biogenese von eisen-schwefel-zentren in cyanobakterien · eingereicht bei european journal of...
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I
Biogenese von
Eisen-Schwefel-Zentren in Cyanobakterien
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt am
Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen
vorgelegt von
Markus Wollenberg
aus
Essen
Bochum
2003
I
Nicht durch unsere Entdeckungen, sondern durch unsere Ahnungslosigkeit bewegen wir uns sicher durch das Leben.
Jean Giraudoux (1882 - 1944), französischer Diplomat, Erzähler, Dramatiker, Bühnen- und Romanautor
I
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht: Wollenberg, M., Berndt, C., Bill, E., Schwenn, J.D. und Seidler, A. : A dimer of the
FeS cluster biosynthesis protein IscA from cyanobacteria binds a [2Fe2S] cluster in
between two protomers and transfers it to [2Fe2S] and [4Fe4S] apo proteins.
Eingereicht bei European Journal of Biochemistry, Oktober 2002
Seidler, A., Jaschkowitz, K. und Wollenberg, M. (2001): Incorporation of iron-
sulphur clusters in membrane-bound proteins. Biochem. Soc. Trans. 29: 418-421.
Inhalt
I
Inhalt
INHALT........................................................................................................... I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..................................................................... V
1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1
1.1 Aufbau und Funktion von Eisen-Schwefel-Zentren ..................................................... 1
1.2 Die Assemblierung von Eisen-Schwefel-Zentren – ein enzymatischer Prozess ?....... 3
1.3 Biogenese von Eisen-Schwefel-Proteinen in Cyanobakterien und Chloroplasten ..... 8
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit............................................................................................... 14
2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 16
2.1 Material........................................................................................................................... 16 2.1.1 Geräte ....................................................................................................................... 16 2.1.2 Chemikalien.............................................................................................................. 16 2.1.3 Enzyme ................................................................................................................. 17 2.1.4 Längen- und Größenstandards.................................................................................. 18 2.1.5 Antibiotika ................................................................................................................ 18 2.1.6 Verwendete Computerprogramme............................................................................ 18 2.1.7 Verwendete Datenbanken......................................................................................... 19
2.2 Mikrobiologische Methoden.......................................................................................... 19 2.2.1 Organismen............................................................................................................... 19
2.2.1.1 Bakterienstämme............................................................................................... 19 2.2.1.1.1 E. coli ......................................................................................................... 19 2.2.1.1.2 Synechocystis PCC 6803............................................................................ 20
2.2.1.2 Hefestämme....................................................................................................... 20 2.2.2 Sterilisation............................................................................................................... 20 2.2.3 Medien, Anzucht und Lagerung ............................................................................... 21
2.2.3.1 E. coli ................................................................................................................ 21 2.2.3.2 Synechocystis PCC 6803 ................................................................................... 21 2.2.3.3 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................. 22
2.2.4 Transformation ......................................................................................................... 23 2.2.4.1 E. coli ................................................................................................................ 23
2.2.4.1.1 Herstellung kompetenter Zellen................................................................. 23 2.2.4.1.2 Transformation........................................................................................... 24 2.2.4.1.3 Hitzeschocktransformation ........................................................................ 24
2.2.4.2 Saccharomyces cerevisiae ................................................................................. 24 2.2.4.3 Synechocystis PCC6803 .................................................................................... 25
2.2.5 Hefe „Two-Hybrid“ Interaktionstest ........................................................................ 26 2.2.6 Heterologe Überexpression von Proteinen ............................................................... 27
2.2.6.2 Vorkultur ........................................................................................................... 27 2.2.6.1 Vorversuche für die Überexpression eines Proteins.......................................... 28 2.2.6.3 Expression von Proteinen im präparativen Maßstab ......................................... 28
2.2.6.3.1 IscA1.......................................................................................................... 28 2.2.6.3.2 IscA2.......................................................................................................... 28 2.2.6.3.3 SynIscU ...................................................................................................... 28
Inhalt
II
2.2.6.3.4 IscS............................................................................................................. 29 2.2.6 Zellaufbruch und Fraktionierung von Zellhomogenisaten ....................................... 29
2.2.6.1 E. coli ................................................................................................................ 29 2.2.6.1.1 analytischer Maßstab ................................................................................. 29 2.2.6.1.2 präparativer Maßstab ................................................................................. 29
2.2.6.1.2.1 Präparation der löslichen Proteinfraktion ........................................... 29 2.2.6.1.2.1 Präparation der unlöslichen Proteinaggregate .................................... 30
2.2.6.2 Synechocystis PCC 6803 ................................................................................... 30
2.3 Molekularbiologische Methoden .................................................................................. 31 2.3.1 Oligonukleotide ........................................................................................................ 31 2.3.2 Plasmide.................................................................................................................... 32 2.3.3 Plasmidschnellisolierung .......................................................................................... 34 2.3.4 Plasmidisolierung im präparativen Maßstab............................................................. 35 2.3.5 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von DNA ................... 35 2.3.6 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-Fragmenten...................... 35 2.3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen .......................................................................... 36 2.3.8 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen.................................................................. 36 2.3.9 Dephosphorylierung von DNA................................................................................. 36 2.3.10 Ligation................................................................................................................... 37 2.3.11 Phenol / Chloroform (P/C) Extraktion und DNA-Fällung...................................... 37 2.3.12 Präparation genomischer DNA aus Synechocystis ................................................. 37 2.3.13 Polymerase-Kettenreaktion..................................................................................... 38 2.3.14 Ortsgerichtete Mutagenese ..................................................................................... 38
2.3.14.1 Amplifikation des Helferphagen ..................................................................... 39 2.3.14.2 Gewinnung der Einzelstrang-DNA ................................................................. 40 2.3.14.3 Phosphorylierung von Oligonukleotiden......................................................... 40 2.3.14.4 Anlagerungs- und Synthese-Reaktion ............................................................. 41
2.3.15 Multiple ortsgerichtete Mutagenese ....................................................................... 41 2.3.16 Sequenzierung von DNA........................................................................................ 42
2.4 Biochemische Methoden................................................................................................ 42 2.4.1 Reinigung von Proteinen .......................................................................................... 42
2.4.1.1 Streptomycinsulfatfällung ................................................................................. 42 2.4.1.2 Ammoniumsulfatfällung ................................................................................... 42 2.4.1.3 Reinigung durch HPLC/FPLC .......................................................................... 43
2.4.1.3.1 IscA1.......................................................................................................... 43 2.4.1.3.2 SynIscU ...................................................................................................... 44 2.4.1.3.3 IscS............................................................................................................. 45
2.4.2 Rückfaltung von IscA2............................................................................................. 45 2.4.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen............................................................... 46
2.4.3.1 Proteinbestimmung............................................................................................ 46 2.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Ferredoxin ..................................................... 46
2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) .............................................................. 46 2.4.4.1 SDS-PAGE........................................................................................................ 46 2.4.4.2 nicht-denaturierende PAGE .............................................................................. 47 2.4.4.3 Coomassie Gelfärbung ...................................................................................... 47 2.4.4.4 Färbung von Gelen mit Stains All..................................................................... 48
2.4.5 Immundetektion von Proteinen................................................................................. 48 2.4.5.1 Elektrotransfer von Proteinen............................................................................ 48 2.4.5.2 Immunnachweis ................................................................................................ 48
2.4.6 Sulfidbestimmung..................................................................................................... 49 2.4.6.1 IscS Aktivitätstest.............................................................................................. 49
2.4.7 Eisenbestimmung...................................................................................................... 50 2.4.8 analytische Gelfiltrationschromatographie ............................................................... 50 2.4.9 Rekonstitution von FeS Zentren ............................................................................... 51
Inhalt
III
2.4.9.1 IscA1 und IscA2................................................................................................ 51 2.4.9.2 SynIscU ............................................................................................................. 51 2.4.9.3 Rekonstitutionen für die Mössbauer-Spektroskopie ......................................... 51
2.4.10 Untersuchungen zur Stabilität der FeS Zentren...................................................... 52 2.4.11 Experimente zur Übertragung des FeS Zentrums von IscA und SynIscU auf Apo-FeS-Proteine ...................................................................................................................... 52
2.4.11.1 Übertragung des FeS Zentrums auf Apoferredoxin ........................................ 52 2.4.11.1.1 Herstellung von Apoferredoxin ............................................................... 52 2.4.11.1.2 Übertragung der FeS Zentren von IscA/SynIscU auf Ferredoxin ............ 52 2.4.11.1.3 Kinetische Untersuchungen ..................................................................... 53
2.4.11.2 Übertragung des FeS Zentrums auf die Catharantus roseus APS- Reduktase und die Bacillus subtilis PAPS-Reduktase.................................................................... 53
2.4.11.2.1 Herstellung der Apo-Proteine .................................................................. 53 2.4.11.2.2 Übertragung der FeS Zentren................................................................... 53 2.4.11.2.3 Aktivitätstest ............................................................................................ 54
2.4.11.2.3.1 APS-Reduktase-Aktivitätstest .......................................................... 54 2.4.11.2.3.2 PAPS-Reduktase-Aktivitätstest ........................................................ 54 2.4.11.2.3.3 Bestimmung des 35SO3
2- ................................................................... 54 2.4.12 Analyse der Reaktion von IscS mit reduziertem SynIscU ...................................... 55 2.4.13 Chlorophyllbestimmung ......................................................................................... 55 2.4.14 Aconitasetest........................................................................................................... 56
2.5 Biophysikalische Methoden........................................................................................... 56 2.5.1 UV/Vis-Spektroskopie.............................................................................................. 56 2.5.2 Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie.............................................................. 56 2.5.3 EPR-Spektroskopie................................................................................................... 56 2.5.4 Mössbauer-Spektroskopie ........................................................................................ 57 2.5.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) ............................................................... 58
3 ERGEBNISSE............................................................................................. 59
3.1 IscA1................................................................................................................................ 59 3.1.1 Expression und Reinigung von IscA1 ...................................................................... 59 3.1.2 Charakterisierung von Apo-IscA1............................................................................ 60
3.1.2.1 UV/Vis-Spektroskopie ...................................................................................... 60 3.1.2.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie.................................................................. 60 3.1.2.3 Untersuchung der Oligomerisierung durch analytische Gelfiltration................ 61
3.1.3 Charakterisierung des FeS-Zentrums von IscA1 ...................................................... 62 3.1.3.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1.................................................... 62 3.1.3.2 Spektroskopische Untersuchung von Holo-IscA1............................................. 63 3.1.3.3 Untersuchung der Oligomerisierung von Holo-IscA1 durch analytische Gelfiltration ................................................................................................................... 64 3.1.3.4 Charakterisierung der Varianten von IscA1...................................................... 65 3.1.3.4 Untersuchungen zur Stabilität von IscA1 und den Varianten ........................... 69 3.1.3.5 Untersuchungen zur Bildung des FeS Zentrums von IscA1 ............................. 70
3.1.4 Übertragungsexperimente mit IscA1........................................................................ 72 3.1.4.1 Übertragung auf [2Fe2S] Apoproteine.............................................................. 72 3.1.4.2 Übertragung auf [4Fe4S]-Proteine .................................................................... 74 3.1.4.3 Übertragungsaktivität der Varianten von IscA1................................................ 76
3.2 IscA2................................................................................................................................ 77 3.2.1 Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2................................................. 78 3.2.2 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA2 ........................................................... 78 3.2.3 Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin ................................................. 79
Inhalt
IV
3.3 SynIscU ........................................................................................................................... 80 3.3.1 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als Überträger des Schwefels.................... 80
3.3.1.1 Biochemische Untersuchungen mit IscS und SynIscU...................................... 80 3.3.1.2 Untersuchungen zur Interaktion von SynIscU mit den NifS-homologen Proteinen aus Synechocystis mit dem Hefe 2-Hybrid-System ...................................... 83
3.3.2 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als potentielle FeS-Assemblierungsplattform........................................................................................................................................... 85
3.3.2.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von SynIscU................................................ 85 3.3.2.2 Charakterisierung des FeS-Zentrums an SynIscU ............................................ 86 3.3.2.3 Versuche zur Übertragung des FeS-Zentrums .................................................. 87
3.4 Charakterisierung der Biogenese von FeS-Zentren in vivo -Erzeugung von Deletionsstämmen ................................................................................................................ 89
3.4.1 iscA1 ......................................................................................................................... 89 3.4.1.1 Erzeugung einer Insertionsmutante ................................................................... 89 3.4.1.2 Expression von IscA1 im Synechocystis-WT.................................................... 90
3.4.2 iscA2......................................................................................................................... 90 3.4.2.1 Erzeugung einer Deletionsmutante ................................................................... 90 3.4.2.2 Wachstum des Stamms iscA2::Sm .................................................................... 92 3.4.2.3 Verhältnis der Photosysteme............................................................................. 93 3.4.2.4 Untersuchungen zur Expression und Aktivität von FeS-Proteinen in iscA2::Sm....................................................................................................................................... 94 3.4.2.5 Einfluss der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt .................................... 95
3.4.3 syniscU ..................................................................................................................... 97
4 DISKUSSION............................................................................................ 98
4.1 Charakterisierung von IscA1 (Slr1417) - IscA1, die Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ?........................................................................................... 98
4.1.1 Expression, Reinigung und Charakterisierung von Apo-IscA1................................ 98 4.1.2 Das FeS-Zentrum von IscA1 .................................................................................... 99 4.1.3 Übertragung des FeS-Zentrums.............................................................................. 103
4.2 Charakterisierung von IscA2 (Slr1565) ..................................................................... 108
4.3 Charakterisierung von SynIscU (Ssl2667) –Sulfidmobilisierung oder Assemblierungsplattform? ................................................................................................ 108
4.4 Die Rolle von IscA1, IscA2 und SynIscU in vivo........................................................ 112
4.5 Ausblick ........................................................................................................................ 117
5 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................... 119
6 LITERATUR............................................................................................ 121
Abkürzungsverzeichnis
V
Abkürzungsverzeichnis µ mikro A Ampere A. bidest Wasser mit sehr niedriger Ionenstärke (Leitfähigkeit < 0,05 µS/cm) A. dest. Wasser mit niedriger Ionenstärke (Leitfähigkeit < 0,3 µs/cm) Abb. Abbildung Amp Ampicillin APS Adenosin-5'-Phosphosulfat ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin C Celsius Cm Chloramphenicol cm Zentimeter CTAB Hexadecyltrimethylammoniumbromid Da Dalton DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleotide DO Drop-Out DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Fa. Firma Fd Ferredoxin FeS- Eisen-Schwefel- g gramm, Erdbeschleunigung Gm Gentamycin h Stunde HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure I-ADEANS 5-((2-jodacetamido)ethyl)-1-amiononaphtalen-sulfonsäure IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid k Kilo K Kelvin Km Kanamycin l Liter m milli, meter M molar min Minute n nano OD optische Dichte p pico PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PAPS Phosphoadenosin-5'-Phosphosulfat PCC Pasteur Culture Collection PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglykol PLP Pyridoxalphosphat PMSF Phenylmethansulfonsäurefluorid R Resistenzkassette RNA Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur, 25°C s Sekunde
Abkürzungsverzeichnis
VI
SDS Natriumdodecylsulfat Sm Spectinomycin Tab. Tabelle TEMED N, N, N´, N´-Tetramethylethylendiamin Tris Tris-(hydroymethyl)-aminomethan Triton X100 Polyoxyethylen-(9,10)p-t-octylphenol U Unit ü.N. über Nacht Upm Umdreheungen pro Minute V Volt v/v Volumen pro Volumen Vol Volumen w/v Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Aufbau und Funktion von Eisen-Schwefel-Zentren
Anorganische Oberflächen bestehend aus Eisen, Nickel und Sulfid gehören zu den
ältesten Katalysatoren auf diesem Planeten und könnten entscheidende Reaktionen
bei der Entstehung des Lebens ermöglicht haben. Frühe Reaktionen der Entstehung
des Lebens, wie Kohlenstofffixierung und Bildung von Peptiden konnten mit diesen
Katalysatoren unter Urzeitbedingungen realisiert werden (HUBER &
WÄCHTERSHÄUSER, 1997, 1998).
Trotz der geänderten Bedingungen auf diesem Planeten gehören Eisen und Schwefel
in der Form von proteingebunden Eisen-Schwefel-Zentren auch heute noch zu den
wichtigen Kofaktoren in der belebten Welt.
Das einfachste der FeS-Zentren ist ein tetrahedrisch von vier Sulfhydrylgruppen der
Aminosäure Cystein koordiniertes Eisen-Atom. Weitere Formen sind das planare
[2Fe2S]-, das kubane [4Fe4S]- und [3Fe4S]-Zentrum (Abb. 1.1 a-d). Diese FeS-
Zentren werden zumeist vom Schwefel der Aminosäure Cystein gebunden. Höher
molekulare Zentren bestehen meist aus Kombinationen dieser Grundtypen (BEINERT,
2000).
Abb. 1.1: a: 1 Fe, Rubredoxin - Clostridium pasteurianum FREY ET AL., 1987 b: [2Fe2S]-Zentrum, Ferredoxin- Chlorella fusca BES ET AL., 1999 c: [4Fe-4S]-Zentrum, Ferredoxin - Bacillus thermoproteoliticus FUKUYAMA ET AL., 2002 d: [3Fe-4S]-Zentrum, Ferredoxin -Desulfovibrio gigas KISSINGER ET AL., 1989
1 Einleitung
2
Die Funktion der FeS-Zentren liegt, aufgrund der Redoxeigenschaften des Eisens
und des Schwefels, in der Elektronenübertragung. Schwefel kann formale Valenzen
von -2 bis +6 annehmen, liegt in FeS-Zentren allerdings immer als S-2 vor, Eisen
liegt als Eisen 2+ und 3+, sehr selten als Eisen 4+ vor. Diese chemische
Vielseitigkeit spiegelt sich in der Vielzahl der verschiedenen FeS-Verbindungen und
dadurch auch in der Bandbreite der Redoxpotentiale der FeS-Zentren von Proteinen
wider. Die Redoxpotentiale proteingebundener FeS-Zentren können einen Bereich
von ca. 1 V umspannen (Übersicht: BEINERT, 2000). Dieser Bereich liegt zwischen
ca. – 650 mV für die 4Fe-Zentren in [7Fe8S]-Ferredoxinen bis ca. + 450 mV für die
[4Fe4S]-Zentren der sogenannten „High-Potential-Iron-Proteins“ (HiPIP). Diese
Varianz im Redoxpotential wird durch die verschiedenen Typen der FeS-Zentren
gewährleistet, die z.T. erhebliche Varianz im Redoxpotential eines Typs durch die
Proteinumgebung des FeS-Zentrums.
Daher sind Eisen-Schwefel-Proteine an nahezu allen wichtigen Redoxprozessen der
belebten Welt beteiligt. Sie fungieren dabei sowohl als kleine lösliche Elektronen-
Übertragungsproteine (Ferredoxine) als auch als Untereinheiten großer z.T.
membrangebundener Proteinkomplexe.
Im der photosynthetischen Elektronentransportkette ist das Photosystem I mit drei
gebundenen [4Fe4S]-Zentren (FX, FA, FB) an der Elektronenübertragung beteiligt
(GOLBECK & BRYANT, 1991). Die Elektronenübertragung vom PS I zur Ferredoxin-
NADP+-Oxidoreduktase wird dann durch ein [2Fe2S]-Ferredoxin übernommen.
Im Cytochrom-b6f-Komplex ist das Rieske-Protein mit einem gebundenem [2Fe2S]-
Zentrum der Elektronenüberträger vom Plastohydrochinon auf Cytochrom f. Die
Koordination des [2Fe2S]-Zentrums durch zwei Cystein- und zwei Histidinliganden
bedingt das hohe Redoxpotential des FeS-Zentrums von ca. + 300 mV (BRITT ET AL.,
1991, FEE ET AL., 1984).
In der mitochondriellen Atmungskette sind FeS-Zentren des Cytochrom bc1-
Komplexes, der Succinat-Dehydrogenase (ALBRACHT ET AL., 1972) und der NADH-
Dehydrogenase, mit 3 [4Fe4S]- und 5-6 [2Fe2S]-Zentren (HAN ET AL., 1989) der
größte bekannte FeS-Protein-Komplex, am Elektronentransport beteiligt.
Ein weiterer zentraler Stoffwechselprozess mit Beteiligung von FeS-Zentren ist die
Stickstofffixierung. Das Molybdän-Eisen-Protein der Nitrogenase bindet neben
einem [8Fe7S]-Zentrum ein [Mo7Fe9S]-Zentrum (CHAN ET AL., 1993).
1 Einleitung
3
Neben den beschriebenen wichtigen Stoffwechselprozessen sind FeS-Proteine an
sehr vielen Reaktionen beteiligt, deren Aufzählung immer unvollständig bleiben
müsste.
Neben der beschriebenen Beteiligung von FeS-Proteinen als Elektronenüberträger
können FeS-Proteine auch regulatorische Funktionen in einer Zelle übernehmen
(Übersicht: BEINERT, 2000). Dabei soll der eukaryontische zelluläre Eisensensor, das
IRP (Iron Regulatory Protein), das SoxR/SoxS-System, ein FeS-Protein als Sensor
gegenüber O2--Radikalen, und der Sauerstoffsensor Fumarat-Nitrat-Reduktase aus E.
coli erwähnt werden.
Ein FeS-Protein, das aufgrund seines Reaktionsmechanismus in den letzen Jahren
Gegenstand intensiver Forschungen gewesen ist, ist die Biotin-Synthase aus
Escherichia coli. Dieses Enzym katalysiert die Insertion des Schwefels zwischen
dem C6- und dem C9-Atom von Desthiobiotin mit einer sehr geringen Umsatzrate.
Ein von diesem Enzym koordiniertes [4Fe4S]-Zentrum bindet S-Adenosyl-
Methionin und katalysiert dessen Reduktion zu einem 5’-Adenosyl-Radikal und
Methionin (COSPER ET AL., 2002). Dies ist eine weitere weit verbreitete Reaktion von
FeS-Zentren um Radikale über das 5’-Adenosyl-Radikal auf Substrate oder aktive
Zentren anderer Proteinuntereinheiten zu übertragen (OLLAGNIER ET AL., 1997;
KULZER ET AL., 1998).
Ein zweites [2Fe2S]-Zentrum der Biotin-Synthase wird bei dieser Reaktion zerstört.
Vieles deutet darauf hin, dass durch die Zerstörung des [2Fe2S]-Zentrums ein
Schwefel aus diesem Zentrum in Biotin eingebaut wird (UGULAVA ET AL., 2001,
2002). Die Funktion eines [2Fe2S]-Zentrums als Schwefeldonor für diese Reaktion
ist eine neue sehr spezialisierte Aufgabe für ein FeS-Zentrum.
1.2 Die Assemblierung von Eisen-Schwefel-Zentren – ein
enzymatischer Prozess ?
Die Synthese verschiedenster FeS-Zentren ist in Anwesenheit von Sulfid, Eisen und
geeigneten Liganden RS- ein spontaner Prozess. Diese Liganden können sowohl von
anorganischen Thiolverbindungen (BEINERT ET AL., 1997) als auch von Proteinen
gestellt werden. Interessante Ansätze zur Erforschung dieser Ligandenstruktur
konnten durch Arbeiten an synthetischen Peptiden erzielt werden, an denen FeS-
Zentren assembliert werden konnten (GIBNEY ET AL., 1996). So konnte an einem
1 Einleitung
4
Peptid aus nur 7 Aminosäuren (CIACGAC) noch ein reduzierbares [4Fe4S]2+/+-
Zentrum chemisch assembliert werden (MULHOLLAND ET AL., 1999).
Neben diesen Untersuchungen an synthetische Liganden für das FeS-Zentrum, ist die
Assemblierung von FeS-Zentren an Proteinen schon lange Gegenstand der
Forschung. Erste Versuche zur chemischen Rekonstitution von FeS-Zentren in
Ferredoxinen aus Clostridium pasterianum und Spinat (MALKIN & RABINOWITZ,
1966; BAYER ET AL., 1967) mit Sulfid und Eisen konnten durch Zugabe eines
Reduktionsmittels zum Rekonstitutionsansatz weiter optimiert werden (MEYER ET
AL., 1986).
Obwohl die chemische Rekonstitution von FeS-Zentren in Proteinen mit hoher
Effizienz möglich ist, ist ein solcher Mechanismus in vivo unwahrscheinlich.
Dagegen spricht die Toxizität der für die chemischen Rekonstitutionen eingesetzten
Konzentration von Sulfid und Eisen, wodurch die Konzentration dieser Stoffe in vivo
gering ist. Diese sind nach FLINT (1996) zu gering um den Bedarf der Zelle an FeS-
Proteinen durch chemische Rekonstitution zu decken. Zudem laufen chemische
Prozesse oft unspezifisch ab und können nicht reguliert werden. Daher ist ein
enzymatischer Prozess zur Assemblierung von FeS-Zentren wahrscheinlich.
Erste Hinweise auf die Beteiligung spezifischer Enzyme an der Biogenese von FeS-
Zentren konnten durch Arbeiten an der Nitrogenase von Azotobacter vinelandii
gewonnen werden. Deletion von Genen des orf6-nifUSVWZM-Operons ergaben
Stämme, die nur sehr schlecht in der Lage waren diazotroph zu wachsen (JACOBSON
ET AL., 1989). Dabei konnte bei Stämmen, in denen die Gene nifS und nifU deletiert
wurden, eine sehr geringe Aktivität des Eisen-Proteins der Nitrogenase bei normaler
Synthese des Apoproteins festgestellt werden.
nifS wurde kloniert und das Genprodukt in E. coli heterolog überexprimiert. NifS, ein
Pyridoxalphosphat-abhängiges Enzym, katalysiert unter anaeroben Bedingungen die
Umwandlung von Cystein in Alanin und elementaren Schwefel (1) (ZHENG ET AL.,
1993). Wird dem Reaktionsansatz ein Reduktionsmittel zugesetzt, entsteht neben
Alanin als weiteres Reaktionsprodukt Sulfid (2).
NifS, O2-Ausschluß
(1) L-Cystein L-Alanin + S0
NifS, O2-Ausschluß, DTT
(2) L-Cystein L-Alanin + S2-
1 Einleitung
5
Untersuchungen des Mechanismus von NifS ergaben, dass es im Verlauf der
Reaktion zur Bildung einer Schiff-Base zwischen der Aminogruppe des Cysteins und
dem Kofaktor PLP kommt. Zudem konnte gezeigt werden, dass der aus Cystein
mobilisierte Schwefel vor der Freisetzung an einen aktiven Cysteinrest (C325)
intermediär als Persulfid gebunden wird (ZHENG ET AL., 1994a). Durch die Aktivität
von NifS konnten in vitro die FeS-Zentren des Fe-Proteins der Nitrogenase
rekonstituiert werden (ZHENG & DEAN, 1994 b).
Um die Funktion von NifU zu ermitteln wurde das Protein ebenfalls heterolog
exprimiert. Das gereinigte Protein konnte als ein Homodimer mit einem gebundenen
[2Fe2S]2+/+-Zentrum pro Untereinheit identifiziert werden (FU ET AL., 1994).
NifU ist ein modular aufgebautes Protein mit insgesamt 9 Cysteinen. Analyse der
Funktion der Cysteine ergab, dass die 7 N-terminalen Cysteine für die Funktion von
NifU in vivo essentiell sind, die in einem CxxC-Motiv angeordneten Cysteine der C-
terminalen Domäne konnten ohne einen Phänotyp gegen Alanin ausgetauscht werden
(AGAR ET AL. 2000a). Das [2Fe2S]2+/+-Zentrum von NifU wird durch die mittleren
Domäne von NifU durch 4 Cysteine koordiniert. Die Cysteine der N-terminalen
Domäne waren in vitro in der Lage Eisen zu binden (AGAR ET AL., 2000a). Durch
Inkubation von NifU mit Eisen, Cystein und NifS unter reduzierenden und anaeroben
Bedingungen konnte an der N-terminalen Domäne ein labiles [2Fe2S]-Zentrum
assembliert werden (YUVANIYAMA ET AL., 2000).
Hinweise auf eine generellere Funktion dieser Proteine außerhalb der Funktion bei
der Aktivierung des Fe-Proteins der Nitrogenase gab die Identifikation von Genen in
A. vinelandii und E. coli (Abb. 1-2), die homolog zu nifS, nifU und orf6 waren und
orf6 nifU nifS
iscS iscU iscA hscAhscB fdx
iscS iscU iscA hscAhscB fdx
A. vinelandii
nif-Operon
isc-Operon
isc-OperonE. coli
Abb. 1-2: Das nif- und isc-Operon aus A. vinelandii und E. coli
1 Einleitung
6
mit weiteren anderen Genen in einem Operon angeordnet waren (BLATTNER ET AL.,
1997; ZHENG ET AL., 1998). Analog zur angenommenen generellen Funktion bei der
Biogenese von FeS-Zentren wurde das nifS-homologe Gen als iscS (iron sulfur
cluster), das nifU-homologe Gen als iscU und das orf6 homologe Gen als iscA
bezeichnet. IscS aus E. coli und A. vinelandii besaßen die für NifS ermittelte
Cystein-Desulfurase-Aktivität (FLINT, 1996; ZHENG ET AL., 1998).
Neben diesen Genen sind im isc-Operon ein Ferredoxin (Fdx) und die beiden DnaJ-
und DnaK- homologen Chaperone HscA und HscB kodiert. Versuche der Deletion
von iscS und hscA in A. vinelandii zeigten, dass diese Gene essentiell sind (ZHENG
ET AL., 1998). Deletion von iscS, iscU, hscB, hscA und fdx in E. coli führten zu einer
stark verminderten Aktivität von FeS-Enzymen und zu einer starken Verlangsamung
des Wachstums (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001). Die Deletion von iscA hatte einen
nicht so stark ausgeprägten Phänotyp zur Folge. Die Regulation der Transkription
des isc-Operons in E. coli erfolgt durch den unmittelbar im isc-Operon
stromaufwärts von iscS kodierten Transkriptionsregulator IscR, der ein [2Fe2S]-
Zentrum bindet (SCHWARTZ ET AL., 2001) und mit gebundenem Zentrum die
Transkription des isc-Operons negativ reguliert.
Analyse der Funktion von A. vinelandii IscU in vitro, das homolog zur N-terminalen
Domäne von NifU ist, ergab die sequentielle Assemblierung von einem, später zwei
[2Fe2S]-Zentren pro Proteindimer, die dann zu einem [4Fe4S]-Zentrum
umgewandelt werden (AGAR, 2000b) und damit eine funktionelle Ähnlichkeit als
FeS-Assemblierungsplattform zu NifU. Assemblierung eines [2Fe2S]-Zentrums
konnte auch für IscU aus Thermatoga maritima gezeigt werden, dass von IscU auch
auf ein menschliches Apo-[2Fe2S]-Ferredoxin transferiert werden konnte (MANSY ET
AL., 2002).
Die Rolle von IscU als primäre Assemblierungsplattform wird durch direkte
Übertragung des Persulfids, das am aktiven Cysteinrest von IscS gebunden ist, auf
IscU bestätigt (SMITH ET AL., 2001; URBINA ET AL., 2001; NUTH ET AL., 2002).
IscU konnte auch als Interaktionspartner des HscA/HscB-Chaperone-Systems
identifiziert werden (HOFF ET AL., 2000; SILBERG ET AL., 2001; HOFF ET AL., 2002).
Neben NifU/IscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren wird für IscA-
Proteine eine Rolle als alternative Assemblierungsplattform diskutiert. So konnte für
A. vinelandii NifIscA (Orf6) die sequentielle Assemblierung eines [2Fe2S]- und eines
[4Fe4S]-Zentrums gezeigt werden (KREBS ET AL., 2001). IscA aus E. coli ist ebenfalls
1 Einleitung
7
in der Lage ein FeS-Zentrum zu binden und dieses auf Apo-Fdx zu übertragen
(OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).
Neben den nif- und isc-System zur Biogenese von FeS-Zentren konnte in E. coli ein
drittes System mit ähnlicher Funktion identifiziert werden. Überexpression des
sufABCDES-Operons konnte den starken Phänotyp der isc-Operon-Deletionsmutante
revertieren (TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002). SufS ist dabei homolog zu IscS, SufA
homolog zu IscA. Die SufBCD-Proteine könnten ein Transporter vom ABC-Typ
bilden. Die Transkription von sufS und sufD ist eisenabhängig durch das Fur-System
von E. coli reguliert (PATZER & HANDTKE, 1999).
In Eukaryonten kommt den Mitochondrien eine essentielle Rolle bei der Biogenese
von FeS-Zentren sowohl mitochondrialer als auch cytosolischer FeS-Proteine zu
(MÜHLENHOFF & LILL, 2000), obwohl auch eine Zellkern-Lokalisation von Nfs1p in
Hefe (NAKAI ET AL., 2001) und im humanen System eine Lokalisation von IscS und
IscU1 im Cytosol diskutiert wird (TONG & ROUAULT, 2000).
So konnte für das NifS-homologe Nfs1p (KISPAL ET AL. 1999; LI ET AL. 1999) , für die
IscU-homologen Isu1p und Isu2p (GARLAND ET AL., 1999; SCHILKE ET AL., 1999), für
das zur C-terminalen NifU-Domäne homologe Nfu1p (SCHILKE ET AL., 1999), für die
IscA-homologen Proteine Isa1p und Isa2p (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL.,
2000; PELZER ET AL., 2000), für das Fdx-homologe Yah1p (LANGE ET AL., 1999) und
für die Chaperone Ssq1p (HscA) und Jaq1p (HscB) (KNIGHT ET AL., 1998; STRAIN ET
AL., 1998; KIM ET AL., 2001) eine Beteiligung an der Biogenese von FeS-Zentren in S.
cerevisiae und die Lokalisation in Mitochondrien nachgewiesen werden.
Im Gegensatz zur Deletion von iscA in E. coli (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001) ist
der Phänotyp der Deletion von isa1 und isa2 in S. cerevisiae stark (KAUT ET AL.,
2000; PELZER ET AL., 2000), da es zum Verlust der mitochondriellen DNA kommt.
Wird das Expressionsniveau eines dieser Gene herabreguliert, ist die Aktivität
zahlreicher zellulärer FeS-Proteine stark herabgesetzt.
FeS-Biogenese-Proteine aus S. cerevisiae ohne prokaryotische Homologe sind der
mitochondrielle ABC-Transporter Atm1p (KISPAL ET AL., 1999) und die im
Intermembranraum lokalisierte Sulfhydryloxidase Erv1p (LANGE ET AL., 2001), deren
Reprimierung nur die Aktivität cytosolischer FeS-Proteine herabsetzt. Bei diesen
Proteinen wird eine Rolle beim Export von FeS-Zentren oder von Vorstufen der FeS-
1 Einleitung
8
Zentren aus den Mitochondrien in das Cytosol diskutiert. Für die Biogenese
cytosolischer FeS-Proteine in S. cerevisiae konnte auch die Beteiligung von
Glutathion nachgewiesen werden (SIPOS ET AL., 2002). Auch die Beteiligung des
Glutaredoxins Grx5 (RODRIGUEZ-MANZANEQUE ET AL., 2002) an der Biogenese von
FeS-Proteinen in Hefe wird diskutiert.
Ein weiteres eukaryotisches Protein, bei dem eine Verbindung zur Biogenese von
FeS-Proteinen besteht, ist Yfh1p (CHEN ET AL., 2002; MÜHLENHOFF ET AL., 2002) aus
S. cerevisiae. Yfh1p besitzt starke Ähnlichkeit mit Frataxin, ein Protein aus dem
Menschen. Defekte im Frataxin führen beim Menschen zur sogenannten Friedreichs
Ataxia, einem neurodenegerativen und kardialen Krankheitsbild (CAMPUZANO ET
AL., 1996). Deletion von yfh1 in Hefe führt zu einer Deregulation des
mitochondriellen Eisenhaushalts (BABCOCK ET AL., 1997) und so zu einem starken
Anstieg der mitochondriellen Eisenkonzentration, einem Phänotyp der auch für die
Deletion einiger FeS-Biogenese-Proteine in Hefe festzustellen ist.
1.3 Biogenese von Eisen-Schwefel-Proteinen in Cyanobakterien und Chloroplasten
Im Genom des komplett sequenzierten Cyanobakteriums Synechocystis PCC 6803
(KANEKO ET AL., 1996) können eine Reihe von Genen identifiziert werden, die für
Proteine kodieren, aufgrund deren Sequenzähnlichkeit mit Proteinen aus anderen
Abb. 1-3: Übersicht über die offenen Leserahmen aus Synechocystis PCC 6803, deren Genprodukte Ähnlichkeit mit Proteinen aus anderen Organismen aufweisen, die an der Biogenese von FeS-Zentren beteiligt sind
A. vinelandii nifUS iscSUA
E. coli iscSUA
SynechocystisPCC 6803
orf6 nifU nifSiscS iscU iscA
iscS iscU iscA
iscSslr0387sll0704slr0077
syniscU/ssl2667
iscA2iscA1slr1417
slr1565
sufS
1 Einleitung
9
Organismen eine Funktion an der Biogenese von FeS-Zentren angenommen werden
kann. Abb. 1-3 gibt eine Übersicht der Situation in Synechocystis. Die gezeigten
Gene sind nicht wie in den meisten anderen Prokaryonten zusammen in Operons
angeordnet, sondern über das gesamte Genom verteilt, was für die Genorganisation
in Synechocystis charakteristisch ist.
Im Genom von Synechocystis PCC 6803 können drei Gene identifiziert werden, die
für Proteine mit Sequenzähnlichkeit zu NifS/IscS kodieren. Biochemische
Untersuchungen am heterolog in E. coli exprimierten IscS (Slr0387) haben eine
Cystein-Desulfurase-Aktivität für das PLP-abhängige Enzym nachgewiesen
(JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000). In vitro konnte durch IscS in Anwesenheit von
Cystein, Eisen und eines Reduktionsmittels der Einbau von FeS-Zentren in
Apoferredoxin und das Apo-Rieske Protein aus Synechocystis katalysiert werden
(JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000; SCHNEIDER ET AL., 2000).
Sll0704, das zweite NifS-homologe Protein aus Synechocystis ist ebenfalls eine
funktionelle Cystein-Desulfurase, die in der Lage ist die in vitro-Rekonstitution des
FeS-Zentrums von Apoferredoxin zu katalysieren (KATO ET AL., 2000).
Kürzlich konnte für das dritte NifS-homologe Protein (Slr0077) aus Synechocystis
eine Cystein-Desulfurase-Aktivität nachgewiesen werden. Neben Cystein kann durch
das Enzym auch Cystin als Substrat für die Reaktion verwendet werden (D. Kessler,
persönliche Mitteilung). Unabhängig vom verwendeten Substrat ist die spezifische
Aktivität von Slr0077 verglichen mit der Aktivität von IscS sehr niedrig.
Das Gen für Slr0077 ist mit Genen für ein SufB- (Slr0074), SufC- (Slr0075) und
SufD-homologes Protein (Slr0076) in einem putativen Operon angeordnet, dessen
Transkription durch ein unmittelbar stromaufwärts kodiertes Protein (SufR) reguliert
wird, das ein FeS-Zentrum bindet (J. Golbeck, persönliche Mitteilung). Deletion des
entsprechenden Gens in Synechococcus PCC 7002 führte zu einem verbesserten
Wachstum unter Eisen-limitierten Bedingungen.
Von den drei NifS-homologen Proteinen in Synechocystis ist einzig Slr0077 (SufS)
essentiell. Die anderen beiden entsprechenden Gene können einzeln oder in
Kombination deletiert werden (SEIDLER ET AL., 2001). Die Untersuchung des
Phänotyps der iscS- und sll0704-Deletionsmutante ergab für beide Stämme einen
Wachstumsdefekt und leicht herabgesetzte Aktivität einiger untersuchter FeS-
Enzyme (VOLLMER, 2002).
1 Einleitung
10
Das Genom von Arabidopsis thaliana enthält zwei offene Leserahmen, die für NifS-
homologe Proteine kodieren. Für ein zu 70 % zu IscS/Slr0387 homologes Protein
(AtNFS1) wurde eine Lokalisation in den Mitochondrien gezeigt (KUSHNIR ET AL.,
2001). Das zweite NifS-homologe Protein aus A. thaliana ist zu 75 % homolog zu
SufS/Slr0077 aus Synechocystis. Durch Lokalisationsvorhersage durch das
Programm TargetP (EMANUELSSON ET AL., 2000) und eine GFP-Fusion konnte
AtNFS2 als chloroplastidäres Protein identifiziert werden. Biochemische
Untersuchungen des Enzyms haben eine Cystein-Desulfurase-Aktivität für AtNFS2
nachgewiesen (LEON ET AL., 2002).
Ein weiteres Protein, das aus löslichen Extrakten des Cyanobakteriums Synechocystis
PCC 6714 aufgrund seiner Fähigkeit aufgereinigt wurde, das FeS-Zentrum von
Apoferredoxin zu rekonstituieren ist die Cystein/Cystin C-S-Lyase. Dieses ebenfalls
PLP-bindende Enzym ist wie NifS in Lage aus Cystein in Anwesenheit eines
Reduktionsmittels Sulfid zu mobilisieren, mit höherer Spezifität wird von dem
Enzym Cystin als Substrat bevorzugt. Als weiteres Reaktionsprodukt entsteht nicht
wie bei NifS-homologen Enzymen Alanin, sondern Pyruvat und Ammonium
(LEIBRECHT & KESSLER, 1997). Die Untersuchung des entsprechenden Enzyms aus
Synechocystis PCC 6803 (Slr2143) ergab einen Reaktionsmechanismus, bei dem ein
im Gegensatz zu NifS exogenes Cystein als Akzeptor des mobilisierten Schwefels
fungiert und so ein Cysteinpersulfid entsteht, das über nicht-kovalente Bindungen
mit dem Protein assoziiert ist. (LANG & KESSLER, 1999). Dieses ungewöhnliche
Reaktionsprodukt konnte durch eine Röntgenkristallstruktur bestätigt werden
(CLAUSEN ET AL., 2000).
Neben den beschriebenen NifS/IscS-homologen Proteinen konnten im Genom von
Synechocystis offene Leserahmen für zwei IscA-Proteine (Slr1417 und Slr1565) und
ein offener Leserahmen für ein Protein mit Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen
Domäne von A. vinelandii NifU (Ssl2667) identifiziert werden. Ein offener
Leserahmen mit Sequenzähnlichkeit zur N-terminalen NifU-Domäne/IscU konnte
nicht identifiziert werden (Übersicht Abb. 1-3), obwohl diese Domäne außer in
einigen Archea und nicht stickstofffixierenden Cyanobakterien in nahezu allen
Organismen konserviert ist (HWANG ET AL., 1996). Auch NifU-Proteine, die im nif-
Operon einiger stickstofffixierender Bakterien (z.B. Rhodobacter capsulatus) kodiert
1 Einleitung
11
sind, besitzen nur Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen NifU-Domäne aus A.
vinelandii (MASEPOHL ET AL., 1993).
Abb. 1-4: Sequenzvergleich von IscA1(Slr1417) und IscA2(Slr1565) aus Synechocystis mit IscA1(AC007067.4), IscA2 (AC005825.3), IscA3 (AC006921.5) aus A. thaliana, IscA aus Porphyra purpurea (NP_053827), IscA (T44283) und Orf6 (Q44540) aus A. vinelandii,
die streng konservierten Cysteine sind gelb, die chloroplastidären Cysteine rot hinterlegt.
1 Einleitung
12
Abb. 1-4 zeigt einen Sequenzvergleich der IscA-Proteine aus Synechocystis PCC
6803 mit IscA-Proteinen aus anderen Organismen. Die Sequenz beider IscA-Proteine
(Slr1417-IscA1 / Slr1565-IscA2) weist drei in allen IscA-Proteinen konservierte
Cysteine auf. Im Fall von IscA1/Slr1417 sind zwei dieser Cysteine in einem
konservierten C-terminalen CGCG-Motiv lokalisiert. In der Sequenz von
IscA2/Slr1565 ist dieses CGCG-Motiv durch ein CSCS-Motiv ersetzt.
Neben diesen drei Cysteinen sind in der Sequenz von IscA1 zwei weitere Cysteine zu
finden. Diese Cysteine (C34 und C75) kommen auch in weiteren IscA-Sequenzen
aus Organismen mit oxygener Photosynthese vor. AtIscA1 aus A. thaliana ist nach
Analyse durch das Programm TargetP im Chloroplasten lokalisiert, das IscA-Protein
aus der Rotalge Porphyra purpurea ist im Chloroplastengenom dieses Organismus’
kodiert.
SynIscU (Ssl2667) aus Synechocystis besitzt Sequenzähnlichkeit zur C-terminalen
Domäne von NifU aus A. vinelandii. Das entsprechende Gen ist für Synechocystis
essentiell (SEIDLER ET AL., 2001). Die Sequenz von SynIscU weist zwei Cysteine auf.
Biochemische Untersuchungen am heterolog exprimierten und gereinigten Protein
ergaben eine Lokalisation dieser Cysteine an der Oberfläche des Proteins
(WOLLENBERG, 2000). Aufgrund des CxxC-Motivs in der Sequenz von SynIscU und
biochemischer Untersuchungen wurde eine Rolle von SynIscU als Reduktionsmittel
bei der Mobilisierung von Sulfid aus Cystein durch IscS/SynIscU vorgeschlagen
(WOLLENBERG, 2000). Alternativ wird eine Rolle von SynIscU als
Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis diskutiert (NISHIO &
NAKAI, 2000).
Im Genom von A. thaliana können mindestens 3 Proteine mit Homologie zu SynIscU
identifiziert werden, all diese Proteine sind nach dem Programm TargetP im
Chloroplasten lokalisiert. Die Sequenz der drei Proteine aus A. thaliana besitzt zwei
zu SynIscU homologe Bereiche. Abb. 1-5 zeigt einen Sequenzvergleich von Nfu1,
Nfu2 und Nfu3 aus A. thaliana mit der verdoppelten Sequenz von SynIscU. Das N-
terminale Methionin der Wiederholung der Sequenz von SynIscU ist rot hinterlegt.
Die Sequenzähnlichkeit zwischen der ersten Wiederholung der SynIscU-Sequenz und
den Nfu-Sequenzen aus A. thaliana ist höher als die der zweiten Wiederholung.
Zudem sind in der zweiten Wiederholung der SynIscU-Sequenz die Aminosäuren des
CxxC-Motivs durch andere ersetzt oder deletiert. Die Rolle der Nfu-Proteine aus A.
1 Einleitung
13
thaliana und der Sinn dieser Domänenverdopplung des SynIscU-Proteins aus
Synechocystis sind noch völlig offen.
Durch die z.T. gezeigte, z.T. vorhergesagte Lokalisation der FeS-Biogenese-Enzyme
AtNfs2, AtIscA1 und Nfu1-3 im Chloroplasten konnte bestätigt werden, dass der
Chloroplast neben den Mitochondrien in der Pflanze ein eigenständiges System zur
Biogenese von FeS-Proteinen besitzt. Arbeiten an isolierten Chloroplasten hatten
Cystein als Schwefelquelle für diesen Prozess identifiziert und zudem eine
Abhängigkeit von Licht oder NADPH und ATP im Dunkeln gezeigt (TAKAHASHI ET
AL., 1986, TAKAHASHI ET AL., 1991a; TAKAHASHI ET AL. 1991b).
Abb. 1-5: Sequenzvergleich von Nfu1 (NP_194321), Nfu2 (AF370353_1) und Nfu3 (AAK62607) aus A. thaliana mit der verdoppelten Sequenz von SynIscU (Ssl2667) aus SynechocystisPCC 6803. Das N-terminale Methionin der zweiten Wiederholung von SynIscU ist rot, die Cysteine des CxxC-Motivs aus SynIscU und die entsprechenden Cysteine in den Proteinen aus A. thaliana sind gelb hinterlegt.
1 Einleitung
14
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
In der vorliegenden Arbeit sollte die Funktion verschiedener Proteine bei der
Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis PCC 6803 durch in vitro und in vivo
Versuche ermittelt werden. IscA1 und IscA2 aus Synechocystis PCC 6803 sollten
heterolog in E. coli exprimiert, gereinigt und untersucht werden. Die Proteine sollten
auf ihre Fähigkeit Eisen oder Sulfid zu binden untersucht werden und ob sie in der
Lage sind ein FeS-Zentrum zu assemblieren. Dazu sollte versucht werden die
Proteine entweder mit gebundenem FeS-Zentrum aus E. coli zu isolieren oder ein
System zu etablieren, das die Assemblierung eines FeS-Zentrums an IscA1 und
IscA2 in vitro erlaubt. Zudem sollte die Funktion der zusätzlichen
pflanzenspezifischen Cysteine in IscA1 untersucht werden.
Für SynIscU sollte der Mechanismus der Bildung von Sulfid mit IscS, reduziertem
SynIscU und Cystein aufgeklärt werden. Dabei sollte gezeigt werden, ob es zu einer
direkten Übertragung des von IscS aus Cystein mobilisierten Schwefels auf SynIscU
kommt und dieser eventuell zur Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU
genutzt werden kann. Um unabhängig von der Fragestellung der
Schwefelübertragung die von NISHIO & NAKAI (2000) vorgeschlagene die Rolle von
SynIscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren zu untersuchen, sollte ein
System etabliert werden, das die Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU in
vitro erlaubt und so die genaue Untersuchung des gebundenen FeS-Zentrums
ermöglicht.
Neben der Fragestellung der Assemblierung und der Art eines FeS-Zentrums an
IscA/SynIscU sollte der Transfer assemblierter FeS-Zentren auf Apo-FeS-Proteine
untersucht werden. Dabei sollte versucht werden neben Ferredoxin andere Apo-FeS-
Proteine, vor allem solche mit einem [4Fe4S]-Zentrum, als Empfänger eines FeS-
Zentrums zu etablieren.
Neben den beschriebenen in vitro-Untersuchungen soll die Rolle von IscA1 und
IscA2 in vivo ermittelt werden. Dazu sollten Deletionsmutanten von Synechocystis
PCC 6803 hergestellt werden und der Phänotyp dieser Stämme untersucht werden.
1 Einleitung
15
Aufgrund ähnlicher Enzymausstattung und des Modellcharakters von Synechocystis
für den Chloroplasten könnten diese Beobachtungen auch Licht auf die
entsprechenden Vorgänge in den Chloroplasten werfen.
2 Material und Methoden
16
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Geräte Hier sind nur häufig verwendete Standard-Laborgeräte aufgelistet. Wurden über diese Auflistung hinaus spezielle Geräte verwendet, so ist dies in den einzelnen Methodenbeschreibungen vermerkt. Autoklav Dampfsterilisator, Typ 300/400/500 EP-Z, Varioklav Brutschrank Heraeus Sniders Scientific, beleuchtet Elektrophorese Elektrophoresis Power Supply, LifeTechnologies Biorad Mini Protean 3 Agarosegelkammer, Eigenbau Entsalzungsanlage Selpapur Pro 90 CN Gefrierschrank, -70°C REVCO Geldokumentation MWG Inkubationsschüttler Model G25, New Brunswick Scientific CO. Inc. Immunoblotaparatur Biometra Konzentratoren Centricon, Centriprep, Amincon Kugelmühle Biospec Products Magnetrührer Heidolph MR 1000 Mikropipetten (-Spitzen) Glison (Sarstedt) pH-Meßgerät HANNA Instruments PVDF-Membran Qurzküvetten Hellma Reaktionsgefäße Sarstedt (1,5 ml & 12 ml), Corning (50 ml) Rotoren Beckmann Ti 50 Beckmann 100.5 Du Pont Sorvall GSA Du Pont Sorvall GS3 Du Pont Sorvall SS34 Spektralphotometer Beckman DU 7400 Sterilbank Thermocycler MWG Primus Ultrafiltrationszelle Amicon Ultraschallstab Sonic Dismembreator, Fisher Vortex Heidolph REAX 2000 Wasserbad Köttermann Zentrifugen Beckman Avanti J-25 Du Pont Sorvall RC-5B Ultrazentrifuge, Beckman Optima TL Ultrazentrifuge, Beckman L8-00 M Tischzentrifuge, Heraeus Biofuge Pico Speedvac, Savant
2.1.2 Chemikalien 1,4-Dithiothreitol (DTT), Fa. Sigma Magnesiumsulfat, Fa. J.T. Baker
Methanol, Fa. J.T. Baker N,N-Dimethyl-p-phenylendiaminsulfat
5-((2-jodacetamido)ethyl)-1-amiononaphtalen-sulfonsäure (1,5-I-ADEANS), Fa. Sigma Natriumacetat, Fa. J.T. Baker Acetonitril, Fa. J.T. Baker Natriumcarbonat, Fa. J.T. Baker Acrylamid/Bisacrylamid (30:0,8), Fa. Appli Chem
Natriumchlorid, Fa. J.T. Baker
Natriumdodecylsulfat (SDS), Fa. Biomol Agarose zur Gelelektrophorese, Fa. Gibco Natriumhydrogenphospat, Fa. J.T. Baker
2 Material und Methoden
17
Aminosäuren (diverse), Fa. Sigma Natriumnitrat, Fa. J.T. Baker Ammoniumacetat, Fa. J.T. Baker Saccharose, Fa. J.T. Baker Ammoniumeisen(II)-sulfat-6-hydrat, Fa. Riedel-de Haen
Salzsäure, Fa. J.T. Baker
Schwefelsäure, Fa. J.T. Baker Ammoniumsulfat, Fa. J.T. Baker Sinapinsäure, Fa. Sigma Argon (Druckgas), Fa. Messer Griesheim Streptomycinsulfat, Fa. Sigma Ascorbinsäure, Fa. J.T. Baker TAPS, Fa. Sigma Bacto Agar, Fa. Difco Laboratories Trifluoressigsäure, Fa. Arcos Organics β-Mercaptoethanol, Fa. Sigma Tris "ultrapure", Fa. Biomol Bradford- Reagenz, Fa. Biorad Trypton, Fa. Difco BSA, Fa. Biomol Butylsepharose, Fa. Pharmacia
X-GAL, Fa. Sigma Yeast Nitrogene Base, Fa. Difco
Chloroform, Fa. Riedel- de Haen Zinksulfat, Fa. J.T. Baker Coomassie Brilliant Blue R 250, Fa. Sigma
CTAB, Fa. Sigma D(+)-Glukose-1-hydrat, z.A., Fa. J.T. Baker
DMSO, Fa. Sigma DNase, Fa. Boehringer Eisen-(III)-chlorid-6-hydrat, Fa. Riedel- de Haen
Essigsäure, Fa. J.T. Baker Ethanol, absolut, z.A., Fa. J.T. Baker Ethidiumbromid, Fa. Pharmacia Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Fa. Merck
Galactose, Fa. Sigma Glycerin, Fa. Riedel-de Haen Glycin, Fa. Biomol Hefeextrakt, Fa. Difco HEPES, Fa. Biomol IPTG, Fa. Appli Chem Isoamylalkohol, Fa. J.T. Baker Kaliumchlorid, Fa. J.T. Baker Kaliumhydrogenphospat, Fa. J.T. Baker Kaliumhydroxid, Fa. J.T. Baker Kaliumpermanganat, Fa. J.T. Baker Kasein, Fa. Difco Kupfersulfat, Fa. J.T. Baker L-Cystein, Hydrochlorid Fa. Sigma Lysozym aus Hühnereiweiß, Fa. Serva Magnesiumchlorid, Fa. J.T. Baker
2.1.3 Enzyme Restriktionsenzyme mit den zugehörigen Puffern wurden von Takara, Gibco oder
New England Biolabs bezogen. RNaseA zum RNA-Abbau stammte von Boehringer
Mannheim, DNase von Pharmacia Biotech, Benzonase von Merck. Es wurde
Lysozym von Sigma verwendet. Weitere DNA-modifizierenden Enzyme wie CIAP,
T4-Ligase und Taq-Polymerase stammten von Gibco. Klenow-Polymerase wurde
2 Material und Methoden
18
von MBI bezogen, T4 DNA Polymerase von Takara, Pfu-Polymerase und PNK von
Stratagene und S1-Nuklease von Pharmacia.
2.1.4 Längen- und Größenstandards
Für die Elektrophorese von Agarose- und SDS-Gelen wurden folgende
Größenstandards verwendet. Tab. 2-1: Größenstandards
DNA bp λ (EcoRI, HindIII) 125, 564, 831, 947, 1375, 1584, 2027, 3530, 4268, 4973,
5148 und 21226 Low Range DNA (MBI) 80, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031 Protein kDa Prestained Protein Ladder (Invitrogen)
9,1; 16,8; 21,7; 28,4; 40; 52,5; 68,8; 85,9; 121,3; 184,5
10 kDa Protein Ladder (Invitrogen)
10; 20; 30; 40; 50; 60; 70; 80; 90; 100; 110; 120, 200
Protein Ladder Low Range (Gibco)
3: 6,2; 14,3; 18,4; 29; 43
Prestained Protein Ladder Low Range (Gibco)
2,9; 5,7; 14,8; 20,2; 29,3; 44,7
2.1.5 Antibiotika Ampicillin, Chloramphenicol (Biomol), Tetracyclin, Kanamycin, Gentamycin,
Spectinomycin (Sigma)
2.1.6 Verwendete Computerprogramme Tab. 2-2: Liste der verwendeten Computerprogramme
Programm Hersteller Anwendung
Netscape Communicator Netscape Internetbrowser
Word XP Microsoft Textverarbeitung
Photoshop 6.0 Adobe Grafikprogramm
Acrobat Reader 4.0 Adobe Erstellen und Lesen von pdf-Dateien
DNA-Strider 1.3 Christian Mark DNA-Sequenzanalyse
Excel XP Microsoft Datenauswertung
Origin 6.0 Microal Darstellung von Grafen
BioEdit Hall, 1999 Sequenzvergleiche Die gezeigten Gele, Blots und Spektren wurden digital bearbeitet, aber inhaltlich
nicht verändert.
2 Material und Methoden
19
2.1.7 Verwendete Datenbanken Tab. 2-3: Liste der verwendeten Computerdatenbanken Datenbank/Programm Beschreibung,
Verwendung URL
Cyanobase Synechocystis-Sequenzen http://www.kazusa.or.jp/cyano Cyanomutants Liste der Synechocystis-
Mutanten http://www.kazusa.or.jp/cyano/mutants
National Center for Biotechnology Information
Datenbank von Fachliteratur, Gensequenzen, Proteinsequenzen
http://www.ncbi.nlm.nih.gov
Expasy Datenbanken Programme etc. zur Analyse von DNA- und Proteinsequenzen
http://www.expasy.ch
Expasy Proteomics tools
Programme zur Analyse von Proteinsequenzen
http://www.expasy.ch/tools
TargetP Programm zur Importvorhersage in Eukaryonten
http://www.cbs.dtu.dk/ services/TargetP
2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2.1 Organismen
2.2.1.1 Bakterienstämme
2.2.1.1.1 E. coli Tab. 2-4 Liste der verwendeten Bakterienstämme
Genotypen und verwendete Abkürzungen stammen aus (SAMBROOK ET AL.,
1989)
Stamm Genotyp Referenz E. coli DH5α supE44∆lacU169 (Φ80lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1 HANAHAN, 1983
E. coli Bl21 (DE3) hsdS gal(λcIts857 ind 1 Sam7 nin5 lacUV5-T7 gene 1)
STUDIER & MOFFATT, 1986
E. coli XL-10 Gold® tetR,(mcrA)183, ∆(mcrCB-hsdSMR-mrr)173, hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA, supE44, lac Hte [F` proAB laclqZ∆M15, Tn10(TetR Amy CamR)
Stratagene
E. coli CJ236i
dut1 ung1 thi-1 relA1 / F' [proAB+ lacIq
lacZ ∆M15 Tn10 (TetR)] KUNKEL ET AL., 1987 verändert von Skerra, unveröffentlicht
E. coli WK6 (lac-proAB) galE, strA / F' lacIq
lacZ.M15 proA+B+ ZELL & FRITZ, 1987
E. coli WK6/VCSM13 WK6 mit dem Phagen VCSM13 infiziert
2 Material und Methoden
20
Die verwendeten E. coli-Stämme sind in Tabelle 2-4 aufgeführt.
Der Stamm DH5α und wurde zur Transformation von Ligationsansätzen verwendet.
Der E. coli-Stamm BL21(DE3) wurde zur heterologen Überexpression von
Proteinen aus Synechocystis PCC 6803 verwendet. Dazu trägt er, in das Chromosom
integriert, das Gen für die RNA-Polymerase aus dem Phagen T7, das unter der
Kontrolle des lacUV5-Promotors steht. Molekularbiologische Arbeiten wurden in der
Regel mit dem Stamm DH5α durchgeführt. Der Stamm E. coli CJ236i diente der
Isolierung Uracil-haltiger einzelsrängiger DNA, der Stamm WK6 zur Vermehrung
des Phagen VCSM13. Der Stamm E. coli XL-10 Gold® wurde zur Transformation
nach multipler ortsgerichteter Mutagenese verwendet.
2.2.1.1.2 Synechocystis PCC 6803 Tab. 2-5: Liste der verwendeten Synechocystis-Stämme Stamm Beschreibung Referenz Synechocystis PCC 6803 Wildtyp, Glukose-tolerant Geschenk von Prof.
Pakrasi, Washington University, USA
Synechocystis iscA1::Gm Insertion einer GmR in slr1417 (iscA1), nicht segregiert
diese Arbeit
Synechocystis iscA2::Sm Insertion einer SmR in slr1565 (iscA2), Deletion eines Teils des Gens
diese Arbeit
2.2.1.2 Hefestämme
Als Hefestamm wurde der Stamm EGY48 (MATα, ura3, his3, trp1, LexAop(x6)-
LEU2; ESTOJAK ET AL., 1995) verwendet.
2.2.2 Sterilisation
Alle Medien wurden bei 121°C für 20 min autoklaviert. Die Zugabe der Antibiotika
erfolgte nach dem Autoklavieren und dem Abkühlen auf ca. 50°C. Zusätze, die nicht
autoklaviert werden konnten, wurden steril filtriert (Sterilfilter Schleicher & Schüll,
0,45 µm) und nach dem Abkühlen des Mediums zugesetzt.
2 Material und Methoden
21
2.2.3 Medien, Anzucht und Lagerung
2.2.3.1 E. coli
E. coli wurde, wenn nicht anders vermerkt, in LB-Medium angezogen, dem je nach
Bedarf Antibiotika aus Stammlösungen zugesetzt wurde. Für die Kultivierung von E.
coli in Flüssigkultur wurden die Zellen, wenn nicht anders vermerkt, bei 37°C auf
einem Schüttler mit 200 Upm ü.N. angezogen.
Für die Herstellung von Agarplatten wurde dem LB-Medium 1,5 % (w/v) Agar und 1
% (w/v) sterilfiltrierte Glukose aus einer 20 %igen Stammlösung zugesetzt.
zugesetzt. Die Inkubation von Agarplatten erfolgte für maximal 18 h in einem
Brutschrank bei 37°C.
Die Platten wurden in Petrischalen (Fa. Sarstedt) gegossen und für wenige Wochen
bei 4°C gelagert. Bakterienkolonien auf Agarplatten wurden maximal für 4 Wochen
bei 4°C im Kühlschrank gelagert. Tab. 2-6 Zusammensetzung der E. coli-Medien Medium Zusammensetzung LB 1 % (w/v) Trypton, 0,5 % (w/v) Hefeextrakt, 86 mM NaCl TP 2 % (w/v) Trypton, 1,5 % (w/v) Hefeextrakt, 137 mM NaCl,
20 mM KH2PO4/Na2HPO4 NZY + Broth 1 % (w/v) Kasein (hydrolysiert), 0,5 % (w/v) Hefeextrakt,
86 mM NaCl 12,5 mM MgCl2, 12,5 mM MgSO4, 20 mM Glukose, pH 7,5
TSB 10 % (w/v) PEG 4000, 5 % DMSO, 0,02 M MgCl2, 1% (w/v) Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 0,5 % NaCl (sterilfiltriert, Lagerung bei 4°C)
2.2.3.2 Synechocystis PCC 6803
Tab. 2-7 Zusammensetzung des Synechocystis-Mediums Medium Zusammensetzung Referenz BG11
5 mM (für Festmedium 10 mM) HEPES/NaOH pH 8,2, 57 µM Ammoniumeisen(III)-citrat, 189 µM NaCO3, 175 µM K2HPO4, 17,6 µM NaNO3, 304 µM MgSO4, 245 µM CaCl2, 31,4 µM Citronensäure, 2,8 µM EDTA, 46,3 µM H3BO3, 9,1 µM MnCl2, 0,77 µM ZnSO4, 1,6 µM Na2MoO4, 0,32 µM CuSO4, 0,17 µM Co(NO3)2,
das Festmedium enthielt zusätzlich 19 mM Na2S2O3, 1,5 % (w/v) Agar
RIPPKA ET AL., 1979
2 Material und Methoden
22
Den Medien wurden je nach Bedarf Antibiotika aus sterilfiltrierten Stammlösungen
zugesetzt. BG11-Agarplatten enthielten standardmäßig 5 mM Glukose. Es wurden
auch Kulturen ohne 57 µM Ammoniumeisen(III)-citrat verwendet. Die Zellen
wurden vor Inokulation des eisenfreien Mediums einmal mit diesem gewaschen.
Für Synechocystis wurden verschiedene Anzuchtsbedingungen gewählt. Die
Lichtintensität betrug entweder 5 µmol Photonen / (m2 . s) (Schwachlicht, SL) bzw.
45 µmol Photonen / (m2 . s) (Hochlicht, HL). Die Temperatur betrug 30°C. Die
Dauerkultivierung von Synechocystis erfolge auf Festmedium im Schwachlicht für
maximal 4 Wochen. Vor der Inokulation von Flüssigmedium wurden die Kulturen
neu ausgestrichen und für höchstens 5 Tage im SL oder 3 Tage im HL kultiviert.
Flüssigkulturen wurden in maximal zu 50% gefüllten Erlenmeyerkolben angezogen.
Für die Durchführung von Wachstumskurven wurden 25 ml BG11 Medium von
Platte inokuliert und bis zum Erreichen einer OD730 von ca. 2 mit Glukose und
Antibiotika angezogen. Daraufhin wurden die Kulturen auf eine OD730 von 0,1 – 0,2
verdünnt und nochmals für einen Tag kultiviert. Daraus wurden beim Beginn der
Wachstumskurve die Kulturen auf eine OD730 von 0,05 inokuliert.
Für die Herstellung von Dauerkulturen wurden die Cyanobakterien in einem 100 ml
Erlenmeyerkolben unter HL-Bedingungen in ca. 30 ml des entsprechenden Mediums
angezogen. In der Mitte der exponentiellen Wachstumsphase (OD730 ≈ 2,5) wurden
die Zellen in einem sterilen Röhrchen durch Zentrifugation bei 5000 g und RT für 6
Minuten sedimentiert. Anschließend wurden sie in 2 - 3 ml frischem Medium mit
15 % (v/v) Glycerin resuspendiert und in 500 µl Aliquots in Schraubdeckelröhrchen
überführt. Die Kulturen wurden 1 - 3 Stunden bei 0 °C gelagert, bei -20 °C
eingefroren und ü.N. inkubiert. Die Dauerkulturen wurden dann bei -70 °C gelagert.
2.2.3.3 Saccharomyces cerevisiae Dropout-Medium ist ein synthetisches Medium, das alle für das Wachstum
erforderlichen Nährstoffe enthält. Zur Selektion auf Stoffwechselmutanten wurden
Komponenten des DO-Mediums weggelassen. Für Drop-Out-Agarplatten (Tab. 2.8)
wurde 20 g/l Agar dem Medium zugesetzt und der pH-Wert mit NaOH eingestellt.
Die Platten wurden bis zur Benutzung bei 4°C gelagert.
Die Anzucht auf Agarplatten erfolgte bei 30°C über 2-4 Tage. Danach wurden die
Platten bei 4°C gelagert.
2 Material und Methoden
23
Für die Anzucht in Flüssigmedium wurden die Kulturen in maximal zu 1/5 gefüllten
Erlenmeyerkolben oder schräg gestellten Reagenzgläsern bei 30°C auf einem
Schüttler mit 250 Upm durchgeführt, um eine ausreichende Belüftung der Kultur zu
gewährleisten. Zur Induktion der Proteinexpression der unter der Kontrolle des
Galaktose-Promotors stehenden Fusionsproteine wurde spezielles glukosefreies DO-
Medium benötigt, das 2 % (w/v) Galaktose und 1 % (w/v) Raffinose enthielt. Wurde
X-Gal in den Platten benötigt, so wurde es nach dem Autoklavieren in einer
Konzentration von 80 mg/l dem Medium zugesetzt. Tab. 2-8: Zusammensetzung des Hefe-Drop-Out-Mediums Medium Zusammensetzung Drop-Out (DO)
0,67 % (w/v) YNB (Yeast Nitrogene Base, ohne Aminosäuren), 0,2 % (w/v) DO-Pulver, 2 % (w/v) Glukose
Tab. 2.9: Zusammensetzung des DO-Pulvers: Nährstoff Einwaage
in g Konzen-tration im
Medium[mg/l]
Nährstoff Einwaage in g
Konzen-tration im
Medium[mg/l]
Adeninhemisulfat 2,5 40 L-Phenylalanin 3,0 50 L-Arginin 1,2 20 L-Serin 22,5 375 L-Aspartat 6,0 100 L-Threonin 12,0 200 L-Glutamat 6,0 100 L-Tryptophan 2,4 40 L-Histidin 1,2 20 L-Tryptophan 2,4 40 L-Isoleucin 1,8 30 L-Tyrosin 1,8 30 L-Leucin 3,6 60 L-Valin 9,0 150 L-Lysin 1,8 30 Uracil 1,2 20 L-Methionin 1,2 20
2.2.4 Transformation
2.2.4.1 E. coli
E. coli DH5α, BL21(DE3) / pLysS, und CJ236i und wurden nach einer
Beschreibung von (CHUNG ET AL., 1989) transformiert. E. coli XL-10Gold wurde
durch Hitzeschock transformiert (2.2.4.1.3).
2.2.4.1.1 Herstellung kompetenter Zellen
Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen (CHUNG ET AL., 1989) wurden 50 ml
LB-Medium (evtl. mit Antibiotikazugabe) aus einer ü.N.-Kultur des entsprechenden
Stammes 1 %ig inokuliert und bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Bei Erreichen
2 Material und Methoden
24
der exponentiellen Phase (OD600 ≈ 0,5) wurde die Kultur bei 3000g, 4°C für 10 min
zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde in 5 ml eiskaltem
TSB-Medium resuspendiert und die Zellen mindestens 10 min auf Eis inkubiert. Die
kompetenten Zellen wurden schockgefroren und bei -70°C gelagert.
2.2.4.1.2 Transformation
50 µl Ligationsansatz oder 1 µl Plasmid-DNA (0,5-1 µg/µl) wurden zu 200 µl
kompetenten Zellen gegeben und mindestens 5 min auf Eis inkubiert. Darauf wurden
zu dem Ansatz 730 µl TSB-Medium und 20 µl 20 % (w/v) sterilfiltrierte Glukose
gegeben und der Ansatz 1 h bei 37° inkubiert.
Nach 1 h wurden 100 µl des Ansatzes auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden
Antibiotikum verteilt, der Rest bei 8000 Upm 2 min in der Tischzentrifuge
zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Sediment im Rest des Mediums
resuspendiert und auf einer zweiten Selektivagarplatte verteilt.
2.2.4.1.3 Hitzeschocktransformation
Hitzeschock-kompetente XL10-Gold-Zellen wurden von der Fa. Stratagene bezogen
und für die Transformation nach Multi-Site-QuiKChange Mutagenese verwendet.
Dazu wurden 45 µl Zellen in ein eisgekühltes Reaktionsgefäß gegeben und mit 2 µl
β-Mercaptoethanol versetzt und 10 min unter gelegentlichem Schütteln auf Eis
inkubiert. 1,5 µl Mutageneseansatz wurden zu den Zellen gegeben und weitere 30
min auf Eis inkubiert. Darauf wurden die Zellen für 30 s in einem Wasserbad auf
42 °C erhitzt und 0,5 ml NZY + Broth (42°C) hinzugegeben. Das Röhrchen wurde
für 1 h bei 37°C in einem Schüttler inkubiert und dann 1, 10 und 100 µl der
Zellsuspension auf Selektivagarplatten mit 80 µg/ml X-Gal und 20 mM IPTG
ausplattiert.
2.2.4.2 Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae wurde nach Li-Acetat-Methode transformiert (GIETZ ET
AL., 1992). Dazu wurden der Ausgangstamm H6 (EGY48/pSH18-34) auf Drop-Out-
Medium ohne Uracil (DO-Ura) mit Glukose ausgestrichen und 2-3 Tage bei 30°C
inkubiert. Von dieser Platte wurden 20 ml DO-Ura +Glukose inokuliert und für 8h
bei 250 Upm auf einem Schüttler inkubiert. Mit 5 ml dieser Kultur wurden wiederum
50 ml DO-Ura+Glukose inokuliert und diese für 16-18 h bei 250 Upm und 30°C
angezogen. Mit dieser stationären Kultur (OD600≥1) wurden 300 ml DO-
2 Material und Methoden
25
Ura+Glukose inokuliert und diese für weitere 3 h bei 30°C auf einem Schüttler
inkubiert bis eine OD600 von ca. 0,5 erreicht war. Die Kultur wurde durch eine
Zentrifugation (1000g, 5 min, RT) geerntet und das Sediment in 50 ml sterilem A.
bidest. gewaschen. Die Zellsuspension wurde erneut sedimentiert und in 1,5 ml
steriler Li-Acetat-Lösung (0,1 M Li-Acetat, 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5)
resuspendiert.
Zur Transformation wurde zunächst Heringssperma-DNA durch Erhitzen auf 100°C
für 20 min denaturiert. 0,1 µg des oder der zu transformierenden Plasmide wurden
mit 100 µg einzelsträngiger Heringssperm-DNA zu 100 µl der Zellsuspension
gegeben und gemischt. Zu den Ansätzen wurden 600 µl PEG-Li-Acetat-Lösung
gegeben (40% PEG4000, 0,1M Li-Acetat, 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5)
und die Ansätze für 30 min bei 30°C auf einem Schüttler inkubiert. Nach einer
Zugabe von 70 µl DMSO wurden die Ansätze für 15 min bei 42°C im Wasserbad
erhitzt, danach auf Eis gekühlt und für 5s, 13000 Upm zentrifugiert. Das Sediment
wurde in 500 µl TE-Puffer resuspendiert.
Von dieser Suspension wurden 100 µl, wenn zwei Plasmide gleichzeitig
transformiert wurden 250 µl, auf DO-Ura+Glukose Platten ausplattiert, denen zudem
noch die Aminosäure(n) fehlte(n), deren Auxotrophie durch das (die)
transformierte(n) Plasmid(e) vermittelt wurde(n). Die Platten wurden für 2-4 Tage
bei 30°C kultiviert bis Einzelkolonien sichtbar wurden.
2.2.4.3 Synechocystis PCC6803
Synechocystis PCC6803 ist ein natürlich kompetenter Bakterienstamm.
Synechocystis-Zellen sind in der Lage DNA aus dem Medium aufzunehmen und in
das Genom zu integrieren, wenn auf dem aufgenommenen DNA-Fragment zur
Genomsequenz homologe Bereiche existieren. Liegen zwei homologen Bereiche vor,
wird das DNA-Fragment in eine Genomkopie über ein Doppel-Crossover integriert.
Zur Transformation von Synechocystis wurde der zu transformierende Stamm von
einer frischen Agarplatte in 50 ml BG11 mit 5 mM Glukose inokuliert und diese
Kultur bis zum Beginn der exponentiellen Wachstumsphase (OD730 ≈ 0,2-0,5) unter
HL Bedingungen angezogen. Die Kultur wurde geerntet (3000g, 10 min, RT) und die
Zellen in BG11 mit 5 mM Glukose resuspendiert, so dass eine OD730 von 2,5 erreicht
wurde. 400 µl der Zellsuspension wurden in einem Reagenzglas mit ca. 2 µg
Plasmid-DNA versetzt und für mind. 12 h im Brutraum auf einem Schüttler
inkubiert. Anschließend wurden 200 µl der Zellsuspension auf einer BG11-
2 Material und Methoden
26
Agarplatte mit 5 µg/ml des entsprechenden Antibiotikums ausplattiert und diese für
mehrere Tage im Brutraum inkubiert. Die restlichen 200 µl der Zellsuspension
wurden mit 1 ml BG11 mit 5 mM Glukose versetzt einen weiteren Tag auf dem
Schüttler inkubiert und von den Zellen ein Glycerinkultur angelegt (2.3.3.2).
Von der ersten Agarplatte wurde nach mehreren Tagen Inkubation Zellen auf eine
Agarplatte mit höherer Antibiotika-Konzentration ausgestrichen. Dieser Vorgang
wurde solange wiederholt bis eine Konzentration von 50 µg/ml für Spectinomycin
und von 70 µg/ml für Gentamycin erreicht wurde. Dann wurde die Segregation durch
PCR (2.3.13) überprüft.
2.2.5 Hefe „Two-Hybrid“ Interaktionstest
Das Hefe 2-Hybrid System ist ein System zum Nachweis von Protein-Protein
Interaktionen in vivo. Das hier benutzte System (GYURIS ET AL., 1993) nutzt dabei
aus, dass die Expression vom E. coli LexA-Operators nur dann erfolgen kann, wenn
dieser durch den Kontakt der LexA-DNA-Bindedomäne mit einer
Aktivierungsdomäne (hier eine synthetische Aktivierungsdomäne, B42) aktiviert
wird. Dies wird zum Nachweis von Protein-Protein Interaktionen genutzt, indem die
Gene für die zu untersuchenden Proteine in den Leserahmen der LexA-DNA-
Bindedomäne (pEG202-Derivate) bzw. der B42-Aktivatordomäne (pJG4-5-Derivate)
kloniert werden. Dadurch werden in Saccharomyces cerevisiae Fusionsproteine
exprimiert, mit der LexA-DNA-Bindedomäne bzw. der B42-Aktivatordomäne als N-
terminalen und den zu untersuchenden Proteinen als C-terminalen Teil des Proteins.
Interagieren nun die C-terminalen Fusionsproteine kommt die Aktivierungsdomäne
in räuliche Nähe der LexA-DNA-Bindedomäne und somit zur Aktivierung der
Transkription vom LexA-Promotor.
Als Reportersysteme dienen in dem Stamm H6 (EGY48/pSH18-34) zum einen das
plasmidkodierte lacZ-Gen, dessen Expression durch 8 LexA-Operatoren reprimiert
wird und der ins Hefechromosom integrierte Leucinreporter leu2, der unter der
Kontrolle von 6 LexA-Operatoren steht und dem Stamm bei Expression des Gens
Leucin-Aututrophie verleiht.
Zum Test auf eine Interaktion wurden die zu untersuchenden pEG202- und pJG4-5-
Derivate (2.3.2) in EGY48/pSH18-34 transformiert (2.2.4.2). Mit einer Einzelkolonie
wurden dann 5 ml Drop-Out-Medium ohne Uracil, Histidin und Tryptophan mit
Glukose (DO-Ura-His-Trp+Glukose) inokuliert und ü.N. im Schüttler bei 30°C
2 Material und Methoden
27
inkubiert. 1,5 ml dieser Kultur wurden in der Tischzentrifuge 2 min bei 13000 Upm
zentrifugiert und in 1 ml DO-Ura-His-Trp+Galaktose/Raffinose gewaschen. Nach
einer weiteren Zentrifugation wurde das Sediment in 0,5 – 1 ml DO-Ura-His-
Trp+Galaktose/Raffinose resuspendiert und mit 0,5 ml dieser Zellsuspension 4,5 ml
DO-Ura-His-Trp+Galaktose/Raffinose inokuliert. Diese Kultur wurde für mindestens
6 h bei 30°C auf einem Schüttler inkubiert. Diese Schritte dienen dazu die von der
Zelle gespeicherte Glukose abzubauen, so dass es zur Transkription der Gene
kommen kann, die in den pJG4-5-Derivaten unter der Kontrolle des Gal4-Promotors
stehen. Die OD600 dieser Kulturen wurde auf 0,6 eingestellt und 20 µl dieser Kultur
wurden auf folgenden Platten ausgestrichen: DO-Ura-His-Trp+Glukose, DO-Ura-
His-Trp-Leu+Glukose, DO-Ura-His-Trp-Leu+Galaktose/Raffinose, DO-Ura-His-
Trp+X-Gal+Glukose und DO-Ura-His-Trp+X-Gal +Galaktose/Raffinose. Die Platten
wurden für 2-4 Tage bei 30°C inkubiert und dann ausgewertet.
Als Positivkontrolle für eine Interaktion wurde der Stamm EGY48/pSH1834/
pCDC28 /pCDI1 (GYURIS ET AL., 1993) verwendet, als Negativkontrolle die pEG202-
bzw. pJG4-5-Derivate gegen den jeweiligen Ausgangsvektor pJG4-5 bzw. pEG202.
2.2.6 Heterologe Überexpression von Proteinen
Zur heterologen Überexpression von Proteinen wurden die entsprechenden Gene in
Plasmide (2.3.2) kloniert, in denen ihre Transkription durch den starken Φ10-
Promoter des Phagen T7 kontrolliert ist. Die Expression erfolgte in dem lysogenen E.
coli Stamm BL21(DE3), in dessen Chromosom das Gen für die T7-RNA-Polymerase
unter der Kontrolle des lacUV5-Promotoers integriert ist. Dazu wurden die
Expressionsplasmide in BL21(DE3)/pLysS transformiert. Das Plasmid pLysS trägt
das Gen für das Lysozym des Phagen T7. Dies ermöglicht als Inhibitor der T7-RNA-
Polymerase eine stringentere Kontrolle der Expression vor der Induktion und einen
besseren Zellaufschluss.
2.2.6.2 Vorkultur
3 - 50 ml LB-Medium (mit Antibiotika) wurden mit einer Einzelkolonie des
Expressionsstamms inokuliert. Die Kultur wurde für 6-8 h bei 37°C in einem
Schüttler inkubiert und die Zellen anschließend bei 5000 g für 10 min bei 4° C
sedimentiert. Die Zellen wurden in 3 - 50 ml frischem Ausgangsmedium
resuspendiert und ü.N. bei 4°C gelagert.
2 Material und Methoden
28
2.2.6.1 Vorversuche für die Überexpression eines Proteins
Zur Ermittlung der optimalen Expressionsbedingungen wurden je 50 ml Medium
(LB/TP mit jeweiligen Antibiotika) mit 1 ml der Vorkulturen vom Vortag inokuliert
und bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase (OD600 ≈ 0,6) bei 37°C
im Schüttler inkubiert. Wurden andere Expressionstemperaturen gewählt, wurden
diese bei einer OD600 von ca. 0,3 eingestellt. Bei Erreichen einer OD600 von 0,6
wurden die Kulturen geteilt und 25 ml mit IPTG (Endkonzentration 0,5 mM)
induziert. Die andere Hälfte diente als Kontrolle ohne Induktion der Expression.
Jeweils nach 1, 2, 3, und 4 Stunden wurde die OD der Kultur bei 600 nm bestimmt
und 1 ml zur Analyse des Proteingehaltes entnommen. Die Zellen der entnommenen
Probe wurden bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge (RT) sedimentiert, der
Überstand abdekandiert und das Zellsediment in flüssigem Stickstoff eingefroren.
Danach wurden die Proben bis zur Präparation und Analyse der löslichen
Zellproteine bei - 70°C gelagert.
2.2.6.3 Expression von Proteinen im präparativen Maßstab
Die Expression von Proteinen im präparativen Maßstab erfolgte in 2 l
Erlenmeyerkolben, die mit 500 ml Medium befüllt wurden. Die Zellernte erfolgte
durch Zentrifugation bei 5000 g und 4°C für 10 min. Der Überstand wurde
verworfen.
2.2.6.3.1 IscA1
Die heterologe Expression von IscA1 erfolgte im Stamm BL21 (DE3)/ pLysS /
pISCA1 bei 25°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde die Kultur mit
0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 6 h inkubiert.
2.2.6.3.2 IscA2
Die heterologe Expression von IscA1 erfolgte im Stamm BL21 (DE3)/ pLysS /
pISCA2 bei 37°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde die Kultur mit
0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 4 h inkubiert
2.2.6.3.3 SynIscU
Die heterologe Expression von SynIscU (WOLLENBERG, 2000) erfolgte im Stamm
BL21 (DE3)/ pLysS / pISCU bei 25°C in LB-Medium. Bei einer OD600 ≈ 0,6 wurde
die Kultur mit 0,5 mM IPTG induziert und bis zur Zellernte 4 h inkubiert.
2 Material und Methoden
29
2.2.6.3.4 IscS
Die heterologe Expression von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) erfolgte durch
den Stamm BL21 (DE3)/ pLysS / pISCS bei 25°C in TP-Medium mit 10 mM
Pyridoxalphosphat. Die Kultur wurde nicht induziert und 18 h nach Inokulation
geerntet.
2.2.6 Zellaufbruch und Fraktionierung von Zellhomogenisaten
2.2.6.1 E. coli
2.2.6.1.1 analytischer Maßstab
Um die löslichen Proteine aus E. coli zu isolieren, wurden die bei -70° C gelagerten
Zellsedimente aufgetaut. Das aufgetaute Sediment wurde in 100 µl 50 mM
HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5 resuspendiert.
Zum Zerkleinern der DNA wurde zu den aufgebrochenen Zellen 2,5 µl 1 M MgCl2
und 5 µl DNaseI (10 mg/ml) gegeben und die Ansätze 15 min bei RT inkubiert. Es
folgte eine Zentrifugation bei 13000 Upm bei RT in der Tischzentrifuge. Das
Sediment, das unlösliche Aggregate, einen Teil der Membranen sowie
Zellwandbestandteile enthielt, wurde mit 100 µl Wasser und 25 µl 5x SDS
Probenpuffer versetzt. Der Überstand wurde, um Membranen zu entfernen, bei
100000g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Das Sediment wurde verworfen und der
Überstand, der die löslichen cytoplasmatischen und periplasmatischen Proteine
enthielt, mittels einer SDS-PAGE (2.4.5.1) analysiert.
2.2.6.1.2 präparativer Maßstab
2.2.6.1.2.1 Präparation der löslichen Proteinfraktion Das Zellsediment in 10 ml Puffer pro Liter Expressionskultur (50 mM
HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen
wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei
-70°C gelagert.
Um die löslichen Zellproteine aus den Zellen zu isolieren wurden die Zellen wieder
aufgetaut. Dieser Vorgang aus Frieren und Tauen wurde zweimal wiederholt. Die
aufgeschlossenen Zellen wurden zum Zerkleinern der Nukleinsäuren mit MgCl2
(Endkonzentration: 15 mM) und 125U Benzonase pro 10 ml Puffer versetzt und 1 h
auf Eis inkubiert. Danach wurde der Ansatz zentrifugiert (15000g, 30 min, 4°C) und
2 Material und Methoden
30
der Überstand abgenommen. Das Sediment wurde mit 5 ml Puffer gewaschen und
erneut zentrifugiert. Der abgenommene Überstand wurde mit dem zuvor
abgenommen Überstand vereinigt und in der Ultrazentrifuge zentrifugiert (100000 g,
1h, 4°C). Der Überstand enthielt dann die lösliche Proteinfraktion.
2.2.6.1.2.1 Präparation der unlöslichen Proteinaggregate
Das Zellsediment in 10 ml Puffer pro Liter Expressionskultur (50 mM
HEPES/NaOH, 10 mM EDTA, 1 mM PMSF, pH 7,5) resuspendiert. Die Zellen
wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Verarbeitung bei
-70°C gelagert. Der Zellaufbruch erfolgte durch 6-8 Zyklen Beschallung mit einem
Ultraschallstab für 30s bei 0°C. Die unlöslichen Aggregate wurden durch
Zentrifugation (20000g, 15 min) sedimentiert, dreimal in 50 mM HEPES/NaOH, pH
7,5, 1 % Triton X-100, dreimal in 50 mM HEPES/NaOH, pH 7,5 gewaschen, in A.
bidest. resuspendiert und bis zu ihrer weiteren Verarbeitung und bei – 70°C gelagert.
2.2.6.2 Synechocystis PCC 6803
50-250 ml Synechocystis-Kultur (OD730 ≈ 1,5-2,5) wurden für 10 min bei 5000g
sedimentiert und 1 ml pro 25 ml Kultur Thylakoidpuffer (50mM HEPES/NaOH,
pH 7,0, 5 mM MgCl2, 15 mM CaCl2 15 % Glycerin, 0,5 % DMSO) gewaschen und
erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde in 0,5 – 1,3 ml Thylakoidpuffer
resuspendiert und in ein 2 ml Schraubgefäß überführt, das zu 1/3 mit Glaskugeln
(Biospec, Ø = 0,1 mm) gefüllt war. Der Ansatz wurde 10 min auf Eis inkubiert. Der
Zellaufbruch erfolgte durch 5-8 Zyklen in einer Schwingmühle für 30s bei 5000
Upm. Zwischen den Zyklen wurde der Ansatz für mind. 1 min auf Eis inkubiert.
Nach dem Zellaufbruch wurde der Ansatz 10 min ruhig auf Eis gelagert und das
Zellhomogenat in ein neues Gefäß überführt. Danach erfolgte eine Zentrifugation in
der Tischzentrifuge für 1 min bei 13000 Upm, wodurch nicht aufgeschlossene Zellen
abgetrennt wurden. Der Überstand wurde für 15 min und 100000 g bei 4°C
zentrifugiert. Im Überstand befanden sich die löslichen Proteine im Sediment die
Membranen. Diese wurden in einem geeigneten Volumen Thylakoidpuffer
resuspendiert.
2 Material und Methoden
31
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Oligonukleotide
Die Oligonukleotide wurden von der Fa. MWG Biotech synthetisiert und bezogen.
Tab. 2-10 Sequenz und Funktion der in dieser Arbeit verwendeten Oligonukleotide. Die Basen,
die bei Mutagenese-Oligonukleotiden im Vergleich zur Gensequenz verändert wurden sind
klein geschrieben, eingeführte Schnittstellen unterstrichen
Oligonukleotid Sequenz Funktion MOslr1417-1 5'-CCCCCACCCGTAgcgctAGATCTT
TGCCCTG Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys34 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer Eco47III Schnittstelle
MOslr1417-2 5'- GTAGGACATGCCAGAggcGCCC CCTTGACG
Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys44 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer KasI-Schnittstelle
MOslr1417-3 5'- GAGATATAGCAAACTTTTCCG aTCGgcGATAATCTGAAAACCTTC
Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys75 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer PvuI Schnittstelle
MOslr1417-4 5'-CCCCAAAGGATTTACCACAACC AgctGTTTGATTAGCATTAGG
Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys110 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer PvuII Schnittstelle
MOslr1417-5 5'- GCTTAAACCCCAAAGGATTTAC CggcgCCACAGGTTTGATTAGC
Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys112 in slr1417 gegen ein Alaninkodon, Einführung einer KasI- Schnittstelle
MOslr1417-4+5 5'-CCCCAAAGGATTTACCAgcACC AgctGTTTGATTAGCATTAGG
Mutagenese-Oligonukleotid zum Austausch des Kodons für Cys110 und 112 in slr1417 gegen je ein Alaninkodon, Einführung einer PvuII Schnittstelle
PRiscA11
5'-GGAATTCCATATGAGCCAAGC CACCGCTACC
5'-Primer zur Amplifikation von slr1417 (iscA1), Einführung einer NdeI-Schnittstelle
PRiscA12 5'-GATCTAAGCTTAAACCCCAAA GGATTTACC
3' -Primer zur Amplifikation von slr1417 (iscA1), Einführung einer HindIII-Schnittstelle
PRiscA2+3 5'-GGTAGTATGGCAAATGGAGC 5'-primer zur Amplifikation von iscA2 (slr1565) mit 65 bp 5'-Bereich
PRiscA2+4 5'-AACTGGGCAAACTTTGACCC 3'-Primer zur Amplifikation von iscA2 (slr1565) mit 200 bp 3'-Bereich
PRslr0387-3 5'-GTTATGAATTCATGGAACGGCC TCTTTACTTCG
5'-Primer zur Amplifikation von slr0387 (iscS), Einführung einer EcoRI Schnittstelle
PRsll0704-4 5'-GATTAGAATTCATGAAAATTTA CCTCGATTACAG
5'-Primer zur Amplifikation von sll0704, Einführung einer EcoRI Schnittstelle
PRslr0077-3
5'-GTTATGAATTCATGGTTGCTCT CCAAATTCCC
5'-Primer zur Amplifikation von slr0077 (sufS), Einführung einer EcoRI Schnittstelle
PRT7TERM
5'-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG 3'-Primer zur Amplifikation von Genen, die in Plasmide mit T7-Terminator kloniert sind
2 Material und Methoden
32
2.3.2 Plasmide
Die Plasmide, auf denen die in dieser Arbeit benutzten und konstruierten Plasmide
(Tab. 2-12) beruhen sind in Tab. 2-11 aufgeführt. Tabelle 2-11: Ausgangsplasmide für die in dieser Arbeit benutzten und konstruierten Plasmide Plasmid Beschreibung Referenz pRSET5a Expressionsplasmid für das T7-Expressionssystem,
AmpR, SCHÖPFER, 1993
pRSET6a Expressionsplasmid für das T7-Expressionssystem, AmpR,
SCHÖPFER, 1993
pEG202 Plasmid für 2-Hybrid System, AmpR, His-Marker zur Selektion in Hefe, Replikationsursprung für E. coli (ori) und Hefe (2µm) "bait" = Gen für DNA-Bindedomäne (LexA) unter Kontrolle des konstituiven ADH-Promoters und Polylinker
GYURIS ET AL., 1993
pJG4-5 Plasmid für das 2-Hybridsystem, AmpR, Trp- Marker für Selektion in Hefe, Replikationsursprung für E. coli (ori) und Hefe (2µm), "prey" = B42 Aktivatordomäne unter Kontrolle des induzierbaren Gal4-Promotors und Polylinker
GYURIS ET AL., 1993
pKS+ Plasmid mit lac-Promotor, Multipler Klonierungsstelle und AmpR
SAMBROOK ET AL., 1989
pLysS Plasmid zur konstitutiven Expression des T7-Lysozyms als Inhibitor der T7-RNA Polymerase in E.coli
STUDIER & MOFFATT, 1986
Tab. 2-12: während dieser Arbeit erzeugte und benutzte Plasmide Plasmid Ausgangs-
plasmid Beschreibung Referenz
pISCA1 pRSET5a Plasmid zur Expression von IscA1(Slr1417) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und HindIII
Seidler, A., unver-öffentlicht
pISCA1C34A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C44A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 44 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C75A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 75 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C110A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 110 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C112A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 112 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
2 Material und Methoden
33
pISCA1C34/75A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34 und 75 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C34/44/75A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34,44 und 75 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C110/112A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 110 und 112 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C34/75/110A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75 und 110 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C34/75/112A pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75 und 112 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA1C34/75/110/112A
pISCA1 Plasmid zur Expression von IscA1 in E. coli, Cys 34, 75, 110 und 112 gegen Ala ausgetauscht
diese Arbeit
pISCA2 pRSET5a Plasmid zur Expression von IscA2 (Slr1565) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und HindIII
Seidler, A., unver-öffentlicht
pISCU
pRSET6a Plasmid zur Expression von SynIscU (Ssl2667) aus Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und PstI
Seidler, A., unver-öffentlicht
pISCS1 pRSET6a Plasmid zur Expression von IscS (Slr0387) von Synechocystis in E. coli, kloniert über NdeI und PstI
(JASCH-KOWITZ & SEIDLER, 2000)
pISCA1+::Gm pKS+ Plasmid zur Erzeugung einer Insertionsmutante in iscA1 (slr1417), slr1417 mit flankierenden Sequenzen (ApaI/EcoRI) mit GmR in BglII,
Seidler, A., unver-öffentlicht
pISCA2+::Sm pKS+ Plasmid zur Erzeugung einer Deletionsmutante von slr1565 (iscA2), slr1565 mit flankierenden Sequenzen PstI/XbaI) und SmR in BstEII
Seidler, A., unver-öffentlicht
pEG-ISCS
pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscS (slr0387) von Synechocystis, iscS kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
pEG-Sll0704
pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit sll0704 von Synechocystis, sll0704 kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
2 Material und Methoden
34
pEG-Slr0077
pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit slr0077 von Synechocystis, slr0077 kloniert über EcoRI und XhoI
diese Arbeit
pEG-ISCU pEG202 Plasmid mit Gen für LexA-DNA-Bindedomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscU (ssl2267) von Synechocystis, iscU kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
pJG-ISCS
pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscS (slr0387) von Synechocystis, iscS kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
pJG-Sll0704
pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit sll0704 von Synechocystis, sll0704 kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
pJG-Slr0077
pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit slr0077 von Synechocystis, slr0077 kloniert über EcoRI und XhoI
diese Arbeit
pJG-ISCU pJG4-5 Plasmid mit Gen für B42-Aktivierungsdomäne am 3'-Ende fusioniert mit iscU (ssl2267) von Synechocystis, iscU kloniert in EcoRI und XhoI Schnittstellen
diese Arbeit
pSH18-34 pUC
Reporter-Plasmid für das Hefe Two-Hybrid System., lacZ unter der Kontrolle des GAL1- Promotors (UASG gegen LexA op(x8) ausgetauscht), URA3
ESTOJAK ET AL., 1995
pCDC28 pEG202 Positivkontrolle für das Hefe Two-Hybrid System
GYURIS ET AL., 1993
pCDI1 pJG4-5 Positivkontrolle für das Hefe Two-Hybrid System
GYURIS ET AL., 1993
2.3.3 Plasmidschnellisolierung (HOLMES & QUIGLEY, 1989)
STET-Puffer: 8 % Saccharose, 0,1 % Triton X 100, 50 mM EDTA
50 mM Tris/HCl, pH 8,0
TE-Puffer: 10 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA
1,5 ml Übernachtkultur wurden in einem Eppendorfgefäß in der Tischzentrifuge
sedimentiert (2 min, 13000 Upm) und der Überstand komplett abgenommen. Das
2 Material und Methoden
35
Sediment wurde in 200 µl STET resuspendiert, 10 µl Lysozym (20 mg/ml)
hinzugegeben und der Ansatz 5 min bei RT inkubiert. Der Ansatz wurde 45 s
gekocht und kurz im Eisbad abgekühlt. Zelltrümmer, chromosomale DNA und nicht
aufgeschlossene Zellen wurden 30 min in der Tischzentrifuge sedimentiert (13000
Upm) und das Sediment mit einem sterilen Zahnstocher entfernt. Zu dem Überstand
wurden 6 µl 5% CTAB in 700 mM NaCl gegeben. Der Ansatz wurde gemischt und 5
min abzentrifugiert (13000 Upm). Der Überstand wurde verworfen und das Sediment
in 300 µl 1,2 M NaCl resuspendiert. Zu dem Ansatz wurden 750 µl Ethanol gegeben
und der Ansatz zentrifugiert (13000 Upm, 10 min). Die DNA wurde mit 500 µl 70%
Ethanol gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde getrocknet und in
50 µl TE mit 10 µg/ml RNase gelöst.
2.3.4 Plasmidisolierung im präparativen Maßstab
Die Plasmidisolierung im präparativen Maßstab erfolgte mit dem Machery & Nagel
AX 100 Kit. Die Plasmidisolierung erfolgte nach der Anleitung und mit dem
Material des Herstellers. Ein Aliquot der erhaltenen DNA-Lösung wurde
abgenommen und die DNA-Konzentration im Photometer (siehe 2.3.5) bestimmt.
Bei einem Verhältnis OD260/OD280 von weniger als 1,75 wurde zur Entfernung der
kontaminierenden Proteine eine P/C-Extraktion mit anschließender Ethanolfällung
durchgeführt (siehe 2.3.11)
2.3.5 Photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung
von DNA
Die Extinktion einer Verdünnung der präparierten DNA wurde im Photometer bei
260 nm und 280 nm bestimmt. Eine OD260 von 1 entspricht einer DNA-
Konzentration von 0,05 µg/µl (MÜLLER ET AL., 1993). Über das Verhältnis der
Absorption bei 260 nm zu 280 nm ließ sich die Reinheit der DNA-Präparation
abschätzen. Wenig verunreinigte Lösungen weisen ein Verhältnis von ca. 1,8 auf. Je
stärker Lösungen verunreinigt sind, desto niedriger ist dieses Verhältnis.
2.3.6 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von DNA-
Fragmenten
1x TBE-Puffer: 0,09 M Tris, 0,09 M Borsäure, 0,002 M EDTA, pH 8,0
2 Material und Methoden
36
Für die Auftrennung von DNA-Fragmenten wurden Agarosegele eingesetzt mit 0,5 x
TBE als Puffersystem. Die Agarosekonzentration im Gel wurde entsprechend den zu
trennenden Fragmentgrößen gewählt und das Gel vor dem Gießen wurde mit etwa 1
µg/ml Ethidiumbromid versetzt. Die zu analysierende DNA-Lösung wurde mit etwa
1/10 Vol 10 x Ladepuffer (Takara) versetzt und in die Taschen des Gels aufgetragen.
Zur Auftrennung wurde für 20-40 min eine konstante Spannung von ca. 7 V/cm
angelegt. Zur Abschätzung der Fragmentgrößen wurde auf das Gel ein
Längenstandard mit aufgetragen.
2.3.7 DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Die DNA-Bande wurde durch Vergleich mit dem Größenstandard auf dem UV-Tisch
im Agarosegel identifiziert und mit einem Skalpell aus diesem ausgeschnitten. Die
Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen erfolgte mit einem Kit der Firma
Pharmacia nach Anleitung des Herstellers. Dazu wurden die mitgelieferten Säulen
und Lösungen verwendet. Nach der Extraktion wurde das eluierte Fragment in 20-50
µl 1/10 TE-Puffer aufgenommen.
2.3.8 Spaltung mit Restriktionsendonukleasen
Die Restriktionsenzyme wurden in den von den Herstellern mitgelieferten Puffern
angewendet und unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen inkubiert.
Für die Gewinnung von DNA-Fragmenten zur Ligation wurden 3-5 µg DNA mit
1/10 Vol 10x Reaktionspuffer und 10 U Restriktionsenzym in einem geeignetem
Volumen (40-80 µl) für 1,5-2,5 h inkubiert.
Für Testrestriktionen nach der Plasmidschnellisolierung wurden 2-5 µl DNA mit 1 µl
10-fach Reaktionspuffer und 2 U Restriktionsenzym in 10 µl Gesamtvolumen 1 h
inkubiert.
2.3.9 Dephosphorylierung von DNA
Um eine Religation eines Plasmids zu verhindern, das nur mit einem
Restriktionsenzym gespalten worden war, wurde das gespaltene Plasmid vor der
Ligation dephosphoryliert. Das Volumen der Lösung, die den linearisierten Vektor
enthielt wurde mit H2O auf 75 µl aufgefüllt. Zu dem Ansatz wurden 10 µl 10x
Dephosphorylierungspuffer und 0,2 µl in 15 µl Verdünnungspuffer verdünnte CIAP
(Gibco) gegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert und danach einer P/C
Extraktion (2.3.11) unterzogen.
2 Material und Methoden
37
2.3.10 Ligation
Die DNA-Konzentration der zu ligierenden DNA-Fragmente wurde über ein
Agarosegel abgeschätzt. Für die Ligation wurde ein DNA-Verhältnis Fragment zu
Vektor von 3:1 gewählt. Die Ligation erfolgte in 20 µl Gesamtvolumen in
Ligasepuffer und 0,2 µl T4-DNA-Ligase (Gibco 5U/µl). Die Inkubation erfolgt bei
4°C ü.N. oder bei RT für 1 h. Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Fragment wie
oben beschrieben behandelt.
2.3.11 Phenol / Chloroform (P/C) Extraktion und DNA-Fällung
Um Proteine aus DNA-Lösungen zu entfernen, wurde die Phenol / Chloroform
Extraktion mit anschließender DNA-Fällung durchgeführt. Dazu wurde das Volumen
der Lösung auf mindestens 100 µl eingestellt. 1 Vol wassergesättigtes Phenol /
Chloroform / Isoamylalkohol (25:24:1) wurde zu dem Ansatz gegeben und der
Ansatz durchmischt. Der Ansatz wurde 2 min bei 13000 Upm in der Tischzentrifuge
zentrifugiert und der Überstand in ein neues Gefäß überführt. Der Überstand wurde
mit dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24:1) versetzt, gemischt
und 1 min zentrifugiert (13000 Upm). Der Überstand wurde wiederum in ein neues
Gefäß überführt, mit 1/10 Vol 3 M Natriumacetat und 2,5 Vol Ethanol versetzt,
gemischt und 30 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde 15 min bei 13000 Upm
abzentrifugiert, das Sediment mit 500 µl 70 % Ethanol gewaschen und getrocknet.
Das DNA-Sediment wurde in einem geeigneten Volumen TE-Puffer gelöst.
2.3.12 Präparation genomischer DNA aus Synechocystis
10 ml einer Synechocystis-Kultur (OD730 ≥ 2) wurden bei 5000g für 10 min
zentrifugiert und das Sediment zweimal in 1 ml TES-Puffer (5 mM Tris/HCl, pH 8,5,
50 mM NaCl, 5 mM EDTA) gewaschen. Das Sediment wurde dann in 450 µl TES-
Puffer resuspendiert und 50 µl Lysozymlösung (20 mg/ml) hinzugegeben. Der
Ansatz wurde 15 min bei RT inkubiert und 100 µl einer 10% Sarkosyllösung
hinzugegeben. Dann wurde der Ansatz mit 600 µl Phenol/Chloroform/
Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt und 15 min auf einem Taumelschüttler inkubiert.
Nach einer Zentrifugation (10 min/13000 Upm/RT) wurde die wässrige obere Phase
abgenommen und in neues Gefäß überführt. Nach Zugabe von 100 µl 5 M NaCl,
100 µl CTAB (10 % w/v in 0,7M NaCl) und 600 µl Chloroform/Isoamylalkohol
(24:1) wurde der Ansatz erneut auf einem Schüttler 15 min inkubiert und
2 Material und Methoden
38
anschließend zentrifugiert (13000 Upm, 10 min, RT). Die wässrige Phase wurde
erneut abgenommen und in ein neues Gefäß überführt, mit 600 µl Isopropanol
versetzt und wiederum zentrifugiert. Das resultierende DNA-Sediment wurde mit
70% Ethanol gewaschen, luftgetrocknet und in 50-100µl TE-Puffer resuspendiert.
Die Konzentration und Reinheit der DNA wurde nach 2.3.5 bestimmt.
2.3.13 Polymerase-Kettenreaktion
Mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR, MULLIS & FALOONA, 1987) können DNA-
Fragmente von einer Vorlage-DNA gezielt amplifiziert werden. Dazu wird die
Vorlage-DNA denaturiert. An die einzelsträngige DNA können Oligonukleotide
(Primer) angelagert werden, die vom 3’-Ende aus durch eine thermostabile DNA-
Polymerase Taq-Polymerase verlängert werden können. In weiteren Zyklen, die aus
einem Denaturierungs-, Anlagerungs- und Verlängerungsschritt bestehen dienen die
neu synthetisierten DNA-Stränge wiederum als Vorlage-DNA, so dass DNA-
Fragmente mit definierter Größe entstehen.
Alle PCR-Ansätze enthielten 1x PCR-Puffer, 25 pmol der jeweiligen Oligo-
nukleotide (2.3.1), 2,5 mM MgCl2 und 0,2 mM dNTP. Das Reaktionsvolumen betrug
i.d.R. 100 µl.
Bei Verwendung chromosomaler DNA als Vorlage betrug die DNA-Konzentration
2-20 µg/ml. Den PCR-Ansätzen wurde dann 5% (v/v) DMSO zugesetzt. Es wurden
30 Zyklen aus Denaturierung, Anlagerung und Verlängerung durchgeführt.
Bei Verwendung von Plasmid-DNA als Vorlage betrug die DNA-Konzentration 50
ng/ml. Es wurden dann 25 Zyklen durchgeführt.
Zu Beginn einer PCR-Reaktion wurde die DNA für 3 min denaturiert. Dann wurden
25 U/ml Taq-Polymerase zugegeben. Die Zyklen bestanden aus je 30s
Denaturierung bei 94°C, einer Anlagerungsphase von 1 min bei 50-60°C und einer
Verlängerungsphase bei 72°C (1 min pro zu amplifizerendes kb). Den Zyklen folgte
eine 10-minütige Verlängerungsphase. Danach wurden die Ansätze auf 4°C
abgekühlt. Der Erfolg einer PCR wurde dann durch eine Agarosegelelektrophorese
kontrolliert (2.3.6).
2.3.14 Ortsgerichtete Mutagenese
Die Mutagenese nach Kunkel et al. (1987) beruht auf dem Prinzip der Anlagerung
eines Mutagenese-Oligonukleotids an einzelsträngige Uracil–haltige DNA mit
2 Material und Methoden
39
nachfolgender Synthese des Komplementationsstrangs und Selektion gegen den
eingesetzten Parentalstrang.
Dazu wird ein Plasmid mit einem Replikationsursprung des Phagens M13 in E. coli
CJ236i transformiert. Dieser Stamm besitzt keine aktive dUTPase und Uracil-N-
Glycosylase, so dass statt Thymin gelegentlich Uracil in die DNA eingebaut wird.
Dieser Stamm wird über Sexpili mit dem Phagen VCSM13 infiziert. Im
Replikationszyklus des Phagens wird nun statt der Phagen-DNA zu einem großen
Anteil einzelsträngige Plasmid-DNA in den Phagen verpackt. Diese kann nach der
Lyse der Zellen und der Freisetzung der Phagen aus diesen isoliert werden und wird
dann als Vorlage für eine enzymatische Verlängerung eingesetzt. Zur Mutagenese
wird ein Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation trägt, an die Einzelstrang-
DNA angelagert. Ausgehend vom 3’-Ende des Oligonukleotids wird der
Komplementationsstrang durch die T4-DNA-Polymerase synthetisiert mit dem 5’-
Ende des Oligonukleotids durch die Ligase ligiert. Die DNA wird dann in einen
Stamm transformiert, der eine aktive Uracil-N-Glycosylase besitzt, wodurch der
Uracil-haltige, nicht mutagenisierte Strang abgebaut wird. Dadurch wird mit einer
höheren Wahrscheinlichkeit der mutagenisierte Strang repliziert. Die DNA kann
dann isoliert werden und durch Restriktion und Sequenzierung die erfolgreiche
Mutagenese verifiziert werden.
2.3.14.1 Amplifikation des Helferphagen
Der Stamm WK6/VCSM13 wurde in 3 ml LB mit 25 µg/ml Km ü.N. angezogen. 1,5
ml der Kultur wurden für 5 min bei RT und 13000 Upm sedimentiert. Der die
Phagen enthaltene Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt und bei
4 °C gelagert.
Zur Bestimmung des Phagentiters wurde in 1 ml LB-Medium eine Verdünnungsreihe
der Phagensuspension angesetzt. In Reagenzgläsern wurden je 3 ml flüssiger H-
Topagar (0,1 % (w/v) Trypton, 0,08 % (w/v) NaCl, 0,8 % (w/v) Agar) bei 37 °C
vorgelegt. Dazu wurden je 100 µl ü.N.-Kultur von WK6 und der Phagenverdünnung
(10-8 bis 10 -10) gegeben. Der Ansatz wurde auf vorgewärmte LB-Agarplatten
gleichmäßig verteilt. Nach dem Erstarren wurden die Platten ü.N. bei 37°C inkubiert.
Der Phagentiter konnte durch Auszählen der Plaques bestimmt werden.
2 Material und Methoden
40
2.3.14.2 Gewinnung der Einzelstrang-DNA
Das Plasmid mit der zu mutagenisierenden DNA-Sequenz wurde in CJ236i
transformiert. Mit 0,4 ml einer ü.N.-Kultur dieses Stamms wurden 20 ml LB-
Medium mit 10 µg/ml Tetracyclin und 50 µg/ml Ampicillin inokuliert und auf einem
Schüttler bei 37°C bis zu einer OD600 von 0,3 (≈ 3 x 108 Zellen/ml) angezogen. Die
Zellen wurden mit einem 20-fachen Überschuss des Phagen infiziert und nach einer
Stunde zur Selektion auf die vom Phagen infizierten Zellen Kanamycin bis zu einer
Konzentration von 50 µg/ml zugegeben. Die Zellen wurden ü.N. unter Schütteln bei
25°C inkubiert.
Zweimal 8 ml der Kultur wurden bei 10000 g für 15 min zentrifugiert und der
Überstand, der die aus den lysierten E. coli-Zellen freigesetzten Phagen enthielt,
abgenommen, mit 10 µl RNase (10 mg/ml) versetzt und für 30 min bei RT inkubiert.
Zu den Ansätzen wurden 2 ml PEG 6000 in 2,5 M NaCl zugegeben und 30 min auf
Eis inkubiert. Die Ansätze wurde bei 10000 g für 10 min zentrifugiert, der Überstand
abgenommen, erneut 1 min zentrifugiert und der Überstand erneut vollständig mit
einer Pasteurpipette entfernt. Das die Phagen enthaltende Sediment wurde in 100 µl
STE-Puffer (100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA) resuspendiert,
wodurch es zur Freisetzung der DNA kam, und die Ansätze vereinigt. Der Ansatz
wurde bei 13000 Upm für 2 min zentrifugiert und der Überstand abgenommen.
Danach schloss sich eine zweimalige Extraktion mit Phenol/Chloroform mit
anschließender DNA-Fällung an (2.3.11). Das die gereinigte Einzelstrang-DNA
enthaltende Sediment wurde in 20 µl TE-Puffer resuspendiert und die DNA über ein
Agarosegel (2.3.6) und eine DNA-Konzentrationsbestimmung (2.3.5) quantitativ und
qualitativ überprüft.
2.3.14.3 Phosphorylierung von Oligonukleotiden
Zur Einführung von Phosphatgruppen an 5’-Enden von Oligonukleotiden wurden
200 pmol eines Oligonukleotids in 30 µl Polynukleotidkinasepuffer mit 5 U
Polynukleotidkinase (Stratagene) 45 min bei 37°C inkubiert. Die
Polynukleotidkinase wurde anschließend durch Inkubation für 10 min bei 65°C
inaktiviert.
2 Material und Methoden
41
2.3.14.4 Anlagerungs- und Synthese-Reaktion
Zur Anlagerung des Oligonukleotids wurden 250 ng Uracil-haltige Einzelstrang-
DNA in 10 µl 20 mM Tris/HCl, pH 7,5, 2 mM MgCl2, 50 mM NaCl mit 0,5 µl
phosphoryliertem Oligonukleotid (6,6 pmol/µl) versetzt und auf 80°C erhitzt. Der
Ansatz wurde dann in 5-minütigen Schritten von 5°C bis auf RT abgekühlt und dann
10 min auf Eis inkubiert. Nach der Zugabe von 1 µl Synthesepuffer (5 mM dNTPs,
10 mM ATP, 100 mM Tris/HCl, pH 7,9, 50 mM MgCl2, 20 mM DTT), 1 U T4-
DNA-Polymerase und 3 U T4-DNA-Ligase wurde der Ansatz bei 37°C für 90 min
inkubiert. 10 µl wurden dann für die Transformation von E. coli (2.2.4.1) eingesetzt.
Als Kontrolle wurde ein Ansatz ohne Oligonukleotid identisch behandelt.
2.3.15 Multiple ortsgerichtete Mutagenese
Gleichzeitige Mutagenese mehrerer Stellen in einem Plasmid wurde durch das
QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit der Fa. Stratagene durchgeführt.
Diese Reaktion beruht auf dem Prinzip der Anlagerung von Mutagense-
Oligonukleotiden an durch Hitze denaturierte einzelsträngige DNA. Durch die
Reaktion der Pfu-Polymerase werden ausgehend vom 3’-Ende der Oligonukleotide
der zur Vorlage komplementäre Strang synthetisiert und dann durch die Reaktion der
Ligase mit den 5’-Enden der Oligonukleotide verknüpft. Bei dieser Reaktion
entstehen vor allem einzelsträngige mutagenisierte DNA-Stränge. Diese sind nicht
methyliert. Die anderen DNA-Arten, die entstehen können, sind die doppelsträngige
Vorlage-DNA und doppelsträngige DNA, bei der ein Strang von der Vorlage-DNA
stammt und der andere neu synthetisiert wurde. Diese Formen sind an einem oder
beiden DNA-Strängen methyliert, da die Vorlage-DNA aus E. coli isoliert wurde.
Zur Selektion gegen die ursprünglichen, nicht die Mutation tragenden Stränge, wird
der Mutageneseansatz mit DpnI restringiert. DpnI schneidet spezifisch nur
methylierte oder hemimethylierte DNA. Die nicht geschnittene zirkuläre
mutagenisierte DNA wird dann in E. coli transformiert und dadurch repliziert.
Ein Mutagenese-Ansatz enthielt 1x Mutagenesepuffer, 50 ng Vorlage-Plasmid-DNA,
100 ng jedes (bis zu 3) phosphorylierten (2.3.14.3.) Oligonukleotids und 0,2 mM
dNTP und 1 µl Multi-Enzyme-Blend (Pfu-Polymerase und Ligase).
Der Ansatz wurde bei 95°C für 3 min in einem Thermocycler denaturiert. Darauf
folgten 30 Zyklen mit jeweils 1 min Denaturierung bei 95°C, 1 min Anlagerung bei
2 Material und Methoden
42
55°C und 2 min/kb Plasmidlänge Verlängerung bei 65°C. Zu den Ansätzen wurde
nach der Reaktion 1 µl DpnI gegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die DNA
wurde durch Hitzeschock-Transformation in E. coli XL10-Gold-Zellen transformiert
(2.2.4.1.3).
2.3.16 Sequenzierung von DNA
Sequenzierungen wurden von der Firma MWG-Biotech durchgeführt. Dazu wurde
etwa 1 µg aufgereinigte Plasmid-DNA benötigt.
2.4 Biochemische Methoden
2.4.1 Reinigung von Proteinen
Die Reinigung von Proteinen (IscA1, IscU, IscS) aus der löslichen Fraktion nach
Überexpression in E. coli umfasste verschiedene Fällungsschritte und die
Aufreinigung durch Säulenchromatographie. Alle Methoden wurden zunächst im
analytischen Maßstab etabliert, hier beschrieben sind die präparativen
Reinigungsschritte. Wenn nötig, wurden die Proteine zum Pufferaustausch zweimal
gegen das mindestens 100-fache Volumen des entsprechenden Puffers dialysiert
(Dialyseschläuche Fa. Sigma) und aufkonzentriert (Amicon-Ultrafiltrationszelle, YM
10 bzw. 30-Membranen)
2.4.1.1 Streptomycinsulfatfällung
Zur Entfernung von Kontaminationen durch Nukleinsäuren wurde der Rohextrakt
unter Rühren tropfenweise mit 1/10 Vol Streptomycinsulfatlösung (100 mM
Streptomycinsulfat in 20 mM HEPES/NaOH, pH 7,5) versetzt und 1 h auf Eis unter
Rühren inkubiert. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C)
von der Lösung getrennt und der Überstand für die Ammoniumsulfatfällung
verwendet
2.4.1.2 Ammoniumsulfatfällung
Zur Fällung wurde gemörsertes Ammoniumsulfat langsam auf Eis und unter Rühren
zum Rohextrakt zugegeben bis die erste gewünschte Konzentration erreicht war. Die
Lösung wurde mindestens für 1h auf Eis inkubiert und das Präzipitat durch
Zentrifugation (20000 g, 20 min, 4°C) von der Lösung getrennt. Der Vorgang wurde
wiederholt und das Sediment nach der zweiten Fällung in 20 mM HEPES/NaOH,
2 Material und Methoden
43
pH 8,0, 1 mM DTT (IscA1), 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT
(SynIscU) oder 20 mM TAPS, pH 9,0 (IscS) resuspendiert und dialysiert.
Tab. 2-13 Für die Fällung der verschiedenen
Proteine verwendeten Ammonuimsulfatkonzentrationen
Protein 1. Fällung [M] 2. Fällung [M] IscA1 1,23 2,05
SynIscU 1,64 2,87 IscS 1,03 1,64
2.4.1.3 Reinigung durch HPLC/FPLC HPLC-Anlage: FLPC-Anlage: Bio-CAD 700 E (PerSeptive) Fraktionssammler Modell FC 203 B (Gilson) Kyrostat Thermomix B und Frigomix (B. Braun) Säulenofen, Sonderanfertigung 60 cm (Jasco)
GradiFrac System (Pharmacia): Pumpe: Peristaltic Pump P-1 GradiFrac System Rack UV-Detektor: UV-1 Schreiber: REC 102 im Kühlraum 8°C
Alle Chromatographieschritte wurden zunächst an der HPLC-Anlage etabliert und
dann bei weiteren Wiederholungen z.T. an der FPLC-Anlage im Kühlraum
durchgeführt.
2.4.1.3.1 IscA1
Die Aufreinigung von IscA1 erfolgte über zwei Säulenchromatographieschritte. Als
erstes wurde ein hydrophobe Interaktionschromatographie und als zweites eine
Hydroxylapatitchromatographie durchgeführt. Die Detektion von IscA1 im Eluat
erfolgte spektroskopisch bei 280 nm.
Zur hydrophoben Interaktionschromatographie wurde eine Säule (Pharmacia XK26,
2,6 x 15 cm) gefüllt mit Butylsepharose (Pharmacia) mit etwa 200 ml 20 mM
HEPES/NaOH, pH 8,0, 760 mM Ammoniumsulfat, 1 mM DTT und einer Flussrate
von 5 ml/min äquilibriert. 80 mg Extrakt nach Ammoniumsulfatfällung wurden auf
eine Ammoniumsulfatkonzentration von 760 mM eingestellt, mit 2,5 mM DTT
versetzt und auf die Säule geladen. Diese wurde mit 140 ml 20 mM HEPES/NaOH,
pH 8,0, 760 mM Ammoniumsulfat, 1 mM DTT gewaschen. IscA1 wurde durch
einen Gradienten von 760 bis 0 mM Ammoniumsulfat in 20 mM HEPES/NaOH, pH
8,0, 1 mM DTT in 420 ml eluiert. Die Fraktionen wurden durch eine SDS-PAGE
2 Material und Methoden
44
(2.4.4) analysiert und die IscA1 enthaltenen Fraktionen vereinigt, aufkonzentriert
und gegen 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT dialysiert.
Zur Hydroxylapatitchromatographie (1 ml/min) wurde eine Säule (Pharmacia HR5/5,
0,5 x 5 cm), gefüllt mit Hydroxylapatit (Typ 1, Biorad), mit 10 ml 20 mM
Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 1 mM DTT äquilibriert und mit 2 mg IscA1 nach
HIC beladen. Das reine IscA1 wurde mit 20 mM Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5,
1 mM DTT von der Säule eluiert, während kontaminierende Proteine an der Säule
gebunden blieben. Die Fraktionen wurden mit einer SDS-PAGE überprüft,
verreinigt, aufkonzentriert und gegen 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0 dialysiert.
Die Reinigung der Varianten von IscA1 erfolgte entsprechend der Vorgehensweise
beim Wildtyp-Protein.
2.4.1.3.2 SynIscU
Die Aufreinigung von SynIscU (WOLLENBERG, 2000) erfolgte über eine hydrophobe
Interaktionschromatographie (5 ml/min) und einer anschließende Gelfiltration. Die
Detektion von SynIscU im Eluat erfolgte spektroskopisch bei 220 nm. Eine
Butylsepharose-Säule (Pharmacia, XR26, 2,6 x 15 cm, Flussrate 5 ml/min) wurde
mit 200 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 0,6 M Ammoniumsulfat, 1 mM
DTT äquilibriert und 80 mg Rohextrakt nach Ammoniumsulfatfällung in 20 mM
Natriumphosphat-Puffer, pH 6,5, 0,6 M Ammoniumsulfat, 2,5 mM DTT auf die
Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit 140 ml des Puffers gewaschen und SynIscU
durch einen Gradienten von 0,6 M auf 0 M Ammoniumsulfat in ca. 350 ml 20 mM
Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 1 mM DTT eluiert. Die SynIscU enthaltenen
Fraktionen wurden vereinigt und aufkonzentriert und gegen PBS (4 mM KH2PO4, 16
mM Na2HPO4, 115 mM NaCl), 1 mM DTT dialysiert.
Zur weiteren Aufreinigung von IscU wurde eine Gelfiltration durchgeführt. Als
Säule wurde eine Superose 12 HR 10/30-Säule (Pharmacia) verwendet und mit PBS,
1 mM DTT äquilibriert. Die Flussrate betrug 0,7 ml/min. Auf die Säule aufgetragen
wurden 2 mg SynIscU nach der HIC. Die Protein enthaltenden Fraktionen wurden
über eine SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die IscU in möglichst reiner Form
enthielten, wurden vereinigt, eingeengt und gegen 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0
dialysiert.
2 Material und Methoden
45
2.4.1.3.3 IscS
Zur Aufreinigung von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) nach
Ammoniumsulfatfällung wurde eine Säule (Butylsepharose, XK26, Pharmacia, 2,6 x
15 cm, Flussrate 5 ml/min) mit 200 ml Hochsalzpuffer (20 mM TAPS, pH 9,0, 0,25
M Ammoniumsulfat äquilibriert und die Ammoniumsulfatkonzentration der
Proteinlösung ebenfalls auf 0,25 M eingestellt. Nach dem Beladen der Säule wurde
diese mit 140 ml Hochsalzpuffer gewaschen. Danach wurde IscS mit
Niedrigsalzpuffer (20 mM TAPS, pH 9,0) eluiert. Die Detektion der Proteine im
Eluat erfolgte spektroskopisch bei 280 nm. Die erhaltenen Fraktionen wurden über
eine SDS-PAGE analysiert und die Fraktionen, die IscS in möglichst reiner Form
enthielten, vereinigt und eingeengt. Zur Rekonstitution von IscS mit dem Kofaktor
Pyrydoxalphosphat wurde IscS mit 0,1 mM PLP versetzt und 2 h inkubiert. Durch
Dialyse (siehe 2.3.7.1) gegen 20 mM TAPS pH 9,0 wurde der Überschuss an PLP
wieder entfernt.
2.4.2 Rückfaltung von IscA2
Die Konzentration unlöslichen Aggregate (2.2.6.1.2.1) wurde durch einen Vergleich
der in einer SDS-PAGE (2.4.4.1) auftretenden Banden der unlöslichen Aggregate mit
Banden bekannter Mengen Lysozym abgeschätzt. Ein Aliquot der Suspension wurde
abzentrifugiert und in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, 8 M Harnstoff, 10 mM DTT gelöst,
so dass eine Konzentration von 10 mg/ml erreicht wurde. Zum Lösen der Aggregate
wurde der Ansatz eine Stunde auf Eis inkubiert und die nicht gelösten Bestandteile
durch einen Ultrazentrifugationsschrtitt (100000g, 15 min) entfernt.
Zur Ermittlung der optimalen Rückfaltungsbedingungen wurden die gelösten
Aggregate durch langsame Zugabe in folgenden Puffer (2ml) schnell 100-fach
verdünnt. Generell wurden basische Pufferbedingungen gewählt und der Einfluss
von Arginin auf die Rückfaltung untersucht.
Puffer A: 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 1 mM DTT, Puffer B: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, Puffer C: 100 mM Tris/HCl, pH 9,0, 1 mM DTT, Puffer D: 1 M Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, Puffer E: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, 0,5 M Arginin Puffer F: 100 mM Tris/HCl, pH 8,5, 1 mM DTT, 1 M Arginin Die Rückfaltungsansätze wurden eine Stunde auf Eis unter Rühren inkubiert und das
nicht korrekt rückgefaltete, aggregierte Protein durch einen Ultrazentrifugations-
2 Material und Methoden
46
schrtitt entfernt. Die Protein-Konzentration des Rückfaltungsansatzes wurde
bestimmt (2.4.3.1) und die Homogenitität des rückgefalteten Proteins über eine
Anionenaustauschchromatographie bestimmt. Dazu wurde eine Säule (HR5/5, Q-
Sepharose, Pharmacia, 0,5 x 5 cm, Flussrate: 1 ml/min) mit 20 mM Tris/HCl, pH 8,0,
1 mM DTT äquilibriert und mit 1 ml des Überstands nach der Ultrazentrifugation
beladen. Das Protein wurde durch einen isokratischen Gradienten von 0 bis 1 M
NaCl eluiert. Die Detektion erfolgte bei 280 nm.
Für die präparative Rückfaltung von IscA2 wurden die Bedingungen der
analytischen Ansätze beibehalten. Die Rückfaltung erfolgte dann in 50 – 100 ml
Puffer C. Nach der Zentrifugation wurde das Protein aufkonzentriert und gegen 20
mM Tris/HCl, pH 8,0 dialysiert.
2.4.3 Konzentrationsbestimmung von Proteinen
2.4.3.1 Proteinbestimmung
Zur Proteinbestimmung (BRADFORD, 1976) wurden kleine Volumina (1-10 µl) der zu
testenden Proteinlösung mit Wasser auf 800 µl aufgefüllt. Zu dem Ansatz wurden
200 µl Bradford-Reagenz (Biorad) zugegeben, gemischt und die Probe für
mindestens 5 min (maximal 15 min) bei RT inkubiert. Die Absorption der Proben
wurde bei 595 nm bestimmt. Als Nullwert diente ein Wert ohne Proteinlösung. Zur
Quantifizierung der Proteinmenge wurden Eichansätze erstellt, die 0, 1, 2, 3, 4, 5,
7,5, 10 und 12,5 µg BSA enthielten
2.2.3.2 Konzentrationsbestimmung von Ferredoxin
Die Proteinkonzentration wurde für Holoferredoxin sowohl photometrisch bei 423
nm (ε423 = 6400 M-1 cm-1) als auch über einen Bradfordtest ermittelt. Aus den
unterschiedlichen Werten wurde ein Korrekturfaktor errechnet, mit dem das Ergebnis
der Proteinbestimmung nach Bradford des Apoferredoxins korrigiert wurde.
2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
2.4.4.1 SDS-PAGE
Die SDS-PAGE wurde nach LAEMMLI (1970), modifiziert SEIDLER (1994) durchge-
führt. Der Quervernetzungsgrad, der dem Verhältnis der Konzentration von
Bisacrylamid zur Gesamtkonzentration an Acrylamid und Bisacrylamid entspricht,
2 Material und Methoden
47
betrug 2,6 %. Die Konzentration an Acrylamid im Trenngel wurde je nach
Proteinprobe variiert. Als Starter der radikalischen Polymerisation wurde
Ammoniumpersulfat, als Radikalüberträger TEMED verwendet. SDS bindet
unspezifisch an Proteine, so dass diese negativ geladen sind und bei der
Elektrophorese zur Anode laufen. Dabei ist die Laufstrecke normalerweise
umgekehrt proportional zum Logarithmus des Molekulargewichts.
Das Sammelgel hatte folgende Zusammensetzung: 125 mM Tris/HCl, pH 6,8, 0,2 %
(w/v) SDS, 5,15 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid, 0,13 % (v/v) TEMED und
0,07 % (w/v) Ammoniumpersulfat. Das Trenngel enthielt 750 mM Tris/HCl, pH 8,8,
0,1 % (w/v) SDS, 12,5 - 17,5 % (w/v) Acrylamid/Bisacrylamid 0,08 % (v/v)
TEMED und 0,08 % (w/v) Ammoniumpersulfat. Es wurden Gele mit einer Höhe von
7 cm, einer Breite von 8,3 cm und einer Dicke von 0,75 mm verwendet. 4 Volumina
der Proteinprobe wurden mit 1 Volumen 5x Probenpuffer (160 mM Tris/HCl, pH
6,8, 5 % (w/v) SDS, 0,5 M DTT, 25% (w/v) Glycerin, 0,05 % (w/v)
Bromphenolblau) versetzt, für 1 min bei 100 °C denaturiert und nach kurzem
Abkühlen für 5 min bei 13000 U/min zentrifugiert. Es wurden 5 bis 25 µl
Proteinlösung auf das Gel aufgetragen. Für Anode und Kathode wurde 1x Laufpuffer
verwendet (192 mM Glycin, 50 mM Tris, 0,1 % SDS, pH 8,3). Die Elektrophorese
wurde bei 20 - 30 mA und maximal 220 V durchgeführt. Nachdem die Farbstofffront
das untere Ende des Gels erreicht hatte, wurde die Elektrophorese beendet und das
Gel gefärbt oder geblottet.
2.4.4.2 nicht-denaturierende PAGE
Für die Analyse von Ferrdoxin-haltigen Ansätzen wurde eine nicht-denaturierende
Gelelektrophorese durchgeführt. Dazu wurden 20%ige Polyacrylamidgele benutzt.
Die Zusammensetzung der Gele war dabei wie unter 2.4.4.1 beschrieben, allerdings
ohne SDS im Ladepuffer, Trenngel und Sammelgel und mit 375 mM Tris/HCl im
Trenngel. Die Spannung wurde auf maximal 200 V limitiert und die Elektrophorese
mit 13 mA Stromstärke durchgeführt.
2.4.4.3 Coomassie Gelfärbung
Lösungen : Färbelösung: 0,2 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue R, 40 % (v/v) Methanol
7 % Essigsäure Entfärber: 40 % (v/v) Methanol, 7 % Essigsäure
2 Material und Methoden
48
Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue R bindet an die Proteine im Gel, die durch
Essigsäure im Gel fixiert wurden. Die SDS- und nicht-denaturierenden
Polyacrylamidgele wurden für mindestens 20 min in der Färbelösung geschwenkt.
Zum Entfernen der Hintergrundfärbung wurden die Gele danach für mindestens 6 h
mit Entfärber behandelt. Die Gele wurden zur Dokumentation fotografiert.
2.4.4.4 Färbung von Gelen mit Stains All
Zur Färbung von Ferredoxin-haltigen Gelen wurde, da Ferredoxine als sehr saure
Proteine wenig Coomassie binden, eine Färbung mit Stains-All durchgeführt. Dazu
wurde das Gel nach der Elektrophorese 15 min in 25 % (v/v) Isopropanol bei 60°C
und dann für mindestens 5 h im Dunkeln mit 0,1 mM Stains-All in 30 mM Tris/HCl,
pH 8,8, 10 % (v/v) Formamid und 25 % (v/v) Isopropanol inkubiert. Zum Entfärben
wurden die Gele mit Wasser gewaschen und für 1 – 2 min auf einem
Overheadprojektor belichtet. Im Anschluss daran wurden die Gele zur
Dokumentation fotografiert.
2.4.5 Immundetektion von Proteinen
2.4.5.1 Elektrotransfer von Proteinen
Zum Transfer von Proteinen auf Membranen wurde ein Semi-Dry-Western-Blot
durchgeführt. Dazu wurde zunächst eine PVDF-Membran für 1 min in Methanol
aktiviert und dann in Transferpuffer (20 mM CAPSO, pH 11,2, 20 % (v/v)
Methanol) überführt. Das Gel und Blotting-Papier (GB002, Gelblotting-Papier,
Schleicher & Schuell) wurden ebenfalls in Transferpuffer inkubiert. Der Transfer
vom Gel auf die Membran erfolgte zwischen je drei Lagen Blotting-Papier für 1 bis
1,5h bei 1,5 mA/cm².
2.4.5.2 Immunnachweis
Zur Absättigung der PVDF-Membran wurde die Membran nach dem Elektrotransfer
in 5 % (w/v) Trockenmilchpulver in TBST (10 mM Tris/HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl,
0,05% (v/v) Tween 20) inkubiert, um unspezifische Reaktionen zu vermeiden.
Danach wurde die Membran zweimal 5 min mit 15 ml TBST gewaschen. Zur
Detektion der Proteine wurde die Membran mit dem primären Antikörper verdünnt
in 15 ml TBST für 1 h inkubiert. Die Antikörper und die verwendeten
Verdünnungen sind in Tab. 2-14 aufgeführt. Zur Entfernung der unspezifisch
2 Material und Methoden
49
gebundenen Antikörper wurde die Membran erneut zweimal 5 min mit 15 ml TBST
gewaschen. Dann wurde die Membran mit dem sekundären Antikörper (anti-
Kaninchen-Antikörper, gekoppelt an die alkalische Phosphatase, Sigma, 1:30000) in
15 ml TBST inkubiert, wieder zweimal mit TBST gewaschen und in den
Reaktionspuffer für die alkalische Phosphatase (100 mM Tris/HCl, pH 9,5, 100 mM
NaCl, 5mM MgCl2,) überführt. Dann wurde die Membran durch eine Farbreaktion
der alkalische Phosphatase gefärbt. Dazu wurde die Membran in 10 ml AP-Puffer
mit 0,0125 % (w/v) NBT und BCIP unter leichtem Schwenken inkubiert, bis die
Signale die gewünschte Intensität erreicht hatten.
Tab. 2-14: Verwendete Antikörper und Verdünnungen. Die Antikörper wurden von der Fa.
Biogenes gegen hochgereinigte Proteine in Kaninchen hergestellt.
Antikörper Verdünnung Referenz anti-IscA1 1:10000 diese Arbeit anti-IscA2 1:10000 diese Arbeit anti-IscU 1:8000 diese Arbeit anti-IscS 1:8000 A. Seidler, unveröffentlicht
2.4.6 Sulfidbestimmung
Zur Bestimmung des Sulfidgehaltes einer Lösung wurde der Sulfidnachweis nach
SIEGEL (1965) angewendet. Der Sulfidnachweis wurde unter anaeroben Bedingungen
(unter Argonbegasung) durchgeführt. Das Volumen der Ansätze betrug 0,5 oder 1
ml.
Zu der Lösung, deren Sulfidgehalt bestimmt werden sollte, wurde schnell
aufeinanderfolgend 0,1 ml 0,02 M N,N-dimethyl-p-phenylendiaminsulfat in 7,2 N
HCl und 0,1 ml 0,03 M FeCl3 in 1,2 M HCl zugegeben. Die Proben wurden gemischt
und für 30 min im Dunkeln inkubiert. Bei der Anwesenheit von Sulfid wird unter
diesen Bedingungen Methylenblau gebildet, das bei 650 nm absorbiert. Als Nullwert
diente ein Ansatz mit Puffer.
Die Quantifizierung des Sulfids erfolgte über eine Eichgerade mit 0, 10, 20, 30 und
40 nmol Na2S. Die Proben der Eichreihe wurden in der gleichen Weise wie die
Testansätze behandelt.
2.4.6.1 IscS Aktivitätstest
Für einen IscS-Aktivitätstest (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) enthielten die Ansätze
20 mM TAPS, pH 9,0, 1 mM DTT, 0,2 mM L-Cystein, 10 µM PLP. Die Reaktion
2 Material und Methoden
50
wurde durch die Zugabe von IscS (i.d.R. 6 µg) gestartet. Die Proben wurden für
i.d.R. 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch den
Sulfidnachweis gestoppt. Die spezifische Aktivität von IscS lag in etwa bei 7,5 µM /
min x mg.
2.4.7 Eisenbestimmung
Die Eisenbestimmung wurde nach der Methode von FISH (1988) durchgeführt. Alle
Angaben beziehen sich auf ein Reaktionsvolumen von 1 ml. Dazu wurde die
Proteinlösung, deren Eisengehalt bestimmt werden sollte, zur Freisetzung des Eisens
mit 0,5 ml 0,6 N HCl, 2,25 % (w/v) KMnO4 versetzt und 2 h bei 60°C inkubiert. Die
Ansätze wurden auf RT abgekühlt und zu den Ansätzen 100 µl reduzierende Eisen-
chelatierende Ferrozine Lösung (6,5 mM Ferrozin, 13, mM Neocuproin, 2 M
Ascorbinsäure, 5 M Ammoniumacetat) gegeben. Nach 15 min Inkubation (RT) und 5
min Zentrifugation (13000 Upm) wurde der magentafarbige Fe(II) [Ferrozin]32+
Komplex photometrisch bei 562 nm bestimmt.
Zur Quantifizierung des Eisengehaltes wurde eine Eichgerade mit 0, 1, 2, 3, 4, 5 und
6 µg Eisen (in A. bidest.) erstellt.
2.4.8 analytische Gelfiltrationschromatographie
HPLC-Anlage bestehend aus: HPLC-Pumpe Modell 515 (Waters), Photodioden
Array Detector (Waters), Säulenofen, Sonderanfertigung (Jasco)
Zur Bestimmung des Oligomerisierungszustandes von IscA1 wurde eine analytische
Gelfiltrationschromatographie durchgeführt. Dazu wurde eine Superose 12 HR
10/30-Säule (Pharmacia) verwendet und mit PBS, 1 mM DTT äquilibriert. Die
Flussrate betrug 0,7 ml/min. Die Probe wurde durch einen Injektionsschleife auf die
Säule aufgetragen. Das Volumen der Probe betrug 100 µl. Zur Eichung der
Molekulargewichte wurde ein Molekulargewichtsstandard (Biorad) bestehend aus
folgenden Substanzen aufgetragen: Tyroglobulin (Rind; 670 kDa), Gamma-Globulin
(Rind; 158 kDa), Ovalbumin (Huhn; 44 kDa), Myoglobin (Pferd; 17 kDa) und
Vitamin B12 (1350 Da).
2 Material und Methoden
51
2.4.9 Rekonstitution von FeS Zentren
2.4.9.1 IscA1 und IscA2
Zur Rekonstitution des FeS Zentrums an IscA1 und IscA2 wurde das Protein (50-200
µM) mit 5 molaren Äquivalenten L-Cystein, 2 molaren Äquivalenten
Fe(NH4)2(SO4)2 (auch Fe(III)ammoniumcitrat) pro Protein-Monomer unter
anaeroben Bedingungen (Argonbegasung) in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0
inkubiert. Als Reduktionsmittel enthielten die Ansätze 85 mM β-Mercaptoethanol,
wenn andere Reduktionsmittel (5 mM DTT) verwendet wurden ist dies vermerkt.
Die Reaktion wurde durch die Zugabe von katalytischen Mengen IscS gestartet.
Nach 2 h wurde der Ansatz über eine Sephadex-G25-Spin Column (0,7 x 6 cm),
äquilibriert mit 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, aufgereinigt.
Zur Optimierung der Rekonstitutionsreaktion wurden auch größere Mengen an
Cystein und Eisen, bis zu einem 10-fachen Überschuss, eingesetzt. Dies führte aber
nicht zu einem höheren Eisen- und Sulfidgehalt an IscA.
2.4.9.2 SynIscU
Das FeS Zentrums an SynIscU wurde mit der gleichen Methode wie bei IscA
rekonstituiert. Die Rekonstitution erfolgte in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM
KCl, 125 mM NaCl, 85 mM β-Mercaptoethanol. Die Reinigung über eine
Gelfiltration erfolgte über Sephadex-G25-Spin-Column (0,7 x 6 cm), äquilibriert mit
dem gleichen Puffer ohne β-Mercaptoethanol.
2.4.9.3 Rekonstitutionen für die Mössbauer-Spektroskopie
Die Rekonstitution der FeS-Zentren für die Mössbauer-Spektroskopie erfolgte unter
den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben. Als Eisenquelle wurde
metallisches 57Fe in verdünnter Schwefelsäure gelöst und der pH der Lösung mit
Ammoniumhydroxid auf ca. pH 2 eingestellt. Um Schäden durch die Säure der 57Fe-
Lösung zu verhindern, wurde der Rekonstitutionsansatz mit 100 mM HEPES/NaOH,
pH 8,0 gepuffert. Der Ansatz wurde nach der Inkubation über eine PD10-Säule
(Pharmacia), äquilibriert mit entgastem und mit Argon gespültem 20 mM
HEPES/NaOH, pH 8,0 (IscA1) bzw. 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl,
125 mM NaCl (SynIscU) gereinigt und dann in einem Centriprep mit YM10-
Membran bei 3000 g in der Zentrifuge eingeengt. Von einem Aliquot der Probe
wurde die Konzentration durch einen Bradfordtest bestimmt (2.4.3.1), ein
2 Material und Methoden
52
Absorptionsspektrum aufgenommen und die Probe in einer Mössbauerküvette
eingefroren.
2.4.10 Untersuchungen zur Stabilität der FeS Zentren
Zur Untersuchung der Stabilität der FeS-Zentren an IscA1 und SynIscU wurden die
rekonstituierten Proteine in 20 mM HEPES/NaOH pH 8,0 (IscA1) bzw. 50 mM
HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl/ 10 % Glycerin (v/v) (SynIscU)
inkubiert. Die Versuche wurden in der Anwesenheit und Abwesenheit von Sauerstoff
ohne und mit Zusatz eines Reduktionsmittels (5 mM DTT, 85 mM β-
Mercaptoethanol) durchgeführt. Der Nachweis eines FeS-Zentrums an IscA1 und
SynIscU erfolgte über UV/Vis-Spektroskopie (2.5.1) nach 5, 10, 20, 30, 60, 120 min.
2.4.11 Experimente zur Übertragung des FeS Zentrums von IscA
und SynIscU auf Apo-FeS-Proteine
2.4.11.1 Übertragung des FeS Zentrums auf Apoferredoxin
Synechocystis Ferredoxin (Ssl0020) wurde in E. coli (BARTH ET AL., 2000) exprimiert
und gereinigt (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000).
2.4.11.1.1 Herstellung von Apoferredoxin
(nach MEYER ET AL., (1986), verändert)
1 ml Holoferredoxin aus Synechocystis PCC 6803 (ca. 2 mg/ml in 20 mM Tris-HCl,
pH 7,5, 10 mM DTT) wurde in ein mit Argon begastes, auf Eis gelagertes Greiner-
Röhrchen überführt. 10 M HCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M
zugegeben und der Ansatz für 45 min auf Eis unter ständigem Rühren und Argon-
Begasung inkubiert. Im Anschluss wurde die Suspension zentrifugiert (15000 g, 10
min, 4°C) und das weiße Sediment mit begastem A. bidest., 10 mM DTT gewaschen.
Das Sediment wurde in 100 - 300 µl mit Argon begastem 50 mM Tris/HCl, pH 8,5,
10 mM DTT resuspendiert.
2.4.11.1.2 Übertragung der FeS Zentren von IscA/SynIscU auf Ferredoxin
Für die Übertragungsreaktion wurden 2,5 nmol apo Ferredoxin mit 5 nmol IscA/IscU
in 100 µl Reaktionsvolumen unter Argonbegasung und mit 5 mM DTT für 1 h
inkubiert. Die Pufferbedingungen waren 20 mM HEPES/NaOH pH 8,0 (IscA) bzw.
50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 10 % (v/v) Glycerin
2 Material und Methoden
53
(SynIscU). Die Analyse der Ansätze erfolgte über eine nicht denaturierende PAGE
(2.4.4.2)
2.4.11.1.3 Kinetische Untersuchungen
Zur Untersuchung der Kinetik der Übertragungsreaktion wurde diese in einem
Volumen von 300 µl mit den oben beschriebenen Konzentrationen durchgeführt.
Nach 2, 5, 10, 20, 30 und 60 min wurde ein Aliquot von 40 µl aus dem Ansatz
entnommen und mit 20 nmol Ferricyanid und 100 nmol EDTA versetzt. Dies führte
zur Zerstörung des FeS-Zentrums an IscA/SynIscU. Zudem wurden die Proben bis
zur Analyse in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
2.4.11.2 Übertragung des FeS Zentrums auf die Catharantus roseus APS-
Reduktase und die Bacillus subtilis PAPS-Reduktase
In E. coli heterolog exprimierte und gereinigte Catharantus roseus APS-Reduktase
und Bacillus subtilis PAPS-Reduktase sowie 35[S]-APS und 35[S]-PAPS wurden von
der Arbeitsgruppe Schwenn am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen an der Ruhr-
Universität Bochum für die Experimente zur Verfügung gestellt.
2.4.11.2.1 Herstellung der Apo-Proteine
Um den Transfer des FeS-Zentrums von IscA1 von Synechocystis auf die APS- bzw.
PAPS-Reduktase zu untersuchen, musste zunächst das [4Fe4S]-Zentrum der (P)APS-
Reduktase entfernt werden und so die Apo-(P)APS-Reduktase hergestellt werden.
Dazu wurde die (P)APS-Reduktase (15 µM) in 100 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, mit
0,3 mM K3Fe(CN)6 0,75 mM EDTA 10 min auf Eis inkubiert. Die Reinigung des
Proteins erfolgte durch eine PD10-Säule (Pharmacia) äquilibriert mit 100 mM
HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Konzentration der Proteinlösung wurde bestimmt
(2.4.3.1) und die Lösung gegebenenfalls aufkonzentriert. Durch die Behandlung
verloren beide Enzyme die Aktivität.
2.4.11.2.2 Übertragung der FeS Zentren
Zum Transfer des FeS-Zentrums von IscA1 auf die Apo-APS- bzw. PAPS-
Reduktase wurden 200 pmol APS- bzw. PAPS-Reduktase in 300 µl 20 mM
HEPES/NaOH, 5 mM DTT mit 800 pmol rekonstituiertem IscA1 (2.4.8) inkubiert.
Alle Lösungen wurden zuvor im Argonstrom begast und der Ansatz für die Dauer
der Übertragung unter Argonatmosphäre gehalten. Nach einer bestimmten
2 Material und Methoden
54
Inkubationszeit wurden 100-200 ng APS-Reduktase bzw. 300 ng PAPS Reduktase
aus dem Ansatz entnommen und auf 30 µl mit 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 verdünnt.
2.4.11.2.3 Aktivitätstest
2.4.11.2.3.1 APS-Reduktase-Aktivitätstest
Der Aktivitätstest der APS-Reduktase (PRIOR ET AL., 1999) beruht auf der Umsetzung
von 35[S]-APS zu 35SO32-.
100 - 200 ng Catharantus roseus APS-Reduktase in 30 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,0
wurden mit 70 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8.0, 100 mM Na2SO3, 500 mM Na2SO4, 60
µM 35[S]-APS, 10 mM reduziertem Glutathion versetzt und für 3 min bei 30°C
inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl Aceton gestoppt. Die
Menge des im Sauren flüchtigen Sulfits wurde wie unter 2.4.11.2.3.3 beschrieben
bestimmt.
2.4.11.2.3.2 PAPS-Reduktase-Aktivitätstest
Der Aktivitätstest der Bacillus subtilis PAPS-Reduktase (SCHWENN & SCHRIEK,
1987) beruht auf der Umsetzung von 35[S]-PAPS zu 35SO32-. 300 ng PAPS-Reduktase
in 30 µl 10 mM Tris/HCl, pH 8,0 wurden mit 70 µl 100 mM Tris/HCl, pH 8,0, 100
mM Na2SO3, 60 µM 35[S]-PAPS, 5-10 µM E. coli Thioredoxin A, 10 mM DTT
versetzt und 3 min bei 30°C inkubiert. Die weitere Behandlung erfolgte wie oben
beschrieben.
2.4.11.2.3.3 Bestimmung des 35SO32-
(SCHWENN & SCHRIEK, 1987)
Die Reaktionsgefäße mit dem mit Aceton versetzten Reaktionsgemisch wurden in
Szintllationsgefäße mit 500 µl Trioctylamin überführt. In das Reaktionsgefäß wurden
zu dem Reaktionsgemisch 300 µl 6 M H2SO4 gegeben. Das durch die Ansäuerung
freigesetzte SO2 wurde in einem geschlossenen Szintillationsgefäß während einer
Inkubation bei 65°C für 45 min oder bei RT ü.N durch das basische Trioctylamin
gebunden. Das Reaktionsgefäß wurde aus den Szintillationsgefäßen entfernt und 4
ml Szintillationsflüssigkeit zugegeben. Die gebundene Radioaktivität wurde in einem
Flüssigkeitsszintillationszähler (Liquid Szintillation Counter 12/9, Rackbeta,
Pharmacia-LBK) bestimmt. Aus den so erhaltenen Daten und der bekannten
2 Material und Methoden
55
spezifischen Radioaktivität des Substrates konnte der Umsatz des Enzyms berechnet
werden.
2.4.12 Analyse der Reaktion von IscS mit reduziertem SynIscU
Zur Analyse der von IscS und SynIscU katalysierten Reaktion wurden 10 nmol
SynIscU (auch die Varianten SynIscUC44A und C47A) in 200 µl 20 mM TAPS, pH
9,0, 1 mM DTT für 30 min reduziert und das Reduktionsmittel über eine Sephadex-
G25-Spin-Column (0,7 x 6 cm) äquilibriert mit 20 mM TAPS, pH 9,0 entfernt. Alle
Puffer wurden zuvor entgast und mit Argon gespült. Die Bestimmung der
Proteinkonzentration nach der Gelfiltration erfolgte durch einen Bradfordtest
(2.4.3.1). Zur Analyse der Reaktion wurden in einem Schraubdeckelgefäß, das mit
Argon gespült wurde, 6 nmol IscS und SynIscU mit 12 nmol Cystein in 600 µl 20
mM TAPS, pH 9,0, 10 µM PLP inkubiert. Die Inkubation erfolgte bei
Raumtemperatur.
Um die Reaktion zu stoppen, wurden nach verschiedenen Zeiten (siehe Ergebnisteil)
100 µl dieses Ansatzes mit 5 µl 10 mM I-ADEANS versetzt. Die alkylierende
Reagenz I-ADEANS bindet kovalent an Sulfhydrylgruppen und besitzt eine
fluoreszierende Gruppe, die durch ultraviolettes Licht zur Fluoreszenz angeregt
werden kann. Liegt SynIscU in reduzierter Form vor, wird dadurch eine weitere
Reaktion mit IscS verhindert, durch die Alkylierung des aktiven Cysteins von IscS
wird auch die Cystein-Desulfurase-Aktivität von IscS unterbunden. Ein eventuell
entstandenes IscS-SynIscU-Heterodimer kann durch die Alkylierung der zweiten
freien Sulfhydrylgruppe von SynIscU ebenfalls stabilisiert werden.
Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte dann durch anschließende SDS-PAGE
und Westernblot mit dem Anti-IscS- und Anti-SynIscU-Antikörper (2.4.4/2.4.5).
Alternativ wurde mit 500 µl des Ansatzes eine Sulfidbestimmung (2.4.6)
durchgeführt.
2.4.13 Chlorophyllbestimmung
Synechocystis enthält nur Chlorophyll a. Für die Extraktion wurde Methanol
verwendet, das Chlorophyll aus ganzen Zellen extrahieren kann.
Zur Chlorophyllbestimmung wurde 0,5 - 1 ml Synechocystis-Kultur abzentrifugiert
und das Sediment mit 1 ml Methanol versetzt. Die Chlorophyllextraktion erfolgte
durch Inkubation der Ansätze für mindestens 30 min auf einem Taumelschüttler bei
RT.
2 Material und Methoden
56
Nach PORRA ET AL. (1989) gilt: cChl a = (0,01629 · E665,2 - 0,00854 · E652) mg/ml für
Methanol.
2.4.14 Aconitasetest
Die Bestimmung der Aktivität der Aconitase (KENNEDY ET AL., 1983) im löslichen
Proteinextrakt von Synechocystis erfolgte in 400 µl Tris/HCl, pH 8,0, 20 mM Iso-
Citrat mit 50 µg Proteinextrakt bei RT. Die Bildung von cis-Aconitat aus Iso-Citrat
wurde photometrisch über eine Zeit von 5 min bei 240 nm verfolgt. Der
Extinktionskoeffizient für cis-Aconitat beträgt 3,6 mM-1.
2.5 Biophysikalische Methoden
2.5.1 UV/Vis-Spektroskopie
Absorptionsspektren wurden im Bereich von 210-800 nm an einem Beckman DU
7400 Diodenarray Spektrometer aufgenommen. Für die Aufnahme wurden
Quarzküvetten mit einer Dicke von 1 cm verwendet.
2.5.2 Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie
Mit der Tieftemperatur-Fluoreszenz-Spektroskopie kann bei 77 K das relative
Verhältnis von PS II zu PS I bestimmt werden.
Zur Messung wurden 0,5 – 1 ml einer Synechocystis-Kultur (OD730 ≈ 0,5 - 1) in
eine Glasküvette (Ø = 0,4 cm) in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder
sofort zur Messung verwendet oder bei -70°C bis zur Messung gelagert. Die
Messung erfolgte bei 77 K in flüssigem Stickstoff. Zur Anregung der Fluoreszenz
der Chlorophylle wurden entweder die Chlorophylle direkt bei 435 nm oder die
Chlorophylle über die Phykobillisomen bei 580 nm angeregt. Die an die
Photosysteme gebundenen Chlorophylle emittieren dabei die Anregungsenergie als
Fluoreszenz. Daher wurde ein Emissionsspektrum in einem Wellenlängenbereich
von 630 – 760 nm aufgenommen. I.d.R. wurden 3 Spektren gemittelt. Die
Monochromatoren waren au eine Bandbreite von 4 nm eingestellt.
2.5.3 EPR-Spektroskopie
Zur Untersuchung der FeS-Zentren in IscA1 wurde EPR-Spektroskopie verwendet.
Rekonstituiertes IscA1 wurde mit und ohne Reduktion bzw. Oxidation mit 10
molaren Äquivalenten Dithionit bzw. Ferricyanid vermessen.
2 Material und Methoden
57
Wird ein Elektron mit einem magnetischem Moment, ein Übergangsmetall oder ein
ungepaartes Elektronenpaar in ein magnetisches Feld gebracht, richtet sich das
magnetische Moment relativ zum angelegten magnetischen Feld aus. Dadurch
entstehen Zustände mit unterschiedlicher Energie. Durch Absorption von
elektromagnetischer Strahlung im Mikrowellenbereich können Übergänge zwischen
diesen Zuständen hervorgerufen werden.
X-Band-EPR-Spektroskopie wurde am Max-Planck-Institutut für Strahlenchemie in
Mülheim a.d. Ruhr in Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill durchgeführt. X-Band-
Spektren wurden an einem Bruker ESP300E Spektrometer ausgerüstet mit einem
Helium Kryostaten (Oxford Instruments ESR 910), einem NMR Gaussmeter und
einem Hewlett-Packard Frequenz-Zähler aufgenommen.
Die Probenkonzentration in der Probe betrug ca. 0,1 mM. Typische Messparameter
waren 1 mW Mikrowellenstärke, 20 G Modulationsamplitude, 9,46 GHz
Mikrowellenfrequenz, 10 K.
2.5.4 Mössbauer-Spektroskopie
Mössbauer-Spektroskopie beruht auf dem Mössbauereffekt, der 1956 von R.L.
Mössbauer entdeckt wurde. Er wies nach, dass Kerne Energie absorbieren und
emittieren können, ohne dass die Energie durch den Rückstoss verbreitert wird. Für
die Emission der Strahlung wird eine radioaktive Quelle eingesetzt, die über
angeregte Zwischenzustände in den Grundzustand zerfällt. Dabei wird γ-Strahlung
emittiert. Im Fall des für die Quelle eingesetzten Isotops ist die Energie der Strahlung
extrem genau definiert. Diese Energieschärfe gilt auch für die absorbierendenden
Isotope wie 57Fe. Diese Isotope nennt man Mössbauerisotope. Durch die extreme
Energieschärfe der Strahlung können sehr geringe Unterschiede zwischen der
Festkörperumgebung der Quelle und der des Absorbers untersucht werden. Ein
Absorber kann die Strahlung nur absorbieren, wenn die Energie der Quelle mit den
Energien der angeregten Zustände der Probe übereinstimmen. Um die Energie der
Quelle zu variieren wird die die Quelle bewegt. Die Veränderung der Energie beruht
auf dem Dopplereffekt. Die Festkörperumgebung der Probe wird beeinflusst durch
die Elektronendichte, den Gradienten des elektrischen Feldes, d.h. die
Ungleichverteilung der Elektronen in der Umgebung, und durch das magnetische
Feld der Probe. Die Mössbauerparameter, die durch diese Faktoren bestimmt werden,
2 Material und Methoden
58
sind die Isomerieverschiebung, die Quadrupol-Aufspaltung und die magnetische
Aufspaltung.
Die in dieser Arbeit angewendete Mössbauer-Spektroskopie wurde am Max-Planck-
Institut für Strahlenchemie in Mülheim a.d. Ruhr von Dr. E. Bill durchgeführt.
Die für die Mössbauer-Spektroskopie verwendeten Proben wurden wie unter 2.4.8.3
beschrieben mit 57Fe rekonstituiert und tiefgefroren.
Die Mössbauer-Spektren wurden mit einem Spektrometer mit wechselnder,
konstanter Beschleunigung aufgenommen. Die minimale experimentelle Linienbreite
war 0,24 mm/s (Signalbreite bei halber Signalhöhe). Die Temperatur wurde entweder
bei 80K oder 4,2 K durch ein Oxford Instrument Variox oder durch einen Oxford
Instruments Mössbauer-Spektromag Kryostaten konstant gehalten. Das magnetische
Feld wurde parallel zur γ-Strahlung angelegt. Als Strahlungsquelle wurde ein 57Co/Rh-Quelle (1,8 GBq) verwendet, angebracht bei RT in einer Nullfeldposition.
2.5.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS)
MALDI-TOF–MS ist eine Methode zur Bestimmung des exakten
Molekulargewichtes von Proteinen. Die Probe wird dabei mit einer Matrix, die die
Laserenergie absorbiert und in Desorptions- und Ionisationsenergie umwandelt,
kristallisiert. Die aus der Matrix gelösten, ionisierten Proteine werden durch eine
Spannung beschleunigt und treffen nach einer bestimmten Flugzeit durch den
evakuierten Raum auf einen Detektor. Die Flugzeit ist dabei abhängig vom
Masse/Ladungsverhältnis (m/z) des Proteins.
Massenspektren wurden an einem Voyager System DEPRO 6061 (Perseptive
Biosystems) aufgenommen. Die Spektren wurden im linearen Modus aus 50 – 100
Einzelspektren gemittelt. Der Messbereich lag zwischen 2500 und 20000 Da, die
untere Ausschlussgrenze lag bei 2000 Da. Zur Beschleunigung der Ionen wurde eine
Spannung von 25000 V angelegt. Die Verzögerungszeit der Extraktion betrug 600
ns.
Als Matrix wurde eine gesättigte Lösung aus 0,1 % Trifluoressigsäure und 50 %
Acetonitril verwendet, die im Verhältnis 1:1 mit der Proteinlösung auf dem
Probenhalter gemischt wurde. Zur Kalibrierung der Masse wurde ein Standard
bestehend aus Insulin (Rind; 5730 Da) und Apo-Myoglobulin (Pferd; 16952 Da)
verwendet, die unter den identischen Bedingungen, wie beschrieben, gemessen
wurden.
3 Ergebnisse
59
Abb. 3-1: SDS-PAGE zu Expression und Reinigung von IscA1 M: Molekulargewichtstandard 1: lösliche Proteine der Expression 2: IscA1 nach Ammoniumsulfatfällung 3: IscA1 nach HIC 4: IscA1 nach HA-Chromatographie
3 Ergebnisse
3.1 IscA1
IscA1 sollte in E. coli exprimiert und gereinigt werden, um die Rolle des Proteins bei
der Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis zu untersuchen.
3.1.1 Expression und Reinigung von IscA1
Die Expression von IscA1 erfolgte in LB-Medium bei 25°C durch den Stamm E. coli
BL21(DE3)/pLysS/pISCA1 (2.2.6.3.1). Unter diesen Bedingungen konnte im SDS-
Gel eine zusätzliche Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von 13 kDa
beobachtet werden, die nach 6 h Expression ihre maximale Intensität erreichte (Abb.
3-1).
Dies entspricht dem kalkulierten Molekulargewicht von IscA1. Dieses Protein
repräsentierte ca. 15 % der löslichen Proteinfraktion. Durch eine Kombination aus
Ammoniumsulfatfällung, hydrophober Interaktionschromatographie und
Hydroxylapatit-Chromatographie wurde IscA1 bis zur Homogenität gereinigt (Abb.
3-1). Die Ausbeute nach dem letzten Chromatographieschritt betrug 55 mg
gereinigtes IscA1 pro Liter E. coli-Kultur.
3 Ergebnisse
60
3.1.2 Charakterisierung von Apo-IscA1
3.1.2.1 UV/Vis-Spektroskopie
Das UV/Vis-Spektrum von Apo-IscA1 weist neben der für Proteine typischen
Absorption bei 278 nm eine Schulter bei 330 nm auf. Zunächst wurde vermutet, dass
es sich dabei um Protein gebundenes Eisen handelt. Durch eine Eisenbestimmung
von IscA1 (2.4.7) konnten keine signifikanten Mengen Eisen nachgewiesen werden.
Säurelabiles Sulfid (2.4.6), das neben Eisen auf ein gebundenes FeS-Zentrum deuten
würde, konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Um den Grund für die
Absorption festzustellen wurde IscA1 in 8 M Harnstoff denaturiert und gegen
Harnstoff dialysiert. Dies wurde auch in Anwesenheit von EDTA oder DTT
durchgeführt. Nach der Dialyse zeigte die Spektren noch immer die beschriebene
Schulter. Daher wurde angenommen, dass die absorbierende Spezies kovalent mit
IscA1 verknüpft sein muss. Um dies weiter zu untersuchen wurde MALDI-TOF
Massenspektroskopie (2.5.5) durchgeführt.
3.1.2.2 MALDI-TOF Massenspektrometrie
Das aufgrund der Aminosäuresequenz kalkulierte Molekulargewicht von IscA1
beträgt 12928,7 Da. Durch MALDI-TOF-MS konnte ein Molekulargewicht von
12797,7 Da bestimmt werden (Abb.: 3-3). Dies entspricht exakt dem berechneten
Molekulargewicht von IscA1 nach Abspaltung des N-terminalen Methionins nach
der Translation. Neben dieser Masse konnten noch weitere größere Massen detektiert
werden. Die prominenteste besitzt ein Molekulargewicht von 12892,5 Da und damit
einer Differenz von 94,8 Da.
Abb. 3-2: Absorptionsspektrum von Apo-IscA1 Die Proteinkonzentration betrug 40 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0.
250 300 350 400 450 5000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
3 Ergebnisse
61
3.1.2.3 Untersuchung der Oligomerisierung durch analytische
Gelfiltration
Zur Bestimmung des Oligomerisierungszustandes des gereinigten IscA1 wurde eine
Gelfiltrationschromatographie wie unter 2.4.8 beschrieben durchgeführt. IscA1
wurde vor dem Auftragen auf die Säule mit 5 mM DTT reduziert. IscA1 eluierte
nach 16,3, 17,5 und 18,3 min. Diese Elutionszeiten entsprechen nach der in Abb. 3-4
gezeigten Molekulargewichts-Eichgeraden Molekulargewichten von 52, 32 und
23 kDa. Jede dieser Formen besaß die für das Absorptionsspektrum von IscA1
typische Schulter bei 330 nm. Die hochmolekularen Formen können als Di- und
Abb. 3-4: links: analytische Gelfiltration von Apo-IscA1 in PBS + 1 mM DTT rechts: Eichgerade der Kalibrierung der analytischen Gelfiltrationschromatographie in PBS+ 1 mM DTT
Abb.: 3.3: MALDI-TOF Massenspektrum von gereinigtem IscA1
5000 8000 11000 14000 17000 20000Masse m/z
0
8155.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 %
Inte
nsitä
t
12797.67
12892.50
6396.15 6437.58 5403.16 9266.656830.35 17118.56
14 16 18 20 22 24 26
1000
10000
100000
Mol
ekul
arge
wic
ht [D
a]
Zeit [min]0 4 8 12 16 20 24 28
0,000,010,020,030,040,050,060,070,080,09
Abso
rptio
n 28
0 nm
Zeit [min]
3 Ergebnisse
62
Tetramer (26 bzw. 52 kDa) interpretiert werden. Die Differenz des hier bestimmten
Molekulargewichts für monomeres IscA1 von 23 kDa zum kalkulierten
Molekulargewicht von ca. 13 kDa ist recht groß. Der Grund dafür könnte in nicht
definierter Faltung des monomeren Proteins oder in der Exposition hydrophober
Bereiche im Monomer liegen.
3.1.3 Charakterisierung des FeS-Zentrums von IscA1
3.1.3.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1
Zur Untersuchung der Fähigkeit von IscA1 ein FeS-Zentrum zu binden und somit als
Assemblierungsplattform für Eisen-Schwefel-Zentren zu dienen wurde, IscA1 wie
unter 2.4.9.1 beschrieben mit Cystein, Eisenammoniumsulfat und IscS (Slr0387) von
Synechocystis unter anaeroben und reduzierenden Bedingungen inkubiert. Das
anschließend über eine Gelfiltration gereinigte Protein besaß ein UV/Vis-Spektrum
(Abb. 3-5), das auf die Bindung eines FeS-Zentrums an IscA1 hindeutete. Das
Spektrum zeigt Absorptionsmaxima bei 278 nm, 330 nm, 420 nm (mit einer Schulter
bei 470 nm) und 580 nm. Diese Maxima sind typisch für ein oxidiertes [2Fe2S]2+-
Zentrum. Sulfid- und Eisenbestimmungen von IscA1 ergaben 0,9 Moleküle Sulfid
bzw. 1,2 Moleküle Eisen pro IscA1-Monomer. Durch Erhöhung der zur
Rekonstitution eingesetzten Cystein- bzw. Eisenkonzentration bis zu einem 10-
fachen Überschuss konnte keine weitere Steigerung der Maxima im Spektrum und
des Gehalts an Sulfid und Eisen erreicht werden.
Die Rekonstitution des mutmaßlichen FeS-Zentrums von IscA1 war unabhängig
davon möglich, ob Eisen(II) (Eisenammoniumsulfat) oder Eisen(III) (Eisen(III)-
ammoniumcitrat) als Eisenquelle eingesetzt wurden.
Abb. 3-5: Absorptionsspektrum des rekonstituierten IscA1 Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 30 µM in 20 mM HEPES/ NaOH, pH 8,0. Das Spektrum wurde unter Argonatmosphäre aufgenommen.
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
3 Ergebnisse
63
3.1.3.2 Spektroskopische Untersuchung von Holo-IscA1
Zur Bestätigung der Existenz eines FeS-Zentrums und zur genaueren Untersuchung
seiner Struktur wurden Elektronen-Spin-Resonanz- (EPR-) und Mössbauer-
Spektroskopie eingesetzt.
In der X- Band EPR-Spektroskopie (2.5.3) zeigte sich kein typisches EPR-Signal,
das auf ein FeS-Zentrum mit nicht ganzzahligem Spinzustand hindeutete. Nur ein
schwaches Signal von unspezifisch gebundenen Eisen(III)-Ionen bei g = 4,3 konnte
beobachtet werden. Die EPR-Ergebnisse deuteten in Übereinstimmung mit den
Ergebnissen der UV/Vis-Spektroskopie auf ein diamagnetisches Fe(III)-Fe(III)-
Zentrum von IscA1 mit einem Spin S = 0 hin. Versuche der Reduktion des FeS-
Zentrums mit äquimolaren Mengen an Dithionit konnten keinen EPR-detektierbaren
Zustand mit einem Spin S=½ einstellen. Höhere Konzentrationen an Dithionit (20
mM) führten zur Zerstörung des FeS-Zentrums. Versuche das FeS-Zentrum durch
Belichtung in Gegenwart von 0,1 mM Flavinmononukleotid und 0,5 mM EDTA zu
reduzieren (TOLLIN, 1995) führten ebenfalls zur Zerstörung des Zentrums.
Oxidation von Holo-IscA1 mit 10 molaren Äquivalenten Ferricyanid führte zum
Ausbleichen der Absorption im sichtbaren Bereich und zur Zerstörung des FeS-
Zentrums.
Um mehr Informationen über das FeS-Zentrum von IscA1 zu bekommen, wurde eine
Probe für die Mössbauer-Spektroskopie rekonstituiert (2.4.9.3). Zunächst wurde eine
Messung (2.5.4) bei 80 K ohne angelegtes externes magnetisches Feld durchgeführt.
Aus dem Nullfeld-Mössbauerspektrum (Abb. 3-6) von rekonstituiertem IscA1
konnten zwei bis drei übereinanderliegende Dupletts berechnet werden. Das mit
86 % Anteil am gemessenen Spektrum prominenteste Duplett besitzt eine
Isomerieverschiebung von δ= 0,27 mm/s und eine Quadrupol-Aufspaltung bei
∆EQ = 0,57 mm/s. Dieses Mössbauer-Duplett ist typisch für Fe(III)-Ionen, die
ausschließlich von Schwefelliganden umgeben sind, d.h. dass sich diese Fe-Ionen in
einem symmetrisch aufgebauten FeS-Zentrum befinden, welches von vier
Cysteinseitenketten ligiert ist. In weiteren Messungen konnte durch das Anlegen
eines magnetischen Feldes von bis zu 10 kG bei 80 K keine magnetische
Aufspaltung des Signals erreicht werden, was die diamagnetische Natur des [2Fe2S]-
Zentrums bestätigte. Diese Daten sprechen für ein [2Fe2S]2+-Zentrum, bei dem beide
Fe-Ionen identisch gebunden sind, da beide Ionen das gleiche Mössbauerspektrum
3 Ergebnisse
64
ergeben. Da alle bekannten [4Fe4S]-Zentren immer auch Fe(II)-Ionen enthalten,
kann ein solches Zentrum ausgeschlossen werden.
Ein weiteres Duplett repräsentiert ca. 12 % des gemessenen Signals. Dieses weist
eine Isomerie-Verschiebung von δ= 0,50 mm/s und eine Quadrupol-Aufspaltung bei
∆EQ = 0,77 mm/s auf. Dieses Signal wurde im magnetischen Feld in sechs Linien
aufgespalten (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass diese Spezies paramagnetisch ist.
Diese Eisenspezies kann begründet durch die hohe Isomerieverschiebung und durch
das magnetische Verhalten bei fehlendem X-Band EPR-Signal als nicht Protein-
gebundene super-paramagnetische Spezies interpretiert werden, die durch Eisen(III)-
Aggregate entstanden ist.
3.1.3.3 Untersuchung der Oligomerisierung von Holo-IscA1 durch
analytische Gelfiltration
Zur Untersuchung des Oligomerisierungszutands von Holo-IscA1 wurde eine
analytische Gelfiltrationschromatographie (2.4.8) durchgeführt.
Wie in Abb. 3-7 zu erkennen ist, eluierte Holo-IscA1 nach 15,9 und 17,5 min. Nach
der Eichgerade (Abb. 3-4) entspricht dies einem Molekulargewicht von 63 und 32
kDa. Demnach liegt Holo-IscA1 zu etwa 35 % als Tetramer und zu etwa 65 % als
Dimer vor. In keinem Experiment wurde monomeres Holo-IscA1 nachgewiesen.
Das Absorptionsspektrum des Holo-IscA1-Tetramers weist im Vergleich zum Dimer
weniger gut aufgelöste Absorptionsmaxima auf.
Abb. 3-6: Nullfeld – Mössbauerspektrum von IscA1 bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Punkte repräsentieren die Messpunkte, die Linien die berechnete Subspektren bzw. deren Addition. In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim.
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
0,980
0,985
0,990
0,995
1,000
Fe3+
[2Fe2S]2+
IscA1
Rel
ativ
e Tr
ansm
issi
on
Geschwindigkeit [mm/s]
3 Ergebnisse
65
3.1.3.4 Charakterisierung der Varianten von IscA1 Zur Ermittlung der Liganden des [2Fe2S]-Zentrums von IscA1 wurden Varianten
von IscA1 hergestellt, bei denen je eins der fünf Cysteine von IscA1 gegen Alanin
ausgetauscht wurde. Dazu wurde die Sequenz des Expressionsplasmids pISCA1
durch ortsgerichtete Mutagenese (2.3.14) verändert. Die Sequenz der erhaltenen
Plasmide pISCA1C34A, pISCA1C44A, pISCA1C75A, pISCA1C110A und
pISCA1C112A wurden durch Restriktionsanalysen und Sequenzierung verifiziert.
Die Expression und Reinigung (Abb. 3-8) der IscA1-Varianten erfolgte analog zum
Wildtyp-Protein.
Abb. 3-8: Reinigung der Varianten von IscA1 M: Molekulargewichtsstandard 1: IscA1 2: IscA1C34A 3: IscA1C44A 4: IscA1C75A 5: IscA1C110A 6: IscA1C112A
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
300 400 500
17,48
15,85
Wellenlänge
Abb. 3-7: links : Chromatogramm der analytischen Gelfiltrationschromatographie von Holo-IscA1 in PBS + 1 mM DTT rechts: Absorptionsspektrum der Elution bei 15,9 (unten) und 17,5 min (oben)
0 4 8 12 16 20 24 280,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10Ab
sorp
tion
280
nm
Zeit [min]
3 Ergebnisse
66
Da die initiale Rekonstitution des FeS-Zentrums der IscA1-Varianten mit 5 mM DTT
als Reduktionsmittel UV/Vis-Spektren ergaben, die auf die Anwesenheit eines FeS-
Zentrums an den Varianten hindeutete, wurden Varianten hergestellt, bei denen
mehrere Cysteine gegen Alanin ausgetauscht wurden. Die Mutagenese des
Expressionsplasmids (2.3.15) ergab die Plasmide pISCA1C34/75A,
pISCA1C34/44/75A, pISCA1C34/75/110A, pISCA1C34/75/112A und
pISCA1C34/75/110/112A. Nach Expression und Reinigung der entsprechenden
Proteinvarianten sollte untersucht werden, ob diese in der Lage waren ein FeS-
Zentrum zu binden. Dazu wurden sie analog zum WT-Protein mit 5 mM DTT als
Reduktionsmittel rekonstituiert. Auch diese Varianten wiesen nach der
Rekonstitution ein Absorptionsspektrum auf, das auf ein gebundenes FeS-Zentrum
hindeutete. Selbst die Variante IscA1C34/75/110/112A, deren Sequenz nur noch ein
Cystein enthält, zeigte dieses Spektrum (Abb. 3-9).
Eine weitere Optimierung der Rekonstitution durch den Einsatz von β-
Mercaptoethanol statt von DTT als Reduktionsmittel führte zu anderen Aussagen der
UV/Vis-Spektroskopie. Abb. 3-9 zeigt exemplarisch das UV/Vis-Spektrum der mit
DTT bzw. β-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel rekonstituierten Variante
IscA1C34/75/110/112A.
Nach der Optimierung der Rekonstitution wurden die Varianten mit einem Cystein-
Alanin-Austausch erneut untersucht. Die Rekonstitution dieser Varianten ergab, dass
der Austausch der C-terminalen Cysteine Cys110 oder Cys112 gegen Alanin dazu
führte, dass das entsprechende Protein kein FeS-Zentrum binden konnte (Abb.3-10).
Abb. 3-9: Rekonstitution der Variante IscA1C34/75/110/112A mit DTT bzw. β-Mercaptoethanol als Reduktionsmittel
300 400 500 600 700 8000,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
β-Mercaptoethanol DTT
3 Ergebnisse
67
Damit konnten die Cysteine Cys110 und Cys112 von IscA1 als die Liganden des
FeS-Zentrums identifiziert werden. Je ein Monomer des dimeren Holo-IscA1 stellt
somit zwei Liganden für die Koordination des [2Fe2S]2+-Zentrums.
Die entsprechenden Apoproteine IscA1C110A und IscA1C112A zeigten auch nicht
die Absorption bei 330 nm (Abb. 3-10).
Die Spektren für die Varianten IscA1C44A und IscA1C75A zeigten weniger gut
aufgelöste Maxima bei 330 und 420 nm. Dies deutet auf einen geringeren Gehalt an
FeS-Zentren in der Population der Proteine hin. Die Variante C34A scheint hingegen
mehr FeS-Zentren als das WT-Protein zu binden.
Die Rekonstitution der Varianten mit mehreren Cystein-Alanin-Austauschen ergab,
dass alle Varianten mit einem Austausch von Cys110 oder 112 nicht mehr in der
Lage waren, ein FeS-Zentrum zu binden. Das Absorptionsspektrum der Variante
C34/75A, bei der die beiden pflanzenspezifischen Cysteinreste gegen Alanin
ausgetauscht wurden, ähnelte dem der Variante C34A, das Spektrum der Variante
C34/44/75A, die nur noch die beiden C-terminalen Cysteine 110 und 112 besitzt,
ähnelte dem der Variante C44A.
Abb. 3-10: Absorptionsspektren von Wildtyp-IscA1 und IscA1-Varianten mit einem Cystein-Alanin-Austausch
links: nach Rekonstitution des FeS-Zentrums mit β-Mercaptoethanol rechts: wie isoliert
300 400 5000,00,10,20,30,40,50,60,70,8
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
IscA1 IscA1C34A IscA1C44A IscA1C75A IscA1C110A IscA1C112A
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
IscA1 IscA1C34A IscA1C44A IscA1C75A IscA1C110A IscA1C112A
3 Ergebnisse
68
Zur genaueren Untersuchung der Rolle des Cysteins 44, das zu den drei streng
konservierten Cysteinen in IscA-Proteinen gehört, wurde eine Mössbauerprobe der
Variante C44A erstellt und analysiert.
Tabelle 3-1: Vergleich der erhaltenen Mössbauer-Spektren für die IscA1, IscA1C44A und
IscA1C34/75A.
Fe-Spezies δ [mm s-1] ∆EQ [mm s-1]
% des Gesamtsignals
[2Fe2S]2+ 0,27 0,57 86,3 Fe(III) 0,50 0,77 12,1
IscA1
Fe(II) 1,30 3,10 1,6 [2Fe2S]2+ 0,27 0,57 39,4
Fe(III) 0,50 0,77 38,6 IscA1C44A
Fe(II) 1,30 3,10 22 [2Fe2S]2+ 0,27 0,57 95,5
Fe(III) 0,50 0,77 0 IscA1C34/75A
Fe(II) 1,30 3,10 4,5
Das erhaltene Spektrum (Abb. 3-11) konnte in drei Einzelspektren mit
Isomerieverschiebungen von δ = 0,27; 0,50; und 1,3 mm/s (siehe Tabelle 3-1) zerlegt
werden. Das Duplett mit δ=0,27 mm/s und einer Quadrupolaufspaltung von
∆EQ=0,57 mm/s, das 39,4 % des Gesamtspektrums ausmacht, ist das Signal der
Eisenionen im [2Fe2S]2+-Zentrum der Variante C44A. Auffällig ist das hohe Maß an
präzipitierten Eisen(III)-Aggregaten (δ=0,50 mm/s, ∆EQ=0,77 mm/s, 38,6 %). Die
dritte vorkommende Spezies mit einer Isomerieverschiebung δ= 1,3 mm/s und der
Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ=3,10 mm/s (22%) stammt von Eisen(II)-Ionen.
Abb. 3-11: Nullfeld-Mössbauerspektrum der Variante IscA1C44A bei 80 K. Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0 In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
0,980
0,985
0,990
0,995
1,000
Fe2+
Fe3+[2Fe2S]2+
IscA1C44A
Rel
ativ
e Tr
ansm
issi
on
Geschwindigkeit [mm/s]
3 Ergebnisse
69
Dieses Ergebnis spiegelt den in der UV/Vis-Spektroskopie geringeren Anteil an
rekonstituiertem Protein wieder.
Das Mössbauerspektrum der Variante C34/75A (Abb. 3-12), bei der die beiden
pflanzenspezifischen Cysteinreste gegen Alanin ausgetauscht sind, konnte ohne
einen Anteil an δ=0,50 mm/s-Isomerieverschiebung in die Einzelspektren zerlegt
werden. Den Hauptanteil des Spektrums (95 %) macht das Signal des [2Fe2S]2+-
Zentrums aus.
Untersuchungen der Varianten C44A und C34/75A durch analytische
Gelfiltrationschromatographie ergaben, dass die Varianten ebenfalls wie das
Wildtyp-Protein in einer dimeren und tetrameren Form vorliegen (Daten nicht
gezeigt).
3.1.3.4 Untersuchungen zur Stabilität von IscA1 und den Varianten
Die Stabilität des FeS-Zentrums von IscA1 wurde unter verschiedenen Bedingungen
untersucht (2.4.10). Unter aeroben Bedingungen war ein schneller Zerfall von IscA1
zu beobachten. Das Zentrum hatte bei Raumtemperatur nur eine Halbwertszeit von
10 min. Unter anaeroben Bedingungen betrug die Halbwertszeit 180 min. In
Anwesenheit von Reduktionsmitteln (5 mM DTT / 85 mM β-Mercaptoethanol) war
das FeS-Zentrum auch unter aeroben Bedingungen so stabil wie unter anaeroben
Bedingungen.
Abb. 3-12: Nullfeld-Mössbauerspektrum der Variante IscA1C34/75A bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 20 mM HEPES/ NaOH, pH 8,0 In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 40,970
0,975
0,980
0,985
0,990
0,995
1,000
Fe2+
[2Fe2S]2+
IscA1C34/75A
Rel
ativ
e Tr
ansm
issi
on
Geschwindigkeit [mm/s]
3 Ergebnisse
70
Die Stabilität der Varianten von IscA1 wurde unter den gleichen Bedingungen
untersucht. Die Varianten zeigten einen ähnlich schnellen aeroben Zerfall wie das
WT-Protein. Der anaerobe Zerfall in Abwesenheit von Reduktionsmitteln der
Varianten C44A und C75A ist beschleunigt, die Varianten C34A und C34/75A
zeigten eine ähnliche Stabilität wie das Wildtyp-Protein. Eine Halbwertszeit t ½ ≈ 80
min für die Varianten C44A und C75A im Vergleich zu t ½ ≈ 180 min für das WT-
Protein konnte ermittelt werden. Unter reduzierenden Bedingungen (5 mM DTT/ 85
mM β-Mercaptoethanol) war das FeS-Zentrum der Varianten C44A und C75A wie
auch aller anderen Varianten ähnlich stabil wie das FeS-Zentrum von IscA1-WT.
3.1.3.5 Untersuchungen zur Bildung des FeS Zentrums von IscA1
Neben der Stabilität des FeS-Zentrums ist die Assemblierung des FeS-Zentrums ein
Faktor, der die geringere Rekonstitution der Variante C44A bedingen könnte. Daher
wurde untersucht durch welchen Mechanismus das FeS-Zentrum an IscA1
rekonstituiert werden kann. Zur Rekonstitution von IscA1 wurde als Schwefelquelle
Cystein eingesetzt. Cystein wird von IscS (Slr0387) von Synechocystis umgesetzt.
Dabei wird Alanin freigesetzt und der Schwefel an einem aktiven Cysteinrest
(Cys326) von IscS als Persulfid gebunden. In Anwesenheit von Reduktionsmitteln
kann dieser Schwefel als Sulfid freigesetzt werden.
Um zu untersuchen, ob der von IscS mobilisierte Schwefel als Sulfid von IscA1 in
das FeS-Zentrum inkorporiert wird, oder ob dazu eine direkte Übertragung vom
Persulfid an IscS auf IscA1 nötig ist, wurde die Kinetik der Bildung des FeS-
Zentrums von IscA1 mit Cystein und IscS bzw. Sulfid als Schwefelquelle verglichen.
Wie in Abb. 3-13 zu erkennen, ist die Kinetik der Bildung des FeS-Zentrums von
IscA1 mit Cystein und IscS bzw. mit Sulfid als Schwefelquelle in etwa zu
vergleichen. Nach 45 – 60 Minuten ist die Bildung des FeS-Zentrums in beiden
Fällen abgeschlossen. Daher ist ein direkter enzymatischer Weg nicht
auszuschließen, aber nicht Vorraussetzung für die Assemblierung des FeS-Zentrums.
Da durch den Austausch von C44 gegen Alanin unter denselben
Assemblierungsbedingungen ein geringerer Prozentsatz der Proteinmoleküle ein
FeS-Zentrum bindet, wurde auch die Assemblierung der Variante C44A untersucht
(Abb. 3-13).
3 Ergebnisse
71
Die Assemblierung von IscA1C44A durch IscS und Cystein ist nicht wie beim WT-
Protein nach 45 – 60 Minuten abgeschlossen. Die Absorption bei 420 nm steigt bis
zu einer Zeit von zwei Stunden kontinuierlich an. Demnach ist die Assemblierung
des FeS-Zentrums an der Variante verlangsamt.
Zur weiteren Untersuchung der Assemblierung des FeS-Zentrums von IscA1 sollten
Bedingungen untersucht werden, bei denen kein Sulfid durch die Reaktion von IscS
mit Cystein unter reduzierenden Bedingungen entstehen kann. Eine Assemblierung
eines FeS-Zentrums unter diesen Bedingungen würde wie bei NifIscA und NifS auf
einen enzymatischen Prozess bei der Assemblierung hinweisen. Dazu wurde
versucht das FeS-Zentrum von IscA1 unter den bei KREBS ET AL. (2001) für NifIscA
aus A. vinelandii verwendeten Rekonstitutionsbedingungen, mit 8 mM Cystein, 2
mM FeSO4, NifS und ohne Zusatz eines weiteren Reduktionsmittels, zu
Abb. 3-13: Kinetik der Bildung der FeS-Zentren von IscA1 mit Cystein und IscS (oben links) bzw. Sulfid als Schwefelquelle (oben rechts) und Kinetik der Bildung der FeS-Zentren der Variante C44A mit Cystein und IscS als Schwefelquelle Die Proben wurden aus einem Ansatz entnommen und über Gelfiltration gereinigt. Die Proteinkonzentration wurde nach Bradford bestimmt und die Spektren demnach korrigiert.
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5IscA1 + Cys+ IscS
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
0 min 15 min 30 min 45 min 60 min 90 min
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6IscA1 Fe2+ S2-
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
0 min 20 min 40 min 60 min 90 min 120 min
300 400 500 600 700 8000,000,050,100,150,200,250,300,350,40 IscA1C44A
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
0 min 20 min 40 min 60 min 90 min 120 min
3 Ergebnisse
72
assemblieren. Dabei konnte keine Assemblierung eines FeS-Zentrums beobachtet
werden.
3.1.4 Übertragungsexperimente mit IscA1
Mit den folgenden Experimenten wurde untersucht, ob das an IscA1 assemblierte
FeS-Zentrum auf andere Apo-FeS-Proteine übertragen werden kann.
3.1.4.1 Übertragung auf [2Fe2S] Apoproteine
Als Modellprotein für die Übertragung von FeS-Zentren wurde zunächst das am
Elektronentransfer vom Photosystem I zu diversen Elektronenakzeptoren wie z.B.
die Ferredoxin-NADP+-Oxidoreduktase beteiligte Ferredoxin (Ssl0020) von
Synechocystis gewählt. Dazu wurde aus dem gereinigten Holoprotein durch
Behandlung mit Salzsäure das FeS-Zentrum entfernt (2.4.11.1.1). Zur
Reinkorporation des FeS-Zentrums (2.4.11.1.2) wurde das so gewonnene
Apoferredoxin mit Holo-IscA1 im molaren Verhältnis von 1 : 2 (Apoferredoxin zu
IscA1-Monomer) unter reduzierenden und anaeroben Bedingungen gemischt und für
eine Stunde inkubiert. Unter diesen Bedingungen ist das FeS-Zentrum von IscA1
stabil (3.1.3.4). Die Analyse des Reaktionsansatzes erfolgte über eine nicht-
denaturierende Gelelektrophorese (2.4.4.2).
Wie in Abb. 3-14 zu erkennen ist, besitzt Holoferredoxin (Bahn 1) im Vergleich zu
Apoferredoxin und IscA1 (Bahn 2 bzw. 3) eine größere Mobilität in der nicht-
Abb. 3-14: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-IscA1 und Apo- Ferredoxin über eine 20%ige nicht-denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: IscA1 4: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All
3 Ergebnisse
73
denaturierenden PAGE. Im Übertragungsansatz (Bahn 4) ist zu erkennen, dass der
größte Teil (80%) des Ferredoxins in der Holo-Form vorliegt. Durch die
Anwesenheit von IscA1 mit assembliertem FeS-Zentrum wurde Apoferredoxin in
Holoferredoxin umgewandelt. Apo-IscA1 hatte keinen Effekt. IscA1 ist somit in der
Lage, das FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen.
Zur Untersuchung der Kinetik der Reaktion wurden zu bestimmten Zeiten aus dem
Ansatz Proben entnommen und die Reaktion gestoppt (2.4.11.1.3).
Wie in Abb. 3-15 zu erkennen ist, war nach 2 Minuten ein signifikanter Anteil des
Apoferredoxins in Holoferredoxin umgewandelt, ca. 50% der FeS-Zentren waren
nach 10 Minuten übertragen worden.
Während der Reaktion konnte eine Farbänderung des Reaktionsansatzes beobachtet
werden. Die Farbe des Ansatzes änderte sich von braun nach rot-braun. Um die
spektroskopischen Eigenschaften des Ferredoxins im Übertragungsansatz zu
überprüfen, wurde der Übertragungsansatz nach der Reaktion über eine Gelfiltration
gereinigt und eventuelle Reste an Holo-IscA1 durch Inkubation des Ansatzes an
Abb. 3-15: Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-IscA1 auf Ferredoxin analysiert über eine nicht-denaturierende PAGE Gezeigt ist nur die Holoferredoxin-Bande, gefärbt mit Stains All
300 400 500 600 700 800
0,000,050,100,150,200,250,300,35
Differenzspektrum Fd wie isoliert
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
Abb. 3-16: Differenzspektrum aus dem Spektrum des Übertragungs-ansatzes abzüglich des Spektrums eines Ansatzes nur mit Holo-IscA1 ohne Apoferredoxin verglichen mit dem Spektrum des gereinigten Holoferredoxins. Vor der Aufnahme der Spektren wurden die Ansätze über eine Gelfiltration gereinigt und das FeS-Zentrum von Holo-IscA1 durch Luftsauerstoff zerstört.
3 Ergebnisse
74
Luftsauerstoff zerstört. Zur Ermittlung des IscA-Anteils am Spektrum wurde ein
Ansatz ohne Apoferredoxin gleich behandelt und ein Differenzspektrum aus den
beiden Absorptionsspektren gebildet. Abb. 3-16 zeigt das Differenzspektrum
verglichen mit dem Absorptionsspektrum von gereinigtem Ferredoxin. Wie in Abb.
3-16 zu erkennen ist, sind die spektroskopischen Eigenschaften des während der
Übertragung entstandenen Holoferredoxins ähnlich dem Absorptionsspektrum des
isolierten Ferredoxins.
Um einen Komplex aus Ferredoxin und IscA1 während der Übertragung
nachzuweisen wurde eine analytische Gelfiltration durchgeführt. Diese konnte keine
stabile Bildung eines Komplexes aus Ferredoxin und IscA1 während der Reaktion
nachweisen.
3.1.4.2 Übertragung auf [4Fe4S]-Proteine
Weiterhin sollte überprüft werden, ob IscA1 in der Lage ist neben [2Fe2S]-Zentren
auch [4Fe4S]-Zentren zu assemblieren. Dazu wurde die APS-Reduktase aus
Catharantus roseus gewählt. Dieses Protein besitzt ein [4Fe4S]-Zentrum, das
essentiell für die Aktivität des Enzyms ist. Das FeS-Zentrum wurde durch
Behandlung mit EDTA und Ferricyanid entfernt und das Apoprotein gereinigt
(2.4.11.3.1). Das so erhaltene Apoprotein wurde mit 4 Äquivalenten Holo-IscA1
(d.h. 2 [2Fe2S]-Zentren an IscA1 pro APS-Reduktasemolekül) unter anaeroben und
reduzierenden Bedingungen inkubiert (2.4.11.3.2) und nach bestimmten Zeiten eine
Probe entnommen. Die APS-Reduktaseaktivität dieser Probe wurde bestimmt
(2.4.11.3.3).
Wie in Abb. 3-17 gezeigt, führte die Inkubation von Apo-C. roseus APS-Reduktase
mit Holo-IscA1 zur Reaktivierung des Enzyms. Nach einer Stunde Inkubation bei
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
Rea
ktiv
ieru
ng [%
]
Zeit [min]
holo IscA1 Fe2+, S2-
apo IscA1
Abb. 3-17: Reaktivierung der Apo-APS-Reduktase aus Catharantus roseus mit Holo-IscA1. Ausgangswert ist die Aktivität des Enzyms vor Entfernung des FeS-Zentrums. In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum
3 Ergebnisse
75
Raumtemperatur sind 40 % der ursprünglichen Aktivität vor der Entfernung des FeS-
Zentrums wieder hergestellt. Bereits nach 20 min beträgt die Reaktivierung über
20 %. Inkubation mit Apo-IscA1 oder entsprechenden Mengen an Sulfid und
Eisen(II) hatten keinen Effekt auf die Reaktivierung des Enzyms.
Ein dreifacher Überschuss an Holo-IscA1-Dimer führte zu einer schnelleren
Reaktivierung und zu höheren Reaktivierungsraten nach einer Stunde. Eine
Verlängerung der Inkubationszeit über eine Stunde hinaus, ergab keine weitere
Steigerung der Aktivität, sondern eine geringere Reaktivierung als nach einer Stunde.
Apo- und Holo-IscA1 alleine zeigten keine Aktivität im Testsystem. Dies
demonstriert, dass die Assemblierung von [4Fe4S]-Zentren aus zwei [2Fe2S]-
Vorstufen gebunden an Holo-IscA1 möglich ist.
Als ein weiteres Modellprotein für die Assemblierung von [4Fe4S]-Zentren wurde
die PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis gewählt. Dazu wurde das für die Aktivität
essentielle [4Fe4S]-Zentrum des Enzyms analog zum C. roseus Enzym entfernt und
die Apo-PAPS-Reduktase mit vier Äquivalenten Holo-IscA1 unter anaeroben und
reduzierenden Bedingungen inkubiert.
Apo-B. subtilis-PAPS-Reduktase wird durch Inkubation mit Holo-IscA1 aus
Synechocystis aktiviert (Abb. 3-17). Die gemessene spezifische Aktivität liegt höher
als die Aktivität vor Entfernung des FeS-Zentrums, da ein Teil des Enzyms wohl
schon als Apoprotein vorlag. Neben der hier gezeigten PAPS-Reduktase-Aktivität
besitzt das Protein auch eine APS-Reduktase-Aktivität. Diese steigt in gleichem
Maße wie die PAPS-Reduktase-Aktivität durch Inkubation mit Holo-IscA1 an. Die
spezifische Aktivität mit APS als Substrat ist mit der Aktivität mit PAPS zu
Abb. 3-17: Reaktivierung der Apo-PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis mit Holo-IscA1 Aufgetragen ist hier die spezifische Enzymaktivität mit 35S-PAPS als Substrat. In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum
0 10 20 30 40 50 600,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Aktiv
ität [
µmol
/ mg
x m
in]
Zeit [min]
holo IscA1 Fe2+, S2-
apo IscA1
3 Ergebnisse
76
vergleichen. Apo-IscA1 und freies Eisen und Sulfid hatten wiederum keinen Effekt.
IscA1 zeigte keine PAPS-Reduktase-Aktivität.
3.1.4.3 Übertragungsaktivität der Varianten von IscA1
Neben dem Wildtyp-Holo-IscA1 wurden auch die Varianten C44A und C34/75A
daraufhin untersucht, ob die nicht an der Bindung des [2Fe2S]-Zentrums beteiligten
Cysteinseitenketten von IscA1 eine Rolle bei der Übertragung des FeS-Zentrums
spielen. Dazu wurden die rekonstituierten Varianten C44A und C34/75A als Donor
für die Übertragung des FeS-Zentrums auf Ferredoxin eingesetzt. Abb. 3-18 zeigt
den Vergleich der Übertragungskinetik des FeS-Zentrums.
Wie in Abbildung 3-18 zu erkennen, sind die Varianten C44A und C34/75A in der
Lage, das assemblierte [2Fe2S]-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen. Weder
der Austausch des strikt konservierten Cysteins 44, noch der der beiden
pflanzenspezifischen Cysteine 34 und 75 unterbinden die Übertragung des FeS-
Zentrums auf Ferredoxin. Die Kinetik des Prozesses ist bei den Varianten ähnlich der
Reaktionskinetik des WT-Proteins.
Um zu überprüfen, welchen Einfluss der Austausch der Cysteine gegen Alanin auf
die Übertragungsreaktion auf [4Fe4S]-Proteine hat, wurden die Varianten C44A und
Abb. 3-18: Vergleich der Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin von Holo-IscA1, C44A und C34/75A Gezeigt ist nur die Holoferredoxin –Bande gefärbt mit Stains All
0 10 20 30 40 50 600
20
40
Aktiv
ieru
ng [%
]
Zeit [min]
IscA1 IscA1C44A
Abb. 3-19: Aktivierung der C. roseus-APS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und IscA1C44AIn Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum
3 Ergebnisse
77
C34/75A in der Übertragungsreaktion auf die C. roseus-APS-Reduktase und B.
subtilis-PAPS-Reduktase getestet.
Dazu wurden die Varianten und das WT-Protein rekonstituiert und mit Apo-APS-
Reduktase inkubiert. Wie in Abb. 3-19 zu erkennen ist die Aktivierung der APS-
Reduktase durch die Variante C44A wesentlich geringer als die durch das WT-
Protein. Sie betrug nach 60 min nur 18,7 % der Aktivierung durch den IscA1-
Wildtyp. Die Aktivierung der APS-Reduktase durch die Variante C34/75A war in
allen Versuchen ähnlich der Aktivierung durch das WT-Protein oder sogar besser.
Zur Bestätigung dieser Ergebnisse wurden die Versuche auch mit PAPS-Reduktase
aus B. subtilis durchgeführt. Nach einer Stunde Inkubation von Apo-B. subtilis-
PAPS-Reduktase mit Holo-IscA1-WT und -C44A erfolgte die Bestimmung der
Aktivität der PAPS-Reduktase.
Die Reaktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-IscA1C44A liegt nur
bei etwa 10 % der Reaktivierung durch IscA1 (Abb. 3-20). Durch den Einsatz der
dreifachen Menge an C44A konnte in etwa das Niveau der Reaktivierung durch
IscA1-WT erreicht werden.
3.2 IscA2 Das zweite IscA-Protein aus Synechocystis (Slr1565/IscA2) wurde ebenfalls in E.
coli exprimiert, gereinigt und untersucht.
100,0
10,2
96,4
0
20
40
60
80
100
120
IscA1 C44A 3 x C44A
% d
er R
eakt
ivie
rung
du
rch
Hol
o-Is
cA1
Abb. 3-20: Aktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und IscA1C44A nach 60 min mit 35S-PAPS als Substrat In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum
3 Ergebnisse
78
3.2.1 Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2
IscA2 wurde als unlösliches Aggregat im Stamm BL21(DE3)/pLysS/pISCA2
exprimiert. Vorversuche zur Expression hatten keine Bedingung ergeben, unter der
eine signifikante Menge an IscA2 löslich angereichert werden konnte.
IscA2 wurde in LB-Medium bei 37°C exprimiert. In einer Analyse des
Gesamtzellproteins durch eine SDS-PAGE konnte nach dem Zellaufschluss eine
starke Bande mit einem apparenten Molekulargewicht von ca. 12 kDa beobachtet
werden. Dieses Protein entsprach ca. 40 % des Gesamtzellproteins (Abb. 3-21, Bahn
1). Durch wiederholte Waschungen mit Puffer und 1 % (v/v) Triton X100 konnten
diese Aggregate bis zu einer Reinheit von ca. 90% (Abb. 3-21, Bahn 2) aufgereinigt
werden (2.2.6.1.2.1). Die Ausbeute betrug ca. 200 mg gereinigte IscA2-Aggregate
pro Liter E. coli-Kultur.
Die Rückfaltung von IscA2 erfolgte nach der Methode der schnellen Verdünnung
nach Auflösen der Aggregate in Harnstoff (2.4.2). Nach Optimierung der
Rückfaltungsbedingungen konnte IscA2 mit einer Ausbeute von 40 – 50 % aus den
unlöslichen Aggregaten in 100 mM Tris, pH 9,0, 1 mM DTT zurückgefaltet werden.
Das Protein war nach der Rückfaltung rein (Abb. 3-21, Bahn 3). Die Homogenität
des rückgefalteten Proteins wurde durch Anionenaustauschchromatographie
überprüft. IscA2 eluierte in einem distinkten Bereich des NaCl-Gradienten von 0 -
1 M NaCl von der Säule (Daten nicht gezeigt).
3.2.2 Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA2
IscA2 wurde wie IscA1 mit Cystein, Fe(NH4)2(SO4)2 und IscS rekonstituiert. Nach
der Reinigung des Ansatzes durch eine Gelfiltration wurde ein Absorptionsspektrum
Abb. 3-21: SDS-PAGE zu Expression, Reinigung und Rückfaltung von IscA2 1: aufgebrochene Zellen 2: isolierte und gereinigte Aggregate 3: rückgefaltetes Protein
3 Ergebnisse
79
aufgenommen. Das Spektrum (Abb. 3-22) ähnelt dem Spektrum von rekonstituiertem
IscA1. Es zeigt Absorptionsmaxima bei 330 und 420 nm (mit einer Schulter bei 470
nm) und 580 nm. Dies demonstriert, dass IscA2 wie IscA1 in der Lage ist ein FeS-
Zentrum zu binden. Das Absorptionsspektrum deutet wieder auf ein [2Fe2S]2+-
Zentrum hin. Das Apoprotein absorbiert bei 278 nm. Eine kleine Schulter bei 330 nm
ist ebenfalls zu erkennen.
3.2.3 Übertragung des FeS-Zentrums auf Apoferredoxin
Analog zu IscA1 sollte untersucht werden, ob IscA2 ebenfalls in der Lage ist, das
assemblierte FeS-Zentrum auf Ferredoxin zu übertragen. Dazu wurde Holo-IscA2
wie unter 2.4.11.1 beschrieben mit Apoferredoxin inkubiert und der Ansatz danach
über eine nicht-denaturierende Gelelektrophorese (2.4.4.2) untersucht. Wie in Abb.
3-23 zu erkennen, ist auch IscA2 in der Lage das FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu
Abb. 3-23: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-IscA2 und Apoferredoxin über eine 20%ige nicht denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: IscA2 4: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All
Abb. 3-22: Absorptionsspektrum von Apo- und Holo-IscA2 Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 25 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0. Die Spektren wurden unter Argonatmosphäre aufgenommen
300 400 500 600 700 8000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
holo IscA2 apo IscA2
3 Ergebnisse
80
übertragen. Der Umsatz von Apo- zu Holoferredoxin war allerdings in allen
Versuchen verglichen mit IscA1 geringer.
3.3 SynIscU
Der Untersuchung von SynIscU wurden zwei verschiedene Arbeitshypothesen zu
Grunde gelegt. Zunächst sollte die Rolle von SynIscU als potentieller Überträger des
von IscS oder anderen NifS-homologen Proteinen mobilisierten Schwefels
untersucht werden. In einem zweiten Teil sollte wie von NISHIO & NAKAI (2000)
vorgeschlagen, die Rolle von SynIscU als Assemblierungsplattform für FeS-Zentren
untersucht werden.
3.3.1 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als Überträger des
Schwefels
Für SynIscU wurde in meiner Diplomarbeit (2000) aufgrund des Thioredoxin-artigen
CXXC-Motivs eine Funktion als Reduktionsmittel bei der Mobilisierung des
Schwefels aus Cystein vorgeschlagen. Diese Hypothese beruhte auf Experimenten,
bei denen katalytische Mengen IscS mit reduziertem SynIscU und Cystein inkubiert
wurden. Nach der Reaktion konnten pro Mol Cystein und reduziertem SynIscU ein
Mol Sulfid nachgewiesen werden. SynIscU lag nach der Reaktion oxidiert vor. Der
Nachweis des Redoxzustandes von SynIscU erfolgte durch Alkylierung der
Sulfhydrylgruppen des Ansatzes durch den Fluoreszenzmarker I-ADEANS. Dieser
bindet schnell und kovalent an reduzierte Sulfhydrylgruppen. Bindung von I-
ADEANS führte zu einer höheren Mobilität des alkylierten Proteins in der nicht-
denaturierenden PAGE. Dadurch konnten die oxidierte und die reduzierte, alkylierte
Form getrennt werden.
Der Mechanismus der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein sollte aufgeklärt
werden. Zudem sollte die Interaktion von IscS mit SynIscU nachgewiesen werden.
3.3.1.1 Biochemische Untersuchungen mit IscS und SynIscU
Zum Nachweis des Reaktionsmechanismus wurden neben dem WT-Protein
Varianten von SynIscU eingesetzt, bei denen ein Cystein gegen Alanin ausgetauscht
worden war. Wenn der von IscS mobilisierte Schwefel direkt als Persulfid vom
aktiven Cystein 326 von IscS auf eines der Cysteinreste von SynIscU übertragen
wird, sollte es an den Varianten von SynIscU mit nur einem Cysteinrest stabilisiert
sein. Das Persulfid könnte dann durch I-ADEANS markiert und durch Zusatz eines
3 Ergebnisse
81
Reduktionsmittels abgespalten werden. Dieser Nachweis konnte in der Diplomarbeit
nicht erbracht werden.
Ein weiterer möglicher Reaktionsmechanismus ist der nukleophile Angriff einer
reduzierten Sulfhydrylgruppe von SynIscU auf den Schwefel des aktiven Cysteinrests
326 von IscS, der das von IscS gebildete Persulfid gebunden hat. Dadurch käme es
unter Ausbildung einer intermolekularen Disulfidbrücke intermediär zu einem IscS-
SynIscU-Heterodimer. Der als Persulfid an IscS gebundene Schwefel würde dadurch
reduziert und als Sulfid freigesetzt. Durch den nukleophilen Angriff der zweiten
Sulfhydrylgruppe von SynIscU auf die Disulfidbrücke könnte durch Bildung einer
intramolekularen Disulfidbrücke die intermolekulare Disulfidbrücke gespalten
werden und das Heterodimer getrennt werden. Eine genauere Besprechung der
Reaktionswege erfolgt in der Diskussion (siehe 4.3).
Um das zweite beschriebene Modell zu bestätigen oder zu widerlegen, wurden
„Single-Turnover“ Experimente mit IscS, SynIscU (bzw. den Varianten
SynIscUC44A bzw. SynIscUC47A) und Cystein durchgeführt.
Abb. 3-24: Analyse der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein. Die Analyse erfolgte über eine 12,5% SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot mit Anti-IscS- und Anti-IscU-Antikörpern. Die Proben wurden nach der angegebenen Zeit aus dem Reaktionsansatz entnommen und mit I-ADEANS versetzt. Die Auftragung auf das 12,5%ige SDS-Gel erfolgte mit SDS-Probenpuffer ohne Reduktionsmittel.
3 Ergebnisse
82
Dazu wurden, wie unter 2.4.12 beschrieben, ein molares Äquivalent IscS und
reduziertes SynIscU mit 2 Äquivalenten Cystein inkubiert. Nach bestimmten Zeiten
wurden Proben entnommen und die Reaktion durch die Zugabe von I-ADEANS
gestoppt. Die Analyse erfolgte durch eine SDS-PAGE mit anschließendem
Immunnachweis mit Antikörpern gegen SynIscU und IscS. Die Proben wurden ohne
Zugabe eines Reduktionsmittels auf das Gel aufgetragen.
Wie in Abb. 3-24 zu erkennen ist, kann im Laufe der Reaktion eine hochmolekulare
Bande nachgewiesen werden, die sowohl mit dem SynIscU- als auch mit dem IscS-
Antikörper reagiert. Diese Bande besitzt ein apparentes Molekulargewicht von ca.
57 kDa. Dies entspricht der Addition der apparenten Molekulargewichte von IscS
(48 kDa) und SynIscU (9 kDa). Nach 30 min ist diese Bande nur noch schwach zu
erkennen. Zu jedem analysierten Zeitpunkt kann nur ein kleiner Anteil beider
Proteine im Heterodimer nachgewiesen werden. Das beschriebene Heterodimer
konnte durch die Zugabe eines Reduktionsmittels gespalten werden (nicht gezeigt).
Dies zeigt, dass es während der Reaktion von IscS mit SynIscU und Cystein zur
Bildung eines intermediären IscS-SynIscU-Heterodimers kommt, das über eine
Disulfidbrücke miteinander verknüpft ist.
Analog zum WT-Protein wurden die Reaktion der Varianten SynIscUC44A und
SynIscUC47A analysiert. Dazu wurden die Varianten wie unter 2.4.12 beschrieben
mit IscS und Cystein inkubiert und nach 30 min eine Probe mit I-ADEANS versetzt.
Die Analyse erfolgte wiederum über einen Immunnachweis.
Wie in Abb. 3-25 zu erkennen ist, kann durch den Anti-SynIscU-Antikörper nach 30
min Reaktionszeit nur mit der Variante C47A eine signifikante Menge IscS-SynIscU-
Heterodimer nachgewiesen werden. Die entsprechende Bande zeigte auch eine
Reaktion mit dem Anti-IscS-Antikörper (nicht gezeigt). Auch bei der Analyse
Abb. 3-25: Analyse der Reaktion von IscS, Cystein und SynIscU/C44A/C47A nach 30 min durch eine SDS-PAGE mit anschließendem Westernblot mit einem Antikörper gegen SynIscU Die Reaktion wurde durch Zugabe von I-ADEANS gestoppt. Der Auftrag auf das 12,5%ige SDS-Gel erfolgte in Probenpuffer ohne Reduktionsmittel.
3 Ergebnisse
83
früherer Reaktionszeitpunke konnte keine Bildung eines IscS-SynIscUC44A-
Heterodimers nachgewiesen werden.
Dies demonstriert, dass das IscS-SynIscU-Heterodimer durch den Austausch des
Cysteins 47 gegen Alanin stabilisiert werden kann. Demnach erfolgt durch Cystein
44 der Angriff auf den aktiven Cysteinrest 326 von IscS, Cystein 47 ermöglicht
durch Reduktion der intermolekularen Disulfidbrücke die Abspaltung von IscS und
die Dissoziation des Heterodimers.
Zum Nachweis des von SynIscU und den Varianten aus IscS und Cystein
mobilisierten Sulfids, wurden 5 nmol IscS, 5 nmol reduziertes SynIscU bzw.
-Variante mit 10 nmol Cystein inkubiert und nach 2 Stunden das gebildete Sulfid
bestimmt.
Für die Reaktion mit SynIscU konnten 3,9 nmol Sulfid, für die Reaktion mit C47A
0,7 nmol Sulfid nachgewiesen werden. Nach der Reaktion der Variante C44A konnte
kein Sulfid nachgewiesen werden.
3.3.1.2 Untersuchungen zur Interaktion von SynIscU mit den NifS-
homologen Proteinen aus Synechocystis mit dem Hefe 2-Hybrid-System
Da für eine Übertragung des Schwefels von einem NifS-homologen Enzym auf
SynIscU eine direkte Protein-Interaktion nötig wäre, wurde nach mehreren
biochemischen Untersuchungen (Diplomarbeit, 2000) das Hefe 2-Hybrid-System für
den Nachweis dieser Interaktion gewählt. Dafür wurden die Gene für die drei NifS-
homologen Proteine und das SynIscU-Protein aus Synechocystis mittels PCR
amplifiziert und über die EcoRI und die XhoI Restriktionsschnittstellen in die
Plasmide für das Hefe 2-Hybrid System pEG202 und pJG4-5 kloniert. Die so
erhaltenen Plasmide wurden nach Kontrollrestriktionen und Sequenzierung
paarweise in Hefe transformiert.
Das Hefe 2-Hybrid System ermöglicht den Nachweis einer direkten Protein-Protein-
Interaktion durch verschiedene Reportersysteme. Für die Aktivierung der LexA-
DNA-Bindedomäne ist eine Interaktion mit der azidischen Aktivierungsdomäne B42
nötig, die nur dann erfolgt, wenn die beiden an diese Domänen fusionierten Proteine
interagieren und so die DNA-Bindedomäne und die Aktivierungsdomäne in
räumliche Nähe gebracht werden. Bei den Reportergenen handelt es sich um das in
das Hefechromosom integrierte leu2-Gen und das episomal kodierte lacZ-Gen, die
beide unter der Kontrolle mehrerer LexA-Promotoren transkribiert werden. Bei
3 Ergebnisse
84
Transkription des leu2-Reportergens wird die Leucin-Auxotrophie des Stamms
EGY48 aufgehoben. Auf X-Gal-haltigem Medium kommt es durch die Expression
der β-Galactosidase zu einer Blaufärbung der Kolonien.
Tabelle 3-2 führt die in den Stamm EGY48/pSH18-34 transformierten
Plasmidkombinationen und die erhaltenen Reaktion auf Leucin-freiem Medium und
Medium mit X-Gal bei Wachstum im glukosefreien Raffinose/Galaktose-Medium
auf. Auf Medien, die Glukose als Kohlenstoffquelle enthielten, kam es zu keiner
Blaufärbung der Hefekolonien auf X-Gal-haltigen Platten und zu keinem Wachstum
auf Leucin-freien Platten, da die Transkription der Gene in den pJG4-5-Derivaten
durch den durch Glukose reprimierten GAL4-Promotor erfolgt.
Tabelle 3-2: Mit dem Hefe 2-Hybrid-System untersuchte Interaktionen mit
Raffinose/Galaktose-Medium
+: Wachstum auf Leucin-freiem Medium
+: Blaufärbung auf X-Gal enthaltenden Platten
n : nicht untersucht Interaktion Selbst-
aktivierung
pJG- ISCS
pJG-Sll0704
pJG-Slr0077
pJG- ISCU pJG4-5
pEG- ISCS + + n n n n - - - - pEG-
Sll0704 n n + + n n - - - - pEG-
Slr0077 n n n n - - - - - -
Interaktion
pEG- ISCU - - - - - - - - - -
Selbstaktivierung pEG202 - - - - - - - - n n
Keines der drei NifS-homologen Proteine (IscS, Sll0704 und Slr0077) interagiert im
Hefe 2-Hybrid Test mit SynIscU. Keines der Reportergene wurde aktiviert. Dies war
unabhängig vom Fusionspartner, da beide möglichen Interaktionsrichtungen
untersucht wurden (pEG-ISCS/Sll0704/Slr0077 mit pJG-ISCU und pEG-ISCU mit
pJG-IscS/Sll0704/Slr0077).
Positive Interaktionssignale konnten hingegen für die Interaktion von IscS und
Sll0704 mit sich selbst erhalten werden (pEG-ISCS mit pJG-ISCS, pEG-Sll0704 mit
pJG-Sll0704). Diese NifS-homologen Proteine liegen somit mindestens als Dimer
vor. Eine Selbstaktivierung der LexA-Bindedomäne durch das fusionierte Protein
3 Ergebnisse
85
ohne den Interaktionspartner konnte nicht beobachtet werden. Bei den
nachgewiesenen Interaktionen handelt es sich echte Protein-Protein-Interaktionen.
Eine Dimerisierung von Slr0077 (pEG-Slr0077 mit pJG-Slr0077) konnte hingegen
nicht nachgewiesen werden.
Auch Dimerisierung von SynIscU konnte nicht nachgewiesen werden (pEG-ISCU
mit pJG-ISCU).
3.3.2 Untersuchungen zur Rolle von SynIscU als potentielle FeS-
Assemblierungsplattform
3.3.2.1 Rekonstitution des FeS-Zentrums von SynIscU
Bei der Expression und Reinigung von SynIscU konnte unter allen untersuchten
Bedingungen kein SynIscU erhalten werden, das ein Absorptionsspektrum besaß,
welches auf ein gebundenes FeS-Zentrum hindeutete. Das isolierte Protein wies
lediglich die übliche Proteinabsorption auf (Abb. 3-26).
Daher wurde versucht, am gereinigten Protein analog zu IscA ein FeS-Zentrum zu
rekonstituieren. Nach Optimierung der Rekonstitutionsbedingungen konnte durch
Inkubation von SynIscU mit IscS, Cystein und Eisenammoniumsulfat nach
Reinigung durch Gelfiltration ein Protein erhalten werden, dessen
Absorptionsspektrum auf ein gebundenes FeS-Zentrum hindeutete (Abb. 3-27).
300 400 5000,00
0,05
0,10
0,15
0,20
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
Abb. 3-26: Absorptionsspektrum von gereinigtem SynIscU Die Proteinkonzentration betrug 50 µM in 20 mM HEPES/NaOH, pH 8,0.
3 Ergebnisse
86
Das Absorptionsspektrum des rekonstituierten SynIscU besitzt Absorptionsmaxima
bei 278, 325, 420 (mit einer Schulter bei 470) und 570 nm. Dies deutet auf ein
gebundenes [2Fe2S]-Zentrum hin.
3.3.2.2 Charakterisierung des FeS-Zentrums an SynIscU
Zur Untersuchung des FeS-Zentrums von SynIscU wurde eine Probe für die
Mössbauer-Spektroskopie rekonstituiert.
Das erhaltene Nullfeld-Mössbauerspektrum (Abb. 3-28) von SynIscU bei 80 K kann
in zwei Anteile zerlegt werden. Der Hauptanteil des Spektrums mit 61,1 % wird
durch ein Duplett mit einer Isomerieverschiebung von δ=0,28 mm/s und einer
Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ = 0,61 mm/s gebildet. Dieses Mössbauer-Duplett
ist wie das von IscA1 typisch für Fe(III)-Ionen, die ausschließlich von
Schwefelliganden umgeben sind, d.h. dass diese Fe-Ionen in einem symmetrisch
aufgebauten FeS-Zentrum befinden, das von vier Cysteinseitenketten ligiert ist.
Zusammengenommen mit dem Absorptionsspektrum zeigt dies ein [2Fe2S]2+-
Zentrum an SynIscU an.
Das zweite Subspektrum (38,9 %) mit einer Isomerieverschiebung δ=0,54 mm/s und
einer Quadrupol-Aufspaltung von ∆EQ = 0,75 mm/s wird wieder als präzipitierte
Eisen(III)-Aggregate interpretiert.
300 400 500 600 700 8000,0
0,2
0,4
0,6Ab
sorp
tion
Wellenlänge [nm]
Abb. 3-27: Absorptionsspektrum des rekonstituierten SynIscU Die Proteinkonzentration in der Probe betrug 50 µM in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 10 % Glycerin. Die Spektren wurden unter Argonatmosphäre aufgenommen
3 Ergebnisse
87
Das von SynIscU assemblierte FeS-Zentrum ist aerob und anaerob instabil. In
Anwesenheit von Sauerstoff kommt es wie bei IscA1 zu einem schnellen Zerfall des
gebundenen FeS-Zentrums. Auch in Anwesenheit eines Reduktionsmittels konnte
das FeS-Zentrum von SynIscU unter anaeroben Bedingungen im Gegensatz zum
FeS-Zentrum von IscA1 nur partiell stabilisiert werden. Durch Zugabe von 10 %
(v/v) Glycerin, 50 mM KCl, 125 mM NaCl und 5 mM DTT in 50 mM
HEPES/NaOH, pH 8,0 wurde das Zentrum soweit stabilisiert, dass nach einer Stunde
bei Raumtemperatur als Maß für die Anwesenheit eines gebundenen FeS-Zentrums
ca. 80 % der Absorption bei 420 nm erhalten blieben.
3.3.2.3 Versuche zur Übertragung des FeS-Zentrums
Neben der Bindung eines FeS-Zentrums sollte überprüft werden, ob SynIscU in der
Lage ist das gebundene FeS-Zentrum auf andere Apo-FeS-Proteine zu übertragen.
Dazu wurde zunächst die Übertragung des FeS-Zentrums von SynIscU auf
Apoferredoxin untersucht. Dabei wurde ein molares Äquivalent Apoferredoxin mit
zwei molaren Äquivalenten rekonstituiertem SynIscU für eine Stunde unter
anaeroben und reduzierenden Bedingungen inkubiert. Die Pufferbedingungen (50
mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl, 5 mM DTT, 10 (v/v)
Glycerin) entsprachen dabei den Bedingungen unter denen das FeS-Zentrum von
SynIscU stabilisiert werden konnte.
-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4
0,970
0,975
0,980
0,985
0,990
0,995
1,000
Fe3+
[2Fe2S]2+
SynIscU
Rel
ativ
e Tr
ansm
issi
on
Geschwindigkeit [mm/s]
Abb. 3-28: Nullfeld – Mössbauerspektrum von SynIscU bei 80 K Die Konzentration der Probe betrug ca. 0,4 mM in 50 mM HEPES/NaOH, pH 8,0, 50 mM KCl, 125 mM NaCl. In Zusammenarbeit mit Dr. E. Bill, MPI für Strahlenchemie, Mülheim
3 Ergebnisse
88
Wie in Abb. 3-29 zu erkennen wurden in einer Stunde 80 – 90 % des eingesetzten
Apoferredoxins in Holoferredoxin umgewandelt. Dies ist ein weitaus größerer
Umsatz als der Anteil des spontanen Zerfalls von Holo-SynIscU unter den
beschriebenen Bedingungen. Daraus ist zu erkennen, dass SynIscU in der Lage ist
das gebundene [2Fe2S]-Zentrum auf Ferredoxin zu transferieren. Die Untersuchung
der Kinetik der Reaktion (Abb. 3-30) ergab, dass bereits nach 2 min ca. 10 % und
nach 10 min ca. 50 % des eingesetzten Ferredoxins in die Holo-Form umgewandelt
wurde. Nach einer Stunde war die Reaktion abgeschlossen.
Zur Untersuchung einer möglichen Reaktivierung der Apo-C. roseus-APS-Reduktase
durch Inkubation mit Holo-SynIscU wurden die Apo-C. roseus-APS-Reduktase und
Holo-SynIscU analog zu den Untersuchungen mit IscA1 inkubiert. Bei gleichzeitiger
Aktivierung durch Holo-IscA1 konnte keine signifikante Aktivierung durch Holo-
SynIscU nachgewiesen werden.
Abb. 3-30: Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-SynIscU auf Apoferredoxin analysiert über eine nicht-denaturierende PAGE Gezeigt ist nur die Holoferredoxin-Bande, gefärbt mit Stains All
Abb. 3-29: Analyse des Übertragungsansatzes mit Holo-SynIscU und Apoferredoxin über eine 20%ige nicht-denaturierende PAGE 1: Holo-Fd 2: Apo-Fd 3: Übertragungsansatz gefärbt mit Stains All, SynIscU wird im mit Stains All gefärbten Gel nicht angefärbt.
3 Ergebnisse
89
Als weiteres Modellprotein für die Übertragung der FeS-Zentren von Holo-SynIscU
auf Apo-[4Fe4S]-Proteine wurde die Reaktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase
untersucht (Abb. 3-31). Die ereichte Reaktivierung lag bei 18,2 % der Reaktivierung
durch Holo-IscA1. Durch Zugabe eines dreifachen Überschusses an Holo-SynIscU –
Dimer lag die Aktivierung der PAPS-Reduktase bei 27,4 % der Reaktivierung durch
Holo-IscA1.
3.4 Charakterisierung der Biogenese von FeS-Zentren in vivo -
Erzeugung von Deletionsstämmen
3.4.1 iscA1
3.4.1.1 Erzeugung einer Insertionsmutante
Zur Erzeugung einer Insertionsmutante wurde das Plasmid pISCA1+::Gm in
Synechocystis PCC 6803 transformiert (2.2.4.3). Das mit 5’- und 3’- flankierenden
Bereichen in das Plasmid klonierte iscA1-Gen ist durch eine Gentamycin-
Resistenzkassette unterbrochen. Transformation von pISCA1+::Gm in Synechocystis
PCC 6803 Wildtyp führte zu Gentamycin-resistenten Transformanden. Durch
sukzessive Erhöhung der Gentamycinkonzentration bei jedem Zellausstrich sollte
erreicht werden, dass die eingeführte Gentamycin-Resistenzkassette in allen Kopien
des Genoms eingeführt wird.
Abb. 3-31: Aktivierung der B. subtilis PAPS-Reduktase durch Holo-WT-IscA1 und SynIscU In Zusammenarbeit mit C. Berndt, AG Schwenn, Ruhr-Universität, Bochum
100
18,227,4
0
20
40
60
80
100
120
IscA1 SynIscU 3 x SynIscU
% d
er R
eakt
ivie
rung
dur
ch
Hol
o-Is
cA1
3 Ergebnisse
90
Beim Erreichen der maximal tolerierten Gentamycinkonzentration von 70 µg/ml
wurde genomische DNA aus dem erzeugten Stamm isoliert (2.3.12) und die
Integration der Resistenzkassette mittels PCR (2.3.13) überprüft.
In mehreren Versuchen konnte keine vollständig segregierte iscA1-Insertionsmutante
erhalten werden.
3.4.1.2 Expression von IscA1 im Synechocystis-WT
Zur Überprüfung der Expression von IscA1 und zum Nachweis, wie stark IscA1
exprimiert wird, wurde IscA1 in löslichem Proteinextrakt durch Immundetektion
nachgewiesen und die Stärke des Signals über Standards mit gereinigtem IscA1
quantifiziert.
Abb. 3-32 zeigt einen Immunnachweis von IscA1 in der löslichen Fraktion des
Synechocystis-Extrakts (Bahn 4). IscA1 wird in Synechocystis exprimiert und
repräsentiert in etwa 0,025 % der löslichen Proteine.
3.4.2 iscA2
3.4.2.1 Erzeugung einer Deletionsmutante
Zur Deletion von iscA2 (slr1565) wurde das Plasmid pISCA2+Sm in Synechocystis
transformiert (2.2.4.3). Das Plasmid enthält einen Teil des iscA2-Gens mit
flankierenden 5’- und 3’- Bereichen. Ein großer Teil des Gens und ein Teil des 5’-
flankierenden Bereichs wurde (BstEII/HpaI) herausgeschnitten und durch eine
Spectinomycin-Resistenzkasette ersetzt.
Der transformierte Stamm wurde auf Medium mit Spectinomycin ausgestrichen und
die Spectinomycin-Konzentration bei jedem neuen Ausstrich erhöht. Beim Erreichen
von 50 µg/ml Spectinomycin im Medium wurde die genomische DNA aus dem
erzeugten Stamm isoliert (2.3.12) und die Deletion von iscA2 mit einer PCR (2.3.13)
überprüft. Als PCR-Primer wurden Oligonukleotide gewählt, deren komplementäre
Sequenzen im 5’- und 3’- flankierenden Bereich von iscA2 zu finden sind.
Abb. 3-33 zeigt die Analyse der Kontroll-PCR zur Segregation. Im Wildtyp (Bahn 2)
wurde ein ca. 600 bp großes Fragment amplifiziert. Dies entspricht der Größe des
Abb. 3-32: Westernblot (anti-IscA1-AK) mit gereingtem IscA1 und Synechocystis-Extrakt. 1: 7,5 ng gereinigtes IscA1 2: 15 ng gereinigtes IscA1 3: 30 ng gereinigtes IscA1 4: 60 µg löslicher Synechocystis Extrakt
3 Ergebnisse
91
iscA2-Gens inklusive flankierender Bereiche. In der Mutante wurde ausschließlich
ein Fragment mit einer Größe von ca. 2,3 kbp amplifiziert. Dies entspricht der
erwarteten Größe für das Fragment der im Gen inserierten Resistenzkassette
inklusive und flankierender 5’- und 3’-Bereiche.
In weiteren PCR-Kontrollen konnte mit der iscA2::Sm-DNA auch mit kurzer
Anlagerungszeit kein Fragment amplifiziert werden, das der Größe des WT-Gens
entsprach. 1/10 der in Ansatz 2 eingesetzten DNA-Menge konnte gemischt mit
iscA2::Sm-DNA nachgewiesen werden.
Zum Nachweis der Segregation der Mutante auch auf Proteinebene, wurden die
löslichen Proteine von Wildtyp und iscA2::Sm isoliert und IscA2 durch einen
Westernblot nachgewiesen.
Wie in Abb. 3-34 zu erkennen, kann IscA2 durch einen spezifischen Antikörper in
der löslichen Proteinfraktion des Deletionsstammes nicht mehr nachgewiesen
werden.
In der löslichen Proteinfraktion des Wildtyps kann IscA2 nachgewiesen werden. Eine
Quantifizierung ergab, dass IscA2 ca. 0,02 % der löslichen Proteine von
Synechocystis entsprach.
Abb. 3-33: Analyse der Kontroll-PCR zur Segregation der Mutante iscA2::Sm über ein Agarosegel (1%) M: λ EcoRI/HindIII-Standard 1: Kontrolle ohne genomische DNA 2: PCR mit WT-DNA 3: PCR mit iscA2::Sm-DNA Primer: PRiscA2+3, PRiscA2+4 30 Zyklen aus 94°C , 30’’ Denaturierung 58°C, 60’’ Anlagerung 72°C, 2,5’ Verlängerung
Abb. 3-34: Westernblot (anti-IscA2-AK) mit löslichem Synechocystis-Extrakt. 1: 30 µg löslicher WT-Extrakt 2: 30 µg löslicher iscA2::Sm-Extrakt
3 Ergebnisse
92
3.4.2.2 Wachstum des Stamms iscA2::Sm
Das erste Kriterium zur Untersuchung der Auswirkung der Deletion ist der Vergleich
des Wachstums von Synechocystis-WT und dem Stamm iscA2::Sm. Dazu wurde die
Wachstumsphase der Stämme wie unter 2.2.3.2 beschrieben synchronisiert und nach
den angegebenen Zeitpunkten Proben entnommen und die OD730 bestimmt. Es wurde
das Wachstum unter photoautotrophen Bedingungen im Hochlicht und unter
photomixotrophen Bedingungen im Niedrig- und Hochlicht untersucht. Das
Wachstum der Mutante iscA2::Sm ist wie in Abb. 3-35 gezeigt, unter allen getesteten
Bedingungen ähnlich dem Wachstum des Wildtyps. Unter photomixotrophen
Bedingungen erreicht die Mutante eine höhere Dichte als der Wildtyp. Unter
photoautotrophen Bedingungen im Schwachlicht wuchsen WT und iscA2::Sm nur
Abb. 3-35: Vergleich des Wachstums von WT und iscA2::Sm bei 30°C
PM-HL: BG11 + 5 mM Glukose, 50 µE Licht PA-HL: BG11, 50 µE Licht PM-NL: BG11 + 5 mM Glukose, 5µE Licht
0 20 40 60 80 1000
1
2
3
4
5
6
PM-HL
OD
730
Zeit [h]
WT iscA2::Sm
0 20 40 60 80 100 120 140
0
1 PA-HL
OD 73
0
Zeit [h]
WT iscA2::Sm
0 20 40 60 80 100 1200
1
2
3
PM-NL
OD 73
0
Zeit [h]
WT iscA2::Sm
3 Ergebnisse
93
sehr langsam. Nach 200 – 300 h kam es bei beiden Kulturen zum Absterben der
Zellen. Die Deletion des iscA2-Gens führt unter den getesteten Bedingungen zu
keinem gravierenden Wachstumsdefekt.
3.4.2.3 Verhältnis der Photosysteme
Da Photosystem I mit drei gebundenen [4Fe4S]-Zentren eines der wichtigsten FeS-
Proteine in Synechocystis darstellt, sollte untersucht werden, ob die Deletion von
iscA2 einen Einfluss auf das Verhältnis von Photosystem II zu Photosystem I hat.
Das Verhältnis von PS II zu PS I kann durch die Tieftemperatur-Fluoreszenz-
Spektroskopie (2.5.3) bestimmt werden. Zur direkten Anregung der Chlorophylle
wird Licht mit einer Wellenlänge von 435 nm verwendet, die Anregung der
Phycobillisomen erfolgt bei 580 nm. Die gemessenen Spektren von WT und
640 660 680 700 720 740 760
1
2
3
4
5
6 A
rel.
Fluo
resz
enz
Wellenlänge [nm]
WT iscA2::Sm
640 660 680 700 720 740 7600
1
2
3
4
5
6 B
rel.
Fluo
resz
enz
Wellenlänge [nm]
WT iscA2::Sm
640 660 680 700 720 740 760
1
2
3
4
5
6C
rel.
Fluo
resz
enz
Wellenlänge [nm]
WT iscA2::Sm
640 660 680 700 720 740 7600
1
2
3
4
5
6 Dre
l. Fl
uore
szen
z
Wellenlänge [nm]
WT iscA2::Sm
Abb. 3-36: 77K-Fluoreszenzemissionsspektren von WT und iscA2::Sm A: Anzucht photomixotroph im Hochlicht; Anregung bei 435 nm (Chlorophyll), Normierung 725 nm B: Anzucht photomixotroph im Hochlicht; Anregung bei 580 nm (Phykobillisomen), Normierung 665 nm C: Anzucht photomixotroph im Schwachlicht; Anregung bei 435 nm (Chlorophyll), Normierung 725 nm D: Anzucht photomixotroph im Schwachlicht; Anregung bei 580 nm (Phykobillisomen), Normierung 665 nm
3 Ergebnisse
94
iscA2::Sm sind in Abb. 3-36 dargestellt. Die Anzucht der Zellen erfolgte unter
photomixotrophen Bedingungen im Hochlicht und Schwachlicht. Die
Fluoreszenzemissionen bei 650 nm und 665 nm stammen von den Pigmenten der
Phycobillisomen, die Emission bei einer Wellenlänge von 685 nm von dem
terminalen phycobillisomalen Emitter Allophycocyanin B und der äußeren Antenne
von PS II. Die Emission bei 695 nm lässt sich den von PS2 gebundenen
Chlorophyllen zuordnen, die Emission bei 725 nm den mit PS I assoziierten
Chlorophyllen (MEUNIER ET AL., 1997).
Bei den gemessenen Fluoreszenzemissionsspektren lässt sich bei Anregung bei
435 nm beim Stamm iscA2::Sm eine leichte Reduktion des PS II –Gehalts relativ zur
Menge an PS I feststellen. Dieser Effekt tritt sowohl bei Anzucht im Hochlicht als
auch bei Anzucht im Schwachlicht auf. Von einer Verringerung des PS I-Gehaltes
kann, da Wildtyp und iscA2::Sm in etwa den gleichen Chlorophyllgehalt aufweisen,
daher nicht ausgegangen werden.
Die bei Anregung bei 580 nm ermittelte Verteilung der Phycobillisomen ist bei
Wildtyp und iscA2::Sm nahezu identisch. Sie liegen als freie, nicht mit einem
Photosystem assoziierte Phycobillisomen (650 und 665 nm), an PS II assoziiert (685-
95 nm) und in geringerem Maße an PS I assoziiert vor.
3.4.2.4 Untersuchungen zur Expression und Aktivität von FeS-Proteinen
in iscA2::Sm
Abb. 3-37: Vergleich des Holo-Ferrdoxingehalts von WT und iscA2::Sm Analyse über eine 20 %ige nicht-denaturierende PAGE, Aufgetragen sind 150 µg der löslichen Proteinfraktion von WT (Bahn1) und iscA2::Sm (Bahn 2), Photomixoptrophe Anzucht der Zellen im HL
3 Ergebnisse
95
Die Auswirkung der Deletion von iscA2 auf weitere FeS-Proteine der Zelle sollte
untersucht werden.
Um den Gehalt von Ferredoxin im Wildtyp und in der Mutante zu vergleichen
wurden 150 µg löslicher Synechocystis-Proteinextrakt auf ein nicht denaturierendes
Gel aufgetragen und die Stärke der Holoferredoxin-Banden verglichen. Wie in Abb.
3-37 zu erkennen, ist der Holoferredoxinanteil in Wildtyp und Mutante etwa gleich.
Die [4Fe4S]-Aconitase katalysiert die Bildung von cis-Aconitat aus Isocitrat. Zum
Vergleich der Aconitaseaktivität wurde die Reaktion im löslichen Synechocystis-
Proteinextrakt wie unter 2.4.14 beschrieben gemessen.
Tabelle 3-3: Vergleich der Aconitaseaktivität im Rohextrakt (Anzucht photomixotroph, HL)
Wildtyp iscA2::Sm Steigung OD240 / min 0,026 0,02
Aktivität [nmol / min x mg] 57 44 Aktivität [%] 100 77
Die Mutante weist nur 77 % der Aconitaseaktivität des Wildtyps auf (Tab. 3-3).
Ausgehend von diesen Ergebnissen ist kein signifikanter Einfluss der Deletion von
iscA2 auf die Expression und Aktivität von FeS-Proteinen festzustellen.
3.4.2.5 Einfluss der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt
IscA-homologe Proteine sind häufig im bakteriellen suf-Operon kodiert, das unter
Eisenmangel verstärkt exprimiert wird (PATZER & HANDTKE, 1999). Daher sollte die
Auswirkungen der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt der Zelle untersucht
werden.
Unter Eisenmangel kommt es bei Cyanobakterien zu einer Ausbildung einer Antenne
um das Photosystem I. Diese besteht aus 18 IsiA-Untereinheiten, die jeweils 180
Chlorophylle binden (BIBBY ET AL., 2001, BOEKEMA ET AL., 2001). Dies führt zu einer
Blauverschiebung des Absorptionsspektrums der Zelle und zu einer Änderung der
Fluoreszenzemission bei 77K.
Um Effekte der Deletion von iscA2 auf den Eisenhaushalt zu untersuchen, wurden
die Zellen unter Eisenmangel photoautotroph im Hochlicht angezogen und die
Reaktion der Zelle durch UV/Vis- und Tieftemperaturfluoreszenz-Spektroskopie
untersucht.
3 Ergebnisse
96
In der UV/Vis-Spektroskopie (Abb. 3-38) konnte bei Anzucht unter Eisenmangel-
bedingungen eine Blauverschiebung der Chlorophyll-Absorption beobachtet werden.
Das Absorptionsmaximum verschob sich bei unter Eisenmangel angezogenen Zellen
von 683 nm auf 677 nm.
Im Vergleich von WT und iscA2::Sm ist allerdings kein signifikanter Unterschied in
der Absorption zu erkennen. Zur weiteren Untersuchung wurden
Fluoreszenzemissionsspektren aufgenommen. Unter Eisenmangel ist beim Wildtyp
und bei der Mutante eine Erhöhung der Fluoreszenz bei 685 nm zu beobachten. Dies
ist auf die Bildung der IsiA-Antenne um das PS I zurückzuführen. Beim Stamm
iscA2::Sm ist diese Reaktion gegenüber dem Wildtyp verstärkt. Dies demonstriert,
dass die Mutante eher eine stärkere Eisenmangelreaktion zeigt als der Wildtyp.
Das Wachstum der Mutante ist bei Anzucht unter Eisenmangel unter
photoautotrophen Bedingungen nicht verlangsamt. Auch ist kein Unterschied in der
maximal erreichten Zelldichte festzustellen.
Abb. 3-38: links: Absorptionsspektren von Synechocystis WT und iscA2::Sm-Zellen in BG11 +/- Fe. rechts: 77K-Fluoreszenzspektren von Synechocystis WT und iscA2::Sm in BG11 +/- Fe. Die Anzucht erfolgte in BG11 +/– Fe unter photoautotrophen Bedingungen im Hochlicht bis zu einer OD730 von ca. 0,9. Die Proben für die Absorptionsspektren wurden 1:2 mit BG11-Medium verdünnt. Die Fluoreszenz-Spektren sind auf die Fluoreszenz bei 725 nm normiert.
600 700 8000,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Abso
rptio
n
Wellenlänge [nm]
WT - Fe iscA2::Sm - Fe WT + Fe iscA2::Sm + Fe
640 660 680 700 720 740 760
1
2
3
4
5
6
7
rel.
Fluo
resz
enz
Wellenlänge [nm]
WT - Fe iscA2::Sm - Fe WT + Fe iscA2::Sm + Fe
3 Ergebnisse
97
3.4.3 syniscU
Zur Bestimmung des Expressionsniveaus von SynIscU in Synechocystis, wurden
30 µg löslicher Synechocystis-Extrakt und bestimmte Mengen gereinigtes SynIscU
über ein SDS-Gel aufgetrennt und SynIscU mit einem spezifischen Antikörper
nachgewiesen.
Wie in Abb. 3-39 gezeigt, kann SynIscU in Synechocystis-Extakt immunologisch
nachgewiesen werden. 30 µg Synechocystis-Extrakt enthalten 5 –10 ng SynIscU,
damit repräsentiert SynIscU ca. 0,015 - 0,03 % der löslichen Proteine von
Synechocystis.
Versuche syniscU (sll2667) zu deletieren, hatten nie vollständig segregierte
Mutanten ergeben (SEIDLER ET AL., 2001).
Abb. 3-39: Westernblot (anti-SynIscU-AK) mit gereingtem SynIscU und Synechocystis-Extrakt. 1: 5 ng gereinigtes SynIscU 2: 10 ng gereinigtes SynIscU 3: 20 ng gereinigtes SynIscU 4: 30 µg löslicher Synechocystis Extrakt
4 Diskussion
98
4 Diskussion
4.1 Charakterisierung von IscA1 (Slr1417) - IscA1, die
Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ?
IscA-homologe Proteine sind in vielen eukaryotischen und prokaryotischen
Organismen verbreitet. Die entsprechenden Gene sind dabei im nif-, isc- und suf-
Operon lokalisiert (TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002)
In Synechocystis PCC 6803 ist die Rolle von IscA-homologen Proteinen besonders
interessant, da ein Gen für Protein mit Ähnlichkeit zu IscU fehlt, obwohl diese
Domäne in nahezu allen Organismen verbreitet ist (HWANG ET AL., 1996).
4.1.1 Expression, Reinigung und Charakterisierung von Apo-IscA1
IscA1 (Slr1417) von Synechocystis konnte mit Hilfe des T7-Expressionsystems als
lösliches Protein in E. coli exprimiert und durch Fällungs- und zwei Säulenchromato-
graphieschritte bis zur Homogenität gereinigt werden.
Isoliertes IscA1 bindet kein FeS-Zentrum und auch kein Eisen, wie durch Eisen- und
Sulfidbestimmung des Proteins gezeigt wurde. Eine Eisenbindung von IscA1
(Slr1417) war aufgrund der Absorption des isolierten Proteins bei 330 nm vermutet
worden. Untersuchungen an A. vinelandii NifIscA (KREBS ET AL., 2001) ergaben, dass
IscA zwar in der Lage ist Eisen zu binden, dies aber mit geringer Affinität. Die
Modifikation von IscA1, wodurch im Absorptionsspektrum eine Absorption bei 330
nm auftritt, ist kovalent mit dem Protein verknüpft.
Da die Varianten C110A und C112A, die in vitro nicht in der Lage sind ein FeS-
Zentrum zu binden, diese Absorption nicht aufweisen, könnte eine mögliche Ursache
für die Absorption bei 330 nm die Bindung eines FeS-Zentrums in E. coli sein, das
während der Reinigung verloren geht und dabei das Protein oxidativ modifiziert. Für
diese Hypothese spricht das Auftreten einer zusätzlichen Masse von + 95 Da in der
Massenspektrometrie, was dem ungefähren Gewicht von 6 Sauerstoffatomen und
damit der Massendifferenz von zwei zur Cysteinsäure oxidierten Cysteinseitenketten
entspricht. Das Absorptionsspektrum von Cysteinsäure zeigt allerdings keine
Absorption bei 330 nm. Daher ist durch diese vermutete Oxidation die Schulter bei
330 nm nicht zu erklären. Die Frage nach Art der eventuell auftretenden
Oxidationsprodukte, die die Absorption bei 330 nm bedingen, ist daher noch offen.
4 Diskussion
99
4.1.2 Das FeS-Zentrum von IscA1
Durch Inkubation von IscA1 mit Eisen, Cystein und IscS (Slr0387) von
Synechocystis konnte unter reduzierenden und anaeroben Bedingungen ein FeS-
Zentrum an IscA1 assembliert werden. Die Bindung eines FeS-Zentrums von IscA-
Proteinen konnte bisher für IscA aus E. coli, NifIscA (Orf6) aus A. vinelandii und für
Isa1 aus Schizosaccharomyces pombe beobachtet werden (KREBS ET AL., 2001;
OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001; WU ET AL., 2002a).
Untersuchungen des gebundenen FeS-Zentrums durch EPR- und Mössbauer-
Spektroskopie ergaben, dass IscA1 von Synechocystis ein [2Fe2S]2+-Zentrum bindet,
das wahrscheinlich durch vier Cystein-Liganden koordiniert wird. Dieser
diamagnetische Zustand ist der einzig stabile Zustand des Zentrums. Alle Versuche
das Zentrum zu reduzieren oder zu oxidieren waren erfolglos.
Im Gegensatz zu den Untersuchungen von KREBS ET AL. (2001) an A. vinelandii NifIscA konnte keine Assemblierung eines [4Fe4S]-Zentrums an IscA1 von
Synechocystis beobachtet werden. Ob dieser Unterschied ein Unterschied genereller
Natur zwischen den IscA-Proteinen aus den beiden Organismen ist oder ein
Unterschied der experimentellen Bedingungen darstellt, ist unklar. Unter den für die
Rekonstitution des FeS-Zentrums von NifIscA aus A. vinelandii verwendeten
Bedingungen durch NifS (8 mM Cystein, kein Reduktionsmittel), war im Fall von
Synechocystis IscA1 mit IscS (Slr0387) nur sehr geringe Rekonstitution des FeS-
Zentrums zu beobachten. Dies kann dadurch bedingt sein, dass es sich bei der
Reaktion von NifS und NifIscA von A. vinelandii um eine enzymatische
Rekonstitution handelt, bei der zwei Enzyme interagieren. Die entsprechenden Gene
sind in einem Operon lokalisiert und werden kotranskribiert (JACOBSON ET AL.,
1989).
Ob es sich bei der Rekonstitution des FeS-Zentrums von IscA1 von Synechocystis
mit IscS und Cystein um eine solche enzymatische Rekonstitution handelt, konnte
nicht endgültig geklärt werden. Eine chemische Rekonstitution von IscA1 mit Sulfid
und Eisen war ebenfalls möglich und kinetisch ähnlich. Daher kann es sein, dass das
von IscS aus Cystein unter reduzierenden Bedingungen mobilisierte Sulfid in dieser
Form in das FeS-Zentrum inkorporiert wird, ohne dass es zu einer direkten Protein-
Protein-Interaktion kommt. Zudem ist es aufgrund meist fehlender Operonstrukturen
in Synechocystis, die einen Hinweis auf die Reaktionspartner eines
Biogenesesystems geben könnten, unklar, ob es sich bei IscA1 und IscS um
4 Diskussion
100
Reaktionspartner in vivo handelt oder ob ein anderes der insgesamt drei NifS-
homologen Proteine aus Synechocystis diesen Reaktionspartner darstellt.
Holo-IscA1 liegt in verschiedenen Oligomerisationsformen vor. Neben einer dimeren
Form, konnte auch eine tetramere Form beobachtet werden. Monomeres Holo-IscA1
hingegen konnte nie beobachtet werden. Die Absorptionsspektren des Dimers und
des Tetramers von Holo-IscA1 unterscheiden sich leicht in der Ausprägung der
Absorptionsmaxima. Diese Unterschiede deuten auf eine durch die unterschiedliche
Oligomerisierung veränderte Mikroumgebung des FeS-Zentrums hin. NifIscA aus A.
vinelandii ist ein Homodimer (KREBS ET AL., 2001), WU ET AL. (2002) beobachteten
für Holo-Isa1 aus S. pombe ebenfalls hochmolekulare Formen. Apo-IscA1 aus
Synechocystis liegt hauptsächlich als Monomer vor. Allerdings ist die Abweichung
des bestimmten Molekulargewichts für das Monomer zum berechneten Gewicht
recht groß. Dieses Laufverhalten könnte darauf hindeuten, dass es sich beim
Monomer um eine Form handelt, die große hydrophobe Oberflächen exponiert hat.
Ob Apo-IscA1 in vivo auch als Monomer vorliegt oder dies durch die
experimentellen Bedingungen, wie die starke Reduktion des Proteins vor dem
Auftragen auf die Säule, bedingt wird, muss noch genauer untersucht werden.
Um die Liganden des [2Fe2S]-Zentrums zu ermitteln, wurde mit Hilfe ortsgerichteter
Mutagenese Varianten von IscA1 hergestellt. Alle Cystein-Alanin-Austausche der
Cysteine 34, 44 und 75, einzeln oder in Kombination, verhinderten nicht die Bindung
eines FeS-Zentrums.
Bei der Variante C44A, bei der das dritte hoch konservierte Cystein gegen Alanin
ausgetauscht wurde, war das Maß der Rekonstitution geringer als beim Wildtyp-
Protein. In Saccharomyces cerevisiae ist die entsprechende Aminosäure für die
Funktion von ISA1 essentiell (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL., 2000).
Untersuchung der rekonstituierten Variante C44A mit Hilfe der Mössbauer-
Spektroskopie zeigte klar die Bindung eines [2Fe2S]2+-Zentrums. Allerdings war der
Anteil an Fe(III)-Aggregaten (δ = 0,50 mm/s) bei dieser Variante wesentlich größer
als der beim Wildtyp-Protein. Der Grund dafür scheint in der Kinetik der
Assemblierung des FeS-Zentums der Variante C44A zu liegen. Diese erscheint im
Vergleich zum Wildtyp-Protein verlangsamt. KREBS ET AL. (2001) hatten vermutet,
dass eines der drei konservierten Cysteine eine Rolle bei der Assemblierung spielt
4 Diskussion
101
und dieses ein am aktiven Cysteinrest von NifS gebildete Persulfid reduziert. Da
aber, wie oben diskutiert, der Mechanismus der Assemblierung des FeS-Zentrums an
IscA1 offen ist, kann eine Beteiligung des Cysteins 44 daran nicht endgültig
bewiesen werden. Zudem bietet das Modell von KREBS ET AL. nur im Bezug auf die
Biogenese von [2Fe2S]-Zentren eine Erklärungsmöglichkeit für die Biogenese eines
FeS-Zentrums ohne exogenes Reduktionsmittel. Die beobachtete Bildung von
[4Fe4S]-Zentren an NifIscA erklärt das Modell nicht.
Neben der beobachteten verlangsamten Assemblierung des FeS-Zentrums an der
Variante C44A, konnte eine Beteiligung dieser Aminosäure beim Transfer des FeS-
Zentrums auf Apo-[4Fe4S]-Zentren gezeigt werden, was später diskutiert werden
soll.
Die Variante C75A assembliert verglichen mit dem IscA1-Wildtyp ebenfalls weniger
FeS-Zentren. Interessanterweise erscheint die Variante C34/75A im Vergleich zum
Wildtypprotein leicht besser rekonstituiert. Das Mössbauerspektrum der Variante
C34/75A zeigt auch keinen Anteil an Eisen(III)-Aggregaten, was die verbesserte
Bindung der FeS-Zentren nochmals untermauert. Da die verminderte Rekonstitution
der Variante C75A durch die Einführung einer weiteren Mutation reversibel ist,
scheint eine direkte Beteiligung des Cysteins 75 an der Stabilisierung oder
Assemblierung des FeS-Zentrums unwahrscheinlich. Möglicherweise bilden C34
und C75 einen Mechanismus, der die Assemblierung oder die Übertragung des FeS-
Zentrums bei IscA1 reguliert. Daher könnte C34 die Assemblierung des FeS-
Zentrums inhibieren oder dessen Bindung schwächen. Dem Cystein C75 käme dabei
eine Rolle als Antagonist der Funktion von C34 zu. Weitere Experimente sind nötig
um diesen Mechanismus aufzuklären
Bei diesen pflanzenspezifischen Cysteinresten könnte auch ein Ansatzpunkt für eine
Regulation im Chloroplasten/Cyanobakterium durch das Thioredoxin-System liegen
und so eine Verknüpfung der Biogenese von FeS-Zentren mit dem Redoxzustand der
Zelle erfolgen.
Die Varianten mit einem Austausch eines der C-terminalen hochkonservierten
Cysteine C110 oder C112 waren klar nicht mehr in der Lage ein FeS-Zentrum zu
binden.
Die Ergebnisse der Charakterisierung der IscA1-Varianten, die Ergebnisse der
Mössbauer-Spektroskopie, die komplette Cystein-Ligation des FeS-Zentrums
4 Diskussion
102
indizieren, und die Ergebnisse der Gelfiltration implizieren ein Modell für Holo-
IscA1 mit einem [2Fe2S]2+-Zentrum pro Protein-Dimer. Dabei stellt ein Protomer
mit den Cysteinresten C110 und C112 je zwei Liganden (Abb. 4-1)
Diese Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen von KREBS ET AL. (2001) für die
[2Fe2S]2+-Form von NifIscA, wo auch ein Zentrum pro Protein-Dimer nachgewiesen
werden konnte.
Arbeiten am S. pombe Isa1 widersprechen diesem Modell. Dort resultierte der
einzelne Austausch aller drei hochkonservierten Cysteine gegen Alanin in Varianten,
die nach Rekonstitution in der Lage waren ein [2Fe2S]2+-Zentrum zu binden (WU ET
AL., 2002a). Die Rekonstitution erfolgte bei diesem Protein bei der Rückfaltung aus
unlöslichen Aggregaten mit hohen Konzentrationen DTT als Reduktionsmittel. Die
Verwendung von DTT als Reduktionsmittel hatte auch bei dem hier untersuchten
IscA1 aus Synechocystis zu Problemen bei der Charakterisierung der Varianten
geführt. Die IscA1-Variante mit nur einem Cysteinrest (C34/75/110/112A) zeigte
nach Rekonstitution mit DTT als Reduktionsmittel ein Absorptionsspektrum, das auf
ein FeS-Zentrum hindeutete. Der Wechsel vom „dithiolen“ DTT zum „monothiolen“
β-Mercaptoethanpol bei der Rekonstitution ermöglichte dann klarere Aussagen.
Offenbar ist DTT in der Lage Eisen zu komplexieren. Dieser Eisen-DTT-Komplex
scheint zudem an Proteine fest binden zu können.
Das [2Fe2S]-Zentrum von IscA1 von Synechocystis ist relativ instabil. In
Anwesenheit von Sauerstoff kommt es zu einem schnellen Zerfall des Zentrums.
Abb. 4-1: Modell der Bindung des [2Fe2S]-Zentrums durch IscA1
4 Diskussion
103
Unter anaeroben Bedingungen besitzt das FeS-Zentrum mit einer Halbwertszeit von
180 min eine größere Stabilität. In Anwesenheit von Reduktionsmitteln war das FeS-
Zentrum von IscA1 in Anwesenheit von Luftsauerstoff ähnlich stabil wie unter
anaeroben Bedingungen. Wahrscheinlich schützt das Reduktionsmittel das FeS-
Zentrum vor Schädigung durch Oxidation /Reduktion. In Anwesenheit von Eisen(III)
kommt es in Anwesenheit von Sauerstoff zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies,
die in der Lage sind FeS-Zentren zu oxidieren oder zu reduzieren. Beides führt, wie
in dieser Arbeit gezeigt zur Zerstörung des FeS-Zentrums an IscA1. Das zugesetzte
Reduktionsmittel scheint der Bildung der reaktiven Sauerstoffspezies oder der
Schädigung der FeS-Zentren an IscA1 durch diese entgegen zu wirken.
Das [2Fe2S]-Zentrum von IscA aus E. coli und A. vinelandii ist aerob ebenfalls
instabil und anaerob stabil (KREBS ET AL., 2001, OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL.,
2001).
4.1.3 Übertragung des FeS-Zentrums
Neben der Assemblierung eines FeS-Zentrums müssen potentielle
Assemblierungsplattformen für eine Beteiligung an der Biogenese von FeS-Zentren
auch in der Lage sein, das assemblierte Zentrum auf Apo-FeS-Proteine zu
übertragen.
Eine Übertragung von FeS-Zentren ist bereits für IscU von Thermatoga maritima
(MANSY ET AL., 2002) und Isu1 von S. pombe (WU ET AL., 2002b) gezeigt worden. Als
Apoproteine wurden dabei verschiedene Apo-[2Fe2S]-Ferredoxine verwendet. Für E.
coli konnte die Übertragung des FeS-Zentrums von Holo-IscA auf das im isc-Operon
kodierte Ferredoxin Fdx gezeigt werden (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).
Synechocystis IscA1 überträgt das gebundene [2Fe2S]-Zentrum auf Apoferredoxin
aus Synechocystis. In vitro war dafür nur die Anwesenheit eines Reduktionsmittels
nötig. Die Geschwindigkeit der Reaktion war hoch. Nach 10 Minuten waren 50 %
der FeS-Zentren übertragen.
Da eine chemische Rekonstitution von Apoferredoxin mit stöchiometrischen Mengen
Sulfid und Eisen unter diesen Bedingungen möglich und ebenfalls schnell ist,
musste, um einen Transfer des FeS-Zentrums zu beweisen, das FeS-Zentrum unter
diesen Bedingungen für die Dauer des Experiments stabil sein. Durch die
Anwesenheit eines Reduktionsmittels und anaerobe Bedingungen wurde dies
gewährleistet.
4 Diskussion
104
Die spektralen Eigenschaften des entstandenen Holoferredoxins stimmen mit denen
des isolierten Proteins überein. Dies und die veränderte Migration im nicht-
denaturierenden Acrylamidgel demonstriert die korrekte Insertion des FeS-Zentrums
durch Holo-IscA1.
Die Cystein-Alanin-Austausche des strikt konservierten Cysteins 44 und der
pflanzenspezifischen Cysteine 34 und 75 hatten keinen Einfluss auf die Übertragung
des FeS-Zentrums auf Ferredoxin.
Die C. roseus APS-Reduktase gehört zur Gruppe der pflanzlichen APS-Reduktasen.
Diese binden, wie die B. subtilis PAPS-Reduktase (Berndt, C., Bill, E., Schwenn, J.-
D., unveröffentlicht), ein [4Fe4S]-Zentrum (KOPRIVA ET AL., 2001). Nach Entfernung
des FeS-Zentrums sind beide Enzyme inaktiv und konnten durch Inkubation mit
Holo-IscA1 aus Synechocystis wieder reaktiviert werden. Da Apo-IscA1 sowie
freies Sulfid und Eisen keinen Effekt hatten, kann daraus geschlossen werden, dass
die FeS-Zentren von Holo-IscA1 auf die Apoproteine übertragen wurden. Damit ist
die hier beschriebene Reaktivierung der beiden Reduktasen die erste bekannte
Rekonstitution eines [4Fe4S]-Zentrums durch IscA/IscU.
Über den Mechanismus der Transferreaktion auf Apo-[2Fe2S]- und Apo-[4Fe4S]-
Proteine kann nur spekuliert werden. Wie die Aktivierung der APS-Reduktase aus C.
roseus und der PAPS-Reduktase aus B. subtilis zeigt, ist der Transfer von FeS-
Zentren auf verschiedene Apo-FeS-Proteine aus verschiedenen Organismen durch
Holo-IscA1 aus Synechocystis möglich. Demnach ist das Vorkommen eines
spezifischen Erkennungssignals oder einer Anlagerungsstelle für IscA1
unwahrscheinlich. Dagegen spricht auch die Vielzahl verschiedener FeS-Proteine
eine Zelle. Vielmehr scheint es die Geometrie der präsentierten Liganden des
Apoproteins für das FeS-Zentrum sein, die den Transfer ermöglicht. Vorstellbar ist
ein Mechanismus, bei dem der Transfer schrittweise erfolgt. In einem ersten Schritt
werden die Liganden eines IscA-Protomers durch zwei Liganden des Apoproteins
ersetzt, in einem weiteren erfolgt dann der Austausch der Liganden des zweiten
Protomers.
Die Liganden des FeS-Zentrums von IscA liegen in einem konservierten CGCG-
Motiv. Dies ist eine sehr ungewöhnliche Ligandenanordnung für ein FeS-Zentrum
(GIBNEY ET AL., 1996). Durch diesen ungewöhnlichen Abstand der Liganden,
4 Diskussion
105
getrennt nur durch die kleinste Aminosäure, könnte eine geringere Affinität von IscA
zum [2Fe2S]-Zentrum bedingt sein, wodurch ein Austausch von Liganden, die in
einer bevorzugteren Geometrie angeordnet sind, thermodynamisch begünstigt würde.
Bei der Aktivierung der Apo-[4Fe4S]-Enzyme durch Holo-IscA1 stellt sich zudem
die Frage, wie Holo-IscA1, das ein [2Fe2S]-Zentrum bindet, ein [4Fe4S]-Zentrum in
diesen Proteinen assemblieren kann. Prinzipiell sind dafür zwei Denkmodelle
vorstellbar.
Zum einen könnte ein gleichzeitiger Transfer von zwei [2Fe2S]-Zentren ein [4Fe4S]-
Zentrum bilden. Der gleichzeitige Transfer zweier Zentren ist allerdings kinetisch
unwahrscheinlich. Zum anderen könnte zunächst ein [2Fe2S]-Zentrum auf das
Apoprotein übertragen werden und dann das zweite. Dabei würde es zur transienten
Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums in der Bindenische der [4Fe4S]-(P)APS-Reduktase
kommen. Bisher ist Bindung eines [2Fe2S]- und [4Fe4S]-Zentrums in der gleichen
oder zumindest überlappenden Bindenische nur für A. vinelandii IscU (AGAR ET AL.,
2000b), NifIscA (KREBS ET AL., 2001) und E. coli FNR (KOROSHILOVA ET AL., 1997)
gezeigt worden.
Hier könnte eine weitere Rolle für das hoch konservierte Cystein 44 von IscA1
liegen, das in Saccharomyces cerevisiae essentiell für die Funktion von ISA1 ist
(JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT ET AL., 2000). Die im Vergleich zum IscA1-
Wildtyp-Protein verminderte Fähigkeit zur Reaktivierung der Apo-APS- bzw. PAPS-
Reduktase deutet auf eine Beteiligung dieser Aminosäure an der Biogenese der
[4Fe4S]-Zentren hin, wohingegen die Übertragung auf Apoferredoxin nicht
beeinträchtigt ist. Obwohl die Variante C44A bei ihrer Rekonstitution weniger FeS-
Zentren assembliert, ist diese Verminderung der Reaktivierung der APS/PAPS-
Reduktasen mit 80 – 90 % größer als die verminderte Beladung der Variante C44A.
Nach den Absorptionsspektren betrug die Beladung von IscA1C44A verglichen mit
dem IscA1-WT ca. 50 %.
Allerdings konnte durch die dreifache Menge IscA1C44A dieser Effekt wieder
aufgehoben werden. Es ist daher noch nicht endgültig geklärt, ob der Effekt
geringerer Aktivierung der APS- bzw. PAPS-Reduktase durch die Variante C44A
nur an geringerer Beladung der Variante C44A liegt oder eine mechanistische
Ursache hat. Die Rolle von C44 könnte in einer Stabilisierung eines von der APS-
bzw. PAPS-Reduktase intermediär gebundenen [2Fe2S]-Zentrums liegen. Auch dann
4 Diskussion
106
hätte eine größere Menge an Holo-IscA1C44A eine Steigerung der Reaktivierung zur
Folge, da durch die größere Menge an Holo-IscA1C44A der Zeitraum einer
intermediären Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums bis zur Insertion eines zweiten
Zentrums verkürzt wäre. Der überproportionale Anstieg der Reaktivierung um einen
Faktor 10 durch die Zugabe einer dreifachen Menge C44A spricht für diesen
kinetischen Effekt. Weitere Experimente sind nötig, um die Rolle dieser Aminosäure
bei der Biogenese von [4Fe4S]-Zentren aufzuklären. Die hier vorgestellten
Experimente bieten einen guten Ansatz dafür.
Wie die Aktivierung der APS-Reduktase aus C. roseus durch die Variante C34/75A
demonstriert sind diese zusätzlichen pflanzenspezifischen Cysteinreste für den
Prozess der Biogenese von [4Fe4S]-Zentren nicht essentiell.
Neben den oben diskutierten mechanistischen Aspekten der Assemblierung von
[4Fe4S]-Zentren aus [2Fe2S]-Vorstufen, muss ein Redoxprozess beachtetet werden.
Liegen die für die Assemblierung eines [4Fe4S]-Zentrums benötigten vier
Eisenatome im [2Fe2S]2+-Zentrum als Fe3+ vor, so haben sie im [4Fe4S]2+-Zentrum
die formale Ladung Fe+2,5. Daher werden zur Bildung eines [4Fe4S]-Zentrums aus
zwei [2Fe2S]-Zentren zwei Elektronen benötigt.
Im untersuchten in vitro Rekonstitutionsansatz können diese durch das
Reduktionsmittel bereitgestellt worden sein. Als potentieller Elektronendonor in vivo
könnte das im isc-Operon kodierte Ferredoxin Fdx dienen. Ein Komplex gebildet
ausschließlich von Holo-IscA und Holo-Fdx konnte für die Enzyme aus E. coli
nachgewiesen werden (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001).
Im Genom von Synechocystis PCC 6803 kann ein zu Fdx homologes Protein
(Slr0148) identifiziert werden. Abb. 4-2 zeigt einen Sequenzvergleich von Slr0148
verschiedenen Ferredoxinen und mit Fdx aus E. coli und A. vinelandii. Neben einem
N-terminalen Teil mit Ähnlichkeit zu Fdx besitzt Slr0148 eine C-terminale
Verlängerung, deren Funktion nicht bekannt ist. Die Cysteine, die bei Fdx aus E. coli
das [2Fe2S]2+/+-Zentrum koordinieren (KAKUTA ET AL., 2001), sind in der Sequenz
von Slr0148 konserviert. Biochemische Untersuchungen und Versuche das
entsprechende Gen zu deletieren müssen eine Funktion von Slr0148 an der
Biogenese von FeS-Zentren nachweisen.
4 Diskussion
107
In S. cerevisiae konnte ein zu Fdx homologes Ferredoxin Yah1p identifiziert werden,
das essentiell für die Lebensfähigkeit der Zelle ist (LANGE ET AL., 1999). Zellen, die
ein niedrigeres Expressionsniveau von Yah1p aufweisen, zeigen den in Hefe
typischen Phänotyp für einen Defekt in der Biogenese von FeS-Zentren, wie
herabgesetzte Aktivität der FeS-Enzyme und hoher mitochondrieller Eisenspiegel.
Arbeiten von (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001) in E. coli deuteten auch auf eine
Beteiligung von Fdx an der Biogenese von FeS-Zentren in E. coli hin.
Abb. 4-2: Sequenzvergleich von Slr0148 aus Synechocystis PCC 6803 mit Tlr2302 aus Themosynechococcus elongatus BP-1, Fdx aus A. vinelandii (T44286) und E. coli(NP_289082) und Ferredoxinen aus Pseudomonas aeroginosa (NP_252498) und Haemophilus influenza (NP_438533). Die das FeS-Zentrum von E. coli-Fdx koordinierenden Cysteine sind gelb hinterlegt.
4 Diskussion
108
4.2 Charakterisierung von IscA2 (Slr1565)
IscA2 konnte durch das T7-Expressionssystem in E. coli nur als unlösliches
Aggregat exprimiert werden. MORIMOTO ET AL. (2002) konnten IscA2 als lösliches
Protein mit gebundenem FeS-Zentrum in E. coli exprimeren, jedoch mit einer
geringen Ausbeute. Das sehr hohe Expressionsniveau von IscA2 als unlösliches
Aggregat (200 mg pro Liter E. coli-Kultur) ermöglichte eine effiziente Aufreinigung
des Proteins aus dem Rohextrakt. Durch Rückfaltung nach der Methode der
schnellen Verdünnung nach Auflösen der Aggregate in Harnstoff konnte mit einer
Ausbeute von 40 – 50 % ein bis zur Homogenität aufgereinigtes lösliches Protein
erhalten werden.
IscA2 konnte analog zu IscA1 rekonstituiert werden. Dies demonstriert, dass IscA2
trotz des für IscA-Proteine ungewöhnlichen C-terminalen CSCS-Motivs anstelle des
konservierten CGCG-Motivs in der Lage ist ein FeS-Zentrum zu assemblieren.
IscA2 ist wie IscA1 in der Lage das assemblierte FeS-Zentrum auf Ferredoxin zu
übertragen, die Effizienz dieser Reaktion scheint gegenüber IscA1 vermindert. Ob
dies ein Unterschied genereller Natur zwischen IscA1 und IscA2 ist, oder ob dies
durch die experimentellen Bedingungen hervorgerufen wird, ist unklar. Die von
MORIMOTO ET AL. (2002) diskutierte Rolle von IscA2 abseits der Biogenese von FeS-
Proteinen, kann hier insofern nicht bestätigt werden, als dass IscA2 wie IscA1 in der
Lage ist ein FeS-Zentrum zu assemblieren und dieses auf Apo-FeS-Proteine zu
übertragen.
4.3 Charakterisierung von SynIscU (Ssl2667) –
Sulfidmobilisierung oder Assemblierungsplattform?
NifU von A. vinelandii ist ein modular aufgebautes Protein bestehend aus drei
Domänen (OUZOUNIS ET AL., 1992; AGAR ET AL., 2000a). Die N-terminale Domäne ist
in der Lage Eisen zu binden und durch Inkubation mit NifS und Cystein ein
transientes [2Fe2S]-Zentrum zu assemblieren (YUVANIYAMA ET AL., 2000). Weitere
Inkubation mit NifS, Cystein und Eisen führt zur Assemblierung eines [4Fe4S]-
Zentrums pro NifU-Monomer (Smith, A., Johnson, M.K., persönliche Mitteilung).
IscU-Proteine aus verschieden Organismen besitzen Ähnlichkeit zu dieser N-
terminalen Domäne des NifU-Proteins.
Die mittlere Domäne des NifU-Proteins bindet ein Ferredoxin-ähnliches
reduzierbares [2Fe2S]2+/+-Zentrum (FU ET AL., 1994). Die C-terminale Domäne des
4 Diskussion
109
NifU-Proteins aus A. vinelandii besitzt zwei konservierte in einem CXXC-Motiv
lokalisierte Cysteinreste, die für die Funktion des NifU-Proteins in vivo nicht
essentiell sind (AGAR ET AL., 2000a). SynIscU besitzt Homologie zu dieser C-
terminalen Domäne. Die Funktion von SynIscU sollte untersucht werden.
Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente zur Rolle von SynIscU als
Reduktionsmittel zur Mobilisierung von Sulfid aus Cystein beruhten auf den
Experimenten aus meiner Diplomarbeit, bei denen pro Mol reduziertem SynIscU
nach Inkubation mit Cystein und IscS (Slr0387) ein Mol Sulfid und oxidiertes
SynIscU nachgewiesen werden konnte. Arbeiten von TAKAHASHI ET AL. (1991a) an
isolierten Chloroplasten zeigten zudem sowohl für die Mobilisierung von Sulfid aus
Cystein als auch für die Biogenese des FeS-Zentrums von Ferredoxin die
Notwendigkeit von Redoxäquivalenten (NADPH) bei diesen Reaktionen. Daher
stellte SynIscU einen potentiellen Kandidat für die Übertragung dieser
Redoxäquivalente auf den von IscS aus Cystein mobilisierten Schwefel dar.
Der durch die Experimente dieser Arbeit gezeigte Mechanismus der Reaktion von
reduziertem SynIscU mit IscS und Cystein, widerlegt die Hypothese der Übertragung
des Persulfidschwefels von IscS auf eine Cysteinseitenkette von SynIscU mit
nachfolgender Oxidation von SynIscU unter Abspaltung von Sulfid (Abb. 4-3,
Reaktion A). Vielmehr konnte ein instabiles IscS-SynIscU-Heterodimer
Abb. 4-3: Mögliche Reaktionsmechanismen von IscS mit reduziertem SynIscU und Cystein, die zur Bildung von Sulfid und zur Oxidation von SynIscU führen
4 Diskussion
110
nachgewiesen werden, dass im Verlauf der Reaktion dissoziierte. Das nachgewiesene
Heterodimer war durch eine intermolekulare Disulfidbrücke kovalent miteinander
verknüpft. Es konnte durch Austausch des Cysteins 47 gegen Alanin stabilisiert
werden. Diese Beobachtung deuten auf einen Reaktionsmechanismus hin, bei dem
der Schwefel des Cysteins 44 von SynIscU den Schwefel des Cysteins 326 von IscS
angreift, wobei der als Persulfid gebundene Schwefel am Cystein 326 von IscS
abgespalten und als Sulfid freigesetzt wird und ein IscS-SynIscU-Heterodimer
entsteht (Abb. 4-3, Reaktion B). In einem zweiten Schritt kommt es dann zu einem
nukleophilen Angriff des Schwefels des Cysteins 47 von SynIscU auf den des
Cysteins 44, wobei intermolekulare die Disulfidbrücke gespalten wird und so eine
intramolekulare Disulfidbrücke der Cysteine 44 und 47 von SynIscU gebildet wird.
Dieser vorgeschlagene Reaktionsmechanismus für Synechocystis IscS, Cystein und
reduziertem SynIscU erklärt die in meiner Diplomarbeit untersuchte Reaktion. Dieser
Reaktionsmechanismus benötigt nicht ein Persulfid an SynIscU. Dieses konnte auch
an den Varianten C44A und C47A nicht nachgewiesen werden, obwohl es durch den
Cystein-Alanin-Austausch stabilisiert worden wäre.
Ob diese in vitro beobachtete Reaktion in vivo relevant ist, ist unklar. Eine direkte
Übertragung des Persulfids von IscS auf SynIscU würde einen Transport des
Schwefels ohne Freisetzung des Zellgifts Sulfid ermöglichen (Reaktion A). Dieser
Schwefel hätte dann zur Assemblierung eines FeS-Zentrums an SynIscU, das von
NISHIO & NAKAI (2000) mit gebundenem FeS-Zentrum nach Überexpression aus E.
coli isoliert werden konnte, oder an einem anderen Protein genutzt werden können.
Der nachgewiesene Reaktionsmechanismus (Reaktion B) setzt aber direkt Sulfid frei
und ist damit wahrscheinlich nicht physiologisch.
Arbeiten an E. coli und A. vinelandii IscS und IscU, die keine Ähnlichkeit zu
SynIscU besitzen, konnten den direkten Transfer eines Persulfids, im Falle von A.
vinelandii mehrerer Persulfide, von IscS auf IscU nachweisen (URBINA ET AL., 2001;
SMITH ET AL., 2001). Bei dieser Reaktion kommt es auch zur Bildung eines IscS-
IscU-Heterodimers, das über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft ist (KATO ET
AL., 2002). Im Falle von E. coli IscS und IscU konnte der übertragene Schwefel zur
Assemblierung eines FeS-Zentrums an IscU genutzt werden (URBINA ET AL., 2001).
Der Reaktionsmechanismus dieser Reaktion ist auch noch nicht endgültig aufgeklärt.
4 Diskussion
111
Die Untersuchung der Interaktion von SynIscU mit den drei NifS-homologen
Proteinen aus Synechocystis durch das Hefe 2-Hybrid-System ergab zudem keine
Interaktion zwischen diesen Proteinen. Dieses Ergebnis bestätigt die biochemischen
Experimente der Diplomarbeit. Durch das Hefe 2-Hybrid System konnte die dimere
Natur von IscS (JASCHKOWITZ & SEIDLER, 2000) und Sll0704 (KATO ET AL., 2000)
bestätigt werden, was ein Charakteristikum der Cysteindesulfurasen ist (KAISER ET
AL., 2000; MIHARA ET AL., 1999). Warum das dritte NifS-homologe Enzym (Slr0077)
keine Dimerisierung im 2-Hybrid-Test anzeigt, ist unklar. Um die genaue Ursache
dafür herauszufinden, wären weitere Experimente nötig. So müsste die Expression
des Fusionsproteins in Hefe überprüft werden. Möglicherweise wird das
Fusionsprotein in Hefe nicht löslich exprimiert oder nicht in den Kern transportiert.
Zusammengefasst erscheint eine Rolle für IscS und SynIscU als Enzympaar für die
Mobilisierung und Übertragung des Schwefels in Synechocystis als
unwahrscheinlich. Ob dies, wie oben für IscA1 und IscS diskutiert, wiederum daran
liegt, dass mit IscS (Slr0387) nur eine von drei Cysteindesulfurasen von
Synechocystis für die biochemischen Untersuchungen eingesetzt werden konnte, ist
unklar. Genetische Untersuchungen haben gezeigt, dass von den drei NifS-
homologen Proteinen einzig Slr0077 (SufS) für Synechocystis essentiell ist (SEIDLER
ET AL., 2001). Dieses Protein konnte nur als unlösliches Aggregat heterolog in E. coli
exprimiert werden. Eine Rückfaltung zu einem aktiven Enzym war nicht möglich (A.
Seidler, pers. Mitteilung). Kürzlich konnte für Slr0077 sowohl eine Cystein-
desulfurase-Aktivität, als auch eine Cystin-Lyase-Aktivität gezeigt werden. (D.
Kessler, pers. Mitteilung). Diese Aktivität war verglichen mit der Aktivität von IscS
(Slr0387) allerdings sehr gering. Versuche mit Slr0077 könnten die hier diskutierten
Fragen zur Übertragung des Schwefels vielleicht klären.
Um die Funktion von SynIscU als FeS-Assemblierungsplattform unabhängig von der
Frage der Übertragung des Schwefels von IscS zu untersuchen, wurde zunächst
analog zu NISHIO & NAKAI (2000) versucht SynIscU mit gebundenem FeS-Zentrum
nach Überexpression in E. coli zu isolieren. Es konnte aber in Gegensatz zu NISHIO
& NAKAI keine Bedingung gefunden werden, SynIscU mit gebundenem FeS-
Zentrum aus E. coli zu isolieren.
4 Diskussion
112
Durch die für IscA verwendete Methode konnte in vitro ein FeS-Zentrum an SynIscU
assembliert werden. Die Untersuchung des FeS-Zentrums durch Mössbauer-
Spektroskopie ergab, dass SynIscU ein [2Fe2S]2+-Zentrum bindet. Dies war auch von
NISHIO & NAKAI (2000) vermutet worden. Die Mössbauer-Spektroskopie deutete auf
eine komplette Cystein-Ligation des FeS-Zentrums. Da die Sequenz von SynIscU nur
zwei Cysteine aufweist, kann dadurch gezeigt werden, dass analog zu IscA1 ein
[2Fe2S]-Zentrum von einem SynIscU-Dimer gebunden wird.
Das rekonstituierte Holo-SynIscU war wie das mit FeS-Zentrum aus E. coli isolierte
Protein in der Lage das gebundene FeS-Zentrum auf Apoferredoxin zu übertragen.
Obwohl das FeS-Zentrum von SynIscU nicht vollständig stabilisiert werden konnte,
kann eine aktive Übertragung postuliert werden, da der Umsatz dieses Prozesses
größer und die Kinetik der Übertragung schneller ist als der spontane Zerfall des
FeS-Zentrums von SynIscU.
Im Gegensatz zu NISHIO & NAKAI (2000) war für diese Übertragung die Zugabe
eines Reduktionsmittels nötig. Ohne Reduktionsmittel konnte nur ein minimaler
Umsatz erreicht werden. Der Grund dafür liegt eventuell in der unterschiedlichen
Herstellung von Apoferredoxin. NISHIO & NAKAI benutzen dafür eine extrem hohe
Konzentration an DTT, die durch Gelfiltration wahrscheinlich nicht vollständig
entfernt wurde.
Der Vergleich der Kinetik der Übertragung des FeS-Zentrums von IscA1 und
SynIscU auf Apoferredoxin zeigt, dass unter den verwendeten Bedingungen der
Prozess in etwa gleich schnell abläuft.
Die Reaktivierung der Apo-[4Fe4S]-Proteine APS-Reduktase aus C. roseus und
PAPS-Reduktase aus B. subtilis war verglichen mit der Reaktivierung durch IscA1
wesentlich niedriger. Sie betrug nur ca. 20 % der Reaktivierung durch Holo-IscA1.
Auch durch Zugabe eines Überschusses an Holo-SynIscU konnte keine weitere
signifikante Steigerung erreicht werden. Die Relevanz dieser Beobachtung für die
Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis und die Rollen von IscA1, IscA2 und
SynIscU bei diesem Prozess sollen im nächsten Abschnitt weiter diskutiert und
voneinander abgegrenzt werden.
4.4 Die Rolle von IscA1, IscA2 und SynIscU in vivo
Neben der biochemischen Charakterisierung in vitro wurden auch Versuche
durchgeführt, die entsprechenden Gene, die die untersuchten Proteine kodieren, zu
4 Diskussion
113
deletieren, um so Informationen darüber zu erhalten, ob das Gen essentiell für den
Organismus ist oder nicht. Die Untersuchung des Phänotyps einer Mutante kann
dann Aufschluss über die Funktion des Proteins in der Zelle geben.
IscA1 wird von Synechocystis PCC 6803 exprimiert. Alle Versuche iscA1 (slr1417)
durch Insertion einer Gentamycin-Resistenzkassette in das Gen zu inaktivieren,
führten zwar zu einer Gentamycin-Resistenz des transformierten Stammes, aber nicht
zu einer homozygoten Insertionsmutante. Dieses Ergebnis spricht für eine essentielle
Funktion von IscA1 für Synechocystis. Nach Analyse der Genomsequenz von
Synechocystis PCC 6803 befindet sich kein weiterer offener Leserahmen
stromabwärts in der Transkriptionsrichtung von iscA1. Daher können polare Effekte,
die durch die Insertion einer Resistenzkassette mit einem Terminator entstehen
können, ausgeschlossen werden.
Die Deletion des zweiten Gens für ein IscA-Protein in Synechocystis war möglich.
Obwohl im Synechocystis-Wildtyp IscA2 in ähnlichem Maß wie IscA1 exprimiert
wird, konnte das iscA2-Gen (slr1565) homozygot durch eine Spectinomycin-
Resistenzkassette ersetzt werden. Die Deletion des iscA2-Gens hatte auf
Synechocystis keine signifikante Auswirkung. Verglichen mit dem Synechocystis-
Wildtyp zeigte die Deletionsmutante unter den getesteten Bedingungen ein ähnliches
Wachstum, ein ähnliches Verhältnis der Photosysteme und ähnliche Aktivität und
Expression der untersuchten FeS-Proteine.
Ob die von dem iscA2-Deletionsstamm unter Eisenmangel gezeigte stärkere
Expression der IsiA-Antenne (BIBBY ET AL., 2001; BOEKEMA ET AL., 2001) signifikant
ist, muss noch genauer untersucht werden. Das ähnliche Wachstum von Wildtyp und
Deletionsstamm unter Eisenmangel zeigt allerdings, dass der Phänotyp der Mutante
durch die erhöhte Stressreaktion, die verstärkte Expression der IsiA-Antenne,
kompensiert werden kann.
Das Gen für SynIscU (ssl2667) ist essentiell (SEIDLER ET AL., 2001). Es konnte
gezeigt werden, dass das Protein in ähnlichem Maße wie IscA1 und IscA2 in
Synechocystis exprimiert wird.
4 Diskussion
114
Zusammengenommen mit den Untersuchungen der Proteinfunktion in vitro
ermöglichen die unternommen Versuche zur Deletion der Gene in Synechocystis
folgende Aussagen und Interpretationsmöglichkeiten.
Trotz ähnlicher Eigenschaften in den in vitro durchgeführten Versuchen, kann die
Funktion von IscA1, da iscA1 essentiell ist, in vivo nicht durch die Funktion IscA2
ersetzt werden. Dies weist auf unterschiedliche zelluläre Rollen für die beiden
Proteine hin. Dies war schon vorher vermutet worden, da für IscA2 und nicht für
IscA1 aus Synechocystis ein spezifischer Komplex mit einem „heat-repeat-protein“
(Slr1098) nachgewiesen werden konnte (MORIMOTO ET AL., 2002). Über die Funktion
dieses IscA2-Slr1098-Komplexes und auch über die Funktion der heat-repeat
Proteine ist nichts weiter bekannt. MORIMOTO ET AL. spekulieren, dass eine spezielle
Funktion von IscA2 von den frühen Cyanobakterien zusammen mit Slr1098
entwickelt worden war. Ob der sehr milde Phänotyp der iscA2-Deletionsmutante
dadurch entsteht, dass diese Funktion für die Zelle unter den verwendeten
Anzuchtsbedingungen nicht essentiell ist oder ob IscA1 die Funktion von IscA2 in
vivo übernehmen kann, muss noch geklärt werden.
Die Abgrenzung der zellulären Funktionen von IscA1 und SynIscU ist hingegen
schwieriger. In vitro konnte für beide Proteine die Bindung eines [2Fe2S]-Zentrums
gezeigt werden, das von beiden Proteinen auf Ferredoxin übertragen werden kann.
Ein Unterschied besteht, wie schon oben diskutiert bei der Reaktivierung der Apo-
[4Fe4S]-Proteine. Beide Gene sind für Synechocystis essentiell und die
entsprechenden Proteine werden exprimiert.
Diese essentielle Funktion für ein IscA-Protein ist neu. Deletion des entsprechenden
Gens im nif-Operon von A. vinelandii (orf6) führt nicht, wie für nifS und nifU
beschrieben, zur sehr starken Verlangsamung des diazotrophen Wachstums
(JACOBSON ET AL., 1989). Deletion von iscA im isc-Operon von E. coli führte zu einer
verminderten Aktivität von FeS-Enzymen, deren Verminderung aber nicht so stark
war, wie bei Deletion von iscS oder iscU (TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001). Auch
bei Ko-Überexpression des isc-Operons in E. coli, führt die Deletion von iscA zwar
zu einer verminderten Bildung der Holo-Form der als Reporter überexprimierten
Ferredoxine, aber trotzdem nicht zu einem totalen Verlust der de novo Synthese von
FeS-Zentren (TAKAHASHI & NAKAMURA, 1999). Deletion der iscA-Gene in S.
4 Diskussion
115
cerevisiae führt zwar zu einem starken Phänotyp (JENSEN & CULOTTA, 2000; KAUT
ET AL., 2000; PELZER ET AL., 2000), aber selbst eine Doppelmutation beider iscA-Gene
ist nicht letal (JENSEN & CULOTTA, 2000).
Das gleiche gilt auch für Proteine oder Proteindomänen mit Homologie zu SynIscU.
Die Cysteine der C-terminalen Domäne des NifU-Proteins aus A. vinelandii sind für
die Funktion des gesamten Proteins nicht essentiell (AGAR ET AL., 2000A). Auch in S.
cerevisiae ist das entsprechende nfu1-Gen nicht essentiell (GARLAND ET AL., 1999;
SCHILKE ET AL., 1999).
Der Grund für diese außergewöhnliche Essentialität dieser beiden Gene in
Synechocystis liegt wahrscheinlich in der Tatsache, dass ein Gen für ein IscU-
homologes Protein oder für ein Protein homolog zur N-terminalen NifU-Domäne in
Synechocystis fehlt, obwohl dieses Protein bzw. diese Domäne evolutionär extrem
konserviert ist (HWANG ET AL., 1996).
Aber warum benötigt Synechocystis zwei essentielle Gene oder Proteine mit
zumindest in vitro teilweise redundanter Funktion?
Eine Hypothese, die diese Beobachtung beantworten würde, ist das Vorkommen
zweier verschiedener Systeme zur Assemblierung von FeS-Zentren in Synechocystis,
wobei IscA1 und SynIscU die jeweilige FeS-Assemblierungsplattform in diesen
Systemen darstellen würden. Das Vorkommen zweier FeS-Assemblierungssysteme
ist bereits in zwei Prokaryonten, A. vinelandii und E. coli, untersucht worden.
In E. coli konnte der Phänotyp einer isc-Operon-Deletionsmutante durch eine
spontane Mutation im Promotorbereich des suf-Operons revertiert werden
(TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002). Die Überexpression des suf-Operons konnte den
Phänotyp der isc-Operon-Mutante aufheben. Im suf-Operon sind neben einem
hypothetischen ABC-Trasporter (sufBCD) auch ein IscS- und IscA-homologes
Protein (sufS/sufA) kodiert.
Ein anderes Bild zeichnet die Situation in A. vinelandii. Neben den im nif-Operon
kodierten Proteinen NifS, NifU und NifIscA (JACOBSON ET AL., 1989), existiert in A.
vinelandii noch ein klassisches isc-Operon (iscSUA-hscBA-fdx; ZHENG ET AL., 1998).
Hier konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von iscS nicht möglich ist, auch
wenn NifS unter Bedingungen, die Stickstofffixierung ermöglichen, exprimiert wird.
Andererseits zeigt ein nifS-Deletionsstamm noch sehr schwaches diazotrophes
Wachstum, was dafür spricht, dass die Funktion von NifS von IscS übernommen
4 Diskussion
116
werden kann. ZHENG ET AL. (1998) interpretieren NifS als spezialisierte Cystein-
Desulfurase für die Biogenese der FeS-Zentren der Nitrogenase und IscS als das eher
generelle Enzym für die Biogenese aller FeS-Zentren der Zelle. Im Vergleich zum
E. coli isc/suf-System liegt hier eine Spezifität in zumindest eine Richtung vor.
Wenn aber zwei essentielle Systeme zur Biogenese von FeS-Zentren in
Synechocystis existieren, worin liegt dann die Spezifität dieser Systeme?
Spezifität könnte dadurch entstehen, dass FeS-Zentren in verschiedenen Apo-FeS-
Proteinen nur von dem einen oder dem anderen Protein assembliert werden können.
Da, wie oben diskutiert, nicht angenommen werden kann, dass es eine spezifische
Anlagerungsstelle für Proteine gibt, die FeS-Zentren übertragen, muss diese
Spezifität ebenfalls wieder in der Geometrie der vom Apo-FeS-Protein präsentierten
Liganden liegen. Hier ist vorstellbar, dass eine Anordnung die Übertragung des FeS-
Zentrums durch das eine Protein bevorzugt, eine andere Anordnung die Übertragung
durch das andere Protein.
Eine weitere Möglichkeit der Spezialisierung ist es, dass in vivo ein Protein nur die
Assemblierung der [2Fe2S]-Zentren, das andere die Assemblierung der [4Fe4S]-
Zentren katalysiert. Die Ergebnisse der nur sehr schwachen Reaktivierung der Apo-
[4Fe4S]-Enzyme durch SynIscU in vitro legen den Verdacht nahe, dass Holo-
SynIscU in vivo das gebundene FeS-Zentrum nur auf Apo-[2Fe2S]-Proteine
übertragen kann, wobei IscA1 die Assemblierung der [4Fe4S]-Zentren katalysiert
oder zumindest dafür spezialisiert ist.
Ein weiterer Faktor, der diese Spezifitäten bedingen könnte, ist die Interaktion von
IscA und SynIscU mit verschiedenen anderen Proteinen in vivo. Diese könnten bei
der Übertragung des FeS-Zentrums von IscA1 oder SynIscU auf Apo-FeS-Proteine
benötigt werden. Wenn für diesen Prozess ein anderes Protein benötigt wird und
dieses mit IscA und nicht mit SynIscU interagiert, oder umgekehrt, wäre dadurch
eine Spezialisierung gegeben.
Potentielle Kandidaten für die Interaktion mit IscA1 und SynIscU sind Chaperone,
die in E. coli und A. vinelandii im isc-Operon kodiert sind. So konnte für E. coli IscU
und Hsc66 (HscA) und Hsc20 (HscB) gezeigt werden, dass IscU die ATPase-
4 Diskussion
117
Aktivität des Hsp70-Chaperones HscA steigert (HOFF ET AL., 2000; SILBERG ET AL.,
2001; HOFF ET AL., 2002; TOKUMOTO ET AL., 2002). Deletion von hscA und hscB in E.
coli führen zu einer stark herabgesetzten Aktivität verschiedener FeS-Enzyme
(TOKUMOTO & TAKAHASHI, 2001), das gleiche konnte für die entsprechenden
Proteine in S. cerevisiae gezeigt werden (STRAIN ET AL., 1998).
Interaktion von HscA konnte auch mit IscA aus E. coli gezeigt werden (TOKUMOTO
ET AL., 2002). Ein weiterer potentieller Interaktionspartner ist Fdx, das ebenfalls in E.
coli mit IscA (OLLAGNIER-DE-CHOUDENS ET AL., 2001), aber auch mit IscS und HscA
(TOKUMOTO ET AL., 2002) interagiert.
Neben der Frage, wodurch Spezifität bei verschiedenen Systemen bedingt sein
könnte, ist die Frage von Interesse, bei welchem Schritt in der Biogenese von FeS-
Zentren die Spezifität der Systeme beginnt. Sind IscA1 und SynIscU wirklich Teile
zweier verschiedener Systeme oder zwei spezialisierte Komponenten eines Systems?
Die Tatsache, dass mit Slr0077 nur eine essentielle Cysteindesulfurase in
Synechocystis existiert, aber zwei essentielle potentielle Assemblierungsplattformen
vorkommen, spricht für eine spätere Verzweigung der Wege. Die Ermittlung der
Rolle der verschieden Proteine in vivo bleibt ein Ansatzpunkt weiterer
Untersuchungen, die zu einem noch besseren Verständnis der Biogenese von FeS-
Proteinen in Synechocystis führen können.
4.5 Ausblick
Durch die Ergebnisse dieser Arbeit konnte eine Funktion von IscA1 als eine
Assemblierungsplattform für FeS-Zentren in Synechocystis ermittelt werden. IscA1
bindet ein [2Fe2S]-Zentrum, das auf Apo-[2Fe2S]- und [4Fe4S]-Proteine übertragen
werden kann. Der Mechanismus der Übertragung müsste noch genauer untersucht
werden. Vor allem die Übertragung auf die Apo-[4Fe4S]-Proteine bleibt ein
interessanter Ansatzpunkt für weitere Untersuchungen im Hinblick auf ein eventuell
intermediär gebundenes [2Fe2S]-Zentrum als Zwischenprodukt der Reaktion. Die
Hinweise dieser Arbeit auf Beteiligung des dritten strikt konservierten Cysteins C44
in IscA1 an diesem Prozess müssten weiter untermauert werden. Die Ermittlung des
Elektronendonors für diese Reaktion in vivo bleibt eine weitere Aufgabe, wobei das
vorgeschlagene Ferredoxin (Slr0148) einen guten Kandidaten für diese Reaktion
darstellt. Das hier etablierte System bietet erstmalig die Möglichkeit die Übertragung
4 Diskussion
118
von FeS-Zentren sowohl auf Apo-[2Fe2S]-Proteine als auch auf Apo-[4Fe4S]-
Proteine zu studieren.
Auch für SynIscU bleibt der Mechanismus der Übertragung der FeS-Zentren weiter
aufzuklären. Ein mechanistischer Unterschied dabei könnte die Rollen von IscA1
und SynIscU weiter voneinander abgrenzen.
Neben der Frage der Übertragung der FeS-Zentren von IscA1 und SynIscU ist die
genauere Untersuchung der Assemblierung dieser Zentren ein offener Punkt. Dabei
wäre die Suche nach der „richtigen“ Cysteindesulfurase für diese Reaktion ein
Ansatzpunkt. Interessant wären auch Experimente der Übertragung des FeS-
Zentrums von SynIscU auf IscA1 oder umgekehrt. Diese Experimente könnten dann
eine primäre bzw. sekundäre Assemblierungsplattform ermitteln und so Auskunft
darüber geben, ob und an welchem Punkt der Assemblierungskette oder –ketten eine
Spezialisierung der Enzyme festzumachen ist.
Die Abgrenzung der Rollen von IscA1 und SynIscU in vivo würde zu einem
genaueren Verständnis der Biogenese von FeS-Zentren in Synechocystis führen.
Dabei könnte der Versuch der Deletion von iscA1 oder syniscU unter dem
Hintergrund der Überexpression des jeweilig anderen Proteins in Synechocystis
Auskunft darüber geben, ob hier wie beim Beispiel des E. coli isc- und suf-Operons
(TAKAHASHI & TOKUMOTO, 2002) ein Dosiseffekt die Übernahme der Funktion des
einen Proteins durch das andere Protein verhindert oder ob dieser Unterschied durch
eine wie auch immer geartete Spezifität bestehen bleibt.
Die molekulare Ursache für diese Spezifität wäre dann eine weitere Fragestellung der
zukünftigen Forschung auf diesem Gebiet.
5 Zusammenfassung
119
5 Zusammenfassung
Eisen-Schwefel-Proteine sind an nahezu allen elementaren Prozessen der belebten
Welt beteiligt. Obwohl die Bildung von Eisen-Schwefel-Komplexen in vitro spontan
ablaufen kann, haben alle Organismen Enzymsysteme entwickelt um FeS-Zentren zu
assemblieren. Ein Teil dieses Systems aus dem Cyanobakterium Synechocystis PCC
6803 wurde in dieser Arbeit untersucht und die Funktion der beteiligten Enzyme
Enzyme aufgeklärt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde IscA1 (Slr1417) heterolog in E. coli
exprimiert und gereinigt. Es konnte ein System entwickelt werden, das die
Assemblierung eines labilen FeS-Zentrums an einem IscA1-Dimer erlaubte. Durch
biochemische und spektroskopische Methoden wurde das FeS-Zentrum als ein
diamagnetisches [2Fe2S]2+-Zentrum identifiziert, das ausschließlich durch
Cysteinseitenketten an das Protein gebunden wird. Ortsgerichtete Mutagenese ergab,
dass von den drei konservierten Cysteinen lediglich die beiden C-terminal in einem
CGCG-Motiv lokalisierten Cysteine an der Bindung des FeS-Zentrums beteiligt sind.
Es wurde gefolgert, dass das [2Fe2S]-Zentrum zwischen den beiden Protomeren
gebunden ist und je ein Protomer des IscA1-Dimers zwei Cystein-Liganden für
dessen Bindung zur Verfügung stellt.
Das FeS-Zentrum von IscA1 konnte mit hoher Effizienz auf Apo-FeS-Proteine
übertragen werden. Neben dem Transfer des FeS-Zentrums auf ein Apo-[2Fe2S]-
Ferredoxin konnten die Apo-[4Fe4S]-Enzyme APS-Reduktase aus Catharantus
roseus und PAPS-Reduktase aus Bacillus subtilis durch Inkubation mit Holo-IscA1
reaktiviert werden. Damit konnte erstmals die enzymatische Synthese eines [4Fe4S]-
Zentrums in vitro durchgeführt werden. Überraschenderweise zeigte sich, dass es
möglich ist dies aus zwei [2Fe2S]-Vorstufen zu erhalten.
Versuche des Transfers des FeS-Zentrums mit der Variante IscA1C44A deuten auf
eine Beteiligung des hoch konservierten Cysteins 44 an der Reaktivierung der Apo-
[4Fe4S]-Proteine, nicht jedoch von Apo-[2Fe2S]-Proteinen.
Das zweite IscA-Protein aus Synechocystis (IscA2/Slr1565) wurde als unlösliches
Aggregat in E. coli exprimiert, aufgereinigt und zu einem homogenen, löslichen
Protein zurückgefaltet. Durch die für IscA1 etablierte Methode konnte ein FeS-
5 Zusammenfassung
120
Zentrum an IscA2 assembliert werden, das von Holo-IscA2 auf Apoferredoxin
transferiert werden konnte. Damit konnten ähnliche Funktionen für die zwei IscA-
Proteine aus Synechocystis in vitro nachgewiesen werden.
Für SynIscU, ein drittes Protein, das an der Biogenese von FeS-Zentren in
Synechocystis beteiligt sein könnte, wurde wie bei IscA die Bindung eines
diamagnetischen [2Fe2S]2+-Zentrums durch ein SynIscU-Dimer nachgewiesen.
Auch das von SynIscU gebundene FeS-Zentrum konnte auf Apoferredoxin
übertragen werden. Die Reaktivierung der Apo-APS- und PAPS-Reduktase von C.
roseus bzw. B. subtilis war im Vergleich zur Reaktivierung durch Holo-IscA1 so
gering, dass diese Reaktion höchstwahrscheinlich nicht von physiologischer
Bedeutung ist.
Neben den biochemischen Untersuchungen in vitro wurde auch die Funktion der
untersuchten Proteine in vivo ermittelt. Versuche zur Deletion von iscA1 haben
gezeigt, dass dieses Gen wie syniscU für Synechocystis essentiell ist. Die Deletion
von iscA2 war hingegen möglich. Untersuchungen des Phänotyps der erzeugten
Deletionsmutante ergaben in Bezug auf Wachstum, Verhältnis der Photosysteme und
Expression und Aktivität verschiedener FeS-Enzyme keinen signifikanten
Unterschied zum Synechocystis-Wildtyp. Dies demonstriert, dass IscA1 nicht durch
IscA2 funktionell ersetzt werden kann, möglicherweise aber IscA2 durch IscA1.
Trotz ähnlicher Eigenschaften in vitro haben beide Proteine offenbar
unterschiedliche Funktionen.
Zusammengenommen geben die Ergebnisse dieser Arbeit neue grundlegende
Erkenntnisse über die Funktion und den Mechanismus der untersuchten Proteine im
Allgemeinen sowie für die Rolle der Proteine bei der Biogenese von Eisen-Schwefel-
Proteinen in Synechocystis. Aufgrund ähnlicher Enzymausstattung und dem
Modellcharakter von Synechocystis für den Chloroplasten, werfen diese Ergebnisse
auch Licht auf den Mechanismus der Biogenese von FeS-Proteinen im
Chloroplasten.
Darüber hinaus konnten in dieser Arbeit Ansätze für die weitere Untersuchung der
Biogenese von FeS-Proteinen aufgewiesen und Methoden zur Arbeit daran etabliert
werden.
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Danke ! Bei einer Arbeit, die in der Zeit von August 2000 bis zum Januar 2003 entstanden ist, ist es nicht nur wichtig, dass sie enstanden ist, sondern auch wie sie entstanden ist. Daher ein herzliches „Danke Schön“ an die Menschen, die das Zustandekommen dieser Arbeit unterstützt haben.
Prof. Dr. Matthias Rögner für die Übernahme der Betreuung der Arbeit und für Möglichkeit diese Arbeit am Lehrstuhl für Biochemie der Pflanzen anzufertigen.
Mein besonderer Dank gilt Dr. Andreas Seidler. Er war es, der mir dieses spannende Thema überlassen hat, mir den Raum und die Möglichkeit gegeben hat es frei auszufüllen und, nicht nur wenn dies mal ins Stocken geriet, mir mit Rat und Tat zur Seite stand. Dank für die vielen anregenden Gespräche, auch abseits zellulärer Biogeneseprozesse.
Prof. Dr. W. Hengstenberg danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferates.
Bei allen aktuellen und ehemaligen Kollegen der AG Seidler möchte ich mich für das gute Arbeitsklima, die Unterstützung und Aufmunterungen bedanken. Danke, Tatjana Reinholz, Martin Vollmer, Marc Novaczyk, Katharina Nünning und vor allem Ulrike Kokelj !!!
Danke an meinen alten Kindergarten- und Schulfreund Carsten Berndt. Unsere Lebensläufe sind durch die gemeinsamen Experimente noch ähnlicher geworden. Dank auch an Jens Dirk Schwenn.
Danke an Dr. E. Bill vom MPI in Mülheim, der mich in den Tiefen der Physik unterstützt hat und so manche Probe gemessen hat.
Dank auch allen anderen Mitarbeiten des Lehrstuhls Biochemie der Pflanzen. Thomas Volkmer, der trotz meiner Schwefelgerüche gute Laune im Gastlabor verbeitet hat, Tatjana Schwabe für ihre Tipps zum Proteine-Schießen, Melanie für die Mitfahrgelegenheiten nach Essen, Bernd und Dieter für die Unterstützung im Kampf gegen die „digitale Sau“, Stephan-Olav, Daniela, Wendy und allen anderen dafür, dass Arbeit auch Spaß macht.
Meinen Freunden danke ich vor allem dafür, dass ihr mich nie in meiner Freizeit über die Forschung habt erzählen lassen. Mit euch war es nie schwer die Arbeit zu verdrängen, Spaß zu haben und das Leben zu zelebrieren. Danke auch an meine große-kleine Schwester Andrea für Unterstützung und Aufmunterung.
Mein besonderer Dank gilt meinen Eltern, die mich immer unterstützt haben, mich nie gedrängt und doch gefördert haben und bei denen ich immer Ich sein durfte.
Essen, im Januar 2003
Markus Wollenberg
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Lebenslauf
Zur Person:
Name: Markus Wollenberg
Geboren am: 27.01.1975 in Essen
Familienstand: ledig, keine Kinder
Schulbildung:
1981 – 1985 Besuch der St. Elisabeth-Grundschule, Essen
1985 – 1994 Besuch des Viktoria-Gymnasiums, Essen
Zivildienst:
1994 – 1995 Zivildienst im kath. Krankenhaus Phillipusstift, Essen
Studium:
1995 – 2000 Studium der Biologie an der Ruhr-Universität Bochum
September 1997 Vordiplom Biologie
Mai 1999 – Juni 2000 Anfertigung der Diplomarbeit am Lehrstuhl für
Biochemie der Pflanzen. Thema: Biogenese von Eisen-
Schwefel-Proteinen in Synechocystis PCC 6803:
Die Rolle von NifU-homologen Proteinen
Juni 2000 Abschluss des Studiums als Diplom-Biologe an der
Ruhr-Universität Bochum
seit August 2000 Anfertigung der Doktorarbeit am Lehrstuhl für
Biochemie der Pflanzen, Ruhr-Universität, Bochum
Tätigkeiten an der Ruhr-Universität Bochum:
Mai/Juni 1998 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für
Pflanzenphysiologie
August – Dezember 1999 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für Biochemie
der Pflanzen
Seit August 2000 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Lehrstuhl für
Biochemie der Pflanzen