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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
BIOCIDAS NATURAIS E SEUS REFLEXOS SOBRE
CONTAMINANTES NA PRODUÇÃO DE ETANOL
Flávio Badin
Orientadora: Profa. Dra. Márcia Justino Rossini Mutton
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Microbiologia (Microbiologia Agropecuária).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Dezembro de 2010
Badin, Flávio B136b Biocidas naturais e seus reflexos sobre contaminantes na
produção de etanol / Flávio Badin. – – Jaboticabal, 2010 iii, 51 f. ; 28 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista,
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2010 Orientadora: Márcia Justino Rossini Mutton
Banca examinadora: Flávia Cecílio Ribeiro Bregagnoli, Francisco Vicente Gaiotto Cleto
Bibliografia 1. Etanol. 2 Extrato de Própolis. 3. Leveduras. I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 663.52 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
FLAVIO BADIN - nasceu aos 08 de abril de 1981, na cidade de Londrina,
estado do Paraná. Em 2003 ingressou no curso de Química da Universidade Federal
de Uberlândia, estado de Minas Gerais. Desenvolveu pesquisas em biosegurança
laboratorial e reformulação de práticas laboratoriais durante a graduação. Na mesma
época lecionou como professor voluntário de Química e Física em cursinhos
alternativo e como professor de Química para o curso preparatório para as forças
armadas e perícia técnica. Estagiário de 4/02/2006 a 26/05/2006 em indústria no
setor de controle de qualidade de produtos domiciliares, como parte obrigatória para
conclusão do curso de Graduação em Química. Recebeu o título de Licenciatura
Plena em Química em janeiro de 2006 e o de Bacharel em Química em julho do
mesmo ano. No período de 20/06/2006 a 08/08/2006 realizou estágio em linha de
produção de produtos automotivos. De abril de 2007 a outubro de 2008 lecionou
aulas de Física em Jaboticabal-SP. A partir de outubro de 2007 passou a integrar o
quadro de estagiários do Laboratório de Tecnologia de Açúcar e Álcool do
Departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP. Em agosto de 2008 ingressou no
curso de mestrado do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agropecuária,
obtendo o título de mestre em Microbiologia (Microbiologia Agropecuária) em
dezembro de 2010.
Sofremos muito pelo pouco que nos falta e gozamos pouco pelo muito que temos
Willian Shakespeare
AGRADECIMENTOS
À Jesus Cristo, pela sua misericórdia e compaixão.
À UNESP, pela oportunidade de realizar o curso de mestrado em Microbiologia
Agropecuária.
À agência CAPES, pela bolsa de mestrado concedida durante o curso.
A professora Doutora Márcia J.R.Mutton e ao professor Miguel A.Mutton pelo auxílio,
dedicação, apoio e orientação nos momentos difíceis.
A professora Doutora Eliana L. Macedo, que abriu a primeira porta para fazer estágio
na respectiva universidade.
A professora de química da Escola Estadual Messias Pedreiro-Uberlandia-MG-
Rosilene Souza M. Ferreira, por ter-me despertado o interesse em Química.
Ao Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia pela qualidade no
ensino oferecido, e os seus respectivos docentes.
Aos alunos estagiários do LABTAA, Igor, Gustavo, Lydiane, Daniele, Aline Jéssica,
Larissa, Leandro, José, Vitor e Rafael,
Aos meus companheiros de pós-graduação, Gisele, Leonardo e Tatiana e aos que
formaram anteriormente, e deixaram muitas saudades Débora e Cidinha.
Ao amigo Sérgio Nobukuni, pela paciência e orientação nas análises tecnológicas.
Ao meu orientador espiritual e amigo Pastor Gideone de Moraeis e a igreja
Redenção por ter me acolhido com tanto amor e carinho. Deus o abençoe.
Ao meu pai, Haroldo Badin, formado nessa respectiva instituição, o qual me ajudou
desde a graduação e sempre me apoiou em meus estudos e decisões.
A minha mãe, Maria A.M. Badin, por ter se dedicado e me ajudado no decorrer do
experimento do mestrado.
Ao meu irmão, Andre Badin, pela amizade e companheirismo.
À família Mendes de Jaboticabal e região, tios, tias e primos.
À família Badin de São Paulo.
Ao meu grande amigo Eduardo Borgato Barbedi, pelo companherismo na época da
graduação e pela amizade duradoura.
Ao meu tio Mauro Mendes Sobrinho (in memoriam), pela amizade que sempre
tivemos. Sinto saudades.
SUMÁRIO
Página
RESUMO ..................................................................................................................... ii SUMMARY ................................................................................................................. iii I. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 1 II. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 3 2.1 Matéria-prima ..................................................................................................... 3 2.2 Leveduras fermentadoras ................................................................................... 4 2.3 Processo fermentativo e Microrganismos Contaminantes .................................. 6 2.4 Biocidas utilizados no controle de contaminantes ............................................ 10 2.5 Compostos Secundários Produzidos................................................................ 14 III. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 16 3.1 Material ............................................................................................................. 16 3.1.1 Própolis .................................................................................................... 16 3.1.2 Caldo de Cana.......................................................................................... 16 3.1.3 Leveduras ................................................................................................. 17 3.2 Preparo dos Biocidas ....................................................................................... 17 3.2.1 Extrato Hidroalcoólico de Própolis (EHP) ................................................. 17 3.2.2 Extrato de Própolis em Óleo de Vegetais (EOP). ..................................... 17 3.2.3 Monensina sódica (Kamoran WP) ............................................................ 18 3.3 Ensaio Preliminar ............................................................................................. 18 3.4 Tratamentos e Delineamento Experimental ..................................................... 20 3.5 Preparo do Mosto ............................................................................................. 20 3.6 Preparo do Inoculo ........................................................................................... 21 3.7 Condução da Fermentação .............................................................................. 21 3.8 Análises Microbiológicas. ................................................................................. 22 3.9 Análises tecnológicas do mosto e vinho ........................................................... 23 3.10 Análise Estatística .......................................................................................... 24 IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 25 4.1 Características químico-tecnológicas do caldo e do mosto .............................. 25 4.2 Características microbiológicas do caldo e do mosto ....................................... 27 4.3 Análises Químico-Tecnológicas do Vinho ........................................................ 32 4.4 Composição do Destilado ................................................................................. 33 V. CONCLUSÕES ..................................................................................................... 38 VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 39 APÊNDICE ................................................................................................................ 47
ii
BIOCIDAS NATURAIS E SEUS REFLEXOS SOBRE CONTAMINANTES NA
PRODUÇÃO DE ETANOL
RESUMO- As indústrias sucroenergéticas têm como preocupação o controle de
contaminantes da fermentação, responsáveis por afetar a viabilidade da levedura,
provocando diversos transtornos no processo, comprometendo a eficiência
fermentativa e o rendimento industrial. Dentre as alternativas para o controle das
contaminações, destacam-se o uso de antimicrobianos sintéticos. Sua utilização
continua pode favorecer o desenvolvimento de cepas resistentes, contribuindo para
o incremento do custo de produção, além da possibilidade de incorporação de
resíduos no produto final. Objetivou-se avaliar o efeito do biocida convencional
(monensina sódica) e biocidas naturais preparados à base de própolis (Extrato
Hidroalcoólico de Própolis - EHP e Extrato Oleoso de Própolis- EOP) sobre a
fisiologia das leveduras, o controle dos contaminantes do processo fermentativo e
composição do destilado. O delineamento experimental utilizado foi o Inteiramente
Casualizado com parcelas subdivididas, com 4 repetições. Os Tratamentos
Principais foram: Testemunha, EOP, EHP e monensina sódica (Kamoran WP). Os
Tratamentos Secundários constituíram-se nos 10 ciclos fermentativos. Avaliaram-se
as características químico-tecnológicas do caldo, mosto e vinho, parâmetros
microbiológicos das leveduras e composição do destilado obtido. Os resultados
obtidos demonstraram que os biocidas avaliados apresentaram efeito similar, sendo
efetivos no controle dos contaminantes da fermentação, não afetando
negativamente suas características fisiológicas. Não afetaram a composição a
composição do destilado final obtido.
Palavras-chave: etanol, monensina sódica, extrato de própolis e leveduras
iii
NATURAL BIOCIDES AND ITS REFLEXES UNDER ETHANOL PRODUCTION
CONTAMINANTS.
SUMMARY –The control of fermentation contaminants is one of the sugar mills
concerns. The fermentation contaminants are responsible to affect the yeast viability,
generating several overturns to the process, compromising the fermentative
efficiency as well the industrial yield. Among the alternatives to control contamination,
the use of synthetic antimicrobials can be highlighted. Its progressed use may favor
the development of resistant strains, contributing in production cost improving,
besides the possibility of residues incorporation into the final product. This work
aimed evaluate the effect of conventional biocides (sodic monensin) and natural ones
based on propolis (Propolis Hydroalcoholic Extract – EHP and Propolis Oily Extract –
EOP) under the yeasts physiology, the fermentative process contaminants control,
and the distilled composition. The experimental design used was the split-plot with
four replications. The main treatments were: Control, EOH, EHP, and sodic monensin
(Kamoran WP). The secondary treatments were the 10 fermentative cycles. The
evaluated characteristics were: juice, must, and wine chemical-technical
characteristics, yeasts microbiologic parameters, and the distillated obtained
composition. The results obtained showed that the evaluated biocides presented
similar effect, being effectives to control the fermentation contaminants, not affecting
negatively its physiologic characteristics. They did not affect the composition of the
distilled obtained.
Keywords: ethanol, sodic monensin, propolis extract, yeasts.
I. INTRODUÇÃO
O Brasil é o maior produtor mundial de etanol, utilizando como matéria-prima
a cana-de-açúcar. Este biocombustível tem se destacado no cenário nacional e
internacional por ser renovável, menos poluente que os derivados de petróleo e de
custo relativamente baixo, especialmente considerando-se o etanol produzido a
partir de milho.
De acordo com informações da CONAB (2010) na safra 2010/2011 serão
processados 664,3 milhões de toneladas de colmos de cana, destinados a produção
de açúcar, etanol, além de diversos produtos. A estimativa de produção de etanol
para o Brasil é de 28,5 bilhões de litros, dos quais 26,3 bilhões serão produzidos na
região Centro-Sul e destes 16,2 bilhões pelo estado de São Paulo.
A produção é realizada através do processo fermentativo, graças a ação
biológica das leveduras, que convertem os açúcares presentes no mosto, em etanol,
gás carbônico e compostos secundários. Entretanto, a levedura necessita de
condições favoráveis do meio para que suas atividades metabólicas sejam
adequadas, resultando em processo eficiente, com rendimentos industriais
satisfatórios.
O controle e o monitoramento da fermentação alcoólica são de extrema
importância, uma vez que a presença de microrganismos contaminantes provoca
diversos transtornos no processo, afetando-o diretamente. A utilização de
antibióticos apresenta-se como uma das possibilidades para controle, em virtude de
suas propriedades bactericidas e/ou bacteriostáticas.
Porém o uso contínuo destes produtos pode favorecer o desenvolvimento de
linhagens resistentes, tornando-as cada vez menos sensíveis à sua ação, gerando
um alto custo do processo de produção, além de possibilitar a incorporação de
resíduos no produto final obtido. A utilização de biocidas naturais, que possuem
mais de um princípio ativo, apresenta-se como alternativa a ser empregada.
2
Neste contexto, o presente estudo objetivou avaliar a eficiência de biocidas
naturais (própolis extraído em etanol e em solvente oleoso), em relação ao biocida
sintético de ampla utilização pelas unidades produtoras de etanol, seus reflexos
sobre a contaminação bacteriana e a microbiota fermentadora, além da composição
final do destilado obtido.
II. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Matéria-prima
A qualidade da matéria-prima pode ser influenciada por diversos
fatores. Dentre eles MUTTON & MUTTON (2002) destacaram a cultivar, condições
edafoclimática, ocorrência de situações estressoras, tais como a falta ou o excesso
de chuvas e a presença de pragas e/ou doenças, planejamento agrícola incluindo a
maturação e o manejo da colheita. Neste contexto, a ocorrência de fatores limitantes
para o desenvolvimento da cana-de-açúcar pode resultar em prejuízos para a
qualidade, com reflexos diretos e indiretos sobre o processamento industrial dos
colmos (MUTTON, 2008).
Para STUPIELLO (1992) a qualidade pode ser definida como “o conjunto de
características da matéria-prima compatível com as exigências da indústria, dentro
de uma variabilidade controlada. A cana-de-açúcar deve atender a uma conjunção
de parâmetros tecnológicos e microbiológicos que definam a sua qualidade e
tenham uma influência fundamental no seu processamento”.
De acordo com MUTTON (2008) a matéria-prima utilizada na indústria
sucroalcooleira corresponde aos colmos de cana acrescidos de impurezas
agregadas, que podem ser de natureza vegetal e/ou mineral. Essas são intrínsecas,
podendo ser alteradas pelo manejo agrícola, acabando por definir o potencial de
produção da matéria-prima para açúcar, etanol ou outros produtos (FERNANDES,
2006).
CLARK & LEGENDRE (1999) relataram que a utilização de matéria-prima
com características não desejadas compromete o processamento industrial,
reduzindo eficiências e rendimentos, afetando diretamente a composição dos
produtos finais obtidos. Deste modo verifica-se que a qualidade da matéria-prima
4
encontra-se diretamente relacionada com o desempenho dos processos industriais,
fundamentais na obtenção de rendimentos satisfatórios e qualidade do produto final.
Neste contexto, a sanidade da cultura apresenta efeitos diretos e significativos
sobre a qualidade da matéria-prima. Segundo observações de MUTTON (2008), sob
situações de estresse a planta passa a utilizar as reservas de açúcares,
anteriormente acumulados objetivando o armazenamento de sacarose nos colmos,
para produção de biomoléculas que auxiliarão no processo de defesa contra o
agente agressor. Deve-se esclarecer ainda que, o controle inadequado destes
agressores, proporciona aumento do número de microrganismos contaminantes, que
por sua vez, ao consumirem açúcar levam a formação de ácidos e outros produtos
secundários. Estes causam inibição das leveduras fermentadoras, trazendo prejuízo
ao processo, incrementando as perdas no rendimento alcoólico e alterações na
composição do destilado (RAVANELI et al., 2006).
Neste contexto, o ataque de pragas como a cigarrinha-das-raízes, broca da
cana, Sphenophorus levis, broca gigante da cana, dentre outras, além do
surgimento recente de doenças como ferrugem laranja tem interferido negativamente
sob a produção e a qualidade da matéria-prima a ser processada na indústria.
2.2 Leveduras fermentadoras
As fermentações industriais geralmente iniciam-se através da inoculação de
uma massa de células proveniente de cepa de levedura selecionada, denominada
inoculo. Ao longo do desenvolvimento dos ciclos fermentativos, verifica-se
freqüentemente a substituição natural das cepas que iniciaram o processo, por
outras denominadas contaminantes, nativas, invasoras. De acordo com MUTTON
(1998) dependendo das características apresentadas pela linhagem oportunista, tais
como agressividade na competição por nutrientes, maior velocidade de
multiplicação, pressão de seleção favorável e das condições predominantes no
processo, ela pode adaptar-se com grande facilidade e sobressair-se no ambiente
fermentativo. Como conseqüência, o processo pode ser negativamente afetado,
através de redução no rendimento alcoólico, maior tempo de fermentação, assim
como produção de metabólitos indesejáveis. De modo semelhante, o autor relata
5
que sob condições adversas, verifica-se o estresse da levedura resultando em
redução da sua viabilidade.
CHERUBIN (2003) estudando o comportamento fisiológico de linhagens de
Saccharomyces cerevisiae, observou que a queda da viabilidade celular era
resultado de estresses provocados pela ação da temperatura, teor alcoólico, autólise
e liberação de aminoácidos. Estes agentes foram considerados os principais
promotores da elevação da contaminação bacteriana, especialmente o estresse
térmico.
A temperatura do processo fermentativo é fator de grande importância. SILVA
(2000) relata que as leveduras são mais efetivas quando trabalham na faixa de
temperatura entre 26 e 32ºC. Segundo STUPIELO & HORII (1981) e NOGUEIRA &
VENTURINI-FILHO (2005) temperaturas inferiores a 30-32ºC prolongam o tempo de
fermentação, provocando redução significativa na atividade fisiológica das
leveduras. Ao mesmo tempo ANGELIS (1992) alerta que sob temperaturas abaixo
dos valores considerados ideais para as leveduras é necessário um maior gasto de
energia para que esta complete o ciclo celular, observando-se redução do
crescimento e incremento do tempo de geração.
De modo semelhante, estes autores observaram que sob temperaturas muito
elevadas, superiores a 40ºC podem acarretar enfraquecimento do fermento, inibindo
o crescimento celular, assim a maioria das leveduras deixa de se multiplicar, perde a
viabilidade especialmente na presença de elevados teores de etanol. Essas
condições apresentam-se como ótimas para o desenvolvimento de microrganismos
contaminantes, resultando em perdas de álcool por evaporação, além da produção
de diversos metabólitos.
A concentração de açúcares no meio é fator determinante para a ocorrência
da respiração e/ou fermentação no meio. De acordo com LEHNINGER (2000)
elevados teores no substrato promovem a inibição da síntese de enzimas
respiratórias, resultando em inatividade das mitocôndrias. Este efeito de repressão
da respiração nas células de leveduras graças a elevadas concentrações de
açúcares é conhecido por Efeito Crabtree. Através do processo de adaptação que
envolve a transferência gradual das células de levedura para substratos contendo
6
concentrações mais elevadas de açúcares é possível aumentar a tolerância do
inoculo (MUTTON, 1998).
Para ANGELIS, (1992) a concentração de açúcares presentes no meio afeta
tanto a produção de biomassa celular como o processo fermentativo. Quando a
levedura está se multiplicando na dorna é preciso manter baixa a concentração de
açúcares para evitar a fermentação. A partir do momento em que a quantidade de
células é obtida, eleva-se a concentração de açúcares para inverter o processo,
favorecendo a fermentação.
O bom desenvolvimento do processo fermentativo depende também das
condições de acidez e do pH do meio (MUTTON, 1998). A levedura apresenta
desenvolvimento normal em faixa de pH entre 4,5 e 5,5, e acidez na faixa de 2,5 a
3,0g ácido sulfúrico.L-1 de mosto, não devendo ultrapassar os 5,0g.L-1. De acordo
com NOVAES (1980), teores excessivos de acidez podem destruir as células de
leveduras, ao passo que valores muito baixos não favorecem o desenvolvimento da
levedura, facilitando as contaminações bacterianas.
Outra influência negativa para as células de leveduras que se deve considerar
é o teor de etanol no meio. Sua influência é significativa, segundo TROYER (1953),
pois promove uma ação inibitória do metabolismo das leveduras, já que como
produto da fermentação, ele tende a se acumular no interior da célula, tornando-se
limitante para sua própria produção.
Concentrações relativamente baixas de etanol no meio já são suficientes para
inibir o crescimento das células de leveduras. Na fermentação, as células parecem
ser tolerantes ao etanol até que este atinja aproximadamente concentração de 20%
(v.v-1) (NAGODAWITHANA & STEINKRAUS, 1976). A ação estressante do etanol
sobre a levedura pode ser potencializada, pelo excesso de acidez e temperaturas
inadequadas na fermentação (AMORIM, 2005).
2.3 Processo fermentativo e Microrganismos Contaminantes
A fermentação alcoólica é um processo bioquímico, através do qual os
microrganismos transformam os açúcares em etanol e CO2 (LEHNINGER et al.,
2000). De acordo com STUPIELLO & HORII (1981) esta ocorre através de reações
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multienzimáticas pela ação de microrganismos fermentadores, sendo que as
leveduras do gênero Saccharomyces cerevisiae se destacam como as mais
importantes.
A eficiência da fermentação é diretamente afetada por diversos fatores que
atuam de modo direto ou indireto. Dentre eles MUTTON & MUTTON (2002)
destacam: a qualidade da matéria-prima, a composição do caldo extraído, pH,
acidez total, presença de microrganismos contaminantes, temperatura, concentração
de açúcares do meio, etanol e disponibilidade de nutrientes.
Informações de AMORIM (1996) estabelecem que a quantificação do pH é um
fator de grande importância quando se objetiva o controle da contaminação
bacteriana na fermentação alcoólica. A princípio o tratamento ácido pode
apresentar-se também como estressante para a levedura, sendo prejudicial, se os
efeitos desta operação provocar conseqüências sobre a fisiologia das células,
alterando seu funcionamento. Entretanto sua ação importante é retardar a
multiplicação das bactérias minimizando a contaminação, que afetam o processo,
reduzindo a eficiência fermentativa (AMORIM, 1996 e MUTTON, 1998).
As leveduras são células consideradas acidófilas, ou seja, são altamente
tolerantes a variações de pH do meio, e podem trabalhar em faixas de pH que
variam desde 2,4 a 8,6 (ANGELIS, 1992). Os valores ideais recomendados para o
processo fermentativo estão na faixa de 3,5 a 4,5.
De acordo com MUTTON (1998) a maioria dos ácidos presentes no caldo da
cana extraído são ácidos orgânicos, em baixas concentrações, representando a
maior proporção da acidez titulável do caldo. Dentre eles, os mais importantes são: o
aconítico, cítrico, málico, oxálico, succínico, fumárico e fosfórico. Cabe destacar que
estes compostos têm um importante efeito nas reações de clarificação do caldo,
sendo inibidores da ação fisiológica das leveduras, especialmente da brotação das
células.
A presença de microrganismos contaminantes inicia-se no campo, uma vez
que fazem parte do ambiente de produção da cana-de-açúcar. Entretanto, de acordo
com STUPIELLO & HORII (1981) a infecção pode aumentar durante o período entre
o corte-carregamento-transporte e o processo de extração, sob condições favoráveis
de desenvolvimento.
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A qualidade do caldo e do mosto pode ser prejudicada pelas bactérias
presentes na matéria-prima uma vez que estes são ótimos substratos para o
crescimento de microrganismos devido aos altos teores de nutrientes orgânicos
como glicose e frutose, e inorgânico como nitrogênio, fósforo e potássio, alta
atividade de água, pH superior a 4,5, além da temperatura utilizada nos processos
industriais de fermentação (GALLO, 1989; GALLO & CANHOS, 1991).
Os microrganismos contaminantes afetam diretamente a fermentação, dentre
eles destacam-se fungos, bactérias e leveduras, os quais não são direcionados para
o processo da fermentação (MUTTON, 1998). Leveduras contaminantes são
aquelas presentes no processo fermentativo que não foram selecionadas para a
condução da produção de álcool, as quais prejudicam o processo causando
problemas e aumentando o tempo de fermentação (CABRINI & GALLO, 1999).
Ao mesmo tempo, a contaminação bacteriana é considerada o maior agente
estressante no processo fermentativo, ela compete com a levedura na dorna
consumindo os açúcares presentes no mosto (AMORIM, 1996). Como
conseqüência, observa-se prejuízos no rendimento da fermentação já que esses
microrganismos ao degradarem o açúcar do meio, liberam metabólitos indesejáveis
como ácidos orgânicos que podem agir como inibidores da fermentação, além disso,
causam a floculação do fermento pela formação de gomas e espumas (YOKOYA,
1991; MUTTON, 1998).
Dentre os microrganismos responsáveis pela redução no rendimento da
fermentação alcoólica destacam-se as bactérias pertencentes aos gêneros
Acetobacter, Clostridium, Aerobacter, Streptococus (AMORIM & OLIVEIRA, 1982),
Pseudomonas, Enterobacter, Klebsiella, Micrococcus, Arthrobacter,
Corynebacterium, Streptomices, Actinomyces , Leuconostoc, Bacillus e Lactobacillus
(BEVAN & BOND, 1971) e os fungos (leveduras e bolores) como Saccharomyces,
Torula, Pichia, Penicillium, Aspergillus, Cladosporium (BEVAN & BOND, 1971) e
Candida (CABRINI & GALLO, 1999).
Segundo GALLO (1992), as bactérias participam ativamente da deterioração
da cana colhida. Por esta razão o processamento da matéria-prima deve ser
realizado no menor tempo de estocagem possível. Os metabólitos resultantes de
sua atividade são indesejáveis e dificultam as etapas de fermentação, causando
9
alterações desfavoráveis às leveduras durante o processamento, provocando a
floculação e perda do fermento, consumindo a sacarose e outros nutrientes do
mosto, comprometendo o rendimento alcoólico.
Relatos de AMORIM & OLIVEIRA (1982), informam que bactérias do gênero
Leuconostoc e Bacillus apresentam habilidade para quebrar a sacarose, formando
polímeros de alto peso molecular, que são constituídos por resíduos de glicose ou
frutose. Estes polímeros apresentam efeito negativo durante o processamento
industrial, podendo entupir as tubulações dos trocadores de calor e outras
canalizações, além de aumentarem a viscosidade do vinho, obstruindo os bicos das
centrífugas. De modo semelhante, as bactérias do gênero Acetobacter e
Gluconobacter oxidam o etanol em ácido acético, aumentando a acidez volátil e fixa
nos vinhos. Segundo CONNOLY (1999) um dos grupos de contaminante mais
encontrado na fermentação alcoólica é o de bactéria láticas devido a sua alta taxa
de crescimento, tolerância à altas temperaturas, alto teor alcoólico e pH menor que
4,5. AMORIM & OLIVEIRA (1982) destacam ainda que os gêneros Lactobacillus,
Leuconostoc, Lactococcus e Pediococcus produzem grande quantidade de ácido
lático a partir da glicose. Para YOKOYA (1995), as bactérias do gênero Clostridium
são responsáveis pela formação dos ácidos butírico, fórmico e acético, que de modo
semelhante são nocivas a ação das leveduras durante o processo fermentativo.
Estudos realizados por TILBURY (1975) indicam que dentre as perdas
quantificadas para o processo fermentativo, 63% são decorrentes da atividade
bacteriana, 25% resultados de inversão enzimática e 13% de inversão química. A
diminuição da produção pode estar relacionada também ao consumo de açúcar
pelos contaminantes, excesso de ácidos, floculação do fermento, dentre outros
(AMORIM & OLIVEIRA,1982).
Os microrganismos contaminantes são também reciclados com o fermento e
isto pode causar muitos problemas, gerando competição entre bactérias e leveduras
pelo mesmo substrato (OLIVA-NETO & YOKOYA, 2001). Neste sentido o
reaproveitamento do inoculo estimula a multiplicação bacteriana graças ao
enriquecimento do meio causado pelas substâncias intracelulares e aminoácidos
produzidos pelas células de leveduras, de acordo com relatos de OLIVA-NETO
(1995) e CHERUBIN (2003).
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Segundo ALCARDE & WALDER (1997), o cultivo conjunto de Saccharomyces
cerevisiae com bactérias contaminantes da fermentação alcoólica, apresentou
contagens na ordem de 106 a 108 UFC.mL-1 no período de 0 a 72 horas de cultivo.
Estes níveis são considerados prejudiciais ao rendimento da fermentação e a
viabilidade celular das leveduras.
Estudos realizados por ANTONINI (2004) mostram que uma concentração
bacteriana de 109 UFC.mL-1 provocou uma queda significativa sobre o rendimento
alcoólico com populações de Lactobacillus e Leuconostoc, sendo a viabilidade das
leveduras reduzidas. NARENDRANATH, et al. (2001) ressaltam a necessidade de
redução dos microrganismos contaminantes no mosto e conseqüentemente dos
metabólitos presentes. Este procedimento favorece a manutenção das taxas de
produção e rendimento alcoólico.
Objetivando controlar a infecção KELSALL & LYONS (2003) recomendam a
adequação do ambiente em que se realizará a fermentação alcoólica. Dentre os
cuidados destacam a limpeza constante das dornas de fermentação, não formação
de “pontos mortos” nas tubulações de mosto e vinho, maximização de condições que
favoreçam o crescimento da levedura, fermentações rápidas com temperatura
controlada, além da utilização de agentes antibacterianos
2.4 Biocidas utilizados no controle de contaminantes
Durante a realização do processo fermentativo, o controle e o monitoramento
da microbiota fermentadora são de fundamental importância para a redução dos
problemas causados pelas contaminações, além da possibilidade de se obter
maiores rendimentos e eficiências.
As bactérias contaminantes presentes no caldo, sob condições favoráveis,
multiplicam-se, provocando diversos transtornos na condução do processo. Dentre
as técnicas utilizadas para o controle de contaminantes destaca-se o uso de
biocidas os quais, em virtude de suas propriedades bactericidas ou bacteriostáticas,
funcionam como agentes desinfetantes, reduzindo a contaminação. Para tanto deve-
se cuidar para que os produtos empregados sejam adequados e a dosagem correta,
11
tendo em vista que se objetiva apenas a população de bactérias e não a de
leveduras (ANTONINI, 2004).
Entretanto, de acordo com OLIVEIRA FILHO (2010) o uso contínuo de tais
antimicrobianos pode facilitar o desenvolvimento de linhagens resistentes, tornando-
as cada vez menos susceptíveis a sua ação, elevando os custos de produção, além
da possibilidade de incorporação de resíduos no produto, podendo comprometer e
até desqualificar o produto final obtido.
Por muito tempo o ácido sulfúrico, destacou-se como um dos produtos mais
utilizados pela indústria sucroalcooleira para o controle de microrganismos
contaminantes. Estudos de GALLO & CANHOS (1991) constataram que o
tratamento do fermento com ácido sulfúrico, por um tempo de 2 horas a pH 2,5,
provocou uma redução média de 44,38% na microbiota bacteriana presente.
Entretanto deve-se considerar a diversidade de antissépticos que estão
disponíveis para a agroindústria sucroalcooleira. De acordo com RANG et al.(1995)
a ampicilina é um antimicrobiano sintético do tipo penicilina, de amplo espectro,
sendo um quimioterápico do grupo β-lactâmico que interfere na síntese de
polipeptidioglicano, na parede celular bacteriana, atuando como inativador de um
inibidor das enzimas autolíticas, conduzindo à lise da bactéria. Deve-se considerar
ainda que a ampicilina é destruída por algumas bactérias que produzem β-lactamase
e por muitos microrganismos Gram-negativos. De modo semelhante CHANG, et al.
(1997) constataram que a aplicação de sulfito em meio fermentativo, reduziu o
número de células de L. fermentum de 3,1x108 para 1,9x107 células.mL-1,
aumentando a concentração de etanol de 57,2 para 78,1g.L-1.
De acordo com RUSSEL & STROBEL et al. (1989) a monensina sódica é um
antimicrobiano sintético muito utilizado pela indústria sucroalcooleira no controle de
bactérias contaminantes dos processos de fermentação alcoólica. Estes
contaminantes prejudicam a eficiência fermentativa uma vez que consomem
açúcares que seriam fermentados pelas leveduras. As principais bactérias
contaminantes são a L. plantarum, L. fermentum e L. buchneri. De acordo com os
autores, a monensina sódica atua diretamente no transporte de sódio/potássio,
desestabilizando a concentração de potássio celular afetado o pH intracelular,
provocando um fluxo de prótons através da bomba Na+/K+, diminuindo o
12
metabolismo interno da célula bacteriana, e conseqüentemente o metabolismo
celular. De acordo com os autores este biocida apresenta ação efetiva no controle
de bactérias Gram-positivas, graças à formação do invólucro celular, neste caso
formada por apenas uma membrana celular de revestimento. Para as bactérias
Gram-negativas, verifica-se a presença de duas membranas de revestimento,
tornando-as mais resistentes aos efeitos desse antibiótico.
Neste contexto, segundo CRISAN (1995) o emprego indiscriminado e
prolongado de antimicrobianos químicos sintéticos favorece a seleção de
microrganismos patogênicos mutantes resistentes a esses compostos, tornando o
uso de produtos de origem natural uma alternativa eficaz e econômica.
Diversos produtos que apresentam ação antimicrobiana eficiente têm sido
descritos na literatura. Dentre eles o óleo essencial de Melaleuca, que contém mais
de 100 compostos bioativos, sendo o principal composto antimicrobiano o terpeno-4-
ol, que induz danos estruturais na membrana e parede celular, comprometendo a
manutenção da integridade das células de bactérias e fungos (HALCON & MILKUS,
2004). Relatos de CARSON et al. (1995), FAOAGALI et al. (1998) e HADA et al.
(2003) comprovam sua ação bacteriostática sobre Escherichia coli, Staphyloccocus
aureus, enquanto HAMMER et al., (2000 e 2003) avaliaram sua ação sobre Cândida
albicans.
Segundo OLIVEIRA FILHO (2010) a própolis é uma substância resinosa
produzida por abelhas Apis melliferas pela transformação de diferentes exudatos
secretados pelas árvores, folhas e flores. Utilizam esta substância para proteção da
colméia contra proliferação de microrganismos, incluindo fungos e bactérias e
também para selar aberturas e eliminar insetos invasores.
De acordo com a literatura disponível, o extrato etanólico de própolis
apresenta propriedades biológicas e farmacológicas, tais como antibacteriana
(MARCUCCI, et al., 2001; SALOMÃO, et al., 2008), antioxidante (PARK & IKEGAKI,
1998), antifúngica (KUJUMGIEV, et al., 1999; OLIVEIRA, et al., 2006; SALOMÃO, et
al., 2008), citotóxica (BANSKOTA, et al. 2000), antiinflamatória (BORRELLI, et al.,
2002), antiviral (AMOROS, et al., 1992; KUJUMGIEV, et al. 1999), entre outras. Além
das diversas utilidades, a própolis também vem sendo utilizada pelas indústrias
farmacêutica e alimentícia na forma de alimentos funcionais (ACKERMANN, 1991).
13
A própolis apresenta composição química é bastante complexa, sendo
constituída por flavonóides, ácidos fenólicos, ésteres, aldeídos fenólicos e cetonas,
considerados os mais importantes agentes antimicrobianos. Apresenta ainda óleos
voláteis e ácidos aromáticos, ceras, resinas, bálsamo e pólen, que é uma rica fonte
de elementos essenciais como magnésio, níquel, cálcio, ferro e zinco (CASTALDO &
CAPASSO, 2002, PIETTA et al., 2002). Estudos de KUJUMGIEV et al., (1999),
FERNANDES JR. et al. (2006) e CASTRO et. al. (2007) indicam que a concentração
destes componentes variam em função do período e da região geográfica de coleta,
interferindo de maneira substancial os teores dos compostos bioativos, influenciando
assim, a atividade antibacteriana.
Relatos de BREGAGNOLI (2006), OLIVEIRA FILHO (2010) e HALABI (2010)
comprovaram o efeito bactericida da própolis, destinados ao controle de
contaminantes na fermentação etanólica para produção de cachaça orgânica e de
etanol, respectivamente. Quando o mosto foi tratado com própolis observaram
menores índices de contaminantes e viabilidade celular constante, mantendo-se em
níveis elevados. O extrato etanólico de própolis atenuou a competição entre células
de leveduras e bactérias pelos nutrientes do meio, exercendo efeito inibitório sobre
as bactérias contaminantes do processo.
Entretanto, estudos realizados por TOSI et al. (1996) sugeriram que a
atividade antimicrobiana da própolis comercial preparada com os seguintes
solventes: etanol 60%, glicerol puro, propilenoglicol e óleo comestível de cereal,
aumentaram a potência da atividade antimicrobiana. Os resultados obtidos
apresentaram maior eficiência quando se utilizou óleo de cereais como solvente.
Não há registros científicos sobre o uso de extratos de própolis utilizando
mistura de óleos de cereais como solvente, no controle de contaminantes do caldo
de cana, destinados ao preparo de mostos para fermentação etanólica. Este estudo
será pioneiro abordando o controle de bactérias contaminantes da fermentação
alcoólica utilizando este biocida.
14
2.5 Compostos Secundários Produzidos
Durante a realização do processo fermentativo destinado a produção de
etanol, verifica-se também a formação de compostos secundários, tais como
aldeídos, cetonas, alcoóis superiores, ácidos e ésteres (AMORIM, 2005). Entretanto,
segundo DATO et al. (2005) a natureza e qualidade desses componentes dependem
da matéria-prima utilizada, condução do processo fermentativo, sistema de
destilação e operações finais realizada com o destilado final obtido, tais como
envelhecimento no caso de cachaça.
Considerando-se a produção de cachaça, os teores de compostos
secundários totais, excluindo-se o etanol, conforme legislação vigente no Brasil
(BRASIL, 2005), devem estar dentro dos limites de 200 a 650mg.100mL-1 de álcool
anidro. Os limites máximos variam dependendo do componente avaliado. Para o
etanol os valores estabelecidos pela legislação são distintos, tendo em vista a
possibilidade de extração destes através dos sistemas de destilação em colunas
contínuas empregados pelas destilarias. Não obstante deve-se destacar que a
formação destes compostos secundários resulta em reduções na eficiência dos
processos de fermentação e destilação, em virtude da utilização dos açúcares para
esta finalidade.
Neste contexto os ácidos apresentam-se como compostos formados
normalmente durante o processo de fermentação, estando presente desde a
matéria-prima utilizada. Segundo (RIGOTT, 1989; ROSE, 1970) citado por MAIA
(1994) são também formados durante a fermentação alcoólica, através da reação
intracelular entre etanol e ácido acético, formando acetato de etila. Após a
fermentação, de acordo com CARDOSO (2001) os ácidos carboxílicos podem reagir
com alcoóis produzindo ésteres. Estes ainda são formados durante o processo de
envelhecimento de destilados e vinhos, pela reação entre álcool e ácidos, sendo
responsáveis pelo aroma agradável, típico e peculiar de frutas, que compõem o
“buquê” de bebidas.
Deve-se considerar ainda as observações de MAIORELLA et al. (1983) que
apontam a interferência do ácido acético sobre o transporte de fosfatos via
15
membrana celular. Sob altas concentrações relataram alterações significativas na
morfologia das células de leveduras.
Os alcoóis superiores são compostos com mais de dois átomos de carbono
formados durante o processo oxidativo, proveniente em grande parte da
transformação de aminoácidos durante a fermentação. De acordo com YOKOYA
(1995) quantidades mais elevadas são formadas quando se utiliza fermento com
baixa atividade metabólica, que por sua vez acabam por influenciar a microbiota
durante o processo fermentativo (SILVA, et al., 1996).
A formação de congêneres como acetaldeído ocorre principalmente nas
primeiras horas da fermentação, diminuindo posteriormente, principalmente, sob
condições de anaerobiose (MAIA, 1994).
O furfural é um aldeído formado como resultado da pirogenação da matéria
orgânica depositada no fundo das caldeiras do aparelho de destilação. É um
composto de aroma penetrante, geralmente enjoativo, considerado indesejável em
bebidas destiladas (TÉO, 2003).
O glicerol é um triálcool de fórmula molecular C3H8O3, formado durante a
fermentação alcoólica. Sua produção está na dependência de vários fatores, tais
como a presença de contaminantes e o pH do mosto. AMORIM (1977) observou que
estes fatores afetam diretamente a produção de biomassa pela levedura, assim
como a de glicerol. Relatou ainda que condições de pH básico, favoreceram a
produção de glicerol, proporcionando o crescimento de contaminantes em
detrimento das leveduras que são acidófilas. Constataram ainda que esta condição
se relacionavam com menor rendimento fermentativo, uma vez que parte dos
açúcares eram desviados da produção de etanol para outras vias metabólicas.
III. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi instalado e conduzido no Laboratório de Tecnologia do
Açúcar e Álcool, Microbiologia das Fermentações do Departamento de Tecnologia
da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP, Jaboticabal - SP, na
safra 2010/11.
3.1 Material
3.1.1 Própolis
A própolis foi coletada em 02/2010 no município de Monte Alto, estado de São
Paulo. Após a coleta realizou-se a limpeza do material objetivando separar toda
impureza que eventualmente acompanhasse a amostra. A seguir procedeu-se a
maceração e armazenamento em embalagem hermética, sob refrigeração.
Posteriormente realizou-se a extração dos princípios ativos da própolis utilizando-se
como solvente solução hidroalcoólica e mistura de óleos vegetais.
3.1.2 Caldo de Cana
Utilizou-se neste estudo caldo primário de cana, coletado em usina produtora
de açúcar e álcool da região de Jaboticabal-SP. A coleta foi realizada diariamente
durante o período de abril/maio de 2010, enquanto durou o experimento. O caldo foi
coletado no 1° terno de moagem, antes da adição de biocidas no processo. A seguir
procedeu-se a identificação e acondicionamento em recipientes adequados, sendo
encaminhado imediatamente para o Laboratório de Tecnologia do Açúcar e do
Álcool do Departamento de Tecnologia da FCAV/UNESP.
17
3.1.3 Leveduras
O microrganismo utilizado para conduzir o processo fermentativo foi o
fermento comercial prensado Saccharomyces cerevisiae.
3.2 Preparo dos Biocidas
3.2.1 Extrato Hidroalcoólico de Própolis (EHP)
A extração dos princípios ativos das própolis marrom foi realizada a partir da
mistura de 25g de própolis triturada em 100mL de solução de etanol 80% v.v -1 sob
agitação, em banho termostatizado a temperatura de 70ºC durante 30 minutos
(KOO, 1996).
3.2.2 Extrato de Própolis em Óleo de Vegetais (EOP).
O Extrato de Própolis em óleo de vegetais foi preparada a partir da mistura
com 25% de óleo de girassol, 25% de óleo de milho e 50% de óleo de soja. Para
composição do meio de extração utilizou-se 30% (m.v-1) do extrato de própolis*1
A própolis bruta foi macerada com o objetivo de aumentar a superfície de
contato entre o soluto (própolis) e o solvente. A seguir esta foi transferida para
erlenmeyer de 1,0L, ao qual adicionaram-se 500mL da mistura de óleos vegetais
(250mL de óleo de soja + 125mL de óleo de girassol + 125mL de óleo de milho).
Estas amostras foram levadas ao SHAKER com rotação de 20rpm e temperatura
controlada de 40°C por 72 horas, sendo a seguir filtrado em papel qualitativo e
armazenado sob refrigeração.
Como não há estudos sobre a influência do solvente de mistura de óleos
vegetais (EOP) sobre os componentes da propolis (flavonóides, ácidos aromáticos,
terpenóides, aldeídos, álcoois, ácidos alifáticos e ésteres, aminoácidos, esteróides,
açúcares, etc), objetivando manter a sua estabilidade, o extrato foi mantido a 40°C
somente durante o processo de.extração.
*1 - Comunicação pessoal de Sacchetti Gianni – email: <[email protected]>
18
3.2.3 Monensina sódica (Kamoran WP)
A solução da monensina sódica foi preparada a partir da dissolução de 2,5g
do produto comercial em solução aquosa a 50%v.v-1 de álcool anidro. Utilizou-se, na
fermentação, alíquota de concentração 1mL.L-1, mantendo-se a dosagem
recomendada que foi de 3,0 ppm em relação ao volume total.(Química Real, 2010).
3.3 Ensaio Preliminar
Objetivando determinar a Concentração Inibitória Mínima (MIC) para o biocida
natural EOP, avaliando-se sua capacidade de controlar os contaminantes da
fermentação etanólica, além dos efeitos provocados sobre a fisiologia das leveduras
fermentadoras, realizou-se este ensaio preliminar.
Utilizou-se como substrato 250mL de solução de glicose estéril com
concentração a 6ºBrix. O inoculo constituiu-se de células de Saccharomyces
cerevisiae multiplicadas em substrato estéril.
Avaliou-se inicialmente o efeito de doses do EOP sobre a fisiologia das
leveduras, em ensaio contendo tratamentos com doses de 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5;
0,6; 0,7; 0,8; 0,9 e 1,0mL de EOP em 250mL de substrato e células de S. cerevisiae.
Após preparo e inoculação dos tratamentos, realizaram-se avaliações periódicas de
viabilidade de células de leveduras, Índice de brotamentos e viabilidade de brotos.
Concomitantemente realizava-se também a avaliação da queda do teor de açúcares
no meio, através do Brix. Os melhores resultados foram obtidos para as dosagens
de 0,1 e 0,2mL de EOP.
Para tanto estabeleceram-se os seguintes tratamentos:
1) Controle: 250mL de solução de glicose, sem adição de produtos biocidas;
2) Extrato Oleoso de Própolis (EOP) [0,1]: 250mL de solução de glicose + 0,1mL de
EOP;
3) Extrato Oleoso de Própolis (EOP) [0,2]: 250mL de solução de glicose + 0,2mL de
EOP.
Após preparo e inoculação dos tratamentos, realizaram-se avaliações
periódicas de viabilidade de células de leveduras, Índice de brotamentos e
19
viabilidade de brotos. Concomitantemente realizava-se também a avaliação da
queda do teor de açúcares no meio, através do Brix. Os resultados obtidos estão
apresentados através das Figuras 01, 02 e 03.
Em seguida realizou-se o mesmo experimento, utilizando-se então caldo de
cana industrial com contaminações superiores a 106, 107 e 108UFCmL-1,
confirmando-se a ação biocida para as dosagens 0,1 e 0,2mL de EOP.
Figura 01- Resultados obtidos para variação do Brix ao longo do tempo (horas) -
Tratamento Controle.
Figura 02- Resultados obtidos para variação do Brix ao longo do tempo (horas) -
Tratamento EOP [0,1].
20
Figura 03- Resultados obtidos para variação do Brix ao longo do tempo (horas) -
Tratamento EOP [0,2].
A partir dos resultados obtidos neste ensaio preliminar verificou-se que a
melhor dosagem a ser empregada para o experimento seria 0,1mL.250mL-1 de
mosto ou 0,4mL.L-1 de EOP.
3.4 Tratamentos e Delineamento Experimental
O delineamento experimental empregado foi o inteiramente casualizado com
parcelas subdivididas, com quatro repetições. Os tratamentos principais
constituíram-se por Testemunha (sem biocida) e os 3 biocidas (EOP, EHP e
Kamoran WP). Os tratamentos secundários constituíram-se nos 10 ciclos
fermentativos.
3.5 Preparo do Mosto
O caldo industrial (caldo primário) chegando ao laboratório era filtrado para
eliminação das impurezas grosseiras e a seguir submetido a um processo de
clarificação para remoção de impurezas. Este processo consistiu na adição de
0,66mL.L-1 ácido fosfórico, correção do pH para valores próximos a 6 com leite de
cal e aquecimento do caldo até 105ºC para decantação das impurezas. A
21
decantação teve duração de 10 minutos, seguida, da filtração do caldo decantado foi
para retirada da borra.
Considerando-se que o caldo industrial era o resultado da moagem de
diversas matérias-prima na unidade industrial, verificava-se que a após o processo
de purificação, o caldo clarificado apresentava valores de Brix que variavam de 13 a
17oBrix. Quando estes valores eram mais elevados procedia-se nova diluição para
preparar o mosto, que era padronizado a 16o. Quando os valores eram inferiores,
não se realizava o processo de diluição.
Após a padronização do Brix, o pH do caldo clarificado foi corrigido com ácido
sulfúrico até 4,5 ( 0,3), sendo os Açúcares Redutores Totais (LANE & EYNON,
1934), e a Acidez Total quantificados. O caldo clarificado foi aquecido a 32oC,
obtendo-se o mosto.
3.6 Preparo do Inoculo
O microrganismo utilizado para a condução do processo fermentativo foi o
fermento comercial prensado Saccharomyces cerevisiae. Objetivando preparar
inoculo para realização do processo fermentativo procedeu-se inicialmente a
multiplicação e adaptação das células, através do processo de cortes. A partir de
uma massa de leveduras equivalente a 30,0g.L-1 de mosto a 2°Brix e pH 4,5 iniciou-
se a multiplicação das leveduras. Procedeu-se a seguir a adaptação das células até
a concentração do mosto 12°Brix. Para a fermentação alcoólica, foram adicionadas
30g de massa úmida (70x107 células mL-1) de S. cerevisiae por litro de mosto,
conforme AMORIM (1996).
3.7 Condução da Fermentação
As fermentações foram realizadas por 10 ciclos fermentativo, seqüenciais,
com 4 repetições, através do processo de condução em bateladas, com recuperação
do fermento por centrifugação. Cada tratamento foi desenvolvido, a partir de 250 mL
do mosto que recebia 30,0g do inoculo (item 3.5), seguido de duas alimentações de
22
mosto de 250 e 500mL, em intervalos de 30 minutos. Utilizou-se erlenmeyers com
capacidade para 2,0L.
Os biocidas foram adicionados durante o preparo do pé-de-cuba em suas
respectivas concentrações, determinando-se assim o início da fermentação.
Os frascos contendo mosto inoculado foram mantidos a 32oC (+1oC) durante
toda a fermentação. O processo foi monitorado com auxílio de densímetro de Brix.
O final das fermentações foi estabelecido quando o Brix apresentava valores
≤1, ou quando houvesse estabilização da leitura, em intervalo de 30 minutos.
Ao término de cada ciclo fermentativo, os vinhos foram centrifugados a
1650xg, 25oC, por 5 minutos (centrífuga HIMAC CR 21G) para separação do
fermento e do vinho delevurado. O fermento era lavado com solução salina 0,85%
estéril e submetido ao tratamento com o biocida, permanecendo sob agitação por 1
hora, a 32ºC. Após esta etapa estava constituído novo pé-de-cuba, que era utilizado
nas fermentações seguintes.
No vinho delevurado, foi determinado o teor de glicerol, segundo
COPERSUCAR (1988), Açúcares Redutores Residuais Totais (LANE & EYNON,
1934) e teor alcoólico, através de cromatografia gasosa.
3.8 Análises Microbiológicas.
As análises microbiológicas foram realizadas por método direto e indireto no
caldo de cana, pé-de-cuba, início (50 minutos após a inoculação do fermento) e final
da fermentação, em cada ciclo fermentativo.
O método direto consistiu em análises de microscopia, avaliando-se
viabilidade das células de leveduras, índice de brotamentos, viabilidade de brotos e
concentração de contaminantes, segundo LEE et. al. (1981).
As avaliações microbiológicas por método indireto foram realizadas em
amostras de caldo, mosto, início e final da fermentação, através de plaqueamento
em diferentes meios de cultura, somente nos ciclos ímpares.
Para contagem de bactérias lácticas empregou-se o meio MRS+ Agar (MAN et
al. 1960) com adição de cicloheximida. Este foi composto por 5g de extrato de
levedura, 10g de peptona, 5g de extrato de carne, 20g de dextrose, 2g de fosfato
23
hidrogênio dipotássico, 1g de tween 80, 5g de acetato de sódio, 0,05g de sulfato de
magnésio e 15g de Agar por litro de meio, com cicloheximida (100mg.L-1).
Para a quantificação de leveduras, foi utilizado o meio WLN (Green & Gray,
1950, modificado por OLIVEIRA & PAGNOCA, 1988) com adição dos antibióticos
ampicilina e ácido nalidíxico. Este foi composto por 50g de glicose, 550mg de fosfato
hidratado de potássio, 425mg de cloreto de potássio, 125mg de cloreto de cálcio,
125mg de sulfato de magnésio, 2,5mg de cloreto férrico, 25g de sulfato de
manganês, 5g de caseína, 4g de extrato de levedura, 22g de verde de bromocresol,
20g de Agar, 500mg de ácido nalidíxico e 500mg de ampicilina por litro de meio.
Para contagem de microrganismos totais empregou-se o meio PCA (Plate
Count Agar, USFDA, 1995). Este foi composto por 5g de caseína, 2,5g de extrato de
levedura, 1,0g de dextrose e 15g de ágar por litro de meio.
De cada meio de cultura, foram utilizadas duas placas, com uma repetição
correspondente a cada diluição seriada de 10-5 e 10-6 para o meio MRS e diluição de
10-7 e 10-8 para os meios WLN e PCA, para as amostras de vinho. Para caldo e
mosto, foram utilizadas as diluições 10-3 e 104. As placas foram incubadas por três
dias a 32°C em B.O.D..
3.9 Análises tecnológicas do mosto e vinho
- Brix do mosto e vinho: determinado por refratometria (SCHENEIDER, 1979) e
densimetria a 20°C, respectivamente;
- Açúcares Redutores Totais (ART) % do mosto: expressos em relação à glicose
e dosados pelo método volumétrico de LANE & EYNON (1934);
- Acidez Total do mosto e vinho: determinado através da titulação do mosto e
vinho em agitação com NaOH padrão 0,05N, expressa em g H2SO4/L (AMORIM,
1996);
- Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT) do vinho: segundo a técnica
descrita por LANE & EYNON, (1934).
- Glicerol do vinho: segundo técnica descrita por MACGOWAN et al. (1993);
- Teor Alcoólico do vinho e Componentes do Destilado(%v/v): Os componentes
voláteis presentes nos vinhos foram recuperados por destilação, onde a cada 50mL
24
de vinho recuperava-se 20mL de destilado. As amostras foram submetidas à análise
de componentes em cromatógrafo gasoso Shimadzu GC 2014, acoplado com
software GC Solution com uma coluna Restec modelo Rtx®-1301, 60m x 0,25mm.
Injetou-se 1µL de cada amostra nas seguintes condições: temperatura do injetor:
200oC, detector FID, temperatura do detector: 240oC, gás de arraste: Nitrogênio;
pressão: 186,6kPa; fluxo: 47,2mL.minuto-1; fluxo da coluna: 1,7mL.minuto-1;
velocidade linear: 30cm.segundo-1. A temperatura da coluna permaneceu por 7,5
minutos a 40oC, aumentando até 220oC, com uma taxa de 10oC.minuto-1 Os
compostos avaliados foram: acetaldeído, acetato de etila, etanol, álcool n-propílico,
álcool isobutílico e álcool isoamílico.
3.10 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância pelo teste F e
a comparação entre as médias realizadas pelo teste de Tukey (P=005), segundo
BARBOSA & MALDONADO (2010).
Considerando-se que apenas uma determinação cromatográfica é suficiente
para atribuir confiança ao resultado obtido, não foram realizadas análises estatísticas
para estas determinações.
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Características químico-tecnológicas do caldo e do mosto
A qualidade do caldo de cana influencia diretamente o desempenho
fermentativo das leveduras. (MUTTON, 1998). O grau de maturação da matéria-
prima caracteriza a maior ou menor disponibilidade de açúcar no caldo, o qual
através da atividade metabólica da levedura será transformado em álcool, e em
outros compostos secundários.
A disponibilidade de açúcares segundo MUTTON (1998) pode ser definida pela
interação entre o genótipo e o fenótipo, sendo este afetado principalmente pelas
condições edafoclimáticas. Relatos de DINARDO-MIRANDA (2003) apontam ainda a
sanidade da cultura como fator responsável pelas alterações fisiológicas, que podem
resultar no comprometimento das características químico-tecnológicas.
Durante a realização das amostragens, realizadas entre março-abril/2010, as
condições climáticas foram desfavoráveis ao processo de maturação da cultura,
contribuindo para o acréscimo de impurezas minerais, presentes nos caldos.
Segundo BRIEGER (1968), as características tecnológicas ideais para
processamento industrial da cana no início de safra devem ser: Brix do caldo ≥ 18,
Pol do caldo ≥ 13, Pureza do caldo ≥ 85 e Açúcar Redutor (AR) ≤ 1%. Os caldos de
cana coletados para o desenvolvimento dos experimentos (Figura 04) apresentaram
valores inferiores aos ideais, conforme estabelecido por BRIEGER (1968).
O comportamento observado para o pH do caldo (Figura 04) apresentou
valores da ordem de 5,0-5,5, considerados adequados, exceto para o 8º ciclo de
fermentação, quando alcançou 4,5, provavelmente em decorrência da qualidade
industrial do caldo, resultante do processamento de matéria prima com elevado
tempo de colheita.
26
Figura 04- Valores médios observados para Brix e pH do caldo utilizado nos dez ciclos fermentativos. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
A qualidade do caldo extraído também apresenta interferências sobre o teor de
impurezas minerais e vegetais que acompanham a cana. (MUTTON, 1998),
provocando alterações na microbiota presente, com reflexos sobre o pH e Acidez
Total. Segundo RIPOLI & RIPOLI (2004) valores de acidez total do caldo de cana
inferiores a 0,8g.L-1 de H2SO4 caracterizam matéria-prima de qualidade. Os
resultados obtidos para esta característica (Figura 05) indicam que a matéria-prima
utilizada apresentou valores superiores ao recomendado, não se configurando de
qualidade para fermentação.
Os valores observados para ART do mosto (Figura 05) refletem de modo direto
a concentração de açúcares iniciais presentes no mosto, da ordem de 9 a
11g.100mL-1 .
Figura 05- Valores médios observados para Açúcares Redutores Totais (ART) e Acidez Total do mosto utilizado em cinco ciclos fermentativos. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
27
4.2 Características microbiológicas do caldo e do mosto
No caldo de cana, segundo relatos de TILBURY (1975), pode-se encontrar
quantidade significativa de microrganismos que fazem parte do ecossistema de
produção. O autor encontrou valores da ordem de 104 a 108 UFC.mL-1 (Unidades
Formadoras de Colônias). Resultados experimentais demonstraram que valores
superiores a 107 UFC.mL-1 são considerados preocupantes, caracterizando
contaminações. Esta chega até a unidade de produção com a terra aderida as
raízes, colmos e folhas, além da água de embebição, segundo LIMA (1975).
Deve-se salientar que os caldos empregados para o preparo dos mostos
apresentavam teores elevados de impurezas minerais que se refletiram na carga de
microrganismos presentes (Figura 06). Verifica-se quantidade elevada de unidades
formadoras de colônias, em todos os meios de cultura específicos estudados
(MRS+, específico para bactérias; WLN, específico para leveduras e PCA, para
microrganismos totais). Por se tratar de um plaqueamento anterior ao preparo do
mosto, comprova-se a alta infestação por contaminantes bacterianos e leveduras
selvagens. Sob este ótica justifica-se a utilização de biocidas para o efetivo controle
dos microrganismos, objetivando a melhoria no desempenho fermentativo e
conseqüente incremento na eficiência de conversão de açúcar em etanol.
0
50
100
150
200
Mic
rorg
an
ism
os
(cel/
mL
.10
7)
MRS+ WLN PCA
Ciclo 1 Ciclo 3 Ciclo 5 Ciclo 7
Figura 06- Valores médios de Unidades Formadoras de Colônias do caldo,
quantificadas por plaqueamentos em meios MRS+, WLN e PCA, através de cinco ciclos fermentativos. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
28
Os resultados obtidos para a viabilidade das células de leveduras no pé-de-
cuba, início e final da fermentação não apresentaram efeito significativo para
tratamentos principais (biocidas), secundários (ciclos fermentativos) e interação
(Figura 07 e Tabela 01-Apêndice). As condições fermentativas favoreceram a
atividade metabólica das leveduras inoculadas. De acordo com OLIVA-NETO &
YOKOYA (1997) a viabilidade celular está diretamente relacionada com o
desempenho fermentativo, sendo este o principal parâmetro indicador do estresse
da levedura Os resultados obtidos (Figura 07) indicam que quando se empregou
biocidas para o tratamento dos mostos observou-se a manutenção da viabilidade
celular até o final do processo fermentativo, sendo que a testemunha apresentou
uma redução para a viabilidade celular ao final do processo. Isso pode evidenciar a
exposição de condições estressantes para as leveduras que não foram tratadas com
biocida, tais como a contaminação bacteriana.
a a a a
a aa
a
a
aa a
90
94
98
Via
bil
idad
e C
elu
lar
(%)
Pé-de-Cuba Início Final
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 07- Valores médios de viabilidade celular das leveduras (%), no pé-de-cuba,
início e final da fermentação e resultados do Teste de Tukey. Médias seguidas pela mesma letra dentro de cada etapa do processo fermentativo não diferem entre si. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
A maior viabilidade final observada para os biocidas à base de própolis podem
estar relacionados não somente à eficiência destes no controle de microrganismos
contaminantes, mas também à presença de complexos vitamínicos B1, B2, B6, além
29
de vitamina C , E e alguns minerais encontrados nesta resina, segundo relatos de
BURDOCK (1998) e BREGAGNOLI (2006).
A análise de variância para índice de brotamento (Tabela 01- Apêndice) aponta
efeito não significativo para biocidas e interação e efeito significativo a 1% de
probabilidade para o final da fermentação. Os menores índices de brotamentos
foram observados no 8º, 9º e 10º ciclos fermentativos.
Relatos de MARCUCCI et al. (1998) afirmam que o extrato de própolis contém
substâncias que podem regenerar células. Esses compostos podem auxiliar o
processo de reprodução por brotamento. Os resultados obtidos neste estudo não
permitem confirmar esta observação.
Os resultados obtidos para viabilidade de brotos (Tabela 01- Apêndice e Figura
08) apresentaram as mesmas tendências observadas para o índice de brotamento,
com efeito significativo apenas para ciclos no pé-de-cuba. Os tratamentos avaliados,
inclusive a testemunha indicaram que houve considerável viabilidade de brotos.
a aa a
a
a a aa
a
a
a
50
60
70
80
90
Via
bil
idad
e d
e B
roto
s
(%)
Pé-de-Cuba Início Final
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
FIGURA 08- Valores médios de viabilidade de brotos celular das leveduras (%), no
pé-de-cuba, início e final da fermentação e resultados do Teste de Tukey. Médias seguidas pela mesma letra dentro de cada etapa do processo fermentativo não diferem entre si. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
Analisando-se os resultados obtidos para número de contaminantes (Tabela
02- Apêndice) verifica-se que não houve diferença significativa entre os tratamentos
estudados, assim como para a interação. O efeito significativo ao nível de 5% de
30
probabilidade foi observado para pé-de-cuba e início da fermentação. Embora não
tenha apresentado efeito significativo, ao final do processo fermentativo, os biocidas
apresentaram menores teores de contaminantes.
Considerando-se a avaliação dos contaminantes através do plaqueamento em
MRS+ (Tabela 02–Apêndice e Figura 09), verificou-se efeito significativo dos
tratamentos principais para pé-de-cuba, início e final da fermentação. Os menores
valores foram observados para o tratamento com Kamoran WP, tanto no pé-de-cuba
quanto no início. Ao final da fermentação o tratamento com Kamoran WP manteve
os menores valores médios de contaminantes, não diferindo dos biocidas à base de
própolis (EOP e EHP), sendo que estes diferiram significativamente da testemunha
que apresentou valores muito superiores de contaminantes. Este desempenho dos
resultados indica que os biocidas à base de própolis e em especial o Kamoran WP
apresentaram-se efetivos no controle dos microrganismos contaminantes,
especialmente os lactobacilos. Os resultados corroboram os relatos de AMORIM &
OLIVEIRA (1982) que apresenta o uso de biocida como uma medida profilática de
controle bacteriano. Ao mesmo tempo OLIVA NETO & YOKOYA (2001) destacam a
ocorrência de perdas significativas de sacarose, que é degradada pela elevada
contaminação bacteriana, resultando ainda na formação dos ácidos lático e acético,
os quais levam a intoxicação das leveduras.
A quantificação de leveduras realizadas através do meio WLN (Tabela 03-
Apêndice e Figura 10) indicou efeito significativo apenas para biocidas e ciclos no
final da fermentação. Entretanto, as médias para os tratamentos com biocidas não
apresentaram diferenças entre si pelo teste de Tukey, embora EHP tenha
apresentado os maiores valores
Observando-se a Figura 10 e comparando-se o desempenho apresentado
pelos biocidas EOP e EHP, verifica-se que ambos mantêm o mesmo padrão no
decorrer da fermentação, considerando o início e o final do processo.
31
0
100
200
300
400
Pé-de-Cuba Início FinalCo
nta
min
an
tes (
10
-5 U
FC
.mL
-1)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
FIGURA 09- Valores médios de contaminantes, em meio MRS+ para pé-de-cuba,
início e final da fermentação. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
a
aa
a aa
a
a
aa
a
a
0
100
200
300
WL
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10
-7 U
FC
.mL
-1)
Pé-de-Cuba Início Final
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
FIGURA 10- Valores médios de contaminantes em meio WLN para pé-de-cuba, início
e final da fermentação e resultados do Teste de Tukey. Médias seguidas pela mesma letra dentro de cada etapa do processo fermentativo não diferem entre si. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
A quantificação de microrganismos totais através de plaqueamento em meio
PCA (Tabela 03-Apêndice) indicou que os biocidas avaliados não apresentaram
diferença significativa entre si, embora o tratamento com Kamoran WP tenha
apresentado os menores valores no final do processo fermentativo. Considerando-se
32
os ciclos de fermentação, observa-se que o 1º ciclo, no pé-de-cuba diferiu
significativamente dos ciclos 3º e 5º.
4.3 Análises Químico-Tecnológicas do Vinho
A quantificação do teor de Açúcares Redutores Residuais Totais (ARRT) do
vinho apresentou efeito não significativo para os biocidas estudados e interação e
significativo para ciclos, conforme Tabela 04- Apêndice. Observou-se ainda que o 2º
ciclo apresentou a maior média, diferindo significativamente do 7º e 9º ciclos que
apresentaram menores médias.
Considerando-se os teores obtidos para Acidez Total (Tabela 04-Apêndice)
verificou-se que não houve efeito significativo para biocidas, ciclos e interação,
sendo que os valores médios variaram entre 2,8 a 3,5g.L-1 de H2SO4. Segundo
AMORIM & OLIVEIRA (1982) bactérias contaminantes do meio fermentativo
provocam aumento na acidez do meio, devido a produção de ácidos fixos e voláteis.
Entretanto este fato não foi observado no presente estudo.
Considerando-se o desenvolvimento do processo fermentativo, sabe-se que
sob valores recomendados de acidez total, a levedura desenvolve normalmente as
atividades metabólicas. Cabe destacar que tanto valores de acidez deficientes
quanto valores elevados são inadequados à fermentação alcoólica, comprometendo
o rendimento do processo (NOGUEIRA & VENTURINI-FILHO, 2005). Nesse sentido,
valores de acidez superiores a 2,5 g.L-1 podem interferir na fisiologia das leveduras
fermentadoras.
A análise dos resultados obtidos para teores de glicerol no vinho (Tabela 04-
Apêndice e Figura 11) indica efeito não significativo para biocidas, ciclos e interação.
Embora não segnificativo, o emprego de EHP e Kamoran WP apresentaram as
maiores médias para glicerol no vinho.
33
Figura 11- Valores médios observados para glicerol no vinho. Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
4.4 Composição do Destilado
Os resultados obtidos para a análise composta do teor de etanol no vinho
(Figura 12) indicam que os tratamentos com Kamoran WP e EHP apresentaram
valores de 80 e 100% maiores que os da testemunha. Em relação ao tratamento
EOP, as diferenças foram de 40% superiores à testemunha.
Em decorrência do número elevado de contaminantes, observou-se redução
significativa no teor alcoólico dos vinhos (Figura 12) para o tratamento testemunha,
em relação aos tratamentos com biocidas, confirmando a influência negativa das
bactérias contaminantes sobre as leveduras fermentadoras. Informações de
NARENDRANATH et al. (1997), destacam que a presença de linhagens de
Lactobacillus durante a fermentação provocou redução da taxa de crescimento da
levedura e diminuição na concentração final de etanol e no número de células
viáveis. Uma contaminação de 106 UFC.mL-1 provocou uma perda de 2% na
produção de etanol. Segundo os autores, contaminações elevadas, da ordem de 109
UFC.mL-1, proporcionaram reduções de 7% do rendimento em álcool.
34
Figura 12- Análise cromatográfica para teores de etanol no vinho, nas amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
Os teores de aldeídos totais expressos em Acetaldeído (Figura 13) variaram
entre 5 e 30mg.100 mL -1. Os aldeídos com até 8 átomos de carbono têm aroma,
penetrante e geralmente enjoativos, sendo considerados indesejáveis quando o
destilado se destina a produção de bebidas. De acordo com MAIA (1994) o
acetaldeído é o principal aldeído associado à fermentação alcoólica, e a sua
concentração pode ser minimizada evitando-se a aeração no final da fermentação.
A análise dos resultados obtidos indica que os tratamentos Kamoran WP e
Testemunha, apresentaram maiores médias em comparação aos tratamentos EHP e
EOP que apresentaram médias bem menores deste composto. Comparando-se o
desempenho dos tratamentos observa-se que apresentaram as mesmas tendências
verificadas para o teor de etanol no vinho.
Os alcoóis homólogos superiores são compostos orgânicos que possuem uma
hidroxila (OH), ligada diretamente ao átomo de carbono, que não pertença a um anel
aromático. Segundo WEBB & INGRAHAM (1963), os alcoóis homólogos superiores
n-propilico, isobutilico e isoamilico são comuns em bebidas fermentadas, estando
presentes em todos os sistemas de fermentação.
Os resultados obtidos para Álcool isoamílico estão apresentados na Figura 14.
Da sua análise verifica-se que apresentaram valores médios que variaram entre 250
e 500 mg.100 mL -1 . Os tratamentos com Kamoran WP e Testemunha se
35
destacaram com os maiores valores médios comparados aos tratamentos EHP e
EOP. De acordo com LIMA (1964) sua formação é tanto maior quanto menor for a
atividade metabólica da levedura. Os resultados obtidos não confirmam esta
constatação. Avaliando-se o tratamento EHP verifica-se que foi o que produziu os
maiores teores de etanol no vinho.
0
10
20
30
Aceta
ldeíd
o (
mg
.L-1
)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 13- Análise cromatográfica para teores de Acetaldeído no destilado, nas amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
200
300
400
500
600
Iso
am
ílic
o (
mg
.L-1
)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 14- Análise cromatográfica para teores de Álcool isoamílico no destilado, nas
amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
36
Os resultados observados para o Álcool n-propílico (Figura 15) apresentaram
valores da ordem de 25 a 50mg.100 mL -1. A análise dos valores obtidos indica que
a realização dos tratamentos com Kamoran WP e Testemunha foram os que
apresentaram os maiores valores de Álcool n-propílico no destilado.
Considerando-se os teores de Álcool n-propílico, o EOP apresentou menores
valores, estes resultados podem estar relacionados com as características
metabólicas de cada levedura. Resultados semelhantes foram obtidos por
SUOMALAINEN & LEHTONEN (1979), que verificaram variação considerável nas
quantidades de alcoóis conforme a levedura utilizada na fermentação.
0
10
20
30
40
50
n-p
rop
ílic
o (
mg
.L-1
)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 15- Análise cromatográfica para teores de Álcool n-propílico no destilado, nas
amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
Os resultados observados para o Álcool Isobutílico (Figura 16) com valores
médios que variaram entre 50 e 175mg.100 mL -1. Da sua análise verifica-se que o
tratamento EHP foi o que apresentou maiores médias, seguido pelo Kamoran WP,
Testemunha e EOP.
O Acetato de etila é o principal éster encontrado nos vinhos. Os resultados
determinados estão na Figura 16 e indicam que os tratamentos com Kamoran WP e
EHP foram os que apresentaram os maiores valores médios. As amostras
compostas tiveram valores médios que variaram entre 55 e 80mg.100 mL -1.
37
0
20
40
60
80
100
120
140Is
ob
utí
lico
(m
g.L
-1)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 16- Análise cromatográfica para teores de Álcool isobutílico no destilado, nas amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
Estudos realizados por CLETO & MUTTON (1997) concluem que quanto
maior a acidez do vinho, maior a concentração do Acetato de etila, confirmando em
parte o resultado deste trabalho.
40
60
80
100
Aceta
to d
e E
tila
(m
g.L
-1)
Testemunha EOP EHP Kamoran WP
Figura 17- Análise cromatográfica para teores de Acetato de etila no destilado, nas
amostras compostas, para os tratamentos avaliados.
V. CONCLUSÕES
Não foram observadas alterações fisiológicas para as leveduras, durante os
ciclos de fermentação, em virtude dos tratamentos efetuados;
O emprego dos biocidas naturais à base de própolis, extraídos em solução
hidroaocoólica (EHP) e em extrato de óleos (EOP) e a base de monensina
sódica (Kamoran WP) foram eficientes no controle de contaminantes da
fermentação;
Não foram determinadas alterações na composição do destilado obtido
quando se utilizou biocidas naturais para o controle de contaminantes da
fermentação;
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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APÊNDICE
48
TABELA 01 – Valores médios observados para viabilidade celular, índice de
brotamentos, viabilidade de brotos, resultados da análise de variância e teste de Tukey. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
TRATAMENTO
Viabilidade Celular (%)
Índice de Brotamentos Viabilidade de brotos
(%)
Pé-de- cuba
Início Fim Pé-de- cuba
Inicio Fim Pé-de- cuba
Início Fim
Testemunha 95,67a 93,98a 90,72a 4,09a 4,37a 4,64a 83,06a 64,17a 73,12a
Kamoran 95,85a 94,23a 94,30a 5,31a 4,50a 4,65a 85,16a 73,87a 77,34a
EHP 95,72a 95,06a 93,78a 3,53a 2,77a 4,84a 85,94a 74,41a 84,72a
EOP 95,66a 94,23a 94,30a 5,31a 4;50a 4,64a 85,16a 73,87a 77,34a
Teste F 0,00ns
0,04ns
0,97ns
0,03ns
0,74ns
0,01 ns
0,03ns
0,99ns
0,49ns
CV 6,72 11,62 8,38 5,24 2,29 7,26 34,86 31,01 39,25
DMS (Tukey 5%)
8,29 14,12 19,42 38,07 56,3 59,1 38,07 28,58 39,48
1 94,59a 93,86ab 93,54a 2,97a 1,79a 4,50ab 87,50ab 67,18a 87,30a
2 94,34a 86,48b 95,20a 3,72a 2,76a 4,74ab 81,21ab 77,81a 87,50a
3 97,06a 98,55a 89,87a 7,40a 6,20a 5,51ab 98,51a 100,00a 71,87a
4 97,00a 95,15ab 90,71a 6,29a 5,41a 5,60ab 86,35ab 69,18a 95,31a
5 96,23a 95,85ab 91,71a 4,16a 2,82a 5,25ab 84,37ab 79,16a 72,22a
6 95,50a 94,39ab 89,49a 3,78a 9,06a 9,65a 90,62ab 53,75a 95,03a
7 96,10a 93,50ab 97,30a 6,40a 4,14a 4,54ab 98,43a 75,00a 75,00a
8 97,93a 95,04ab 93,33a 2,83a 3,42a 3,06b 88,84ab 81,25a 71,87a
9 94,13a 95,24ab 97,29a 3,93a 2,69a 2,17b 60,84b 60,41a 62,50a
10 94,82a 95,73ab 94,25a 4,06a 2,06a 1,94b 71,60ab 52,08a 50,00a
Teste F 1,11ns
1,96ns
1,24ns
1,91ns
1,74ns
3,81** 2,34* 1,18ns
2,13ns
CV 3,65 6,63 8,38 70,4 120,26 67,42 25,13 52,34 39,71
DMS (Tukey 5%) 5,89 10,55 12,08 5,41 8,19 5,34 35,92 63,12 52,27
TPXTS
Teste F 0,96ns
0,48ns
0,46ns
0,41ns
0,33ns
0,45ns
0,53ns
0,41ns
0,63ns
Obs.: EHP – Extrato Hidroalcoólico de Própolis EOP – Extrato Oleoso de Própolis Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey ns – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade * - significativo a 5% de probabilidade
** - significativo a 1% de probabilidade
49
TABELA 02 – Valores médios observados para Número de contaminantes e
Unidades Formadoras de Colônias, quantificadas por plaqueamento em meio MRS+(10-5) e resultados da análise de variância e teste de Tukey. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
TRATAMENTO
Número de Contaminantes (10
6)
Plaqueamento em Meio MRS(10
5 UFC.mL
-1)
Pé-de- cuba
Início Fim Pé-de- cuba
Inicio Fim
Testemunha 48,8a 47,3a 55,0a 273,12a 223,75a 247,43a
Kamoran 36,1a 38,5a 10,7a 155,12b 61,56b 40,62b
EHP 27,9a 31,2a 15,8a 297,5a 162,5a 107,81b
EOP 36,1a 38,5a 17,7a 264,93a 210,25a 131,06b
Teste F 0,54 ns
0,21 ns
4,31 ns
26,51** 36,58** 21,32**
CV 121,83 155,78 154,13 14,02 20,89 40,06
DMS (Tukey 5%) 68.10 6
83,5.106
52,7.106
70,69 69,95 107,41
1 0,00b 23,9ab 26,8a 250,62a 205,62a 153,43a
2 32,7ab 21,4b 20,5a
3 25,3ab 46,3ab 36,8a 231,31a 125,25a 105,56a
4 60,0ab 61,5ab 29,2a
5 32,3ab 40,6ab 45,8a 260,00a 148,75a 122,68a
6 71,7a 80,5a 28,8a
7 28,8ab 31,9ab 21,4a 248,75a 178,43a 145,25a
8 17,5ab 21,9b 20,5a
9 38,5ab 25,8ab 15,1a
10 65,4a 34,6ab 20,5a
Teste F 2,89* 2,56* 0,94ns
0,61ns
2,61ns
1,63ns
CV 100,32 87,78 100,69 17,52 20,89 40,06
DMS (Tukey 5%) 6,80.107
8,35.107
4,51. 107
64,45 90,90 71,64
TPXTS
Teste F 0,30ns
0,24ns
0,44ns
2,86* 1,69ns
0,50ns
Obs.: EHP – Extrato Hidroalcoólico de Própolis EOP – Extrato Oleoso de Própolis Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey ns – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade * - significativo a 5% de probabilidade
** - significativo a 1% de probabilidade
50
TABELA 03 – Valores médios observados para Unidades Formadoras de Colônias,
quantificadas por plaqueamento em meios WLN (10-7), PCA (10-7), resultados da análise de variância e teste de Tukey. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
TRATAMENTO
107 UFC.mL
-1
(WLN) 10
7 UFC.mL
-1
(PCA)
Pé-de- cuba
Início Fim Pé-de- cuba
Inicio Fim
Testemunha 78,25a 99,68a 58,12a 152,43a 109,87a 165,43a
Kamoran 90,75a 195,5a 50,00a 100,93a 118,67a 114a
EHP 193,06a 111,68a 183,18a 219a 152a 249,5a
EOP 151,68a 68,25a 82,7 a 209,37a 86,25a 199,56a
Teste F 2,25ns
5,22Ns
6,83* 1,80ns
0,71ns
5,85ns
CV 78,92 56,61 71,01 67,8 78,48 36,48
DMS (Tukey 5%) 206,33 136,88 135,18 235,22 186,27 135,36
1 170,0a 117,93a 47,50b 258,75a 104,81a 173,37a
3 90,0a 139,00a 110,56ab 118,31b 104,81a 183,50a
5 73,0a 60,81a 79,75ab 105,93b 89,86a 170,75a
7 30,0a 157,37a 136,25a 198,75ab 148,00a 201,37a
Teste F 0,54
ns 1,49
ns 5,79* 6,03** 0,82
ns 0,07
ns
CV 68,00 81,58 48,26 48,54 67,12 80,21
DMS (Tukey 5%) 129,6 143,8 67,0 122,8 116,3 217,01
TP X TS
Teste F 0,99 ns
0,79 ns
2,57 ns
1,79 ns
0,86 ns
0,33 ns
Obs.: EHP – Extrato Hidroalcoólico de Própolis EOP – Extrato Oleoso de Própolis
Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey ns – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade * - significativo a 5% de probabilidade
** - significativo a 1% de probabilidade
51
TABELA 04 – Valores médios observados para Açúcares Redutores Residuais
Totais, Acidez Total, Glicerol no vinho, resultados da análise de variância e teste de Tukey. Jaboticabal – SP. Safra 2010/11.
TRATAMENTO ARRT
(g.100mL-1
)
Acidez Total
(gH2SO4.L-1
)
Glicerol
(mg.100mL-1
)
Testemunha 0,98a 3,16a 7,48a
Kamoran 0,71a 3,07a 7,71a
EHP 0,69a 3,10a 7,84a
EOP 0,84a 3,09a 7,47a
Teste F 3,07 ns
0,04 ns
0,02 ns
CV 50,89 24,59 71,2
DMS (Tukey 5%) 0,49 0,99 6,99
1 0,61ab 2,80a 8,10a
2 1,39a 2,80a 7,44a
3 0,72ab 3,05a 8,13a
4 0,93ab 3,79a 8,62a
5 0,89ab 2,90a 8,39a
6 0,78ab 3,25a 8,64a
7 0,24b 2,57a 6,31a
8 0,66ab 3,46a 6,08a
9 0,44b 3,29a 6,28a
10 0,92ab 3,49a 8,25a
Teste F 2,45* 1,67ns
2,76ns
CV 73,96 26,53 71,83
DMS (Tukey 5%) 0,9504 1,4057 2,93
TP X TS
Teste F 0,71ns
0,6ns
0,93ns
Obs.: EHP – Extrato Hidroalcoólico de Própolis EOP – Extrato Oleoso de Própolis Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si pelo teste de Tukey ns – Não significativo ao nível de 5% de probabilidade * - significativo a 5% de probabilidade
** - significativo a 1% de probabilidade