biokémia enzimológia makromolekulák témakör
DESCRIPTION
Biokémia Enzimológia Makromolekulák témakörTRANSCRIPT
A nukleinsavak biológiai funkciójaA nukleinsavak biológiai funkciója
‐A genetikai információ tárolása (genom)R liká ió (DNS→ DNS)‐ Replikáció (DNS → DNS)
‐ Transzkripció (DNS → RNS)Reverz (RNS → DNS)
T lá ió (RNS → f hé j )‐Transzláció (RNS → fehérje)
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
3
DNS-fehérje komplex –egy jellemző példa
Fehérje : helix-turn-helix szuper-másodlagosszerkezeti egységgel kapcsolódikszerkezeti egységgel kapcsolódik
Az egyik hélix pont jól beilleszkedik aDNS spirál nagyárkábaDNS spirál nagyárkába
Példa: transzkripciós faktorok, fontos szerep a génkifejeződésszabályozásában
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
szabályozásában
4
A zsírsavak főbb típusaiA zsírsavak főbb típusai
K b ilKarboxilcsoport
Szénhidrogénlánclánc
Telítettzsírsavak
Telített és telítetlenzsírsavak keveréke
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
6
GlicerinKevert triglicerid:
A három OH-t háromkülönböző zsírsav észteresítizsírsav észteresíti(sztearinsavlinolsavpalmitilsav)
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
7
Tároló funkció:Neutrális zsírok
Membrán lipidek:Polárosak: foszfátcsoport vagy cukrok
Neutrális zsírok vegyületei
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
8
AZ ENZIMMŰKÖDÉS ALAPJAI Katalitikus hatékonyság
– sebesség fokozás: 106-1016x (Keq nem változik!!!)
Enzim
Reakcióféléletideje(katalízis
kun kcat kcat/kun(1/s)(katalízis nélkül)
OMP dekarboxiláz 78 millió év 2,8x10-16 39 1,4x1017
(Katalízis nélkül) (1/s)
OMP dekarboxiláz 78 millió év 2,8x10 39 1,4x10
Staphylococcus proteáz 130 ezer év 1,7x10-13 95 5,6x1014p
karboxipeptidáz A 7,3 év 3,0x10-9 578 1,9x1011
trióz foszfáttrióz-foszfát izomeráz 1,9 nap 4,3x10-6 4300 1,0x109
szénsav-anhidráz 5 sec 1 3x10-1 1x106 7 7x106
10
szénsav anhidráz 5 sec 1,3x10 1x10 7,7x10
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Specifitás abszolút v részleges– abszolút v. részleges
• pl. proteázok: szubtilizin (minden peptidkötés), tripszin, trombin• pl. proteázok: peptidkötés, egyéb amid- és észterkötés
– geometria és elektrosztatikus komplementaritás– sztereospecifitás
• prokirális szubsztrátokra is (pl etanol és alkohol-dehidrogenáz)• prokirális szubsztrátokra is (pl. etanol és alkohol-dehidrogenáz)– molekuláris felismerés
11tripszin trombin
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Reguláció– enzim mennyiség és izoenzimek (genetikai)– modulátor fehérjék (pl. Ca2+ és kalmodulin)j (p )– kovalens módosítás:
• reverzibilis– Ser, Thr, Tyr foszforiláció: protein-kinázok (~600 emberben),
protein foszfatázok• irreverzibilis• irreverzibilis
– zimogének: pl. Ser-proteázok– enzimkaszkádok: pl. véralvadás, komplement rendszerp p– ubikvitinálódás (72 a.s.; degradációs szignál)– membrán-kötődés: pl. farneziláció (Src, kalcineurin)
ll té ik bál á– allosztérikus szabályozás– enzim inhibitorok
12• irreverzibilis, reverzibilis (kompetitív, nem-kompetitív)
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Kofaktorok– apoenzim + kofaktor = holoenzim– Me-ionMe ion
• Zn2+ : karboxipeptidáz A, szénsav-anhidráz• Mg2+: restrikciós endonukleázok, hexokináz• Ni2+ : ureáz• Mn2+: szuperoxid-diszmutáz
K+ i át ki á• K+ : piruvát-kináz• Se : glutation-peroxidáz• Mo : nitrát-reduktázMo : nitrát reduktáz
– koenzim (sokszor vitamin származék)– prosztetikus csoport (erősen kötött) vagyprosztetikus csoport (erősen kötött) vagy– ko-szubstrát
13Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
Koenzim vitamin csoport transzfer példatranszfer
tiamin-pirofoszfát (TPP) B1 (tiamin) aldehid piruvát-dehidrogenáz
flavin-adenin-dinuklotid (FAD) B2 (riboflavin) H atom szukcinát-
dehidrogenázik ti id d i lk h lnikotinamid-adenin-
dinukleotid (NAD) niacin hidrid-ion alkohol-dehidrogenáz
k i A (C A) t té il acetil-CoA-koenzim-A (CoA) pantoténsav acil acetil CoAkarboxiláz
biocitin biotin karboxil piruvát-k b ilábiocitin biotin karboxil karboxiláz
piridoxál-foszfát (PLP) B6 (piridoxin) amino glikogén-foszforilázfoszforiláz
5’-dezoxiadenozil-kobalamin B12 H és alkil metilmalonil-
CoA-mutáz
14tetrahidrofolát (THF) folsav 1-szén timidilát-szintáz
• Enzimek osztályozása E C i i 1964– Enzyme Commission, 1964
– pl. hexokináz: EC 2.7.1.1 (ATP:D-hexóz-6-foszfotranszferáz)
osztály reakciótípus példa1 oxidoreduktázok redox laktát-dehidrogenáz1. oxidoreduktázok redox laktát-dehidrogenáz
2. transzferázok csoport transzfer NMP-kináz
3. hidrolázok hidrolízis kimotripszin
4 liázok kettőskötéshez fumaráz4. liázok kettőskötéshez ± csoport
fumaráz
5 izomerázok intramolekuláris trióz foszfát izomeráz5. izomerázok intramolekuláris csoport transzfer
trióz-foszfát-izomeráz
6 ligázok kovalens kapcsolás aminoacil tRNS15
6. ligázok kovalens kapcsolás (+ATP)
aminoacil-tRNS-szintetáz
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Szubsztrát kötés: ES-komplexSzubsztrát kötés: ES komplexszubsztrát telítési görbe
maximális sebesség
geb
essé
gea
kció
sre
16[S]
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
Hogyan tud betalálni a szubstrát az enzim aktív helyére??Három különböző modell: kulcs zár indukált fit fluktuációs fitHárom különböző modell: kulcs-zár, indukált fit, fluktuációs fit
L
LKulcs-zár
L
LL Induced fit
L
L
Fluktuációs fitStraub, 1960(más néven„conformationalselection”
17Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
– kulcs-zár hipotézis (E. Fischer, 1894)p ( , )
18Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
– indukált-illeszkedés (“induced-fit”)indukált illeszkedés ( induced fit )(D. Koshland, 1958)
19Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Mi is az az aktív hely” (aktív centrum)?Mi is az az „aktív hely (aktív centrum)?– kötőhely + katalitikus hely (katalitikus csoportok)
3 D hasíték árok zseb (ált apoláros)– 3-D hasíték, árok, zseb (ált. apoláros)
Lizozim(Glu35, Asp52)
20
• Átmeneti állapot teóriaaktivációs szabadenergia (G‡)– aktivációs szabadenergia (G‡)
– az enzim csökkenti a G‡-t
Átmeneti állapot, S‡
G‡ ( k t )
G‡ (katalizált)
G‡ (nem-kat.)
G‡ = Gs‡ -Gs = H‡ – TS‡
ergi
aG
szubstrátab
aden
eS
za
termék
21Reakció koordinátaBiokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
Több intermedier is van!!
22Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Enzimkatalízis lényege: – átmeneti állapot specifikus, preferált kötődése
(L. Pauling, 1947)( g )
23Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Az ATP kémiai energiáját felhasználó enzimek– motorfehérjék– ATP-szintáz– membrán pumpák
Ca2+-ATPázCa ATPáz
24Biokémia 3, Vértessy Beáta,
ENZIMKINETIKAENZIMKINETIKA• Szaturációs kinetika (sebesség/szubsztrát koncentráció)( g )
(V0)
bess
ég (
zdet
i seb
kez
25szubsztrát koncentráció [S] Biokémia 3, Vértessy Beáta,
MICHAELIS-MENTEN EGYENLET• Feltételek:
– egy szubsztrát (ha több, egy változó, a többi állandó)ES E + P i ibili k d ti b é é é– ES E + P irreverzibilis v. kezdeti sebesség mérése([P] ~ 0)
– [S] >> [ET] és [ET][ ] [ T] [ T]– T, pH, (ionerő) állandó
k1 k2
E + S ES E + P (1)
k–1
V = d[P]/dt = k2[ES] (2)
26d[ES]/dt = k1[E][S] – (k–1+ k2)[ES] (3)
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Egyensúlyi közelítés (L. Michaelis, M. Menten, 1913)• k–1 >> k2 (gyakran nem áll fenn)
• Steady-state közelítés (G. Briggs, J.B.S. Haldane, 1925)
d[ES]/dt = 0d[ES]/dt 0
(4)
27Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
k kk1 k2
E + S ES E + Pk
(1)
k–1
k1[E][S] = (k–1+ k2)[ES] (5)
[E][S]/[ES] = (k–1+ k2)/k1(6)
KM = (k–1+ k2)/k1(7)
KM : Michaelis-konstans (dimenzió: M (azaz mol/liter)
28Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
– kezdeti sebesség feltétel
Vo = (d[P]/dt)t→o = k2[ES]
k1 k2
E + S ES E + Pk–1
Vmax = k2 [E]T29
max 2 [ ]TBiokémia 3, Vértessy Beáta,
KM = Kd(ES)– ha k2<<k 1 KM Kd(ES)ha k2 k–1
30Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
V = k [E]
• k : átviteli szám (katalitikus konstans)
Vmax = kcat [E]T
• kcat: átviteli szám (katalitikus konstans)– dimenzió: s–1
Vo = (kcat/KM) [E][S]
– ha [S]<< KM V = (k /K ) [E] [S][ ] M[E] ~ [ET]
– fiziológiásan: 0,01 < [S]/KM < 1
Vo = (kcat/KM) [E]T[S]
fiziológiásan: 0,01 [S]/KM 1
• kcat/KM : enzim hatékonyság mértéke
31– dimenzió: M–1s–1 (másodrendű sebességi áll.)
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
enzim szubstrát KM(M)ki t i i til L t i t fá id 5000kimotripszin acetil-L-triptofánamid 5000lizozim hexa-N-acetilglükózamin 6szénsav-anhidráz CO2 8000dUTPáz dUTP 0,2piruvát-karboxiláz piruvát 400
Specificitás és katalitikus képességenzim kcat (s–1)
Specificitás és katalitikus képesség
szénsav-anhidráz 600.000 laktát-dehidrogenáz 1.000kimotripszin 100DNS polimeráz-I 15
32
plizozim 0.5
Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]
• Kinetikai állandók meghatározásaö b ill té– görbeillesztés
– kettős-reciprok (Lineweaver-Burk) ábrázolás
33
ENZIMGÁTLÁSOKkompetitív i hibitszubsztrát
• reverzibilisinhibitor
– kompetitív• ES v. EI
– nem kompetitív• ESI szubsztrátESI
– kevert (“is-is”) nem-kompetitívinhibitor
szubsztrát
34Biokémia 3, Vértessy Beáta,
• Kompetitív gátlásK ö k ik V ál l– KM
app növekszik, Vmax változatlan
KI = [E][I]/[EI]KI [E][I]/[EI]
K app = K (1+[I]/K )KMpp = KM(1+[I]/KI)
35
• Nem-kompetitív gátlás– Vmax csökken, KM nem változik
36
• Irreverzibilis gátlószerek (ált. kovalens kötés)– oldallánc specifikus reagensek
• Ser + organofoszfátok: diizopropil-fluorofoszfát (DFP), szarinés tabun (ideggázok) parathion (inszekticid)és tabun (ideggázok), parathion (inszekticid)
Szíria
DFP
acetilkolin észteráz;37
acetilkolin-észteráz; Ser-proteázok inaktív enzim
– affinitás jelölés (szubsztrát analógok)• pl kimotripszin + TPCK (His módosítás)• pl. kimotripszin + TPCK (His módosítás)
kimotripszin
kimotripszin természetes szubsztrátkimotripszin természetes szubsztrát
38tozil-L-fenilalanin-klórmetil-keton (TPCK)
ALLOSZTÉRIKUS ENZIMEKALLOSZTÉRIKUS ENZIMEK
• Szigmoidális szubsztrát telítési görbeSzigmoidális szubsztrát telítési görbe– általában negyedleges szerkezetű (és/v. több domén)
fehérjefehérjebe
sség
kció
seb
Rea
k
39Szubsztrát koncentráció
• Együttműködő és/vagy szekvenciális modellgy gy
szekvenciális modell effektor: + vagy – kooperáció(Koshland)
együttműködő modell (MWC) effektor: csak + kooperációegyüttműködő modell (MWC) effektor: csak kooperáció
40MWC: Monod, Wyman, Changeux
MIOGLOBIN ÉS HEMOGLOBIN„tiszteletbeli enzimek”- kiváló példa
Gl bi lád O tá lá (Mb) é állítá (Hb)• Globin család: O2 tárolás (Mb) és szállítás (Hb)• Hem (Fe2+-protoporfirin IX) prosztetikus csoport
Fe2+
Fe hat 2+
41porfirin gyűrű hemkoordinációs hely,
ebből 4-et a hem leköt
• Mb, Hb() és Hb() szekvencia illesztés (18% azonosság)
Disztális His(kö li Hi )(közeli His)
Proximális His(távoli His):
Ezek fontosakEzek fontosaklesznek!
42
hemhem
43mioglobin (153 a.s.) hemoglobin -lánc (146 a.s.)
• O2 kötődés; proximális és disztális His szerepe 2 ; p p(HisF8, HisE7)
oldalnézet
proximális His porfirin síkproximális His(HisF8)
porfirin sík
2+
44Fe hat koordinációs hely: 4 hem porfirin, 1 His (prox), 1 O2
2+
– O2 kötés hidrofób zsebbe– oxigenáció → színváltozás (vénás és artériás vér)– oxigenáció → színváltozás (vénás és artériás vér)– szabad Fe2+ oxidáció → metMb, metHb (Fe3+; alvadt vér)– CO, NO mérgezésCO, NO mérgezés
Disztális(távoli) His
CO kötés(kémény)
Proximális(közeli) His
( y)
45
Mioglobinszövet tüdő
Tapasztalat:
Tüdő: Oxigén felvétel
ráci
ó) Szövetek: Oxigén leadás
(sza
tur Oxigén leadás
Y (
13,3 kPa4 kPa
Mit segít a kooperativitás?
,
46
• A kooperativitás molekuláris alapja– Kötőhelyek közötti kommunikáció– O2-kötés → konformációváltozás (negyedleges szerk.)
az Fe(II) ion a hem csoport síkjába rendeződikaz Fe(II) ion a hem csoport síkjába rendeződik
47
T → R konformációs átmenet (“tense”, “relaxed”)– T: alacsony O2 affinitás; R: magas O2 affinitásy 2 ; g 2
– T-állapot: extra sóhidak stabilizálnakAmikor az alfa alegység oxigént köt, akkor a bétaAmikor az alfa alegység oxigént köt, akkor a béta
alegységgel alkotott kölcsönhatásai megváltoznak
48
Al éAlegységkölcsön-h tá khatásokhelye
49
• Hemoglobin alloszterikus fehérje (reguláció)h ó ff k O (k i i á )– homotróp effektor: O2 (kooperativitás)
– heterotróp effektorok: H+, CO2, BFG– O2 affinitás csökkentése szövetekben (R – allosztéria modellek:
a) Együttműködőa) Együttműködő (“concerted”)
MWC, Monod, Wyman,yChangeux (1965)
b) SzekvenciálisKoshland (1966)
Mi a különbséga két modell között?
50
a két modell között?
• Bohr-effektus (Ch. Bohr, 1904)
– H+ és CO2 fokozza az O2 leadást a szövetekben
HHb+ + O2 HbO2 + H+2 2
Izomaktivitás szén-dioxidot (és tejsavat) produkálíti h l bi i é l dá át
51– ez segíti a hemoglobin oxigén leadását.
Bohr effektusBohr effektus
52Magas metabolikus ráta: pH csökkenés
Hemoglobin szabályozásHemoglobin szabályozás
• Allosztéria• Parciális oxigén nyomásParciális oxigén nyomás• pH• CO2 tartalom (két úton is: CO2 bekötés ill
szénsavanhidrázzal való együttműködés)s é sa a d á a a ó együtt ű ödés)• 2,3-biszfoszfoglicerát (BFG)• Magzati hemoglobin
53
• Hb CO2 szállítása (~20 % totál CO2)
• 2,3-biszfoszfoglicerát (BFG) szerepe: O2-mentes hemoglobinhoz köt! T-t stabilizál O leadásra késztetköt! T-t stabilizál, O2 leadásra késztet
– [BFG] ≈ 5 mM (nagy magasságban: ≈ 8 mM)([Hb] ≈ 2-5 mM)([Hb] ≈ 2-5 mM)
HbBFG + O2 HbO2 + BPG
54Honnan lesz a 2,3-BPG? 1,3-BPG-ből, ami a glikolízis intermedierje
• Magzati Hb (22)Hi 143S– : His143Ser
– 2 + töltéssel kevesebb a BPG kötőhelyen T → RO anyai vérből magzatba– O2 anyai vérből magzatba
55
• Sarlósejtes vérszegénységHb A Hb S ( Glu6Val mutáció) – Hb A → Hb S ( Glu6Val mutáció)
– Dezoxi-Hb hidrofób felszíni folt → polimerizáció → tubuláris rost (sejtalak változás)tubuláris rost (sejtalak változás)
– Heterozigóta előny: malária rezisztencia(2011 Science cikk: heterozigóta aktin citoszkeleton(2011 Science cikk: heterozigóta aktin citoszkeleton
megváltozik)
56
57
ENZIMEK MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSA
• Katalitikus mechanizmusok– átmeneti állapot komplex preferált kötődéseátmeneti állapot komplex preferált kötődése– sav-bázis katalízis
k l k t lí i– kovalens katalízis– fémion katalízis– proximitás és orientáció– ES destabilizáció: (kötési energia kompenzálása)ES destabilizáció: (kötési energia kompenzálása)
58Biokémia 3, Vértessy Beáta, [email protected]