BIOLOGÍA MOLECULAR U.D. 2 ÁCIDOS NUCLEICOS ÍNDICE I

1. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA2. ¿QUÉ SON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS?

2.1. COMPONENTES DEL ADN Y ARN2.1.1. Las bases nitrogenadas2.1.2. La pentosa2.2.3. Ácido fosfórico

2.2. NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS2.3. DIFERENCIAS CLAVE ENTRE EL ARN Y ADN

3. EL ADN3.1. LA CROMATINA3.2. ESTRUCTURA DEL ADN

ÍNDICE II

3.3. ORGANIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE ADN3.4. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁC. NUCLEICOS3.5. RECORDEMOS LOS TIPOS DE CROMATINA

4. ESTRUCTURA DEL ARN4.1. Tipos de ARN.

4.1.1. ARNm4.1.2. ARNr4.1.3. ARNt4.1.4. ARN con función reguladora4.1.5. Otros ARN

ÍNDICE III

5. FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL ADN5.1. Almacenamiento De Información. Conceptos.5.2. Replicación del ADN.

5.2.1. Enzimas de la replicación5.2.2. Fases de la replicación

5.3. Codificación de Proteínas 5.3.1.Transcripción5.3.2.Traducción

6. ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR6.1. Nucleasas6.2. Endonucleasas de restricción6.3. ADN polimerasas6.4. Otras enzimas

� La biología molecular estudia las moléculas de la vida: azúcares, grasas, proteínas y ac. nucleicos. En su sentido moderno, la biología molecular pretende explicar los fenómenos de la vida a partir de las propiedades macromoleculares de dos macromoléculas en particular, que son los ácidos nucleicos y las proteínas.

� La citogenética es el campo de la genética que comprende el estudio de la estructura, función y comportamiento de los cromosomas.

1. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA Recordemos:

� Son grandes polímeros formados por la repetición demonómeros denominados nucleótidos, unidos medianteenlaces fosfodiéster.

� Algunas moléculas llegan a alcanzar tamañosgigantescos, con millones de nucleótidos encadenados.

� Almacenan la información genética de los organismosvivos y son los responsables de la transmisiónhereditaria.

� Existen dos tipos básicos, el ADN y el ARN.

2. ¿QUÉ SON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS?

Base nitrogenada + pentosa (ribosa o desoxirribosa)

2.1.COMPONENTES DEL ADN Y ARN. Los nucleósidos

Enlace N-glicosídico

2.1. COMPONENTES DEL ADN Y ARN. Los nucleótidos.

Base nitrogenada + Pentosa: ribosa o desoxirribosa+ Ácido fosfórico (PO4H3)

Son compuestos orgánicos cíclicos, que incluyen dos o másátomos de nitrógeno y son parte fundamental de los ácidosnucleicos. Biológicamente existen más de seis basesnitrogenadas que se clasifican en tres grupos. Nosotros nosvamos a centrar en dos grupos:� bases púricas o purinas: derivadas de la purina. Aquí se

encuentran la adenina (A) y la guanina (G)� bases pirimidinas: derivadas de la pirimidina. Se

encuentran la timina (T), la citosina (C) y el uracilo (U).Por comodidad, cada una de las bases se representa por laletra indicada. Las bases A, T, G y C se encuentran en el ADN,mientras que en el ARN en lugar de timina aparece el uracilo.

2.1.1.Las bases nitrogenadas

2.1.2. La pentosa

La ribosa llamada también pentosa o monosacárido decinco átomos de carbono es de alta relevancia biológica enlos seres vivos al constituir uno de los principalescomponentes del ARN en su forma cíclica, y de otrosnucleótidos no nucleicos como el ATP.

La desoxirribosa, o más precisamente 2-desoxirribosaes un desoxiazúcar derivado de un monosacárido de cincoátomos de carbono (pentosa), derivado de la ribosa porpérdida de un átomo de oxígeno en el hidroxilo de 2'.Forma parte del ADN.

2.1.3. Ácido fosfórico

El ácido fosfórico es un compuesto químico ácido, de fórmula H3PO4. El anión asociado al ácido fosfórico se llama anión fosfato (PO4 ̄ ³), muy importante en la biología, especialmente en los compuestos derivados de los azúcares fosforilados, como el ADN, el ARN y la adenosina trifosfato (ATP).

2.3. DIFERENCIAS CLAVE ENTRE ARN Y ADN

ADN ARN

Generalmente cadenas largas de nucleótidos

Generalmente cadenas cortas de nucleotidos

Desoxirribosa Ribosa

Generalmente cadena doble A- -T C- - -G

Generalmente cadena simple, aunque puede sufrir plegamientosA- -U C- - -G

Almacena composición genética

Transmitir la información del ADN y creación proteínas

Nucleo celular. También en mitocondrias y cloroplastos.

En el núcleo, disperso en el nucleoplasma o concentrado en los nucleolos.En el citoplasma, disperso en el citosol o concentrado en los ribosomas

Más estable debido a la doble hélice

Menos estable, puesto que sus niveles organizativos no son tan compactos.

REGLAS DE CHARGAFF PARA ADN DE DOBLE HÉLICE

La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = TLa relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T= 1)

La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G = CLa relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad (G/C= 1)

La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las basespirimidínicas (T+C). (A+G) = (T+C). La relación entre (A+G) y(T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1

Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) eracaracterística de cada organismo, pudiendo tomar por tanto,diferentes valores según la especie estudiada. Este resultadoindicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótonade un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición debases nitrogenadas.

3. EL ADN3.1. LA CROMATINA

Está formada por el ADN con la información genéticay las proteínas que lo empaquetan que seencuentran dentro del núcleo. La cromatina es unaestructura dinámica que adapta su estado decompactación y empaquetamiento para optimizar losprocesos de replicación, transcripción y reparacióndel ADN.

La unidad básica de la cromatina es el nucleosomaque consiste en un fragmento de ADN enrolladoalrededor de un octámero de histonas.

Se compone de dos cadenas enrolladas una a la otra en una doblehélice, de modo similar a una escalera de caracol, dónde:– Los peldaños, en el interior de la hélice, serían las bases

nitrogenadas– Los pasamanos serían el esqueleto azúcar-fosfato

En cada vuelta de hélice hay 10 nucleótidos Los azúcares y fosfatos que unen un nucleótido al siguiente forman

el esqueleto en cada lado de la doble hélice. En tanto que las bases de cada cadena se aparean en el centro de la

hélice. Solo pares específicos de bases, llamados pares de bases

complementarias, se pueden unir en la hélice mediante enlaces dehidrógeno: adenina con timina y guanina con citosina.

3.EL ADN3.2. ESTRUCTURA DEL ADN

• Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un grupo fosfato forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones 3’ de un azúcar y 5’ del siguiente).

• Las dos hélices se mantienen unidas mediante puentes o enlaces de hidrogeno producidos entre las bases nitrogenadas de cada hélice.

Para la formación de un enlace de hidrógeno una de las bases debe presentar un "donador" de hidrógenos con un átomo de hidrógeno con carga parcial positiva (-NH2 o -NH) y la otra base debe presentar un grupo "aceptor" de hidrógenos con un átomo cargado electronegativamente (C=O o N).

Siguiendo los datos de Chargaff (1959), la Adenina de una hélice aparea con la Timina de la hélice complementaria mediante dos puentes de hidrógeno. Igualmente, la Guanina de una hélice aparea con la Citosina de la complementaria mediante tres puentes de hidrógeno

A T C G

EXTREMO 5EXTREMO 3

3.2.1. Estructura 1ª del ADN

Secuencia de nucleótidos encadenados. Se encuentra la información genética y el esqueleto

es el mismo para todos. La diferencia de la información radica en la distinta

secuencia de bases nitrogenadas. Esta secuencia presenta un código, que determina

una información u otra, según el orden de las bases.

3.2.2. Estructura 2ª del ADN

Es una estructura en doble hélice. Permite explicar elalmacenamiento de la información genética y elmecanismo de duplicación del ADN.

Es una cadena doble, dextrógira o levógira, según eltipo de ADN. Algo parecido a dos muelles entrelazados.

Para separar las dos hélices es necesario girarlas comosi fuera un sacacorchos.

Ambas cadenas son complementarias (A- -T / C- - -G) Principio de complementariedad cantidad A=T / C=G Ambas cadenas son antiparalelas, pues el extremo 3´

de una se enfrenta al extremo 5´ de la homóloga.

levo dextro 3.2.2. Estructura 2ª del ADN

Un giro de la doble hélice equivale a 10 nucleótidos. La separación de bases es de 0,34 nm Una vuelta completa de la hélice tiene 3,4 nm Misma cantidad de bases púricas y pirimidínicas

(excepto en algunos virus de ADN monocatenario)

3.2.3. Estructura 3ª del ADN

En procariotas el ADN se pliega como una súper-hélice,generalmente en forma circular y asociada a unapequeña cantidad de proteínas. Lo mismo ocurre enorgánulos celulares como las mitocondrias y en loscloroplastos.

El nucleosoma es una estructura que constituye launidad fundamental y esencial de la cromatina, que es laforma de organización del ADN en las células eucariotas.

Los nucleosomas están formados por un núcleo proteicoconstituido por un octámero de histonas (proteínas).

3.2.4. Estructura 4ª del ADN

El enrollamiento de los nucleosomas recibe el nombre desolenoide.

Los solenoides se enrollan formando la cromatina delnúcleo interfásico de la célula eucariota.

La cromatina presente en el núcleo tiene un grosor de300 Å, pues la fibra de cromatina de 100 Å se enrollaformando una fibra de cromatina de 300 Å.

Cuando la célula entra en división, el ADN se compactamás, formando así los cromosomas.

Solenoide

3.2.5 Cromosoma

Cada una de las estructuras altamente organizadas,formadas por ADN y proteínas, que contiene la mayorparte de la información genética de un individuo.

Formado por un gran número de genes La cromatina, organizada en cromosomas, se

encuentra en el núcleo de las células eucariotas y sevisualiza como una maraña de hebras delgadas.Cuando comienza el proceso de duplicación y divisióndel material genético, esa maraña de hebras inicia unfenómeno de condensación progresivo que permitevisualizar cada uno de los cromosomas.

1. Cromátida, cada una de laspartes idénticas de uncromosoma luego de laduplicación del ADN.

2. Centrómero, el lugar delcromosoma en el cual ambascromátidas se tocan.

3. Brazo corto.4. Brazo largo.

a) Diagrama de un cromosoma eucariótico (duplicado y condensado)

CromátidasHermanas

Cromátidas

3.3.ORGANIZACIÓN DE LAS MOLÉCULAS DE ADN.

VIRUS DE ADNPresentan una única molécula lineal o circular, bicatenaria o monocatenaria.

ORGANISMOS PROCARIOTASADN se encuentra en su mayor parte en un solo cromosoma y en menor proporción en fragmentos pequeños llamados plásmidos Cromosoma bacteriano: 1 molécula ADN bicatenaria y circular de

gran tamaño, en el citoplasma y sin membrana celular. En el m. electrónico este ADN empaquetado se observa como una estructura clara de aspecto fibrilar denominado nucleoide.

Plásmidos: algunas bacterias además del cromosoma bacteriano, contienen pequeñas moléculas circulares bicatenarias de ADN.

• Están formados por unos pocos de miles de nucleótidos

• Su nº oscila entre 1 y varios cientos• Se replican independiente del cromosoma bacteriano• Habitualmente contienen genes de resistencia a

antibióticos y factores de virulencia

Características de los plásmidos

ORGANISMOS EUCARIOTAS.

ADN CROMOSÓMICO NUCLEAR: Asociado a proteínas: histonas con función estructural y

no-histonas con funciones estructurales, enzimáticas y reguladoras.

ADN+histonas=cromatinaADN MITOCONDRIAL (ADNmt) o CROMOSOMA MITOCONDRIAL Molécula bicatenaria y circular Contiene genes que codifican para ARNr, ARNt y

enzimas empleadas en los procesos metabólicos de la mitocondria

ORGANISMOS EUCARIOTAS.

ADN CLOROPLASTOS Células vegetales. Molécula bicatenaria y circular Codifica enzimas específicas de este orgánulo.ADN COPIA (ADNc) Obtenido in vitro, se obtiene en el laboratorio a partir

de ARN aislado de una célula (retrotranscriptasa) Permite obtener una copia de ADN de todas las

moléculas de ARN presentes en una célula en un estado metabólico concreto, muy útil para conocer la información almacenada en el ADN con los estudios de expresión génica.

3.4. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LOS ÁC. NUCLEICOS

Fuertemente ácidas en solución acuosa (grupos fosfato) Elevada viscosidad Pico absorción UV 260 nm Hibridación: unión doble cadena mediante puentes H Desnaturalización ADN (rotura puentes H): temperatura y ph Renaturalización ADN: tª lentamente y ph

4. ESTRUCTURA DEL ARN.

Largas cadenas de ribonucleótidos (A,U,G,C) Los ARNt pueden contener pequeñas cantidades de otras

bases nitrogeneadas (derivadas de las anteriores) ARN es monocatenario y lineal excepto en algunos virus

que es bicatenario (ARNds / double stranded – doble hebra). Ej.reovirus

Puede plegarse y forma regiones de doble hélice denominadas horquillas

Bucles: secuencias no complementarias, extremo de la horquilla

A- - U / C- - - G

ADENINA, URACILO, CITOSINA Y GUANINA (carece de TIMINA)

4.1. TIPOS DE ARN.

PRINCIPALES:– ARN mensajero (ARNm)– ARN ribosómico (ARNr) – ARN de transferencia (ARNt)

FUNCIÓN REGULADORA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA:– ARNsi– ARNmi

OTROS: – ARNhn– ARNsn– ARNsno

4.1.1. ARN mensajero (ARNm)

Múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños (2-5% del ARN total de una célula)

Copia exacta de la secuencia de un gen (1 codón=tres bases=1 aminoácido)

ARNm procariota es policistrónico, portan información para sintetizar varias proteínas distintas.

4.1.2. ARN ribosómico (ARNr)

80% en la célula ARNr+proteínas=ribosomas (síntesis de proteínas) Se clasifican según su coeficiente de sedimentación:

– Procariotas: 5S,16S Y 23S (svedbergs (1 S = 10−13

segundos)– Eucariotas: 5S,5.8S,18S Y28S

http://biomodel.uah.es/biomodelmisc/anim/centrif/centrif-vs.webm

4.1.3. ARN de transferencia (ARNt)

Transportan los aminoácidos(aa) hasta los ribosomas Cadenas cortas (70-90 nucleótidos) Estructura 2ª: Forma de trébol: cuatro horquillas y tres bucles o

lazos Estructura 3ª: en forma de L o bumerán Extremo 3`de todos los ARNt termina con la secuencia 5`-CCA-3`y

es el sitio de unión del aminoácido Un 10% de sus bases pueden ser distintas a las habituales. Pueden

tener Timina.– Lazo D: unión de la enzima-une el aa al extremo 3`– Lazo T: unión al ribosoma– Lazo anticodón: contiene tres bases complementarias del codón en el

ARNm que codifica para el aa que porta

ARNt

Ribosoma

ARNm

EnzimaAminoacil-ARNtSintetasa (20) Anticodón

Extremo aa

ESTRUCTURA 2ª ESTRUCTURA 3ª

4.1.4. ARN con función reguladora

Moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones especificas del ARNm

Estas moléculas se unen al ARNm y bloquean la traducción a proteína o activan a enzimas que degradan al ARNm

Bicatenarias:– ARN interferente pequeño o ARNsi

Monocatenarias:– MicroARN o ARNmi (forman una horquilla)

4.1.5. Otros ARN

ARN heterogéneo nuclear (ARNhn): pre-ARNm (transcrito primario). Largas moléculas lineales en el núcleo que maduran hacia ARNm que sale hacia el citoplasma

ARN pequeño nuclear (ARNsn): pequeñas moléculas de ARN (núcleo) + proteínas=ribonucleoproteínas. Maduración ARNm.

AN pequeño nucleolar (ARNsno): en nucleolo y precursor de varios ARNr (45S tras fragmentar=5,8S,18S y 28S)

• El RNA pequeño nuclear (RNAsn) presente en el núcleo y es de pequeño tamaño.

• Implicado en los procesos de maduración del RNAhn.

• En este proceso, el RNAsn se asocia a proteínas formando las ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPsn) que se encargan de eliminar los intrones (aquellos fragmentos del transcrito primario de RNA que no aparecen en el molde de RNAm).

• El complejo RNA-proteína de gran tamaño, visible al microscopio electrónico recibe el nombre de espliciosoma(spliceosome).

5. FUNCIONES BIOLÓGICAS DEL ADN

5.1. ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN. CONCEPTOS.

5.2. REPLICACIÓN DEL ADN.

5.3. CODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 5.3.1.TRANSCRIPCIÓN5.3.2.TRADUCCIÓN

5.1. ALMACENAMIENTO DE INFORMACIÓN.

El ADN es la molécula que codifica las instrucciones para crear un ser vivo casi igual a aquél que le da origen.

Todas las células que forman a un organismo tienen la misma información genética. Esta cualidad, la de hacer copias exactas de sí mismo, es una característica esencial del material genético y está relacionada con la replicación del ADN.

5.1.1. Conceptos: Gen

Es una unidad de información en un locus (es una posiciónfija en un cromosoma, como la posición de un gen o de unmarcador genético) de ADN que codifica un productofuncional, o ARN o proteínas.

Es la unidad de herencia molecular. También se conoce como una secuencia de nucleótidos en

la molécula de ADN. o de ARN, en el caso de algunos virusy contiene la información necesaria para la síntesis de unamacromolécula con función celular específica,habitualmente proteínas pero también ARN mensajero(ARNm), Ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) y ARN detransferencia (ARNt).

5.1.2. Conceptos: Genoma y ADN genómico

Genoma es el conjunto de genes contenidos en loscromosomas, lo que puede interpretarse como latotalidad de la información genética que posee unorganismo o una especie.

ADN genómico (que se organiza en moléculas decromatina que a su vez se ensamblan en cromosomas)se encuentra en el núcleo celular de los eucariotas,además de pequeñas cantidades en las mitocondrias ycloroplastos. En procariotas, el ADN se encuentra enun cuerpo de forma irregular denominado nucleoide.

5.1.3. Conceptos: Genotipo y Fenotipo

Genotipo: información genética que posee un organismo enparticular, en forma de ADN. Normalmente el genoma de unaespecie incluye numerosas variaciones o polimorfismos enmuchos de sus genes. El genotipado se usa para determinarqué variaciones específicas existen en el individuo.

Fenotipo: a la expresión del genotipo en función de undeterminado ambiente. Los rasgos fenotípicos cuentan conrasgos tanto físicos como conductuales. Es importantedestacar que el fenotipo no puede definirse exclusivamentecomo la "manifestación visible" del genotipo, pues a veces lascaracterísticas que se estudian no son visibles en el individuo,como es el caso de la presencia de una enzima.

5.2. REPLICACIÓN DEL ADN.

Las dos cadenas originales se separan en los puentes hidrógeno y cada una sirve de molde para fabricar dos nuevas hebras complementarias.

Modelo semiconservativo (1 original-1 copia) Origen de la replicación: varios puntos en cromosomas

eucariotas y uno solo en los bacterianos Bidireccional y secuencial: dos horquillas de replicación Semidiscontinua: sintesis 5`-3`y lectura 3`-5. Una hebra

continua (hebra adelantada o conductora) y otra discontinua mediante fragmentos Okazaki (hebra retardada)

5.2.1. Enzimas de la replicación I

Helicasa: Desenrolla y separa las dos cadenas de la doblehélice.

Proteína de unión a cadena sencilla (SSBP-single-stranded DNAbinding proteins o proteínas ligantes de ADN monocatenario):se unen a las cadenas desenrolladas evitando que se vuelva aformar la doble hélice.

Girasa y topoisomerasa: la burbuja de replicación genera unatensión en la doble hélice que estas enzimas relajan mediantecortes y empalmes.

ADN polimerasa: no puede iniciar una cadena, solo elongarla,requieren de un iniciador 3'-OH (ADN o ARN) llamado cebadorque es sintetizado por la ARN primasa (ARN polimerasa). Elextremo 3' del cebador se denomina extremo cebador.

degrada primer

elonga primer

5.2.1. Enzimas de la replicación II

Primasa: función ARN polimerasa que sintetiza cortosfragmentos de ARN (aprox. 10 nucleótidos) denominadoscebadores o primers. Para la hebra conductora serequiere un único cebador en el origen de la replicación yvarios para la retardada, uno para cada fragmento deOkazaki.

Ligasa: une los fragmentos de Okazaki entre si y con lahebra conductora para conseguir la continuidad de lanueva cadena.

Características dela replicación5.2.2.Fases de la replicación I (procariotas) FASE DE INICIACIÓN

Helicasas rompen puentes de H (burbuja dereplicación)

Las SSBP se unen a las cadenas separadas evitandosu unión

Girasas y topoisomerasas relajan la tensión próximaburbuja replicación

Helicasa permite que la burbuja de replicación seextienda, formándose dos regiones en forma de Y enlos extremos de la burbuja denominados horquillas dereplicación

5.2.2.Fases de la replicación II (procariotas) FASE DE ELONGACIÓN

Primasa sintetiza los cebadores 5`-3`. Posteriormente se separa de la cadena molde y entra la ADN pol III que inicia la elongación añadiendo desoxinucleótidos en la posición 3`libre.

En la cadena retardada ADN pol III se separa de la cadena molde cuando alcanza el cebador del fragmento de Okazaki anterior.

ADN pol I se une en los cebadores, los elimina mediante su actividad exonucleasa 5`-3`y los sustituye por ADN

La ligasa une los fragmentos Okazaki consecutivos Errores se reparan por actividad exonucleasa ADN pol III

5.2.2. Fases de la replicación III (eucariotas)

Es a grandes rasgos similar a la de procariotas con algunas peculiaridades: Orígenes de replicación múltiples (varios puntos del

cromosoma) Hay 5 tipos de ADN polimerasas con tareas de

elongación, eliminación de cebadores y corrección de errores.

El ADN eucariótico está unido a histonas, por lo que durante la replicación se van estructurando también los nucleosomas.

Intervienen enzimas similares a los que actúan en

las células procariontes y otros enzimas que han de duplicar las histonas que

forman parte de los nucleosomas. Los

nucleosomas viejos permanecen en la hebra

conductora.

5.3. CODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.5.3.1. Transcripción

Es el proceso por el que se transmite la información contenida en el ADN al ARN.

Este proceso se lleva a cabo por la ARN polimerasa-ADN dependiente o transcriptasa que utiliza como molde una de las dos hebras del ADN, la denominada hebra codificante.

Durante el proceso de transcripción se reconoce un sitio específico de la molécula de ADN en el que se van a unir las enzimas.

Algunos virus-ARN son capaces de replicar su ARN e incluso sintetizar ADN a partir de su ARN (transcripción inversa).

ARN-POLIMERASA

5.3.1. Transcripción .Enzimas

En procariontes solo existe un tipo de ARN polimerasa En eucariontes tres tipos:

– ARN polimerasa I: síntesis de la mayor parte del ARNr– ARN polimerasa II: síntesis ARNm– ARN polimerasa III: síntesis ARNt y de la subunidad 5S del ARNr

5.3.1. Transcripción. Fase de Iniciación.

El ARN polimerasa reconoce al promotor(es la secuencia de bases específicas que señala el comienzo de la transcripción del ADN a ARN) y se une a él.

Separación de las dos cadenas de ADN

5.3.1. Transcripción. Fase de Elongación.

ARN polimerasa cataliza la adición de ribonucleótidos Solo se transcribe la cadena molde o codificadora La que no se transcribe es la cadena no molde,

informativa o sin sentido ARN pol lee 3`-5`selecciona ribonucleótido

complementario del ADN e incorporándolo a la cadena de ARN en crecimiento (mediante enlace fosfodiéster).

Crecimiento de la cadena de ARN 5`-3`

5.3.1. Transcripción. Fase de Terminación.

ARN polimerasa alcanza una secuencia específica en el ADN denominada señal o secuencia de terminación.

La cadena de ARN se separa del ADN y de la enzima La ARN polimerasa se separa del ADN El ADN recupera doble hélice

5.3.1. Transcripción. Fase de Maduración

Proceso que requieren las cadenas de ARN transcritas para dar lugar a los tipos principales de ARN:

– ARNt– ARNr– ARNm

A continuación veremos las diferencias en la maduración del ARN en procariontes y eucariontes.

5.3.1. Transcripción. Fase de Maduración en Procariontes

ARNt y ARNr =largas moléculas (transcritos primarios) con muchas copias de cada uno de ellos

Enzimas específicas los cortan dando lugar a los diferentes tipos de ARNt y ARNr

ARNm no requiere modificación, la traducción se inicia antes de terminar la transcripción ya que los ribosomas se pueden acoplar al extremo 5`libre de la cadena ARNm en crecimiento.

5.3.1. Transcripción. Fase de Maduración en Eucariontes

Exones: secuencias que se transcriben y traducen Intrones: secuencias que se transcriben pero no se

traducen(no codifican) ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) o pre-ARNm contiene

intrones y no puede salir del núcleo La maduración del ARNm se puede esquematizar en tres

pasos:

1. Adición de una caperuza (cap) en 5`libre de la cadena en crecimiento. Protege de la degradación. Se une un nucleótido modificado de guanina, que forma lo que se denomina la “caperuza”, el “casquete” o el extremo “Cap”.

2. Adición cola de Poli-A (una cola de muchas adeninas) en 3`mediante la enzima Poli-A polimerasa tras haberse separado del ADN y de la ARN polimerasa. Permite salir del núcleo.

3. Eliminación de los intrones (splicing). Interviene unas ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPsn) que se sitúan en los extremos de los intrones efectuando “corte-empalme” denominado espliceosoma.

Este mecanismo de corte y unión ha recibido el nombre de "splicing" en inglés. Cuando se analizan las secuencias de las regiones de paso de intrón a exón y de exón a intrón se encuentra unas secuencias bastante conservadas, en casi todos los casos aparece la secuencia GU en el punto de corte 5' del intrón y AG en el punto de corte 3'. Estas secuencias son reconocidas por moléculas de ARN nucleares pequeñas (ARNsn) que interaccionan con proteínas formando ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNPs) que constituyen lo que se ha denominado el "espliceosoma".

http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_03.htm

5.3.CODIFICACIÓN DE PROTEÍNAS 5.3.2. Traducción.

Es el proceso por el que la información genéticacontenida en el ADN y transcrita en un ARNmensajero va a ser utilizada para sintetizar unaproteína. El proceso se lleva a cabo en losribosomas.

5.3.2. Traducción.El código genético. Características.

Es el diccionario que permite traducir una secuencia de bases nitrogenadas a una secuencia de aminoácidos. Codón: 3 bases nitrogenadas codifican 1 aa. De los 64 codones posibles, 61 codifican aa y 3 son de terminación.- Es universal (excepto en el código genético mitocondrial, algunos codones codifican un aa distinto)- No es ambiguo: cada codón codifica un único aa- Es degenerado: la mayoría de los aa están codificados por más de un codón (codones sinónimos)- Es continuo y no solapado: codones sin separaciones- Todos ARNm empiezan con el codón de inicio AUG (metionina) y termina con los codones de terminación UAA,UAG Y UGA.

Serie de codones en unsegmento de ARN. Cadacodón se compone de 3bases nitrogenadas quecodifican 1 aminoácidoespecífico.

5.3.2. Traducción.Fases del proceso. Elementos necesarios.

ARN m 20 aminoácidos ARNt que transportan los aa hasta los ribosomas Enzimas que catalizan la unión entre aa Los ribosomas (ARNr+proteínas)

– Subunidad menor: unión ARNm– Subunidad mayor:

sitio peptidil o sitio P está el ARNt que porta la cadena polipéptídica en crecimiento

Sitio aminoacil o sitio A está el ARNt que porta el siguiente aa que se incorpora en la cadena

P A P A P A

6. ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas de BM implican manipulaciones de ácidosnucleicos, tales como amplificación, degradación, corte,unión, marcaje, secuenciación, etc.Todas estas acciones son posible gracias a la actividadcatalizadora de enzimas específicas que son aisladas detodo tipo de organismos (virus, bacterias y célulaseucariotas).Realizan in vitro la misma actividad que llevarían a caboin vivo en condiciones fisiológicas.

6.1. NUCLEASAS. CLASIFICACIÓN I

Son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos. Según el tipo de ácido nucleico:

Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa) rompen los enlaces fosfodiéster entre ribonucleótidos.

Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa) rompen enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos.

6.1. NUCLEASAS. CLASIFICACIÓN II

Según el tipo de cadena: Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias,

rompiendo enlaces en ambas cadena. Nucleasas que solo atacan moléculas monocatenarias

(p. ej. Nucleasa S1 degrada ARNss, ADNss y zonas monocatenarias de ADNds, como lazos o bucles)

Según la situación del punto de corte Exonucleasas: eliminan nucleótidos uno a uno desde

un extremo 5`-3`y/o 3`-5` Endonucleasas que cortan en puntos intermedios de la

molécula.

6.1. NUCLEASAS. CLASIFICACIÓN III

Según la especificidad del corte: Nucleasas que cortan aleatoriamente. Nucleasas que cortan en sitios concretos. Se unen en

una secuencia concreta y la cortan.

6.2. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN

Son endonucleasas bacterianas que reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario (4-8 pares de bases) y producen un corte en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula.Las secuencias de ADN específicas que reconocen se denominan dianas de restricción.En las bacterias constituye una defensa inmune puesto que degrada el ADN exógeno. Para protegerse modifican sus dianas de restricción (metilación de las bases nitrogenadas). En muchas ocasiones tienen ambas funciones (corte y metilación)

6.2.1. Tipos de enzimas de restricción

Tipo I: reconoce su diana y efectúa el corte en una región anterior o posterior de la diana a una distancia aleatoria de hasta 1000 pb. No generan patrones de fragmentos. No tiene gran utilidad en BM.

Tipo II: reconocen la diana de restricción y cortan en puntos específicos, generalmente dentro de la misma diana. Generan patrones específicos y reproducibles de fragmentos. Se les llama tijeras moleculares.

Tipo III: reconocen dos secuencias invertidas dentro de la misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción a una distancia corta (25-30 pb)

6.2.2. Nomenclatura enzimas de restricción

Tres letras (nombre científico de la bacteria-cursiva) y un nº romano

1ª letra: genero, 2ª y 3ª primeras letras de la especie Nº romano: orden en el que se ha aislado la enzima en

la misma especie A veces 4ª letra: cuando la enzima se ha aislado de

una cepa concreta de una especie bacteriana, p.ej: EcoR V= 5ª enzima aislada en Escherichia coli, cepa RY13

6.2.2. Tipos de corte enzimas de restricción

Extremo romo: generalmente en el centro de la diana Cohesivos: normalmente en los extremos de la diana. Genera en

cada extremo regiones monocatenarias cortas y complementarias que se pueden adherir facilmente a fragmentos de ADN con secuencia de bases complemetarias.

6.2.2. Enzimas de restricción. Aplicaciones en BM.

CREACIÓN DE ADN RECOMBINANTE

1. Se cortan 2 moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción.

2. Se unirán las regiones monocatenarias por la complementariedad de las bases los fragmentos con extremos cohesivos

3. Las mellas que quedan en cada cadena se unen con una ligasa y se obtiene una molécula híbrida recombinante.

6.2.2. Enzimas de restricción. Aplicaciones en BM.

PATRONES DE RESTRICCIÓN 1 molécula ADN+1 enzima restricción=fragmentos

separables mediante electroforesis en gel El conjunto de bandas es único para un ADN en concreto

y se denomina patrón de restricción Utilidades:

– estudios filogenéticos– anomalías en diagnóstico prenatal– detección de mutaciones (mutación que afecte a una

diana de restricción)

6.3. ADN POLIMERASAS

Permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación (PCR- reacción en cadena de la polimerasa)

Las más usadas son de los tipos I y III. Para actuar necesitan:

– Los cuatro desoxinucleótidos trifosfato– ADN MOLDE– Cebadores– Mg2+ como cofactor

6.3. ADN POLIMERASAS

Actualmente se dispone de numerosas, que se diferencian en: Velocidad de polimerización (nucleótidos/seg) Fidelización en la replicación (proporción errores) Termoestabilidad (temperatura a la que se inactivan) Procesividad (nº nucleótidos que pueden incorporarse

antes de separarse de la cadena molde) Presencia o ausencia de actividad exonucleasa además

de la actividad polimerasa.

6.4. OTRAS ENZIMAS. Retrotranscriptasas o transcriptasas inversas

Son ADN polimerasas-ARN dependientes: sintetizan moléculas de ADN (ADN copia-ADNc) utilizando ARN como molde.

Se han aislado de los retrovirus.Esto ha permitido: Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en

combinación con técnicas de ADN recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADNc

Amplificación de ARN: PCR convencional no puede. La RT-PCR si puesto que hace un paso previo obteniendo ADNc de la secuencia de ARN que queremos amplificar y después PCR convencional.

6.4. OTRAS ENZIMAS. Desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt)

Es una ADN polimerasa que cataliza la incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3`de una molécula de ADN

No requiere de un cebador ni de una cadena molde para actuar.

En presencia de una molécula bicatenaria de ADN y desoxinucleótidos, sintetiza colas de ADN monocatenarias en ambos extremos 3`

Se han aislado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfomas y leucemias.

Utilidad: marcaje terminal de sondas con nucleótidos marcados.

6.4. OTRAS ENZIMAS. Ligasas

Unen 2 moléculas de ADN mediante enlaces fosfodiéster entre los extremos 3`de una molécula y 5`de la otra

Reparar mellas en una de las cadenas de un ADNds (enlace fosfodiéster)

Útiles en la tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de ADN de distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción

Existen ligasas de ARN que permiten circularizar moléculas monocatenarias

6.4. OTRAS ENZIMAS. Topoisomerasas

Relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas de replicación o transcripción.

Relajan estructuras superenrolladas de ADN como paso previo a la aplicación de otras técnicas de BM