biofisica fisica24ore il file pdb header oxygen transport 22-jan-98 1a3n title deoxy human...

fisica24ore Biofisica

Il file PDB

HEADER OXYGEN TRANSPORT 22-JAN-98 1A3N TITLE DEOXY HUMAN HEMOGLOBIN COMPND MOL_ID: 1; COMPND 2 MOLECULE: HEMOGLOBIN; COMPND 3 CHAIN: A, B, C, D; COMPND 4 BIOLOGICAL_UNIT: ALPHA-BETA-ALPHA-BETA TETRAMER SOURCE MOL_ID: 1; SOURCE 2 ORGANISM_SCIENTIFIC: HOMO SAPIENS; SOURCE 3 ORGANISM_COMMON: HUMAN; SOURCE 4 TISSUE: BLOOD; SOURCE 5 CELL: RED CELL KEYWDS OXYGEN TRANSPORT, HEME, RESPIRATORY PROTEIN, ERYTHROCYTE EXPDTA X-RAY DIFFRACTION AUTHOR J.TAME,B.VALLONE REVDAT 1 29-APR-98 1A3N 0 REMARK 1 REMARK 2 REMARK 2 RESOLUTION. 1.8 ANGSTROMS. REMARK 3

Esempio: Deossiemoglobina umana (1a3n)

[…]

http://www.rcsb.org/pdb


ATOM 1 N VAL A 1 10.720 19.523 6.163 1.00 21.36 N

ATOM 2 CA VAL A 1 10.228 20.761 6.807 1.00 24.26 C

ATOM 3 C VAL A 1 8.705 20.714 6.878 1.00 18.62 C

ATOM 4 O VAL A 1 8.164 20.005 6.015 1.00 19.87 O

ATOM 5 CB VAL A 1 10.602 22.000 5.966 1.00 27.19 C

ATOM 6 CG1 VAL A 1 10.307 23.296 6.700 1.00 31.86 C

ATOM 7 CG2 VAL A 1 12.065 21.951 5.544 1.00 31.74 C

ATOM 8 N LEU A 2 8.091 21.453 7.775 1.00 16.19 N

ATOM 9 CA LEU A 2 6.624 21.451 7.763 1.00 17.31 C

ATOM 10 C LEU A 2 6.176 22.578 6.821 1.00 18.55 C

ATOM 11 O LEU A 2 6.567 23.730 7.022 1.00 18.72 O

ATOM 12 CB LEU A 2 6.020 21.707 9.129 1.00 18.34 C

ATOM 13 CG LEU A 2 6.386 20.649 10.198 1.00 17.39 C

ATOM 14 CD1 LEU A 2 5.998 21.119 11.577 1.00 17.99 C

ATOM 15 CD2 LEU A 2 5.730 19.337 9.795 1.00 16.96 C

ATOM 16 N SER A 3 5.380 22.237 5.852 1.00 15.02 N

ATOM 17 CA SER A 3 4.831 23.237 4.928 1.00 16.59 C

ATOM 18 C SER A 3 3.725 24.027 5.568 1.00 14.84 C

ATOM 19 O SER A 3 3.095 23.717 6.591 1.00 14.40 O

ATOM 20 CB SER A 3 4.308 22.429 3.727 1.00 16.47 C

ATOM 21 OG SER A 3 3.076 21.786 3.991 1.00 14.91 O

…

X Y Z

coordinatetipo diatomo

tipo diamminoacido


1a3ncatena A

C

O

N

S

EME

Fe


http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm

RASMOL v 2.7


Tecniche computazionali

L’utilizzo complementare di tecniche di tipo sperimentale e di tipo

computazionale è l’approccio ottimale per lo studio dei sistemi e dei processi

biologici.

Questa considerazione riguarda in particolare gli aspetti strutturali del problema, ovvero la

conoscenza della conformazione, o variazione di conformazione, di una molecola biologica in

relazione alla sua attività.


Limiti delle tecniche sperimentali

risoluzione spaziale misure ad alta risoluzione di strutture molecolari sono possibili solo per sistemi relativamente rigidi

risoluzione energetica analisi delle energie di interazione atomica difficoltosa

risoluzione temporale i primissimi eventi dei processi biologici sono di difficile misurazione


Limiti delle tecniche computazionali

Sistemi biomolecolari troppo complessi meccanica classica con funzioni di interazione semi-empiriche per descrivere le interazioni tra gli atomi di un sistema molecolare

Campionatura limitata dello spazio delle conformazioni di una macromolecola utilizzo dei dati sperimentali per restringerlo

Simulazione del comportamento di un sistema molecolare su un computer solo un numero limitato (<NA) atomi o di gradi di libertà (di solito 102-105 atomi), per un limitato periodo di tempo (102-104 picosecondi) può essere simulato piccoli sistemi, con tempi di rilassamento brevi


importanza della COMPLEMENTARITA’

DELL’APPROCCIO TEORICO-SPERIMENTALE


Alcune Applicazioni

In primis: conoscere la struttura tridimensionale a risoluzione atomica della molecola per comprendere, spiegare, e a volte anche modificare ed utilizzare, la sua attività biologica.


Monitorare i cambiamenti strutturali indotti su peptidi o proteine da parte di MEMBRANE BIOLOGICHE, i quali sembrano essere fondamentali per il riconoscimento con il recettore o per oltrepassare la fase lipidica e raggiungere zone altrimenti inaccessibili.


Effettuare MUTAZIONI puntiformi, che possono fornire indicazioni utili per il riconoscimento del sito attivo o di strutture indispensabili all'attività della molecola o dirette ad una certa funzione.


Studiare le variazioni conformazionali provocate dall’interazione della proteina con uno o più LIGANDI, la quale fornisce l’attivazione (o inattivazione) necessaria per compiere la propria funzione biologica (o per impedirla).


Comprendere il processo di FOLDING delle proteine, ovvero il meccanismo di ripiegamento con cui raggiungono la confomazione biologicamente attiva.


Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.


Modellizzazione molecolare


Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)

L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa

Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina


Diagramma di flussodella modellizzazioneproteica

Sequenza proteica

Allineamento multiplodi sequenza

Dati sperimentali

Ricerca nelle banchedati

Assegnazionedei domini

Proteinaomologa

nella banca datiPDB?

E’ statopredettoun fold?

Predizionedel fold

Predizione dellastruttura secondaria

Analisi della famiglia del fold

Allineamento dellestrutture secondarie

Allineamento dellasequenza alla struttura

Predizione dellastruttura terziaria

Modellizzazionecomparativa

Modello tridimensionaledella proteina

No

SìSì

No


che viene usata come STAMPO.

Permette di costruire la struttura tridimensionale di

una proteina

sulla base della SIMILARITÀ DI SEQUENZA con un’altra proteina

di struttura NOTA


1. Allineamento di sequenza con la/le proteina/e “stampo”

Passi fondamentali

4mdh.aa 1 SEPIRVLVTG AAGQIAYSLL YSIGNGSVFG KDQPIILVLL DITPMMGVLD 11BMD 1 KAPVRVAVTG AAGQIGYSLL FRIAAGEMLG KDQPVILQLL EIPQAMKALE *.** *** *****.**** . *. * ..* ****.** ** .* * *. 4mdh.aa 51 GVLMELQDCA LPLLKDVIAT DKEEIAFKDL DVAILVGSMP RRDGMERKDL 11BMD 51 GVVMELEDCA FPLLAGLEAT DDPDVAFKDA DYALLVGAAP RKAGMERRDL **.***.*** .*** . ** * ..**** * *.***. * *. ****.** 4mdh.aa 101 LKANVKIFKC QGAALDKYAK KSVKVIVVGN PANTNCLTAS KSAPSIPKEN 11BMD 101 LQVNGKIFTE QGRALAEVAK KDVKVLVVGN PANTNALIAY KNAPGLNPRN * * *** ** ** ** * ***.**** ***** * * *.**.. * 4mdh.aa 151 FSCLTRLDHN RAKAQIALKL GVTSDDVKNV IIWGNHSSTQ YPDVNHAKVK 11BMD 151 FTAMTRLDHN RAKAQLAKKT GTGVDRIRRM TVWGNHSSTM FPDLFHAEVD *. .****** *****.* * * * .. . .******* .**. ** * 4mdh.aa 201 LQAKEVGVYE AVKDDSWLKG EFITTVQQRG AAVIKARKLS SAMSAAKAIC 11BMD 201 GRP----ALE LVDME-WYEK VFIPTVAQRG AAIIQARGAS SAASAANAAI .. * * . * ** ** *** **.* ** * ** ***.* 4mdh.aa 251 DHVRDIWFGT PEGEFVSMGI ISDGNSYGVP DDLLYSFPVT IKDKTWKIVE 11BMD 246 EHIRDWALGT PEGDWVSMAV PSQGE-YGIP EGIVYSFPVT AKDGAYRVVE .*.** .** ***. ***.. *.*. **.* . ..****** ** . ..** 4mdh.aa 301 GLPINDFSRE KMDLTAKELA EEKETAFEFL SSA 11BMD 295 GLEINEFARK RMEITAQELL DEMEQVKALG LI ** **.*.* .*..** ** .*.* .

* aa identici. aa simili


2. Costruzione dello scheletro


3. Inserimento delle catene laterali


4. Inserimento dei loop corrispondenti a “buchi”

nell’allineamento


5. Ottimizzazione del modello

Minimizzazione energetica

Regolarizzazione di legami, angoli

e torsioni

Eliminazioni di clash strutturali


6. Controllo della qualità del modello


Meccanica molecolare

e il RICONOSCIMENTO MOLECOLARE (DOCKING).

Comprende la DINAMICA MOLECOLARE,

la RICERCA DELL’ENERGIA CONFORMAZIONALE,


Ad ogni conformazione molecolare è associata un’ENERGIA


La forma più semplice dell’energia potenziale di una molecola è :

ENERGIA pot =

Energia di ALLUNGAMENTO dei legami

+ Energia di PIEGAMENTO degli angoli di legame

+ Energia di TORSIONE degli angoli diedri

+ Energia delle interazioni di NON-LEGAME: repulsioni steriche, interazioni di Van der Waals, interazioni elettrostatiche

La meccanica molecolare considera gli atomi come sfere e i legami come molle.

Forma equazione + parametri = force field


Ricerca dell’energia conformazionale

ii rVF

Ipotesi termodinamica di Anfinsen (per proteine a singolo dominio)

L’informazione codificata nella sequenza amminoacidica di una proteina determina completamente la sua struttura nativa

Lo stato nativo è il minimo assoluto dell’energia libera della proteina


La superficie dell'energia libera configurazionale di una proteina è tipicamente "rugosa", poichè esistono

molti stati metastabili, alcuni dei quali hanno un'energia molto vicina al minimo globale (problema

della ricerca del minimo assoluto)


Conformazione energeticamente preferita

minimo globale dell'energia potenziale

equilibrio

stato più popolato

risultante delle forze nulla ii rVF


Minimizzare l'energia potenziale di una molecola significa trovare un percorso (costituito dalle variazioni dei gradi di libertà

intramolecolari) che conduca da una conformazione iniziale alla conformazione a minima energia più vicina (MINIMO LOCALE), usando

il minor numero di calcoli possibile.

Minimizzazione dell’energia


Campionamento energetico sistematico:

L’energia viene campionata ad intervalli regolari sull’intera estensione di ciascun grado di libertà (tipicamente rotazioni dei legami).


Annealing simulato: riscaldamento ad alta temperatura che modifica la struttura superando le barriere energetiche, seguito da un raffreddamento lento.


Dinamica molecolare: superamento delle barriere energetiche conformazionali (più basse dell'annealing) e analisi della stabilità strutturale.

Ricerca casuale: campionamento che genera strutture in maniera casuale, le quali vengono poi minimizzate


Dinamica molecolare

Permette lo studio di processi dinamici complessi che avvengono nei sistemi biologici. Studia sia transizioni

conformazionali che vibrazioni locali, ad esempio:

stabilità delle proteine

variazioni conformazionali

folding proteico

trasporto ionico


Calcola la TRAIETTORIA di un sistema molecolare

= la configurazione molecolare in funzione del

tempo, ovvero come variano nel tempo le posizioni,

le velocità e le accelerazioni degli atomi della

molecola.


La traiettoria è generata da integrazioni simultanee dell’ equazione del moto di Newton

Fi = mi ai

per tutti gli atomi del sistema molecolare

Tenendo presente che la forza si può esprimere come gradiente dell'energia potenziale:Fi = - dV/dri

si combinano le due equazioni e si ottiene: - dV/dri = mi d

2ri/dt2

che collega la derivata dell'energia potenziale alle variazioni di posizione in funzione del tempo ed è quella che viene integrata.


3. le accelerazioni sono determinate dal gradiente dell'energia potenziale.

Perciò per calcolare una traiettoria c'è bisogno: 1. delle posizioni iniziali degli atomi (coordinate

atomiche) 2. delle velocità iniziali 3. delle accelerazioni

1. le posizioni inziali ri si ricavano da strutture sperimentali (cristallografia raggi X, NMR ecc.) o ottenute con modeling;

2. le velocità iniziali vi si ottengono dalla distribuzione delle velocità ad una data temperatura;


In pratica si considerano intervalli di integrazione finiti t. t tipicamente va da 0.1 a 10 fs per i sistemi molecolari una simulazione di 100 ps coinvolge 105-106 intervalli di integrazione.

Le posizioni e le velocità iniziali (t = 0) determinano le posizioni e le velocità a tutti gli

altri tempi t.


Sistema allo zero assoluto

Temperatura di simulazione desiderata

Riscaldamento lento alla temperatura di simulazione

Riequilibrazione dell’energia tra gli atomi

Distribuzione iniziale di velocità vi

Energia cinetica totale del sistema


Struttura iniziale

rimuove interazioni di Van der Waals forti che porterebbero a distorsioni locali

nel caso si usi un solvente esplicito, aggiungere le molecole d’acqua

per equilibrarlo con la struttura

la simulazione prosegue finchè sono stabili nel tempo la struttura, la pressione, la temperatura (si riscalano le velocità), l'energia

Fase di simulazione vera e propria

Minimizzazione dell’ energia

Solvatazione della proteina

Minimizzazione dell’ energia in presenza

del solvente

Fase di riscaldamento

Fase di equilibrazione

si lancia la MD con velocità iniziali a bassa temperatura nuove velocità riassegnate periodicamente a T leggermente più alta e così via fino al raggiungimento della T di simulazione desiderata.


Analisi dei risultati

Campionamento periodico di coordinate (e velocità)

Calcolo dell’energia potenziale media in funzione del tempo

Calcolo della differenza con la struttura di partenza in

funzione del tempo

Calcolo della superficie accessibile al solvente e del

raggio di girazione, in funzione del tempo

Calcolo della struttura media

Residue number10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

100ps

200ps

300ps

400ps

500ps

600ps

700ps

800ps

900ps

1000ps

1100ps

1200ps

1300ps

1400ps

1500ps

1600ps

1700ps

media

-helix

-strand

S1 H1 H2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10

0 500 1000 1500 2000-900

-800

-700

-600

-500

-400

-300

-200

-100

0

100

200

Ene

rgia

pot

enzi

ale

(Kca

l/mol

)

tempo (ps)


Riconoscimento molecolare

E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch)


La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.


Elemento chiave: scoperta di composti guida nuovi e innovativi

Composto guida = composto che mostra affinità per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la

bioattività


1. Ricerca del composto guida (1-2 anni)2. Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni)3. Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni)4. Test tossicologici (1-3 anni)5. Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno)6. Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni)

tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco

è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità

Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni

Costo totale: circa $ 500 000 000


Screening sperimentale:

test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le

proprietà strutturali del recettore

Metodi computazionali

detti Rational Design:si basano su informazioni strutturali del

recettore e/o del ligando


Metodi computazionali

Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota

Structure Based Drug DesignQSAR (Quantitaive Structure-Activity

Relationship)Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore.

De Novo DesignI nuovi composti vengono generati

nel sito di legame a partire da atomi o

frammenti preposizionati nel

sito e che successivamente

vengono trasformati in

molecole intere da softwares specifici.

Screening VirtualeLibrerie di molecole

(esistenti o ipotetiche) vengono analizzate

cercando ligandi con caratteristiche in

accordo con i requisiti del sito di legame

Docking


Predice la struttura 3D di complessi proteina-ligando.

Tali funzioni valutano:

•Complementarità fra superficie

•Energia libera di solvatazione

•Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

Trova il corretto modo di legame di un composto, tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione confomazionale ligando-recettore.


Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per:•la modellazione di sistemi proteici•la comprensione dei processi biologici•la comprensione della relazione struttura-attività•la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici

Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e

indirizzando le conoscenze sperimentali

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