Trabajo de Investigación de cuerpo enteroOptimización de la producción de un extracelular frío activo proteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528 y su aplicación en la industria de los detergentes

Biodetergentes se prefieren sobre los detergentes sintéticos convencionales en vista de su mejor limpiezapropiedades, entrada de baja energía y la reducción de la contaminación. Los derivados de biodetergentesorganismos mesófilos / termófilo y también detergentes sintéticos a base de peróxido requieren altala temperatura óptima para su actividad. Por lo tanto, las enzimas activas en frío son muy útiles, ya que funcionan a menor temperaturas y no requieren el aporte de energía. El propósito de este estudio fue el optimización de la producción y purificación de la proteasa alcalina en frío activo a partir de una novela psychro-toleranteStenotrophomonas maltophilia MTCC 7528 y su aplicación como un aditivo para detergentes para el fríolavar. Psychro tolerante a proteolítica bacteria S. maltophilia MTCC 7528 se aisló a partir del suelo deGlaciar Gangotri, Himalaya Occidental, India, que produce máximo proteasa (56,2 U / ml) a 20 ° C y pH9,0 después de 120 h de incubación en condiciones de agitación (120 rev / min). La enzima purificada tiene un peso molecular de 75 kDa con la máxima actividad y estabilidad a pH 10 y 20 º C de temperatura. Se mostró una excelente compatibilidad con detergentes comerciales con mayor poder de limpieza a baja temperatura. Laenzima elimina completamente la sangre y manchas de hierba y aumenta la reflectancia en un 26 y 23%,respectivamente. Detergentes a base de enzimas encontrar una amplia gama de aplicaciones en ropa y textilesindustrias. Proteasa alcalina en frío activo de S. psychro-tolerante maltophilia puede ser un potencialcomponente para ser utilizado como un aditivo detergente para el lavado de frío que será beneficioso para ahorrar energía como que trabajan a temperaturas más bajas.

Palabras clave: proteasas alcalinas, enzimas biodetergente, frío activos, lavar el rendimiento.

INTRODUCCIONBiodetergentes, también conocidos como productos químicos verdes, cuenta por alrededor de 30% de la producción total de la enzima en todo el mundo. Proteasa se usa en detergentes para eliminar la proteína basadamanchas por hidrólisis en pequeños péptidos que son dispersarse fácilmente en el licor de lavado. En la actualidad, tiene microorganismos han reconocido que el frío-adaptado proporcionar un amplio potencial biotecnológico y la oferta numerosas ventajas económicas y ecológicas mas organismos mesófilos y termófilos y sus enzimas (Gounot, 1991; Margesin y Schinner, 1994; Brenchley, 1996; Gerday et al, 2000;. Soriano et al,. 2000; Margesin et al, 2002;. Soror et al, 2007).. En frío enzimas activas, tienen mayor eficiencia catalítica a baja temperaturas y se han aplicado en la biotecnología sólo muy poco en comparación con su mesofílico y contrapartes termófilas (Margesin et al., 2005). La aplicación de tales enzimas permite la reducción de la la temperatura y la reducción de los tiempos de procesamiento sin un pérdida de eficiencia, lo que conduce a ahorro de tiempo y energía el consumo. Por lo tanto, es deseable buscar nueva fuente de enzimas en frío activos con propiedades novedosas de tantas fuentes como sea posible. Si bien ha habido numerosos informes sobre las enzimas activas en frío producidos por microorganismos (Hamamoto et al, 1994;.. Hoshino et al, 1997; Kun-Hee et al, 1999;. Hoffmann y Decho, 2000; Huston et al, 2000;. Irwin et al, 2001;. Zeng et al, 2003),. muy poca información se ha publicado en los microbios de Gangotri regiones glaciares del Himalaya occidental que puede ser un hábitat ideal para los organismos adaptados al frío y sus enzimas. En este trabajo, reportamos la producción optimización, purificación y aplicaciones de frío-activaproteasa alcalina de Stenotrophomonas maltophilia MTCC 7528, una nueva bacteria psychro tolerante aisladosdel suelo del glaciar Gangotri.

MATERIALES Y MÉTODOSLas especies microbianas y el cultivoUna bacteria psychro tolerante a S. maltophilia MTCC 7528 fue obtenido de microbiano tipo cultura colección(MTCC), Chandigarh, India el producido una extracelular frío activo proteasa alcalina. La cepa se cultivó en agar de leche descremada contenida (g / l): leche desnatada en polvo, 100; peptona, 5 y agar, 15; y se almacena a 4 ° C (Baghel et al., 2005)

Producción de proteasa y ensayo de la enzimaLa producción de proteasa se llevó a cabo en un medio que contiene (g / l): glucosa, 10; peptona, 5; extracto de levadura, 5; KH 2 Correos 4 , 1 y Sulfato de magnesio 4 0,7 H 2 O, 0,2. El pH del caldo tratado en autoclave se ajustó (pH 7) mediante la adición de Na esterilizada 2 CO 3 solución (20% w / v). De los medios de comunicación inoculado a 1,0% (v / v) con 24 h de edad de cultivo (OD 0,6) y se incubaron a 15 ± 2 ° C en un incubador agitador refrigerado (100 rpm) durante 48 h. Los cultivos de crecimiento se centrifugaron a 4 º C (10.000 xg, 15 min) y el sobrenadante se utilizó para el ensayo de proteasa. Actividad de proteasa con azocaseína (Sigma) como sustrato fue ensayada porel método modificado de Secades y Guijarro (1999). Una unidad de actividad de la enzima se define como la cantidad que produjo un aumentar en un 420 de 0,01 en 30 min a 20 ° C. La concentración de proteínas se determinó por el método de Lowry et al. (1951) utilizando bovino albúmina de suero tal como una proteína estándar

Optimización de las condiciones de fermentaciónLos métodos adoptados para optimizar los parámetros de crecimiento de frío activo producción de proteasa tuvo como objetivo evaluar el efecto de una sola parámetro a la vez y más tarde se manifiesta como condición estándar.El tiempo de incubación que varía desde 24 hasta 168 h y los efectos de diferentes inductores (BSA, caseína, leche descremada, albúmina de huevo a razón de 0,5-1% en los medios de comunicación) se evaluaron en relación con el rendimiento de la enzima. La cultura condiciones tales como la temperatura (4-45 º C), pH (5-10) y el modo de Se optimizaron las condiciones de incubación estática y movimiento (120 rpm). Para evaluar el impacto de los metales pesados, el caldo de los medios de comunicación era complementado con un nivel de tolerancia máxima de diferentes metales y se incubaron en condiciones óptimas durante 48 h. Los metales pesados utilizados fueron co 2+ , Hg 2 + , Cd 2 + , Cu 2 + , Zn 2 + y Cr 2 + a la concentración final de 50, 10, 25, 100, 50 y 150 g / ml, respectivamente. Las enzimas producida por las células bacterianas fueron representados en términos de unidades de actividad de la proteasa en el sobrenadante del cultivo y se midió según método estándar (Secades y Guijarro, 1999). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y los resultados son la media de tres conclusiones independientes.

Extracción y purificación de la proteasaEl caldo de fermentación, se incubaron a condiciones optimizadas, fue se centrifugó a 4 º C (10.000 x g, 15 min) y la proteasa extracelular en el sobrenadante del cultivo celular libre se obtuvo por el sulfato de amonio Precipitación (Deutscher, 1990). El precipitado de proteína fue disuelto en tampón de acetato de sodio 0,05 M (pH 5) y se dializófrente al mismo tampón durante 24 h con 6-8 cambios. La fracción con máxima actividad de enzima se aplicó a la columna de DEAE-Celulosa (3 × 12 cm, genei Bangalore, India), equilibrada previamente con 0,02 M tampón de acetato de sodio (pH 5), y se eluyó con gradiente lineal de diez De NaCl (0,1-1 M, 20 ml de cada uno) en el mismo tampón. Total de 40 fracciones, 5 ml cada una, se recogieron y analizaron para proteínas y enzimas actividad. Todas las etapas posteriores se llevaron a cabo a 4 ° C. La fracción con alta actividad de proteasa se concentró por liofilización (Liofilizador MSW137, Macro Scientific Works, India).

Caracterización bioquímica de la proteasa purificadaEfecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y la estabilidad

El pH óptimo para la actividad de la enzima se determinó mediante el uso tampones siguientes: fosfato de citrato (pH 5-6), fosfato de sodio (pH 7), Tris-HCl (pH 8) y glicina-NaOH (pH 9-11). Las mezclas de reacción se incubaron a 20 ± 2 ° C durante 30 min y la actividad respectiva se midió. La estabilidad de la proteasa se determinó mediante la pre- la incubación de la enzima sin sustrato a diferentes valores de pH (5 - 11) durante 1 hora a 20 ± 2 ° C. La actividad enzimática residual en cada La exposición se midió por ensayo como estándar. El efecto de los la temperatura se determinó mediante la realización de la prueba estándar procedimiento dentro de un rango de temperatura de 4-50 ° C. Para determinar la estabilidad de la proteasa con los cambios de temperatura, la enzima era pre-incubaron a diferentes temperaturas durante 3 h y la actividad enzimática se sometió a ensayo según el protocolo estándar.

SDS-PAGE y zimogramaSe realizó la SDS-PAGE de la fracción liofilizada, utilizando un mini aparato de placa de gel (Bangalore Genei, India), por el método de Laemmli (1971). Las bandas de proteínas se visualizaron por tinción de la gel con azul de Coomassie y la masa molecular relativa de la proteína se calculó utilizando marcadores de proteínas estándar (Bangalore Genei, India) ejecutar de forma simultánea. El gel se analizó con un gel Sistema de documentación (Geneline, Spectronics Corporation, New York). Gelatina zimografía se realizó en losa de poliacrilamida gel que contenía SDS y gelatina (0,1%) como un co-polimerizado sustrato. La banda de la actividad se observó como un área transparente incoloro agotamiento de gelatina en el gel sobre el fondo azul.

Compatibilidad enzimática y el análisis de rendimiento de lavado de proteasa alcalina para el lavado frío.

Proteasa activa en frío (crudo) como un aditivo detergente se estudió por utilizando el método de Beg y Gupta (2003). La compatibilidad enzima Se estudió con detergentes comerciales. La solución de detergentes (1% w / v) se llevó a ebullición durante 10 minutos para destruir cualquier proteasa ya presente (ensayo enzimático se realizó para comprobar la actividad). La solución se incubó con detergentes fijo concentración de la proteasa para diferentes intervalos de tiempo (0,5-3 h) a 20 º C y la actividad residual se determinó en comparación con el control(Sin detergente). Los detergentes utilizados fueron Ariel y Tide (Procter and Gamble, India), Surf Excel y rueda (Hindustan Lever Ltd., India) y Nirma (Nirma Química, India). Además, la análisis de rendimiento de lavado de enzima bruta se estudió en blanco piezas de tela de algodón (5 x 5 cm) con manchas de sangre de pollo y de la hierba

savia. Concentrado hierba savia se obtiene de la maceración de fresco hierba (100 g en 100 ml de agua destilada) en un mortero y mano de mortero y filtrada mediante el uso de una gasa. Se permitió que las piezas de tela sucios

para sentarse durante la noche y tomada en frascos separados. Los siguientes conjuntos fueron preparados:a) frasco que contiene agua destilada (100 ml) + paño sucias (con sangre y la hierba de savia, de forma independiente). b) frasco que contiene agua destilada (98 ml) + paño manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v). c) frasco que contiene agua destilada (96 ml) + paño manchado + 2 ml detergente de la rueda (1% w / v) + 2 ml de enzima en bruto. Los matraces se incubaron durante 30 min (20 º C) y se enjuagaron con frío agua y luego se seca al aire. El rendimiento de lavado se analizó mediante el uso reflectancia digital de metro (Foto instrumentos eléctricos, India). La reflectancia relativa de las piezas de tela fueron examinados para probar enzima la eficiencia de la eliminación de manchas. Piezas de tela sin tratar manchados con la sangre y la hierba savia se tomaron como control (Beg y Gupta, 2003; Adinarayana et al., 2003)

RESULTADOS Y DISCUSIÓNOptimización de la producción de enzimas Efecto del tiempo de incubación

Se observó el patrón de crecimiento y producción de enzimas de 168 horas en los medios de producción de la proteasa a 15 ± 2 º C (pH 7). La producción de proteasa aumenta gradualmente y fue máxima (49 U / ml) a 120 h de incubación. La enzima la producción fue de crecimiento independiente (Figura 1). Similar a muchas enzimas proteolíticas, que también se secreta en gran medida en la fase de crecimiento exponencial tardía (Dube et al, 2001.

Efecto de la temperatura de incubación y el pH de los medios de comunicación

La temperatura tiene gran influencia en la producción de enzimas microbianas. La máxima producción de proteasa(56,2 U / ml) se obtuvo a 20 º C y totalmente inhibido en 45 ° C. Los resultados indicaron que la alta cantidad de enzima puede ser producido en entre el rango de temperatura de 15 a 25 ° C (Figura 2a). Por lo tanto, puede ser aplicable para los fines industriales que tiene pequeña variación de temperatura en proceso. El pH de la cultura afecta en gran enzimáticos procesos y transporte de compuestos a través de la célula membrana. La máxima producción de enzima era alcanzado a pH 9 (62,2 U / ml) a 120 h de incubación y 20 ° C (Figura 2b). Thangam y Rajkumar (2002) también reportado producción de proteasa en medio alcalino por Alcaligenes faecalis, pero fue dentro de un estrecho rango de pH.

Efecto de la agitación y diferentes sustratos

La producción de enzimas se aumentó dos veces a partir de 18,2 a 45,7 Um / l en condiciones de agitación en comparación con condiciones imperturbable. El uso de carbono y barato fuentes de nitrógeno son importantes, ya que pueden significativamente reducir el costo de producción de la enzima. La aislar utilizado caseína para la producción máxima de enzima (52,4 U / ml) seguido de leche descremada (46,6 U / ml), BSA (37,6 U / ml) y sealbúmina de huevo (26,3 U / ml). Sin embargo, la leche descremada es la mejor sustrato para la producción de enzima adaptada al frío desde

diferentes cepas de la Antártida sea comunicada por Dube y colaboradores (2001)

Efecto de iones metálicosLos metales pesados presentes en el entorno juegan un importante papel en el crecimiento de las bacterias. La producción de enzimas fue reforzada por Cu 2 + (126,8%) y Cr 2 + (134,6%), mientras que Co 2 + (43,5%) peor producción. Los otros metales pesados tales como Hg 2 + , Cd 2 + y Zn 2 + no tienen ningún efecto significativopero mantener más de 50% de la producción de enzimas.

Purificación y caracterización de la proteasa

La enzima se purificó parcialmente por solo paso de iones cromatografía de intercambio. La proteína de pellets obtiene después de 80% de saturación de sulfato de amonio fue disuelto en tampón de acetato de sodio y se cargó en una DEAE-celulosa columna pre-equilibrada con el mismo tampón. El perfil de elución de la columna de DEAE-celulosa

Figura 3. Cromatografía de intercambio iónico de DEAE-celulosa de sulfato de amonio precipitado con S. maltophilia sobrenadante de cultivo. Precipitado dializada se aplicó a una columna (3x12 cm) equilibrada en acetato de sodio tampón (0,02 M, pH 5). La elución se realizó con gradiente de NaCl 0,1 a 1 M. El material removido de la columna (fracción de 0,6 M) se concentró para su posterior aplicación.

cromatografía expuesto que la proteasa se eluyó como un pico único bien resuelto de actividad de la enzima en 0,6 M Concentración de NaCl (Figura 3). Aproximadamente 55 veces la purificación de la enzima en bruto se logró con la actividad específica de 20.964 U / mg y migró como una sola banda en SDS-PAGE, lo que sugiere que la proteasa purificada era homogénea

Efecto del pH y la temperatura sobre la actividad de proteasa y estabilidad

La enzima era activa sobre el rango de pH de 7 a 11 con la actividad máxima a pH 10 hacia azocaseína. Laactividad aumentó casi linealmente desde pH 6 a 10, y 84% de la actividad total de la enzima se manifiesta entre lospH 8 y 11 (Figura 4a). Los resultados que recomienda la enzima es proteasa alcalina. Era relativamente estableentre los intervalos de pH de 8 a 10 y retenido más de 93% de su actividad original (Figura 4a). Similar resultado setambién obtenido por Margesin et al. (2005) para purificarse proteasa de Pedobacter cryoconitis. El efecto de lala temperatura en la actividad de la proteasa se muestra en la Figura 4b. La temperatura óptima de 20 º C se retiene el 100% de actividad de la enzima y por lo tanto puede ser clasificado como en frío proteasa tolerante (Morita, 1975). La actividad de proteasa fue aumentó de 4 a 20 º C después de que se ha rechazado. La la actividad de la enzima no se vio afectada después de repetidas congelación y descongelación. La enzima fue estable a 20 º Cjunto con la actividad 85% entre 4 a 20 ° C (Figura 4b).

Las proteasas de estas características y sus productores organismos pueden tener aplicaciones interesantes enprocesos biotecnológicos.

La masa molecular de la proteasa

La masa molecular de la enzima se determinó en la base de su movilidad relativa a los patrones de proteínasen SDS-PAGE mediante el uso de sistema de documentación de gel. Por interpolación, la masa molecular del polipéptido único cadena era 75 kDa. La actividad proteolítica de la proteína banda fue confirmada por análisis de zimograma. Similar masas moleculares también se ha informado de otra proteasas alcalinas previamente caracterizados (Thangam y Rajkumar, 2002).

Estabilidad de la proteasa con detergente y lavado análisis de rendimiento a baja temperatura

Además de pH, se espera una buena proteasa detergente ser estable en presencia de detergentes comerciales enbaja temperatura para el lavado en frío. Proteasa purificada a partir S. maltophilia expuesto tremenda estabilidad ycompatibilidad con una amplia gama de localmente disponibles detergentes comerciales a 20 ° C (Figura 5a). Similar resultados se obtienen también por otros trabajadores de diferentes cepas de Bacillus sp. pero a 60 ° C (Adinarayana et al., 2003; Beg y Gupta, 2003). Era más estable con

Figura 4. Influencia del pH (a), y la temperatura (b) en la actividad (♦) y la estabilidad (○) de la purificadoproteasa. La actividad relativa se define como el porcentaje de actividad detectada con respecto a lamáxima actividad de proteasa

«Detergente Wheel 'conserva la actividad 92 y el 87% después de 0,5 y 1,0 h de incubación (Figura 5a). Sin embargo, más de Actividad de 65% se mantuvo con toda la probada detergentes, incluso después de 3 h. En comparación con la anterior resultados, es evidente a partir de la figura 5b que la proteasa alcalina de S. maltophilia exhibió alta eficiencia para la extracción de sangre y manchas de hierba a 20 º C y los aumentosla reflectancia en un 25,7 y un 23,2% de la sangre y la hierba manchas, respectivamente (Figura 5b). Por lo tanto, puede ser recomendado que la suplementación de la frío-activa aislado proteasa alcalina a partir de S. maltophilia MTCC 7528 podrían significativamente animar la limpieza de la manchas proteináceas que resulta en la remoción completa manchas a baja temperatura.

Conclusión

La alta actividad de las enzimas a bajas y moderadas temperaturas ofrece potenciales beneficios económicos (Gerday et al., 2000). La capacidad de los microorganismos para crecer más amplia gama de temperatura los hace atractivos para los aplicaciones industriales y biotecnológicas (Kuddus y Ramteke, 2009). El presente análisis microbiano concluyó que aísla la proteasa alcalina a partir de S. maltophilia MTCC 7528 es una proteasa activa en frío que es estables a pH alcalino y con detergentes comerciales. Estas propiedades indican las posibilidades de esta proteasa como un aditivo detergente para el lavado en frío para mejorar la la limpieza de las manchas proteínicas. El lavado con

Figura 5. (A) La estabilidad y compatibilidad de la proteasa alcalina de S. maltophilia en la presencia de detergentes comerciales a pH 10 y 20 º C de temperatura. (B) Lavado el rendimiento de la proteasa alcalina a partir de S. maltophilia en combinación con detergente comercial (Rueda) a 20 º C. Cuando, (A) de tela manchada con

sangre, (B) Tela manchada de sangre se lava con detergente solo, (C) paño manchado de sangre lavó con detergente y enzima, (D) de tela manchada con la hierba savia, (E) Hierba savia manchado tela lavada con detergente solo, (F) Grass tela manchada savia lava con detergente y enzima.detergentes también requiere una gran cantidad de energía en particular cuando hecho a alta temperatura debido a base de peróxido blanqueadores necesitan mayor temperatura para que funcione correctamente. Por lo tanto, la reducción de la temperatura de lavado mediante el uso de frío-activa proteasa puede ahorrar mucha energía. El organismo también puede encontrar aplicaciones en biorremediación ambiental de los residuos proteínicos en las regiones frías.