enables the detection of single or double DNA strand breaks and

alkali-labile sites, in various types of individual cells. First introduced by Ostling and Johanson

(1984) and then modified by Singh et al. (1988), the comet assay is widely used to measure DNA

strand breaks in plants, worms, molluscs, fish, amphibians and mammalians in biomonitoring

studies (Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et al., 2009). DNA strand breaks measured with the

comet assay are due to direct genotoxic effects and/or to DNA lesions repair. Among the

different forms of DNA damage, oxidative lesion is of particular concern. It has been proven to

be associated with carcinogenesis (Kasai 1997) and aging (Zahn et al., 1987). The 8-oxo-7,8-

dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG), is a modification of Guanine, which contributes to G- to

T- transversion. This substitution of a pyrimidine by a purine could have two types of effects. If

the new nucleotide changes the codon, it will produce an altered amino acid in the protein

product. Such changes are called missense mutation. If the new nucleotide changes a codon, leads

to an amino acid corresponding to one of the STOP codons, the translation step will stop

prematurely. This is called a nonsense mutation. Some studies have reported a high level of 8-

oxodG in organisms exposed in situ to urban contaminants (Charissou et al., 2004). Jebali et al.

(2007) have detected an increase of 8-oxodG levels in the digestive glands and gill cells of

Ruditapes decussates at three sites in the Gulf of Gabés. Due to their ability to accumulate

numerous pollutants from their natural environment (Hung et al., 2001), bivalve DNA is subject

to a considerable amount of oxidative damage (de Almeida et al., 2003; Emmanouil et al., 2007).

Polycyclic aromatic hydrocarbons, such as benzo[a]pyrene, commonly found as pollutant is

carciniogenic and an indirect toxicant, as it has to be metabolized to soluble metabolites to cause

toxic effects. During B[a]P metabolism redox cycling quinones are formed in mussels as a result,

ROS could be generated (Livingstone et al., 1990). The capacity of the bivalve to transform B[a]P

into active metabolites was demonstrated by Binelli et al. (2008), although CYP-450 induction in

bivalves is lower than observed in invertebrates (Mitchelmore et al., 1998).


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DNA oxidation by heavy metals represents a significant ecological and public health

concern due to their toxicity and their ability to accumulate in beings. The mechanism of metal

carcinogenesis remains largely unknown, although several lines of experimental evidence suggest

that a genotoxic effect may be involved (Snow 1992). Among them, the cadmium is a ubiquitous

environmental pollutant that has been classified as a human carcinogen by the International

Agency for Research on Cancer. Cadmium itself is unable to generate free radicals directly,

however, indirect formation of reaction oxygen species and reactive nitrogen species involving the

superoxide radical, hydroxyl radical and nitric oxide has been reported (Waisberg et al., 2003).

The development of the comet-hOGG1 assay for the DNA oxidative lesions detection

was performed by Michel et al. (in press), demonstrating a sensitive tool to detect specifically 8-

oxodG and has allowed us to assess the 8-oxodG level induced by B[a]P. The comet-hOGG1

assay was applied to caged zebra mussels in the Seine River basin and showed that the urban area

induced DNA oxidation (Michel et al., submitted). In a previous field study with zebra mussels,

we recently observed that the induction of DNA strand breaks and the rate of micronuclei were

higher in gill cells than in haemocytes (Bourgeault et al., 2010), which was confirmed by a

laboratory experiment (Vincent-Hubert et al., 2011). However, very little is known about the

longevity of the DNA damage and DNA repair efficiency in aquatic organisms (Jha 2004),

especially in molluscs. In the present study, we need to apply the comet-hOGG1 assay in order

study the DNA oxidation induced in zebra mussel gill cells by two model urban contaminants

B[a]P and Cd and how they are repaired. To do so, we have exposed zebra mussels to Cd and

B[a]P during 24h and then the DNA oxidations were measured during a depuration step of 6days

in clean water. The aim of this study was to use the comet-hOGG1 assay in gill cells of Dreissena

polymorpha in order to quantify DNA oxidative lesions, particularly 8-oxodG and determine their

stability.

2. Materials and methods

2.1. Chemicals and enzymes

The enzyme hOGG1 was purchased from Ozyme (St-Quentin-en-Yvelines, France), Dispase II

was from Roche Diagnostic (Meylan, France), B[a]P (CAS number 50328) from Acros organics

(Geel, Belgium), CdCl2 (CAS number 7790-78-5) and all other reagents were purchased from

Sigma–Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France).


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2.2. Mussel sampling and maintenance conditions

Zebra mussels were collected in the Meuse River (France). The mussels were manually removed

from rocks using a scalpel, selected by length (25–30 mm) and rapidly brought back to the

laboratory in water from the sampling site. The mussels were randomly placed in 20-L aerated

tanks of Valvert mineral water and acclimatized to constant temperature (15°C); a day/night

lighting system was implemented. The mussels were fed daily with an algal suspension (Müller

Naturhaus, Germany) and water was changed every two days.

2.3. Exposure conditions

Mussels were exposed during 24h in tanks containing 12 L of water each, to B[a]P (7, 12 and

18µg/L in 0.001% DMSO, empirical values), CdCl2 (3, 32 and 81µg/L empirical values) or

DMSO (0.001%) and one tank for the control. At the end of the exposure the contaminated

water was removed and replaced by clean water for the depuration step of six days. The DNA

strand breaks and the DNA oxidation levels were measured on mussels after 6h and 24h of

exposure to contaminants. Then, during the depuration step these levels were measured at 48h,

72h and 168h. In order to limit B[a]P adsorption onto the tank walls and ensure a constant

exposure, the clean tanks were conditioned with the spiked medium one night prior to the

experiment.

2.4. Comet assay

2.4.1. Gill cells isolation

Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described

by Vincent-Hubert et al. (2011) modified as follow. Gills were carefully removed, rinsed in cold

phosphate buffered saline (PBS) diluted one third in water, cut into three pieces each to facilitate

the cells’ dissociation from the gills, and incubated with dispase II (2U/mL) for 30min at 37°C.

Cell viability was assessed using the Trypan blue exclusion test. The comet assay was performed

only when cell viability exceeded 90%.


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2.4.2. Comet assay and Comet-hOGG1 assay

DNA damage levels were quantified in gill cells using the comet assay as described by

Singh et al. (1988) and modified as follows (Vincent-Hubert et al., 2011). 90µL of 0.5% low-

melting point agarose (LMA) in PBS mixed with 10µL of cell suspension were spread on pre-

coated slides (0.5% normal melting agarose) and covered with a cover slip. After agarose

polymerization at 8°C for 15min, the cover slips were removed and the slides were placed in a

lysis solution (2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1% Triton X-100 and 10% DMSO, pH 10)

at 8°C for at least 1h. After this, the cover slips were removed from the slides used for the comet

assay alone, which were rinsed three times in PBS in Coplin jar and were directly placed in a

horizontal electrophoresis tank filled with cold electrophoresis buffer (0.3M NaOH, 0.001M

EDTA, pH 13, 8°C) for DNA unwinding during 15min. Electrophoresis then took place in cold

electrophoresis buffer at 0.78V/cm, 300mA for 10min at room temperature.

For the comet-hOGG1 assay, the protocol used was modified as follow (Michel and

Vincent Hubert in press): slides were incubated 3 times for 5 min in Coplin jar, with hOGG1

buffer (40mM HEPES, 0.1M KCl, 0.5mM EDTA, 0.2mg/mL BSA, pH 8). 50µL of hOGG1

enzyme (0.16 U) in hOGG1 buffer were added to each slide and a cover slip was then placed on

each. The slides were incubated at 37°C in a dark, humidified chamber for 45min. After the

enzyme exposure, these slides were treated as the comet slides not exposed to hOGG1, without

being rinsed three times in PBS.

Finally, all the slides were drained and immersed in 70° ethanol for 5min to dehydrate the

agarose, and then left to dry. The slides were stored at room temperature with desiccant until

staining.

Quantitation of Comet assay data

Slides were stained with 30µl of ethidium bromide (0.8µg/ml) and a cover slip was added.

The slides were examined the next day with a fluorescence microscope (Olympus BX51, 60X

lens). For the quantitation of the comet assay data, we used an image analysis system (Komet 5.5,

Andor Technology) linked to a CCD camera. One hundred randomly chosen nuclei were

examined per mussel (1200 nuclei per site). The level of DNA damage was expressed as Olive

Tail Moment (OTM = Tail DNA % x (tail mean-head mean)) (Olive et al., 1990) in arbitrary unit

(AU). All slides were coded and analyzed blind.


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Statistical analysis

The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the comet data.

The normality was not respected, thus the non-parametric Wilcoxon test was performed to

evaluate eventual significant differences between control and treated slides. Three levels were

considered significant: p<0.05 (*), p<0.01 (**) and p<0.001 (***). All statistical analysis were

performed with R software.

3. Results

3.1. DNA strand breaks measured after B[a]P exposure

The mean OTM levels measured after mussel exposure to B[a]P are presented on the

figure 1. The DNA strand breaks levels measured in mussel gill cells showed a rapid significant

increase after 6h of exposure with the three concentrations of B[a]P (p<0.001). These levels

decreased at the day 2 but stayed higher than in the controls mussels. At the day 3, these levels

reached the basal level of DNA strand breaks corresponding to the OTM measured in the control

mussels or mussels exposed to the DMSO. This level did not vary at the day 7.

After 6h of exposure, the OTM measured in gill cells of mussels exposed to the two higher

concentrations of B[a]P were higher than those induced by the lower B[a]P concentration

(p<0.001). At 24h these levels were in the same range but stayed higher than in the control

mussels and mussels exposed to DMSO.

3.2. DNA oxidation levels measured after B[a]P exposure

The hOGG1-sensitive sites levels measured with the comet-hOGG1 assay on mussel gill

cells exposed to B[a]P are presented in the table II. The hOGG1-sensitive site level increased

after 6h of mussel exposure to B[a]P 18µg/L while this level increased at the day 1 for the B[a]P

12µg/L. After exposure to the lowest concentration of B[a]P (7µg/L) no hOGG1-sensitive sites

was detected. From the day 2 to the day 7, the hOGG1-sensitive sites levels were not detected.

3.3. DNA strand breaks measured after Cd exposure


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The means OTM levels measured after mussel exposure to Cd are presented on the figure

2. After 6h of mussel exposure to Cd, the mean OTM levels measured in gill cells showed a

significant increase for each Cd concentration (p<0.001). We can observe a dose-effect relation

with the increasing Cd concentrations. The DNA strand breaks levels induced by the Cd 3µg/L

stayed stable until the end of the depuration and significantly different from the OTM measured

in control mussels. For the Cd 32µg/L we can observe a significant decrease of this level at the

day 7. For the Cd 81µg/L the DNA strand breaks level was significantly decreased at the day 2

and continues to decrease to reach the basal level corresponding to the control at the day 7.

3.4. DNA oxidation levels measured after Cd exposure

The hOGG1-sensitive sites levels measured with the comet-hOGG1 assay on mussel gill

cells exposed to Cd are presented in the table II. The hOGG1-sensitive sites levels measured after

exposure to Cd 3 and 32µg/L were increased until 6h and decreased from the day 1 to the day 7.

For the higher Cd concentration (81µg/L) the hOGG1-sensitive sites level was higher compared

to those induced by the two lower concentrations (3 and 32µg/L) and rapidly decreased to

become null at the day 3.

4. Discussion

4.1. B[a]P exposure

4.1.1. DNA strand breaks detected by the comet assay

The B[a]P exposure induced a significant increase of DNA strand break levels in mussel

gill cells after 6h of exposure leading us to suppose a very fast capacity of the bivalve to transform

B[a]P into active metabolites as it was observed by Binelli et al. (2008). The same early genotoxic

effect of B[a]P was observed by Vincent-Hubert et al. (2011) after 10h of exposure. Even though

the bivalve metabolisation by CYP-450 induction remain lower than in vertebrates, these data

indicated that mussel gill cells are able to transform the B[a]P into active metabolite and induce

DNA oxidation. This is in accordance with a previous study showing the formation of DNA

adducts in zebra mussels after B[a]P exposure during 5days (5 and 50µg/L) (Le Goff et al., 2006).

Previous studies have indicated the ability of B[a]P to produce DNA SB in Mytilus sp. in vivo, using

alkaline elution techniques (Bihari et al., 1990) and in Crassostrea gigas (Nacci et al., 1996) with the


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comet assay. However, using a free radical scavenger as N-N-t-butyl-α-phenylnitrone (PBN),

Mitchelmore et al. (Mitchelmore et al., 1998) suggested the role of free radicals by DNA SB

inhibition of about 75%. Thus, the DNA strand breaks detected after B[a]P exposure by the

comet assay could provide in part from the DNA repair of oxidized bases.

4.1.2. DNA strand breaks stability

B[a]P-induced lesions were rapidly repaired leading to the decrease of the level of DNA SB which

became equal to the basal level of DNA SB measured in the control mussels after 48h of

depuration. The same B[a]P-induced lesion repair was highlighted by Bihari et al. (1990). In their

study, the B[a]P exposure was different from those used in our study, the B[a]P was directly

injected in the haemolymph, but the DNA repair of B[a]P-induced lesions occurred rapidly, after

48h. This study explained the necessity of taking into account the DNA repair in the

biomonitoring with the DNA strand breaks as biomarkers for the result interpretation.

4.1.3. DNA oxidation detection by the comet-hOGG1

The oxidative DNA damage detection with the comet-hOGG1 assay showed a rapid DNA

oxidation in gill cells of zebra mussel exposed to B[a]P corresponding to about 30% of DNA

strand breaks detected with the comet assay alone. This means that the B[a]P is able to produce

free radicals leading to the DNA oxidation and this was confirmed by the use of N-N-t-butyl-α-

phenylnitrone (PBN) (Mitchelmore et al., 1998), a free radical scavenger, which induced a

significant decrease of DNA SB of about 75%. Although the low bivalve metabolic capacity,

these results showed that the mussel gill cells are able to transform the B[a]P in active metabolites

able to DNA alteration and DNA oxidative induction.

4.1.4. Oxidative DNA lesion stability

DNA oxidative lesions induced by the B[a]P were rapidly repaired, since after 24h of depuration,

the hOGG1-sensitive sites were not detected whatever the B[a]P concentration. The same

observation was made in marine mussels, confirming the existence of oxidative repair

mechanisms, specifically the BER (Akcha et al., 2000). Indeed, in this study, the levels of 8-

oxodG measured in mussels reached the level measured in control mussels after 5days of

depuration.


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4.2. Exposure to Cd

4.2.1. DNA strand breaks detection with the comet assay

Although the Cd is known to be a low genotoxic inducer, the exposure of mussels to low non-

cytotoxic concentrations of Cd induce a rapid significant increase of DNA strand breaks levels

after 6h, following a dose-response relation. These lesions detected by the comet assay did not

result from the direct action of the Cd on DNA (Valverde et al., 2001). Cd affects the genome

stability by inducing the ROS generation and also by the inhibition of the DNA repair systems,

depleting glutathione and protein-bound sulfhydryl groups, which results in enhanced production

of ROS like hydrogen peroxide, superoxide ion and hydroxyl radical (Bertin and Averbeck 2006).

Thus, the DNA SB accumulation is due to the inhibition of the final ligation step of the BER

after the DNA oxidative lesion excision. Emmanouil et al. (2007) have also detected the increase

of the DNA SB levels after Cd exposure. These ones may have many origins: single strand breaks

associated to DNA damage induced by genotoxic, alkali-labile sites transformed into single strand

breaks in alkaline environment and transient single strand breaks associated with incomplete

excision repair of lesions rectified by a variety of repair pathways in the cell (Tice et al., 2000).

The same rapid DNA strand breaks induction was observed by Vincent-Hubert et al. (2011) after

124h of exposure with 10µg/L of Cd.

4.2.2. DNA strand break stability

DNA strand breaks induced by Cd showed a slight but significant decrease at the end of the

depuration step (6days) but did not reached the basal level of DNA strand breaks detected in the

control mussels. However, the DNA strand breaks induced by the lower Cd concentration

(81µg/L) reached the basal level at the end of the depuration step.

4.2.3. DNA oxidation by the comet-hOGG1assay

Cd is not a direct genotoxic agent is unable to generate directly free radicals but is implicated in

the production of the of ROS like hydrogen peroxide, superoxide ion and hydroxyl radical

(Bertin and Averbeck 2006). Our study showed oxidative lesion induction by the increase of the

hOGG1-sensitive sites induced by the Cd exposure. Bivalve DNA is subject to considerable

amounts of oxidative damage evident by levels of 8-oxodG, which generally are higher than those


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commonly in mammals (de Almeida et al. , 2003(de Almeida et al., 2003). Emmanouil et al. (2007)

did not detected significant oxidative DNA damage in mussels exposed to Cd (200µg/L) during

10days, but have observed the increase in lipid peroxidation end products, suggesting that Cd

induced ROS formation. In another study, it was observed that the Cd-exposure experiments

ROS production was enhanced when oyster were exposed to 160µg/ml (Larson et al., 1989).

4.2.4. Oxidative DNA lesion stability

The evolution of the hOGG1-sensitive sites levels measured during the depuration step indicated

that oxidative lesions induced by the Cd could be repaired less quickly than those induced by the

B[a]P. Indeed, Cd is known to inhib the DNA repair pathways interfering with the last step of

ligation of the BER. Thus, the inhibition of this final step induced the increase of the SSB

accumulation formed by the incomplete oxidative DNA repair (Emmanouil et al., 2007).

5. Conclusions

The aim of this study was to measure and to study the stability of the DNA oxidation lesions

induced by two urban model contaminants such as B[a]P and Cd. We can conclude that B[a]P

induced the increase of DNA strand breaks detected with the comet assay during the 24h of

exposure and then the DNA repair induced the decrease of DNA SB levels which reached the

basal level after two days of depuration. The B[a]P exposure rapidly induced oxidative DNA

damage which were repaired after one day of depuration. The cd exposure induced rapidly DNA

strand breaks following a dose-response relation. During the depuration step, the level of DNA

SB decrease but did not reached the basal level, except for the higher Cd concentration. The

oxidative lesion repair slowly induced the decrease of the hOGG1-sensitive sites which reached

the basal level after six days of depuration.

6. Acknowledgements

Aurélie Germain contributed to the completion of this study. Cécile Michel was funded by the Ile

de France region.


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Legends of tables and figures:

c

0

1

2

3

0 2 4 6 8days

me

an

OT

M

Control DMSO 0.001% BaP 7µg/LBaP 12µg/L BaP 18µg/L

Figure 1: OTM measured in mussel gill cells after 24h of exposure to B[a]P and 6days of

depuration

DNA SB data were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (7, 12 and 18µg/L) and

6days of depuration in clean water. DNA strand breaks levels are expressed as the mean OTM ±

SE measured with the comet assay. Letters represent the statistical differences obtained with the

Kruskall-Wallis test, p<0.001

0

1

2

3

4

0 2 4 6 8days

mean O

TM

Control Cd 3µg/L Cd 32µg/L Cd 81µg/L

Figure 2: OTM measured in mussel gill cells after 24h of exposure to Cd and 6days of

depuration

a a a a a

a

b

c

c c

b,c

c,d d

e

e

a a

a

b b b

c c,f c,f c

c

d

e d,e

d,e d,e,f

f

f

f a

f


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DNA SB data were measured in time, during 24h of Cd exposure (3, 32 and 81µg/L) and 6days

of depuration in clean water. DNA strand breaks levels are expressed as the mean OTM ± SE

measured with the comet assay. Letters represent the statistical differences obtained with the

Kruskall-Wallis test, p<0.001

days 0 0.2 1 2 3 7

Control nd 0.02 0.15 nd nd nd

DMSO 1% nd nd 0.70 nd nd nd

B[a]P 7µg/L nd nd nd nd nd nd

B[a]P 12µg/L nd nd 0.52 nd nd nd

B[a]P 18µg/L nd 0.33 0.43 nd nd nd

Table I: hOGG1 sensitive sites measured in mussel gill cells after 24h of exposure to

B[a]P and 6days of depuration

hOGG1-sensitive sites were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (7, 12 and 18µg/L)

and 6days of depuration in clean water. hOGG1-sensitive sites levels correspond to the

difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet assay alone (nd: not

detected)

days 0 0.2 1 2 3 7

Control nd 0.15 0.13 nd nd nd

Cd 3µg/L nd 0.42 0.36 0.05 0.48 nd

Cd 32µg/L nd 0.29 0.22 0.02 0.4 nd

Cd 81µg/L nd nd 0.62 0.25 nd nd

Table II: hOGG1 sensitive sites measured in mussel gill cells after 24h of exposure to Cd

and 6days of depuration

hOGG1-sensitive sites were measured in time, during 24h of B[a]P exposure (3, 32 and 81µg/L)

and 6days of depuration in clean water. hOGG1-sensitive sites levels correspond to the

difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet assay alone (nd : not

detected)

References :


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Partie B

- 89 -

Partie B: Etude de la réponse génotoxique exprimée par D. polymorpha in situ

La partie B concerne l’étude de la réponse génotoxique exprimée par Dreissena polymorpha

encagée sur des sites urbains du bassin de la Seine.

La génotoxicité exprimée par Dreissena polymorpha comme outil de biomonitoring a été utilisée

dans plusieurs études (Mersch and Beauvais 1997; Pavlica et al., 2001; Bourgeault et al., 2010). Or

il apparaît que des variations du taux de cassures à l'ADN au cours des saisons ont été observées

chez la moule marine. En effet, certaines études montrent que le taux de cassures de l'ADN est

plus élevé lors de la période de reproduction des moules, (Bodin et al., 2004; Skarphéinsdóttir et

al., 2005) tandis qu'une autre étude montre un taux de dommages à l'ADN plus important en été

qu'au printemps (Bolognesi et al., 2004). Nous avons cherché au cours de ce travail de thèse à

étudier dans un premier temps la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité tels que

les cassures à l'ADN et la fréquence de micronoyaux, afin d'éliminer le biais induit par des

variations potentielles dans de futures études de transplantation.

L’étude des dommages oxydatifs induits in situ est généralement réalisée par la mesure du

taux de 8-oxodG par la technique d’HPLC ou par le test comet-Fpg, moins spécifique que

l’endonucléase hOGG1 envers la 8-oxodG. Le test comet-Fpg a permis de mesurer des

oxydations de l'ADN sur des hémocytes d'huîtres exposés au peroxyde d'hydrogène (Gielazyn et

al., 2003). Une autre étude a permis de mesurer des taux de sites sensibles à Fpg chez Dreissena

polymorpha exposée au Cd (10µg/L), après respectivement 1 et 3 jours d'exposition (Vincent-

Hubert et al., 2011). Cependant, le test comet-hOGG1 n’a jamais été appliqué sur des organismes

transplantés. Afin d’approfondir nos recherches sur les lésions oxydatives nous avons mesuré

l’induction des lésions oxydatives sur des moules encagées sur des sites urbains du bassin de la

Seine avec le test comet-hOGG1.

Le chapitre IV concerne l’étude de la variabilité naturelle des biomarqueur de génotoxicité tels

que les cassures à l'ADN et la fréquence de micronoyaux, pendant une année afin d'éliminer ce

biais dans de futures études de transplantation. Ce chapitre est constitué d’un article soumis à

Aquatic Toxicology, intitulé « Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater

mussel Dreissena polymorpha ». Nous avons réalisé un caging de dreissènes d’une année sur des sites

urbains du bassin de la Seine, afin de mesurer le taux de cassures à l’ADN, la fréquence des

micronoyaux et d’autres anomalies chromosomiques, le taux de filtration et la bioaccumulation

des HAP.

Le chapitre V consistait à déterminer si la pression chimique du milieu urbain induit des

oxydations de l'ADN sur des moules transplantées. Ce chapitre est composé d’un article soumis à

Partie B

- 90 -

Environmental Science and Pollution Research et intitulé « Genotoxicity biomarkers in caged zebra

mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination ».

Cette étude consistait à évaluer si la pression chimique du milieu urbain induit des lésions

oxydatives (8-oxodG) et la formation d’adduits encombrant de l’ADN. Cette étude a été

complétée par la mesure d’autres paramètres tels que la fréquence des micronoyaux et autres

anomalies chromosomiques induites, la bioaccumulation des HAP par les moules et la

contamination de l’eau par les HAP. Le printemps et l’automne ont été choisis d’après les

résultats obtenus dans la précédente étude (cf. chapitre IV) qui montraient une faible activité de

filtration et donc une faible exposition des organismes aux contaminants présents dans la colonne

d'eau. Parallèlement à ce travail de recherche des lésions oxydatives, nous avons recherché si la

transplantation des moules pouvait ou non avoir un impact sur le statut physiologique des moules

afin de valider l'utilisation de cette technique pour la mesure de biomarqueurs en biomonitoring.

Le détail des résultats de bioaccumulation des HAP par les moules est présenté en annexe 1.

Chapitre IV

Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ

Chapitre IV : Variabilité naturelle des cassures à l'ADN et des micronoyaux in situ

- 93 -

Publication 3: Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena polymorpha

Résumé

Les biomarqueurs de génotoxicité sont de bons outils pour surveiller la qualité physicochimique

et biologique des écosystèmes aquatiques. Afin d’interpréter les réponses génotoxiques exprimées

par les espèces sentinelles, il est nécessaire de comprendre leur sensibilité face aux facteurs

biotiques et abiotiques.

Une étude de caging de dreissènes d’un an a été réalisée dans le bassin de la Seine. Trois sites ont

été choisis selon un gradient de contamination chimique croissant : un site amont de Paris et trois

sites en aval de Paris. Les taux de cassures à l’ADN et les fréquences de micronoyaux ont été

mesurés sur les moules transplantées sur les sites d’étude en hiver, au printemps et en été.

Parallèlement à ces mesures, un suivi de la contamination chimique en HAP de l’eau a aussi été

réalisé, ainsi que des mesures de bioaccumulation, d’indice de condition, d’indice gonado-

somatique et du taux de filtrations ont été évalués sur les dreissènes. Les résultats montrent un

faible taux de cassures à l’ADN en hiver qui augmente au printemps en même temps que le taux

de filtration et que l’indice gonado-somatique. A la même période, le taux de micronoyaux et la

bioaccumulation des HAP par les moules diminuent. Les résultats obtenus par les tests comète et

micronoyaux donnent des résultats différents, mais sont complémentaires. Les plus forts taux de

cassures à l’ADN ont été détectés au printemps, qui semble être une saison favorable pour

étudier ce biomarqueur. Les taux de cassures de brins et de fréquence des micronoyaux montrent

des variations intersites correspondant au gradient de contamination chimique. Nos résultats

montrent que le taux de cassures à l’ADN et la fréquence des micronoyaux, appliqués aux cellules

de branchies de moules transplantées sont des outils sensibles pour surveiller la génotoxicité du

milieu aquatique soumis à l’urbanisation de Paris.

Mots clés

Moule zébrés, test comète, test micronoyaux, variabilité saisonnière, biomarqueurs de

génotoxicité


- 95 -

Seasonal fluctuations of genotoxic biomarkers in the freshwater mussel Dreissena

polymorpha

Cécile Michel 1, Adeline Bourgeault 1, Catherine Gourlay-Francé 1, Frédéric Palais 2, Alain

Geffard 2 and Françoise Vincent-Hubert 1

1CEMAGREF, Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés, 1 rue Pierre-Gilles de

Gennes CS 10030, 92761 Antony Cedex, France

2Université de Reims Champagne-Ardenne, EA2069 URVVC-SE, Laboratoire d'Ecologie -

Ecotoxicologie, UFR Sciences, Moulin de la Housse, BP 1039, 51687 Reims Cedex 2, France


Tel: +33 0(1) 40 96 61 21

Fax: +33 0(1) 40 96 61 99



- 96 -

ABSTRACT: Genotoxicity endpoints are a useful tool to biomonitor the physicochemical

and biological quality of aquatic ecosystems. In order to interpret the genotoxic responses

measured in sentinel species, their sensitivity to biotic and abiotic factors has to be understood. A

one-year caging study on the freshwater bivalve Dreissena polymorpha was conducted in the Seine

river basin. Three sites were chosen along the Seine River: one upstream from Paris and two

downstream, corresponding to a chemical gradient of water contamination. The DNA strand

break (Comet assay) and the chromosomal damage (micronucleus test) were measured in exposed

mussels at each site and in every season, along with PAH water contamination, PAH

bioaccumulation, mussel condition index (CI), gonado-somatic index (GSI) and filtration rate

(FR). Results showed a low level of DNA strand breaks in winter which increased in spring,

concomitantly with FR and GSI. Over the same period, micronucleus (MN) frequency and PAH

bioaccumulation decreased significantly in exposed mussels, both parameters being positively

correlated to each other. The highest DNA strand break levels were detected in spring, which

therefore seems to be the best season to study DNA damage. DNA strand break levels and MN

frequencies showed intersite variations corresponded to the chemical contamination gradient.

These two genotoxicity endpoints usefully complement each other in field studies. Our results

show that the MN test and comet assay, when applied to gill cells of caged zebra mussels, are

sensitive tools for freshwater genotoxicity monitoring.

Keywords: zebra mussel, comet assay, micronucleus test, seasonal variation, genotoxic

biomarkers.


- 97 -

Introduction

The chemical contamination of the Seine estuary has been studied for ten years in the Seine-

Aval program. The bulk of the flow of contaminants entering the Seine estuary comes from

upstream, mainly the Paris basin (Lachambre and Fisson 2007). The principal sources of pollution

in the Seine river basin are urban sprawl and intensive agriculture. This area of the French

territory (75000km²) is inhabited by 16 million people, most of whom are concentrated within 2%

of this area (Blanchard et al., 2007). The high population density leads to elevated levels of metals

and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), which come from domestic and industrial

wastewater as well as agricultural activities (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et

al., 1999; Tusseau-Vuillemin et al., 2007; Thévenot et al., 2009).

Water pollution directly influences aquatic life. Characterizing the impact of contamination on

the health status of biota requires specially-designed biological methods. Mixtures of micro-

contaminants present in the water could affect many species at different levels of biological

organization, e.g. infra-individual (cell viability, organ functions), individual (growth, reproduction,

survival), populational (Bickham et al., 2000; Dixon et al., 2002). The study of biomarkers at the

organism level, in species sensitive to contaminants makes it possible to observe the impact of

chemical pressure. A biomarker is a change in a biological system, that can be related to an

exposure to, or an effect of, a specific xenobiotic or other types of toxic materials (Henderson et

al., 1989).

Genotoxicity endpoints are widely used as early indicators of the effects of exposure to

contaminants. Binelli et al. (2007) compared three different biomarkers (acetylcholinesterase

(AChE) activity inhibition, ethoxy resorufin-O-deethylase (EROD) activity induction and DNA

strand breaks) in Dreissena polymorpha (also known as zebra mussel), an organism commonly used

as a bioindicator of freshwater pollution (Kraak et al., 1991; Mersch and Johansson 1993; Binelli et

al., 2007; Bourgeault et al., 2010). Mussels were collected in Lake Maggiore (Italy-Switzerland) and

results indicated that the evaluation of DNA strand breaks was the strongest discrimination factor

between sites. The comet assay, also known as single cell gel electrophoresis, enables the detection

of DNA damage as single or double strand breaks and alkali-labile sites, in various types of

individual cells. First introduced by Ostling and Johanson (1984) and then modified by Singh et al.

(1988), the comet assay is widely used to measure DNA strand breaks in plants, worms, molluscs,

fish, amphibians and mammalians in biomonitoring studies (Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et

al., 2009). In many studies, the comet assay applied to Dreissena polymorpha has proved to be a

useful tool to determine the genotoxic potential of a polluted environment (Pavlica et al., 2001;


- 98 -

Rocher et al., 2006; Binelli et al., 2007; Bourgeault et al., 2010).

The micronucleus assay allows the detection of chromosomal aberrations in organisms.

Micronuclei (MN) are small chromatin bodies visible in the cytoplasm after cell division. MN are

formed by the loss of a piece of chromosome as a result of DNA double-strand breakage

(clastogenic effect) or by the loss of an entire chromosome as a result of protein dysfunctions in

chromosome segregation (aneugenic effect) (Kirsch-Volders et al., 2003). The comet and MN

assays are complementary genotoxicity tests, that have proved very reliable in the analysis of

genotoxic effects in aquatic environments (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Rank et al.,

2005). In a previous field study with zebra mussels, we recently observed that the induction of

DNA strand breaks and the rate of micronuclei were higher in gill cells than in haemocytes

(Bourgeault et al., 2010), which was confirmed by a laboratory experiment (Vincent-Hubert et al.,

2011). The MN test can be complemented by the detection of other types of chromosomal

aberrations, also indicative of cellular dysfunction: binucleated cells caused by the blocking of

cytokinesis or cell fusion (Rodilla 1993); nuclear buds caused by elimination of amplified DNA

(Miele et al., 1989; Shimizu et al., 1998; Shimizu et al., 2000) and possibly by elimination of DNA-

repair complexes (Haaf et al., 1999). In addition to these anomalies, apoptotic cells (Izquierdo et

al., 2003), which correspond to the programmed cell death, can also be detected.

In field studies, individual genotoxic responses depend not only on chemical exposure, but

also on various factors such as physiological status, and in particular reproductive status. Little

data is available on the potential influence of these confounding factors on genotoxic responses.

In the case of Mytilus galloprovincialis, Bolognesi et al. (2004) detected a higher level of DNA strand

breaks in September than in May, and the opposite pattern for MN frequency. Besides, other

studies (Magni et al., 2006; Pavlica et al., 2008) detected higher MN frequencies in marine mussels

in summer than in autumn. Several factors may explain the seasonal variability of the genotoxic

responses. Firstly, the physiological status of the organisms, strongly linked to water temperature,

could influence the metabolic activities of zebra mussels and, besides, modify the

bioaccumulation kinetics of pollutants, which would in turn modify the biomarkers’ responses

(Bolognesi et al., 2004). Secondly, the physicochemical characteristics of water vary between

seasons, which modulate the bioavailability of pollutants and therefore potentially influence the

genotoxic response. Finally, water contamination also varies from season to season, and the

evolution of the nature and concentrations of the pollutants could be considered as one possible

cause of the genotoxic response’s variability.

In this study, we chose to use a freshwater mussel, Dreissena polymorpha. The aim of this study


- 99 -

was to determine whether the genotoxic response of Dreissena polymorpha could vary depending on

the seasons, and to investigate the impact of contamination on DNA strand breaks and MN

levels. Indeed, the genotoxic response of zebra mussels has never been studied over the course of

several seasons in the Seine river basin. The genotoxic response of zebra mussels was monitored

for one year in mussels transplanted onto three study sites. These sites are located in the Seine

river basin, along an increasing gradient of chemical contamination.



Dispase II was purchased from Roche Diagnostic (Meylan, France) and all other reagents

were purchased from Sigma-Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France).

2.2. Mussel sampling and caging

Zebra mussels were collected at a reference site, not located in the Seine basin, but on the

Meuse river (France) in October 2008. Mussels were manually removed from rocks using a

scalpel, selected by length (20-30mm) and rapidly brought back to the laboratory in water from

the collection site. The mussels were distributed into polyethylene 5mm-mesh experimental cages,

which contained 12 organisms each (length 25-30mm), for genotoxicity assays. In the case of

PAH bioaccumulation, filtration rate and gonado-somatic index measurements, 25, 15 and 30

organisms were respectively caged (length 20-24mm). The cages were maintained in water from

the canal sampling site until field deployment the following day. Cages were implanted in October

2008 at three sites (fig.1) in the Seine river basin (France): one site 200km upstream from Paris

(site 1), chosen as a site which is not affected by the Paris area, and the other two downstream

from Paris (sites 2 and 3). Site 2, 40km downstream from Paris, is subject to diffuse urban

contamination (atmospheric fallouts from Paris and its suburb, discharge of combined sewers)

and site 3, 80km downstream from Paris, is subject to both urban contamination and the Seine-

Aval wastewater treatment plant (Priadi et al., 2011).

As regards the genotoxic measurements, mussels were sampled from each transplantation

site in winter (January), spring (April), summer (June) and autumn (September) 2009, but results

for September are not available because all of the mussels had died. The physicochemical

characteristics of water at the three sites were monitored monthly during the study (water


- 100 -

temperature, pH, anions/cations, chlorophyll, dissolved and particulate organic carbon, total

suspended solids). Results are presented in detail in a concomitant study (Priadi et al., 2011). Back

in the laboratory, 15 mussels were immediately processed for filtration rate measurement; 12

others were sacrificed and used for the calculation of morphological indices and genotoxic assays;

25 for the bioaccumulation, while another 30 were used to determine the gonado-somatic index.

2.3. Exposure parameters and biological data

Morphological indices and survival rate Mussels were opened, the byssus taken off and the soft body parts (gills, gonad and

remaining soft tissues) removed from the shells. Soft body parts and shells were then weighed.

The condition index (CI) was calculated as the ratio between the total wet weight of soft tissues

and the total wet weight of the mussel (including the shell). The gonado-somatic index (GSI) was

calculated as the ratio between the wet weight of the isolated gonad and the total wet weight of

soft tissues. The percentage of mortality was measured at each sampling site in each season as the

ratio between dead mussels and live mussels.

Filtration rate measurement Once brought back to the laboratory, mussels (length 20-22mm) were used for "ex situ"

filtration rate measurements as described by Bourgeault et al. (submitted). For each site, the

apparent filtration rate (FRapp) was measured in filtered field water spiked with 1.106cells.mL-1 of

algae (Selenastrum capricornutum). The decrease in algae concentration after 2h of mussel exposure

was measured with a spectrophotometer set at 680nm. The experiments were conducted in

triplicates on 5 pooled mussels in a thermostated room adjusted to the site water temperature.

FRapp was corrected in order to take into account the total suspended solids (TSS) concentration

in the field (Bourgeault et al., submitted).

Bioaccumulation of PAHs in mussels

PAH analyses were performed on 15 freeze-dried mussels (length 20-22mm) pooled and

reduced to a powder. The detailed protocol is described by Bourgeault et al. (2010). To put it

briefly, 0.5g of dried mussel tissue were microwave-extracted in 20mL of Heptane/Acetone

(50/50) (v/v) containing an internal standard. The extract was then filtered using a GFF filter,

evaporated to a final volume of 500µL and purified using a silica gel column (Silica cartridges


- 101 -

Chromabond Macherey-Nagel, France). Thirteen PAHs, corresponding to the US EPA list

except naphthalene, acenaphtene and acenaphtylene, were quantified by gas chromatography-

mass spectrometry (GC-MS Thermo Trace GC Ultra-DSQII). Results were expressed in µg of

PAH per g of dry weight (µg.gdw-1).

Measurement of labile dissolved PAHs

The water contamination in PAHs was monitored using integrative passive samplers. At

each site, two Semi Permeable Membrane Devices (SPMDs) (Exposmeter, Sweden) were

deployed for one month to assess labile PAHs. SPMD has been shown to provide a good

estimate of bioavailable dissolved PAHs (Gourlay et al., 2005). Three additional SPMDs were

used at each sampling date to assess a possible contamination in the laboratory or at the sites.

SPMDs were dialyzed for 48h in 250mL heptane spiked with 100µL of internal standard at

5mg/L on a shaking table. The heptane solution containing the PAHs was then concentrated

down to 1mL with a rotary evaporator. The silica columns (Silica cartridges Chromabond

Macherey-Nagel, France) were conditioned beforehand with 4mL of heptane/Ethylacetate 94/6

(v/v) and were then used to purify the sample. Cartridges were eluted with 20mL of

heptane/Ethylacetate. The sample was concentrated under nitrogen-flow. 1mL of heptane was

then added, and the sample was then dried. As for PAH bioaccumulation, 13 PAHs were

analysed in the extract. The data analysis is described in detail elsewhere (Tusseau-Vuillemin et al.,

2007).

2.4. Comet assay

2.4.1. Isolation of gill cells

Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described

by Vincent-Hubert et al. (2011). To put it briefly, gills were carefully removed, rinsed in cold

phosphate buffered saline (PBS) diluted one third in water, cut into three pieces each to facilitate

the cells’ dissociation from the gill, and incubated with dispase II (2U/mL) for 30min at 37°C.

The cellular suspension was removed and centrifuged at 1200rpm (600g) for 5min.

Supernatant was removed and cells were resuspended in PBS diluted one third in water. The

cellular suspension was then kept on ice to minimize endogenous damage during slide

preparation. All of these steps were performed in a dark room lit with low-intensity red light to

minimize the induction of additional DNA damage.


- 102 -

Cell viability was assessed using the Trypan blue exclusion test (Bourgeault et al., 2010;

Vincent-Hubert et al., 2011). The comet assay was performed only when cell viability exceeded

90%.

2.4.2. Comet assay

DNA damage was quantified in gill cells using the comet assay as described by Singh et al.

(1988) and modified as follows. 90µL of 0.5% low-melting agarose (LMA) in PBS mixed with

10µL of cell suspension were spread on pre-coated slides (0.5% normal melting agarose) and

covered with a cover slip. After agarose polymerization at 8°C for 15min, the cover slips were

removed and the slides were placed in a lysis solution (2.5M NaCl, 0.1M EDTA, 0.01M Tris, 1%

Triton X-100 and 10% DMSO, pH 10) at 8°C for at least 1h. The slides were rinsed three times

in PBS in a Coplin jar and placed at 8°C for 15min in a horizontal electrophoresis tank filled with

cold electrophoresis buffer (0.3M NaOH, 0.001M EDTA, pH 13, 8°C) for DNA unwinding.

Electrophoresis then took place at 0.78V/cm, 300mA for 10min at room temperature (Buschini et

al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Frenzilli et al., 2004; Vincent-Hubert et al., 2011). After

electrophoresis, the slides were neutralized 3 times in a Coplin jar for 5min in a neutralization

buffer (0.4M Tris/HCl, pH 7.5 – 3 x 5 min). Finally, the slides were drained and immersed in 70°

ethanol for 5min to dehydrate the agarose, and then left to dry. The slides were stored at room

temperature until staining.

Quantitation of comet assay data

Each slide was stained with 30µl of ethidium bromide (0.8µg/ml) and a cover slip was

added. The slides were examined the next day with a fluorescence microscope (Olympus BX51,

60X lens). For the quantitation of the comet assay data, we used an image analysis system (Komet

5.5, Andor Technology) linked to a CCD camera. One hundred randomly chosen nuclei were

examined per mussel (1200 nuclei per site). The level of DNA damage was expressed as Olive

Tail Moment (OTM = Tail DNA % x (tail mean-head mean)) (Olive et al., 1990) in Arbitrary Unit

(AU). All slides were coded and analyzed blind.

2.5. Micronucleus assay

The micronucleus (MN) assay was performed according to Bolognesi et al. (1999) and

modified according to Bourgeault et al. (2010): gill cells were fixed in Carnoy’s solution


- 103 -

(methanol/acetic acid (3:1)) for 20min at room temperature, then spread onto slides which were

stored in a humidified room for one night. The slides were then rinsed, stained for 15min with

4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (1µg/ml in methanol). PBS:Glycerol (33% 1:1) was added

in each slide, and the slides were covered with a cover slip. They were then observed with a

fluorescence microscope; one thousand cells with preserved cytoplasm per mussel were selected

at random to determine the frequency of micronuclei, binucleated cells, nuclear bud cells and

apoptotic cells using the criteria proposed by Kirsch-Volders et al. in 2003 (2003).

2.6. Statistical analysis

The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the comète and

MN data. As regards the comète data, normality was not respected, so that the non-parametric

Kruskal-Wallis test was performed, followed by Dunn's post-hoc test to evaluate significant

differences between seasons and sites (α=5%). In the case of the MN data, normality was

respected; therefore the parametric t-test was performed. The Kruskal-Wallis test was performed

using the XLSTAT© 2010 software and the t-test was performed using R software version 2.7.1.

Principal Component Analysis (PCA) was performed on the normalised results of comète

data, MN data, mortality rate, Filtration Rate, gonado-somatic index and PAH bioaccumulation

(as explanatory variables), as well as labile dissolved PAHs in the water column sampled by

SPMD and water temperature (as supplementary variables) to study the link between the

biological responses and environmental factors. Statistical analysis of the data was performed

using the XLSTAT© 2010 software (α=0.05).

3. Results

3.1. DNA damage measured through the comet assay

The levels of DNA damage (mean OTM) were measured in Dreissena polymorpha gill cells

over three seasons (figure 2).

The mean OTMs measured in gill cells varied from season to season. We noticed that at

each site, the mean OTM was lower in January than in April and June (p<0.05). In April, OTMs

increased significantly (p<0.05) before decreasing in June, with the values measured in June

remaining higher than those measured in January. These results show that the level of DNA

strand breaks is higher in April and June than in January (January < June < April).


- 104 -

As regards the intersite differences of the OTM, we observed higher OTM values in

mussels caged on sites 2 and 3 than in mussels caged on site 1 (p<0.001), whatever the season.

The widest difference was always noted between site 1 and site 3 (OTM: +0.15UA in January,

+3.85UA in April, +0.66UA in June at site 3). This data clearly indicates an increase of DNA

strand breaks at the downstream sites compared with the upstream site.

3.2. Micronucleus assay

The frequencies of micronuclei, binucleated cells, nuclear buds and apoptotic cells,

measured through the MN assay protocol, are represented in figure 3.

MN frequencies decreased slightly between January and April (p<0.05), and remained

stable in June. Higher levels of binucleated cells and apoptotic cells were measured in mussels in

January than in April (p<0.05), while in June they both plunged to almost zero. The nuclear bud

frequency was always weak (between 0 and 0.75 ‰) and did not vary significantly over the three

seasons.

As regards the intersite differences, we observed that the MN frequency was always higher

in mussels from site 3 than in mussels from site 1 (p<0.05). The MN frequency was higher in

mussels from site 2 than in mussels from site 1 in June only (p<0.05).

Higher frequencies of apoptotic cells were noted in mussels exposed at the downstream

sites than in mussels exposed at the upstream site, but only in January (p<0.05). No intersite

variations were ever observed for the frequencies of binucleated cells and nuclear buds.

3.3. Parameters of exposure and biological data

Mussel mortality, CI, GSI, FR and PAH bioaccumulation, as well as labile dissolved PAHs

in water and water temperature are represented in Table I.

The mortality rate shows a gradual increase over the seasons, up to the death of all caged

mussels in September at the three sites (data not shown). No variation of CI between seasons was

noticed. Only a slight increase of CI was observed in April at site 2 (p<0.05) and a slight decrease

in June compared with January at site 1 (p<0.05). As regards the intersite variations, the CI of

mussels from site 1 was lower than that of mussels from site 2 in April (p<0.05) and than that of

mussels from site 3 in June (p<0.05). The FRs measured on mussels (20-22mm) were higher in

April than in January (48 and 18ml/mussel/h respectively). In June we noticed a slight decrease in

FR compared with April (48 to 31ml/mussel/h). At each site, GSI was significantly higher in


- 105 -

April than in January (p<0.001 at sites 2 and 3, p<0.05 at site 1) and June (p<0.001). No intersite

variation of the GSI could be observed in any season. PAH bioaccumulation was lower in April

than in January and June at the three sites. In April, a great difference between the upstream site

and the two downstream sites was observed: the concentration of bioaccumulated PAHs in soft

tissues averaged 521ng/g dry weight at site 1 while it averaged 1472 and 1164ng/g dry weight at

sites 2 and 3 respectively. The water contamination in PAHs, measured using SPMDs, showed an

increase in April and June compared with January at sites 2 and 3. A great difference between the

upstream site and the two downstream sites was observed. The average contamination at site 1

was about 6ng/L while it was about 43 and 21ng/L at sites 2 and 3 respectively. The water

temperature, which was similar at the three sites in each season, showed a marked increase in

April compared with January (from 5°C to 15°C), and continued to increase in June (from 15°C

to 20°C).

3.4. Principal component analysis

The correlation circle (fig. 4, a) of the PCA shows a high positive correlation between

bioacc and MN (r = 0.812), bioacc and T (r = 0.733), bioacc and mortality (r=0.536), FR and GSI

(r = 0.179), FR and comète (r = 0.117), and a high negative correlation between FR and MN (r =

-0.946) as well as bioacc and comète (r = -0.167).

The second chart (fig. 4, b) highlights the distinctions between the different sites and

seasons. The data from January and June were plotted on the right side of the graph, while only

the April data were plotted on the left side of the graph. The horizontal axis is positively

correlated with the MN frequencies, FR and bioaccumulation (squared cosine: 0.894, 0.853 and

0.826 respectively). The vertical axis shows a clear separation between the upstream site (site 1) at

the bottom of the graph and the two downstream sites (sites 2 and 3) at the top of the graph. The

second axis is positively correlated to the mortality rate and the comète data (squared cosine:

0.776 and 0.704 respectively).

The first axis seems to separate the data according to seasons and the second axis

according to the location of the exposure site, even though we need to keep in mind the fact that

many other factors, not studied in this article, could also separate the observed results.


- 106 -

4. Discussion

Seasonal variations of DNA strand breaks, chromosomal aberrations and apoptotic cells:

The in situ study has not revealed any statistically significant variations of CI over the

seasons. The variations of the genotoxic response were not correlated to the evolution of the

"global health status" as revealed by CI, which contrasts with the high positive correlation

between the DNA strand breaks detected by the comet assay and the mortality rate. Other

physiological mechanisms may have occurred and could explain the variability of the genotoxic

response.

In winter (January), the low level of DNA strand breaks could be explained by the lower

water contamination in PAHs measured at sites 2 and 3, compared to April and June. Indeed, as

observed in many studies (Pavlica et al., 2001; Pavlica et al., 2008; Bourgeault et al., 2010), water

contamination has a major influence on the genotoxic response, especially in the case of (but not

restricted to) PAH contamination (Binelli et al., 2007).

Moreover, during the winter months, because of low water temperatures (<4°C), the

zebra mussels are dormant (Herman L. 2010). Their low activity in winter was evidenced by the

very low estimates of mussel FRs. Thus, the low filtration rate observed in January may have

resulted in a low filtration of contaminants, as previously shown by Gossiaux et al. (1996),

leading to a reduced absorption of PAHs and therefore to a limited genotoxic response.

The increase of water temperatures, from January to April (4 to 15°C), allowed

development and maturation of the gonad. This was highlighted by the peak of the gonado-

somatic index in April, which is consistent with the fact that in Dreissena polymorpha, the pre-

spawning stage of gonadal development occurs in late spring / early summer (Mackie 1991;

Garton and W.R. Haag 1992; Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001; Juhel et

al., 2003). In spring, the water temperatures increase, leading to the FR increase. Contrary to what

was expected, FR was negatively correlated to bioaccumulation, and no correlation was observed

between bioaccumulation and water contamination in PAHs. Indeed, during the spring, FR

increased, but the increase of water temperatures activated the reproduction maturation, and thus

the growth of soft tissue. The growth of soft tissue led to the decrease of the PAH concentration

in soft tissues (Bourgeault et al., 2010). During the summer, we noticed a decrease of FR

(Bourgeault et al., in prep), which probably reduced the exposure to contaminants, leading to the

observed decrease of the genotoxic response. Spawning could also have lowered the


- 107 -

concentration of bioaccumulated PAHs. Indeed, bioaccumulated PAHs are lipophilic and could

have been eliminated with the bulk of the lipid content, which is lost as a result of the release of

gametes during spawning season (Carro et al., 2004). As previously observed in clams [48], the

reproductive cycle of zebra mussels may modulate biomarker responses and also influence

sensitivity to some contaminants (Blaise et al., 2002). This link was also observed by Bodin et al.

(2004) in M. galloprovincialis and (Skarphéinsdóttir et al., 2005) in M. edulis, who detected higher

DNA adduct levels during the reproduction maturation. As zebra mussels devote more energy to

reproduction than to growth (Stoeckmann 2003), the period of reproduction could also increase

sensitivity to potential genotoxic compounds and impair the DNA repair capacity, affecting the

DNA in zebra mussel gill cells (Hartl et al., 2004) as observed in April. The increase of water

temperature also seems to affect the survival rate of caged mussels from one season to the next.

The higher temperatures induce decreasing oxygen rates, and therefore the death of mussels.

It was shown that gametogenesis, in mussels, caused high respiration rates (de Vooys

1976) and therefore an increase of oxygen consumption (Rajagopal et al., 2005), leading to the

generation of Reactive Oxygen Species (ROS) (Verlecar et al., 2007; Bigot et al., 2009), which

damage lipids, proteins and DNA (Riso et al., 1999).

The detection of many types of chromosomal abnormalities is useful to assess the impact

of environmental pollution (Barsiene et al., 2006). In this study, we observed that in caged

mussels, MN frequency was higher than the frequencies of other nuclear abnormalities, and seems

to be the most stable parameter throughout the seasons. It decreased slightly from January to

April but micronuclei could always be detected, contrary to binucleated cells or apoptotic cells.

The mechanisms behind the variability of MN frequencies from season to season remain

unclear. In the case of Mytillus galloprovincialis, Pytharropoulou et al. (2006) detected a lower MN

frequency in spring than in winter. Other studies, on the contrary, detected an increase of MN

frequency in spring (Izquierdo et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Barsiene et al., 2006; Magni et al.,

2006; Pytharopoulou et al., 2006), which is generally attributed to an increasing exposure to

genotoxic contaminants. In this study, the results of the comète and MN assays are anti-

correlated. The MN frequencies are positively correlated to the PAHs bioaccumulated in mussels,

while the level of DNA strand breaks seems to be more closely related to water contamination.

The water contamination in PAHs observed in winter was not correlated to the levels of DNA

strand breaks, due to a low FR which limited the exposure to genotoxic contaminants. In spring,

the increasing water contamination in PAHs of sites 2 and 3, combined with the increase of FR,

induced a higher exposure to contaminants and thus an increase of DNA strand breaks at these


- 108 -

sites. In summer, a slight decrease of the water contamination in PAHs, combined with the

decrease of FR, induced a decrease of DNA strand break levels at sites 2 and 3. Mutagenic effects

detected by the MN assay are more stable in time, because they are the result of chromosome

breaks or mitotic anomalies, which require a passage through mitosis to be detectable and are not

repairable. This delayed response of the formation of micronuclei and their higher stability could

explain why the comet assay and MN data did not increase or decrease simultaneously. This

difference could also be explained by the fact that the comet assay detects primary repairable

damage, and therefore reversible DNA lesions (alkali labile sites, single strand DNA breakage),

whereas the MN assay detects more persistent chromosomal aberrations that cannot be repaired

(Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001). Moreover, DNA damage, measured using the comet

assay, results from two main processes: direct DNA scission and alkali-labile sites induced by

genotoxic compounds or DNA strand breaks induced by the DNA repair; whereas micronuclei,

once formed, stay present in the cell until the end of its life-span (Klobucar et al., 2003). Because

of a higher sensitivity to some contaminants, the DNA repair activity could be more effective and

induce higher levels of DNA strand breaks. The comet assay and MN tests are widely applied in

genotoxicity testing and biomonitoring. The DNA damage measured by the comet assay appears

earlier than micronuclei (Deventer 1996), which require cell division. Its longevity is much

shorter, indicating recent pollution status (Bolognesi et al., 1995), than that of micronuclei, which

last as long as the cell itself.

Genotoxicity end-points are related to the urban chemical contamination

Mussels exposed at the downstream sites displayed higher levels of DNA damage than

mussels exposed at the upstream site. Our results are consistent with many biomonitoring studies

that use the zebra mussel as a sentinel species. Klobucar et al. (2003), working on the Sava river,

also observed higher levels of DNA strand breaks at sites where the contamination in genotoxic

chemicals was greater. This observation allowed them to conclude that Dreissena polymorpha is a

sensitive species for freshwater genotoxicity monitoring. Binelli et al. (2007) concluded that the

evaluation of DNA strand breaks using the comet assay applied to Dreissena polymorpha had the

strongest discriminating power between sites. The same trend was observed in a previous caging

study on zebra mussels, in a smaller urban river (Bourgeault et al., 2010). In our study, the

upstream site was located 200km upstream from Paris, and was therefore not subjected to much

urban pollution. The comet assay results seem to be representative of the contamination gradient

in PAHs observed between the three sites (Priadi et al., in submission). Thus, the comet assay

seems to be a good indicator of the genotoxic response expressed by zebra mussels caged in a


- 109 -

contaminated urban area, in the Seine river basin.

MN frequency remained weak (<10‰), as is generally found in Dreissena polymorpha

(Mersch and Beauvais 1997; Vincent-Hubert et al., 2011). Indeed, Mersch et al. (1997) detected

MN frequencies that ranged from 5.0 to 8.8‰ in mussels exposed to effluents. These levels were

significantly higher than the baseline level of 2.0‰ recorded in a concurrent control mussel

group reintroduced at the reference location. In our study, at the downstream sites, the MN

frequencies measured in the gill cells of zebra mussels were higher than at the upstream site (site

1). No significant difference could be detected between the two downstream sites, which are

both impacted by urbanization. These results are consistent with the upstream/downstream

pollution gradient. The moderate, but significant, induction of MN in zebra mussel gill cells

transplanted to urban sites emphasizes the practical feasibility and the ecotoxicological usefulness

of the method (Mersch and Beauvais 1997).

5. Conclusion

This study has allowed us to establish the positive correlation between MN frequency and

PAH bioaccumulation. The increase of DNA strand break levels in spring was linked to the

increase of FR, and thus to the higher exposure to water contaminants. Bioaccumulation was not

correlated to levels of either DNA strand breaks or water contamination. The biological dilution

induced by the activation of reproduction led to the decrease of the PAH concentration in soft

tissues.

These results highlight the complexity inherent to the study of genotoxic biomarkers. MN

frequency seems to be stable throughout the seasons and to discriminate between non-impacted

sites and urban sites. DNA strand break levels seem to be related in part to water temperature,

which conditions FR and thus the exposure to contaminants. The activation of reproduction,

induced by the increase of water temperatures detected in spring, also seems to induce a higher

sensitivity of mussels to the contamination, which results in higher levels of DNA damage in

mussel gill cells.

This study confirms that the use of these two assays in field studies is informative because

they complement each other. Our results support the performing of MN tests and comet assays

on gill cells from caged mussels as a sensitive tool for freshwater genotoxicity monitoring.

Spring and the start of summer seem to be the best seasons to study the genotoxic

response expressed by the zebra mussel. Indeed, in winter the low FR reduces the exposure to


- 110 -

contaminants, whereas the increase of FR induced by the increase of water temperature in spring

enables the detection of the DNA strand breaks induced by water contamination. In the near

future, we wish to investigate the autumn response in order to determine if it is also related to

water contamination.

6. Acknowledgements

Aurélie Germain and Amélie Dubois contributed to the completion of this study. Julien Guieu

provided linguistic support. Cécile Michel and Adeline Bourgeault acknowledge a PhD grant from

the Ile-de-France Regional Council (R2DS program). This work is part of the PIREN-Seine

research program, which was also funded by ONEMA.

Captions of tables and figures:

Figure 1: Location of the three exposure sites in the Seine river basin


- 111 -

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

site 1 site 2 site 3 site 1 site 2 site 3 site 1 site 2 site 3

January April June

me

an

OT

M

0

5

10

15

20

25te

mp

era

ture

s (°C

)

Figure 2: Seasonal evolution of the OTM measured in gill cells of caged Dreissena polymorpha (mean ± SE) in

January, April and June. Site 1: upstream site, Sites 2 and 3: downstream sites impacted by the urban sprawl

around Paris (p<0.05)

02468

1 2 3 1 2 3 1 2 3

January April June

freq

uen

cy ‰

a b, c b

a

c

d

b, c

e f

a

a,d,

e,f

a,b,

d,f b,f

c,e

d,c,f d,f e

f

f


- 112 -

0

2

4

6

8

1 2 3 1 2 3 1 2 3

January April June

fre

qu

en

cy

‰

0

1

2

1 2 3 1 2 3 1 2 3

January April June

fre

qu

en

cy

‰0

5

10

15

1 2 3 1 2 3 1 2 3

January April June

freq

uen

cy ‰

Figure 3: Seasonal evolution of the frequencies of a) micronucleated cells, b) binucleated cells, c) nuclear bud cells

and d) apoptotic cells, in Dreissena polymorpha gill cells (mean ± SD) in January, April and June. Site 1:

upstream site, Sites 2 and 3: downstream sites impacted by the urban sprawl around Paris (p<0.05)

Variables (axes F1 et F2 : 72.16 %)

FR

IGSbioacc

comet

MN

mortality

T HAP

-1

-0.5

0

0.5

1

-1 -0.5 0 0.5 1

F1 (46.29 %)

F2

(2

5.8

7 %

)

explanatory variables supplemantary variables

Observations (axes F1 et F2 : 72.16 %)

Site 3 Ju

Site 2 Ju

Site 1 Ju

Site 3 Ap

Site 2 Ap

Site 1 Ap

Site 3 Ja

Site 2 JaSite 1 Ja

-2

-1

0

1

2

-3 -2 -1 0 1 2 3F1 (46.29 %)

F2 (

25.8

7 %

)

Figure 4: Representation of the different parameters measured during the caging by a) Principal Component

Analysis, score plot (Correlation circle) b) Principal Component Analysis, loading plot

b c

a

d

a

a,c a

a

b,d b,c b,d

d d d

a,c

a,b a,b,c b

a,b,c

b

a,b,c

c

a,b

a

b

c

a a a a a a


- 113 -

January April June

Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3 Site 1 Site 2 Site 3

CI 0.27 ± 0.02

0.23 ± 0.02

0.28 ± 0.03

0.21 ± 0.02

0.30 **/Δ ± 0.02

0.24 ± 0.02

0.21 *± 0.01

0.24 ΔΔ

± 0.01 0.24 ± 0.01

Mortality (%) 0 0 16 4 28 8 12 24 20

FR 34.65

± 14.44

14.09 ± 0

7.66 ± 6.17

42.12 ± 9.99

72.42 ± 18.52

30.74 ± 5.95

40.52 ± 12.22

29.57 ± 8.43

22.06 ± 3.15

GSI 0.07 ± 0.03

0.08 ± 0.03

0.08 ± 0.03

0.10 ± 0.03

0.11 ± 0.03

0.12 ± 0.04

0.05 ± 0.03

0.07 ± 0.02

0.07 ± 0.02

Bioaccumulation of PAHs

ng/g dry weight

1658 ±

248.7

2577 ± 387

2332 ± 350

520 ± 78 1472 ±

221 1164 ±

221 1385 ±

207 3365 ±

505 1953 ±

293

labile dissolved PAHs ng/L

10.97 ± 0.29

35.11 ± 5.17

15.03 ± 1.62

3.49 ± 0.27

48.69 ± 6.92

22.78 ± 3.12

3.83 ± 0.23

44.10 ± 4.03

26.46 ± 3.28

water temperature

6.00 4.50 4.90 14.90 16.00 15.40 19.00 20.70 20.10

Table I: Parameters measured during the caging in January, April and June: Mean of Condition Index, mortality

rate, Filtration Rate (mean ± SD), Gonado Somatic Index (mean ± SD), PAH bioaccumulation in mussels,

labile dissolved PAHs in the water column sampled by SPMD (mean ± SD) and water temperature.

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Chapitre V

Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ

Chapitre V : Détection des biomarqueurs de génotoxicité et lésions oxydatives in situ

- 123 -

Publication 4: Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and the water chemical contamination

Résumé

Dreissena polymorpha est utilisée en biomonitoring pour évaluer l’impact génotoxique des polluants

aquatiques. Nous avons précédemment observé que le taux de cassures de brins à l’ADN était lié

à l’activité physiologique des moules, indiquant que le printemps est une saison favorable pour

mesurer ces biomarqueurs.

Le but de cette étude était de confirmer ce point et de déterminer si la pression chimique du

milieu urbain entraîne la formation d’oxydation de l’ADN. Les moules zébrées ont été

transplantées durant deux mois, au printemps et à l’automne, sur des sites du bassin de la Seine.

A la fin de la période de transplantation, plusieurs types de dommages à l’ADN ont été mesurés,

tels que les cassures de brins, les micronoyaux et les adduits ainsi que la bioaccumulation des

HAP par les moules. Un faible niveau d’oxydation de l’ADN a été détecté par le test comet-

hOGG1. Une augmentation du taux d’adduits à l’ADN est observée à l’automne, par rapport au

printemps, corrélée à la bioaccumulation des HAP par les moules. Cette étude confirme l’intérêt

de la mesure des cassures de brins à l’ADN et de la fréquence de micronoyaux comme

biomarqueur de génotoxicité et montre une induction de lésions oxydatives par la pression

chimique du milieu urbain du bassin de la Seine, ainsi que la formation d’adduits à l’ADN.

Mots clés

Moule zébrée, test comet-hOGG1, oxydation de l’ADN, biomarqueurs de génotoxicité


- 125 -

Genotoxicity biomarkers in caged zebra mussels are related to the mussel physiological status and

the water chemical contamination

Cécile Michel, Amélie Châtel, Emmanuelle Uher, Marine Perret, Matthieu Combe, Aurélie

Germain, Catherine Gourlay-Francé and Françoise Vincent-Hubert

CEMAGREF

Unité de Recherches Hydrosystèmes et Bioprocédés

1 rue Pierre-Gilles de Gennes

CS 10030

92761 Antony Cedex


Tel: +33 0(1) 40 96 62 33

Fax: +33 0(1) 40 96 61 99



- 126 -

ABSTRACT:

Dreissena polymorpha is used in biomonitoring to evaluate the genotoxic impact of freshwater

pollutants. We previously observed that DNA strand breaks level was related to the physiological

activity of the mussel, contrary to micronuclei. Higher levels of DNA strand breaks were

measured in spring indicating that spring was a favourable season for measurement of these

genetic end-points. The aim of this study was to confirm this point and to determine whether

DNA oxidation (8-oxodG) and DNA bulky adducts occurred in mussels exposed to urban

pollutants. Zebra mussels were transplanted during 2 months in spring and autumn in the Seine

River basin, in the urban area of Paris. After exposure, several types of DNA damages (DNA

strand breaks, DNA oxidation (8-oxodG), DNA bulky adducts, MN frequencies and nuclear

abnormalities) were measured, along with PAH bioaccumulation in mussels. We first confirmed

that caging did not modify mussel health status and genetic end-points. DNA strand breaks levels

and the MN frequencies in mussels increased with the PAH contamination. A low level of DNA

oxidation in gill cells of mussels caged in the urban area of Paris was revealed with the comet-

hOGG1 assay. We also detected a higher level of DNA adducts in caged mussels in autumn

compared to spring, which was correlated to the PAH bioaccumulation. This study confirms the

interest of DNA strand breaks as a suitable marker of genotoxicity and showed that DNA

oxidations and DNA adducts occurred in field zebra mussels in relation with PAHs

contamination.

Keywords: zebra mussel, comet-hOGG1 assay, DNA oxidation, genotoxic biomarkers


- 127 -

Introduction

Urban development increase in the heart of the Seine basin marks the last two centuries (Meybeck

1998). Nowadays, this area of the French territory (75,000km²) is inhabited by 16 millions people,

concentrated within 2% of this area, which leads to an increase of metal and polycyclic aromatic

hydrocarbons (PAHs) concentrations in water, derived from domestic, industrial wastewater and

agricultural activities (Chevreuil and Granier 1991; Meybeck 1998; Boët et al., 1999; Tusseau-

Vuillemin et al., 2007). Micro-contaminants present as a mixture in water can have an impact on

the aquatic life. The characterization of the impact of contamination on the health status of biota

requires specially designed biological methods. The study of biomarkers at the organism-level

response in species sensitive to contaminants allows observing chemical pressure impact.

Dreissena polymorpha, also called zebra mussel (Pallas, 1771), is a filtering freshwater bivalve, largely

used for biomonitoring in lakes and rivers (Binelli et al., 2001; Guerlet et al., 2007; Bacchetta and

Mantecca 2009; Bourgeault et al., 2010). Biomarkers of the DNA alterations (DNA strand breaks

(SB), micronuclei (MN) and DNA adducts) have already been developed on this organism, and

were proved to be reliable indicators of the water genotoxic contamination (Pavlica et al., 2001;

Rocher et al., 2006; Binelli et al., 2007; Bourgeault et al., 2010). Binelli et al. (2007) compared

various genotoxic biomarkers in the same organism and concluded that the measurement of

DNA strand breaks was the strongest discrimination factor between polluted and reference sites.

The alkaline comet assay enables the detection of single or double DNA strand breaks and alkali-

labile sites, in various types of individual cells. First introduced by Ostling and Johanson (1984)

and then modified by Singh et al. (1988), the comet assay is widely used to measure DNA strand

breaks in plants, worms, molluscs, fish, amphibians and mammalians in biomonitoring studies

(Cotelle and Férard 1999; Frenzilli et al., 2009). The DNA SB measured with the comet assay are

due to direct genotoxic effects and/or to DNA lesions repair such as DNA oxidation. DNA

oxidation is of particular concern, because it has been proved to be involved in carcinogenesis

(Kasai 1997) and aging process (Zahn et al., 1987). The main oxidative lesion is 8-oxo-7,8-

dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodG) which contributes to G- to T- transversion. This lesion can

be detected by a modified comet assay coupled with specific endonucleases, such as formamydo-

pyrimidine glycosylase (Fpg), Endonuclease III (Endo III) and the 8-hydroxyguanosine DNA

glycosylase, a human enzyme (hOGG1) of the base excision repair system (Smith et al., 2006; Park

et al., 2008), specific of 8-oxodG lesions. The measurement of 8-oxodG lesions has been recently

developed in zebra mussels gill cells (Michel and Vincent Hubert in press), based on the comet-


- 128 -

hOGG1 assay. We recently observed that Cd and BaP induced an increase of 8-oxodG in zebra

mussels (Michel et al. in prep).

The MN assay allows the detection of chromosomal aberrations. MN are small chromatin bodies

visible in the cytoplasm after cell division, they are formed by the loss of a piece of chromosome

as a result of DNA double-strand breakage (clastogenic effect) or by the loss of an entire

chromosome as a result of protein dysfunctions in chromosome segregation (aneugenic effect)

(Kirsch-Volders et al., 2003). The comète and the MN assays are two complementary genotoxicity

tests, which are largely used in combination for the analysis of genotoxic effects in aquatic

environment (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Rank et al., 2005). The MN test can be

completed by the detection of other types of chromosomal aberrations, also indicative of cellular

dysfunction: such as binucleated cells, which are due to blocking of cytokinesis or cell fusion

(Rodilla 1993); nuclear buds, due to the elimination of amplified DNA (Miele et al., 1989; Shimizu

et al., 1998; Shimizu et al., 2000) and possibly to elimination of DNA-repair complexes (Haaf et al.,

1999). In addition to these anomalies, we can also detect apoptotic cells (Izquierdo et al., 2003).

Some compounds, like PAHs, may be metabolized by zebra mussels in electrophilic metabolites

which can react with DNA bases and form bulky DNA adducts (Le Goff et al., 2006). Bulky

DNA adducts have been recognized to play a role in the initial step of chemical carcinogenesis

(Van der Oost et al., 1996). The measurement of DNA adducts levels is used in biomonitoring to

detect DNA alterations in aquatic species e.g. (Solé et al., 1996; Harvey et al., 1997).

The level of DNA damages is usually directly related to the chemical genotoxic contamination. It

has also been proved to strongly vary with the organisms' physiology. For instance, we recently

observed that the DNA strand breaks and the MN levels were related to the chemical gradient of

pollution in the Seine River basin (Michel et al., submitted) and that the DNA strand breaks

within the same site strongly vary according to the season and the physiological status of zebra

mussels. As a consequence, spring appeared as a favourable season for genotoxic biomonitoring,

because of the highest levels of DNA SB. The present study had two purposes. The first one was

first to validate this last point and the second one to get insight into the type of reparable DNA

lesions observed with the comet assay. To do so, we measured DNA SB, MN, DNA oxidation

and bulky DNA adducts in zebra mussels transplanted in spring and autumn along an urban

gradient in the Seine River basin. Bioaccumulated PAHs and the PAHs in water were also

measured to attest the level of PAHs exposure on these urban sites of the Seine River. We also

verified whether the transplantation protocol induced physiological modifications or DNA

damages.


- 129 -



hOGG1 enzyme was purchased from Ozyme (St-Quentin-en-Yvelines, France), Dispase II from

Roche Diagnostic (Meylan, France) and all other chemical reagents were purchased from Sigma-

Aldrich (St-Quentin-Fallavier, France)

2.2. Mussel sampling and caging

Zebra mussels were collected in a reference site, located in the Meuse River (France). Mussels

were manually removed from rocks using a scalpel, selected by length (25-30mm) and placed into

polyethylene 5mm-mesh experimental cages as previously described (Bourgeault et al., 2010). 30

mussels were transplanted the same week for two months, in March and September on each of

the four sites of the Seine River basin (France) (Fig. 1). In March, 30 mussels were also

transplanted in the reference site, where mussels were collected. The site 1 was located 200 km

upstream from Paris. The three other sites are urban sites, highly impacted by the urban area of

Paris, among them the site 4 is subject to the Seine-Aval wastewater treatment plant. The water

pH and temperature were monitored during the study.

After a 2-month exposure, mussels were brought back to the laboratory and dissected within the

same day. 25 organisms were used for condition index and bioaccumulation measurements. For

the biomarkers of genotoxicity 12 mussels were dissected. Gills were isolated for comète and MN

assays, whereas digestive glands were isolated for DNA adducts measurements.

2.3. Biochemical and chemical measurements

2.3.1. Condition index and survival rate


- 130 -

The condition index (CI) was calculated individually as the ratio between the total wet weight of

soft tissues and the total wet weight of the mussel (including the shell). The mortality was

calculated as the ratio between dead mussels and live mussels (expressed in %).

2.3.2. Bioaccumulation of PAHs in mussels

PAH analyses were performed on 25 freeze-dried mussels (length 25-30mm) pooled and reduced

to a powder as described by Bourgeault et al. (2010). Thirteen PAHs, corresponding to the US

EPA list except naphthalene, acenaphtene and acenaphtylene, were quantified by gas

chromatography-mass spectrometry (GC-MS Thermo Trace GC Ultra-DSQII). Results were

expressed in µg of PAH per g of dry weight.

2.3.3. Measurement of labile dissolved PAHs

The water contamination in PAHs was monitored using integrative passive samplers. At each

site, two Semi Permeable Membrane Devices (SPMDs) (Exposmeter, Sweden) were deployed for

three weeks to assess the time-weight average concentrations of labile PAHs. The extraction was

performed as described by Bourgeault et al. (2010). As for PAH bioaccumulation, 13 PAHs were

analysed in the extract. The data analysis is described in detail elsewhere (Tusseau-Vuillemin et al.,

2007).

2.3.4. Comet assay and Comet-hOGG1 assay

Gill cell suspensions were obtained by an enzymatic dissociation procedure as described by

Vincent-Hubert et al. (2011). DNA damage levels were quantified in gill cells using the comet

assay as described by Singh et al. (1988) and modified following (Vincent-Hubert et al., 2011).

Results were expressed as OTM (Olive Tail Moment = Tail DNA% x Tail Moment Length). For

the comet-hOGG1 assay, the protocol used was described in detail in Michel and Vincent-Hubert

(in press). The hOGG1-sensitive sites were calculated as the difference between the mean OTM

obtained with the comet-hOGG1 assay and those obtained with the comet assay alone. Please

note that this calculation prevents from testing statistical differences between sites and seasons.


- 131 -

2.4. MN assay

The MN assay was performed according to Bolognesi et al. (1999) and modified according to

Vincent-Hubert et al. (2011) using the criteria proposed by Kirsch-Volders et al. (2003). Other

chromosomal aberrations as binucleated cells and nuclear bud cells were also observed. The

apoptotic cells frequencies were also measured.

2.5. 32P-Postlabeling Analysis of DNA adducts

DNA adducts measurement were performed by Dr Virginie Marquis and Dr Annie Pfohl-

Leszkovicz (ENSAT, Toulouse, France). Digestive glands or gills (n=6) were homogenized and

the DNA extraction was realised as described by Faucet et al. (2004). The method used for 32P-

postlabeling was initially described by Reddy and Randerath (1987), with minor modifications

including validation steps (Amat-Bronnert et al., 2007). 4µg of DNA were used.

2.6. Statistical analysis

The Shapiro-Wilk test was used to verify the normality of the variance of the CI, the comète and

the MN data. The normality was not respected in comète data, thus the non-parametric Kruskal-

Wallis test was performed, followed by Dunn's post-hoc test to evaluate significant differences

between seasons and sites (α=5%). In the case of the CI and MN data, normality was respected;

therefore the parametric t-test was performed. The Kruskal-Wallis test was performed using the

XLSTAT© 2010 software and the t-test was performed using R software version 2.7.1.

3. Results

3.1. Caging effect


- 132 -

Results obtained with autochthonous mussels and mussels caged during two months at the

sampling site are presented on the table 1. We did not observe any difference between

autochthonous mussels and caged mussels for the CI, the mean OTM, the MN, the nuclear bud

and the apoptotic cell frequencies in mussel gill cells. No DNA oxidation was detected with the

comet-hOGG1 assay. Only a slight decrease of binucleated frequencies in caged mussels

compared to autochthonous mussels could be observed (p<0.001). No differences have been

detected in the PAHs accumulation.

3.2. Condition Index, mortality and water parameters

The mean of mussels CI was significantly higher in spring (0.4), than in autumn (0.3), on each site

(p<0.001) (table 2). No strong intersite variations were observed. The mussel mortality was less

than 20% in all transplanted cages (table 2). Mortality was slightly higher in autumn than in spring

except in site 2.

3.2.1. PAHs bioaccumulation in mussels and PAHs concentration in water

PAHs concentrations in water and in mussels caged on urban sites (sites 2, 3 and 4) were higher

(7 to 35ng/L in water and 1 to 4.4µg/g in mussels) compared to the upstream site (2.5ng/L in

water and 1µg/g in mussel) (table 2). Bioaccumulated PAHs in mussels were higher in autumn

than in spring.

3.2.2. DNA strand breaks and DNA oxidations

We observed a great increase of OTM in mussels caged on the urban sites (2, 3 and 4) compared

to the upstream site (site 1), whatever the season (p<0.001) (Fig. 2A). The OTM of the site 3 was

lower than those observed on the sites 2 and 4 (p<0.001) in spring. No significant variation of

DNA strand breaks level in mussel gill cells between spring and autumn was observed, except a

slight but significant higher of OTM measured in mussel gill cells in autumn in site 2 (p<0.05).

hOGG1-sensitive sites were detected in caged mussels at each site whatever the season, except at

the site 1 in spring (Fig. 2B).


- 133 -

3.2.3. Chromosomal abnormalities and apoptotic cells

The MN frequencies detected in mussel gill cells showed a great increase on the three urban sites

compared to the site 1 whatever the season (Fig. 2C). Nevertheless, all measured MN frequencies

were very low at about 3 to 7‰. No great seasonal variations were observed in the MN. The

apoptotic, binucleated cells and nuclear bud frequencies were very low whatever the site and the

season (table 2).

3.2.4. Bulky DNA adducts

The DNA adduct levels (Fig. 2D) increased at the downstream sites 2, 3 and 4, compared to the

upstream site 1 whatever the season. The site 3 showed the higher level of adducts for each

season. The total DNA adduct levels detected in mussel digestive glands were higher in autumn

compared to the spring whatever the site.

4. Discussion

4.1. No influence of caging on mussels physiology and genotoxic end-points

Transplantation of mussels is largely used in biomonitoring, however this helpful method needs

to be validated by an appropriate control attesting the lack of effect due to the transplantation

itself. Contrary to a previous study (Bolognesi et al., 2004), a 2-month caging using the protocol

deployed in this study did not modify physiological parameters (such as the CI), nor PAH

bioaccumulation, nor genetic end-points, such as DNA strand breaks and 8-oxodG lesions. This

validates the caging method for upcoming biomonitoring studies.

4.2. DNA strand breaks and chromosomal abnormalities in caged mussels


- 134 -

The DNA strand breaks and the MN levels measured in caged mussel gills cells revealed a

tendency in accordance with the increasing chemical contamination gradient, as revealed both by

labile concentration in water and PAH bioaccumulation in mussels. These results are in

accordance with a previous study (Michel et al., submitted), confirming that DNA strand breaks

and MN level are sensitive genetic end-points to biomonitor the chemical contamination impact.

Measurement of the DNA strand breaks and the MN frequencies detected in mussel gill cells did

not showed great variation between spring and autumn. These results are in accordance with a

previous study, showing no seasonal variation of DNA strand breaks in gill cells of Mytilus edulis

between spring and autumn (Rank et al., 2005). However, this correlation is not obvious. In a

previous study we observed a higher DNA strand breaks level in spring compared to winter, while

the higher MN frequency was detected in winter compared to spring (Michel et al., submitted).

This difference could be explained by the fact that the comet assay detects primary repairable

damage, and therefore reversible DNA lesions (alkali labile sites, single strand DNA breakage),

whereas the MN assay detects more persistent chromosomal aberrations that cannot be repaired

(Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001). Thus, in this study, the absence of variations between

the MN and DNA strand breaks levels could indicate that the water contamination by chemical

compounds was constant and that mussels were not exposed to a peak of contamination during

the caging period.

The MN frequencies remained weak, 3 to 7‰, as it is generally found in Dreissena polymorpha

exposed in urban rivers (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010). Indeed, Mersch et al.

(1997) detected MN frequencies that ranged from 5.0 to 8.8‰ in mussels exposed in rivers

impacted by industrial effluents. These levels were significantly higher than the baseline level of

2.0‰, suggesting a low MN induction probably due to low mutagenic events.

Our results showed that the genotoxic response expressed by zebra mussels measured in spring

was in the same range than in autumn. These two seasons seem to be favourable seasons to use

Dreissena polymorpha for biomonitoring genotoxic responses. In a previous study, mussels were

more vulnerable to genotoxic contaminants in spring (Michel et al., submitted). This was explained

by higher filtration activity leading to a higher water contaminant exposure (Michel et al.,

submitted) and a higher vulnerability to toxic compounds during the spawning step. The fact that

DNA SB levels were as high in autumn as in spring tends to prove that the higher sensitivity of

mussels towards genotoxic compounds was not due to the spawning.


- 135 -

4.3. DNA oxidation and bulky DNA adducts formation in caged mussels

DNA SB may be due to the DNA alteration induced directly by genotoxic compounds or to the

DNA repair. Thus, among the DNA strand breaks levels measured, one part could be due to the

oxidative or adducts repair, but it is not possible to make the difference with other types of

lesions. The sensitivity and the specificity of the comet assay can be improved by incubating the

lysed cells with lesion-specific endonucleases. Thus, in this study we wanted to search specific

oxidative lesions with the comet-hOGG1 assay (Michel et al., submitted). For the first time, the

DNA oxidation was detected in caged mussels with the comet-hOGG1 assay. DNA oxidations

may be induced indirectly after the metabolization of organic contaminants like PAHs

(Livingstone et al., 1990) or by some metals (McLachlan et al., ; Emmanouil et al., 2007). For

instance the benzo[a]pyrene needs a metabolic activation to produce its major metabolite

benzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol-9,10-epoxide (BPDE) which can react with DNA to form a

bulky DNA adduct (Le Goff et al. , 2006) as well as an increase of oxygen free radical. The Cd

can alter the antioxidant defence system, causing a depletion in the levels of reduced glutathione,

as well as an alteration in the activity of antioxidant enzymes, and a change in the structure of the

cellular membrane through a process of lipid peroxidation (Zikic et al., 1996; Bagchi et al., 1997).

Cd increases formation of reactive oxygen species, including superoxide anion radical (Amoruso

et al., 1982), hydrogen peroxide (Zhong et al., 1990), and probably hydroxyl radical (Ochi et al.,

1988). Thus, the DNA oxidations measured in caged zebra mussels could be linked to these types

of chemical contaminants.

The hOGG1-sensitive site levels measured in our study remained weak: between 0.2 and 0.55

A.U. in OTM, corresponding to 25% of the DNA strand breaks levels detected with the comet

assay alone. To our knowledge, the hOGG1 enzyme has never been used for environmental

biomonitoring. In one study, the DNA oxidation levels were measured in zebra in mussels

exposed to Cd (10µg/L) with the comet assay coupled to the Fpg (Vincent-Hubert et al., 2011).

After 1 and 3 days of exposure, the oxidative DNA damage in gill cells accounted for,

respectively, 13.8% and 23.3% of the total tail-extent moment. Fpg is less specific to 8-oxodG,

but results obtained with Fpg are in the same range as the low levels observed in our study.

The increase of DNA adducts levels detected in the digestive glands of mussels was related to

PAH bioaccumulation, especially with three substances (benzanthracene, benzo[b]fluoranthene

and benzo[k]fluoranthene, data not shown). The metabolites of these PAHs have been proven to


- 136 -

induce DNA adducts (Weyand et al., 1993; Ericson et al., 1999; Borosky and Laali 2006). Only few

studies concern the DNA adducts measurement on Dreissena polymorpha. The comparison of the

DNA adducts levels measured in digestive glands of mussels in our study with data from the

literature revealed that DNA adduct levels measured in the present study were in the same range

as those reported by Le Goff et al. (2006), in the upper part of the Seine estuary and those

obtained by Châtel et al. (in preparation) after BaP exposure (10 and 100µg/L). These results

confirm the usefulness of the bulky DNA adducts as a genotoxicity biomarker.

Conclusions

The absence of caging effect confirms the interest of mussel transplantation method for

environmental biomonitoring studies. Spring and autumn seem to be favourable seasons for the

biomonitoring study, allowing the detection of increase of DNA strand breaks and MN

frequencies. Moreover these genotoxic endpoints are correlated to the chemical gradient of

contamination. In addition, DNA oxidation was detected for the first time with the comet-

hOGG1 in caged mussels, providing supplementary information. The DNA adducts results were

in accordance with the PAHs bioaccumulation. This study confirms that studying the

environmental effects of contamination with many biomarkers is more reliable and presents

encouraging results concerning the comet-hOGG1 assay for further biomonitoring studies.

6. Acknowledgements

We thank Dr. Annie Pfhol-Leszkowicz and Dr. Virginie Marquis who have performed the DNA

adducts analysis. Cécile Michel acknowledges a PhD grant from the Ile-de-France Regional

Council (R2DS program). This work is part of the PIREN-Seine research program and was also

funded by ONEMA.

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Fig 1 Localisation of the sampling site and the four study sites in the Seine River Basin

Sampling site located in the Meuse River, and study sites located in the Seine river basin: Site 1:

site upstream of Paris city, Sites 2, 3 and 4: sites impacted by the urban area of Paris


- 142 -

Table 1Comparison of the CI, PAHs bioaccumulation (µg/g), means DNA strand breaks

(OTM), 8-oxodG levels, MN, binucleated, nuclear bud and apoptotic cells in mussels between

autochthonous and caged zebra mussels

Autochthonous mussels Caged mussels

CI 0.35± 0.04 0.33± 0.04

Σ13 PAHs bioaccumulated (µg/g) 3.24 ± 1.13 1.85 ± 0.64

DNA strand breaks (mean OTM) 0.61± 0.02 0.61± 0.02

8-oxodG levels 0 0

MN (‰) 1.67 ± 1.15 0.91 ± 0.70

Binucleated (‰) 2.42 ± 1.31 0.64 ± 0.67

Nuclear bud (‰) 2.50 ± 0.67 1.55 ± 0.93

Apoptotic cells (‰) 2.25 ± 1.06 1.91 ± 1.04

Autochthonous mussels and caged mussels were analysed after a 2-months caging on the

sampling site for their condition index (CI). DNA strand breaks measured with the comet assay

(expressed as means OTM), 8-oxodG measured with the comet-hOGG1 assay and nuclear

abnormalities measured with the MN protocol. In bold letters: data statistically different with the

t-test, (p<0.05)


- 143 -

Fig 2 Evolution of A) DNA strand breaks (OTM), B) hOGG1-sensitive sites, C) MN

frequencies and D) total DNA adduct levels in caged zebra mussels

DNA SB, hOGG1-sensitive sites, MN frequencies and DNA adducts data were measured in

mussel after a 2-month caging in spring and autumn; A) DNA strand break (expressed ad the

mean OTM ± SE), measured with the comet assay in mussel gill cells; B) hOGG1-sensitive sites

correspond to the difference of OTM measured with the comet-hOGG1 assay and the comet

assay alone; C) MN frequencies measured in mussel gill cells (mean ± SD, expressed in ‰); D)

total DNA adducts measured in digestive glands of mussels Site 1: upstream site of Paris, Sites 2,

3 and 4: sites impacted by the urban area of Paris; letters represent the statistical differences

obtained with the Kruskall-Wallis test for OTM and t-test for MN frequencies, (p<0.05)


- 144 -

Table 2 Parameters studied during the caging period

Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

spring autumn spring autumn spring autumn spring autumn

Water

parameters

River water

temperature (°C) 14.8 10.5 17.1 10.6 16.8 10.5 16.7 10.6

River water pH 8.33 8.33 7.7 8.42 7.87 8.26 7.8 7.9

Chemical

contamination

by PAHs

Σ 13PAHs in water

(ng/L) 2.4 2.7 7.6 7.6 35.1 18.7 21.2 15.6

Σ 13PAHs

bioaccumulated by

mussels (µg/g)

0.9 0.6 1 2,1 2 4,4 1,2 2.1

Physiological

index

CI 0.37 ±

0.04

0.27 ±

0.04

0.37 ±

0.06

0.27 ±

0.04

0.38 ±

0.05

0.29

±0.03

0.37

±0.06

0.30

±0.03

Mortality (%) 0 8 8 4 8 20 0 12

Biomarkers

DNA strand breaks

(Mean OTM)

0.88 ±

0.03

0.88 ±

0.03

2.02 ±

0.0

2.16 ±

0.07

1.86 ±

0.06

1.65 ±

0.07

2.13 ±

0.05

1.95 ±

0.06

8-oxodG levels 0 0.46 0.29 0.54 0.26 0.24 0.22 0.25

Miconucleated cells

(‰)

2.83 ±

0.41

2.91 ±

0.42

6.83 ±

0.81

5.73 ±

0.32

4.50 ±

0.42

6.18 ±

0.82

5.73 ±

0.57

5.36 ±

0.58

Binucleated cells (‰) 4.58 ±

0.57

4.55 ±

0.42

9.92 ±

0.76

6.73 ±

0.63

3.67 ±

0.59

6.91 ±

0.68

6.09 ±

0.79

7.00 ±

0.59

Nuclear bud cells (‰) 2.17 ±

0.55

3.27 ±

0.37

5.42 ±

0.58

5.09 ±

0.27

3.08 ±

0.54

5.55 ±

0.54

2.00 ±

0.75

6.00 ±

0.56

Apoptotic cells (‰) 0.50 ±

0.19

0.73 ±

0.26

1.17 ±

0.32

1.00 ±

0.26

2.83 ±

0.87

1.18 ±

0.28

1.36 ±

0.43

1.09 ±

0.21

total adducts/109

nucleotides

0.19 ±

0.09

0.62 ±

0.02

0.41 ±

0.04

1.12 ±

0.09

0.56 ±

0.07

1.32 ±

0.1

0.25

±0.06

0.79 ±

0.06

Water contamination in PAHs: dissolved PAHs were sampled by passive samplers (SPMDs

exposed during 3 weeks), and are expressed in µg/L; PAHs bioaccumulated by mussels were

measured as described in the materials and methods section, and are expressed in ng/g of mussel;

DNA strand break (expressed ad the mean OTM ± SE), measured with the comet assay in caged

mussel gill cells; hOGG1-sensitive sites correspond to the difference of OTM measured with the

comet-hOGG1 assay and the comet assay alone; MN, binucleated, nuclear bud and apoptotic

cells frequencies are expressed as means ± SD in ‰; the DNA adducts levels are expressed as

the total adducts/109 nucleotides; letters represent the statistical differences obtained with the

Kruskall-Wallis test, p<0.05; Site 1: upstream site of Paris, Sites 2, 3 and 4: sites impacted by the

urban area of Paris

Chapitre VI

Discussion générale

Chapitre VI : Discussion générale

- 147 -

Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l'Eau, la nécessité d'évaluer l'impact

de la contamination chimique sur les organismes aquatiques implique de pouvoir établir un

diagnostic de la qualité des masses d'eau. La diversité des substances chimiques présentes à de

très faibles concentrations dans l'environnement rend difficile la prédiction de leurs interactions

avec les organismes et de ce fait complique ce diagnostic. Les biomarqueurs de génotoxicité,

largement utilisés en milieu marin, pourraient être appliqués aux écosystèmes continentaux ; ils

permettraient d'évaluer l’impact de la contamination chimique du milieu aquatique sur l'intégrité

structurelle de l'ADN des organismes.

Dans ce contexte, l'objectif de ce travail de thèse était d'utiliser le test comète, comme

biomarqueur de génotoxicité de la contamination chimique et de lui donner plus de significativité,

en le couplant à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives, telle que la 8-

oxodG. Nous avons donc adapté le test comet-hOGG1 pour Dreissena polymorpha dans le but de

valider par la suite cet outil de détection de la 8-oxodG par des études de terrain.

La dreissène présente un intérêt dans les études de bioaccumulation des contaminants

chimiques présents dans l'eau (Marvin et al., 2000; Roditi et al., 2000; Bervoets et al., 2005; Binelli

et al., 2006; Minier et al., 2006) et est aussi utilisée pour étudier les effets génotoxiques induits par

la contamination chimique du milieu aquatique. En effet, les mesures du taux de cassures à

l'ADN (Klobucar et al., 2003), de la fréquence des micronoyaux (Mersch and Beauvais 1997) et

du taux d'adduits (Le Goff et al., 2006) ont été développés chez cet organisme. Cependant des

incertitudes subsistent quant à la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité (cassures à

l’ADN, fréquence des micronoyaux et adduits à l’ADN) dans les organismes. Plusieurs études ont

montré des variations du taux de cassures à l'ADN au cours des saisons, mais peu de corrélations

ont pu être établies. En effet, dans certaines études, le taux de cassures de l'ADN mesuré sur les

moules est plus élevé lors de la période de reproduction, c'est-à-dire au printemps (Bodin et al.,

2004; Skarphéinsdóttir et al., 2005) tandis qu'une autre étude montre un taux de dommages à

l'ADN plus important en été qu'au printemps (Bolognesi et al., 2004). Nous avons donc cherché,

au cours de ce travail de thèse, à étudier la variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité

tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et les adduits à l'ADN, dans le

but de limiter l'influence de paramètres biotiques ou abiotiques sur la réponse génotoxique

exprimée par la dreissène.

La mesure du taux de cassures à l'ADN par le test comète représente un biomarqueur

d’exposition à des facteurs génotoxiques. Nous avons cherché à augmenter la significativité du


- 148 -

test comète, test qui permet de détecter les cassures de brins et les sites alcali-labiles, en ajoutant

une enzyme de détection spécifique des lésions oxydatives. Le test comet-hOGG1 mis au point

pour Dreissena polymorpha a ensuite été appliqué sur des moules exposées en laboratoire à des

composés génotoxiques modèles de la contamination urbaine, afin de déterminer la vitesse de

formation des lésions oxydatives et leur niveau de réparation. A partir de cette évaluation nous

définirons, selon le niveau et la vitesse de réparation des lésions, si ce test permet de détecter des

lésions précoces de l'ADN.

La démarche scientifique développée s'appuie sur les quatre objectifs suivants:

1. Développer le test comète couplé à une endonucléase spécifique sur Dreissena

polymorpha afin de mesurer l’induction de lésions oxydatives.

2. Rechercher la formation des lésions oxydatives sur des moules exposées à des

contaminants modèles du milieu urbain par le test comet-hOGG1 et mesurer leur

stabilité dans le temps.

3. Déterminer quelle est la variabilité naturelle de la réponse génotoxique exprimée par

les dreissènes lors de transplantation.

4. Déterminer si la pression chimique du milieu urbain entraine l’oxydation de

l’ADN chez les moules zébrées transplantées dans le bassin de la Seine.

1. Développer le test comet-hOGG1 sur Dreissena polymorpha

Le premier objectif était d'augmenter la significativité du test comète en ajoutant une

étape d'exposition des cellules lysées à une enzyme de détection spécifique des lésions oxydatives.

En effet cette étape permet de détecter des cassures supplémentaires spécifiques de l'oxydation

de l'ADN, non détectées par le test comète seul.

1.1. Choix de l’organisme : Dreissena polymorpha

Dreissena polymorpha a été sélectionnée comme modèle biologique pour de multiples

raisons. Il s'agit d'un organisme filtreur, donc très exposé aux contaminants présents dans la

colonne d'eau. Vivant fixée sur des supports, la dreissène présente un avantage pour l'étude de la

génotoxicité d'une zone bien définie. De plus, il s'agit d'un organisme facile à identifier et à

échantillonner possédant une large distribution géographique. Enfin, sa résistance à la


- 149 -

transplantation en fait un organisme intéressant. En effet, de nombreuses études de

biomonitoring utilisent la méthode de transplantation des dreissènes dans le but d'étudier l'impact

de la contamination chimique du milieu par la mesure des cassures de brins de l'ADN (Frenzilli et

al., 2009), la fréquence des micronoyaux (Mersch and Beauvais 1997) ou encore le taux d'adduits

à l’ADN (Le Goff et al., 2006).

1.2. Utilisation des cellules branchiales

La recherche de biomarqueurs de génotoxicité tels que les cassures des brins d'ADN et la

fréquence de micronoyaux a été réalisée sur les cellules de la glande digestive (Le Goff et al.,

2006), de l'hémolymphe (Mersch et al., 1996; Bourgeault et al., 2010; Vincent-Hubert et al., 2011)

ou des branchies (Mersch et al., 1996; Vincent-Hubert et al., 2011). Les branchies présentent un

avantage par rapport aux autres types de cellules. En effet l'activité de filtration des moules

favorise un contact continu entre les cellules branchiales et les contaminants de l’eau. De ce fait,

l'étude des lésions de l'ADN au niveau de ces cellules est très représentative de l'impact des

contaminants présents dans la colonne d'eau. La simplicité de prélèvement des branchies de la

dreissène en fait un aussi bon outil d’étude. En prenant les précautions nécessaires lors de l'étape

de digestion enzymatique, le taux de viabilité cellulaire est suffisamment important (> 90%) et le

nombre de cellules satisfaisant pour la réalisation des tests de génotoxicité. C'est donc ce type

cellulaire que nous avons choisi d'utiliser dans ce travail de thèse.

1.3. Test comète couplé à hOGG1

Le test comète permet de mesurer les cassures induites par les génotoxiques, de manière

directe ou indirecte ainsi que les sites alcali-labiles, nous renseignant sur l'impact des composés

génotoxiques présents dans l'environnement. Cependant, ce test rend compte aussi des processus

de réparation par excision et resynthèse qui génèrent des coupures transitoires de l’ADN et qui

ne doivent pas être considérées comme des dommages en soi, mais comme marqueurs de

l’exposition à des facteurs génotoxiques (Shaw et al., 2000; Smart et al., 2006).

Le développement in vitro du protocole du test comet-hOGG1 sur les cellules de branchies

de dreissènes, exposées à H2O2, agent oxydant, montre qu'il est possible de détecter des cassures

supplémentaires par l'incubation des cellules lysées à hOGG1. En effet, le niveau d'oxydation

détecté par hOGG1 sur des cellules de branchies exposées in vitro pendant une heure à 200µM


- 150 -

d'H2O2 représente 24% de l'ensemble des cassures à l'ADN détectées par le test comète seul.

Après une exposition in vitro à 99nM de BaP, le niveau d'oxydation correspond à 18%. Les

niveaux d'oxydation mesurés par le test comet-hOGG1 sur des cellules exposées à ces deux

composés sont du même ordre de grandeur.

In vivo, la spécificité de hOGG1 face aux dommages oxydatifs est retrouvée. En effet,

chez les moules exposées au BaP, on observe une augmentation du taux de cassures à l'ADN

avec le test comet-hOGG1 suivant une relation dose-réponse (39% avec BaP 40nM et 74% avec

BaP 120nM). En revanche, après une exposition des moules au MMS, seul le test comet-Fpg

détecte une augmentation du taux de cassures à l'ADN (7%).

D'après la littérature, le niveau d'oxydation de l'ADN détecté par le test comet-hOGG1

varie selon le type cellulaire et selon l'agent oxydant. En effet, après une irradiation aux rayons γ

de 10Gy, le taux de cassures indiquant le niveau d'oxydation correspond à 25% des cassures

détectées par le test comète seul, tandis que le traitement des cellules de lymphomes de souris par

le KBrO3 (2,5mmol/L) produit une augmentation du taux de cassures supplémentaires

correspondant à 4000% du taux de cassures à l'ADN par le test comète seul (Smith et al., 2006).

Dans une autre étude, le taux d'oxydation induit dans des fibroblastes humains par 1µM de 6-

thioguanine irradiés par des UV-A (1J/cm²) pendant 48h est équivalent à 50% du taux de

dommages à l'ADN détectés par le test comètes seul (Cooke et al., 2008).

Des mesures des dommages oxydatifs de l'ADN ont été réalisées sur des bivalves avec le

test comet-Fpg, enzyme moins spécifique que hOGG1 envers la lésion 8-oxodG. On retrouve un

niveau d'oxydation de l'ADN correspondant à 38% sur des hémocytes d'huîtres exposés in vitro à

88µM de H2O2 (Gielazyn et al., 2003). Une autre étude a permis de mesurer des taux de sites

sensibles à la Fpg chez Dreissena polymorpha de 13,8 et 23,3% après exposition à 10µg/L de Cd,

après respectivement 1 et 3 jours d'exposition (Vincent-Hubert et al., 2011). Ces différentes

études montrent un niveau d'oxydation de l'ADN des cellules de bivalves assez proche de ceux

mesurés dans notre étude. Le taux de dommages oxydants à l'ADN détecté par le test comète

modifié, après exposition à H2O2 et au BaP, se situe entre 10 et 40% du taux de cassures à l'ADN

détecté par le test comètes seul.


- 151 -

1.4. Conclusions

Les résultats du test comet-hOGG1 sur cellules branchiales de moules zébrées sont

concluants et permettent de mettre en évidence une oxydation de l'ADN aussi bien in vitro, qu'in

vivo. De plus, le test comet-hOGG1 montre un effet-dose du BaP. Enfin, l'absence de sites

sensibles à hOGG1 après exposition au MMS confirme la validité du protocole comet-hOGG1

in vitro et in vivo.

2. Validation du protocole du test comet-hOGG1 et étude de la réparation des

lésions induites par le BaP et le Cd

Le deuxième objectif de ce travail était de mesurer l'oxydation de l'ADN dans les cellules

branchiales chez des dreissènes exposées à des contaminants chimiques représentatifs du milieu

urbain et de déterminer leur stabilité dans le temps.

2.1. Exposition de Dreissena polymorpha au BaP

Détection des cassures de brins d'ADN par le test comète

Nous avons observé que l’exposition des moules au BaP induit une augmentation

significative et rapide du taux de cassures à l’ADN, indiquant que les branchies de moules ont

métabolisé le BaP. Une réponse génotoxique aussi rapide a également été observée par Vincent-

Hubert et al. (2011) dès 10h d’exposition au BaP. Ces résultats sont en accord avec d’autres

études qui ont mis en évidence la capacité du BaP à induire des cassures de brin chez la dreissène

après 24h (Binelli et al. , 2008), la moule marine Mytilus sp (Bihari et al., 1990) et l’huître (Nacci et

al., 1996) exposées in vivo.

Réparation des cassures de brins induites par le BaP

Nos résultats montrent que les cassures de brins d'ADN induites indirectement par le

BaP sont rapidement réparées. En effet, le taux de cassures à l’ADN revient au niveau basal après

48h de dépuration. Chez la moule marine Mytilus Galloprovincialis, une réparation des lésions

induites par le BaP dès 48h a été mise en évidence par les travaux de Bihari et al. (1990).


- 152 -

Ces études soulignent donc la nécessité de prendre en compte la capacité de réparation de

l'ADN dans l'interprétation des niveaux de cassures à l'ADN détectés lors d'études de

biomonitoring. Il est donc nécessaire de coupler le test comète à d’autres biomarqueurs mettant

en évidence des lésions plus stables dans le temps, comme par exemple les micronoyaux. De

nombreuses études de biomonitoring recoupent les informations obtenues par le test comète et le

test micronoyaux (Klobucar et al., 2003; Bolognesi et al., 2004; Bourgeault et al., 2010), montrant

une bonne corrélation entre les deux tests et une différence inter-sites basées sur une

augmentation du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence des micronoyaux sur les sites

contaminés.

Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1

Nos résultats montrent que le BaP induit une oxydation rapide de l’ADN dans les cellules

de branchies de moules dès 6h d'exposition. Par ailleurs, le taux de cassures supplémentaires

détectées par l'enzyme hOGG1 correspond en moyenne à 30% du taux de cassures à l’ADN

détectées par le test comète seul. Mitchelmore et al. (1998) ont montré, par l’utilisation de l'anti-

radicalaire N-N-t-butyl-α-phenylnitrone (PBN), une diminution du taux de cassures à l’ADN de

près de 75%, confirmant l’implication des radicaux libres dans la génotoxicité du BaP et donc

dans l’induction de lésions oxydatives. Bien que la capacité de métabolisation du BaP par les

bivalves soit faible (Mitchelmore et al., 1998) nos résultats montrent que les cellules branchiales

des dreissènes sont capables de transformer le BaP en métabolites actifs pouvant altérer l’ADN et

induire des dommages oxydatifs.

Réparation des lésions oxydatives induites par le BaP

Les lésions oxydatives de l'ADN induites par le BaP sont rapidement réparées,

puisqu’après 24h de dépuration les sites sensibles à hOGG1 ne sont plus détectés, quelle que soit

la concentration en BaP. En effet, la même observation a été faite sur des moules marines, où le

taux de 8-oxodG mesuré dans les moules marines revient au niveau des valeurs du témoin, après

cinq jours de dépuration, confirmant l’existence de mécanismes de réparation des lésions

oxydatives, notamment par la voie BER (Akcha et al., 2000).


- 153 -

2.2. Exposition de Dreissena polymorpha au Cd

Détection des cassures de brins par le test comète

Nos résultats confirment que l’exposition des dreissènes au Cd induit une augmentation

significative et rapide du taux de cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011) suivant une

relation dose-réponse. Ces cassures à l'ADN ne résultent pas de l'action directe du Cd sur l'ADN

(Valverde et al., 2001). En effet, le cadmium affecte la stabilité du génome en induisant la

génération de ROS telles que l'ion superoxyde, le radical hydroxyle et le peroxyde d'hydrogène

(Bertin and Averbeck 2006), mais aussi en inhibant les systèmes de réparation de l'ADN, en

induisant une déplétion du glutathion et des protéines à groupements thiols. Emmanouil et al.

(2007) ont détecté une augmentation de cassures à l’ADN après exposition au Cd chez la moule

marine. L'hypothèse émise pour expliquer cette observation concerne l’enzyme de détection des

bases oxydées chez les moules. S'il s'agit d'une enzyme homologue de OGG1 contenant des

groupements thiols, l’affinité du Cd pour les groupements thiols pourrait inactiver la réparation

des lésions oxydatives (Potts et al., 2001). En effets, la liaison du Cd sur les groupements thiols de

l'enzyme pourrait nuire à son activité de réparation des lésions oxydatives (Bravard et al., 2006).

Stabilité des cassures de brin

Le taux de cassures de brin induit par le Cd diminue légèrement à la fin de la période de

dépuration (6 jours) mais n'atteint pas le niveau basal. Seul le taux de cassures induit par la plus

forte concentration de Cd (81µg/L) retrouve un niveau basal. Ces résultats montrent un retard de

réparation des lésions de l'ADN induite par le Cd (à la plus faible concentration). A notre

connaissance, aucune étude de mesure de cassures de brins par le Cd n'est suivie par une période

de dépuration des organismes après l'exposition, ce qui ne nous permet aucune comparaison de

nos résultats. Une étude d’exposition de la dreissène au Cd (10µg/L) induit une augmentation

des cassures de brins mais à cinq et onze jours on observe une diminution significative du taux de

cassures à l’ADN (Vincent-Hubert et al. (2011). Cette diminution du taux de cassures à l'ADN

pourrait être due à une détoxification du Cd par les moules (Vincent-Hubert et al., 2011).


- 154 -

Détection des lésions oxydatives par le test comet-hOGG1

Notre étude montre une induction de lésions oxydatives de 25% par le Cd. Le Cd n'est

pas un génotoxique direct mais il est cependant impliqué dans la production de radicaux libres,

du radical superoxyde, du radical hydroxyle et de l’oxyde nitrique (Waisberg et al., 2003).

Emmanouil et al. (2007) n'ont pas détecté de dommages oxydatifs significatifs sur des moules

exposées au Cd (200µg/L) durant dix jours, mais ont observé une augmentation de produits

finaux de péroxydation lipidique suggérant la formation de ROS par le Cd. En revanche, l’étude

de Vincent-Hubert et al. (2011) a mis en évidence la présence de sites sensibles à Fpg par le test

comet-Fpg indiquant la présence de lésions oxydatives. Ce niveau s’élève à 13,8% et 23,3% du

taux de final de cassures détecté par le test comet-Fpg. Ces niveaux d'oxydation sont du même

ordre que ceux mesurés par nos études confirmant la bonne sensibilité du test comet-hOGG1.

Stabilité des lésions oxydatives induites par le Cd

Le taux de sites sensibles à hOGG1 mesuré lors de la phase de dépuration montre que les

lésions oxydatives induites par le Cd sont réparées plus lentement que celles induites par le BaP.

En effet, le Cd est connu pour agir sur l'activité de réparation des lésions de l'ADN en interférant

avec la dernière étape de la voie BER. Ainsi, l’inhibition de cette étape finale de ligation peut

induire une augmentation de l'accumulation de cassures simple brin, issues de la réparation

incomplète des lésions oxydatives (Emmanouil et al., 2007).

2.3. Conclusions

D’après nos résultats, le test comet-hOGG1 permet de détecter des lésions précoces de

l’ADN. Les lésions oxydatives induites par le BaP sont rapidement réparées, puisqu’après 24h de

dépuration le taux de sites sensibles à hOGG1 devient nul. Le retard de la réparation des lésions

oxydantes induites par l’exposition des moules au Cd suggère une inhibition de la réparation de

ces lésions par le Cd.


- 155 -

3. Etude de la variabilité naturelle de la réponse génotoxique : établissement d’un

niveau basal du taux de cassures à l’ADN

Le troisième objectif de ce travail était d’étudier la variabilité naturelle des biomarqueurs

de génotoxicité, tels que les cassures de l'ADN et les anomalies chromosomiques, exprimés par

Dreissena polymorpha transplantée sur des sites urbains du bassin de la Seine.

3.1. Vérification de l’absence d’impact dû à la transplantation

La transplantation de dreissènes pour des études de biomonitoring a été utilisée dans

plusieurs études (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010; Guerlet et al., 2010; Palais et

al., 2011), mais l'impact potentiel de la transplantation sur le statut physiologique des moules n'a

jamais été étudié. Pour valider cette méthode, il est donc nécessaire de vérifier l’absence d’effet

sur les organismes dû à la transplantation. Nos résultats montrent qu’après deux mois de

transplantation sur un site considéré comme site de référence, aucune différence du taux de

cassures à l’ADN, de la fréquence de micronoyaux, de l’indice de condition et de la

bioaccumulation des HAP n'est observée entre les moules autochtones et les moules encagées.

De plus aucune oxydation de l’ADN n’a été détectée, ce qui nous permet de valider l'utilisation

de cette technique pour des études de biomonitoring.

3.2. Etablissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN

L’établissement d’un niveau basal de cassures à l’ADN chez Dreissena polymorpha nous

permet de valider l’importance de l’augmentation du taux de cassures mesuré lors d’expositions

en laboratoire ou lors de transplantations. Deux niveaux de base ont été établis, l'un pour les

études en laboratoire et l'autre pour les études de terrain. Ils correspondent soit à la moyenne des

différentes valeurs mesurées lors des deux transplantations, soit à la moyenne des études en

laboratoire.

En laboratoire, les valeurs du taux de cassures à l'ADN mesurées sur les organismes

témoins sont comprises entre 0,54 et 0,80U.A. (OTM) soit moins de 10% Tail DNA. Ces

résultats nous permettent d'estimer le niveau basal à 0,66U.A. (OTM). Sur le terrain, les valeurs

d'OTM mesurées sur les dreissènes prélevées sur le site d'échantillonnage sont en moyenne de

0,50U.A. Sur le site en amont de Paris, ce taux basal est d'environ 0,65U.A. Ces résultats nous


- 156 -

permettent de conclure sur le fait que le niveau basal de cassures de l'ADN est sensiblement

équivalent sur le terrain et en laboratoire.

Cette observation est assez surprenante du fait que les conditions de laboratoire et de

terrain sont différentes, bien que les conditions de maintenance des organismes en laboratoire

tendent à reproduire au mieux celles du milieu par un éclairage jours/nuit, une bonne

oxygénation et un courant artificiel. Le type de nourriture différent entre ces deux conditions

pourrait induire un stress. En laboratoire les moules sont nourries par une suspension algale de

chlorelles alors qu’en milieu naturel les dreissènes se nourrissent de diverses particules en

suspension telles que des bactéries, des algues bleues, de petites algues vertes et de particules très

fines de détritus.

3.3. Variabilité naturelle des biomarqueurs de génotoxicité

3.3.1. Taux de cassures à l’ADN

Lors de la première transplantation des dreissènes (année 2008-2009), l’augmentation du

taux de cassures à l’ADN est mesurée sur les sites impactés par l'urbanisation de Paris. Ce taux de

cassures au printemps est corrélé à l’augmentation des températures et par conséquent à

l’activation de la période de reproduction. Cette activation de la reproduction est mise en

évidence par le pic de l’indice gonado-somatique correspondant à l’étape de pré-ponte qui se

produit à la fin du printemps, au début de l’été (Mackie 1991; Garton and W.R. Haag 1992;

Domagala 1997; Roe and MacIsaac 1998; Binelli et al., 2001; Juhel et al., 2003). Par ailleurs, une

augmentation du taux de filtration au printemps par rapport à l'hiver, qui se traduit par une

augmentation de l’exposition des dreissènes aux contaminants de la colonne d’eau, explique

l’augmentation du taux de cassures à l’ADN observée à cette période. Il est ensuite possible que

la période de reproduction rende les moules plus sensibles aux contaminants comme l’ont

suggéré Blaise et al. (2002). En effet, si la dreissène alloue plus d’énergie à la reproduction qu’à la

croissance (Stoeckmann 2003), elle serait plus sensible aux contaminants pendant la période de

reproduction en lien avec une diminution de la capacité de réparation de l’ADN (Hartl et al.,

2004). Cette même observation de l’augmentation du taux de cassures à l’ADN au printemps a

été observée par Bodin et al. (2004) chez M. galloprovincialis et par Skarphéinsdottir et al. (2005)

chez M. edulis. Une dernière hypothèse serait que la période de gamétogénèse induit une activité

de respiration plus importante (de Vooys 1976) et donc une consommation accrue d’oxygène


- 157 -

(Rajagopal et al., 2005), menant à une augmentation de la production de ROS (Verlecar et al.,

2007; Bigot et al., 2009) endommageant les lipides, les protéines et l’ADN (Riso et al., 1999).

Dans notre deuxième étude de transplantation de dreissènes, le taux de cassures à l’ADN

et la fréquence des micronoyaux permettent de mesurer une réponse génotoxique plus

importante sur les sites urbains que sur les sites de référence. Ces observations ont également été

mises en évidence par d'autres études réalisées sur la rivière Sava (Klobucar et al., 2003), sur le lac

Majeur (Binelli et al., 2007) et dans le bassin de l'Orge (Bourgeault et al., 2010). Dans notre étude,

ces deux biomarqueurs de génotoxicité ne montrent pas de variation naturelle entre le printemps

et l’automne. Ces résultats sont en accord avec une précédente étude réalisée par Rank et al.

(2005). Les températures de l’eau à ces deux saisons, se situant entre 10 et 20°C, ne semblent pas

induire de variation sur le taux de cassures à l’ADN sur les dreissènes.

Les niveaux de cassure de l’ADN mesurées sur les sites urbains sont statistiquement

supérieurs au taux basal estimé à 0,65U.A. Le test comète est donc un bon outil de bioindication

de la contamination chimique du milieu urbain.

3.3.2. Fréquence des micronoyaux

Dans la première étude de transplantation, nous avons noté que le taux de micronoyaux

était plus élevé en hiver qu’au printemps contrairement au taux de cassures à l’ADN et suivait le

gradient de contamination chimique dans le Seine. D’autres études ont observé une augmentation

de la fréquence des micronoyaux au printemps (Izquierdo et al., 2003; Bolognesi et al., 2004;

Barsiene et al., 2006; Magni et al., 2006; Pytharopoulou et al., 2006), corrélée à l’augmentation de

l’exposition aux contaminants. Les fréquences des micronoyaux mesurées dans notre étude sont

corrélées positivement à la bioaccumulation en HAP par les moules tandis que le taux de cassures

à l’ADN est positivement corrélé à la contamination du milieu en HAP. Cette différence

s’explique par le fait que les cassures à l’ADN mesurés par le test comète sont le résultat

immédiat d’une exposition à des contaminants génotoxiques et reflètent à la fois les cassures

crées par les contaminants génotoxiques ainsi que les cassures créées par la réparation des bases

endommagées. La formation de micronoyaux nécessite une division cellulaire, provocant

l’apparition des micronoyaux plus tardivement. De plus, contrairement aux cassures de l’ADN

les micronoyaux sont plus stables dans le temps du fait qu’ils ne soient pas réparables et qu'ils

nécessitent une division cellulaire pour apparaître (Bombail et al., 2001; Hartmann et al., 2001).


- 158 -

Les tests comète et micronoyaux fournissent deux types d’information et sont souvent réalisés en

parallèle dans les études de biomonitoring.

Dans la seconde étude de transplantation, la fréquence des micronoyaux tout comme le

taux de cassures à l'ADN expliqué précédemment, ne varie pas entre le printemps et l’automne.

Contrairement à ce qui était observé lors de la première transplantation, la deuxième étude ne

montre pas de corrélation entre la bioaccumulation des HAP par les moules et le taux de

fréquence des micronoyaux. Cette observation soulève une question quant à la relation entre la

bioaccumulation en HAP et la fréquence de micronoyaux. En effet, dans la première étude, ces

deux biomarqueurs semblaient être liés et variaient dans le même sens, tandis que dans cette

deuxième étude, aucune corrélation ne peut être établie. Pour expliquer cette observation, on

peut émettre l’hypothèse que la contamination des sites a été constante durant le printemps et

l’automne lors la deuxième étude, permettant d’induire un taux de cassures à l’ADN et une

fréquence des micronoyaux constants au cours de ces deux saisons.

Une corrélation entre la fréquence des micronoyaux et le taux de cassures à l'ADN,

détectés par les tests comète et micronoyaux, est généralement observée malgré un léger retard

d'apparition des micronoyaux. Ce décalage dans le temps est lié au mécanisme de formation des

micronoyaux, nécessitant une division cellulaire. Les cassures de l’ADN peuvent être transitoires

du fait qu’elles sont réparables contrairement aux micronoyaux qui sont des dommages

irréversibles et présents dans la cellule jusqu’à sa mort (Kirsch-Volders et al., 2003).

La sensibilité de la réponse génotoxique exprimée par la mesure de la fréquence des

micronoyaux est dépendante de l’index mitotique des cellules étudiées. L'indice mitotique varie

selon l’âge des organismes et leur stade de développement. De ce fait, ces deux paramètres sont à

prendre en compte lors l'interprétation des résultats. En effet, un taux de division cellulaire

physiologiquement bas du tissu étudié peut diminuer la vitesse de formation des micronoyaux et

ainsi influencer leur fréquence dans les études de biomonitoring (Vasseur et al., 2008).

On peut cependant noter que la fréquence des micronoyaux est relativement faible chez la

dreissène, ne dépassant pas 10‰ (Mersch and Beauvais 1997; Bourgeault et al., 2010). Malgré la

faible fréquence des micronoyaux, il est possible de déterminer des différences statistiques entre

les sites contaminés et les sites de référence, permettant de montrer une réponse génotoxique en

accord avec le gradient de contamination chimique du milieu. De plus, ce test permet de traduire

l’exposition à des substances aneugènes, c’est-à-dire des substances induisant une augmentation


- 159 -

du nombre de chromosomes, indétectable par le test comète. Ces observations montrent donc

l'intérêt d’utiliser le test micronoyaux parallèlement à d’autres tests de génotoxicité.

3.3.3. Adduits encombrants de l’ADN

Dans la deuxième étude de transplantation de dreissènes, le taux d’adduits à l’ADN

montre une augmentation sur les sites urbains du bassin de la Seine en lien avec le gradient

chimique de contamination. De plus, le taux d'adduit à l'ADN sur les moules transplantées est

plus élevé en automne par rapport au printemps. Le taux d’adduits mesuré dans cette deuxième

étude est corrélé à la bioaccumulation en HAP par les moules et notamment avec le

benzanthracène, benzo[b]fluoranthène et le benzo[k]fluoranthène. Les métabolites de ces trois

composés sont connus pour induire des adduits à l’ADN (Weyand et al., 1993; Ericson et al.,

1999; Borosky and Laali 2006). Il n’existe que peu d’études de mesure des adduits à l’ADN sur la

dreissène, mais la comparaison des résultats obtenus lors de notre étude montre une bonne

corrélation avec les taux retrouvés par Chatel et al. après exposition de dreissènes à 10 et

100µg/L de BaP pendant cinq jours (0,9 à 2,29 adduits/109 nucléotides). Cependant, les taux

d’adduits obtenus sur les moules encagées sur les sites impactés par l’urbanisation de Paris sont

légèrement plus faibles que ceux mesuré sur le site d’Yville en juin 2002 (Le Goff et al., 2006),

dans la partie supérieure de l’estuaire de la Seine, où on retrouve 3,9 adduits/109 nucléotides.

3.4. Conclusions

Nous avons mis en évidence l’absence d’effet de la transplantation sur les dreissènes ce

qui valide la méthode de transplantation. Une augmentation du taux de cassures à l’ADN et de

micronoyaux sur les sites impactés par l’urbanisation de Paris par rapport au site amont de Paris a

été mesurée. Dans les deux études, les niveaux de cassures à l'ADN sont significativement

supérieurs au niveau basal de 0,65U.A. indiquant une réponse génotoxique significative et donc la

présence de composés à action génotoxique. L’absence de variation du taux de cassures à l’ADN

et de la fréquence des micronoyaux entre le printemps et l’automne démontre que ces deux

saisons sont favorables à la mesure de ces deux biomarqueurs de génotoxicité. La mesure des

oxydations de l’ADN chez la dreissène encagées sur des sites urbains du bassin de la Seine

montre que la dreissène est capable de métaboliser les contaminants du milieu et que les

métabolites induits forment des oxydations de l’ADN. Cette étude montre aussi la formation


- 160 -

d’adduits plus importante en automne qu’en hiver, positivement corrélée à la bioaccumulation en

HAP et notamment du benzanthracène, benzo[b]fluoranthène et le benzo[k]fluoranthène.

4. Détection des dommages oxydatifs en milieu naturel

Le quatrième objectif de ce travail était de rechercher si la pression chimique du milieu

urbain entrainait une oxydation de l’ADN chez les moules zébrées par le test comet-hOGG1.

Lors de la deuxième étude de transplantation, nous avons montré pour la première fois

une oxydation de l’ADN, détectée par le test comet-hOGG1, sur des moules encagées sur des

sites urbains du bassin de la Seine. L’induction de l’oxydation de l’ADN peut résulter de

l’activation métabolique de certains contaminants organiques, tels que les HAP (Livingstone et al.,

1990) ou être induite par certains métaux (McLachlan et al., ; Emmanouil et al., 2007). Par

exemple, le BaP nécessite une activation métabolique pouvant induire une augmentation de

radicaux libres par la voie des quinones. Le Cd peut altérer le système de défense antioxydante en

induisant une déplétion du glutathion ou une altération de l’activité des enzymes antioxydantes,

ou encore en changeant la structure de la membrane cellulaire par le processus de peroxydation

lipidique (Zikic et al., 1996; Bagchi et al., 1997). Le Cd augmente la formation de ROS tels que le

radical superoxyde, le peroxyde d’hydrogène et le radical hydroxyle. L’oxydation de l’ADN

mesurée sur les moules transplantées peut provenir en partie de ces contaminants chimiques

présents dans l’environnement. Cette présence d’oxydation de l’ADN met en évidence la capacité

de la dreissène à métaboliser les contaminants.

Les sites sensibles à hOGG1 mesurés dans cette deuxième étude de caging montrent une

oxydation de l’ADN correspondant à 25% du taux de cassures mesuré par le test comète seul. A

notre connaissance, aucune étude de biomonitoring n’a mesuré le taux d’oxydation sur des

moules par le test comet-hOGG1. Cependant, Emmanouil et al. (2008) ont étudié le taux

d’oxydation de l’ADN induit par la contamination d’un site industrialisé sur Mytilus edulis et ont

mesuré un niveau d’oxydation correspondant à 11% du taux de cassures à l’ADN mesuré par le

test comète seul.

Dans nos études de terrain, les pourcentages de sites sensibles à hOGG1 sont compris

entre 10 et 50% du taux de cassures à l'ADN détecté par le test comètes seul, ce qui est similaire

aux taux mesurés sur des moules exposées au Cd et au BaP en laboratoire. Les concentrations en


- 161 -

contaminants chimiques sont plus faibles dans le milieu aquatique que celles utilisées en

laboratoire, mais la multiplicité des substances présentes dans l'environnement peut conduire à

des effets additifs sur les organismes et donc induire des niveaux de cassures à l'ADN aussi

importants que dans les études en laboratoire.

Conclusions et perspectives

Conclusions et perspectives

- 165 -

Lors de ce travail de thèse, le test comet-hOGG1 a été adapté à Dreissena polymorpha, puis

utilisé pour mesurer l'oxydation de l'ADN des branchies de moules par des expositions en

laboratoire. Le niveau moyen d'oxydation par le BaP (12µg/L) est de 30% et de 25% pour le Cd

(81µg/L). Les lésions oxydatives induites par le BaP sont très rapidement réparées et ne sont plus

détectées après le premier jour de dépuration des moules. En revanche, les lésions oxydatives

induites par le Cd sont réparées plus lentement et ne sont ainsi plus détectées après six jours de

dépuration.

La partie terrain de cette thèse s'est déroulée en deux phases montrant dans un premier

temps que les saisons favorables à l'étude de la réponse génotoxique, du taux de cassures à l'ADN

et de la fréquence des micronoyaux exprimée par Dreissena polymorpha en milieu urbain, sont le

printemps et l'automne. En effet, lors de ces deux saisons les températures de l'eau favorisent une

activité de filtration suffisante permettant l'exposition des moules aux contaminants chimiques de

la colonne d'eau.

Dans un deuxième temps, l'oxydation de l'ADN des branchies de moules a été mise en

évidence lors de transplantation de dreissènes sur les sites urbains du bassin de la Seine. Les

niveaux d'oxydation mesurés in situ sont du même ordre que ceux mesurés en laboratoire ce qui

montre une certaine cohérence de ce biomarqueur et indiquent la présence de contaminants

induisant un stress oxydatif sur les organismes présents dans la colonne d'eau du bassin de la

Seine.

Ces divers travaux nous montrent l'intérêt d'utiliser la moule zébrée comme bioindicateur

de la contamination chimique du bassin de la Seine.

Perspectives de ce travail:

L'application du test comet-hOGG1 pour la détection d’oxydation de l’ADN couplé à

d'autres outils d'évaluation du stress oxydatif, comme la mesure de l'activité des enzymes du

stress oxydatif pourrait être plus informative. Cloner et séquencer l'endonucléase homologue de

OGG1 retrouvée chez la dreissène permettrait de mesurer son induction sur des moules exposées

en laboratoire. Il serait alors possible de mesurer l'induction de l'enzyme homologue de hOGG1

et étudier le lien entre son induction et les niveaux de lésions oxydatives mesurés par le test

comet-hOGG1. Ensuite, ces comparaisons pourraient être réalisées sur des organismes

transplantés, afin d'établir une relation entre le niveau de 8-oxodG et les niveaux d'induction de

l'enzyme de réparation de ces dommages.

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Annexe

Annexe 1

Tableau récapitulatif des résultats de bioaccumulation des HAPs par Dreissena polymorpha

lors de l'étude de transplantation réalisée au printemps et à l'automne 2010. Site1: site amont

de Paris, sites 2, 3 et 4: site impactés par l'urbanisation de Paris.

Site 1 Site 2 Site 3 Site 4

Printemps Automne Printemps Automne Printemps Automne Printemps Automne

Fluorène 7.20 nd 9.88 20.98 12.64 37.99 11.62 19.06

Phénanthrène 464.23 202.98 479.87 640.22 402.93 783.13 381.32 528.78

Anthracène 25.93 9.89 34.44 52.54 68.28 104.01 34.21 52.28

Fluoranthène 107.92 108.63 78.52 422.65 241.90 1078.96 165.53 352.84

Pyrène 185.33 213.94 130.88 608.70 295.33 1423.50 253.38 461.66

Benzo(a)anthracène 29.84 nd 85.64 48.97 366.56 445.46 121.63 140.95

Chrysène 45.87 nd 151.48 85.39 490.63 497.99 241.50 179.30

Benzo(b)fluoranthène nd nd nd 86.60 nd nd nd 137.76

Benzo(k)fluoranthène 53.95 nd nd 161.67 93.38 nd nd 202.66

Benzo(a)pyrène nd 113.27 nd nd nd nd nd nd

Indéno(1,2,3-cd)pyène nd nd nd nd nd nd nd nd

Dibenzo(a,h)anthracène 0.42 nd nd nd nd nd nd nd

Benzo(g,h,i)pérylène nd nd nd nd nd nd nd nd

Somme 920.69 648.72 970.70 2127.71 1971.65 4371.04 1209.19 2075.27

Résumé

Les activités anthropiques sont responsables de l'introduction d'un grand nombre de substances chimiques dans l'environnement. Dans le cadre de la Directive Cadre Européenne sur l’eau, il est nécessaire d'évaluer l'impact de la contamination chimique sur les milieux aquatiques afin d'établir un diagnostic de l'état écologique des masses d'eau. Les biomarqueurs de génotoxicité permettent l'évaluation de l'impact des contaminants chimiques sur l'intégrité structurelle de l'ADN et comme indicateurs prédictifs d’effets au niveau populationnel.

L'objectif général de cette thèse est de développer un biomarqueur de génotoxicité sensible et précoce des effets de la contamination chimique urbaine sur Dreissena polymorpha. Dans ces travaux, nous avons utilisé le test comète, permettant de mesurer les cassures de brins d'ADN et les sites alcali-labiles. Nous avons couplé ce test à une endonucléase spécifique de la détection des lésions oxydatives (hOGG1)

afin d’améliorer sa significativité, par la recherche de lésions oxydatives, telle que la 8-oxodG, impliquée

dans le vieillissement cellulaire et la cancérogénèse. La formation d'oxydation de l'ADN a été mise en évidence par le test comet-hOGG1 appliqué à des cellules de branchies de moules exposées au BaP et au Cd. La réparation des lésions oxydatives induites par le BaP s'est avérée plus rapide que celles induites par le Cd. D'autre part, la variabilité naturelle de certains biomarqueurs de génotoxicité tels que le taux de cassures à l'ADN, la fréquence des micronoyaux et le nombre d'adduits à l'ADN, a été étudiée dans le but d'éliminer ce biais dans de futures études de biomonitoring. Les résultats des études in situ ont permis de mettre en évidence une induction de lésions oxydatives sur les moules transplantées sur les sites urbains du bassin de la Seine. De plus, ces travaux montrent que la technique de transplantation des moules n'induit pas de modification du statut biologique des organismes, ni de variation de l'expression du taux de cassures à l'ADN et de la fréquence de micronoyaux. Enfin, la comparaison de l'expression des biomarqueurs de génotoxicité entre le printemps et l'automne montre que ces deux saisons sont favorables aux études de biomonitoring par la transplantation de dreissènes.

Mots clés : Biomarqueurs de génotoxicité, Oxydation de l’ADN, Comet-hOGG1, Transplantation, Variabilité naturelle.

Abstract

Human activities are responsible of the introduction of a large number of chemical contaminants in the environment. In order to assess the ecological status of water bodies, it becomes necessary to assess the impact of chemical contamination in the aquatic environment. The use of genotoxicity biomarkers allows the evaluation of the impact of chemical contaminants on the DNA integrity as predictors of effects at the population level.

The main objective of this work was to develop a sensitive biomarker of early genotoxic effects of chemical contamination in Dreissena polymorpha caged in urban area. We used the comet assay, to measure DNA strand breaks and alkali-labile sites. We have coupled this assay with a specific endonuclease of oxidative DNA damage (hOGG1) to enhance the significance of the comet-hOGG1 assay, by the oxidative DNA damage detection, such as 8-oxodG, involved in cellular aging and carcinogenesis. The DNA oxidation formation has been demonstrated by the comet assay applied to mussel gills cells exposed to BaP and Cd. The oxidative DNA damage induced by BaP exposure were faster repaired than in mussels exposed to Cd. Then, the intrinsec variability of some genotoxicity biomarkers such as the level of DNA strand breaks, the micronuclei frequency and the number of DNA adducts, was assessed in order to eliminate this parameter in future biomonitoring studies. Results obtained in field studies showed the oxidative DNA damage induction in caged zebra mussels in urban sites of the Seine river basin. In addition, these studies showed that the mussels transplantation did not induce change either in the biological status of organisms or changes in the DNA strand break levels and micronuclei frequency. Finally, the comparison of the expression of genotoxicity biomarkers between spring and autumn showed that these two seasons are favourable to biomonitoring studies by the transplantation of Dreissena polymorpha.

Keywords: Genotoxicity biomarkers, DNA oxidation, Comet-hOGG1, Caging, Intrinsec variability.

biomarqueurs de génotoxicité chez dreissena polymorpha

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