bioinformática i 2011 tutorial

5/25/2018 Bioinformtica I 2011 Tutorial

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Tutorial para laresolucin de la prctica:

Introduccina la Bioinformtica I

Instituto Politcnico NacionalEscuela Nacional de Ciencias BiolgicasMateria: Biologa MolecularCarrera: Qumico Bacterilogo Parasitlogo

2011


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Autores:

Dra. Jane Castillo Vera

Dra. Karla Montserrat Gil Becerril

Dra. Alicia Jimnez Alberto

Dra. Rosa Mara Ribas Jaimes


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En este tutorial sepresentan ejerciciosque pueden ser tomadoscomo ejemplo pararesolver los problemasplanteados en el manual

de prcticas.


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Se hacen sealamientos

importantes mediante el usode flechas, crculos y letrasde colores.


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Identificar pginas Web que

ofrezcan explicacionestutoriales y/o demostracionesen lnea por medio deanimaciones o video deenzimas de restriccin.

EJERCICIO 1


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Ingresar a algn buscador en Internet; seleccionar la bsqueda de imgeneso videos y escribir las palabras clave del tema de inters. A continuacin sepresentan 3 ejemplos.


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Ejemplo de resultados obtenidos con el servidor yahoo.com


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Consultar la pgina web de

Restriction Enzyme data BASE(REBASE)

http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

EJERCICIO 2


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a)Explica que tipo de protenas forman esta base de datos.

En la pgina principal se encuentran datos generales sobre el tipo deinformacin que proporciona el sitio y los conos que permiten ingresar a lasherramientas con que cuenta.

Seleccionar


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Aparecer la seccin en la que se muestran los tipos de protenas quecontiene esta base de datos.


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b) Cuntas enzimas de restriccin nuevas se han registrado en estasemana?

Es posible localizar las enzimas informadas en el ltimo da, semana, mes,ao, etc.

Seleccionar


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Seleccionarnuevasenzimas


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Seleccionar


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Aparecer un listado de las enzimas nuevas reportadas en la semana de labsqueda.


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c)De cuntas de estas enzimas nuevas se conoce la secuencia dereconocimiento? Contarlas a partir de la lista, aqu se sealan dosejemplos.


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d)Diga cul es la secuencia de reconocimiento de la enzima EcoRI.

Para encontrar datos ms especficos de una enzima; desde la pginaprincipal se puede solicitar la informacin, escribiendo el nombre de laenzima.


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Algunos de los datos que se pueden obtener son: secuencia especfica decorte, organismo del que se aisl, nmero de cortes en algunos vectores,etc.


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Utilizando las herramientas deREBASE investigar para el plsmidopUC19 y contestar:

EJERCICIO 3


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a)Cul es su contenido GC?

Elegir

estaopcin


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Seleccionar


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2. Oprimir

1. Seleccionar


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Se mostrarn una serie de datos como el contenido de GC, enzimascomerciales que cortan el plsmido, los sitios de reconocimiento, etc.


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Oprimir

b)Cuntos sitios de corte existen en este plsmido para la enzimaAluI?


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Lista de las enzimas de restriccin que cortan este vector.


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c)Cuntas enzimas comercialmente disponibles tienen corte nico en elvector?

Seleccionar All commercialdentro del men Availability.


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Despus seleccionar 1 cuttersdentro del men List,para ver el listadode las enzimas que slo cortan una vez en este vector.


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Lista de las enzimas que tienen corte nico en este vector.


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d)Obtener los esquemas que indiquen los sitios de restriccin nicos yexportarlos a una presentacin de PowerPoint.Seleccionar de la lista las enzimas con sitio nico de corte, despus oprimirDigest.

Aparecer un esquema, con los sitios nicos de restriccin.


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pa ece u esque a, co os s t os cos de est cc Copiar el resultado con la tecla Impr Pant (imprimir pantalla), que seencuentra en el teclado de la computadora, y pegarla en un archivo dePowerPoint .


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Utilizar PubMed y obtener la listade publicaciones de los ltimos 5aos, relacionadas con laaerolisina de Aeromonashydrophila.

EJERCICIO 4


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a) Cuntos artculos se encontraron?Seleccionar PubMed del men Search.


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Escribir la bsqueda: aerolysin AND Aeromonas hydrophila y oprimirSearch.


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Es posible limitar la bsqueda de informacin de acuerdo con criteriosespecficos como pueden ser: ttulo de la publicacin, palabras clave,autor o perodo, entre otros. Esto puede hacerse desde el men Limits.


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Seleccionar datos publicados en los ltimos 5 aos.


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Se mostrar la lista de artculos publicados en los ltimos 5 aos.En este caso aparecen 21 artculos.

b) Cuntos fueron publicados por las revistas Nature Structure Molecular


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b) Cuntos fueron publicados por las revistas Nature Structure MolecularBiology y por Infection and Immunity?La flechas en esta diapositiva sealan dos de los resultados.

c)Cuntos artculos estn relacionados con las toxinas de otros


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c)Cuntos artculos estn relacionados con las toxinas de otrosmicroorganismos?Aqu se seala 1 artculo relacionado con toxinas de Clostridium sp.

Si se quita el lmite del periodo de 5 aos a) cuntos artculos se


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Si se quita el lmite del periodo de 5 aos a)cuntos artculos seencuentran?As se localizan 124 artculos.


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b)Elegir los tres primeros artculos y leer los resmenes (Abstract).Una vez ledos, guardarlos como archivo de texto (*.txt).

Entrar en uno de ellos


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Entrar en uno de ellos.


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Guardar el resumen como archivo de texto, desde el men Archivo.

G d l hi l b d Ab t t 1 A li i


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Guardar el archivo con el nombre de Abstract 1 Aerolisina.

d)De qu Instituciones son esos artculos?


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e)Cmo se puede contactar a estos grupos de investigacin?


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Algunos autores escriben su direccin electrnica, enseguida del ttulo.

Otros autores no escriben a simple vista su direccin electrnica,


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p ,por lo que hay que seleccionar su nombre.

Aparecern otros artculos de ese autor, entonces hay que ingresar


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p , y q ga alguno de ellos.

Y entonces aparecer su direccin de correo electrnico y as se podr


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p y pcontactar al investigador.


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Utilizando la herramienta Entrez delNCBI, buscar la secuencia de

nucletidos completa del gen aerA deAeromonas hydrophila

EJERCICIO 5

Con el men All Databasesse puede desplegar la lista de bases de datos


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p p gcon que cuenta el NCBI, seleccionar la base de datos de nucleotidepara labsqueda y delimitarla con palabras clave.

De todas las opciones, seleccionar la de inters


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p ,

Para descargar una secuencia, lo ms conveniente es hacerlo en formato


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FASTA, ya que ste es compatible con muchos programas de alineamiento oedicin.

Al guardar el archivo debe hacerse como archivo de texto (* txt) o FASTA


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Al guardar el archivo debe hacerse como archivo de texto ( .txt) o FASTA(*.fasta) seleccionando del men Send la opcin File.

S l i l d ti 1 l f t d l hi 2


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Seleccionar el destino1y el formato del archivo 2.

1

2

a) Realizar una bsqueda por homologa de secuencias, empleando la


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herramienta BLAST.

Desde la pgina principal del NCBI, seleccionar BLAST.

BLAST es una herramienta para localizar secuencias homlogas a lasecuencia en estudio mediante alineamientos locales


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secuencia en estudio mediante alineamientos locales.

En este caso se har un alineamiento nucletido-nucletido, por lo que sedebe seleccionar esta opcin (nucleotideblast).

La bsqueda puede ser ms especfica si se seleccionan una base de datos1.


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q p p

1

Aparecen los resultados.


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a) En la primera seccin se encuentran los datos generales de labsqueda.

Bajar en la pgina para seguirviendo los resultados

a) Posteriormente, se encuentra un grfico donde se muestran las


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) , gsecuencias con similitud a la secuencia que se ingres (Query).

Bajar en la pginapara seguir viendo

los resultados.

b)Obtener las secuencias nucleotdicas de los 5 genes que tuvieron la mejorpuntuacin Ms abajo est la lista de las secuencias con las que se


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puntuacin. Ms abajo est la lista de las secuencias con las que seencontr homologa, as como algunos parmetros del alineamiento paracada una.

Estas secuencias se descargarnc) y usarn en el inciso d)

PARA GUARDARLAS SIGUE LASINSTRUCCIONES QUE SE

ENCUENTRAN MS ADELANTE ()

Bajar en la pginapara seguir viendo

los resultados

a) Despus, se encuentra cada uno de los alineamientos mostrando lasi t l i d i t l t d


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regiones que son comunes entre la secuencia de inters y la encontrada porBLAST.

Para descargar las secuencias resultantes del alineamiento,


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g ,se selecciona cada una de ellas como se indica a continuacin.

Una vez seleccionadas las secuencias de inters al principio de


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p plos alineamientos se localiza el botn Get selected sequences

Seleccionar las seis secuencias


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En el men Display Settings se selecciona el formato en el que


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En el men Display Settingsse selecciona el formato en el quese desean guardar, que para este ejercicio ser el formatoFASTA

Despus en el men Show se selecciona Text


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Despus en el men Showse selecciona Text


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Archivo contodas las

secuencias en

formato FASTA

d) Realizar un alineamiento mltiple empleando el programa CLUSTALX oCLUSTALW, con los parmetros predeterminados. Esta es la interfase del


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, p pprograma CLUSTALX, desde el men File se lee el archivo que contienetodas las secuencias por alinear.

Se selecciona el tipo de alineamiento desde el men Alignment y sinmodificar ningn parmetro predeterminado, se selecciona Do Complete


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g p p , pAlignment.

Secuencias poralinear

Posicin de los nucletidos

e) Localizar las regiones ms conservadas y ms diferentes en elalineamiento obtenido Hacerlo de forma manual desplazndose a


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alineamiento obtenido. Hacerlo de forma manual desplazndose atravs de los resultados1, se seala una regin muy conservada2.

Secuencias alineadas

1

2Regin conservada, notarque las secuencias separecen y slo hay uncambio en la reginmarcada

Se generan dos archivos:


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Archivos generados porCLUSTALX

El archivo *.aln contiene el alineamiento de todas las secuencias, y seabre con el block de notas


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abre con el block de notas.

El archivo *.dnd contiene un grfico, en el que puede visualizarse con facilidadcuales son las secuencias que se encuentran ms relacionadas entre s.


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Puede leerse con los programas BioEdito TreeView .

f)Realizar la misma operacin modificando los parmetros para la apertura yextensin de huecos (Gap penalties)


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1

2

extensin de huecos (Gap penalties).

Cul es la diferencia entre los diferentes alineamientos que se realizaron?El alineamiento puede hacerse ms o menos estricto, modificando losparmetros predeterminados 1,2.

Si se disminuyen los valores de penalizacin por apertura y extensin deh bt d li i t t i t


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Cambiar los valores predeterminados por cero

huecos se obtendr un alineamiento menos estricto.

La barra inferior corresponde a la numeracin de los nucletidos, si secompara con el alineamiento anterior a este mismo nivel, se nota la


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compara con el alineamiento anterior a este mismo nivel, se nota ladiferencia debida a la modificacin de los parmetros predeterminados.

Resultado del alineamientomenos estricto para los valores

de Gap penalties

Observar que se trata de la misma reginmostrada en el alineamiento inicial del inciso e).


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EJERCICIO 6

Diseo de oligonucletidos

PARMETROS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN ELDISEO DE OLIGONUCLETIDOS


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Es de especial importancia el dato de energa libre de Gibbs (oentalpa libre) que se obtiene para distintos parmetros de losoligonucletidos, como la formacin de estructuras secundariasllamadas horquillas (hairpinen ingls) y la formacin de dmeros.

Las horquillasson estructuras indeseables en un oligonucletido paraPCR, pues podran dificultar el alineamiento de ste con la secuenciablanco, afectando la eficiencia y especificidad de la reaccin.

Los dmerosson resultado de la alineacin entre oligonucletidos, yasea directo con directo o reverso con reverso (homlogos), o directocon reverso (heterlogos); lo cual afecta negativamente el desarrollode la PCR.

La energa libre de Gibbs es un potencial termodinmico que da lacondicin de equilibrio y de espontaneidad para una reaccin qumica(a presin y temperatura constantes). Los cambios en la energa librese simbolizan como G, la cual representa la energa que quedadisponible para trabajo qumico til.

En el diseo de iniciadores este trmino se aplica para indicar laenerga requerida para deshacer las estructuras secundarias y los

dmeros.

DISEO DE OLIGONUCLETIDOS

PARMETROS IMPORTANTES A CONSIDERAR EN EL DISEO DE LOSOLIGONUCLETIDOS


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1)A una Tm mayor de 80C la Polimerasa presenta actividad baja, de modo que la

Tm ptima se encuentra entre los 55 y los 60C.

3)El contenido GC deber estar entre 40 y 60%.

4) La diferencia de Tm entre los iniciadores no deber ser mayor a 5C.

5)La formacin de horquillas (Hairpin): cuando se presentan valores de G -2

kcal/mol en el extremo 3y G -3 kcal/mol en la regin interna son aceptables,

es decir, con estos valores de energa no es tan probable la formacin de

horquillas.

6)Los dmeros homlogos (Self dimer): cuando se presentan valores de G -5kcal/mol en el extremo 3y G -6 en la regin interna son admisibles, es decir,

con estos valores de energa no es tan probable la formacin de dichos dmeros.

7)Los dmeros heterlogos (Cross dimer): cuando se presentan valores de G -5

kcal/mol en el extremo 3y G -6 en la regin interna son aceptables, es decir,

con estos valores de energa no es tan probable la formacin de dichos dmeros.

2)Generalmente, la longitud de los oligonucletidos deber ser de 20 a 30 bases,aunque depender de diferentes factores, por ejemplo el tipo de PCR y el contenidode GC.

Disear un par de oligonucletidos para detectar por la PCR: a)el gen de laaerolisina de Aeromonas hydrophila. Indicar el programa que se emple y


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los criterios fundamentales que cumplen estos oligonucletidos para serutilizados en la PCR. Bsqueda de la secuencia nucleotdica del gen aerA

Secuencia del gen aerAbuscada en el ncbi en la basede datos nucleotidecomo serealiz en los ejerciciosanteriores.

Se puede restringir labsqueda a la regincodificante del gen se se

requiere, mdiante el link CDS.

Elegir el formato FASTA de la secuencia.


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Diseo de oligonucletidoscon el software

PrimerQuest

http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/PrimerQuest/Default.aspx/

Iniciar en modo bsico.


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URL

Modo bsico

Pegar la secuencia en la ventana correspondiente.


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Ir a modo avanzado y anotar en la ventana Targetsel nucletido dondecomienza el gen de la metiltransferasa y su longitud, separando con una


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coma ambos datos (inciso banterior, diapositiva 87).

Ms abajo en esa misma pgina anotar en la ventana Product SizeRanges un intervalo dentro del que se encuentre la longitud del gen, eneste caso el gen de la metiltransferasa es de 1763 pb


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este caso el gen de la metiltransferasa es de 1763 pb

Enviar los datos oprimiendo CALCULATE.


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A continuacin se mostrarn los resultados, en los cuales se sugierenvarios pares de oligonucletidos, de ellos se escoger el ms adecuado de


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p g , gacuerdo con los siguientes criterios:

- Regin blanco que amplificarn (verificar que se delimite lo mejor posibleel gen de inters).- Longitud y contenido GC de los oligonucletidos.- Tm.- Formacin de horquillas.

Resultados: primer par de oligonucletidos propuesto; en este caso sedelimita bien la regin de inters (nucletidos 1948 a 3711), por lo que estepar de iniciadores es elegible. Adicionalmente tienen Tm similares no se


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par de iniciadores es elegible. Adicionalmente tienen Tm similares no seforman horquillas estables (ver siguiente pgina).

1

Para ver la formacin de horquillas en el iniciador directo, oprimirHAIRPIN (pgina anterior)1, luego oprimir mFold Input2 y finalmente,


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SUBMIT3.

2

3

De acuerdo con la G, la estructura ms estable que podra formar eliniciador directo es la 1 y no es muy probable.


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iniciador directo es la 1 y no es muy probable.

Para ver la formacin de horquillas en el iniciador reverso, oprimirHAIRPIN1 (Diapositiva 97), luego oprimir mFold Input2 y finalmente,


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SUBMIT3.

3

2

De acuerdo con la G la estructura ms estable que podra formar eliniciador reverso tampoco es estable.


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Diseo de oligonucletidos

con el softwareGeneFisher

Ingresar a la pgina web:http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher/old.htmly oprimir Start.


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Ingresar direccin de correo electrnico1y pegar la secuencia en elformato FASTA2.


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1

2

Seleccionar OK, para iniciar el clculo de oligonucletidos.


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La secuencia ya fue aceptada, presionar OK.


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Aparecern una serie de parmetros, como la longitud del oligonucletido,contenido de GC, Tm, degeneracin del primer, etc., los cuales no semodificarn.


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Los iniciadores se estn calculando, oprimir Result.


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A continuacin aparecer un listado de los 8 mejores pares de oligonucletidos,de ellos se escoger el ms apropiado de acuerdo con los siguientes criterios:Regin blanco que amplificarn (verificar que se delimite lo mejor posible el gen


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Regin blanco que amplificarn (verificar que se delimite lo mejor posible el gende inters), as como la longitud y Tm de los oligonucletidos.

Se muestran otras condiciones de ambos oligonucletidos, el contenido deGC, tamao y degeneracin de la bases; al elegir la liga sealada con la flecharoja se mostrar una lista de los oligonucletidos directos.


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Se muestrauna lista de los oligonucletidos directos; luego (regresaruna pgina).


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Seleccionar list reverse primers.


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Semuestra una lista de los oligonucletidos reversos.


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datos generales

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enzimas informadas

datos ms especficos

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