bioinformatika 2 −3. előadás3 2019.09.30. bioinformatika 2 többszörös...

2019.09.30. Bioinformatika 2

Bioinformatika 2 − 3. előadás

Prof. Poppe László

BME Szerves Kémia és Technológia Tsz.

Bioinformatika – proteomika

Előadás és gyakorlat

2 Bioinformatika 22019.09.30.

Többszörös szekvencia összerendezés

A többszörös szekvencia összerendezés [multiple sequence alignment (MSA)]

három vagy több biológiai szekvencia (általában fehérje, DNS vagy RNS)

szekvenciájának összerendelése. A páronkénti összerendezéshez képest nő a jel/zaj

viszony.

A vizsgált szekvenciák között általában evolúciós kapcsolat van, így a közös ős-

szekvenciától való genetikai távolság is elemezhető. A szekvenciák közötti homológia

viszonyok tanulmányozhatóak és filogenetikai analízis segítségével vizsgálható a közös

evolúciós eredet.

A többszörös szekvencia összerendezés eredményének vizuális megjelenítése jól

elemezhetővő tesz mutációs eseményeket (pontmutáció az egyetlen nukleotid /

aminosav csere eltérő karakterként jelenik meg; beékelődéses / kitörléses mutációk

ezek egy vagy több szekvencia esetében kötőjelekként jelennek meg).

Többszörös szekvencia összerendezés segítségével meghatározhatóak konzervált

nukleotidok / aminosavak, konzervált szekvencia elemek, fehérje domének vagy

szekunder / tercier szerkezeti elemek.


Többszörös szekvencia összerendezésVizuális megjelenítés (pl. Clustal W)

Kétdimenziós táblázat. Sorok: a szekvenciák; Oszlopok: a pozíciók

Clustal: http://www.clustal.org/


Abszolút pozíció: Egy adott aminosav/nukleotid sorszáma az egy adott szekvencián belül.

Az adott szekvencia jellemzőjeként ez mindig változatlan.

Relatív pozíció: Annak az oszlopnak a sorszáma, amelyben az adott aminosav/nukleotid

az összerendezésen belül szerepel. Az összerendezés változtatásával változik.

Konszenzus-szekvencia: Az összerendezés összegzéseként nyerhető pszeudoszekvencia,

amely egy sorban (általában az összerendezés felett), szimbólumok segítségével összegzi

az egyes pozíciók változását/változatlanságát. A pszeudoszekvencia matematikai

objektumokból (pl. helyettesítési mátrixok) is állhat.

Többszörös szekvencia összerendezésAlapfogalmak


A többszörös szekvencia összerendezés ugyancsak jelenti a három vagy több biológiai

szekvencia összerendelésének eljárását / algoritmusát is.

A páronkénti összerendezéshez képest a három vagy több biológiai jelentőséggel bíró

hosszúságú szekvencia összerendelése kézi módszerekkel igen nehéz és időigényes,

számítógépes algoritmusok szükségesek az összerendezéshez és az eredmény analíziséhez.

A többszörös szekvencia összerendezés bonyolultabb eljárásokat igényel, mint a páronkénti

összerendezés.

A páronkénti összerendezés algoritmusainak (Needleman−Wunsch, Smith−Waterman, stb.)

egyszerű kiterjesztése többdimenziós mátrixokat igényel, a számításigény a szekvenciák

számával exponenciálisan nő.

A legtöbb többszörös szekvencia összerendezési algoritmus inkább heurisztikus eljárásokat

mintsem globális optimalizálást alkalmaz, mivel már közepes hosszúságú szekvenciák

esetén is a néhányat meghaladó számú szekvencia összerendelése igen számításigényes.

Többszörös szekvencia összerendezésAlgoritmusok


Többszörös szekvencia összerendezésManuális szerkesztőprogramok

BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html)

Jalview (http://www.jalview.org/)

SeaView (http://doua.prabi.fr/software/seaview ):

A kézi szerkesztőprogramok pl. színezéssel segítik a motívumok felismerését. A kézi igazításra az automatikus

összerendezés finomításakor is szükség lehet. Néhány program:

http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.htmlhttp://www.jalview.org/http://doua.prabi.fr/software/seaview


A progresszív (hierarchikus ill. fa-) módszerek olyan heurisztikus eljárások, amelyek

elfogadható időtartam alatt szolgáltatnak megfelelően jó (még ha nem is optimális)

összerendezést.

A szekvenciák összerendezése több szempont szerint történhet:

Adott szekvencia összerendezése az összes szekvenciával

Szekvenciák összerendezése valamilyen szempont szerinti sorrendben

Szekvenciák összerendezése egy filogenetikai törzsfa elágazásainak sorrendje szerint

A progresszív módszerek a többszörös szekvencia összerendezést a páronkénti

összerendezések kombinációiként hozzák létre úgy, hogy a leginkább hasonló pártól haladnak

a legtávolabbi kapcsolatban levő pár felé.

Progresszív mószereken alapuló programok: Clustal, MultAlin

Többszörös szekvencia összerendezésProgresszív módszerek


Program: Clustal W2 vagy Clustal Ω; Grafikus felület: Clustal X (http://www.clustal.org/)

(Új command line-ból és Webszerverről futtatható új változat: Clustal Omega.

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)

A szekvenciákon páronkénti összerendezést végez az összes lehetséges módon

A páronkénti összerendezésekből a szekvenciapárok közötti távolságokat számít

A távolságok alapján filogenetikai törzsfát készít, ez a vezérfa.

A többszörös összerendezést a vezérfa elágazásainak sorrendje szerint végzi: a legközelebbi szekvenciák

összerendezése után ehhez rendezi az egyre távolabbiakat. A megközelítés problémája: a kezdeti,

páronkénti, tökéletlen összerendezésekből származtatja a vezérfát. A valódi fát a végső összerendezésből

lehetne megkapni.

Az újabb verziók finomításai:

Az összerendezés pontszámának kiszámításakor a közeli szekvenciákat kisebb súllyal veszik figyelembe

azért, hogy a közel azonos szekvenciák ne nyomják el a távolabbiakat

Az aminosav helyettesítési mátrixok változtatása az aktuális összerendezett szekvenciák távolsága szerint

Oldallánc- és pozíció specifikus gap penalty−k

Többszörös szekvencia összerendezésProgresszív módszerek - Clustal

J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson,

Nucl. Acids Res., 1994, 22, 4673-4680.

http://www.clustal.org/http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/


Chenna, R. et al. Nucl. Acids Res. 2003, 31, 3497-3500.

Többszörös szekvencia összerendezésProgresszív módszerek – Clustal W

Négy oxidoreduktáz NAD kötő domén protein szekvenciáinak összerendezése.


Többszörös szekvencia összerendezésProgresszív módszerek - MultAlin

F. Corpet, Nucl. Acids Res., 1988, 16(22), 10881-10890

A MultAlin rekurzív eljárás, amely az előállított többszörös összerendezésből

újraszámolja a vezérfát, ennek alapján újabb összerendezést készít, ezt addig ismétli,

míg már nem javul tovább a pontszám.

Hátrány: kezdeti hibák a rekurzió során

továbbadódnak

Online elérés:

http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/

http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/


Többszörös szekvencia összerendezésProgresszív módszerek - MultAlin

F. Corpet, Nucl. Acids Res., 1988, 16(22), 10881-10890

http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/

Multalin version 5.4.1

Copyright I.N.R.A. France 1989, 1991, 1994, 1996

Published research using this software should cite

Multiple sequence alignment with hierarchical clustering

F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 10881-10890

Symbol comparison table: blosum62

Gap weight: 12

Gap length weight: 2

Consensus levels: high=90% low=50%

Consensus symbols:

! is anyone of IV

$ is anyone of LM

% is anyone of FY

# is anyone of NDQEBZ

MSF: 134 Check: 0 ..

Name: CCPC50 Len: 134 Check: 7173 Weight: 0.71

Name: CCRF2C Len: 134 Check: 1222 Weight: 0.71

Name: CCRF2S Len: 134 Check: 8544 Weight: 1.35

Name: CCQF2R Len: 134 Check: 8341 Weight: 1.12

Name: CCQF2P Len: 134 Check: 1096 Weight: 1.12

Name: Consensus Len: 134 Check: 4972 Weight: 0.00

Öt citokróm C2 protein szekvenciáinak összerendezése.


Többszörös szekvencia összerendezés

Az egyes módszerek eredményei eltérhetnek.

Van-e a preferált módszer?

Ez nem egyértelmű, az egyes módszerek megbízhatósága változó. Fontos esetekben a

követendő eljárás az, ha több módszert eredményeit összevetjük, majd ennek

konszenzusát állítjuk elő, adott esetben kézi szerkesztési módszereket is felhasználva.


Többszörös összerendezés adatbázisok

Xfam - Pfam (http://xfam.org/)

Pl.: a hisztidin / fenilalanin ammónia liáz család összerendelése, Pfam (PF00221):

Automatikusan származtatott protein domén / protein család összerendezéseket tartalmaz.

Sok, erősen divergens szekvenciákat tartalmazó családok esetében széteső az összerendelés.


Többszörös összerendezés adatbázisok InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/)

Pl.: a hisztidin / fenilalanin ammónia liáz család az InterPro adatbázisban:


Filogenetikus analízis

Filogenetikus analízis eszközök:

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html)

A filogenetikai analízis az evolúciós események, evolúciós történet

elemzésének eszköze. Eredménye általában egy filogenetikai fa (törzsfa).

Gyökeres fa:

A gyökeres filogenetikus fa olyan rendezett

fa, amely egyedülálló csomóponttal

rendelkezik, amely a fa levelein található

összes entitás közös ősének felel meg.

http://evolution.genetics.washington.edu/phylip.html



Gyökértelen fa:

A gyökér nélküli filogenetikus fa a levelek közti

kapcsolatot anélkül mutatja be, hogy feltételeznék a

közös származást. Míg a gyökértelen fák minden

esetben származtathatóak gyökeres fából a gyökér

elhagyásával, a gyökér nem vezethető le egy

gyökértelen fárból, anélkül, hogy a származást

azonosították volna


A filogenetikus analízist főként DNS szekvenciák alapján végzik, a protein szekvenciák

elemzésén alapuló eljárás ritka, nem is eléggé kidolgozott.

A filogenetikai törzsfákat generáló eljárások egyféle evolúciós modell érvényességét

feltételezik. Az a feltételezés azonban, hogy az evolúció törzsfával ábrázolható nem

mindenkor igaz: a hibrid fajok, ill. az egyes szervezetek közt lezajló laterális géntranszfer

esetén ez nem áll fenn.

További problámakat eredményező feltételezés az, hogy a szekvenciák mind homológok.

A filogenetikai analízis eredményét a fentiek értelmében mindig fenntartásokkal kell kezelni.

Mivel a múltbeli eseményekre csak következtetni tudunk, de pontos ismereteink nincsenek egy

filogenetikai analízis program esetenként nem a valóságnak megfelelő eredményeket

eredményezhet.



1. Összerendezés

2. A helyettesítési (tk. evolúciós) modell meghatározása

3. Faépítés

4. A fa kiértékelése

A filogenetikai analízis lépései


Filogenetikus analízis – Összerendelés (HAL)

Az ismertetett módszerek (Clustal, MultAlin, stb.) elvégzik több szekvencia összerendelését:


Filogenetikus analízis – Összerendelés (HAL)

Az ismertetett módszerek (Clustal, MultAlin, stb.) kezdetleges filogenetikai analízist végeznek

a vezérfa felépítésekor, de ezek nem megbízhatóak


Filogenetikus analízis – Összerendelés

Clustal vezérfa az 5.8S rDNS szekvenciák alapján.

Míg a vörösmoszatok (red alga) és a tűlevelűek

(conifers) több törzsben szétszórva szerepelnek, a

páfrányok (ferns) és mohák (moss) viszont

összekerültek.

Az ismertetett módszerek (Clustal, MultAlin, stb.)

kezdetleges filogenetikai analízist végeznek a

vezérfa felépítésekor, de ezek nem megbízhatóak


A vezérfát és a biológiai háttértudást felhasználva az összerendezést alkalmassá kell

tenni az alaposabb filogenetikai analízisre

−−> "összerendezés−sebészet".

Ennek kivitelezése részletes biológiai / taxonómiai ismereteket és gondos elemző

munkát kíván

Filogenetikus analízis – Összerendelés


A helyettesítési (evolúciós) modell meghatározása

Három eleme (paramétere) van:

Bázisgyakoriságok

A bázisok egymás közti cseréjének gyakorisága

A szekvencián belüli pozíciók mutációgyakoriságának heterogenitása

Ezek meghatározásának két módja:

Empirikus módszer: korábbi elemzésekből meghatározott értékeket használunk fel, mint fix

értékeket.

Előny: könnyű számíthatóság. Hátrány: az adott adathalmazra nem biztos, hogy jók a

paraméterek.

Paraméteres módszer: magából a vizsgált adathalmazból vezetjük le a paramétereket.

Előny: pontosabb lehet. Hátrány: félrevezethet, ha az adatkészlet nem megfelelő.


A bázisok egymás közti cseréjének gyakorisága

Lehet előre rögzített mátrix pl.:

A C G T

A − 2 1 2

C 2 − 2 1

G 1 2 − 2

T 2 1 2 −

A pontszámok a csere költségét mutatják. Purinbázis pirimidinbázisra való cseréje (transzverzió)

ritkább, ezért költségesebb, mint a purin−purin és a pirimidin−pirimidin csere (tranzíció).

Dolgozhatunk az összerendezésből számított helyettesítési mátrixokkal is:

Időreverzibilis mátrixok: az oda− és visszacsere pontszáma azonos, akkor teljesül, ha nincs

meghatározott időbeli eltolódás a bázisfrekvenciákban (stacioner modell).

Létezik korrekciós módszer nem stacioner esetre.



A szekvencia mutációgyakoriságok heterogenitásaA szekvencián belül a mutációk gyakorisága erősen változó. Pl. fehérjét kódoló

szakasznál a kodonok harmadik bázisai sokkal variábilisabbak, mint az első kettő. A

fehérjék konzerválódott régióit kódoló részek is kevésbé variábilisek. Modellek a

mutációgyakoriság heterogenitásának leírására:

1. Nemparaméteres módszer: az egyes pozíciókat (pl. szekvenciaszakaszokat) kategóriákba

sorolja a megfigyelt mutációs gyakoriság alapján

2. Invariánsok módszere: A pozíciók egy bizonyos hányadát invariánsnak tekinti, a többit

azonos valószínûséggel változónak

3. Gamma eloszlás módszere (legkorszerűbb): feltételezi, hogy a mutációs gyakoriságok

eloszlása a gamma valószínûségeloszlás szerinti, ennek az alakját egy paraméter jellemzi,

melyet meg kell becsülni. Lehet folytonos vagy diszkrét.


valószínűségeloszlás

sűrűségfüggvénye,

valószínűségeloszlás

eloszlásfüggvénye,



Melyik helyettesítési modellt válasszuk? A kevés paraméterrel dolgozó modellek jobban

alkalmazhatóbbak, megbízhatóbbak, a túlságosan leegyszerűsített modellek viszont hibás

eredményt adhatnak.

Fontos a tranzíció és a transzverzió megkülönböztetése és a mutációgyakoriság

heterogenitásának figyelembe vétele. Gondosan kell kiválasztani az adott adatokhoz legjobban

illeszkedő evolúciós modellt.


Faépítés

Kétféle faépítő módszer különböztethető meg:

1.

Algoritmus alapú: egy algoritmus levezet egy bizonyos fát

Kritérium alapú: az összes lehetséges fát generálja, ezeket értékeli valamilyen optimalizációs

kritérium alapján.

2.

Távolság alapú: Páronkénti távolságokat számít a szekvenciák között, majd ezekkel a

távolságokkal dolgozik tovább, fákat levezetve belőlük. A távolságszámításnál mindig

információvesztés van.

Karakter alapú: (Karakter = pozíció az összerendezésben.) Olyan fákat származtat le, amelyek

mindegyik pozícióra optimalizálják az adatmintázatok eloszlását.


A szekvenciák közötti távolság egy határértéket ér el, ahogy a távolság nő. Ha egy pozícióban

már történt mutáció, a további mutációk már nem teszik távolibbá. A távolság alapú módszerek

korrigálnak erre az effektusra.

Neighbour Joining (NJ): Egy csillag alakú fából kiindulva a legközelebbi szomszédokat

összekapcsolja, helyettesíti őket az átlagukkal, majd ezt ismételgeti a teljes fa kialakulásáig.

Minimum Evolution (ME): A legrövidebb olyan fát találja meg, amely összeegyeztethető a

szekvenciák közötti távolságokkal. (A faágak hossza evolúciós távolságnak felel meg, így két

szekvencia távolsága a fa szerint számítható a megfelelő ágak hosszának összeadásával.)

Hasonló elven működik a Fitch−Margoliash (FM) módszer.

FaépítésTávolság alapú módszerek


Maximum Parsimony (MP): "legnagyobb takarékosság" módszere: Olyan fát épít, ami a lehető

legkevesebb mutációs eseménnyel magyarázza meg a meglévő szekvenciák létrejöttét.

Számos azonos pontszámú fát szolgáltat, ezek közös részét vehetjük mint megbízhatót. Nagy

távolságú szekvenciák esetében hátránya, hogy azonos bázis esetén azt tételezi fel, hogy nem

történt mutáció, holott valószínûbb a visszacserélődés.

·

Maximum Likelihood (ML): "legnagyobb valószínûség" módszere: Komplikált módszer.

Minden pozícióra kiszámítja, hogy adott fa és helyettesítési modell mellett mi a valószínűsége

annak, hogy a megfigyelt variációs mintázat jöjjön létre az adott pozícióban. Az egyes

pozíciókra kapott valószínűségek összeszorzásával adódik a teljes fa valószínűsége. Ezt sok

fára a legjobbat kiválasztja. Ezt többféle helyettesítési modell mellett is elvégezhetjük, ezek

közül is kiválasztva a legjobbat. Igen számításigényes, de ez a legmegbízhatóbb.

A fák kiértékelése (kétféle módszer):

Randomizált adatokra kapott eredményekkel való összehasonlítás.

A kapott fa alátámasztottságának tesztelése ún. "resampling" statisztikai módszerekkel

(bootstrapping, jackknife). Lényegük: a meglévõ adatokból véletlenszerûen mintákat veszünk,

ezekre végezzük el a számítást, majd statisztikát készítünk. (Nem részletezzük.)

FaépítésKarakter alapú módszerek


A helyettesítési (evolúciós) modell meghatározásaAz emberszabású majmok leszármazási viszonyai


ICF

vektorokMP

ML

Bayes

analízis

NJ

Jaccard

ICF

Manhattan

távolság

mátrix

NJ

szubsztitúciós

modell

távolság

mátrix

Hagyományos módszerek Diszkrét matematikai

módszer

22 mitokondriális tRNS gén

Öt módszer

Számos fa

Konszenzus törzsfák



és

Bayes



Filogenetikus analízis online

bioinformatika 2 −3. előadás3 2019.09.30. bioinformatika 2 többszörös...

Documents