Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 1 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

___________________________________ Imię i nazwisko

_____________ data

Uzyskane punkty /2

podpis asystenta

_____________ Nr albumu

ĆWICZENIE 5

WĘGLOWODANY O ZNACZENIU BIOLOGICZNYM

Wstęp merytoryczny

Węglowodany (syn. cukry, cukrowce sacharydy) należą do grupy związków organicznych o charakterze

polihydroksyaldehydów (aldozy) lub polihydroksyketonów (ketozy). Związki te powszechnie występują w organizmach

żywych stanowiąc około 80% suchej masy organizmów roślinnych i do 2% suchej

masy organizmów zwierzęcych. Najpowszechniej występującymi w komórkach

węglowodanami są triozy, pentozy i heksozy zawierające odpowiednio 3, 5 i 6

atomów węgla w cząsteczce. Ze względu na budowę węglowodany wyróżnia się:

- monosacharydy (cukry proste), które nie podlegają hydrolizie do prostszych

związków cukrowych;

- disacharydy, które ulegają hydrolizie na dwie cząsteczki cukrów prostych;

- oligosacharydy zawierające od 3 do 10 cząsteczek monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi

- polisacharydy zawierające w swojej strukturze więcej niż 10 cząsteczek monosacharydów.

Monosacharydy

Monosacharydy (syn. cukry proste) mogą występować w postaci anomerów D i L.

W organizmach żywych występują prawie wyłącznie izomery szeregu D, gdyż jedynie

one mają możliwość prawidłowego dopasowania się do chiralnie ukształtowanej struktury

centrum katalitycznego enzymów. U ssaków wyjątkiem są: L-fukoza, L-gulonian

i L-iduronian. L-fukoza występuje głównie w postaci związanej w łańcuchach

oligosacharydowych glikoprotein i glikolipidów błonowych i rozpuszczalnych, stanowiąc

m.in. stanowi istotny element antygenów grupowych krwi ABH oraz struktur cukrowych

typu Lewisx, Lewisy, Lewisa i Lewisb. Cukier ten odgrywa znaczącą rolę w procesach

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 2 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

rozpoznawania komórek oraz oddziaływań pomiędzy komórkami i macierzą zewnątrzkomórkową. L-gulonian

i L-iduronian, będące metabolitami glukozy, są odpowiednio: metabolitem szlaku kwasu uronowego i składnikiem

glikozaminoglikanów. Monosacharydy w roztworach wodnych mają strukturę pierścieniową, przyjmowaną w wyniku

utworzenia wewnątrzcząsteczkowego hemiacetalu lub hemiketalu. Powstający wtedy sześcioczłonowy układ cykliczny

nosi nazwę pierścienia piranowego, zaś pięcioczłonowy – pierścienia furanowego.

Efektem zajścia cyklizacji jest pojawienie się dodatkowego asymetrycznego atomu węgla w cząsteczce monosacharydu (węgiel C1 w przypadku pierścienia piranowego lub C2 w przypadku pierścienia furanowego), przy którym znajduje się dodatkowa grupa hydroksylowa. Powstałe w ten sposób nowe formy cukrów określa się jako anomery α- i β-. Różnią się one między sobą skręcalnością właściwą i mogą wzajemnie w siebie przechodzić (zjawisko mutarotacji).Monosacharydy wykazują właściwości redukujące. Do najważniejszych ze względów monosacharydów występujących u zwierząt należą:

ryboza i deoksyryboza: pentozy występujące w kwasach nukleinowych, odpowiednio RNA i DNA glukoza: główny cukier metaboliczny (substrat energetyczny dostarczający 4 kcal/g = 17kJ/g energii), w stanie wolnym występuje w owocach i miodzie, składnik disacharydów (laktozy, mannozy, sacharozy), magazynowany w postaci polisacharydów (skrobia, glikogen). Do najważniejszych przemian metabolicznych glukozy należą: glikoliza (utlenianie), glukoneogeneza (biosynteza z substratów niecukrowych), glikogenogeneza (biosynteza glikogenu), glikogenoliza (katabolizm glikogenu), cykl pentozofosforanowy (dostarczanie równoważników redukcyjnych do reakcji redukcji oraz cukrów pięciowęglowych) oraz procesy glikozylacji białek. Nadmierne spożycie glukozy prowadzi do rozwoju nadwagi i otyłości. fruktoza: występuje w stanie wolnym w owocach, nektarze, miodzie oraz spermie ssaków (materiał energetyczny wykorzystywany przez plemniki), składnik sacharozy. U ssaków metabolizowana w mięśniach i tkance tłuszczowej oraz wątrobie (odpowiednio do fruktozo-1-fosforanu lub fruktozo-6-fosforanu włączanych do glikolizy), a także w plemnikach. Nadmierne spożycie fruktozy prowadzić może m.in. do rozwoju nadwagi i otyłości, zespołu metabolicznego oraz zaburzenia żołądkowo-jelitowe.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 3 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

galaktoza: składnik laktozy, antygenów zgodności grupowych erytrocytów (układu AB0) oraz substancji mózgu, wykorzystywana jako substrat energetyczny po przekształceniu w UDP-glukozę (szlak Leloira). Disacharydy Disacharydy (syn. dwucukry) zbudowane są z dwóch cząsteczek monosacharydów połączonych wiązaniem glikozydowym. Wyróżnia się wśród nich grupę trehaloz (wiązanie glikozydowi tworzone jest pomiędzy grupami -OH znajdującymi się przy węglach asymetrycznych obu cząsteczek monosacharydów, np. sacharoza) oraz grupę maltozy (wiązanie glikozydowi tworzone jest pomiędzy grupami -OH znajdującymi się odpowiednio przy węglu asymetrycznym jednej cząsteczki oraz przy węglu 3, 4 lub 6 drugiej cząsteczki monosacharydu, np. laktoza, maltoza). sacharoza (syn. cukier buraczany): zbudowana z α-

D-glukozy i -D-fruktozy połączonych za pomocą wiązania α,β-1,2-glikozydowego, występuje w burakach cukrowych i trzcinie cukrowej, nie wykazuje właściwości redukujących, podlega hydrolizie przy udziale sacharozo-izomaltazy – dwufunkcyjnego enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz;

laktoza (syn. cukier mlekowy): zbudowana z -D-galaktozy i D-glukozy połączonych za pomocą wiązania β-1,4-glikozydowego, występuje w mleku ssaków, wykazuje właściwości redukujące, podlega hydrolizie przy udziale laktazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; maltoza (syn. cukier słodowy): zbudowana z dwóch cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązania α-1,4-glikozydowego, produkt katabolizmu glikogenu i skrobi, wykazuje właściwości redukujące, podlega hydrolizie przy udziale maltazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; trehaloza: zbudowana z dwóch cząsteczek α-D-glukozy połączonych za pomocą wiązania O-glikozydowego, główny cukier organizmów niższych (glony, grzyby), nie posiada właściwości redukujących, podlega hydrolizie przy udziale trehalazy - enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz; izomaltoza: zbudowana z dwóch cząsteczek α-D-glukozy połączonych za pomocą wiązania α-1-6-glikozydowego, podlega hydrolizie przy udziale sacharozo-izomaltazy – dwufunkcyjnego enzymu rąbka szczoteczkowego nabłonka jelitowego z grupy disacharydaz. Polisacharydy Polisacharydy są to nierozpuszczalne w wodzie produkty polikondensacji cukrów prostych, pozbawione słodkiego smaku. W organizmach żywych pełnią funkcję zapasowa i strukturalną. Ze względu na budowę dzielą się na homopolisacharydy (zbudowane z jednakowych jednostek cukrowych) oraz heteropolisacharydy (zbudowane z różnych monosacharydów i ich pochodnych). Do najważniejszych polisacharydów zalicza się: skrobię: materiał zapasowy roślin, zbudowana z dwóch rodzajów cząsteczek: amylozy (nierozgałęziona, zbudowana z około 300 cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązań α-1,4-glikozydowych, stanowi 20–35% struktury skrobi) oraz amylopektyny (rozgałęziona, zbudowana z cząsteczek D-glukozy połączonych za pomocą wiązań α-1,4- i α-1,6-glikozydowych, stanowi 65-80%), podlega hydrolizie przy udziale α-amylaz: ślinowej i trzustkowej do mieszaniny dekstryn, glukozy, maltozy i izomaltozy;

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 4 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

glikogen: materiał zapasowy zwierząt (wątroba, mięśnie) i grzybów, zbudowany z cząsteczek D-glukozy połączonych w proste łańcuchy wiązaniami α-1,4-glikozydowymi, w których co 8–12 monomerów występuje rozgałęzienie tworzone przez wiązanie α-1,6-glikozydowe, w przewodzie pokarmowym podlega hydrolizie przy udziale α-amylaz: ślinowej i trzustkowej, zaś w wątrobie i mięśniach podlega reakcjom fosforolizy i hydrolizy odpowiednio przy udziale fosforylazy glikogenowej (wiązania 1,4-glikozydowe) i enzymu usuwającego rozgałęzienia (wiązania 1,6-glikozydowe) do glukozo-1-fosforanu i glukozy; celulozę (syn. błonnik): materiał strukturalny roślin, glonów, grzybów i niektórych protestów, zbudowana z 3000-14000 cząsteczek

-D-glukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, nie podlega trawieniu w przewodzie pokarmowym większości ssaków (u człowieka hydrolizę mogą w ograniczonym stopniu prowadzić mikroorganizmy flory bakteryjnej jelita grubego); chitynę: składnik pancerzy owadów i skorupiaków, materiał strukturalny grzybów, zbudowany z monomerów N-acetylo-D-glukozoaminy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi, nie podlega trawieniu w przewodzie pokarmowym większości ssaków; glikozoaminoglikany (syn. mukopolisacharydy): heteroglikany zawierające oprócz składników cukrowych (aminocukry) kwasy uronowe, składniki proteoglikanów (substancja podstawowa tkanki łącznej) zatrzymujące wodę i mające zdolność pęcznienia; glikoproteiny: białka zawierające w strukturze łańcuchy poliwęglowodanowe, składniki błon komórkowych, wydzielin śluzowych oraz osocza krwi.

Leki będące pochodnymi węglowodanów:

Heparyna: wielkocząsteczkowy anionowy polimer kwasu glukuronowego i iduronowego z N-siarczanowana glukozaminą (glukozoaminoglikan o nieregularnie powtarzających się sekwencjach bogatych w GlcNAc) o masie cząsteczkowej wynoszącej średnio 15000 Da, naturalnie syntetyzowany w organizmie człowieka przez komórki tuczne, makrofagi i komórki śródbłonka naczyń krwionośnych, wykazujący działanie antykoagulacyjne (aktywator antytrombiny, uwalnia śródbłonkowy inhibitor drogi krzepnięcia zależnej od czynnika tkankowego). Łańcuch jest niejednolity pod względem sekwencji. Czas półtrwania heparyny we krwi zależy od dawki i wynosi od 30 do 120 minut. Heparyna wiąże się z lipoproteinami klasy LDL, globulinami oraz fibrynogenem. Jest metabolizowana w wątrobie oraz układzie siateczkowo-śródbłonkowym i wydalana przez nerki.

Dekstran: preparat krwiozastępczy o masie cząsteczkowej 40 tys. 70 tys. lub 100 tys. będący polimerem cząsteczek D-glukozy połączonych wiązaniami 1-6 α -glikozydowymi (90-95% cząsteczki), posiadający krótkie boczne łańcuchy powstające w wyniku tworzenia wiązań 1-3 i 1-4-glikozydowych, wykazujący ciśnienie koloidalno-osmotyczne i lepkość identyczne z krwią, mający zdolność wiązania wody (1 g dekstranu wiąże 20 ml wody). Czas półtrwania dekstranu we krwi wynosi 6–8 h. Jest on wydalany przez nerki, w mniejszym stopniu, przez płuca. Dekstran jest metabolizowany w wątrobie do CO2 i wody.

Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z reakcjami charakterystycznymi służącymi jakościowej i ilościowej

analizie węglowodanów oraz dokonanie identyfikacji nieznanego węglowodanu.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 5 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

CZĘŚĆ I

ANALIZA CUKRÓW Z WYKORZYSTANIEM REAKCJI CHARAKTERYSTYCZNYCH

Reakcje charakterystyczne służą do jakościowego wykrywania węglowodanów. Są to reakcje, które w obecności danego cukru

powodują pojawienie się charakterystycznego zabarwienia roztworu lub innej dostrzegalnej zmiany (np. wytrącenie osadu).

Doświadczenie 1

Cel: Wykrywanie obecności cukrowców w materiale biologicznym (mocz) z zastosowaniem reakcji Molischa.

Zasada metody: Monosacharydy zawierające więcej niż 4 atomy węgla, a także cukry złożone, podczas ogrzewania z silnymi kwasami nieorganicznymi, np. HCI, H2SO4, ulegają odwodnieniu i cyklizacji, wskutek czego tworzą pochodne furanu, odpowiednio: pentozy - furfural, heksozy – hydroksymetylofurfural. Powstałe pochodne w środowisku alkoholu tworzą z fenolami (np. α-naftolem) barwne kompleksy. Reakcja z monosacharydami zachodzi gwałtownie, zaś w przypadku disacharydów, oligosacharydów i polisacharydów znacznie wolniej. Ujemny wynik próby wyklucza obecność cukrów w badanym materiale, pozytywny zaś nie jest wystarczającym dowodem obecności cukrów, gdyż reakcja zachodzi także w obecności innych związków zawierających grupę aldehydową (-CHO) oraz acetonu.

Postępowanie: Proszę przygotować 10 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik Numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1% roztwór wodny glukozy 0,5 cm3 – – – – – – – – –

1% roztwór wodny fruktozy – 0,5 cm3 – – – – – – – –

1% roztwór wodny arabinozy – – 0,5 cm3 – – – – – – –

1% roztwór wodny sacharozy – – – 0,5 cm3 – – – – – –

1% roztwór wodny maltozy – – – – 0,5 cm3 – – – – –

1% roztwór wodny trehalozy – – – – – 0,5 cm3 – – – –

1% roztwór wodny skrobi – – – – – – 0,5 cm3 – – –

1% roztwór wodny nieznanego cukru – – – – – – – 0,5 cm3 – –

mocz – – – – – – – – 0,5 cm3 –

H2O – – – – – – – – – 0,5 cm3

2% etanolowy roztwór α-naftolu 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople

Ostrożnie podwarstwić stężonym H2SO4. Nie mieszać.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 6 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Obserwacje:

Wnioski:

Doświadczenie 2

Cel: Wykrywanie obecności monosacharydów redukujących z zastosowaniem reakcji Fehlinga.

Zasada metody: Monosacharydy zawierające wolną grupę aldehydową lub ketonową powodują w środowisku alkalicznym redukcję jonów Cu

2+ do Cu2O, który wytrąca się w podwyższonej temperaturze w postaci osadu o barwie ceglastoczerwonej.

Niekiedy roztwór przyjmuje zabarwienie zielone wynikające ze zmieszania barwy wytrącającego się osadu tlenku miedzi(I) i niebieskiego zabarwienia odczynników.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 7 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Postępowanie: Proszę przygotować 9 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik Numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1% roztwór wodny glukozy 0,5 cm3 – – – – – – – –

1% roztwór wodny fruktozy – 0,5 cm3 – – – – – – –

1% roztwór wodny arabinozy – – 0,5 cm3 – – – – – –

1% roztwór wodny sacharozy – – – 0,5 cm3 – – – – –

1% roztwór wodny maltozy – – – – 0,5 cm3 – – – –

1% roztwór wodny trehalozy – – – – – 0,5 cm3 – – –

1% roztwór wodny skrobi – – – – – – 0,5 cm3 – –

1% roztwór wodny nieznanego cukru – – – – – – – 0,5 cm3 –

H2O – – – – – – – – 0,5 cm3

Roztwór Fehlinga I (0,15 M wodny roztwór CuSO4)

0,5 cm3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3

Roztwór Fehlinga II (0,6 M roztwór winianu sodowo-potasowego w 0,75M NaOH)

0,5 cm3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3

Dokładnie wymieszaj zawartość probówek i ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez około 10 minut.

Obserwacje:

Wnioski:

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 8 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Doświadczenie 3

Cel: Odróżnienie monosacharydów redukujących od disacharydów redukujących za pomocą reakcji Barfoeda.

Zasada metody: Reakcja z octanem miedzi(II) zachodząca w środowisku kwasu mlekowego pozwala odróżnić monosacharydy redukujące od disacharydów redukujących na podstawie różnic w szybkości redukcji jonów miedzi. Monosacharydy szybko utleniają się do kwasu karboksylowego, redukując jony Cu

2+ do tlenku miedzi(I),

który wytrąca się w postaci ceglastoczerwonego osadu. Disacharydy ulegają reakcji dopiero po około 15 minutach, po zajściu reakcji hydrolizy do monosacharydów.

Postępowanie: Proszę przygotować 9 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1% roztwór wodny glukozy 0,5 cm3 – – – – – – – –

1% roztwór wodny fruktozy – 0,5 cm3 – – – – – – –

1% roztwór wodny arabinozy – – 0,5 cm3 – – – – – –

1% roztwór wodny sacharozy – – – 0,5 cm3 – – – – –

1% roztwór wodny maltozy – – – – 0,5 cm3 – – – –

1% roztwór wodny trehalozy – – – – – 0,5 cm3 – – –

1% roztwór wodny skrobi – – – – – – 0,5 cm3 – –

1% roztwór wodny nieznanego cukru – – – – – – – 0,5 cm3 –

H2O – – – – – – – – 0,5 cm3

Odczynnik Barfoeda 2,5 cm3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3 2,5 cm

3

Dokładnie wymieszaj zawartość probówek i ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez około 8-10 minut.

Obserwacje:

Wnioski:

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 9 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Doświadczenie 4

Cel: Odróżnianie pentoz od heksoz za pomocą reakcji Biala.

Zasada metody:

Pentozy pod wpływem stężonego kwasu chlorowodorowego ulegają odwodornieniu do furfuralu, który w obecności

jonów żelaza(III) daje z orcyną kompleks o barwie zielonej lub zielono-niebieskiej.

Postępowanie: Proszę przygotować 9 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1% roztwór wodny glukozy 0,5 cm3 – – – – – – – –

1% roztwór wodny fruktozy – 0,5 cm3 – – – – – – –

1% roztwór wodny arabinozy – – 0,5 cm3 – – – – – –

1% roztwór wodny sacharozy – – – 0,5 cm3 – – – – –

1% roztwór wodny maltozy – – – – 0,5 cm3 – – – –

1% roztwór wodny trehalozy – – – – – 0,5 cm3 – – –

1% roztwór wodny skrobi – – – – – – 0,5 cm3 – –

1% roztwór wodny nieznanego cukru – – – – – – – 0,5 cm3 –

H2O – – – – – – – – 0,5 cm3

Odczynnik Biala (0,2% roztwór orcyny w 20% roztworze HCl )

2 cm3 2 cm

3 2 cm3 2 cm

3 2 cm3 2 cm

3 2 cm3 2 cm

3 2 cm3

1% roztwór wodny FeCl3 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla

Dokładnie wymieszaj zawartość probówek i ogrzewaj w 100C przez kilka minut.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 10 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Obserwacje:

Wnioski:

Doświadczenie 5

Cel: Odróżnianie ketoz od aldoz za pomocą reakcji Seliwanowa.

Zasada metody: Powstający podczas ogrzewania ketozy ze stężonym kwasem solnym 5-hydroksymetylofurfural tworzy z rezorcyną kompleks o barwie czerwono wiśniowej, czasami wytrącający się w postaci brązowoczerwonego osadu. Aldozy także mogą w tych warunkach tworzyć oksymetylofurfurol, ale znacznie wolniej, dzięki czemu próba Seliwanowa jest w wystarczającym stopniu specyficzna dla ketoz. Postępowanie: Proszę przygotować 9 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1% roztwór wodny glukozy 0,5 cm3 – – – – – – – –

1% roztwór wodny fruktozy – 0,5 cm3 – – – – – – –

1% roztwór wodny arabinozy – – 0,5 cm3 – – – – – –

1% roztwór wodny sacharozy – – – 0,5 cm3 – – – – –

1% roztwór wodny maltozy – – – – 0,5 cm3 – – – –

1% roztwór wodny trehalozy – – – – – 0,5 cm3 – – –

1% roztwór wodny skrobi – – – – – – 0,5 cm3 – –

1% roztwór wodny nieznanego cukru – – – – – – – 0,5 cm3 –

H2O – – – – – – – – 0,5 cm3

Odczynnik Seliwanowa 0,5 cm3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3 0,5 cm

3

Dokładnie wymieszaj zawartość probówek i ogrzewaj we wrzącej łaźni wodnej przez 2-4 minuty.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 11 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Obserwacje:

Wnioski:

Doświadczenie 6

Cel: Hydroliza skrobi przy udziale amylazy ślinowej.

Zasada metody:

Ślina zawiera enzym - α-amylazę (EC 3.2.1.1, 4-glukohydrolaza α,1→4-glukanu), należącą do klasy hydrolaz (EC 3.), podklasy hydrolaz działających na wiązania glikozydowe (EC 3.2), podpodklasy hydrolaz glikozydów (EC 3.2.1). α-amylaza wykazuje optimum działania w pH 6,6-6,8 oraz w obecności jonów Ca

2+ (utrzymują odpowiednią

konformację białka ezymatycznego) i Cl- (aktywator enzymu). W wyniku jej działania skrobia ulega hydrolizie do mieszaniny zawierającej dekstryny (zazwyczaj z jednym wiązaniem α-1-6 glikozydowym), glukozę, maltozę i izomaltozę. O aktywności α-amylazy ślinowej świadczy ujemna próba z jodem (I2 w wodnym roztworze KI). Skrobia tworzy z jodem w środowisku wodnym produkt o barwie granatowej.

Postępowanie: W długiej szklanej probówce należy przygotować mieszaninę inkubacyjną poprzez zmieszanie 2 cm

3 buforu

fosforanowego pH 6.6, 5 cm3 0.9% NaCl i 5 cm

3 1% wodnego roztworu skrobi. Probówkę na czas całego

doświadczenia należy umieścić w termobloku o temperaturze 37C. Do kolbki stożkowej o pojemności 50 cm

3 należy pobrać około 1 cm

3 śliny i dodać 3-4 cm

3 wody destylowanej.

Następnie należy przygotować mieszaninę reakcyjną poprzez dodanie 1 cm

3 rozcieńczonej śliny do probówki

zawierającej mieszaninę inkubacyjną, wymieszanie zawartości probówki i ponowne umieszczenie jej w termobloku

o temperaturze 37C.

Biochemia Ćwiczenie 5 _______________________________________________________________________________________________

Zakład Biochemii i Farmakogenomiki str. 12 Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej WUM

Proszę przygotować 6 probówek i postępować zgodnie z poniższą tabelą.

składnik numer probówki

1 2 3 4 5 6 7 8

roztwór I2 w KI 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla

2 M HCl 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla 1 kropla –

1% roztwór skrobi – – – – – – 2 krople –

roztwór nieznanego cukru – – – – – – – 2 krople

Do kolejnych probówek należy dodawać mieszaninę reakcyjną zgodnie z zamieszczonym poniżej schematem czasowym

czas pobierania mieszaniny reakcyjnej

czas 0 po 1 min po 3 min po 5 min po 7 min po 9 min – –

mieszanina reakcyjna 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople 2 krople – –

Obserwacje:

Wnioski:

CZĘŚĆ II

IDENTYFIKACJA NIEZNANEGO CUKRU

Dokonaj identyfikacji nieznanego cukru na podstawie wykonanych poprzednio reakcji charakterystycznych.

Reakcja

Molicha

Reakcja

Fechlinga

Reakcja

Barfoeda Reakcja Biala

Reakcja

Seliwanowa Reakcja z I2

Wynik reakcji

W próbce nr ___________________ stwierdzono obecność _______________________