bim gyak 2015

BIOMRNKI MVELETEK GYAKORLAT BIOMRNK BSC III. 2015

BCE, LELMISZERTUDOMNYI KAR SR- S SZESZIPARI TANSZK

LEVEGZTETS HATKONYSGNAK MRSE

Aerob mikroorganizmusok oxignignye A mikroorganizmusok a tpoldatban oldott oxignt lgzsre (respircira) s katalitikus oxidcira hasznljk fel. A lgzsi folyamat sorn a tpoldat szn, ill. energiaforrsnak oxidlsval fknt ATP-t raktroznak. A mikroorganizmusokban lv enzimek kmiai reakcikat katalizlnak, s a lejtszd reakciknak megfelelen az oxign sztchiometrikus arnyban hasznldik el. A fenti kt folyamat hatrozza meg a mikroorganizmusok oxignignyt, ami a fermentci sorn jelentsen vltozhat. Oxignabszorpci folyadkokban A tpkzegbe kerl levegbl az oxignnek elszr a levegbuborkokbl a gz-folyadk hatrfelleten keresztl a fermentlbe, a folyadkban diffzival a mikrobasejthez, majd a sejtfalon keresztl a sejtben lv enzimekhez kell eljutnia. A fenti folyamatok kzl a gz-folyadk hatrfelletnek az "ellenllsa" a legnagyobb, ez a sebessgmeghatroz lps. Az oxign abszorpcit a kvetkez kplet rja le: ( )LLs ccakr = rs = oxign anyagtviteli sebessg kL = a folyadk fel trtn tviteli koefficiens a = a gz-folyadk hatrfellet nagysga c* = teltsi oxignkoncentrci cL = aktulis oxignkoncentrci A "kL" s az "a" tnyezket kln nem lehet meghatrozni, gy ezek szorzatt szoks megadni, melyet teljes abszorpcis koefficiensnek neveznek. (Dimenzija /h-1/) Oxignabszorpci-sebessg mrse A levegztets hatkonysgra jellemz oxignabszorpci-sebessget kt ton lehet meghatrozni: direkt s indirekt mdon. Direkt mdszer Normlis fermentcis krlmnyek kztt -tptalajban a mikroorganizmusok jelenltben- trtnik. A fermentor levegztetst megszntetve az oxignkoncentrci az idvel linerisan cskken a ckrit rtkig, ennek segtsgvel kzvetlenl meghatrozhat az oxign abszorpci.

BIOMRNKI MVELETEK GYAKORLAT


2

Indirekt mdszer Az oxignabszorpci sebessgt nem tptalajban, hanem vizes kzegben mikroorganizmusok tvolltben vgzik. A leggyakrabban alkalmazott mdszer az un. szulfitos mdszer. Ezzel knnyen s gyorsan meg lehet hatrozni a kL*a szorzat rtkt. A fermentort megtltjk ntriumszulfitot s rzionokat tartalmaz vzzel, kevertetjk s levegztetjk. Idnknt mintt vesznk, s a mintban meghatrozzuk a szulfittartalmat.

+ + 24Cu223 SOO21SO

2 Az Na2SO3 oldat a leveg oxignjvel irreverzibilisen pillanatszeren, 0,01-0,1 mol/l kiindulsi 23SO koncentrci tartomnyban szulftt oxidldik. A maradk szulfitot jodometrisan hatrozzuk meg HI2ISOOHI2SO 2242223 ++++ 6423222 OSNaNaI2OSNa2I ++ Miutn a szulfitionok oxidcija pillanatszeren megy vgbe cL rtke gyakorlatilag nulla ( 0CL ) egszen addig, mg szulfit ionok jelen vannak a rendszerben. Teht a szulftosodsi reakcit az oxign beoldds sebessge hatrozza meg: Reakcisebessg = oxignabszorpci-sebessg = kL.aC* A mrs alapja, hogy megmrjk a szulftosodsi reakci sebessgt, melybl szmthat az oxignabszorpci-sebessge [mg O2/l*ra], [mml O2/l*ra] illetve [mg SO2/l*ra] eztbbi a szulfitszm. A szulfitszm jl jellemzi a fermentcis rendszer levegztetsi hatkonysgt, amelybl C* ismeretben a kLa kiszmthat. A szulfitszm meghatrozsa: A fermentorba vizet tltnk s literenknt 20 g Na2SO3-t (vzmentes) oldunk fel s 3-5 mg CuSO4 kataliztort is tesznk az oldatba. A fermentor sszeszerelse utn belltjuk a kvnt hmrskletet, levegztetst s kevertetst, majd meghatrozott idkznknt (15 percenknt) mintt vesznk. A vett mintk 5 ml-t elre elksztett 20 ml 0,1 n jdoldatba pipettzzuk, majd megsavanytjuk 2 ml 10 %-os ssavval s 0,1 n tioszulft oldattal visszatitrljuk a jd felesleget. A vgpont jelzsre kemnyt indiktort hasznlunk. A tioszulftfogys rtkeket (ml-ben) az id fggvnyben brzoljuk. Az gy nyert egyenes irnytangensbl szmthat a szulfitszm (S), melynek dimenzija [mg SO2/l*ra]. 1 ml 0,1 n jdoldat (irnytangensbl szmolva 1 ml tioszulft oldat is) 3,2 mg SO2-dal egyenrtk.



3

JDOMETRIS TITRLS 0,1n I2 oldat ksztse: Tramrlegen, kis hengerpohrkban gyorsan lemrnk 13 g jdot, 1000 ml-es mrlombikba visszk, 25 g KI-dal s 30 ml vzzel addig rzogatjuk, mg a jd teljesen felolddik, majd a lombikot desztilllt vzzel jelig tltjk. 0,1n Na2S2O3 oldat ksztse: A tioszulft bemrst nem rdemes analitikai mrlegen vgezni. Mivel az oldat hatrtke idvel cskken, valamivel tbbet mrnk be, mint az egyenrtkslynyi mennyisg tizedrsze. Tramrlegen, vagy kzimrlegen lemrnk 25 g Na2S2O3 5H2O-t, vesztesg nlkl 1000 ml-es mrlombikba visszk, hozzadunk kb. 0,2 g vzmentes Na2CO3 -ot, 10 ml izobutilalkoholt (vagy amilalkoholt) s forralssal CO2 - mentestett, majd gyorsan lehttt desztilllt vzzel jelig feltltjk. Az oldat belltst 2-3 napi lls utn vgezzk, vgleges hatrtkt 2 ht mlva llaptjuk meg. A ksz oldatot krmknsavval, vzzel s a mroldattal kibltett vegdugs vegben, lehetleg stt helyen tartjuk. Ha az oldat az idk folyamn megromlott, amit sok kn kivlsrl ismernk fel, az oldatot kintjk s az veget krmknsavval dezinficiljuk. Bellts KH(IO3)2-ra (Than-fle s): A KH(IO3)2 savany kzegben a KI-bl I2 -ot tesz szabadd: KH(IO3)2+ 10 KI + 11 HCl = 11 KCl + 6 H2O + 6 I2 Egyenrtkslynyi a molekulasly tizenketted rszvel egyenl: 1/2 KH(IO3)2 = 32,495 g 500 ml 0,1 KH(IO3)2 -oldat ellltshoz bemrnk pontos analitikai mrlegen 1,6248 g szrtott szilrd KH(IO3)2-ot, vesztesg nlkl 500 ml-es mrlombikba mossuk, majd teljes feloldds utn vzzel jelig tltjk. Alapos sszerzs utn az oldat 20,0 ml-es rszlett titrl lombikba pipettzzuk, 10 ml 30%-os KI oldatot adunk hozz, 10 ml 10%-os HCl-val megsavanytjuk s 0,1n Na2S2O3-tal borsrga sznig titrljuk. 2-3 ml kemnytoldat hozzadsa utn ppen szntelenre titrljuk. A tioszulft faktort hrom mrs kzprtkbl hatrozzuk meg. Ha a titrlshoz A ml tioszulft fogyott, akkor az oldat faktora:

A

0,20F =

Szulfitok meghatrozsa: vegdugs Erlenmeyer-lombikba pipettzunk 20,0ml 0,1n I2-oldatot, 2 ml 10%-os HCl-val megsavanytjuk, majd hozzmrnk ismert mennyisg mintt s a jdflsleget 0,1n tioszulfttal visszatitrljuk. A vgpont jelzsre kemnyt indiktort hasznlunk.



4

MIKROORGANIZMUSOK SZAPORODSA S PUSZTULSA

Szaporodskinetika Egy adott mikroorganizmus szaporodsa esetn a krnyezet az elsdleges meghatroz, ennek megfelelen, a mikroorganizmusok szaporodst illetve szaporodsuk gtlst valamint pusztulsukat a kls krnyezeti tnyezkkel befolysolni tudjuk. Adott krlmnyek kztt a mikroorganizmusok bizonyos idej nvekeds utn kettosztdnak, majd erre ugyanennyi id elteltvel ismt sor kerl. Mikroorganizmusok szaporodsnak egyes szakaszai

1. bra: Szaporodsi grbe (Dek Tibor, 2009)

A szaporodsi grbe szakaszait a vltoz szaporodsi sebessg () jellemzi. I.: Lappangsi vagy lag szakasz: A mikrobasejtek mg nem szaporodnak, szmottev, mrhet szaporods sem szm szerint, sem tmeg szerint nincsen. A sejtek adaptldnak az j krnyezethez.

=0 (: szaporodsi sebessg) II.: Gyorsul szaporodsi szakasz: Az adaptci folytatdik, de mr szlelhet nvekeds, egyre gyorsul temben. Nem minden sejt jut el egyidejleg oda, hogy maximlis sebessggel szaporodjon, fokozatosan kapocsoldnak be a szaporodsba.

0< < max

III.: Exponencilis szakasz: A teljes sejttmeg maximlis intenzitssal szaporodik.



5

= max IV.: Lassul szaporodsi szakasz: A szaporods egyre lassabb temv vlik.

0< < max s tart a nullhoz. V.: Stacioner fzis: A pusztul s jonnan keletkez sejtek szma megegyezik. VI.: Hanyatl fzis: A pusztul sejtek szma nagyobb, mint az jonnan keletkez sejtek szma. Termszetes krlmnyek kztt a populci heterogn, a sejtek az letciklus klnbz llapotban vannak benne. Ilyenkor, brmely idpillanatban, a sejtkoncentrci nvekedse, vagyik a populci szaporodsi sebessge arnyos az ppen jelenlv sejtek koncentrcijval:

dX/dt= * X

Adott krlmnyek kztt a szaporodsi sebessg az exponencilis szakaszban ri el a legnagyobb s lland rtket. Az exponencilis szaporodst ler sszefggs csak erre a szakaszra rvnyes. Az egyenlet logaritmusos alakja az exponencilis szakaszra egyenes vonalat ad, amelynek hajlsszge arnyos a szaporodsi sebessggel. A szaporodsi grbe jellegzetes brzolsa a 2. brn lthat.

2. bra: Szaporodsi grbe fllogaritmikus brzolssal (Sevella Bla, 2011).

=(logXt - logX0)/ (tt-t0) [1/perc]



6

Az brbl a rtke knnyen kiszmthat.

Fajlagos szaporodsi sebessg:

tg = /2,303 = tg * 2,303

Az osztdsok kzti idt genercis idnek nevezzk s tgen-nel jelljk, ennek szmolsa a

kvetkez egyenlettel trtnik:

tgen= 0,693/ [perc]

A fajlagos szaporodsi sebessg ennek segtsgvel is meghatrozhat:

= 0,693 / tgen

Mikroorganizmusok szaporodsnak nyomon kvetsi lehetsgei:

A mikroorganizmusok szaporodsnak tanulmnyozsra tbbfle mdszer egyarnt alkalmas, s ezekkel a szaporods alapvet trvnyszersgei megismerhetk. A szaporods nyomon kvetsre kmiai, fizikai illetve mikrobiolgiai mdszerek llnak rendelkezsre.

1. A mikrobiolgiai meghatrozsok a mikroba minta tenysztsn alapulnak s az l mikrobaszm meghatrozsra szolglnak. Htrnyuk, hogy lassak s aszeptikus munkt ignyelnek.

2. Kzvetlen sejtszmlls mikroszkppal: Brker-kamra segtsgvel lesztgomba sejteket szmolhatunk meg, Breed-festst kveten baktriumok sejtszmt hatrozhatjuk meg, penszgombk szaporodsnak mrtkt pedig Howard-kamra segtsgvel kvethetjk nyomon.

3. A kmiai mdszerek azon alapulnak, hogy szoros korrelci van a sejtek egyes alkotelemei (fehrje, RNS, DNS) s a sejttmeg, sejtszm kztt

4. A fizikai mdszerek kzl legelterjedtebbek a szrazanyag-meghatrozs, turbidimetria, nefelometria valamint a vizulis s elektronikus rszecskeszmlls

a. Szrazanyag-meghatrozs esetn a mikroba szuszpenzit ismert trfogat mintjt paprszrn leszrjk, a sejttmeget pedig slyllandsgig szrtjuk majd lemrjk

b. A turbidimetria ill. nefelometria elve a kvetkez: ha kvettban elhelyezett mikroba szuszpenzit monokromatikus fnnyel tvilgtunk, akkor a celln thalad fny intenzitsa cskkeni fog. A sejtek a fny egy rszt visszaverik, sztszrjk, ill. elnyelik s gy a fnynek csak egy tredk rsze jut t a celln. Nefelometria esetn a szrt fnyt hatrozzuk meg, turbidimetria esetn pedig a vltozatlanul thalad fny intenzitst.

c. Rszecskeszmlls lehetsges elektronikus rszecskeszmlk alkamazsval.



7

Elektronikus sejtszmlls: Az elektronikus rszecskeszmllk mkdsi elve a kvetkez: Ers elektrolit oldatba (fiziolgis soldat) ismert lyuktmrj (10-100 m) kapillris merl, melynek kt oldaln elektrda pr tallhat. A celln keresztl az oldat vezetkpessge ltal meghatrozott ram folyik. Szvhatsra a mrend mikroba szuszpenzi ismert mennyisge keresztlfolyik a kapillrison. A rosszabb vezetkpessg mekrobarszecskk megvltoztatjk a kapillris ellenllst (nvelik), gy minden egyes mikrobarszecske feszltsgimpulzust- melyek a mikroba mretvel arnyosak- hoz ltre az elektrdok kztt. A mrs elnye, hogy gyors s alkalmazsval a mikrobk nagysg szerinti elemzsre is lehetsg nylik.

Mikroorganizmusok pusztulsa A mikroorganizmusok szaporodsuk utols fzisban termszetes krlmnyek kztt is pusztulni kezdenek. A pusztuls egy id utn nagyobb mrtk, mint az j sejtek keletkezse, gy cskken a populci lsejt-koncentrcija. A mikrobapopulcik pusztulst a krnyezeti tnyezk szablyozsval mestersgesen is elidzhetjk (fizikai, kmiai, vagy e kett kombinlsbl ll kezelssel). Ez az lelmiszertartsts s az eszkzk sterilizlsnak alapja. Az lelmiszeriparban a mikrobapusztuls kinetikai trvnyszersgeinek s a befolysol tnyezinek ismerete nlklzhetetlen. A tnyezket kombinlva, azok klcsnhatsnak kihasznlsval kmletesebb tartsts rhet el, gazdasgosabban llthat el biztonsgos s tarts lelmiszer. A mikrobapusztt eljrsok eredmnyessge igen nagymrtkben fgg a krnyezeti tnyezktl. Sterilizls mechanikai mdszerekkel

Nagy nyoms. A baktriumok, az lesztk s a penszek vegetatv sejtjei 300-600 MPa nyomssal krosthatk, azonban az endosprk tllik az 1000 MPa-t meghalad nyomst is. A gyakorlatban azonban nhnyszor 100-600 MPa nyomslksek hatsra (pl. 5 percig 200 MPa, majd 5 percig 0 MPa, jbl 5 percig 200 MPa, stb.) a baktriumsejtfalak felrepednek s pusztulsuk kimutathat.

Klnbz sejtek feltrsnl, vagy baktrium kivonatok ksztsnl alkalmazzk a fagyasztst s az olvasztst egyms utn tbbszr vltakozva (a kpzd jgkristlyok okozzk a sejtek krosodst), illetve az ultrahanggal val kezelst, vagy jelents nyrerket keltve (eldrzsls, veggyngykkel trtn rzats, stb.) roncsoljk a sejteket.

Sterilizls szrssel. A mechanikus ton trtn csramentests legltalnosabban alkalmazott mdszere a szrs, amikor is a sterilizland folyadkot, vagy gzt olyan prusmret, illetve adszorpcis fellet szrfelleteken prseljk t, amely a mikroorganizmusokat visszatartja s a szrlet sterill vlik. Ez a mdszer hatst tekintve nem felel meg teljesen a sterilizls alapelveinek, mert a mikroorganizmusok a szrs sorn nem



8

pusztulnak el. A szrk prusainak tmrjt gy kell megvlasztani, hogy azon a baktriumok s ms sejtes elemek, illetve vrusok ne juthassanak t. A baktriumok eltvoltsra a 0,22 m tmrj membrnszrk a legalkalmasabbak, m ezek a vrusokat teresztik, utbbiak kiszrsre mg finomabb prusmret (0,02-0,05 m) szrket alkalmaznak. A szrket klnfle tptalajokra helyezve a baktriumok knnyen tenyszthetk rajtuk.

Sterilizls kmiai mdszerekkel

A kmiai anyagok szles kre alkalmas a mikrobk gtlsra. Az anyagok egy rsze csupn szaporodsban gtolja a baktriumokat (bakteriosztatikus hats), ms rsze viszont megli (baktericid hats) ket. Az, hogy egy anyag sztatikus vagy cid hats, az anyagi minsgen kvl fgg a koncentrcitl s a behatsi idtl is. A kmiai sterilezsre csak cid hats anyagok alkalmasak. Ezekkel szembeni kvetelmny, hogy hatsuk szles spektrum legyen (pl. fungicid gombal, virucid vrusl, sporocid spral).

A kmiai sterilezsre hasznlt anyagok lehetnek folykony, vagy gz halmazllapotak. A folykony szereket fknt felletek sterilezsre hasznljk. A gz halmazllapot vegyletek jelentsgt az n. gzzal sterilizl berendezsek adjk.

Sterilizls fizikai mdszerekkel

Sterilizls sugrzssal. A mikrobk elpusztthatk klnbz sugrzsok (pl. UV-, rntgen-, radioaktv-sugrzs) alkalmazsval is, amelyeknek elnyk, hogy hrzkeny anyagok esetben is alkalmazhatk. A hhatson alapul mikrohullm sugrzsnak is van antimikrobilis hatsa, de a kezelend trgy anyaga meghatrozza a sejtpusztt hatst (pl. a hhats egyenetlenl ri a klnbz mret anyagokat).

Az UV-sugrzs teljes spektruma (4-400 nm) krosthatja a sejteket, de csupn szk rsze felels az n. germicid hatsrt. 265 nm hullmhossznl van a DNS abszorpcis maximuma, ezrt ezen a hullmhosszon leghatkonyabb a sterilizls. A sejtpusztuls legfbb oka a nukleinsav krosodsa. A krosodsokat a baktriumok klnbz hibajavt mechanizmusokkal kpesek kijavtani, azonban a krosodsok bizonyos szintje felett az enzimrendszerek kapacitsa mr nem elgsges s gy a mutcik felhalmozdsa a sejt pusztulst okozza.

A germicid lmpk hasznlata zonkpzdssel is jr (msodlagos germicid hats). Ebben az esetben a germicid sugrzs (fknt a 185 nm-en is sugroz lmpa) ionizlja az oxignt s zon (O3) keletkezik, ami rendkvl ers oxidlszerknt, ferttlentszerknt ismert. Mint instabil molekula oxignmolekulra (O2) s egyatomos, rendkvl reagens, gynevezett naszcensz (atomi llapot) oxignre ('O') bomlik. Utbbi oxidlhat anyagokkal pl. mikroorganizmusokkal rintkezve, azok pusztulst okozza.

Sterilizls hvel



9

Sterilizls szraz hvel

A szraz h hatsa alapveten a sejtek vztartalmnak eltvoltsn s ezt kvet oxidcijn alapszik.

Nylt lnggal trtn sterilizls olyan esetekben alkalmazhat, ha a csrtlantand trgy a lnggal kzvetlenl rintkezve nem krosodik. Klnbz laboratriumi eszkzk (szike, ks, oltt, oltkacs) nylt lngon izztva gyorsan s biztosan sterilezhetk.

A szraz hvel trtn sterilezst hlgsteriliztorokban vgezzk. Ezek termoszttos rendszer, meghatrozott hmrskletre bellthat elektromos szekrnyek (legtbbszr lgkeverssel elltva). Szraz hvel csak hll fm-, veg-, porcelneszkzket, glicerint, vazelint, olajokat, zsrokat s hstabil porokat sterilezhetnk, amelyek az endosprs baktriumok biztos elpuszttshoz szksges hmrskleteket elbrjk (160 C-on 45 perc; 180 C-on 25 perc; 200 C-on 10 perc).

Sterilezs nedves hvel

A vz hvezetse sokszorosa a levegnek, gy nedves meleg vz vagy vzgz jelenltben alkalmazott hhats lnyegesen gyorsabban s hatsosabban sterilizl, mint a szraz h.

A nedves h alkalmazsnak legegyszerbb s legrgebbi mdja a kifzs. A forrsban lv vz hfoka norml lgkri nyoms mellett a 100C-ot nem haladja meg, ezrt a klnsen ellenll endosprs baktriumok a 10-15 perces kezelsnl nem pusztulnak el, gy sterilizl hats a kifzs sorn nem vrhat.

Pasztrzs. Egy alkalommal vgrehajtott, 30 perces 65C-os vagy 5 perces 85C-os melegtssel, a kezelst egyes endosprs baktriumok, hre kevsb rzkeny mikrobk tllhetik. Azonban ultrapasztrzs esetn a tej, illetve tejszn 135-150 C-on 2 mp-es htartssal val kezelse sorn a termk gyakorlatilag sterill vlik.

A tindallozs (frakcionlt sterilizls) sorn a sterilizlsra sznt tptalajt, vagy oldatot, naponta egy alkalommal, ngy napon t 60C feletti hmrskletre melegtik, majd a kvetkez kezelsig termoszttban inkubljk. Az egyes melegtsek alkalmval a vegetatv sejtek elpusztulnak, feltehetleg az utols melegts mr az utolsnak kicsrzott endosprkat puszttja el. Hrzkeny tpkzeg komponensek esetn (pl. zselatin) alkalmazhatjuk.

Sterilizlsra a leghatsosabb mdszer a tlnyomson, teltett vzgz jelenltben alkalmazott nedves h. Autoklvokban megvalsthat, ezek hermetikusan zr, nagy bels nyomst kill nagymret tartlyok. Az autoklv zrt terben a nyoms nvelsvel prhuzamosan emelkedik a hmrsklet, gy pl. az 1 atm tlnyoms elrsekor a teltett gz hfoka elri a 121C-ot. Ezt a hmrskletet a legtbb mikroba nem kpes elviselni 10 percen



10

tl (kivtel pl. prionok, hipertermofil baktriumok). Biztonsgi okokbl a sterilezsi id ennl hosszabb: 15, illetve 20 perc.

Pusztulsi kinetika A mikroorganizmusok pusztulsnak vizsglatnl az a mdszertani problma merl fl, hogy az elpusztult, halott sejteket nem lehet egyrtelmen kimutatni. Egy mikrobasejt akkor tekinthet halottnak, ha tbb nem kpes szaporodni, ezrt a mikroorganizmusok pusztulst a -cid/pusztt hats utn mg letben maradt, szaporodsra kpes, tll sejtek kimutatsval vizsgljuk. A mikrobapopulci pusztulsa idben lejtszd folyamat, ami a szaporodshoz hasonlan kpletekkel lerhat:

dN/dt = - k N, vagyis a tll sejtek szmnak (N, dimenzija sejt/ml) vltozsa t id alatt arnyos a mindenkori sejtszmmal, ahol a k a pusztulsi sebessgi egytthat, vagy fajlagos pusztulsi sebessg (eljele azrt negatv, mert cskken a sejtszm). Az egyenletet N0 (kezdeti sejtszm) s Nt (t idben tll sejtek szma) hatrok kzt integrlva a mikrobapopulcik pusztulsnak alapegyenlett kapjuk:

Nt = N0e- kt Az egyenletet logaritmlva a tllsi grbe egyenlethez jutunk:

log Nt/N0 = - kt, amelybl a pusztulsi sebessgi egytthat (k) kifejezhet:

k = 2,303/t log (N0/Nt). A tll sejtek logaritmust az id fggvnyben brzolva egyenest kapunk, amelynek meredeksge a pusztulsi sebessgi egytthatval arnyos.

3. bra: Tllsi grbe s a tizedelsi id (D) (Dek, 2006).

tg = lgN/t = - k/2,303 = -1/D



11

Ha t az az idtartam, amely alatt a tll sejtek szma tizedre cskken, akkor a tizedelsi id fogalmhoz jutunk. Ha teht Nt = 0,1 N0 s t = D, akkor

k = 2,303 D, vagy D = 2,303/k. A pusztulsi sebessgi egytthat s a tizedelsi id egymssal fordtottan arnyos. Minl gyorsabb egy populci pusztulsa, annl rvidebb a tizedelsi id, s fordtva. A D rtk dimenzija id (perc vagy ra), a pusztulsi sebessg id-1. A tizedelsi id a mikrobapopulci ellenll kpessgnek, rezisztencijnak mrtke is, minl nagyobb a D rtk, annl ellenllbb a mikroba az adott pusztt hatssal szemben. A D vagy k rtk csak akkor egyrtelm, ha megadjuk a behatsnak azt a mrtkt vagy dzist, amelyre vonatkozik, pl. D65 a tizedelsi id 65 C-on. A lineris tllsi grbe szerint minden D idtartam alatt a sejtek 90%-a pusztul el (10% marad letben), 2D alatt a sejtek 99,9%-a, 3D alatt 99,99% s gy tovbb. Ez azt jelenti, hogy a pusztulsi sebessg lland, s fggetlen a kezdeti sejtszmtl. A gyakorlatban ennl sokkal nagyobb pusztulsi arnyt kell elrni, br a teljes sterilezst elmletileg nem lehet megvalstani. A tll sejtek szmt 8-10 nagysgrenddel cskkentve azonban mr olyan mrtk pusztuls rhet el, hogy az letben maradt sejtek szma a kezdeti populci elenysz hnyadra cskken. Ha a D rtk logaritmust a pusztt hats klnbz erssg dzisainak fggvnyben brzoljuk (pldul hkezelsnl tbb hfok), akkor a pusztulsi grbt kapjuk (= rezisztencia grbe).

5. bra. Mikrobapopulcik pusztulsi grbi (Dek, 2006).

A grbe meredeksge jelzi a mikroorganizmus rezisztencijnak vltozst a pusztt hats erssgnek fggvnyben. Ennek a rezisztencinak a jellemzje a z-rtk, a pusztt dzis nvelsnek az a mrtke, amely a pusztulsi vagy tizedelsi idt 1 log nagysgrenddel (vagyis tizedre) cskkenti. A z-rtk a pusztulsi grbe meredeksgnek negatv reciproka. A pusztulsi grbe alkalmazsnak legfontosabb terlete a hkezelses tartsts. A hpusztulsi grbe a klnbz hmrskletekhez tartoz tizedeldsi idk logaritmust



12

brzolja. Ebben az esetben a z-rtk az a hmrskletnvekeds, amely a pusztulsi idt tizedre cskkenti.

5. bra. Hpusztulsi grbe s a z-rtk (Dek, 2006).

Q10 Hmrskleti koefficiens: Megadja, hogy a 10 C-kal emelve a hmrskletet hnyszor nagyobb sebessggel zajlik a tizedelds. Q10 = Dt/Dt+10 tg = - 1/z = - lgQ10/10 , ebbl kvetkezik, hogy z = 10/ lgQ10 s Q10 = 1010/z Gyakorlati feladatok:

Combase adatbzis megismerse Egyni feladat:

o Combase adatbzisban szaporods kinetikai adatok keresse adott mikroorganizmus s krnyezeti paramterek esetn

Csoportos feladat o pusztuls kinetikai szmolsok vgzse kapott adatok alapjn

Beadand: Egyni (szaporods kinetika):

tblzat: Combase adatbzisban tallt sejtszm s id adatok rtkeivel szaporodsi grbe felvtele a kapott szaporodsi grbe szakaszainak meghatrozsa az exponencilis szakasz brzolsnak segtsgvel a szaporodsi sebessg s a

genercis id meghatrozsa eredmnyek szveges rtkelse

Csoportos (pusztulsi kinetika): tblzat: a kapott id s sejtszm adatok valamint azok logaritmikus rtkeivel



13

a logaritmikus rtkek brzolsa s egyenes illesztse a kapott egyenes segtsgvel k s D rtkek meghatrozsa



14

KSRLETTERVEZS 1. CSOPORT

A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a szacharz szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az ammnium-acettot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:

Y = a0 + a1*x1 + a2*x12 + a3*x2 + a4*x22 +a5*x1x2 Ahol:

Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 szacharz koncentrci x2 ammnium-acett koncentrci

Fggetlen vltozk: szacharz (szubsztrtum)

ammnium-acett (nitrognforrs)

Munkapontok: 2 % szacharz koncentrci

0,4 % ammnium-acett koncentrci

Lptktnyez: 1 % szacharz esetn

0,2 % ammnium-acett esetn

A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Szacharz (%) Ammnium-acett (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



15

Az enzim fermentci Inokulum tpkzegben felszaportjuk a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b mikroorganizmust, 47C-on, 220 1/perc rzatsi sebessg rzgpben. Az enzimtermelshez 2 napos inokulum tenyszettel indtjuk a fermentcit (47C, 220 1/perc rzatsi sebessg, 6-7 nap), s az -galaktozidz enzim termels alakulst enzimaktivits mrsen keresztl kvetjk. A gyakorlat sorn elksztjk a ksrleti belltsoknak megfelelen a szksges tpkzegeket. Tenysztsi krlmnyek: 47C, 220 1/perc rzatsi sebessg

Inokulum tenyszet: 2 nap Enzim fermentci: 6-7 nap

Alkalmazott tpkzegek Inokulum tpkzeg:

Glkz-aszparagin tpkzeg

Glkz 20 g L-aszparagin 4 g KH2PO4 3 g K2HPO4 2 g MgSO4.7H2O 0,5 g Vogel-fle nyomelem oldat 1 ml Desztilllt vz 1000 ml-re Vogel-fle nyomelem oldat:

Citromsav.H2O 5 g ZnSO4.7H2O 5 g Fe(NH4)2(SO4)2.6H2O 1 g CuSO4.5H2O 0,25 g MnSO4.H2O 0,05 g H3BO3 (anhidrid) 0,05 g Na2MoO4.2H2O 0,05 g Desztilllt vz 100 ml-re

2 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 150-150 ml tpkzeget mrnk, majd autoklvban sterilezzk 121C-on 15 percig.



16

Fermentcis tpkzeg

Sznforrs Nitrognforrs KH2PO4 3 g K2HPO4 2 g MgSO4*7H2O 0,5 g Vogel-fle nyomelem oldat 1 ml Desztilllt vz 1000 ml

500 ml-es Erlenmeyer lombikokba 150 ml tpkzegeket mrnk, majd autoklvban sterilezzk 121C-on 15 percig.

Alfa-galaktozidz enzim aktivits mrse

Az enzimek mkdse szmszeren jellemezhet az enzim mennyisge, az talaktott anyagmennyisg s az ehhez szksges id kztti sszefggssel. Ennek alapjn definilhatjuk az enzimaktivits egysgt (U): az az enzim mennyisg (ml, l, mg, g stb.), amely bont vagy felszabadt egysgnyi (mol, mol, mmol, g, mg stb.) szubsztrtumot vagy termket egysgnyi id alatt (msodperc, perc, ra, nap, hnap stb.) az adott krlmnyek kztt. A -galaktozidz aktivits meghatrozsa a p-nitrofenil--D-galaktopiranozid szubsztrtumbl felszabadtott p-nitrofenol mennyisgnek mrsvel trtnik spektrofotomterrel 405 nm-en, s kalibrcis egyenes segtsgvel szmthat. Egy egysgnyi -galaktozidz az az enzimmennyisg, mely 1M p-nitrofenolt szabadt fel egy perc alatt a reakci krlmnyei kztt.

Az aktivits mrs menete: A klnbz ksrleti belltsoknak megfelel tpkzeget ill. fermentlevet tartalmaz

lombikokbl steril krlmnyek kztt mintt vesznk, melyet szrpapron leszrnk. A mikrobamentesre szrt s megfelelen hgtott fermentlbl vgezzk el az aktivitsmrst. Az enzimaktivits rtkelshez minden minthoz enzimvakot, s 1-1 db szubsztrtvakot s mszervakot is ksztnk, a tblzatnak megfelelen.

Az enzimakivits mrshez hasznlt reakcielegyek sszelltsa DV

[ml] Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]

Enzim oldat Minta[ml]

Mszer vak 0,7 0,3 - - Szubsztrtum vak 0,2 0,3 0,5 - Enzim vak 0,5 0,3 - 0,2 Minta 0,3 0,5 0,2



17

Az aktivits mrse sorn, a fenti tblzatban szerepl mennyisgeket (a minta kivtelvel) kmcsvekbe mrjk. A kmcsveket 5 percre, 58 C-ra elmelegtett vzfrdbe tesszk elinkubls cljbl. Az id lejrta utn 0,2 ml mintval indtjuk el az enzimreakcit. Az 5 perces reakciid lejrta utn 5 ml 0,1 M-os Na2CO3 oldattal lltjuk le a reakcit. Ezutn a mszervakra nullzott spektrofotomterrel 405 nm-en megmrjk a reakcielegyek abszorbancijt. A felszabadult p-nitrofenol mennyisg meghatrozshoz a kalibrcis egyenes adatait vesszk alapul, mely egyenes egyenlete a kvetkez:

y = 2,559 x

A -galaktozidz enzim aktivits a kvetkez kplettel hatrozhat meg:

Az eredmnyeket STATISTICA program segtsgvel rtkeljk. A program lehetsget nyjt az eredmnyek vlaszfellet mdszerrel trtn rtkelsre s brzolsra.



18


A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a szacharz szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az lesztkivonatot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:


Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 szacharz koncentrci x2 lesztkivonat koncentrci


lesztkivonat (nitrognforrs)

Munkapontok: 2 % szacharz koncentrci

0,8 % lesztkivonat koncentrci


0,2 % lesztkivonat esetn

A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Szacharz (%) lesztkivonat (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



19





Glkz 20 g L-aszparagin 4 g KH2PO4 3 g K2HPO4 2 g MgSO4.7H2O 0,5 g Vogel-fle nyomelem oldat 1 ml Desztilllt vz 1000 ml-re

Vogel-fle nyomelem oldat





20

Fermentcis tpkzeg




Az enzimek mkdse szmszeren jellemezhet az enzim mennyisge, az talaktott anyagmennyisg s az ehhez szksges id kztti sszefggssel. Ennek alapjn definilhatjuk az enzimaktivits egysgt (U): az az enzim mennyisg (ml, l, mg, g stb.), amely bont vagy felszabadt egysgnyi (mol, mol, mmol, g, mg stb.) szubsztrtumot vagy termket egysgnyi id alatt (msodperc, perc, ra, nap, hnap stb.) az adott krlmnyek kztt. A -galaktozidz aktivits meghatrozsa a p-nitrofenil--D-galaktopiranozid szubsztrtumbl felszabadtott p-nitrofenol mennyisgnek mrsvel trtnik spektrofotomterrel 405 nm-en trtnik, s kalibrcis egyenes segtsgvel szmthat. Egy egysgnyi -galaktozidz az az enzimmennyisg, mely 1M p-nitrofenolt szabadt fel egy perc alatt a reakci krlmnyei kztt.



Az enzimakivits mrshez hasznlt reakcielegyek sszelltsa

DV [ml]

Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]





21

Az aktivits mrse sorn, a fenti tblzatban szerepl mennyisgeket (a minta kivtelvel) kmcsvekbe mrjk. A kmcsveket 5 percre, 58 C-ra elmelegtett vzfrdbe tesszk elinkubls cljbl. Az id lejrta utn 0,2 ml mintval indtjuk el az enzimreakcit. Az 5 perces reakciid lejrta utn 5 ml 0,1 M-os Na2CO3 oldattal lltjuk le a reakcit. Ezutn a mszervakra nullzott spektrofotomterrel 405 nm-en megmrjk a reakcielegyek abszorbancijt. A felszabadult p-nitrofenol mennyisg meghatrozshoz a kalibrcis egyenes adatait vesszk alapul, mely egyenes egyenlete a kvetkez:

y = 2,559 x


Aminta minta abszorbancija AEV enzimvak abszorbancija ASV szubsztrtvak abszorbancija h hgts Vr reakci trfogat Vm bemrt minta trfogata t reakci id Az eredmnyeket STATISTICA program segtsgvel rtkeljk. A program lehetsget nyjt az eredmnyek vlaszfellet mdszerrel trtn rtkelsre s brzolsra.



22


A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a borsliszt szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az ammnium-acettot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:


Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 borsliszt koncentrci x2 ammnium-acett koncentrci

Fggetlen vltozk: borsliszt (szubsztrtum)


Munkapontok: 6 % borsliszt koncentrci


Lptktnyez: 1,5 % borsliszt esetn


A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Borsliszt (%) Ammnium-acett (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



23






Vogel-fle nyomelem oldat:





24

Fermentcis tpkzeg








DV [ml]

Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]





25

Az aktivits mrse sorn, a fenti tblzatban szerepl mennyisgeket (a minta kivtelvel) kmcsvekbe mrjk. A kmcsveket 5 percre, 58 C-ra elmelegtett vzfrdbe tesszk elinkubls cljbl. Az id lejrta utn 0,2 ml mintval indtjuk el az enzimreakcit. Az 5 perces reakciid lejrta utn 5 ml 0,1 M-os Na2CO3 oldattal lltjuk le azt a reakcit. Ezutn a mszervakra nullzott spektrofotomterrel 405 nm-en megmrjk a reakcielegyek abszorbancijt. A felszabadult p-nitrofenol mennyisg meghatrozshoz a kalibrcis egyenes adatait vesszk alapul, mely egyenes egyenlete a kvetkez:

y = 2,559 x





26


A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a borsliszt szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az lesztkivonatot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:


Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 borsliszt koncentrci x2 lesztkivonat koncentrci







A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Borsliszt (%) lesztkivonat (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



27

Az enzim fermentci Inokulum tpkzegben felszaportjuk az Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b mikroorganizmust, 47C-on, 220 1/perc rzatsi sebessg rzgpben. Az enzimtermelshez 2 napos inokulum tenyszettel indtjuk a fermentcit (47C, 220 1/perc rzatsi sebessg, 6-7 nap), s az -galaktozidz enzim termels alakulst enzimaktivits mrsen keresztl kvetjk. A gyakorlat sorn elksztjk a ksrleti belltsoknak megfelelen a szksges tpkzegeket. Tenysztsi krlmnyek: 47C, 220 1/perc rzatsi sebessg










28

Fermentcis tpkzeg








DV [ml]

Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]


Mszer vak 0,7 0,3 - -

Szubsztrtum vak 0,2 0,3 0,5 -

Enzim vak 0,5 0,3 - 0,2

Minta 0,3 0,5 0,2



29

Az aktivits mrse sorn, a fenti tblzatban szerepl mennyisgeket (a minta kivtelvel) kmcsvekbe mrjk. A kmcsveket 5 percre, 58 C-ra elmelegtett vzfrdbe tesszk elinkubls cljbl. Az id lejrta utn 0,2 ml mintval indtjuk el az enzimreakcit. Az 5 perces reakciid lejrta utn 5 ml 0,1 M-os Na2CO3 oldattal lltjuk le azt a reakcit. Ezutn a mszervakra nullzott spektrofotomterrel 405 nm-en megmrjk a reakcielegyek abszorbancijt. A felszabadult p-nitrofenol mennyisg meghatrozshoz a kalibrcis egyenes adatait vesszk alapul. Mely egyenes egyenlete a kvetkez:

y = 2,559 x

A -galaktozidz enzim aktivits a kvetkez kpletekkel hatrozhat meg:




30


A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a borsliszt szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az lesztkivonatot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:


Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 borsliszt koncentrci x2 lesztkivonat koncentrci







A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Borsliszt (%) lesztkivonat (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



31











32

Fermentcis tpkzeg








DV [ml]

Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]


Mszer vak 0,7 0,3 - -


Enzim vak 0,5 0,3 - 0,2

Minta 0,3 0,5 0,2



33


y = 2,559 x





34


A gyakorlat sorn a Thermomyces lanuginosus CBS 395.62 b fonalas gomba -galaktozidz enzim termelsnek optimalizlst vgezzk el kzponti elrendezs ksrlettervezsi mdszer alkalmazsval. Kt fggetlen vltozt vlasztunk, a szacharz szubsztrtumot, valamint nitrognforrsknt az ammnium-acettot s rtkeljk, hogy miknt befolysolja az enzim termeldst ezen tnyezk koncentrciinak vltozsa. A gomba enzimtermelsnek lersra a kvetkez modellt hasznljuk fel:


Y -galaktozidz aktivits a1-5 regresszis egytthatk x1 szacharz koncentrci x2 ammnium-acett koncentrci



Munkapontok: 2,5 % szacharz koncentrci




A ksrleti belltsok

Mintaszm X1 X2 Szacharz (%) Ammnium-acett (%)

1 -1,41 0 2 -1 1 3 0 1,41 4 1 1 5 1,41 0 6 1 -1 7 0 -1,41 8 -1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0



35











36

Fermentcis tpkzeg








DV [ml]

Puffer [ml]

Szubsztrtum [ml]


Mszer vak 0,7 0,3 - -


Enzim vak 0,5 0,3 - 0,2



37

Minta 0,3 0,5 0,2


y = 2,559 x



Inokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldat:Inokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldatInokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldat:Inokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldat:Inokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldat:Inokulum tpkzeg:Glkz-aszparagin tpkzegVogel-fle nyomelem oldat:

bim gyak 2015

Documents