bib.irb.hrbib.irb.hr/.../626830.doktorski_rad_adriana_dijanoi.docx · web viewusporedno s...
TRANSCRIPT
PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET
Adriana Dijanošić
ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMASPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI
POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA
DOKTORSKI RAD
Zagreb, 2013.
FACULTY OF SCIENCE
Adriana Dijanošić
SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN
SMALL MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES
DOCTORAL THESIS
Zagreb, 2013.
PRIRODOSLOVNO-MATEMATIČKI FAKULTET
Adriana Dijanošić
ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMASPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI
POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA
DOKTORSKI RAD
Mentor: Dr. sc. Snežana Miljanić, doc.
Zagreb, 2013.
FACULTY OF SCIENCE
Adriana Dijanošić
SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN
SMALL MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES
DOCTORAL THESIS
Supervisor: Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof.
Zagreb, 2013.
Ovaj rad izrađen je u Zavodu za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka
Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u Zagrebu
pod vodstvom doc. dr. sc. Snežane Miljanić.
iv
Zahvaljujem se mentorici doc. dr. sc. Snežani Miljanić na odabiru teme, stručnim i svim
ostalim savjetima te uloženom trudu i vremenu koje mi je posvetila pri izradi ove disertacije.
Veliko hvala dr. sc. Ivi Piantanidi na ustupljenim spojevima te svim konstruktivnim
primjedbama i ispravcima rada.
Hvala članovima Zavoda za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka koji su na bilo koji način
pridonijeli izradi ovog rada.
Hvala mojim prijateljima, posebno Katji, na potpori i druženju.
Hvala Dominiku na beskrajnom strpljenju i ljubavi.
Veliko hvala mojoj obitelji, bratu Mariu te osobito mami i tati, koji su uvijek bili uz mene i
pružali mi neizmjernu podršku tijekom cijelog školovanja.
Ovaj rad posvećujem njima.
Zagreb, 2013.
Adriana Dijanošić
v
Sadržaj
SAŽETAK................................................................................................................................ix
ABSTRACT...............................................................................................................................x
1. UVOD.....................................................................................................................................1
2. LITERATURNI PREGLED................................................................................................3
2.1. Nukleinske kiseline.......................................................................................................................3
2.1.1. Otkriće DNA...........................................................................................................................3
2.1.2. Građa nukleinskih kiselina.....................................................................................................4
2.1.2.1. Sparivanje baza................................................................................................................7
2.1.2.2. Utori.................................................................................................................................8
2.1.2.3. Strukture DNA.................................................................................................................9
2.1.3. Funkcija nukleinskih kiselina...............................................................................................11
2.2. Male organske molekule kao antitumorski lijekovi....................................................................12
2.2.1. Vezanje antitumorskih molekula i DNA..............................................................................12
2.2.1.1. Interkalatori...................................................................................................................12
2.2.1.2. Molekule koje se vežu u utor.........................................................................................14
2.2.1.3. Molekule s metalom u strukturi.....................................................................................18
2.2.2. Poliamini kao antitumorski lijekovi.....................................................................................19
2.2.3. Metode istraživanja interakcija malih molekula s polinukleotidima....................................20
2.3. Površinski pojačano Ramanovo raspršenje.................................................................................22
2.3.1. Ramanova spektroskopija.....................................................................................................22
2.3.2. Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja..............................................27
2.3.2.1. Otkriće...........................................................................................................................27
2.3.2.2. Metalni supstrati............................................................................................................27
2.3.2.3. Teorije površinskog pojačanja Ramanovog raspršenja.................................................29
2.3.2.3.1. Elektromagnetski mehanizam.................................................................................29
2.3.2.3.2. Kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja...........................................32
2.3.2.4. Izborna pravila i asignacija SERS spektara...................................................................33
2.3.2.5. Istraživanje vezanja malih molekula s DNA SERS spektroskopijom...........................34
3. EKSPERIMENTALNI DIO..............................................................................................35
3.1. Kemikalije...................................................................................................................................35
3.2. Istraživani spojevi........................................................................................................................36
3.2.1. 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP).....................36
3.2.2. N1-((1H-imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilami-
no)etil)amino)-etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY)...........36
vi
3.2.3. N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin (Sp)....................................................................37
3.2.4. 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolin (PHENPOD) i
2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridin (PYPOD)...................................37
3.3. Priprava koloidnih suspenzija srebra...........................................................................................38
3.3.1. Koloid 1................................................................................................................................38
3.3.2. Koloid 2................................................................................................................................38
3.3.3. Koloid 3................................................................................................................................38
3.3.4. Koloid 4................................................................................................................................39
3.4. Priprava otopina i mjernih uzoraka.............................................................................................40
3.4.1. Priprava uzoraka sa spojem ADAP......................................................................................40
3.4.2. Priprava uzoraka sa spojevima IM i PY..............................................................................41
3.4.3. Priprava uzoraka sa spojem Sp.............................................................................................42
3.4.4. Priprava uzoraka sa spojevima PHENPOD i PYPOD........................................................42
3.5. Mjerni uređaji..............................................................................................................................44
3.5.1. Snimanje UV/VIS apsorpcijskih spektara............................................................................44
3.5.2. Određivanje pH vrijednosti koloidne suspenzije..................................................................44
3.5.3. Snimanje koloida transmisijskom elektronskom mikroskopijom........................................44
3.5.4. Snimanje FT-Ramanovih i SERS spektara...........................................................................44
4. REZULTATI I RASPRAVA.............................................................................................45
4.1. Karakterizacija koloidnih suspenzija srebra................................................................................45
4.1.1. Koloid 1................................................................................................................................45
4.1.2. Koloid 2................................................................................................................................47
4.1.3. Koloid 3................................................................................................................................49
4.1.4. Koloid 4................................................................................................................................51
4.2. Istraživanje interakcija spoja ADAP s DNA...............................................................................53
4.2.1. FT-Ramanovi spektri spoja ADAP......................................................................................53
4.2.2. SERS spektri spoja ADAP...................................................................................................53
4.2.2.1. Odabir koloida...............................................................................................................53
4.2.2.2. Koncentracijska ovisnost...............................................................................................55
4.2.2.3. Utjecaj pufera.................................................................................................................58
4.2.2.4. SERS spektri smjesa spoja ADAP i DNA.....................................................................59
4.2.2.4.1. Utjecaj priprave uzorka...........................................................................................59
4.2.2.4.2. Interakcije molekula ADAP i DNA.......................................................................60
4.3. Istraživanje interakcija spojeva IM i PY s polinukleotidima......................................................63
4.3.1. FT-Ramanovi spektri spojeva IM i PY................................................................................63
vii
4.3.2. SERS spektri spojeva IM i PY.............................................................................................65
4.3.2.1. Odabir koloida...............................................................................................................65
4.3.2.2. Koncentracijska ovisnost...............................................................................................66
4.3.2.3. Utjecaj NaBH4...............................................................................................................70
4.3.2.4. Utjecaj pufera.................................................................................................................72
4.3.2.5. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s polinukleotidima i DNA...............................74
4.3.2.5.1. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s jednolančanim RNA polinukleotidima. .74
4.3.2.5.2. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima.....................................................................................................................80
4.3.2.5.3. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA...................................................86
4.4. Istraživanja sa spojem Sp............................................................................................................87
4.4.1. FT-Ramanovi spektri spoja Sp.............................................................................................87
4.4.2. SERS spektri spoja Sp..........................................................................................................88
4.4.2.1. Koncentracijska ovisnost...............................................................................................88
4.4.2.2. SERS spektri spoja Sp s polinukleotidima i DNA........................................................91
4.4.2.2.1. SERS spektri spoja Sp s jednolančanim RNA polinukleotidima...........................91
4.4.2.2.2. SERS spektri spoja Sp s dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima i ct-DNA....93
4.5. Istraživanja sa spojevima PHENPOD i PYPOD.......................................................................96
4.5.1. FT-Ramanovi spektri spojeva PHENPOD i PYPOD.........................................................96
4.5.2. SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD......................................................................98
4.5.2.1. Odabir koloida...............................................................................................................98
4.5.2.2. Koncentracijska ovisnost...............................................................................................99
4.5.2.3. Utjecaj pufera...............................................................................................................102
4.5.2.4. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s polinukleotidima i ct-DNA. .104
4.5.2.4.1. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA polinukleotidima...................................................................................................................104
4.5.2.4.2. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA.................................................................................................109
5. ZAKLJUČAK...................................................................................................................114
6. LITERATURNA VRELA................................................................................................117
7. POPIS KRATICA I SIMBOLA......................................................................................124
8. PRILOZI...............................................................................................................................xi
9. ŽIVOTOPIS.......................................................................................................................xiv
viii
SAŽETAK
Sveučilište u Zagrebu Doktorski radPrirodoslovno-matematički fakultet Kemijski odsjek
ISTRAŽIVANJE INTERAKCIJA MALIH MOLEKULA S POLINUKLEOTIDIMA SPEKTROSKOPIJOM POVRŠINSKI POJAČANOG RAMANOVOG RASPRŠENJA
Adriana Dijanošić
Zavod za analitičku kemijuKemijski odsjek
Prirodoslovno-matematički fakultetSveučilište u Zagrebu
Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja (SERS) primijenjena je pri istraživanju interakcija malih organskih molekula sa svojstvima interkaliranja (ADAP) i vezanja u utore (IM, PY, Sp, PHENPOD, PYPOD) s jednolančanim RNA polinukleotidima te dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima. Kao metalni supstrati korištene su koloidne suspenzije srebra pripravljene redukcijom srebrova nitrata. Istraživane male molekule intenzivno raspršuju zračenje kada se nalaze blizu ili su vezane na nanočestice srebra. Ovisno o koncentraciji različito se orijentiraju na površini metala, pri čemu smanjenje koncentracije do 5106 mol dm3 prati pojačanje raspršenog zračenja spojeva ADAP, PHENPOD i PYPOD, za razliku od slabljenja raspršenja spojeva IM i PY te Sp.
Nove vrpce u spektrima smjesa malih molekula s polinukleotidima pripisane su vibracijama dijelova polinukleotida koji sudjeluju u interakcijama. SERS spektri smjesa poliaminskih spojeva i jednolančanih RNA polinukleotida ukazuju na interakcije malih molekula s dušičnim bazama polinukleotida poli A, poli G, poli C i poli U. Male molekule spojeva IM i PY vežu se u mali i veliki utor dvostruke uzvojnice polinukleotida poli dAdT–poli dAdT, dok interakcije s dušičnim bazama stvaraju samo u velikom utoru polinukleotida poli dGdC–poli dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA. Molekule spoja Sp, koje strukturno odgovaraju aminometilenskim poveznicama u molekulama IM i PY, vežu se na isti način s DNA/RNA polinukleotidima kao i poliaminske molekule. Molekule složenije strukture PHENPOD i PYPOD također se vežu u oba utora dvolančanog polinukleotida adenina i timina. Analizom SERS spektara nisu opažene interakcije s polinukleotidom gvanina i citozina, dok se slabim interakcijama u veliki utor dvolančanog RNA polinukleotida veže samo PHENPOD. Također je utvrđeno da molekule PHENPOD fenantrolinskim sustavom interkaliraju u dvostruku uzvojnicu nekih DNA analoga. Smanjenje intenziteta raspršenog zračenja u spektru kompleksa ADAP/ct-DNA ukazuje na interkaliranje spoja u uzvojnicu nukleinske kiseline.
(xvi + 124 stranica, 78 slika, 18 tablica, 138 literaturna navoda, izvornik na hrvatskom jeziku)
Rad je pohranjen u Središnjoj kemijskoj knjižnici Prirodoslovno-matematičkog fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu, Horvatovac 102a, Zagreb.
Ključne riječi: površinski pojačano Ramanovo raspršenje, DNA/RNA polinukleotidi, koloid srebra
Mentor: Dr. sc. Snežana Miljanić, doc., PMF
Ocjenjivači: Dr. sc. Tomica Hrenar, izv. prof., PMFDr. sc. Snežana Miljanić, doc., PMFDr. sc. Ivo Piantanida, zn. savj., IRB
Zamjena: Dr. sc. Goran Baranović, zn. savj., IRB
Rad prihvaćen: 3. travnja 2013.
ix
ABSTRACT
University of Zagreb Doctoral thesisFaculty of Science Department of Chemistry
SURFACE-ENHANCED RAMAN STUDY OF THE INTERACTIONS BETWEEN SMALL MOLECULES AND POLYNUCLEOTIDES
Adriana Dijanošić
Laboratory of Analytical ChemistryDepartment of Chemistry
Faculty of ScienceUniversity of Zagreb
Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy (SERS) has been applied in a study of the interactions of small organic intercalating (ADAP) and groove-binding (IM, PY, Sp, PHENPOD, PYPOD) molecules with single stranded RNA polynucleotides and double stranded DNA and RNA polynucleotides. Silver colloidal suspensions, prepared by reduction of silver nitrate, were used as metal substrates. An intense scattering was obtained from the studied small molecules close to or bound onto the silver nanoparticles. Depending on concentration the molecules adopted various orientations on the metal surface, whereby a decrease in concentration down to 5106 mol dm3 was followed by enhancement of the scattered radiation of ADAP, PHENPOD and PYPOD, unlike scattering diminution of IM, PY and Sp.
New bands in the spectra of mixtures of small molecules and polynucleotides were assigned to vibrations of polynucleotide moieties involved in interactions. SERS spectra of the polyamine compounds with single stranded RNA polynucleotides indicated interactions of the small molecules with the nucleic bases of the poly A, poly G, poly C and poly U polynucleotides. The small molecules of IM and PY bound in to the minor and the major groove of the helical poly dAdT–poly dAdT polynucleotide, while interacting with the nucleobases only in the major groove of the poly dGdC–poly dGdC, poly rA–poly polynucleotides and ct-DNA. The molecules of Sp, structurally related to aminomethylene chains of IM and PY, bound in the same way in the DNA/RNA analogs as polyamine molecules. Molecules of more complex structure, PHENPOD and PYPOD, also bound in both grooves of the double stranded adenine-thymine polynucleotide. Analyzing the SERS spectra, interactions with the guanine-cytosine polynucleotide were not observed, while the weak interactions of PHENPOD within the major groove of the double stranded RNA polynucleotide were obtained. Phenanthroline parts of PHENPOD molecules also intercalate into helix of some DNA analogs. A decrease in scattered radiation intensity indicated intercalation of ADAP in the nucleic acid helix.
(xvi 124 pages, 78 figures, 18 tables, 138 references, original in Croatian)
Thesis deposited in the Central Chemical Library, Faculty of Science, University of Zagreb, Horvatovac 102a, Zagreb, Croatia.
Keywords: surface enhanced Raman scattering, DNA/RNA polynucleotides, silver colloid
Supervisor: Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof., PMF
Reviewers: Dr. Tomica Hrenar, Assoc. Prof., PMF Dr. Snežana Miljanić, Asst. Prof., PMF Dr. Ivo Piantanida, Scientific Advisor, IRB
Substitute: Dr. Goran Baranović, Scientific Advisor, IRB
Thesis accepted: 3 April 2013
x
1. UVOD
Usprkos brojnim uspješnim terapijama i liječenju, karcinom se ubraja među najčešće
uzroke smrti ljudi u svijetu.1 Većina antitumorskih lijekova, uz poželjno djelovanje na stanice
tumora, štetno djeluje na zdrave stanice tkiva. Radi toga se sintetiziraju novi spojevi,
strukturno slični onima koji imaju aktivno antitumorsko djelovanje ili se aktivne tvari
modificiraju, a sve s ciljem prepoznavanja isključivo tumorskih stanica. U stanici se aktivne
molekule najčešće vežu s deoksiribonukleinskom kiselinom što rezultira oštećenjem
nukleinske kiseline i uzrokuje smrt stanice.2 Iz tog se razloga većina istraživanja provodi u
svrhu određivanja točnog mjesta i načina vezanja poznatih lijekova i njihovih modificiranih
formi s DNA.
Osim razumijevanju mehanizama djelovanja antitumorskih i antivirusnih lijekova,
istraživanja interakcija malih molekula s deoksiribonukleinskom kiselinom (eng.
deoxyribonucleic acid, DNA) i ribonukleinskom kiselinom (eng. ribonucleic acid, RNA)
doprinose određivanju strukturnih značajki nukleinskih kiselina, pojašnjenju mutacije gena i
nastanka pojedinih bolesti.3 Pri otkrivanju načina vezanja malih organskih molekula s
polinukleotidima primjenjuju se različite spektroskopske metode: UV/VIS apsorpcijska i
fluorescencijska spektroskopija, spektroskopija linearnog i cirkularnog dikroizma,
spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije te infracrvena i Ramanova spektroskopija.
Svaka metoda ima svoje prednosti i nedostatke te informacijama koje pruža upotpunjuje
spoznaju o interakcijama malih molekula i nukleinskih kiselina. Uz preporuku primjene
raznovrsnih metoda, osobita pažnja pridaje se onim metodama koje se mogu koristiti za
mjerenja u biološkim uvjetima. Postavlja se stoga zahtjev za osjetljivom i selektivnom
metodom koja omogućava strukturnu analizu, kako malih organskih molekula, tako i
biomakromolekula u vodenom mediju.
Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja (eng. surface-enhanced
Raman spectroscopy, SERS) opaža se vibracijski spektar specifičan za molekulu smještenu na
ili vrlo blizu neravne metalne površine.4 Adsorpcijom molekule na metalni supstrat, raspršeno
zračenje pojačava se i do milijun puta, a fluorescencija gasi, što omogućava strukturna
istraživanja molekula koje raspršuju zračenje pri mikromolarnim koncentracijama. Prednosti
spektroskopije površinski pojačanog Ramanovog raspršenja u vidu osjetljivosti i selektivnosti
te mogućnosti mjerenja sustava u vodi, nameću SERS spektroskopiju kao vrlo suvremenu
metodu pri istraživanju prepoznavanja i vezanja biomolekula.
1
Svrha ovog rada je primijeniti spektroskopiju površinski pojačanog Ramanovog
raspršenja pri istraživanju vezanja malih organskih molekula s polinukleotidima. Suspenzije
nanočestica srebra u vodi pripravljene različitim redukcijskim postupcima djelovat će kao
vodeni medij fiziološke pH vrijednosti i istovremeno omogućiti pojačanje raspršenog zračenja
molekula. Istražit će se interakcije malih molekula, koje imaju svojstvo interkaliranja i/ili
vezanja u utore, s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima. S obzirom da
vibracijski spektri omogućavaju uvid u strukturu molekula prije i poslije interakcije, očekuje
se da će spektralne promjene ukazati na mjesto i način vezanja molekula.
2
2. LITERATURNI PREGLED
2.1. Nukleinske kiseline
Deoksiribonukleinska kiselina i ribonukleinska kiselina su biomakromolekule koje
sudjeluju u pohrani, prijenosu i ekspresiji genetičke informacije. DNA sadrži genetičke upute
neophodne za razvitak i funkcioniranje svih živih bića i nekih virusa, dok RNA sudjeluje u
sintezi proteina te u nizu drugih životno važnih procesa.
2.1.1. Otkriće DNA
DNA je prvi izolirao švicarski liječnik F. Miescher 1869. godine.5 Tijekom razgradnje
leukocita izoliranih iz sekreta otvorenih rana zamijetio je taloženje do tada nepoznate tvari.
Desetak godina kasnije A. Kossel odredio je kemijski sastav Miescherovog spoja i zaključio
da sadrži dušične baze, šećer i fosfornu kiselinu te da u stanici ne djeluje niti kao izvor
energije niti služi za pohranu energije.6 Pedesetih godina dvadesetog stoljeća E. Chargaff sa
suradnicima otkrio je da nukleinska kiselina sadrži istu količinu purinskih (adenin, gvanin) i
pirimidinskih baza (timin, citozin) te da su molarni omjeri dušičnih baza adenin/timin te
gvanin/citozin gotovo uvijek približno jednaki jedan, a međusobni omjeri svih baza bitno
različiti od jedan.7 Omjeri dušičnih baza isti su i karakteristični za pojedinu vrstu. Usporedno
s istraživanjem sastava nukleinske kiseline, pokušavala se odrediti njezina uloga u stanicama.
A. Hershey i M. Chase utvrdili su 1952. godine na temelju prethodnih istraživanja Averya,
MacLeoda i McCarthya da je DNA genetski materijal.8 Godinu dana kasnije J. D. Watson i F.
Crick predložili su strukturu DNA koji se danas smatra prvim točnim modelom dvostruke
uzvojnice nukleinske kiseline. Model su temeljili na slici DNA koju su R. Franklin i R.
Gosling snimili metodom rentgenske difrakcije u svibnju 1952. godine (Slika 2.1.1), a objavili
sljedeće godine u časopisu Nature,9 te na Chargaffovom otkriću o jednakom broju purinskih i
pirimidinskih baza. Eksperimentalni dokazi o modelu dvostruke uzvojnice DNA objavljeni su
iste godine u časopisu Nature.10,11 Watson i Crick su u svojim radovima opisivali kako su dva
lanca nukleinske kiseline međusobno antiparalelna i povezana vodikovim vezama između
dušičnih baza. Smatrali su da prilikom replikacije pucaju vodikove veze, lanci se odmotavaju
i svaki lanac služi kao kalup za stvaranje novog lanca. Ovaj model objašnjava kako se DNA
3
replicira i kako se zadržava genetska kontinuiranost. Završnu potvrdu o mehanizmu
replikacije dali su M. Meselson i F. Stahl 1958. godine istraživanjem replikacije DNA u
Escherichii coli.12
Slika 2.1.1. Rentgenski difraktogram DNA.8
Sredinom šezdesetih godina 20. stoljeća otkriveno je da se genetski kod temelji na
tripletima baza koji su nazvani kodoni. Ovo otkriće omogućilo je Holleyu, Khorani i
Nienbergu te njihovim suradnicima konačno razbijanje genetskog koda.1315 Otkrićem
strukture i uloge DNA započinje era molekularne biologije i genetike.
2.1.2. Građa nukleinskih kiselina
DNA i RNA su dugački linearni polimeri građeni od monomernih jedinica zvanih
nukleotidi. Svaki monomer se sastoji od šećera, fosfatne skupine i dušične baze.16
Deoksiribonukleinska kiselina sadrži šećer deoksiribozu (Slika 2.1.2.a). Predmetak
„deoksi“ označava da na 2' ugljikovom atomu nedostaje hidroksilna skupina, koja je prisutna
u ribozi, građevnom šećeru ribonukleinske kiseline (Slika 2.1.2.b).
(a) (b)
Slika 2.1.2. Šećeri u nukleinskim kiselinama: a) deoksiriboza i b) riboza.
4
Molekule šećera koje grade nukleinske kiseline su β-D-stereoizomeri. Oba šećera su
derivati furanoze i nisu planarni, već u prostoru mogu postojati u dvije konformacije:
„omotnice“ i „stolice“ (Slika 2.1.3).17
Slika 2.1.3. Konformacije šećera: a) „omotnica“ i b) „stolica“.
Kada se jedan atom iz prstena nalazi izvan ravnine koju čine preostala četiri atoma,
prsten ima oblik „omotnice“. Šećer je u konformaciji „stolice“ kada se dva susjedna atoma
nalaze van ravnine, pri čemu je jedan atom iznad, a drugi ispod ravnine. Najčešće jedan od
atoma izvan ravnine odstupa od ravnine više od drugog atoma. Ako je taj atom smješten na
istoj strani kao i C4'–C5' veza šećera i dušična baza, konformacija nosi oznaku endo (Slika
2.1.4). Ako je atom na suprotnoj strani, konformacija se označava exo. U živim organizmima
šećer u DNA nalazi se u endo konformaciji.17
Veza između šećera i dušične baze naziva se glikozidna veza. Za purinske baze vezane
na šećer glikozidni torzijski kut definiran je s četiri atoma O4'–C1'–N9–C4, a za pirimidinske
baze s O4'–C1'–N1–C2 (Slika 2.1.4).18 Glikozidni torzijski kut poprima anti konformaciju
kada su N1–C2 veza purina, odnosno C2–N3 veza pirimidina, usmjerene nasuprot prstenu
šećera (Slika 2.1.4.a). Veze dušičnih baza orijentirane na strani šećera čine sin konformaciju
(Slika 2.1.4.b).
(a) (b)
Slika 2.1.4. Konformeri deoksigvanidina: a) C2'-endo/anti i b) C3'-endo/sin.18
5
Molekule šećera su međusobno povezane dvjema fosfoesterskim vezama preko 5'O i
3'O atoma. Pri pH medija većem od 7 fosfati su dvostruko negativno nabijeni, a pri pH
manjem od 7 nose samo jedan negativan naboj.19 Dakle, okosnica nukleotida koju čine fosfati
i šećeri je negativno nabijena u fiziološkim uvjetima te je uvijek prisutna određena količina
kationa koji ju neutraliziraju.
Dušične baze su planarne aromatske heterocikličke molekule koje se dijele u dvije
skupine, purinske i pirimidinske, ovisno o molekuli čiji su derivati (Slika 2.1.5).20 Purinske
baze adenin (A) i gvanin (G) te pirimidinska baza citozin (C) grade i DNA i RNA, dok se
pirimidinska baza timin (T) nalazi samo u DNA, a RNA umjesto timina sadrži uracil (U).
Timin i uracil se razlikuju prema metilnoj skupini na C5 atomu prstena koja izostaje u
strukturi uracila.
Slika 2.1.5. Dušične baze u nukleinskim kiselinama.20
Dušična baza vezana sa šećerom čini nukleozid, dok nukleotid podrazumijeva da je na
šećer uz bazu vezana i jedna ili više fosfatnih skupina (Slika 2.1.6).18 Vezanjem većeg broja
nukleotida nastaje polinukleotid. U dvostrukoj uzvojnici smjer nukleotida u jednom lancu
suprotan je smjeru nukleotida u drugom lancu, odnosno lanci su antiparalelni. Asimetrični
završeci DNA nazivaju se 5' kraj i 3' kraj. Kada se na 5' kraju nalazi fosfatna skupina, a na 3'
kraju hidroksilna skupina, takav polinukleotid se naziva 5' nukleotid (Slika 2.1.6.c).
6
Slika 2.1.6. Strukture nukleozida: a) adenozina, rA, i b) deoksicitidina, dC, te nukleotida:
c) 5' nukleotida, pN, i d) 3' nukleotida, Np.18
U živim organizmima DNA se sastoji od dva polinukleotidna lanca koji se uvijaju
jedan oko drugoga i oko zajedničke osi u suprotnim smjerovima te stvaraju oblik dvostruke
uzvojnice.11 Fosfatna okosnica je zajedno s vezanim šećerima smještena s vanjske strane, dok
dušične baze leže unutar uzvojnice. Polarnija površina izložena je tako okolnom mediju
(vodi), dok su nepolarni dijelovi smješteni unutar uzvojnice.19,21 Dvostruka uzvojnica je
stabilna zbog vodikovih veza između komplementarnih dušičnih baza te aromatskog slaganja
baza. Interakcije koje nastaju uslijed vertikalnog privlačenja susjednih parova baza prilično su
slabe, no s obzirom na velik broj parova dušičnih baza u uzvojnici, značajno doprinose
stabilizaciji molekule DNA.
2.1.2.1. Sparivanje baza
Dva lanca polinukleotida povezana su međusobno vodikovim vezama između dušičnih
baza. Chargaffovo otkriće o jednakim omjerima adenina i timina te citozina i gvanina navelo
je Watsona i Cricka na ideju o međusobnom sparivanju purinskih i pirimidinskih baza
antiparalelnih lanaca. Opisani proces naziva se komplementarno sparivanje baza.11,22 Purinske
baze stvaraju vodikove veze s pirimidinskim bazama, točnije, adenin se komplementarno veže
s timinom, a gvanin s citozinom (Slika 2.1.7). Par baza adenin i timin povezan je dvjema
7
vodikovim vezama, dok su gvanin i citozin povezani trima vodikovim vezama. Kao rezultat
komplementarnog sparivanja sve informacije sadržane u slijedu dvostruke uzvojnice DNA su
duplicirane na svakom lancu, što je od velike važnosti u replikaciji DNA.
(a) (b)
Slika 2.1.7. Komplementarno sparivanje baza: a) adenin-timin i b) gvanin-citozin.22
Pri sparivanju baza ribonukleinske kiseline adenin se komplementarno sparuje s
uracilom dvjema vodikovim vezama.22
Pojedinačne baze u jednom lancu su planarne, no parovi baza, a shodno tome i baze
svakog para iz svakog lanca posjeduju određenu fleksibilnost. Ova fleksibilnost više ovisi o
okolini u kojoj se parovi baza nalaze, nego o samoj njihovoj prirodi.19
2.1.2.2. Utori
Neovisno o sastavu dušičnih baza, svaka dvostruka uzvojnica ima utore koji nastaju
uvijanjem antiparalelnih polinukleotidnih lanaca, a dijele se na veliki i mali utor (Slika 2.1.8).
Utori su nejednake veličine radi toga što glikozidne veze nisu dijametralno suprotne jedna
drugoj pa svaki par baza ima veću stranu koja definira veliki utor i manju stranu koja
predstavlja mali utor.19 U malom utoru se uvijek nalazi O2 atom pirimidinske baze te N3 atom
purinske baze koje čine par, dok su u velikom utoru smješteni heteroatomi suprotne strane
para. Metilna skupina timina nalazi se u velikom utoru.
U svakom utoru postoje mjesta za nastajanje vodikovih veza, koja uključuju bilo
vodikov atom vezan na elektronegativan atom bilo odgovarajući heteroatom. Zahvaljujući
upravo vodikovim vezama ostvaruju se specifične interakcije s molekulama koje se vežu u
utore nukleinske kiseline. Na Slici 2.1.8 crvene strelice upućuju na atome koji mogu
sudjelovati u vodikovoj vezi kao akceptori vodika, dok su plavim strelicama označene amino
8
skupine koje doniraju vodik pri stvaranju vodikovih veza. U malom utoru N3 atom adenina ili
gvanina i O2 atom timina ili citozina mogu djelovati kao akceptori vodika, dok amino skupina
vezana na C2 atom gvanina može donirati vodik. U velikom utoru N7 atom gvanina ili
adenina je potencijalni akceptor vodika, kao i O4 atom timina te O6 atom gvanina, dok se kao
donori vodika ponašaju amino skupine vezane na C6 atom adenina i C4 atom citozina.
(a) (b)
Slika 2.1.8. Utori nastali prilikom sparivanja a) adenina i timina te b) gvanina i citozina.
2.1.2.3. Strukture DNA
DNA se javlja u različitim strukturnim oblicima, od kojih su najvažniji A-DNA, B-
DNA te Z-DNA (Slika 2.1.9).
B-DNA je najučestaliji strukturni oblik u kojoj se DNA nalazi u stanicama živih bića.11
B-DNA je desna uzvojnica, čiji je glikozidni kut okosnice anti orijentacije, a šećer
deoksiriboza C2'-endo konformacije.18 U B-DNA su baze položene gotovo okomito na os
uzvojnice, međusobno su udaljene 3,4 Å i zakrenute jedna u odnosu na drugu za 36º. S
obzirom da se struktura uzvojnice ponavlja svakih 34 Å i puni okretaj iznosi 360º, zavojnica
sadrži 10 parova baza po okretaju. Promjer uzvojnice B-DNA iznosi 20 Å, a veliki utor je
širok i gotovo jednako dubok kao uži mali utor.
A-DNA je također desna uzvojnica, no šira i kraća od B-strukture.19 Razlike u
strukturnim značajkama A-DNA u odnosu na B-DNA proizlaze iz činjenice da je u A-DNA
šećer C3'-endo konformacije, za razliku od C2'-endo konformacije šećera u B-DNA.
9
Navedena konformacija šećera u A-DNA uzrokuje slaganje parova baza pod kutom od 19º u
odnosu na okomiti položaj prema okosnici. Veliki utor A-DNA je dubok i uzak, dok je mali
širok i vrlo plitak.
U strukturi Z-DNA fosfati u okosnici su naizmjence poredani, te je takva struktura
nestabilna i nastaje samo kratkotrajno tijekom procesa transkripcije.23 Z-DNA je lijeva
uzvojnica čiji je veliki utor dubok i uzak, a mali utor vrlo plitak. Konformacija šećera i
glikozidni torzijski kut ovise o dušičnoj bazi na koju su vezani. U slučaju gvanina kut ima syn
orijentaciju, a šećer C3'-endo konformaciju, dok je za ostale baze glikozidni kut anti
orijentacije, a šećer C2'-endo konformacije.
Slika 2.1.9. Strukture: a) A-DNA, b) B-DNA i c) Z-DNA.18
10
2.1.3. Funkcija nukleinskih kiselina
Glavna uloga molekule DNA je dugotrajno pohranjivanje informacija potrebnih za
sintezu pojedinih dijelova stanice, kao što su proteini i molekule RNA.16 Genetska informacija
u DNA je sačuvana u slijedu dušičnih baza duž lanca nukleinske kiseline. Parovi baza
omogućavaju kopiranje genetske informacije procesom replikacije postojeće nukleinske
kiseline pri čemu nastaje novi lanac DNA. Dijelovi molekule DNA koji nose genetske
informacije nazivaju se genima.24 Ostali dijelovi DNA imaju strukturnu ulogu ili su uključeni
u kontrolu sinteze RNA.
Eukariotski organizmi pohranjuju većinu svoje DNA u jezgri stanice, a manji dio u
staničnim organelama poput mitohondrija i kloroplasta. Za razliku od njih, prokarioti
pohranjuju svoju DNA isključivo u citoplazmi. Unutar stanice DNA je smještena u nitaste
strukture zvane kromosomi. U kromosomu se nalaze proteini poput histona koji zbijaju i
motaju molekulu DNA.25
Transkripcijom DNA u stanici dolazi do nastajanja jednolančane molekule RNA.16 U
stanici postoje četiri vrste RNA molekula koje imaju različite funkcije, a to su: ribosomska
RNA (eng. ribosomal RNA, rRNA), prijenosna RNA (eng. transfer RNA, tRNA), glasnička
RNA (eng. messenger RNA, mRNA) i male jezgrine RNA (eng. small nuclear RNA, snRNA).
Najbrojnija je rRNA, koja čini oko 80 % ukupne RNA u stanici. Sastavni je dio ribosoma, te
čini glavnu komponentu na kojoj se odvija proces sinteze proteina (translacija). Oko 15 %
ukupne RNA čini tRNA. Ona sudjeluje u prijenosu aktiviranih aminokiselina do ribosoma
gdje dolazi do sinteze proteina. mRNA čini tek oko 5 % ukupne RNA, a služi kao kalup za
sintezu proteina u procesu translacije. U snRNA ubrajaju se male RNA molekule koje se
nalaze u jezgri. Imaju ulogu u nizu važnih procesa, kao što su procesiranje mRNA i
održavanje krajeva kromosoma (telomera).
11
2.2. Male organske molekule kao antitumorski lijekovi
U svrhu razumijevanja načina na koji djeluju lijekovi i njihovog utjecaja na strukturu i
funkciju nukleinske kiseline, istraživanja interakcija malih aktivnih molekula i DNA sve su
intenzivnija. Pri otkrivanju načina vezanja i utvrđivanju selektivnosti malih molekula, koriste
se oligo i polinukleotidi kontrolirane strukture i poznatog slijeda dušičnih baza.
2.2.1. Vezanje antitumorskih molekula i DNA
Biološki aktivne tvari koje se koriste kao antitumorski lijekovi mogu djelovati na
DNA na tri različita načina.3 Prvi način je interakcijom s proteinima, kao što su transkripcijski
faktori i polimeraze, koji se vežu s DNA.26 Drugi način je vezanjem s ribonukleinskom
kiselinom, nakon čega se nastali kompleks veže s DNA, te nastali hibrid DNA-RNA ometa
proces transkripcije.27 Treći način je neposrednim vezanjem kao ligandi u dvostruku
uzvojnicu DNA. Male molekule koje se vežu poput liganada s DNA dijele se u nekoliko
skupina, ovisno o mjestu i načinu vezanja te svojoj strukturi.3 Prema tome postoje molekule
koje se vežu u utore,28 molekule koje se umeću između parova baza (interkalatori),29 molekule
koje se kovalentno vežu s DNA30 i molekule čije vezanje uzrokuje kidanje lanca DNA.2
Molekule koje sadrže metal u strukturi zasebna su skupina spojeva, a s DNA mogu ostvarivati
i kovalentne i nekovalentne interakcije.31 Interkaliranje i vezanje u utore načini su povratnog
vezanja malih molekula, dok se nastajanjem kovalentnih veza molekule nepovratno vežu s
DNA.
2.2.1.1. Interkalatori
Interkaliranje kao način vezanja malih molekula s DNA prvi je predložio L. Lerman
1961. godine istražujući derivate akridina.32 Klasični interkalatori su molekule koje sadrže
nezasićene aromatske prstenove.33 Tipični primjeri interkalatora su akridinske soli, poput
proflavin klorida, te fenantridinski spojevi, kao što su etidijev bromid i propidijev jodid (Slika
2.2.1).
12
(a) (b) (c)
Slika 2.2.1. Molekulske strukture interkalatora: a) proflavin klorida, b) etidijevog bromida i c)
propidijevog jodida.33
Planarni aromatski sustavi umeću se između parova baza i pri tome ne ometaju
vodikove veze između komplementarnih dušičnih baza. Interkaliranje se zbiva po principu
isključenja najbližeg susjeda, prema kojem i pri suvišku liganda svako drugo potencijalno
mjesto za interkaliranje u zavojnici ostaje prazno. Princip isključenja najbližeg susjeda može
se ilustrirati na primjeru interkalatora diterkalina.34 Iako je poveznica između dva dijela
molekule diterkalina koji se interkaliraju u DNA dovoljno fleksibilna da omogućava umetanje
planarnih dijelova između susjednih parova baza, vezanje jednog aromatskog sustava
isključuje mogućnost vezanja drugog aromatskog sustava na susjedno mjesto (Slika 2.2.2).
Slika 2.2.2. a) Struktura diterkalina. b) Vezanje diterkalina u DNA fragment d(CGCG)2.33
13
(a) (b)
Interkalatori se približavaju mjestu vezanja u dvostrukoj uzvojnici kroz utore.
Dvostruko interkaliranje diterkalina zbiva se kroz veliki utor, dok se ranije navedeni spojevi
(proflavin klorid, etidijev bromid, propidijev jodid) interkaliraju kroz mali utor DNA.
Interkaliranje se smatra posljedicom aromatskog slaganja molekula s dušičnim bazama
molekule DNA. Stabilnost kompleksa se povećava kada je aromatski interkalator pozitivno
nabijen. Osim aromatskih i elektrostatskih interakcija, vodikove veze te prijenos naboja
također zadržavaju interkalator na veznom mjestu.35 Interakcije aromatskog slaganja baza
uzrokuju batokromne pomake u elektronskim apsorpcijskim spektrima kompleksa navedenih
interkalatora s DNA.36
Interkaliranje karakterizira mala selektivnost prema različitim sljedovima dušičnih
baza. Međutim, poznato je da se interkalatori radije vežu u YpR nego RpY, pri čemu je Y
pirimidinska baza, a R purinska baza, radi lakše dostupnog veznog mjesta.37 Vezanje
pojedinih interkalatora u DNA uzrokuje strukturne promjene uzvojnice, pri čemu se mijenja
konformacija šećera deoksiriboze iz C2'-endo u C3'-endo, a struktura DNA iz B u A.38
Interkaliranjem molekula produljuje se lanac DNA i mijenjaju kiralna svojstva.39
Osim navedenih strukturno jednostavnih interkalatora, poznati su i spojevi složenije
strukture koji se također interkaliraju između parova baza, ali se zbog veličine i oblika neki
dijelovi molekule smještaju i u utore.40
Interkalatori se većinom koriste kao antivirusni lijekovi i antibiotici,41 no neki od njih
imaju i antitumorska svojstva.42
2.2.1.2. Molekule koje se vežu u utor
Prirodni i sintetski spojevi koji se vežu u mali utor DNA tema su brojnih istraživanja
interakcija malih molekula s DNA s obzirom na njihovu biološku aktivnost i potencijalna
antitumorska svojstva. Na temelju svog kemijskog sastava molekule koje se vežu u utore
dijele se u nekoliko skupina.43 Tako se razlikuju polipiroli, čiji su najznačajniji predstavnici
distamicin A i netropsin, zatim bis(benzimidazoli) koje predstavlja Hoechst 33258,
bis(fenilamidini) u koje se ubrajaju berenil i DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) te mnogi
drugi.
Spoznajama o načinu djelovanja tvari koje ostvaruju interakcije s DNA vezanjem u
mali utor najviše su doprinijela istraživanja polipirolnih antibiotika distamicina A i netropsina
(Slika 2.2.3).44
14
(a) (b)
Slika 2.2.3. Molekulske strukture a) netropsina i b) distamicina A.44
Netropsin je izoliran iz bakterije Streptomyces netropsis i dokazano posjeduje
antivirusno i antitumorsko djelovanje. Sastoji se od niza pirolnih jedinica povezanih amidnim
vezama koje završavaju s jednim ili više pozitivno nabijenih dušikovih atoma. Distamicin je
tri-N-metilpirolni analog netropsina izoliran iz bakterije Streptomyces distamyces.
Veliki broj molekula koje se vežu u utore preferira dijelove DNA bogate AT
sljedovima.45 Uz netropsin i distamicin, u tu skupinu ubrajaju se i Hoechst 33258, DAPI te
mnogi drugi. Sve navedene molekule imaju sličnu strukturu, aromatske prstenove koji čine
zakrivljen središnji dio molekule te pozitivno nabijene skupine i donore vodika na
konveksnom kraju. Zahvaljujući upravo svom zakrivljenom obliku koji odgovara strukturi
dvostruke uzvojnice DNA, ovi spojevi mogu stvarati interakcije s malim utorom B-DNA.
Radi navedenog se distamicin A, netropsin i njihovi derivati nazivaju molekulama koje se
vežu na temelju selektivnosti prema obliku.46 Duboki i uski mali utor adenin-timin parova
baza, bez ometajuće amino skupine gvanina, osigurava idealne uvjete za vezanje molekule i
maksimalnu stabilizaciju van der Waalsovim silama, kao i nizom drugih tipova interakcija
poput hidrofobnih efekata i sl. Vodikove veze između DNA baza u utoru i niza H-donorskih i
H-akceptorskih skupina malih molekula (npr. amidnih, heterocikličnih atoma itd.) te
elektrostatske interakcije fosfatnih skupina okosnice s pozitivno nabijenim skupinama
(protoniranim alifatskim aminima, gvanidinijevim ili amidinijevim derivatima i sl.) dodatno
doprinose stabilizaciji kompleksa ligand-DNA i značajno utječu na selektivnost male
molekule prema određenim sljedovima nukleobaza.
Tako na primjer, ovisno o slijedu baza u DNA, stehiometrija vezanja distamicin:DNA
može biti 1:1 ili 2:1. Primjerice, distamicin će se vezati u omjeru 1:1 ako se u malom utoru
nalaze četiri para baza AT. Kada je u utoru smješteno pet parova baza AT ili četiri para baza
AT i jedan par baza GC, dvije molekule distamicina s nabijenim skupinama na suprotnim
15
stranama smjestit će se u isti utor.47 S obzirom da svaki od tri pirolna prstena tvori
nekovalentne interakcije jednim parom baza, a tako i svaki supstituent na krajevima molekule,
logično je očekivati da će kompleks 2:1 nastajati samo onda kada se slijed sastoji od pet ili
više AT parova baza (Slika 2.2.4).
Slika 2.2.4. Shema vezanja distamicina u mali utor DNA.45
Dvije molekule netropsina ne mogu se paralelno orijentirati jedna u odnosu na drugu
zbog elektrostatskog odbijanja pozitivno nabijenih krajeva molekule. Iz tog se razloga
netropsin veže s DNA samo u omjeru 1:1 (ref. 47). Isto vrijedi za sve molekule koje imaju
pozitivan naboj na oba kraja molekule (primjerice DAPI). Dakle, vodikove veze, van der
Waalsove sile i elektrostatske interakcije između oligopeptidnih pirolkarbamidnih struktura
koje završavaju amidino skupinama i dvostruke uzvojnice omogućavaju vezanje u područja
DNA bogata adenin-timin parovima baza.43 Analozi distamicina koji sadrže više pirolnih
jedinica u strukturi specifični su za duže AT slijedove zbog većeg broja vodikovih veza i van
der Waalsovih sila.48
Iako u svojoj strukturi ne sadrži pirolne prstenove, Hoechst 33258 također se
selektivno veže u mali utor DNA kojeg čine adenin-timin parovi baza (Slika 2.2.5). Pri tome
se planarne benzimidazolne skupine orijentiraju paralelno smjeru utora, a svaki dušikov atom
sudjeluje u vodikovim vezama s AT parovima baza, slično vezanju netropsina.49
16
Slika 2.2.5. Molekulska struktura Hoechsta 33258.44
Stehiometrija vezanja Hoechsta 33258 s DNA također je ovisna o slijedu parova baza i
može biti 1:1 i 2:1, ali se vezanje molekula ostvaruje na drugačiji način nego u slučaju
distamicina. Pri omjeru Hoechst 33258:DNA 2:1 dvije molekule liganda smještaju se svaka u
svoj utor, a okrenute su jedna prema drugoj N-metilpiperizinskim skupinama (Slika 2.2.6).50
Slika 2.2.6. Vezanje Hoechsta 33258 s DNA u omjeru 2:1.50
DAPI je primjer molekule koja se zahvaljujući svojoj strukturi i veličini, a ovisno o
slijedu parova baza, veže na različite načine s DNA (Slika 2.2.7).
Slika 2.2.7. Struktura molekule DAPI.45
17
Postojeći aromatski sustav u strukturi omogućava torziju molekule u konformaciju koja
nalikuje spiralnom okretaju DNA utora. Utvrđeno je da način interakcije spoja DAPI s DNA
ovisi o slijedu parova baza. Dakle, DAPI se veže u mali utor kada se u njemu nalaze tri ili više
uzastopnih AT parova baza, dok se pri manjem broju parova baza AT u utoru te u gotovo
čistom slijedu GC parova baza DAPI interkalira u DNA.51 Iz navedenih primjera vidljivo je da
molekule koje se vežu u utore polinukleotida pokazuju izrazitu selektivnost prema određenim
sljedovima parova dušičnih baza, za razliku od interkalatora.52 Stoga se takve molekule
koriste pri prepoznavanju sljedova parova baza u polinukleotidima.45,53
2.2.1.3. Molekule s metalom u strukturi
Kompleksi metala mogu stvarati interakcije s dvostrukom uzvojnicom DNA na dva
načina: kovalentno i nekovalentno.54 Interkaliranje uključuje nekovalentne interakcije i jedan
je od najčešćih načina vezanja ovih molekula. Na interkaliranje kompleksa metala utječu
planarnost liganda i geometrija koordinacije te vrsta atoma donora u ligandu i metala koji je
koordiniran.55 Smatra se da biološka aktivnost kompleksa metala koji imaju antitumorsko
djelovanje isključivo ovisi o njihovoj sposobnosti da se vežu s DNA, oštete dvostruku
uzvojnicu i na taj način ometaju njezinu funkciju.56 S obzirom da interkalatori većinom nisu
selektivni prema sljedovima parova baza, istraživanja su usmjerena na sintezu molekula koje
sadrže metalni ion u strukturi, a vežu se u utore DNA, čime se povećava selektivnost prema
određenom slijedu dušičnih baza u polinukleotidima.
Iako se cisplatin (cis-Pt(NH3)2Cl2) i karboplatin ubrajaju među najuspješnije
antitumorske lijekove u povijesti kemoterapija,57 izazivaju nuspojave, nisu specifični i
toksični su prema zdravim stanicama.58 Iz tog razloga proučavaju se brojni kompleksi
različitih metala koji bi trebali uzrokovati manje nepoželjnih popratnih pojava, a imati širi
spektar antitumorskog djelovanja. Uz komplekse platine,59 istražuju se i koordinacijski spojevi
rodija,60 rutenija,61 kadmija,54 bakra,54 cinka62 i drugih metala, a sve u svrhu pronalaska
aktivnijeg i selektivnijeg antitumorskog lijeka.
18
2.2.2. Poliamini kao antitumorski lijekovi
Male molekule koje vrlo lako ostvaruju interakcije s DNA najčešće su poliamini po
svom kemijskom sastavu. Biogene poliamine sintetiziraju žive stanice. To su linearne
molekule male molekulske mase koje su u fiziološkim uvjetima pozitivno nabijene.63
Poliamini, poput putrescina, spermidina i spermina, koji potječu od arginina i ornitina,
metabolički su regulatori proliferacije i diferencijacije stanice (Slika 2.2.8.ac). Među biogene
poliamine ubraja se i histamin (Slika 2.2.8.d). Interakcijom sa specifičnim receptorima
stanične membrane histamin sudjeluje u brojnim biološkim procesima.64
(a)
(b)
(c)
(d)
Slika 2.2.8. Molekulske strukture a) putrescina, b) spermidina, c) spermina i d) histamina.63,64
Na izravnim interakcijama poliamina i nukleinskih kiselina temelje se pojedine
biološke funkcije poliamina.65 Vezane poliaminske molekule stabiliziraju konformaciju DNA
i na taj način ju štite od pucanja lanca uslijed djelovanja vanjskih čimbenika.66 Međutim,
priroda vezanja poliamina i nukleinskih kiselina još uvijek nije sasvim poznata.67 Smatra se da
se poliaminske molekule vežu elektrostatskim interakcijma s DNA/RNA analozima, no
djeluju i na mnoge različite načine na nukleinske kiseline.68
Tumorske stanice koriste biogene poliamine u puno većim količinama nego što to čine
zdrave stanice,69 što čini poliamine dobrim kandidatima za sintezu novih antitumorskih
19
lijekova ili za poboljšanje aktivnosti postojećih antitumorskih lijekova.70 Iz tog se razloga sve
intenzivnije istražuju načini i specifična mjesta vezanja biogenih poliamina s DNA i RNA
polinukleotidima.71
Jedan od najvećih nedostataka antitumorskih terapija je djelovanje citotoksičnih
lijekova na zdrave stanice. Stoga je potrebno antitumorske lijekove učiniti selektivnima.
Selektivnost se postiže modifikacijom osnovne molekule koja pokazuje antitumorska
svojstva, primjerice uvođenjem alifatskog supstituenta u aromatsku strukturu već poznatih
interkalatora72 ili sintezom spojeva strukturno vrlo sličnih spojevima poznatog antitumorskog
djelovanja.73
2.2.3. Metode istraživanja interakcija malih molekula s polinukleotidima
Pri istraživanju interakcija malih organskih molekula i nukleinskih kiselina
primjenjuju se različite analitičke metode.3 Najčešće se koriste metode optičke spektroskopije
(apsorpcijska i fluorescencijska spektroskopija, spektroskopija linearnog i cirkularnog
dikroizma), spektroskopija nuklearne magnetske rezonancije, metode vibracijske
spektroskopije (infracrvena i Ramanova spektroskopija), spektrometrija masa te kapilarna
elektroforeza, gel elektroforeza, viskozimetrija, difrakcija kristala x-zrakama, SPR i niz
drugih metoda.74
Spektrofotometrijskim metodama određuje se konstanta stabilnosti kompleksa nastalih
vezanjem malih organskih molekula s polinukleotidima.75 S obzirom da su promjene u
apsorpcijskim spektrima molekula, poput batokromnog efekta i hipokromnog pomaka,
posljedica interkaliranja molekula u uzvojnicu DNA, primjenom UV/VIS apsorpcijske
spektroskopije može se utvrditi način vezanja molekule. Nadalje, na temelju vrpci koje se
opažaju u spektrima linearnog i cirkularnog dikroizma kompleksa malih molekula s
nukleinskim kiselinama, mogu se razlikovati interkalatori od molekula koje se vežu u utore.
Ovim metodama, međutim, ne može se odrediti točno vezno mjesto u DNA.76
Iako se i spektrometrijom masa mogu razlikovati načini vezanja malih molekula s
polinukleotidima, informacije o točnom mjestu vezanja malih molekula i strukturi kompleksa
nastalog vezanjem molekule s DNA izostaju.77
Spektroskopijom nuklearne magnetske rezonancije mogu se identificirati molekule
vrlo slabo vezane s DNA, s obzirom da interakcija s elektromagnetskim zračenjem ne
20
uzrokuje kidanje niti najslabijih veza. Ovom metodom može se odrediti točan slijed baza u
veznom mjestu DNA.51
Pri istraživanju sljedova polinukleotida na koje se preferirano vežu male molekule,
bilo da se interkaliraju u polinukleotidnu uzvojnicu ili se vežu u utore, često se koristi i
kapilarna elektroforeza.78
Iako metode vibracijske spektroskopije omogućavaju uvid u molekulsku strukturu
antitumorskih spojeva,79,80 primjena infracrvene (IR) i Ramanove spektroskopije pri
proučavanju interakcija malih molekula i polinukleotida prilično je ograničena. Voda jako
apsorbira infracrveno zračenje i tako čini IR spektroskopiju nepogodnom za istraživanje
sustava u vodenom mediju, dok Ramanovu spektroskopiju, osim zahtjeva za visokom
koncentracijom analita, otežava i fluorescencija molekula.81 S obzirom da se istraživanja
vezanja potencijalnih antitumorskih lijekova s DNA provode u biološkim uvjetima, a voda
slabo raspršuje zračenje, osjetljiva i selektivna metoda koja se temelji na Ramanovom
raspršenju nalazi svoju primjenu. Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog
raspršenja raspršeno zračenje pojačava se i do milijun puta u odnosu na normalno Ramanovo
raspršenje i gasi se fluorescencija, što omogućava istraživanja strukture molekula pri niskim
koncentracijama u vodenim otopinama.4 SERS spektroskopija nameće se stoga kao vrlo
atraktivna metoda pri istraživanju prepoznavanja i vezanja biomolekula.
21
2.3. Površinski pojačano Ramanovo raspršenje
2.3.1. Ramanova spektroskopija
Ramanova spektroskopija je metoda vibracijske spektroskopije koja se primjenjuje pri
istraživanju strukture molekula.81 Razvoj Ramanove spektroskopije započinje 1923. godine
kada je A. Smekal opisao fenomen neelastičnog raspršenja zračenja. Njegovu teoriju su C. V.
Raman i K. S. Krishnan 1928. godine i eksperimentalno dokazali. Izveli su pokus u kojem su
teleskopom na tekući uzorak fokusirali sunčevu svjetlost, a raspršeno zračenje sakupljali
drugom lećom, smještenom u blizini uzorka. Sustavom optičkih filtera utvrdili su da se
frekvencija raspršenog zračenja razlikuje od frekvencije upadnog zračenja.
Djelovanjem elektromagnetskog zračenja tvar može apsorbirati zračenje, reflektirati,
raspršiti ga ili zračenje može proći kroz uzorak bez interakcije.82 U IR spektroskopiji energija
upadnog infracrvenog zračenja mora odgovarati razlici energije dvaju vibracijskih stanja da bi
molekula apsorbirala fotone i prešla iz osnovnog u više vibracijsko stanje. Nakon prolaska
zračenja kroz uzorak detektira se smanjenje intenziteta upadnog zračenja. Za razliku od IR
spektroskopije, Ramanova spektroskopija koristi pobudno zračenje samo jedne frekvencije, a
detektira se raspršeno zračenje čija se energija razlikuje od energije pobudnog zračenja.
Prilikom raspršenja zračenja nije nužno da upadni fotoni imaju energiju koja odgovara razlici
između dva vibracijska stanja molekule. Stoga izvori zračenja koji se koriste u Ramanovoj
spektroskopiji mogu emitirati zračenje ultraljubičastog (UV), vidljivog (VIS) ili bliskog
infracrvenog (NIR) područja.83,84
Interakcija elektromagnetskog vala s molekulom može uzrokovati distorziju
elektronskog oblaka oko jezgre, pri čemu elektroni prelaze u više energijsko stanje.82 Nastalo
energijsko stanje ne odgovara niti jednom stvarnom elektronskom stanju molekule, i budući
da je nestabilno, zračenje se vrlo brzo otpušta u obliku raspršenog zračenja Takvo
kratkoživuće stanje molekule često se naziva virtualno stanje.85 Distorzija elektronskog oblaka
ovisi o količini energije prenesene na molekulu, a energija virtualnog stanja o energiji
pobudnog zračenja, odnosno frekvenciji lasera.
Poznata su dva načina raspršenja zračenja: Rayleighovo i Ramanovo raspršenje.82
Najintenzivnije raspršenje je Rayleighovo raspršenje. Ono se zbiva prilikom interakcije
upadnog zračenja i elektronskog oblaka pri kojoj se jezgre atoma ne pomiču. To je elastični
proces tijekom kojeg nema značajnijeg prijenosa energije, dakle raspršeni fotoni su iste
energije kao i upadni fotoni. U odnosu na Rayleighovo raspršenje, Ramanovo raspršenje
22
rijetko se događa, s obzirom da se samo jedan od 106–108 upadnih fotona neelastično rasprši.
Ono se zbiva kada se interakcijom upadnog zračenja s oblakom elektrona potakne i gibanje
jezgara. S obzirom da jezgre atoma imaju znatno veću masu od elektrona, energija raspršenog
zračenja značajno se mijenja. Ovisno o tome da li se interakcija zračenja i molekule događa
kada se ona nalazi u osnovnom ili pobuđenom vibracijskom stanju, razlikuju se dvije vrste
Ramanovog raspršenja.86 Pri sobnoj temperaturi većina molekula nalazi se u osnovnom
vibracijskom stanju. Interakcijom s upadnim zračenjem prelaze u virtualno stanje, u kojem se
vrlo kratko zadržavaju, te se vraćaju u pobuđeno vibracijsko stanje. Pri povratku u pobuđeno
vibracijsko stanje raspršuju zračenje manje energije, odnosno veće valne duljine od upadnog
zračenja. Opisano raspršenje naziva se Stokesovo raspršenje koje se uobičajeno mjeri u
Ramanovoj spektroskopiji. Manji broj molekula, međutim, nalazi se u pobuđenom
vibracijskom stanju, i one se, nakon pobude u virtualno stanje, vraćaju u osnovno vibracijsko
stanje. Raspršeni fotoni u tom slučaju imaju veću energiju, odnosno manju valnu duljinu od
upadnih fotona, a opisano Ramanovo raspršenje naziva se anti-Stokesovo raspršenje. I
Stokesov i anti-Stokesov spektar sadrže iste informacije o energijama vibracija.
Procesi elastičnog i neelastičnog raspršenja mogu se promatrati i objasniti s klasičnog i
kvantno-mehaničkog stajališta.81,86 Prema klasičnoj teoriji, upadno zračenje deformira
elektronski oblak pri čemu se inducira električni dipolni moment. Mjera fleksibilnosti
elektronskog oblaka oko jezgre, odnosno lakoće kojom se elektronski oblak može polarizirati
pod utjecajem vanjskog električnog polja naziva se polarizabilnost. Polarizabilnost molekule
povezana je s induciranim dipolnim momentom prema izrazu (2.3.1)
µ = αE (2.3.1)
gdje μ označava inducirani dipolni moment, α polarizabilnost, a E jakost električnog polja.
Električno polje ovisi o frekvenciji upadnog zračenja prema (2.3.2)
E = E0cos(2πc~νt ) (2.3.2)
gdje je E0 jakost električnog polja upadnog zračenja, c brzina svjetlosti (u vakuumu, c = c0 =
2,99792458 × 108 m s1), ~ν valni broj upadnog zračenja, a t vrijeme.
23
Polarizabilnost α se mijenja s vibracijskim gibanjem prema izrazu (2.3.3)
α = α0 + βcos(2πc~νkt) (2.3.3)
gdje je α0 polarizabilnost u ravnotežnom položaju, a β je jednaka [∂α/∂qk]0. qk je normalna
koordinata gibanja koja odgovara određenom vibracijskom gibanju k.
Uvrštavanjem izraza (2.3.2) i (2.3.3) u izraz (2.3.1) slijedi jednadžba koja prikazuje
kako inducirani dipolni moment određene vibracije ovisi o vremenu.
μ = α0E0cos(2πc~νt) + 12 ( ∂ α∂ qk )0E0 × [cos2πc(~ν+ ~νk)t + cos2πc(~ν– ~νk)t]
(2.3.4)
Tri različite kosinus funkcije u izrazu (2.3.4) ukazuju da inducirani dipol oscilira simultano s
tri različite frekvencije što rezultira zračenjem energije valnih brojeva ~ν0 te ~ν0±~νk. Dakle, za
određenu vibraciju Rayleighovo raspršenje javlja se pri valnom broju ~ν0, Stokesovo
raspršenje pri ~ν0–~νk, a anti-Stokesovo raspršenje pri ~ν0+~νk. Derivacija polarizabilnosti po
koordinati vibracije (2.3.5) pokazuje osjetljivost polarizabilnosti molekule na promjene
nuklearne konfiguracije u smjeru normalne koordinate vibracije, što znači da je vibracija
aktivna u Ramanovom spektru ukoliko je barem jedna komponenta polarizabilnosti različita
od nule.
( ∂ α ij
∂ qk)0 ≠ 0 (2.3.5)
Prema osnovnim principima kvantne mehanike, sva energijska stanja molekule,
elektronska, vibracijska i rotacijska, su kvantizirana. To znači da će molekula prijeći iz jednog
energijskog stanja u drugo onda kada energija elektromagnetskog zračenja koje molekula
apsorbira ili emitira odgovara razlici energije dvaju energijskih stanja. Energija je
proporcionalna frekvenciji, odnosno valnoj duljini zračenja prema izrazu (2.3.6)
ΔE = hν = hcλ = hc~ν (2.3.6)
24
gdje je ΔE razlika energije između dva energijska stanja, h Planckova konstanta (h = 6,62608
× 10–34 J s), valna duljina, a ν frekvencija elektromagnetskog zračenja.
Prilikom Rayleighovog i Ramanovog raspršenja događaju se dva gotovo simultana
procesa preko virtualnog stanja u kojima sudjeluju dva fotona (Slika 2.3.1). Jedan foton
upadnog zračenja nestaje, dok drugi foton nastaje, bilo jednake frekvencije upadnom fotonu
(Rayleighovo raspršenje) ili različite frekvencije od upadnog fotona (Ramanovo raspršenje).
Raspršeni fotoni energije manje od energije upadnih fotona čine Stokesovo raspršenje, dok
raspršeni fotoni veće energije od upadnih čine anti-Stokesovo raspršenje.
Slika 2.3.1. Procesi apsorpcije te raspršenja infracrvenog zračenja.82
Dakle, energija Stokesovog raspršenja, ΔES, opisana je izrazom (2.3.7), dok je energija anti-
Stokesovog zračenja, ΔEaS, definirana izrazom (2.3.8).
ΔES = hc(~ν0−~νk) (2.3.7)
ΔEaS = hc(~ν0+ ~νk) (2.3.8)
Ramanov spektar prikazuje ovisnost Ramanovog intenziteta o valnom broju, odnosno
razlici valnih brojeva upadnog i raspršenog fotona (Slika 2.3.2).81 Na apscisi Ramanovog
spektra uobičajeno se ipak navode razlike valnih brojeva, a ne apsolutne vrijednosti valnih
25
brojeva jer se na taj način mogu međusobno uspoređivati spektri, neovisno o frekvenciji
pobudnog zračenja. S obzirom da je većina molekula pri sobnoj temperaturi u osnovnom
stanju, najčešće se analizira samo Stokesov spektar. U slučaju prekrivanja Stokesovog spektra
fluorescencijom uzorka izazvanom pobudnim zračenjem u vidljivom području preferira se
anti-Stokesov spektar.
Slika 2.3.2. Ramanov spektar kumarina.81
Infracrvena i Ramanova spektroskopija su metode vibracijske spektroskopije koje se
međusobno nadopunjuju. Vrpce odgovarajućih vibracija intenzivne u Ramanovom spektru
slabog su intenziteta u IR spektru i obrnuto. S obzirom da se Ramanovo raspršenje događa
uslijed vibracija koje mijenjaju polarizabilnost molekule, najveće raspršenje zračenja
uzrokuju simetrične vibracije funkcionalnih skupina bogatih elektronima, a vrpce koje im
odgovaraju najintenzivnije su u spektru. Za molekule koje imaju centar simetrije vrijedi
dodatno izborno pravilo, pravilo međusobnog isključenja, prema kojem niti jedna vibracija
istovremeno ne može biti i IR aktivna i Raman aktivna.
Najveći nedostaci Ramanove spektroskopije su slaba osjetljivost, posebice pri analizi
otopina, te interferencije uzrokovane fluorescencijom obojanih uzoraka.87 Iz tog se razloga
razvijaju tehnike koje bi umanjile navedene nedostatke, a jedna od takvih je spektroskopija
površinski pojačanog Ramanovog raspršenja.
26
2.3.2. Spektroskopija površinski pojačanog Ramanovog raspršenja
Spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja opaža se raspršenje
molekula adsorbiranih na hrapavu površinu metala.85 U odnosu na klasičnu Ramanovu
spektroskopiju intenzitet raspršenog zračenja povećava se 104 do 106 puta, a u nekim
sustavima čak 108 pa sve do 1014 puta.88 Na pojačanje Ramanovog raspršenja utječu različiti
parametri: karakteristike pobudnog zračenja (frekvencija, snaga), značajke metalnog
supstrata, struktura i svojstva analita te način adsorpcije analita na površinu metala.89
2.3.2.1. Otkriće
Površinski pojačano Ramanovo raspršenje otkrio je M. Fleischmann sa suradnicima
1974. godine.90 Zapazili su intenzivno Ramanovo raspršenje piridina adsorbiranog iz vodene
otopine na srebrovu elektrodu. Elektrodu su prethodno učinili hrapavom nizom oksidacijsko-
redukcijskih procesa. Autori su pojačanje raspršenog zračenja pripisali povećanju površine
srebrove elektrode uslijed hrapavosti, na koju se adsorbirao veći broj molekula piridina. No,
dvije grupe znanstvenika, D. L. Jeanmarie i R. P. Van Duyne91 te M. G. Albrecht i J. A.
Creighton,92 su neovisno jedni o drugima dokazali da bi samo povećanje površine srebra
uzrokovalo pojačanje raspršenja 10 puta, dok je faktor pojačanja raspršenja piridina bio 106 u
odnosu na klasično Ramanovo raspršenje piridina u otopini. Dakle, povećanje površine metala
nije bio uzrok drastičnom pojačanju raspršenog zračenja, već se radilo o efektu poznatom kao
površinsko pojačanje raspršenja.
2.3.2.2. Metalni supstrati
Površinsko raspršenje opaža se primarno za molekule adsorbirane na površini metala
koji apsorbiraju zračenje u vidljivom području elektromagnetskog spektra.93 S obzirom na
učinkovitost, metalni supstrati najčešće se pripravljaju od srebra94 i zlata,95 dok površine
drugih metala, poput bakra, željeza, litija, natrija, platine i paladija također pojačavaju
raspršeno zračenje, ali manje efikasno.96 Primjerice, reaktivnost željeza i bakra rezultira
nastankom slojeva oksida na površini metala, čime se mijenja priroda metalne površine i gubi
27
hrapavost. Nastali sloj oksida također predstavlja prostornu barijeru koja ometa približavanje
analita metalnoj površini i uzrokuje smanjenje intenziteta ili potpuni izostanak raspršenog
zračenja.97
Kao aktivne površine u SERS spektroskopiji s kojih se opaža pojačanje raspršenog
zračenja najčešće se koriste metalne elektrode98, nanočestice metala u koloidnim
suspenzijama99, metalne nanočestice na čvrstim podlogama100 te metalni filmovi101 (Slika
2.3.3). Značajke idealnih SERS supstrata i aktivnih površina su visoka SERS aktivnost koja
omogućava visoku osjetljivost, homogena raspodjela čestica koja osigurava jednoliko
pojačanje uz što manja odstupanja, dobra stabilnost i reproducibilnost te čistoća. 102 Naime,
nečistoće odnosno tvari koje zaostaju nakon priprave metalnog supstrata, mogu rezultirati
vrpcama u spektru mjernog uzorka i otežati interpretaciju spektra. Nažalost, još uvijek ne
postoji supstrat koji zadovoljava sve navedene uvjete pa se ovisno o vrsti analize primjenjuju
suspstrati odgovarajućih svojstava. Primjerice, u kvantitativnoj analizi reproducibilnost
suspstrata veoma je važna, dok je pri detekciji molekula u tragovima najvažnija SERS
aktivnost odnosno sposobnost pojačanja raspršenja.102
Uspješna primjena metalnih nanočestica kao supstrata u SERS spektroskopiji ovisi o
njihovim svojstvima, poput oblika i veličine te stupnju agregacije, ali i o samoj prirodi
metala.103 Koloidne nanočestice najčešće se primjenjuju kao supstrati u SERS istraživanjima
zbog financijski povoljne i jednostavne priprave. Redukcijom soli metala s nekim od spojeva,
poput natrijevog citrata,104 natrijevog borhidrida105 ili EDTA106 pripravljaju se koloidne
suspenzije koje sadrže čestice različitih veličina. Dodatkom elektrolita, poput natrijevog
klorida ili natrijevog nitrata, u koloidnu suspenziju SERS intenzitet se pojačava.107 Elektrolit
smanjuje elektrostatsku barijeru koja sprječava adsorpciju analita na koloidne čestice te
uzrokuje agregaciju čestica, što u oba slučaja rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja s
metalne površine.108
28
Slika 2.3.3. TEM mikrografi: a) nanočestica srebra, b) nanočestica zlata, c) nanoštapića zlata,
d) nanopločica zlata.107
2.3.2.3. Teorije površinskog pojačanja Ramanovog raspršenja
Teorije koje objašnjavaju pojačanje raspršenog zračenja s metalne površine predlažu
dva mehanizma uslijed kojih se taj efekt događa. Jedan je elektromagnetski mehanizam i
prema njemu pojačanje potječe od interakcije analita i površinskih plazmona, pri čemu je
analit adsorbiran na površinu metala ili se nalazi vrlo blizu metalne površine.109 Drugi je
kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja, prema kojem se analit kemijski veže na
metalnu površinu i tako omogućava prijenos elektrona s metala na analit i obrnuto.110
2.3.2.3.1. Elektromagnetski mehanizam
U elektromagnetskom mehanizmu glavnu ulogu imaju površinski plazmoni. Površina
metala prekrivena je elektronima. Elektrone na površini čine vodljivi elektroni koje u rešetci
29
zadržavaju privlačne sile s pozitivno nabijenim centrima metala.111 Elektroni se mogu
relativno slobodno gibati uzduž površine, stvarajući elektronski oblak koji se proteže na
određenoj udaljenosti od površine. Interakcijom električnog polja upadnog zračenja i
elektronskog oblaka na površini metala slobodni elektroni se polariziraju te se inducira dipol
metalne čestice (Slika 2.3.4).
Slika 2.3.4. Shematski prikaz površinskih plazmona metalne sfere s naznačenim pomakom
elektronskog oblaka s obzirom na jezgru.111
Elektroni počinju koherentno oscilirati i te oscilacije se nazivaju površinski
plazmoni.112 Oni imaju rezonantnu frekvenciju pri kojoj najefikasnije apsorbiraju i raspršuju
zračenje. Rezonantna frekvencija ovisi o gustoći slobodnih elektrona, odnosno o vrsti metala i
prirodi površine. Plazmoni srebra i zlata osciliraju pri frekvencijama vidljivog zračenja te se
mogu pobuditi zračenjem VIS i NIR lasera koji se koriste u Ramanovoj spektroskopiji.113 U
slučaju pobude zračenjem u ultraljubičastom području kao supstrati se mogu koristiti
aluminij, platina ili paladij.114 Upadno zračenje može se apsorbirati ili raspršiti s površine
metala, a koji proces će biti dominantniji ovisi o vrsti metala i prirodi površine.109 Dielektrična
konstanta metala sadrži realni i imaginarni dio. Raspršenje zračenja je povezano s realnim
dijelom, a apsorpcija s imaginarnim. Ovisno o veličini realnog, odnosno imaginarnog dijela
konstante, metal će apsorbirati ili raspršiti zračenje. Na glatkim metalnim površinama
plazmoni osciliraju u ravnini površine i moguća je samo apsorpcija zračenja.85 Pri raspršenju
zračenja oscilacije moraju biti okomite na ravninu površine, a one su moguće na hrapavim
površinama. Frekvencije površinskih plazmona mogu se odrediti snimanjem apsorpcijskog
spektra. Maksimum i širina plazmonske apsorpcijske vrpce ovise o obliku i veličini čestica te
30
o njihovoj kemijskoj okolini.112 Za veće čestice i agregate maksimum apsorpcije pomiče se
prema većim valnim duljinama. Tako se kontrolom svojstava nanočestica može podesiti
plazmonska rezonancija odnosno pripraviti SERS supstrati s kojih se optimalno raspršuje
zračenje odgovarajuće valne duljine.102
Fizikalna pozadina elektromagnetskog mehanizma može se objasniti na jednostavnom
primjeru metalne sfere koja se nalazi u vanjskom električnom polju i čiji je polumjer puno
manji od valne duljine zračenja.115 Kada je mala metalna sfera izložena promjenjivom
električnom polju zračenja lasera, E0, električno polje na površini opisuje se sljedećim
izrazom (2.3.9)
E r =E0 cosθ+g( a3
r3 )E0 cosθ (2.3.9)
gdje je Er ukupno električno polje na udaljenosti r od površine sfere, a polumjer sfere, θ kut u
odnosu na smjer električnog polja, a g konstanta za koju vrijedi (2.3.10)
g=( ε1( νL )−ε0
ε1 (ν L)+2 ε0) (2.3.10)
pri čemu su ε0 i ε1 dielektrične konstante medija koji okružuje sferu i metalne sfere, a vL je
frekvencija zračenja lasera. Polarizabilnost metalne sfere, odnosno pojačanje električnog polja
na površini sfere, proporcionalno ovisi o faktoru g, a on doseže maksimum pri rezonantnoj
frekvenciji plazmona za koju vrijedi ε1(L) = 20.
Ukupno električno polje na površini metala uprosječeno je preko cijele površine male
sfere. Na svakoj točki površine električnom polju doprinose dvije komponente, polje okomito
na površinu sfere i polje paralelno s površinom sfere. S obzirom da je dielektrična konstanta
za većinu metala približno 1, iz izraza (2.3.9) i (2.3.10) proizlazi da je električno polje
okomito na površinu veće od onog paralelno s njom. Prema tome, raspršenje će biti najjače za
molekule analita koje su adsorbirane i polarizirane okomito na površinu metala. Nadalje,
jačina električnog polja obrnuto je proporcionalna r3. Udaljavanjem od površine električno
polje slabi, a time i lokalno polje koje osjeća analit, što rezultira slabijim raspršenjem
zračenja. Objašnjenje elektromagnetskog pojačanja može se sa sfernih čestica proširiti na
31
morfološki drugačije supstrate, pri čemu se mijenja samo brojčani faktor „2“ u izrazu
rezonancije, ovisno o obliku metala.
Iznimno jako električno polje nastaje na mjestu gdje se dvije čestice dodiruju. Ta
mjesta se nazivaju „vruće točke“ (hot spots).116 Eksperimentalno je dokazano da su polja
najjača kada je razmak između čestica 12 nm. Raspršeno zračenje molekule koja je
adsorbirana na takvom mjestu može se pojačati i do 1012 puta.
2.3.2.3.2. Kemijski mehanizam ili mehanizam prijenosa naboja
Ukoliko bi pojačanje raspršenja bilo posljedica samo elektromagnetskog mehanizma,
efekt pojačanja trebao bi biti neovisan o kemijskoj prirodi adsorbiranih molekula, s obzirom
da kemijska struktura analita nije definirana u elektromagnetskom modelu. No, primjećeno je
da se SERS intenziteti nekih strukturno sličnih molekula podjednake polarizabilnosti jako
razlikuju.82 Opaženo se može objasniti mehanizmom u kojem se mijenja elektronsko stanje
molekule adsorbirane na metal uslijed interakcije s površinom ili nastaje novo elektronsko
stanje kao rezultat kemisorpcije, odnosno kemijskog vezanja molekule s česticom metala.117 U
procesu prijenosa naboja elektron iz metala, pobuđen upadnim fotonom, tunelira u pobuđeno
stanje adsorbirane molekule. Nastali negativni ion (adsorbirana molekula-elektron) ima
drugačiju ravnotežnu geometriju od početne neutralne molekule analita.
Mehanizam prijenosa naboja prikazan je na Slici 2.3.5. Površina metala apsorbira
upadno zračenje pri čemu nastaje par elektron-šupljina (a). Elektron se prenosi s metala na
molekulu vezanu na metal (b). Ako se pri tome molekula pobudi u virtualno stanje i nakon
toga vrati u više vibracijsko stanje osnovnog elektronskog stanja, elektron se vraća u metal
(c). Sjedinjenje elektrona sa šupljinom u metalu praćeno je otpuštanjem fotona koji nosi
informaciju o vibracijskom prijelazu molekule (d).
32
Slika 2.3.5. Mehanizam prijenosa naboja.117
Kemijski mehanizam pojačanja ponajviše ovisi o strukturnim i elektronskim
svojstvima analita. Najčešće se opaža za boje koje sadrže delokalizirani -sustav s amino i
imino skupinama, a koje vezu s metalnom površinom ostvaruju preko dušikova atoma.
Pojačanje prijenosom naboja kratkog je dosega i ograničeno je na prvi sloj molekula analita
vezanih na metal, dok se elektromagnetsko pojačanje raspršenog zračenja opaža i iz
udaljenijih slojeva.110 Ukupnom pojačanju raspršenog zračenja doprinose oba mehanizma, no
smatra se da elektromagnetsko pojačanje ima veću ulogu od kemijskog pojačanja. Kemijski
mehanizam ovisi o mjestu i geometriji vezanja te energijskim stanjima vezane molekule, a
pruža korisne informacije o interakciji između metala i analizirane molekule.118 No, ovaj
mehanizam nije osnovni mehanizam pojačanja raspršenja i primjenjiv je samo na pojedine
molekule.
2.3.2.4. Izborna pravila i asignacija SERS spektara
SERS spektar vrlo se često razlikuje od klasičnog Ramanovog spektra, a njegova
asignacija nije sasvim jednostavna. U SERS spektru mogu se javiti nove vrpce koje u
klasičnom Ramanovom spektru nisu opažene, dok neke vrpce mogu postati vrlo slabe ili čak
potpuno izostati.82 Razlog tome su većinom izborna pravila za molekule na površini metala
prema kojima vibracije polarizirane okomito na površinu najintenzivnije raspršuju zračenje, a
vibracije paralelno s njom ne doprinose raspršenju. Nadalje, adsorpcijom molekula na
33
površinu metala geometrija molekule se mijenja i dolazi do promjena normalnih vibracija. To
je najizraženije za molekule s centrom simetrije koje vezanjem na površinu gube to svojstvo.
Tada pravilo međusobnog isključenja više ne vrijedi, te se u SERS spektru javljaju vrpce i
onih vibracija koje su inače bile samo IR aktivne.
Za molekule koje u strukturi sadrže kromofor raspršeno zračenje može se dodatno
pojačati. Tada se kao pobudno zračenje koristi zračenje lasera čija frekvencija odgovara
energiji elektronskog prijelaza kromofora. Uslijed kombinacije rezonantnog i površinskog
pojačanja raspršeno zračenje pojačava se i do 1014 puta. Ova tehnika naziva se površinski
pojačano rezonantno Ramanovo raspršenje (surface-enhanced resonance Raman scattering,
SERRS).88
S obzirom na detekciju samo onih molekula koje se nalaze blizu metalne površine,
SERS tehnika je selektivna, a s obzirom na pojačanje raspršenog zračenja, i izrazito osjetljiva
u odnosu na klasičnu Ramanovu spektroskopiju.89 Iz tog se razloga široko primjenjuje u
različitim analizama, od identifikacije eksploziva, različitih ljekovitih supstancija, droga,
aditiva u hrani, pa sve do određivanja vrsta stanica i spora.119,120
2.3.2.5. Istraživanje vezanja malih molekula s DNA SERS spektroskopijom
Usprkos navedenim prednostima SERS spektroskopije pred ostalim metodama
vibracijske spektroskopije, samo je nekoliko radova objavljeno na temu istraživanja vezanja
malih molekula s polinukleotidima primjenom ove tehnike. Pri tome većina njih opisuje
promjene u spektrima interkalirajućih molekula opaženim nakon pobude vidljivim
zračenjem.121,122 Razlog tome je intenzivno raspršenje policikličkih aromatskih molekula na
površini metala uslijed rezonancije apsorpcije kromofora, površinskih plazmona i zračenja
lasera. Interkaliranjem u dvostruku uzvojnicu polinukleotida molekula se udaljava od metalne
površine pri čemu se i intenzitet raspršenja smanjuje.123 Molekule koje se potencijalno vežu u
utore, većinom poliamidi i poliamini, slabo raspršuju zračenje, te su stoga istraživanja ovih
molekula zanemarena. Međutim, SERS spektri oligonukleotida u koloidnoj suspenziji srebra,
opaženi tek nakon agregacije nanočestica sperminom, ukazali su na potencijal SERS
spektroskopije pri istraživanju molekula koje se vežu u utore nukleinskih kiselina.124
Vezanjem s poliaminskim molekulama na površini metala vrpce vibracije funkcionalnih
skupina odnosno dijelova polinukleotida koji sudjeluju u interakciji uočene se u spektru.
34
3. EKSPERIMENTALNI DIO
3.1. Kemikalije
Srebrov nitrat, p.a., Kemika
Trinatrijev citrat dihidrat, p.a., Kemika
Natrijev borhidrid, p.a., Carlo Erba Reagents
Poli(vinil alkohol), Mr 72000, p.a., Kemika
Etilendiamintetraoctena kiselina, p.a., Kemika
Natrijev hidroksid, p.a., Kemika
Klorovodična kiselina (36,5%), p.a., Kemika
Hidroksilamin hidroklorid, p.a., Kemika
Natrijev kakodilat, p. a., Sigma
Spermin tetrahidroklorid, p.a., Aldrich
Calf thymus DNA(ct-DNA), p.a., Aldrich
Poli A, p.a., Sigma
Poli G, p.a., Sigma
Poli C, p.a., Sigma
Poli U, p.a., Sigma
Poli dAdT−poli dAdT, p.a., Sigma
Poli dGdC–poli dGdC, p.a., Sigma
Poli rA−poli rU, p.a., Sigma
Laboratorijsko suđe za pripravu koloida i mjerenje uzoraka oprano je otopinom
deterdženta (Kemex), isprano običnom vodom, destiliranom vodom, 5%-tnom otopinom
dušične kiseline te deioniziranom vodom.
35
3.2. Istraživani spojevi
3.2.1. 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP)
Interkalator 4-metil-2,7-diamino-5,10-difenil-4,9-diazapirenijev hidrogensulfat (ADAP)
sintetiziran je i karakteriziran prema ref. 125 (Slika 3.2.1).
Slika 3.2.1. Struktura molekule ADAP.
3.2.2. N1-((1H-imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilami-
no)etil)amino)-etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY)
Poliaminski spojevi s imidazolnim i piridinskim prstenovima u strukturi N1-((1H-
imidazol-4-il)metil)-N3-(2(bis(2-(3-((1H-imidazol-4-l)metilamino)propilamino)etil)amino)-
etil)propan-1,3-diamin (IM) i tris(8-(4'-piridil)-3,7-diazaoktil)amin (PY) sintetizirani su i
karakterizirani prema ref. 126 (Slika 3.2.2).
(a) (b)
Slika 3.2.2. Strukture molekula a) IM i b) PY.
36
3.2.3. N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin (Sp)
Spermin (N,N′-bis(3-aminopropil)-1,4-butandiamin, Sp) je lančana poliaminska
molekula čija je struktura prikazana na slici 3.2.3.
H2N NH
HN NH2
Slika 3.2.3. Struktura molekule Sp.
3.2.4. 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolin (PHENPOD) i
2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridin (PYPOD)
Sinteza spojeva 2,9-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]fenantrolina
(PHENPOD) i 2,6-di[5-(2-aminoetil)-2,5,8-triaza[9]-(2,6)-piridinofan]piridina (PYPOD) i
njihova karakterizacija opisane su u ref. 127 (Slika 3.2.4).
(a) (b)
Slika 3.2.4. Strukture molekula a) PHENPOD i b) PYPOD.
37
3.3. Priprava koloidnih suspenzija srebra
3.3.1. Koloid 1
Koloidna suspenzija srebra 1 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s
hidroksilamin hidrokloridom.128 Srebrov nitrat (0,0085 g) otopio se u destiliranoj vodi (45
cm3). Zasebno se pripremila otopina hidroksilamin hidroklorida otapanjem čvrste tvari
(0,0085 g) u vodi (5 cm3), u koju se zatim dodala otopina natrijevog hidroksida, c = 2 mol
dm3 (0,110 cm3). Pripravljena otopina hidroksilamin hidroklorida dodala se u otopinu
srebrovog nitrata uz snažno miješanje na magnetskoj miješalici. Nakon nekoliko sekundi
reakcijska smjesa poprimila je sivo smeđu boju te se miješanje nastavilo 10 minuta.
3.3.2. Koloid 2
Koloidna suspenzija srebra 2 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s trinatrijevim
citratom prema modificiranom Lee-Meiselovom postupku.104 Srebrov nitrat (0,00892 g)
otopio se u deioniziranoj vodi (50 cm3) te se otopina zagrijala do vrenja na uljnoj kupelji. U
vruću otopinu dodala se 1%-tna otopina trinatrijevog citrata (1 cm3) i reakcijska smjesa
miješala uz vrenje 60 minuta pri čemu je promijenila boju iz bezbojne u smeđe sivu.
3.3.3. Koloid 3
Koloidna suspenzija srebra 3 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s natrijevim
borhidridom.94 Natrijev borhidrid (0,00229 g) otopio se u vodi (30 cm3) i zatim hladio u
ledenoj kupelji. U ohlađenu otopinu naizmjence se dodavala otopina srebrova nitrata,
pripremljena otapanjem tvari (0,00836 g) u vodi (10 cm3), i 1%-tna otopina poli(vinil
alkohola) (5 cm3). Reakcijska smjesa se zatim kuhala 60 minuta u svrhu uklanjanja suviška
NaBH4. Pripravljena koloidna suspenzija razrijedila se vodom do ukupnog volumena od 50
cm3.
38
3.3.4. Koloid 4
Koloidna suspenzija srebra 4 pripravljena je redukcijom srebrova nitrata s
etilendiamintetraoctenom kiselinom (EDTA).106 U vruću vodu (50 cm3) dodala se otopina
EDTA, c = 0,1 mol dm3 (1 cm3), zatim otopina NaOH, c = 0,1 mol dm3 (3 cm3) te otopina
srebrova nitrata pripremljena otapanjem tvari (0,01699 g) u vodi (1 cm3). Smjesa se kuhala
jednu minutu i zatim se u nju dodala otopina HCl, c = 0,1 mol dm3 (1 cm3). Reakcijska
smjesa nastavila se kuhati još 23 minute sve dok nije poprimila žuto smeđu boju.
3.4. Priprava otopina i mjernih uzoraka
39
Ishodne otopine ct-DNA, dvolančanih polinukleotida (poli dGdC−poli dGdC, poli
dAdT−poli dAdT, poli rA−poli rU) i jednolančanih polinukleotida (poli A, poli G, poli C, poli
U) pripravljene su u kakodilatnom puferu pH 7,0 ionske jakosti 0,05 mol dm3. Posebno,
otopina ct-DNA je po otapanju sonificirana i filtrirana kroz filter pora 0,45 µm, kako bi u
filtratu bili samo kraći ulomci dvolančane DNA do par stotina parova baza, karakteristične B-
DNA sekundarne strukture.129 Koncentracije ishodnih otopina polinukleotida određene su
spektrofotometrijski izražene kao koncentracije fosfata bile su sljedeće: c(ct-DNA) =
4,00×103 mol dm3, c(poli dAdT−poli dAdT) = 2,56×10−3 mol dm3, c(poli dGdC−poli dGdC)
= 1,10×103 mol dm3, c(poli rA−poli rU) = 9,64×10−3 mol dm3, c(poli A) = 8,81×10−3 mol
dm3, c(poli G) = 1,00×103 mol dm3, c(poli C) = 1,01×103 mol dm3 i c(poli U) = 1,03×103
mol dm3.
3.4.1. Priprava uzoraka sa spojem ADAP
Ishodna otopina spoja ADAP koncentracije 1,9×10−4 mol dm−3 pripravljena je
otapanjem odgovarajuće mase krute tvari u deioniziranoj vodi. Radi lakše priprave mjernih
uzoraka pripravljena je i otopina koncentracije 5×10−5 mol dm−3 razrijeđivanjem ishodne
otopine s deioniziranom vodom.
U svrhu određivanja koloida na kojem ADAP najjače raspršuje zračenje pripravljeni
su uzorci dodavanjem 50 μL otopine ADAP (5×10−5 mol dm−3) u 400 μL odgovarajuće
koloidne suspenzije srebra, te nadopunjavanjem deioniziranom vodom do 500 μL. U svim
uzorcima koncentracija spoja iznosila je 5×10−6 mol dm−3.
Uzorci za mjerenje SERS spektara otopina različitih koncentracija spoja ADAP
pripravljeni su miješanjem 400 μL koloidne suspenzije 1 i odgovarajućeg volumena ishodnih
otopina spoja ADAP (1,9×10−4 i 5×10−5 mol dm−3) te nadopunjavanjem deioniziranom vodom
do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije spoja ADAP u pripravljenim mjernim
uzorcima bile su 5×10–5, 1×10–5, 5×10–6, 1×10−6, 5×10−7 i 1×10−7 mol dm3.
Pri istraživanju utjecaja priprave uzorka na pojačanje Ramanova raspršenja smjese
spoja ADAP i ct-DNA pripravljene su na tri različita načina. U prvom uzorku najprije su
pomiješani ADAP i DNA, a potom je kompleksu dodan koloid srebra 1. Drugi uzorak je
pripravljen na način da je na koloid 1 dodan ADAP pa DNA, dok je u trećem uzorku na
koloid srebra 1 najprije dodana nukleinska kiselina, a zatim ADAP. Svi pripravljeni uzorci
40
sadržavali su ADAP koncentracije 5×10–6 mol dm3 i DNA koncentracije 1×10–4 mol dm3, pri
čemu je omjer ADAP/DNA, u kojem je koncentracija nukleinske kiseline izražena kao
koncentracija parova iznosio 1/10.
Mjerni uzorci smjesa spoja ADAP i ct-DNA sadržavali su sastojke u omjerima
ADAP/DNA 10/1, 7/1, 5/1, 2/1, 1/1, 1/2, 1/5, 1/7 i 1/10. Koncentracija malih molekula u
svim uzorcima bila je 5×10–6 mol dm3. Uzorci su pripravljeni na opisani prvi način, pri čemu
su najprije pomiješani odgovarajući volumeni kakodilatnog pufera i ishodne otopine DNA te
50 μL otopine ADAP (5×10−5 mol dm−3), a zatim je nastalom kompleksu dodano 400 μL
koloidne suspenzije srebra 1.
3.4.2. Priprava uzoraka sa spojevima IM i PY
Ishodne otopine spojeva IM i PY koncentracija 1×10−3 mol dm−3 pripremljene su
otapanjem odgovarajuće mase čvrstih uzoraka u deioniziranoj vodi.
Koloid koji će se koristi kao metalni supstrat za daljnja SERS mjerenja odabran je
pomoću uzoraka pripravljenih dodavanjem 50 μL ishodne otopine IM u 268 μL odgovarajuće
koloidne suspenzije srebra (1, 2 ili 3) te nadopunjavanjem vodom do 500 μL. U svim
uzorcima koncentracija spoja bila je 1×10−4 mol dm−3.
Uzorci za mjerenje SERS spektara spojeva IM i PY različitih koncentracija
pripravljeni su miješanjem 268 μL koloidne suspenzije 2 i odgovarajućeg volumena ishodnih
otopina IM, odnosno PY (1×10−3 ili 1×10−4 mol dm−3), te nadopunjavanjem deioniziranom
vodom do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije spojeva u mjernim uzorcima bile su
1×10–4, 5×10–5, 1×10–5, 5×10–6, 1×10−6, 5×10−7 i 1×10−7 mol dm3.
Uzorci za mjerenje SERS spektara koji su sadržavali natrijev borhidrid u svrhu
uklanjanja citratnih iona s površine nanočestica u koloidnoj suspenziji 2 pripravljeni su
miješanjem 268 μL koloida 2 i 46,3 μL otopine NaBH4 (1×103 mol dm3), dodavanjem
odgovarajućeg volumena ishodne otopina IM, odnosno PY (1×10−3 ili 1×10−4 mol dm−3), te
nadopunjavanjem deioniziranom vodom do ukupnog volumena od 500 μL. Koncentracije
spojeva u mjernim uzorcima bile su 1×10–4 i 5×10–6 mol dm3.
Uzorci u kojima su istraživane interakcije između spojeva IM i PY te jednolančanih
polinukleotida, dvolančanih polinukleotida i ct-DNA pripravljeni su u omjerima [spoj]/[DNA
fosfati] 1/20, pri čemu je koncentracija poliaminskih molekula u svim uzorcima bila 5×106
mol dm3, a koncentracija polinukleotida izražena kao koncentracija fosfata 1×104 mol dm3.
41
Uzorci su pripravljeni u koloidnoj suspenziji 2 dodatkom najprije spoja, a potom
polinukleotida. Serija uzoraka pripravljena je i s natrijevim borhidridom, koji je na koloid
dodan prije spoja i odgovarajućeg polinukleotida, a njegova koncentracija u mjernom uzroku
iznosila je 1×103 mol dm–3.
3.4.3. Priprava uzoraka sa spojem Sp
Ishodna otopina spoja Sp koncentracije 1×10−3 mol dm−3 pripremljena je otapanjem
odgovarajuće mase čvrstog uzorka u deioniziranoj vodi.
Uzorci za mjerenje SERS spektara spoja Sp različitih koncentracija pripravljeni su
miješanjem 268 μL koloidne suspenzije 2 i odgovarajućeg volumena ishodnih otopina Sp
(1×10−3 ili 1×10−4 mol dm−3), te nadopunjavanjem deioniziranom vodom do ukupnog
volumena od 500 μL. Koncentracije spoja u mjernim uzorcima bile su 1×10–4, 5×10–5, 1×10–5,
5×10–6 i 1×10−6 mol dm3.
Uzorci u kojima su istraživane interakcije spoja Sp s jednolančanim polinukleotidima
i dvolančanim polinukleotidima te ct-DNA pripremani su u koloidnoj suspenziji srebra 2
dodatkom najprije spoja, a zatim polinukleotida, te nadopunjavanjem kakodilatnim puferom.
U svim uzorcima koncentracija spoja Sp bila je 5×10–6 mol dm-3, dok je omjer koncentracija
spoja Sp i polinukleotida, [spoj]/[DNA fosfati] iznosio 1/20.
3.4.4. Priprava uzoraka sa spojevima PHENPOD i PYPOD
Ishodne otopine spojeva PHENPOD i PYPOD koncentracija 6,5×10−4 mol dm−3,
odnosno 5×10–4 mol dm−3 pripremljene su otapanjem odgovarajuće mase čvrstog uzorka u
deioniziranoj vodi.
Pri odabiru koloida za daljnja SERS mjerenja, uzorci su pripravljeni miješanjem 78 μL
ishodne otopine PHENPOD s 400 μL odgovarajuće koloidne suspenzije (1 ili 2), te
nadopunjavanjem deioniziranom vodom do 500 μL. U svim uzorcima koncentracija spoja
iznosila je 1×10−4 mol dm−3.
Uzorci za mjerenje SERS spektara spojeva PHENPOD i PYPOD različitih
koncentracija pripravljeni su miješanjem odgovarajućeg volumena ishodne otopina
PHENPOD, odnosno PYPOD (6,5×10−4 ili 5×10−4 mol dm−3) s deioniziranom vodom, nakon
42
čega je dodano 400 μL koloidne suspenzije 2, tako da je ukupni volumen iznosio 500 μL.
Koncentracije spojeva u mjernim uzorcima bile su 6,5×10–5, 3,2×10–5, 6,5×10–6, 3,2×10–6,
6,5×10−6, 3,2×10−7 i 6,5×10−8 mol dm3.
Uzorci u kojima su istraživane interakcije spojeva PHENPOD i PYPOD s
jednolančanim polinukleotidima, dvolančanim polinukleotidima i ct-DNA pripravljeni su u
omjerima [spoj]/[DNA fosfati] 1/20. Uzorci su pripremani u koloidnoj suspenziji srebra 2
dodatkom najprije spoja, a zatim polinukleotida, te nadopunjavanjem kakodilatnim puferom.
U svim uzorcima koncentracija spoja PHENPOD, odnosno spoja PYPOD bila je 5×10–6 mol
dm-3.
3.5. Mjerni uređaji
3.5.1. Snimanje UV/VIS apsorpcijskih spektara
43
Apsorpcijski spektri koloidnih suspenzija srebra snimljeni su pomoću UV/VIS
spektrofotometra SPECORD 200 tvrtke Analytik Jena. Korištene su kvarcne kivete duljine
puta zračenja 1,00 cm. Spektri su snimani u području između 1100 i 200 nm uz razlučivanje
od 1 nm.
3.5.2. Određivanje pH vrijednosti koloidne suspenzije
Za mjerenje pH vrijednosti koloidnih suspenzija korišten je pH metar tvrtke Mettler
Toledo (model MP 220) s kombiniranom staklenom-kalomel elektrodom InLab®413. Uređaj
je prije mjerenja baždaren s otopinama pufera pH 7,00 i 4,01.
3.5.3. Snimanje koloida transmisijskom elektronskom mikroskopijom
Nanočestice srebra u koloidnim suspenzijama 1, 2 i 3 vizualizirane su transmisijskom
elektronskom mikroskopijom (transmission electron microscopy, TEM) pomoću JEOL JEM-
1400 mikroskopa. Uzorci za snimanje TEM slika pripremljeni su nanošenjem kapi suspenzije
na ugljikom prevučenu bakrenu mrežicu (100 mesh) i sušenjem pri sobnoj temperaturi.
3.5.4. Snimanje FT-Ramanovih i SERS spektara
Ramanovi i SERS spektri snimljeni su pomoću interferometra EQUINOX 55 tvrtke
BRUKER, opremljenim s Ramanovim modulom FRA 106/S. Kao izvor zračenja za pobudu
uzoraka korišten je Nd:YAG laser koji je emitirao zračenje pri 1064 nm snage 100 mW
prilikom snimanja krutih uzoraka, odnosno 500 mW pri snimanju otopina i koloidnih
suspenzija. Za čvrste uzorke korišteni su nosači od aluminija, dok su tekući uzorci snimani u
staklenim kivetama. Spektri su snimani u području od 3500 do 100 cm1 uz razlučivanje od 4
cm1, a rezultat su uprosječivanja 128 snimaka.
4. REZULTATI I RASPRAVA
4.1. Karakterizacija koloidnih suspenzija srebra
44
4.1.1. Koloid 1
Koloid 1 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s hidroksilamin hidrokloridom.128
Hidroksilamin djeluje kao reducirajući agens, dok se kloridni ioni, zaostali nakon priprave,
smještaju uz površinu nanočestica srebra i stabiliziraju koloid.
pH koloidne suspenzije iznosio je 6,70, a valna duljina rezonancije plazmona 416 nm
(Slika 4.1.1).
300 400 500 600 700 800 900 1000 11000,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
1,50
Aps
orba
ncija
Valna duljina / nm
Slika 4.1.1. Apsorpcijski spektar koloidne suspenzije 1.
Ramanov spektar koloidne suspenzije 1 nalikuje Ramanovom spektru vode (Slika
4.1.2). Široka vrpca u području 35003200 cm1 odgovara istezanju O–H veza u molekuli
vode, dok se slaba vrpca pri približno 1600 cm1 pripisuje promjeni kuta između dvije O–H
veze odnosno deformaciji molekule vode.130
45
Slika 4.1.2. Ramanov spektar koloidne suspenzije 1.
Na TEM slici koloidne suspenzije 1 opažaju su pojedinačne i agregirane nanočestice
srebra sfernog oblika veličine od 20 do 120 nm (Slika 4.1.3).
Slika 4.1.3. TEM slika koloida 1.
46
4.1.2. Koloid 2
Koloid 2 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s trinatrijevim citratom.104 Citrati
reduciraju srebrove ione pri čemu nastaju acetondikarboksilna kiselina i acetoctena kiselina,
koje se zajedno sa suviškom citratnih iona adsorbiraju na površinu nanočestica i djeluju kao
stabilizirajući agensi.
Valna duljina maksimalne apsorpcije koloidne suspenzije zabilježena je pri 421 nm
(Slika 4.1.4), a pH vrijednost iznosila je 7,69.
300 400 500 600 700 800 900 1000 11000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Aps
orba
ncija
Valna duljina / nm
Slika 4.1.4. Apsorpcijski spektar koloidne suspenzije 2.
U Ramanovom spektru koloidne suspenzije 2 vrpca pri 3200 cm1 odgovara istezanju
OH veze vode, dok se vrpca pri 1090 cm1 pripisuje istezanju CO veza citratnih aniona i
oksidacijskih produkata na površini koloidnih nanočestica (Slika 4.1.5).131
47
Slika 4.1.5. Ramanov spektar koloidne suspenzije 2.
TEM slika koloida 2 ukazuje na prisutnost sfernih nanočestica, većinom agregiranih,
veličine između 20 i 150 nm (Slika 4.1.6).
Slika 4.1.6. TEM slika koloida 2.
48
4.1.3. Koloid 3
Koloid 3 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s natrijevim borhidridom u
prisutnosti poli(vinil alkohola).95 Pri redukciji srebrovih kationa, borhidrid se oksidira do
borata koji, uz polimer u suspenziji, stabiliziraju nastale nanočestice srebra.
Valna duljina rezonancije plazmona opažena je pri 393 nm (Slika 4.1.7), a pH
koloidne suspenzije iznosio je 6,89.
300 400 500 600 700 800 900 1000 11000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Aps
orba
ncija
Valna duljina / nm-1
Slika 4.1.7. Apsorpcijski spektar koloidne suspenzije 3.
U Ramanovom spektru koloidne suspenzije 3 opažaju se vrpce koje potječu od
vibracijskih modova molekule vode: istezanja OH veza pri 3200 cm1 i deformacije pri 1600
cm1 (Slika 4.1.8).130
49
Slika 4.1.8. Ramanov spektar koloidne suspenzije 3.
Na TEM slici koloida 3 uočavaju se sferne nanočestice srebra veličine od 20 do 50
nm, pojedinačne, ali i u manjim nakupinama (Slika 4.1.9).
Slika 4.1.9. TEM slika koloida 3.
50
4.1.4. Koloid 4
Koloid 4 pripravljen je redukcijom srebrova nitrata s etilendiamintetraoctenom
kiselinom (EDTA).107 Negativno nabijeni oksidacijski produkti EDTA na površini
stabiliziraju nanočestice srebra.
Rezonantna valna duljina plazmona nanočestica opažena je pri 408 nm (Slika 4.1.10).
pH koloidne suspenzije iznosio je 7,90.
300 400 500 600 700 800 900 1000 11000,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Aps
orba
ncija
Valna duljina / nm
Slika 4.1.10. Apsorpcijski spektar koloidne suspenzije 4.
Uz vrpce vibracijskih modova vode pri 3200 i 1600 cm1, u Ramanovom spektru
koloidne suspenzije 4 opaža se vrpca pri 1090 cm1 koja odgovara istezanju CO veza
karboksilnih skupina EDTA i njezinih oksidacijskih produkata (Slika 4.1.11).130
51
4.2. Istraživanje interakcija spoja ADAP s DNA
4.2.1. FT-Ramanovi spektri spoja ADAP
Snimljeni su Ramanovi spektri krutog uzorka spoja ADAP te zasićene vodene otopine,
c(ADAP) = 1,9×10–4 mol dm–3 (Slika 4.2.1). Izostanak vibracijskih vrpci u spektru krutine
pripisuje se tamnoljubičastoj boji uzorka koji u potpunosti apsorbira zračenje lasera. U slučaju
vodene otopine spoja, snimljeni spektar odgovara Ramanovom spektru vode. Radi slabe
topljivosti spoja ADAP u vodi nije bilo moguće pripraviti otopinu veće koncentracije koja bi
bila dovoljna za opažanje Ramanovog spektra.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.2.1. FT-Ramanovi spektri a) vodene otopine ADAP, c = 1,9×10–4 mol dm–3, i b)
krutog uzorka spoja ADAP.
4.2.2. SERS spektri spoja ADAP
4.2.2.1. Odabir koloida
Uvjet za površinsko pojačanje raspršenog zračenja, odnosno opažanje SERS spektra
molekule je vezanje ili blizina molekule i odgovarajuće metalne površine. U svrhu odabira
53
prikladnog metalnog SERS supstrata pripravljene su četiri koloidne suspenzije srebra.
Optimalan koloid odabran je snimanjem SERS spektara spoja ADAP na pripravljenim
koloidima 1, 2, 3 i 4 (Slika 4.2.2).
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
R
aman
ov in
tenz
itet
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
Slika 4.2.2. SERS spektri spoja ADAP na a) koloidu 1, b) koloidu 2, c) koloidu 3 i
d) koloidu 4; c(ADAP) = 5×10–6 mol dm3.
Jedino se u spektru snimljenom na koloidu 1, pripravljenom redukcijom srebrovog
nitrata s hidroksilamin hidrokloridom, javljaju vrpce koje odgovaraju vibracijskim modovima
molekule spoja ADAP. S obzirom da nanočestice srebra u koloidnoj suspenziji 1 nose
negativan naboj kloridnih iona na površini, molekule spoja ADAP se uslijed elektrostatskih
privlačnih sila pozitivno nabijenog heterocikličkog sustava smještaju blizu površine metalnih
nanočestica. Mali kloridni ioni na površini mogu se lako razmaknuti i omogućiti adsorpciju
molekula na metal koja rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja.
Iako su nanočestice srebra u koloidnim suspenzijama 2 i 4, nastale redukcijom s
trinatrijevim citratom odnosno EDTA, također negativno nabijene uslijed reducensa i njihovih
oksidacijskih produkata na površini, pretpostavlja se da svojom veličinom ometaju
približavanje molekula spoja ADAP površini srebra. Nanočestice srebra u koloidu 3 okružuje
stabilizirajući polimer te, osim što je neutralan i onemogućava elektrostatske sile, predstavlja
steričku barijeru između površine metala i istraživanih molekula.
Za daljnja mjerenja SERS spektara spoja ADAP stoga je korišten koloid 1.
54
4.2.2.2. Koncentracijska ovisnost
Snimljeni su SERS spektri spoja ADAP u ovisnosti o koncentraciji u području 1×10–7
–5×10–5 mol dm3 (Slika 4.2.3).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)(f)
Slika 4.2.3. SERS spektri spoja ADAP: a) c = 5×10–5 mol dm3, b) c = 1×10–5 mol dm3, c) c =
5×10–6 mol dm3, d) c = 1×10–6 mol dm3, e) c = 5×10–7 mol dm3 i f) c = 1×10–7 mol dm3.
Intenzitet površinski pojačanog raspršenog zračenja spoja ADAP ovisi o koncentraciji
spoja u koloidnoj suspenziji, no pri tome ne slijedi linearan trend. Koloidni uzorak najveće
istraživane koncentracije spoja ADAP, c = 5×10–5 mol dm3, slabo raspršuje zračenje.
Smanjenjem koncentracije raspršenje zračenja se pojačava i dostiže svoj maksimum pri
koncentraciji 5×10–6 mol dm3. Pri nižim koncentracijama SERS intenzitet vrpci slabi. Spektar
uzorka najmanje koncentracije spoja, c = 1×10–7 mol dm3, odgovara spektru koloidne
suspenzije.
Zahvaljujući planarnoj aromatskoj strukturi ADAP agregira u vodenim otopinama
formirajući dimere, Ks,dim 400 dm3 mol1.126 U strukturi dimera jedna molekula spoja ADAP
zarotirana je za 180º oko najduže molekulske osi u odnosu na drugu molekulu (Slika 4.2.4).
55
Slika 4.2.4. Dimer molekula ADAP.126
Pretpostavlja se da u otopini spoja ADAP najveće koncentracije, c = 5×10–5 mol dm3,
prevladavaju dimeri molekula. U blizini koloidnih čestica dimeri se na različite načine
orijentiraju prema površini srebra što uzrokuje slabo raspršenje zračenja. Smanjenjem
koncentracije ravnoteža se pomiče na stranu monomera. Monomeri lakše zauzimaju
optimalan položaj prema površini koloidnih nanočestica što rezultira intenzivnijim i bolje
definiranim vrpcama u spektru. Smanjenjem koncentracije spoja osobito se pojačavaju vrpce
vibracijskih modova diazapirenskog sustava, što upućuje na smještanje policikličkog
aromatskog sustava molekule ADAP okomito na površinu metala.
U Tablici 4.2.1 asignirane su vibracijske vrpce spoja ADAP u SERS spektrima
otopina različitih koncentracija. Intenzivne vrpce u području 16251300 cm–1 odgovaraju
istezanjima CC i CN veza središnjeg aromatskog sustava.132 Vrpca pri 1592 cm–1 pripisuje se
istezanju benzenskih prstena vezanih na diazapirenski sustav, dok vrpce oko 1000 cm–1
potječu od njihovih deformacija. Najintenzivnije vrpce u SERS spektrima svih koncentracija
opažaju se oko 240 cm–1 s ramenom pri 211 cm–1. S obzirom da je ADAP sintetiziran kao sol,
hidrogensulfat, intenzivna vrpca najvjerojatnije potječe od istezanja Ag–O i/ili Ag–S veza
formiranih između površine srebra i odgovarajućih atoma HSO4– iona te prekriva vrpcu
istezanja Ag–N veza molekula spoja ADAP s koloidnim nanočesticama.133
56
Tablica 4.2.1. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja ADAP različitih koncentracija.130,132
Valni broj / cm-1
Vibracija5×10–5 mol dm3
1×10–5 mol dm3
5×10–6 mol dm3
1×10–6 mol dm3
5×10–7 mol dm3
1621 1623 1622 1622 1622 ν CC diazapiren
1594 1593 1592 ν CC fenil
1573 1573 1569 1567 ν CC/CN diazapiren
1559 1559 ν CC/CN diazapiren
1526 ν CC diazapiren
1516 1518 1512 ν CC, ν CC/CN diazapiren
1452 1451 1450 1448 δas CH3
1441 1437 1437 ν CC/CN diazapiren
1386 1386 1386 1386 1386 ν CC diazapiren, δs CH3
1353sh 1353 ν CC diazapiren
1345 1347 1349 ν CC diazapiren
1337sh 1337 1336 1336 ν CC diazapiren
1312 1312 1310 1308 δip C–H
1302 1301 δip C–H
1226 ν C–N, δip C–H
1178 1182 1182 1185 δip C–H
1150 1150 1150 1150 δip C–H
1028 1031 1030 ν CC diazapiren
998 998 998 998 998 δ CC fenil
972 972 972 972 δ CC fenil
893 ν CC diazapiren
857 850 854 857 δ diazapiren
819 816 825 824 δ diazapiren
721 721 721 721 721 δ diazapiren
687 687 692sh δ diazapiren
434 436 438 437 γ diazapiren
362 363 364 364 γ diazapiren
240 239 238 238 237 ν Ag–O / ν Ag–S / ν Ag–N
211sh 211sh 211sh 211sh 211sh ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; γ, torzija; ip, u ravnini; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame
Pojačanje raspršenja spoja ADAP posljedica je većinom elektromagnetskog
mehanizma. Molekule ADAP adsorbiraju se na površinu srebra uslijed elektrostatskih
interakcija između pozitivno nabijenog dušikovog atoma aromatskog sustava i kloridnih
aniona koje se nalaze na površini nanočestica srebra. Blizina molekule i metalne površine
57
omogućava interakciju s površinskim plazmonima. Međutim, u strukturi molekule prisutne su
i amino skupine preko kojih se može ostvariti kemijska veza s površinom metala. Iako
prekrivanje vrpci u području nižih valnih brojeva onemogućava uočavanje vrpce vibracije
nastale Ag–N veze, za očekivati je da i kemijsko pojačanje doprinosi ukupnom raspršenom
zračenju.
Budući da su pri koncentraciji 5×10–6 mol dm3 molekule spoja ADAP u otopini
prisutne kao monomeri i ujedno najintenzivnije raspršuju zračenje, daljnja istraživanja s DNA
provedena su pri toj koncentraciji spoja.
4.2.2.3. Utjecaj pufera
S obzirom da je otopina ct-DNA pripremljena u kakodilatnom puferu, istražen je
utjecaj pufera na SERS spektar spoja ADAP. Spektri spoja ADAP koncentracije 5×10–6 mol
dm3 bez pufera i u prisutnosti kakodilatnog pufera pH vrijednosti 7,4 prikazani su na Slici
4.2.5.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.2.5. SERS spektri spoja ADAP a) bez kakodilatnog pufera i b) s kakodilatnim
puferom; c(ADAP) = 5×10–6 mol dm3.
58
SERS spektri otopine ADAP bez pufera i s puferom nalikuju jedan drugome.
Prisutnost kakodilatnog pufera ne uzrokuje pojavu novih vrpca niti pomak postojećih vrpci.
Porast intenziteta vibracijskih vrpci u odnosu na spektar uzorka bez pufera posljedica je
agregacije nanočestica srebra izazvane ionima u sastavu pufera. Agregirane nanočestice
srebra doprinose pojačanju raspršenja s površine metala i shodno tome intenzivnijim vrpcama
u SERS spektru.109
4.2.2.4. SERS spektri smjesa spoja ADAP i DNA
4.2.2.4.1. Utjecaj priprave uzorka
Istražen je utjecaj priprave uzorka na pojačanje raspršenog zračenja kompleksa spoja
ADAP s ct-DNA pri omjeru ADAP/DNA 1/10 i koncentraciji spoja ADAP 5×10–6 mol
dm3. Uzorci su pripravljeni na tri načina koji su se razlikovali prema redoslijedu dodavanja,
odnosno miješanja sastojaka s koloidnom suspenzijom srebra 1. Snimljeni spektri uspoređeni
su sa SERS spektrom spoja ADAP u prisutnosti pufera (Slika 4.2.6.a).
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
Slika 4.2.6. SERS spektri uzoraka ADAP/DNA s obzirom na pripravu uzoraka u usporedbi sa
SERS spektrom spoja ADAP. c(ADAP) = 5×10–6 mol dm3, ADAP/DNA 1/10.
59
Opažen je SERS spektar samo uzorka pripravljenog miješanjem spoja ADAP s
koloidom srebra, nakon čega je u suspenziju dodana DNA (Slika 4.2.6.b), dok uzorak
pripravljen miješanjem nukleinske kiseline s koloidom prije dodatka spoja, kao i onaj u koji je
koloid dodan nakon priprave kompleksa, nisu raspršili zračenje (Slike 4.2.6.c i d).
Kada se uzorak pripravlja prvotnim miješanjem koloida sa spojem, molekule ADAP
vežu se na površinu nanočestica srebra što rezultira pojačanjem Ramanovog raspršenja.
Naknadnim dodatkom DNA u uzorak intenzitet vrpci slabi, što se može pripisati vezanju
određenog broja molekula ADAP s nukleinskom kiselinom.
U slučaju kada se najprije pomiješaju nukleinska kiselina i koloid ili prethodno
pripravljeni kompleks i koloid, suvišak negativno nabijene DNA sprječava adsorpciju
molekula ADAP na površinu srebra. Elektrostatsko odbijanje negativno nabijenih fosfatnih
skupina okosnice DNA i kloridnih iona na površini nanočestica onemogućava nastalom
kompleksu približavanje površini metala s koje se raspršenje pojačava.
4.2.2.4.2. Interakcije molekula ADAP i DNA
U svrhu istraživanja interakcija molekula ADAP i DNA snimljeni su SERS spektri
smjesa spoja s DNA pripravljenih dodatkom koloida srebra 1 nastalom kompleksu (Slika
4.2.7). Svi uzorci sadržavali su spoj ADAP koncentracije 5×10–6 mol dm3, a razlikovali su se
prema koncentracijskim omjerima ADAP/DNA u rasponu od 10/1 do 1/10.
U uzorcima koji su sadržavali suvišak spoja ADAP, smjese ADAP/DNA od 10/1
do 2/1, intenzitet vrpci spoja smanjuje se s porastom udjela DNA, što upućuje na smanjenje
broja molekula ADAP adsorbiranih na koloidne nanočestice uslijed vezanja s nukleinskom
kiselinom.133
Pri omjerima ADAP/DNA 1/1 i 1/2 slabe vrpce u SERS spektrima potječu od
kompleksa ADAP/DNA koji se nalazi u blizini površine srebra, s obzirom da u tim uzorcima
nema slobodnih malih molekula koje bi se mogle adsorbirati na nanočestice metala.
Prethodnim spektroskopskim mjerenjima utvrđeno je da ADAP uz dominantan način vezanja
odnosno interkaliranje, pri navedenim omjerima ostvaruje i drugačije interakcije s
nukleinskom kiselinom.126 Zahvaljujući pozitivno nabijenom dušiku u strukturi molekule
moguće su elektrostatske interakcije molekula ADAP s negativno nabijenim fosfatnim
skupinama DNA. Osim toga, amino skupine molekule interkalatora mogu stvarati vodikove
veze s kisikom iz šećera ili fosfata iz okosnice nukleinske kiseline.
60
Pri omjerima 1/5, 1/7 i 1/10 pri kojima je DNA prisutna u velikom suvišku u odnosu
na male molekule, gotovo u potpunosti nestaju SERS vrpce spoja ADAP, što upućuje na
interkaliranje molekula spoja u DNA kao jedini način vezanja s nukleinskom kiselinom. Pri
navedenim omjerima molekule ADAP duboko su umetnute u dvostruku zavojnicu i ne mogu
se približiti površini metala što je uvjet za pojačanje Ramanovog raspršenja.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
721
972
99813
86
1622
Slika 4.2.7. SERS spektri spoja ADAP i kompleksa ADAP/DNA molarnih omjera od 10/1 do
1/10 (od vrha prema dolje); c(ADAP) = 5×10–6 mol dm3.
Usporedbom SERS spektara kompleksa ADAP/DNA i spektra slobodnih molekula
interkalatora nije zamjećena pojava novih vrpci (Tablica 4.2.2). Osim smanjena intenziteta
svih vrpci u SERS spektru, nema značajnih pomaka vrpci u spektru kompleksa u odnosu na
spektar samog spoja ADAP. Spomenuta opažanja su i očekivana, s obzirom da većina vrpci u
spektru potječe od vibracijskih modova planarnog diazapirenskog sustava koji se umeće
između parova baza DNA. S povećanjem količine DNA položaj mijenja samo vrpca pri 238
cm1 koja se pomiče prema 232 cm–1. Pomak prema manjem valnom broju pripisan je
slabljenju kemijske veze interkalatora s površinom metala uslijed favoriziranog vezanja
molekula s nukleinskom kiselinom.
61
Opažene promjene u SERS spektrima pri odgovarajućim omjerima interkalatora i
nukleinske kiseline u skladu su s rezultatima mjerenja fluorescencije i cirkularnog dikroizma
uzoraka.126
Tablica 4.2.2. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja ADAP i kompleksa ADAP/DNA
različitih molarnih omjera; c(ADAP) = 5×10–6 mol dm3.
Valni broj / cm–1
VibracijaADAP
[ADAP]/[DNA]
10/1 7/1 5/1 2/1 1/1 1/2
1622 1622 1622 1622 1622 1622 1622 ν CC diazapiren
1592 1592 1591 1591 1595 1596 1600 ν CC fenil
1569 1569 1569 1569 1569 1568 1568 ν CC/CN diazapiren
1526 1526 1526 1525 1527 1525 1524 ν CC diazapiren
1512 1513sh 1513sh 1512sh 1512 1512 1511 ν CC, ν CC/CN diazapiren
1450 1450 1451 1450 1451 1450 1450 δas CH3
1437 1437 1437 1437 1438 1437 1440sh ν CC/CN diazapiren
1386 1385 1386 1385 1385 1385 1385 ν CC diazapiren, δs CH3
1347 1347 1346 1346 1347 1348 1348 ν CC diazapiren
1336 1337 1340sh 1340sh 1338 ν CC diazapiren
1310 1311 1311 1311 1310 1312 1310 δip C–H
1301 1302 1301 1301 1302sh δip C–H
1182 1182 1182 1182 1182 1183 1182 δip C–H
1150 1149 1149 1149 1149 1149 1148 δip C–H
1030 1030 1030 1030 1030 1030 1032 ν CC diazapiren
998 996 996 996 997 996 997 δ CC fenil
972 972 972 972 972 971 971 δ CC fenil
893 891 890 892 893 892 891 ν CC diazapiren
854 855 855 859 854 861 850 δ diazapiren
825 825 825 824 824 δ diazapiren
721 721 721 721 721 721 721 δ diazapiren
439 438 439 438 438 439 438 γ diazapiren
364 364 364 363 363 363 363 γ diazapiren
238 239 239 239 238 233 232 ν Ag–O / ν Ag–S / ν Ag–N
211sh 211sh ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; γ, torzija; ip, u ravnini; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame
4.3. Istraživanje interakcija spojeva IM i PY s polinukleotidima
62
4.3.1. FT-Ramanovi spektri spojeva IM i PY
Snimljeni su Ramanovi spektri krutih uzoraka IM i PY te njihovih vodenih otopina
koncentracije 1×10–3 mol dm–3 (Slike 4.3.1 i 4.3.2). Obje poliaminske molekule slabo
raspršuju zračenje, na što upućuje slab intenzitet i mali broj vrpci u spektru čvrstih uzoraka,
dok je koncentracija spojeva u vodenim otopinama nedovoljna za opažanje Ramanovog
raspršenja te spektri otopina odgovaraju spektru vode.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(b)
(a)
Slika 4.3.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka IM i b) vodene otopine IM,
c = 1×10–3 mol dm–3.
U Ramanovom spektru molekule IM, koja na krajevima tri aminometilenska lanca
sadrži imidazolne prstenove, opaža se široka vrpca u području valnih brojeva 30002850 cm–1
koja se pripisuje istezanjima C–H veza metilenskih skupina, i dijelom prekriva vrpcu istezanja
C–H veza imidazolnih jedinica pri 3110 cm–1 (Tablica 4.3.1).134 Slabe vrpce pri 1624 cm–1 i
1318 cm–1 te srednja vrpca pri 1464 cm–1 s ramenom pri 1457 cm–1 potječu od istezanja
imidazolnih prstenova. Pri tome, deformacije metilenskih skupina doprinose širokim vrpcama
pri 1464 cm–1 i 1318 cm–1. Oštra vrpca srednjeg intenziteta pri 1277 cm–1 posljedica je
deformacija CH skupina imidazolnog prstena u ravnini, a vrpce pri 830 cm–1 i 747 cm–1
63
svijanja van ravnine. Uslijed C–C i C–N istezanja aminometilenskih lanaca opažene su slabe
vrpce između 1200 cm–1 i 950 cm–1.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
R
aman
ov in
tenz
itet
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.3.2. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PY i b) vodene otopine PY,
c = 1×10–3 mol dm–3.
U Ramanovom spektru poliaminskog spoja s piridinskim prstenovima u strukturi, PY,
većina vrpci odgovara vibracijskim modovima aromatskih jedinica (Tablica 4.3.2).135 Slično
spoju IM, vrpce istezanja aromatskih i alifatskih CH veza opažaju se pri 3076 cm–1 odnosno
2964 cm–1. Srednje vrpce pri 1642 cm–1 i 1462 cm–1 te slaba vrpca pri 1602 cm–1 pripisuju se
istezanjima piridinskih skupina, dok je intenzivna vrpca pri 1010 cm–1 posljedica vibracije,
tzv. „disanja“ aromatskog prstena. Ostale vrpce u spektru potječu od deformacija CH skupina
i torzija piridinskih prstenova.
64
4.3.2. SERS spektri spojeva IM i PY
4.3.2.1. Odabir koloida
Snimljeni su SERS spektri spoja IM koncentracije 1×10–4 mol dm–3 na koloidima 1, 2 i
3 (Slika 4.3.3). Iako se u spektrima sva tri uzorka uočavaju slabe i većinom široke vrpce u
području 1600800 cm1, najizraženije su uzorku pripravljenom na koloidu 2. Nanočestice
srebra koloidne suspenzije 2 nose negativan naboj uslijed citratnih aniona na površini te
stvaraju Coulombove interakcije s molekulama spoja IM, koje su višestruko pozitivno
nabijene pri pH koloidne suspenzije 7,69.127 Intenzivna vrpca pri približno 240 cm1 pripisuje
se istezanju AgCl veze nastale između površine srebra i kloridnih iona u sastavu spoja, kao i
onih prisutnih u koloidnoj suspenziji 1.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
Slika 4.3.3. SERS spektri spoja IM na a) koloidu 1, b) koloidu 2 i c) koloidu 3;
c(IM) = 1×10–4 mol dm–3.
S obzirom da su IM i PY slične poliaminske strukture, za pretpostaviti je da će
pojačanje raspršenog zračenja molekule s piridinskim prstenovima također biti najveće na
nanočesticama srebra pripravljenim redukcijom s citratom, pa su mjerni uzorci oba spoja za
daljnja istraživanja pripravljani u koloidnoj suspenziji 2.
65
4.3.2.2. Koncentracijska ovisnost
Snimljeni su SERS spektri spojeva IM i PY u koloidnoj suspenziji srebra 2 u
koncentracijskom području 1×10–6–1×10–4 mol dm3 (Slike 4.3.4 i 4.3.5).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
**
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Slika 4.3.4. SERS spektri spoja IM: a) c = 1×10–4 mol dm3, b) c = 5×10–5 mol dm3,
c) c = 1×10–5 mol dm3, d) c = 5×10–6 mol dm3 i e) c = 1×10–6 mol dm3.
Usporedbom Ramanovog spektra krutog uzorka i SERS spektara spoja IM uočava se
pomak vrpce pri 1624 cm–1 u Ramanovom spektru prema 1582 cm–1 u SERS spektru, te porast
intenziteta vrpci pri 1450 i 1326 cm–1 u SERS spektrima (Tablica 4.3.1). Osim promjena vrpci
koje potječu od istezanja imidazolnih prstenova, smještanje molekula blizu površine srebra
uzrokuje i pojačanje vrpci pri 1282, 840 i 744 cm–1 pripisanih deformacijama CH skupina
imidazolnih jedinica. Široka vrpca pri 1400 cm–1 te vrpce ispod 1100 cm–1, sve označene
zvjezdicom na spektrima, ne potječu od istraživanog spoja nego su rezultat vibracijskih
modova citratnih aniona i njihovih oksidacijskih produkata koji su zaostali u suspenziji nakon
priprave koloida.131
66
Tablica 4.3.1. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima
spoja IM različitih koncentracija.130,134
Valni broj / cm–1
VibracijaFT-
Raman SERS
IM 1×10–4 mol dm–3
5×10–5 mol dm–3
1×10–5 mol dm–3
5×10–6 mol dm–3
1×10–6 mol dm–3
3110sh ν C–H imidazol
2967 2964 2969 2969sh 2970sh 2970sh ν C–H (CH2)
1624 1582 1581 1582 1581 1577 ν imidazol
1464 1450 1447 1450sh 1450sh 1451sh ν imidazol, δsc CH2
1457 ν imidazol
1376 1394 1403 1400 1400 citrati
1318 1326 1328 1332 1328w 1325sh ν imidazol, δtw,wg CH2
1277 1282 1282 1283 1282 1282 δip C–H imidazol
1179 1170 1172 1178 1172w 1170 ν C–N
1134 1143 1143 1142 ν C‒C/C–N
1107 1102 1083 1087 1096 citrati
1060 δip C–H imidazol
1037 1038 1030 1030 1037 citrati
981 1008 1011 1010sh 1008sh 1010sh ν C–C/C‒N
950 951 951 950 951 citrati
927sh 928 927 931 923 nitrati
837 833 836 837 835 δoop C–H imidazol
744 736 738 749 738 δ C–H imidazol
238 235 ν Ag–Cl
226 226 220b ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
67
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
*****
***
*****
****
***
Slika 4.3.5. SERS spektri spoja PY: a) c = 1×10–4 mol dm3, b) c = 5×10–5 mol dm3,
c) c = 1×10–5 mol dm3, d) c = 5×10–6 mol dm3 i e) c = 1×10–6 mol dm3.
Slično spoju IM, vrpce istezanja piridinskog prstena pri 1642 cm–1 i 1602 cm–1 pomiču
se prema 1610 cm–1 i 1561 cm–1 u SERS spektrima PY. Osim toga, povećava se intenzitet
vrpce pri 1011 cm–1, koja odgovara vibracijskom modu disanja piridinskog prstena, te vrpca
pri 1214 cm–1 i 1068 cm–1, koje se pripisuju deformacijama CH skupina prstena u ravnini. I u
SERS spektrima spoja PY uočavaju se vrpce vibracija citratnih iona na površini nanočestica.
Tablica 4.3.2. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima
spoja PY različitih koncentracija.130,135
68
Valni broj / cm–1
VibracijaFT-
Raman SERS
PY 1×10–4 mol dm–3
5×10–5 mol dm–3
1×10–5 mol dm–3
5×10–6 mol dm–3
1×10–6 mol dm–3
3076 3061 3062 3066 3065 3065 ν C–H piridin
2964 2962 2962sh 2963sh 2963 2968 ν C–H (CH2)
1642 1610 1611 1613 1614 1615 ν piridin
1602 1561 1559 1561 1566 1565sh ν piridin
1500 1500 1493 1502 1505 ν piridin
1462 1450 1449 ν piridin, δsc CH2
1394 1394 1394 1395 1401 citrati
1327 1330 1338 1338 δtw,wg CH2, δip C–H piridin
1215 1214 1214 1214 1215 1215 δip C–H piridin
1106 1101 δip C–H piridin
1066 1068 1068 1069 1069 1071 δip C–H piridin
1036 1036 1034sh 1032sh 1032sh citrati
1010 1011 1011 1014 1015 1016 ν piridin (disanje prstena)
949 949 951 951 951 citrati
926sh 924 925 926 925 nitrati
837 830 835 837 836 836 γ piridin
800 800 800 800 801 citrati
739 738 738 738 738sh δoop C–H piridin
651 667 668 667 668 669 γ piridin
239 238 ν Ag–Cl
228 228 216b ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
U SERS spektrima spojeva IM i PY intenzitet vrpci vibracijskih modova poliaminskih
spojeva raste s povećanjem koncentracije u uzorku. Tako vrpce oko 1450 cm–1 i 1000 cm–1,
koje su pri nižim koncentracijama prekrivene širokim vrpcama citrata, postaju vidljive i dobro
definirane u SERS spektrima najveće mjerene koncentracije. S obzirom da povećanje
koncentracije ne uzrokuje značajnije pomake vrpci niti pojavu novih vrpci, osim onih koje su
prvotno prekrivene vrpcama vibracija citrata, može se zaključiti da su razlike između SERS
spektara različitih koncentracija posljedica utjecaja citratnih iona na površini nanočestica, a ne
promjene orijentacije molekula na njihovoj površini.
Površinskom pojačanju raspršenja zračenja molekula IM i PY doprinose
elektromagnetski i kemijski mehanizam. Elektrostatske interakcije između pozitivno nabijenih
69
molekula i citratnih aniona na nanočesticama srebra omogućavaju blizinu poliaminskih
molekula i površine metala, koja je preduvjet za površinsko pojačanje raspršenja. S obzirom
da i IM i PY na krajevima lanaca sadrže aromatske prstenove s dušikom, mogu stvarati σ-
vezu sa srebrom preko slobodnog para elektrona na dušikovom atomu. Uslijed redistribucije
naboja u aromatskim prstenovima izazvane vezanjem s površinom srebra, vrpce koje potječu
od istezanja prstenova, između 1650 i 1600 cm–1 u Ramanovom spektru krutog uzorka pomiču
se prema nižim valnim brojevima u SERS spektru. Na kemijsko vezanje poliaminskih spojeva
sa srebrovim nanočesticama upućuju i vrpce pri 226 cm–1 i 223 cm–1 u spektrima IM, odnosno
PY, koje se uočavaju pri koncentracijama manjim od 1×10–5 mol dm3, a pripisuju istezanju
Ag–N veze. Pri većim koncentracijama poliaminskih molekula, koncentracija kloridnih iona
doprinosi intenzivnoj vrpci istezanja Ag–Cl veze (238 cm–1) koja prekriva vrpcu istezanja
veze poliaminskih molekula sa srebrom.
4.3.2.3. Utjecaj NaBH4
S obzirom da su u SERS spektrima spojeva IM i PY opažne vrpce vibracija iona
koloidne suspenzije koje prekrivaju vrpce vibracija istraživanih molekula, tzv. anomalne
vrpce, bilo ih je potrebno ukloniti. Interferencije izazvane citratnim aniona mogu se umanjiti
dodatkom natrijevog borhidrida u mjerni uzorak, s obzirom da borhidridni ioni smanjuju
električni potencijal površine srebra i uzrokuju desorpciju citratnih iona.130
Dodatkom natrijevog borhidrida na koloid 2 spektar koloidne suspenzije srebra se ne
mijenja, odnosno ne uočavaju se vrpce koje bi potjecale od NaBH4 (Prilog 1). S obzirom da
vrpce citratnih aniona najviše utječu na SERS spektre otopina poliaminskih molekula nižih
koncentracija, snimljeni su spektri spojeva IM i PY koncentracije 5×10–6 mol dm3 na koloidu
2 bez natrijevog borhidrida i nakon njegova dodatka (Slike 4.3.6 i 4.3.7).
U SERS spektru spoja IM snimljenom na koloidu 2 s natrijevim borhidridom, vrpce
vibracijskih modova citrata, označene zvjezdicom na Slici 4.3.6 nestaju, a javljaju se vrpce
vibracijskih modova spoja koje su u spektru bez NaBH4 prekrivene anomalnim vrpcama.
Tako se opažaju vrpce pri 1445 cm–1 i 1058 cm–1 pripisane istezanju imidazola, odnosno
deformacijama CH skupina prstena u ravnini, te pojačava intenzitet vrpci pri 1357, 1329 i
1002 cm–1.
70
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
* ** *
Slika 4.3.6. SERS spektri spoja IM na a) koloidu 2 i b) koloidu 2 s NaBH4;
c(IM) = 5×10–6 mol dm3. c) FT-Ramanov spektar krutine IM.
Dodatkom natrijevog borhidrida u mjerni uzorak spoja PY također izostaju anomalne
vrpce citratnih iona (Slika 4.3.7). Pri tome se vrpce vibracijskih modova spoja PY pojačavaju,
osobito vrpca pri 1630 cm–1. Međutim, u spektru dominira nova, vrlo intenzivna vrpca pri
1087 cm–1, za koju se, s obzirom da je selektivno pojačana i da ne odgovara vibraciji spoja,
pretpostavlja da je posljedica prisutnosti NaBH4 u mjernom sustavu.
Zanimljivo je uočiti da vrpce pri 226 cm–1 (IM) i 228 cm–1 (PY), koje potječu od
istezanja veze srebra i dušika u strukturi spojeva nestaju, te da se u području niskih valnih
brojeva javlja široka vrpca pri 310 cm–1 nepoznatog porijekla. Iako su dodatkom natrijevog
borhidrida interferirajuće vrpce citratnih iona na površini nanočestica uspješno uklonjene iz
SERS spektra, javile su se nove vrpce, koje nije bilo moguće asignirati.
71
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
* ** *
Slika 4.3.7. SERS spektri otopina PY na a) koloidu 2 i b) koloidu 2 s NaBH4;
c(PY) = 5×10–6 mol dm3. c) FT-Ramanov spektar krutine PY.
4.3.2.4. Utjecaj pufera
S obzirom da su ishodne otopine DNA i RNA polinukleotida pripravljene u
kakodilatnom puferu, istražen je utjecaj pufera na SERS spektre IM i PY. Snimljeni su SERS
spektri uzoraka spojeva IM, odnosno PY, c = 5×10–6 mol dm–3, na koloidu 2, u prisutnosti
kakodilatnog pufera. SERS spektri obje poliaminske molekule bez i s puferom u sustavu
gotovo su isti (Slike 4.3.8 i 4.3.9). Blagi porast intenziteta pojedinih vrpci, osobito spoja PY,
pripisuje se agregaciji koloidnih nanočestica srebra ionima u sastavu pufera koja rezultira
pojačanjem raspršenog zračenja.109
72
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.3.8. SERS spektri spoja IM a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog pufera;
c(IM) = 5×10–6 mol dm3.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.3.9. SERS spektri spoja PY a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog pufera;
c(PY) = 5×10–6 mol dm3.
73
4.3.2.5. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s polinukleotidima i DNA
Snimljeni su SERS spektri jednolančanih RNA polinukleotida, dvolančanih RNA i
DNA polinukleotida te ct-DNA u koloidnoj suspenziji 2 (Prilog 2). U spektrima nisu
zamijećene vrpce koje potječu od vibracijskih modova šećera, baze ili fosfata u strukturi
polinukleotida. Budući da polinukleotidi nose negativan naboj fosfatnih skupina okosnice,
odbojne elektrostatske sile s citratnim anionima na površini nanočestica sprječavaju
približavanje biomolekula površini srebra s koje se raspršeno zračenje pojačava. Utvrđeno je,
međutim, da se molekule IM i PY smještaju vrlo blizu nanočestica pri čemu vrlo vjerojatno
mijenjaju naboj na površini metala. Za očekivati je također da će polinukleotidi stvarati
interakcije s molekulama poliamina na površini i tako se približiti nanočesticama srebra. Iz
tog razloga mjerni uzorci za istraživanje interakcija poliaminskih spojeva s polinukleotidima
pripravljeni su miješanjem najprije koloidne suspenzije srebra i otopina malih molekula,
nakon čega je dodan odgovarajući polinukleotid.
4.3.2.5.1. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s jednolančanim RNA polinukleotidima
Snimljeni su SERS spektri smjesa jednolančanih RNA polinukleotida (poli A, poli G,
poli C i poli U) sa spojevima IM i PY u koloidnoj suspenziji srebra 2 (Slike 4.3.10 i 4.3.11).
Koncentracija poliaminskih molekula u smjesama iznosila je 5×10–6 mol dm–3, a molarni
omjer spojeva u smjesi, u kojem je koncentracija polinukleotida izražena kao koncentracija
fosfata, bio je 1/20.
U odnosu na SERS spektre samih spojeva, u spektrima njihovih smjesa s
jednolančanim polinukleotidima opaža se povećanje intenziteta vrpci koje potječu od malih
molekula, pri čemu spektri nalikuju onima najveće mjerene koncentracije 1×10–4 mol dm–3
(Slika 4.3.4.a i 4.3.5.a). Osobito su pojačane vrpce istezanja aromatskih prstenova pri 1580
cm–1 (IM) i 1611 cm–1 (PY), te vrpca pri 1450 cm–1 koja je u spektrima spojeva koncentracije
5×10–6 mol dm–3 prekrivena anomalnom vrpcom citrata. Uz porast SERS intenziteta vrpci,
prisutnost polinukleotida u uzorku uzrokuje i relativne promjene intenziteta pojedinih vrpci.
Primjerice, u spektru smjese IM s poli C omjer intenziteta vrpci pri 1450 cm–1 i 1281 cm–1,
I1450/I1281, jednak je 1,08, dok u spektru spoja IM koncentracije 1×10–4 mol dm3 on iznosi 0,89.
S obzirom na izborna pravila na površini koja vrijede u SERS spektroskopiji, relativne
promjene intenziteta vrpci u SERS spektru upućuju na promjenu položaja molekule na
74
površini metala. Pretpostavlja se stoga da se interakcijom spojeva IM i PY s polinukleotidima
mijenja orijentacija poliaminskih molekula na površini srebra, uslijed čega su različiti
vibracijski modovi malih molekula različito pojačani.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
*
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
im u c g a
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
1582
*
1328 12
81
* * * 836
750
731
923**
1330
*14
22
1495
804
79592
6
1330
1355 14
21
1421
1500 ***
*
791
92713
521423
1625 ***
*
795
925
135614
22
1498
****
Slika 4.3.10. SERS spektri a) IM, b) IM/poli A, c) IM/poli G, d) IM/poli C i e) IM/poli U;
c(IM) = 5×10–6 mol dm–3, IM/poli 1/20. Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i
nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).
75
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
B u c g a
1614
1566
* 1214 10
70
*
1011
* 837
*
739 66
8
**** 73
2
924
127113
32
1420
925
127113
351421
****
****
****
925
129314
22
925
129014
23
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika 4.3.11. SERS spektri a) PY, b) PY/poli A, c) PY/poli G, d) PY/poli C i e) PY/poli U;
c(PY) = 5×10–6 mol dm–3, PY /poli 1/20. Anomalne vrpce koje potječu od citratnih i
nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).
Osim povećanja i relativne promjene intenziteta vrpci koje potječu od malih molekula,
u SERS spektrima smjesa uočene su nove vrpce koje su pripisane vibracijskim modovima
polinukleotida (Tablica 4.3.3).136 U spektrima svih smjesa opaža se vrpca pri 1422 cm–1 koja
odgovara deformaciji metilenske skupine, a može se pripisati bilo CH2 skupinama
aminometilenskih lanaca u strukturi spojeva IM i PY, bilo 5'CH2 skupinama šećera u
okosnici.136 S obzirom da odgovarajuća vrpca nije uočena niti u Ramanovim spektrima krutih
uzoraka niti u SERS spektrima spojeva, pretpostavlja se da vrpca potječe od vibracije riboze.
Druga vrpca koja se pripisuje šećeru javlja se pri 925 cm–1, no djelomično je prekrivena
vrpcom nitratnih aniona.
76
Tablica 4.3.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja IM i smjesama s jednolančanim
RNA polinukleotidima.130,134,136
Valni broj / cm–1
Vibracijac(IM) / mol dm3 [IM]/[poli] 1/20
1×10–4 5×10–6 IM/poli A IM/poli G IM/poli C IM/poli U
2964 2970sh 2963 2963 2963 2963 ν C–H (CH2)
1625 citozin
1582 1581 1579 1577 1580 1578 ν imidazol
1500 gvanin
1495 adenin
1495 uracil
1450 1450sh 1454 1452 1450 1451 ν imidazol, δsc CH2
1422 1421 1423 1422 δip CH2 šećer (C5'H2)
1376 1400 1387 1392 1393 1393 citrati
1356 uracil
1355sh gvanin
1352 citozin
1330 gvanin
1330 adenin
1326 1328 1324 1327 ν imidazol, δtw,wg CH2
1282 1282 1281 1280 1282 1282 δip C–H imidazol
1170 1172 1166 1171 1173 1168 ν C–N
1143 1147 1148 1148 1148 ν C–C/C‒N
1107 1087 1089 1093 1093 1091 citrati
1037 1030 1036 1029 1029 1036 citrati
1008 1016 1012 1012 ν C–C/C‒N
950 950 951 951 951 951 citrati
927sh 931 923 927 927 925 nitrati, šećer (ν C–C)
837 837 825 832 832 832 δoop CH imidazol
804 795 791 795 okosnica (ν O–P‒O)
744 749 748 747 745 δoop C–H imidazol
731 adenin 238 235 235 235 235 ν Ag–Cl
226 ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
77
Najznačajnije promjene zamijećene su u spektru smjese IM/poli A. Uočava se vrlo
intenzivna vrpca pri 1330 cm–1, koja potječe od istezanja aromatskog sustava adenina, te
vrpca pri 731 cm–1 koja se pripisuje disanju prstena adenina. Nova vrpca u spektru smjese
IM/poli G pri 1330 cm–1 s ramenom pri 1355 cm–1 odgovara vibracijama istezanja gvanina.
U SERS spektrima pirimidinskih baza javljaju se slabe vrpce pri 1352 cm–1 i 1356 cm–
1, koje se pripisuju deformacijama u ravnini C5H i C6H skupina citozina odnosno uracila. U
spektru smjese IM/poli C opaža se i slaba vrpca pri 1625 cm–1 koja odgovara istezanju C=O
skupine citozina, a upućuje na vezanje molekule spoja IM s citozinom preko karbonilne
skupine. U SERS spektrima smjesa IM/poli C i IM/poli U vrpce pri 791 cm–1 odnosno 795
cm–1 posljedica su simetričnog istezanja veza šećera i fosfata u okosnici (5'C–O–P–O–C3).
Vrpca istezanja CC i CN veza poliaminskih lanaca pri približno 1012 cm–1 različitog
je intenziteta u SERS spektrima, ovisno o polinukleotidu u smjesi. Intenzivna je u spektru
smjese s poli G, srednje jaka u spektrima smjesa s poli A i poli U, dok se u spektru smjese s
poli C javlja kao rame prekriveno susjednom vrpcom citrata (1029 cm–1). Vrlo je vjerojatno
da se uslijed vezanja s različitim dušičnim bazama poliaminske molekule različito smještaju
na površini metala što rezultira različitim pojačanjem raspršenog zračenja vibracije okosnice
molekula.
Promjene u SERS spektrima smjesa IM s jednolančanim RNA polinukleotidima
pripravljenim na koloidu 2 u prisutnosti natrijeva borhidrida u skladu su s opisanim
promjenama u SERS spektrima uzoraka koji nisu sadržavali borhidridne anione (Prilog 3).
Slično SERS spektrima smjesa spoja IM, i u spektrima smjesa spoja PY s
jednolančanim polinukleotidima uočene su vrpce koje potječu od vibracijskih modova
polinukleotida (Tablica 4.3.4).
Vrpce vibracija adenina koje upućuju na interakciju PY s poli A opažaju se pri 1332
cm–1 i 732 cm–1, dok široko rame pri 1335 cm–1 u spektru smjese s poli G ukazuje na vezanje s
gvaninom. U spektrima smjesa PY s polinukleotidima purinskih baza javlja se i slaba vrpca
pri 1271 cm–1 koja odgovara istezanju C–N veze amino skupine vezane na prsten dušične
baze. Slabe vrpce pri 1293 cm–1 i 1290 cm–1 u SERS spektrima smjesa s poli C odnosno poli
U posljedica su interakcija malih molekula s polinukleotidima pirimidinskih baza, a potječu
od vibracija prstena.
78
Tablica 4.3.4. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PY i smjesama s jednolančanim
RNA polinukleotidima.130,135,136
Valni broj / cm–1
Vibracijac(PY) / mol dm3 [PY]/[poli] 1/20
1×10–4 5×10–6 PY/poli A PY/poli G PY/poli C PY/poli U
3061 3065 3063 3062 3063 3063 ν C–H piridin
2962 2963 2963 2964 2964 2964 ν C–H (CH2)
1610 1614 1611 1611 1611 1611 ν piridin
1561 1566 1588 1561 1557 1556 ν piridin
1500 1502 1500 1503 1498 1502 ν piridin
1450 1453 1452 1451 1451 ν piridin, δsc (CH2)
1420 1421 1422 1423 δip C–H šećer (C5'H2)
1394 1395 1397 1397 1397 1396 citrati
1335sh gvanin
1332 adenin
1330 δtw,wg (CH2), δip C–H piridin
1293 citozin
1290 uracil
1271 gvanin
1271 adenin
1214 1215 1214 1214 1214 1214 δip C–H piridin
1101 δip C–H piridin
1068 1069 1070 1070 1070 1070 δip C–H piridin
1036 1032sh 1034sh 1035sh 1033sh 1035sh citrati
1011 1015 1011 1011 1011 1011 ν piridin (disanje prstena)
949 951 950 950 950 950 citrati
926sh 926 924 925 925 925 nitrati, šećer (ν C–C)
830 836 834 840 837 838 γ piridin
800 800 799 798 799 799 citrati, okosnica (ν O–P‒O)
739 738 739 739 739 δoop C–H piridin
732 adenin
667 668 668 668 668 668 γ piridin
239 236 236 238 236 ν Ag–Cl
228 ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
Dodatak natrijevog borhidrida u uzorke smjesa PY s jednolančanim RNA
polinukletodima nije uzrokovao promjene u odnosu na opisane spektre (Prilog 4).
4.3.2.5.2. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima
79
Pri istraživanju interakcija IM i PY s dvolančanim polinukleotidima korišteni su
polinukleotidi strukture uzvojnice, poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–poli dGdC te poli rA–
poli rU. Koncentracija malih molekula u uzorcima pripravljenim u koloidnoj suspenziji srebra
2 bila je 5×10–6 mol dm–3, a molarni omjeri smjesa u kojima je koncentracija polinukleotida
izražena kao koncentracija fosfata 1/20.
U SERS spektrima svih smjesa s dvolančanim polinukleotidima opaža se povećanje
intenziteta vibracijskih vrpci imidazola pri 1580, 1450 i 1280 cm–1, te piridina pri 1610, 1560 i
1450 cm–1, što upućuje na vezanje poliamina s polinukleotidima. Prilikom interakcija s
polinukleotidima imidazolni i piridinski prstenovi orijentiraju se okomito na površinu srebra
čime se polarizabilnost malih molekula povećava, a raspršeno zračenje pojačava. Iz toga
slijedi da su polinukleotidi na površini srebra smješteni okosnicom paralelno površini srebra,
a dušičnim bazama okomito na metalnu površinu.
Vrpca u spektrima smjesa, koja se javlja pri 1422 cm–1 i pripisuje deformaciji 5'CH2
skupine šećera, podupire pretpostavku o smještaju okosnice blizu površine srebra (Tablica
4.3.5). Vrpce koje potječu od fosfata okosnice nisu opažene u spektrima smjesa s
dvolančanim polinukleotidima, uslijed bilo prekrivanja s anomalnim vrpcama bilo položaja
P–O veza u ravnini s metalnom površinom gdje promjene polarizabilnosti ne doprinose
površinskom raspršenju.
80
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1581 *
1282
1328
* * * 837
749
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
73292
7
1330
1422
929
1327
135214
23
929
1330
1423
*
*
925
1328
135514
22
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
**
Slika 4.3.12. SERS spektri a) IM, b) IM/poli dAdT–poli dAdT, c) IM/poli dGdC–poli dGdC,
d) IM/poli rA–poli rU i e) IM/ct-DNA; c(IM) = 5×10–6 mol dm–3, IM/poli 1/20. Anomalne
vrpce koje potječu od citratnih i nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).
U SERS spektru smjese IM s poli dAdT–poli dAdT opažena je jaka vrpca istezanja
adenina pri 1330 cm–1 i slabija vrpca pri 732 cm–1 koja potječe od disanja prstena. Pod
pretpostavkom da se u spektru smjesa opažaju vrpce vibracija onih funkcionalnih skupina
polinukleotida koje se nalaze najbliže površini metala, kao posljedica interakcije s
poliaminima na nanočesticama srebra, može se odrediti mjesto vezanja molekula. Vibracija
adenina pri većem valnom broju odnosi se na istezanje peteročlanog prstena čiji se N7 atom
nalazi u velikom utoru. S obzirom da taj dušikov atom ne sudjeluje u Watson-Crickovom
sparivanju baza, on predstavlja slobodno mjesto za vezanje s poliaminom. S druge strane,
vrpca disanja adenina pri nižem valnom broju potječe od vibracije šesteročlanog prstena s N3
atomom u malom utoru, slobodnom za interakcije s malim molekulama. Za pretpostaviti je
stoga da se molekule spoja IM vežu i u mali i u veliki utor poli dAdT–poli dAdT
polinukleotida.
U spektrima smjesa spoja IM s poli dGdC–poli dGdC javljaju se vrpce vibracijskih
modova dušičnih baza pri 1327 cm–1 i 1352 cm–1. Dok je vrpca pri manjem valnom broju
posljedica istezanja purinske baze, vrpci pri većem valnom broju doprinose i istezanje
peteročlanog prstena gvanina i deformacije C5–H i C6–H skupina na prstenu citozina. S
81
obzirom da se i N7 atom prstena gvanina i navedene CH skupine citozina nalaze u velikom
utoru, pretpostavlja se vezanje molekula spoja IM u veliki utor poli dGdC–poli dGdC
polinukleotida. Također, u SERS spektru nije uočena vrpca istezanja C=O skupine citozina
koja bi upućivala na interakcije u malom utoru polinukleotida. Favorizirano vezanje molekula
u veliki utor poli dGdC–poli dGdC polinukleotida u skladu je s činjenicom da amino skupina
gvanina u malom utoru stvara steričku smetnju i čini ga manje reaktivnim mjestom za vezanje
malih poliaminskih molekula.
U SERS spektrima smjesa spoja IM s dvolančanim RNA analogom, poli rA–poli rU,
opažena je vrpca pri 1330 cm–1 i pripisana istezanju prstena adenina s N7 atomom u velikom
utoru. S obzirom da nisu uočene vrpce koje bi odgovarale drugim vibracijskim modovima
adenina i uracila, za pretpostaviti je da se molekule IM vežu s adeninom u velikom utoru poli
rA–poli rU polinukleotida. Vezanje poliaminskih molekula isključivo u veliki utor, za razliku
od interakcija s velikim i s malim utorom polinukleotida koji osim adenina sadrži i timin,
posljedica je razlike u strukturi uzvojnica. Mali utor poli rA–poli rU polinukleotida širi je i
plići od malog utora poli dAdT–poli dAdT te onemogućava učinkovito vezanje malih
molekula.
82
Tablica 4.3.5. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja IM i smjesama s dvolančanim DNA
i RNA polinukleotidima te ct-DNA. 130,134,136
Valni broj / cm–1
VibracijaIMc = 1×10–4
mol dm–3
IMc = 5×10–6
mol dm–3
[IM]/[poli] 1/20IM/
poli dAdT–poli dAdT
IM/poli dGdC–poli dGdC
IM/poli rA–poli rU
IM/ct-DNA
2964 2970sh 2963 2963 2963 2962 ν C–H (CH2)
1582 1581 1578 1579 1579 1578 ν imidazol
1450 1450sh 1452 1451 1451 1450 ν imidazol, δsc CH2
1422 1423 1423 1422 δip C–H šećer (C5'H2)
1376 1400 1392 1394 1392 1395 citrati
1352 1355sh gvanin
1352 citozin
1330 1330 1328 adenin
1327 1328 gvanin
1326 1328 ν imidazol, δtw,wg CH2
1282 1282 1282 1282 1282 1282 δip C–H imidazol
1170 1172 1167 1170 1170 1170 ν C–N
1143 1148 1152 1148 1146 ν C–C/C‒N
1107 1087 1096 1095 1095 1094 citrati
1037 1030 1036 1036 1036 1036 citrati
1008 1014 1011 1011 1012 ν C–C/C‒N
950 950 950 950 950 950 citrati
927sh 931 927sh 929sh 929 925 nitrati, šećer (ν C–C)
837 837 833 829 833 833 δoop C–H imidazol
794 796 794 794 okosnica (ν O–P‒O)
744 749 744 745 747 δoop C–H imidazol
732 adenin 238 235 235 235 235 ν Ag–Cl
226 ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
83
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1614
1566 *
*
*
*
1214 10
70
*
*
*
*
1014
* 837
*
*
*
*
739 66
8
*
*
*
735
924
126313
321422
92513
421422
92513
301422
* **
* 92413
31
1270
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
1422
Slika 4.3.13. SERS spektri a) PY, b) PY/poli dAdT–poli dAdT, c) PY/poli dGdC–poli dGdC,
d) PY/poli rA–poli rU i e) PY/ct-DNA; c(PY) = 5×10–6 mol dm–3, PY/poli 1/20. Anomalne
vrpce koje potječu od citratnih i nitratnih iona označene su zvjezdicom (*).
U spektrima smjesa spoja PY s dvolančanim polinukleotidima također se opažaju
vrpce koje potječu od dušičnih baza, ali manjeg intenziteta nego u spektrima smjesa sa spojem
IM. Vrpce u spektrima smjese s poli dAdT–poli dAdT pri 1332 cm–1 i 735 cm–1 upućuju na
interakciju poliamina s adeninom i vezanje u oba utora dvolančanog polinukleotida, dok
široko rame pri 1342 cm–1 u spektru smjese s poli dGdC–poli dGdC ukazuje na interakciju
molekula PY s gvaninom u velikom utoru polinukleotida.
U spektru smjese s RNA polinukleotidom opaža se vrpca pri 1330 cm–1, kao i u SERS
spektru smjese istog polinukleotida sa spojem IM, te se može pretpostaviti da se i molekule
spoja PY vežu s adeninom u velikom utoru poli rA–poli rU polinukleotida.
84
Tablica 4.3.6. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PY i smjesama s dvolančanim DNA
i RNA polinukleotidima te ct-DNA. 130,135,136
Valni broj / cm–1
VibracijaPYc = 1×10–4
mol dm–3
PYc = 5×10–6
mol dm–3
[PY]/[poli] 1/20PY/
poli dAdT–poli dAdT
PY/poli dGdC–poli dGdC
PY/poli rA–poli rU
PY/ct-DNA
3061 3065 3063 3063 3063 3063 ν C–H piridin
2962 2963 2963 2963 2963 2963 ν C–H (CH2)
1610 1614 1610 1610 1610 1610 ν piridin
1561 1566 1560 1560 1560 1560 ν piridin
1500 1502 1497 1501 1498 1500 ν piridin
1450 1452 1451 1452 1450 ν piridin, δsc CH2
1422 1422 1422 1422 δip C–H šećer (C5'H2)
1394 1395 1395 1395 1396 1396 citrati
1342sh gvanin
1332 1330 1331 adenin
1330 δtw,wg CH2,δip C–H piridin
1263 1270 adenin (ν C6–NH2)
1214 1215 1214 1214 1214 1214 δip C–H piridin
1101 δip C–H piridin
1068 1069 1070 1070 1070 1070 δip C–H piridin
1036 1032sh 1033 1036 1037 1034 citrati
1011 1015 1011 1011 1011 1011 ν piridin (disanje prstena)
949 951 951 951 951 citrati
926sh 926 924 925 925 924 nitrati, šećer (ν C–C)
830 836 833 834 833 834 γ piridin
800 800 798 798 799 799 citrati, okosnica (ν O–P‒O)
739 738 740 741 740 δoop C–H piridin
735 adenin
667 668 666 666 666 666 γ piridin
239 236 236 236 236 ν Ag–Cl
228 ν Ag–Nν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; sh, rame; tw, savijanje; wg, mahanje; sc, striženje
Kao i u slučaju smjesa s jednolančanim polinukleotidima, mjerni uzorci s dvolančanim
polinukleotidima pripravljeni u koloidnoj suspenziji 2 u prisutnosti natrijeva borhidrida
rezultirali su spektrima karakteristika opisanih u spektrima uzoraka bez borhidridnih iona
(Prilog 5 i 6).
85
4.3.2.5.3. SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA
Snimljeni su SERS spektri smjesa spojeva IM i PY s ct-DNA u koloidnoj suspenziji
srebra 2, pri čemu je koncentracija malih molekula bila 5×10–6 mol dm–3, a molarni omjer, u
kojem je koncentracija nukleinske kiseline izražena kao koncentracija fosfata, [spoj]/[DNA]
1/20.
U SERS spektrima smjesa opaža se pojačanje intenziteta raspršenog zračenja koje, u
skladu sa spektrima smjesa s jednolančanim i dvolančanim polinukleotidima, upućuje na
interakcije između poliaminskih molekula i nukleinske kiseline (Slike 4.3.12.e i 4.3.13.e).
Analizom SERS spektara s dvolančanim polinukleotidima utvrđeno je da interakcije s
uređenim zavojitim strukturama rezultiraju smještanjem aromatskih prstenova molekula IM i
PY okomito na površinu srebra i aminometilenskih lanaca blizu površine metala. To podupire
pretpostavku da se DNA uz površinu srebra orijentira okosnicom paralelno površini metala.
U SERS spektru smjese spoja IM s ct-DNA glavna spektralna promjena, u odnosu na
spektar spoja IM, uključuje pojavu široke vrpce pri 1325 cm–1 s ramenom pri 1355 cm–1
(Slika 4.3.12.e, Tablica 4.3.5). I vrpca i rame potječu od vibracija purinskih dušičnih baza,
odnosno istezanja peteročlanih prstenova adenina i gvanina, te upućuju na interakciju N7
atoma purina s aminoskupinama spoja IM. Dušikov atom obje purinske baze smješten je u
velikom utoru i ne sudjeluje u komplementarnom sparivanju baza vodikovim vezama. U
prilog vezanju spoja IM u veliki utor DNA je i izostanak vrpce adenina pri 732 cm–1 koja se
pripisuje disanju prstena s N3 atomom kao potencijalnim veznim mjestom u malom utoru. S
obzirom na zavojitu strukturu DNA, pretpostavlja se da su timin i citozin smješteni dalje od
metalne površine i stoga njihove i inače slabe vrpce u SERS spektru nisu zamijećene.
U SERS spektru smjese spoja PY s ct-DNA uočava se široka vrpca srednjeg
intenziteta pri 1331 cm–1 koja upućuje na interakciju s N7 atomom adenina i gvanina u
velikom utoru nukleinske kiseline (Slika 4.3.13.e, Tablica 4.3.6). Na vezanje molekula spoja
PY u veliki utor ukazuje i vrpca pri 1270 cm–1 koja se pripisuje istezanju C6–NH2 veze
adenina, s obzirom da se amino skupina adenina nalazi u velikom utoru.
86
4.4. Istraživanja sa spojem Sp
S obzirom na strukturu molekula IM i PY, u kojoj su aromatski prstenovi smješteni na
krajevima aminometilenskih poveznica, doprinos poliaminskih lanaca vezanju malih
molekula s polinukleotidima istražen je pomoću linearnog poliamina spermina. Nakon pobude
u vidljivom području zračenja, SERS spektri ukazali su na vezanje spermina u veliki utor
nukleinske kiseline,125 međutim, sustavno istraživanje koje obuhvaća snimanje koncentracijski
ovisnih SERS spektara te smjesa s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima
i ct-DNA u bliskom infracrvenom području nije provedeno.
4.4.1. FT-Ramanovi spektri spoja Sp
Snimljeni su FT-Ramanovi spektri krutog uzorka spermina i vodene otopine
koncentracije 1×10–3 mol dm–3 (Slika 4.4.1). Molekule spermina dobro raspršuju zračenje na
što upućuju intenzivne vrpce u spektru čvrstog uzorka. U vodenoj otopini koncentracija spoja
Sp nedovoljna je za opažanje Ramanovog raspršenja te snimljeni spektar odgovara spektru
vode.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.4.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka spoja Sp i b) vodene otopine spoja Sp,
c = 1×10–3 mol dm–3.
87
U Ramanovom spektru krutog uzorka spoja Sp opažaju se vrlo intenzivne vrpce
istezanja C–H veza metilenskih skupina u području 2990–2800 cm–1. S obzirom da je spoj Sp
dostupan u obliku hidroklorida, vrpca pri 3129 cm–1 pripisana je istezanju N–H veza
protonirane amino skupine, a vrpce pri 1615 cm–1 i 1592 cm–1 deformacijama primarnih i
protoniranih sekundarnih amino skupina u strukturi molekule. Vrpce deformacija metilenskih
skupina javljaju se između 1475 cm–1 i 1200 cm–1, dok vrpcama u području 1060–925 cm–1, uz
svijanja CH2 skupina, doprinose i istezanja C–C veza okosnice molekule. Pri nižim valnim
brojevima nalaze se vrpce koje odgovaraju deformacijama i torzijama aminometilenskog
lanca.
4.4.2. SERS spektri spoja Sp
S obzirom da je optimalno pojačanje raspršenog zračenja molekula IM i PY opaženo u
koloidu pripravljenom redukcijom srebrove soli citratnim ionima, mjerni uzorci sa spojem Sp
pripremljeni su u koloidnoj suspenziji srebra 2.
4.4.2.1. Koncentracijska ovisnost
Snimljeni su SERS spektri spoja Sp u koncentracijskom području 1×10–6– 1×10–4 mol
dm–3 (Slika 4.4.2 i Tablica 4.4.1). Smanjenjem koncentracije spoja Sp intenzitet vibracijskih
vrpci slabi, pri čemu uzorak najmanje koncentracije, 1×10–6 mol dm–3, ne raspršuje zračenje
pa snimljeni spektar odgovara spektru koloidne suspenzije.
Osim vibracijskih vrpci spermina u SERS spektrima opažaju se i intenzivne vrpce
pripisane citratnim ionima na nanočesticama srebra. Anomalne vrpce pri približno 1400,
1090, 1030 i 950 cm–1 također su uočene u SERS spektrima spojeva IM i PY. Od navedenih
vrpci u spektru čiste koloidne suspenzije 2 javlja samo široka vrpca slabog intenziteta pri
1090 cm–1, pripisana istezanju C–O veza citratnih iona, dok pojačanje intenziteta i pojavu
ostalih vibracijskih vrpci citrata potiče prisutnost poliaminskih molekula u koloidnoj
suspenziji. Vrlo je vjerojatno da su interferirajuće vrpce u spektru posljedica elektrostatskih
interakcija stabilizirajućih aniona na površini metala i malih pozitivno nabijenih poliaminskih
molekula.
88
1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)(d)(e)
**
**
****
**** *
***
Slika 4.4.2. SERS spektri spoja Sp: a) c = 1×10–4 mol dm3, b) c = 5×10–5 mol dm3,
c) c = 1×10–5 mol dm3, d) c = 5×10–6 mol dm3 i e) c = 1×10–6 mol dm3. Anomalne vrpce koje
potječu od citratnih iona označene su zvjezdicom (*).
Pojačanju raspršenja zračenja molekula spermina na koloidnim nanočesticama
doprinose i elektromagnetski i kemijski mehanizam. Pozitivno nabijene protonirane molekule
spermina elektrostatski se vežu s negativno nabijenim citratnim ionima na nanočesticama
srebra i na taj se način približavaju površini metala što rezultira elektromagnetskim
pojačanjem raspršenog zračenja. Na kemijsko vezanje molekula Sp s nanočesticama srebra
upućuje vrpca pri približno 220 cm–1 koja se uočava pri koncentracijama nižim od 1×10–5 mol
dm3, a pripisuje istezanju Ag–N veze. Pri višim koncentracijama poliaminskih molekula,
kloridni ioni u uzorku doprinose intenzivnoj vrpci istezanja Ag–Cl veze (235 cm–1) koja
prekriva vrpcu istezne vibracije veze molekula Sp sa srebrom.
89
Tablica 4.4.1. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima
spoja Sp različitih koncentracija.130
Valni broj / cm–1
VibracijaFT-
Raman SERS
Sp 1×10–4
mol dm–35×10–5
mol dm–31×10–5
mol dm–35×10–6
mol dm–3
3129 ν N–H (NH3+)
2989 ν C–H (CH2)2983 ν C–H (CH2)2944 ν C–H (CH2)2923 ν C–H (CH2)2881 ν C–H (CH2)2803 ν C–H (CH2)1615 δ NH2
1592 1588 1590 1588 1589 δ NH2
1549 1546 1551 1553 δ NH2
1471 δ CH2
1431 1445 1445 1449sh 1451sh δ CH2
1416 1417 1419 1418 δ CH2
1383 1396 1396 1403sh 1403 δ CH2; citrati1323 δ CH2
1282 δ CH2
1202 δ CH2
1166 ν C–N–C1120 ν C–N–C, ν C–C1074 1083 1085 1082 1081 ν C–N; citrati1060 1068sh δ CH2, ν C–C1033 1035sh 1035sh 1034 1034 δ CH2, ν C–C; citrati1008 1017 1022 δ CH2, ν C–C970 δ CH2, ν C–C
948 949 951 951 δ CH2, ν C–C; citrati927 925 924 925 924 δ CH2, ν C–C911 907 906 908 906 δ CH2, ν C–N–C837 836 837 836 836 δ CH2
793 798 799 δ CH2
777 δ CH2, δ C–C–C755sh 752 755 755 δ C–C–C732 735 734 735 δ C–N–H
522 δ C–C–C416 δ C–N–C378 γ C–C–C343 γ C–C–C278 γ C–C–C
238 234 ν Ag–Cl222 217 ν Ag–N
γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; sh, rame
4.4.2.2. SERS spektri spoja Sp s polinukleotidima i DNA
90
Pri istraživanju interakcija spermina s jednolančanim i dvolančanim DNA/RNA
polinukleotidima te ct-DNA pripravljene su smjese u kojima je molarni omjer spoja i
polinukleotida iznosio 1/20. Koncentracija spoja Sp u svim uzorcima iznosila je 5×10–6 mol
dm–3, a koncentracija polinukleotida, izražena kao koncentracija fosfata, bila je 1×10–4 mol
dm–3. Svi uzorci pripravljeni su dodavanjem najprije spoja, a zatim polinukleotida u koloidnu
suspenziju 2.
4.4.2.2.1. SERS spektri spoja Sp s jednolančanim RNA polinukleotidima
Snimljeni su SERS spektri smjesa spoja Sp s s jednolančanim RNA polinukleotidima
poli A, poli G, poli C i poli U (Slika 4.4.3, Tablica 4.4.2). U odnosu na SERS spektar samog
spermina, u spektrima smjesa uočene su nove vrpce koje ukazuju na interakcije spoja Sp s
odgovarajućim polinukleotidima.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
1636
1335
1504
1302
1272
73583
6
924
951
1034
1081
1403
1418
1451
1355
797
798
794
796
793
Slika 4.4.3. SERS spektri a) Sp, b) Sp/poli A, c) Sp/poli G, d) Sp/poli C i e) Sp/poli U;
c(Sp) = 5×10–6 mol dm–3, Sp/poli 1/20.
91
Tablica 4.4.2. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja Sp i smjesama s jednolančanim
RNA polinukleotidima.18,130,136
Valni broj / cm–1
Vibracijac(Sp) / mol dm3 [Sp]/[poli] 1/20
1×10–4 5×10–6 Sp/poli A Sp/poli G Sp/poli C Sp/poli U
1636 citozin
1588 1589 1583 1579 1588 1588 δ NH2
1549 1553 1558 1546sh 1562 1562 δ NH2
1445 1451sh 1448 1446 1447 1448 δ CH2
1416 1418 1418sh 1414 1412 1417 δ CH2
1396 1403 1409 1397 1396sh 1398 δ CH2; citrati
1355 gvanin
1335 adenin
1302 citozin
1272 gvanin
1083 1081 1081 1081 1083 1084 ν C–N; citrati
1035sh 1034 1036 1035sh 1036sh 1037sh δ CH2, ν C–C; citrati
1017 1024 1023 1024 1028sh δ CH2, ν C–C
948 951 947 949 949 949 δ CH2, ν C–C; citrati
836 836 836 837sh 834 836 δ CH2
798 793sh 797 798 794 796 δ CH2; ν O–P–O
794 citozin
732 735 732 729 730sh 735 δ C–N–H
238 239 238 238 238 ν Ag–Cl
217 ν Ag–Nγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; sh, rame
SERS spektrima svih smjesa zajednička je vrpca srednjeg intenziteta pri približno 800
cm–1, kojoj doprinose i deformacije metilnih skupina spoja Sp i istezanja fosfatnih skupina
polinukleotida. Uslijed elektrostatskih interakcija između pozitivnog naboja spermina i
negativnih fosfata okosnice, polinukleotidni lanci približavaju se nanočesticama srebra, a
vrpca vibracije skupina, koje se sada nalaze blizu površine metala, pojačava.
U spektru smjese Sp/poli A opažena je intenzivna vrpca pri 1335 cm–1 i pripisana
istezanju peteročlanog prstena adenina. Dušikov atom u prstenu pogodan je za ostvarivanje
vodikovih veza s vodikom amino skupina spermina. Na interakciju s drugom purinskom
bazom ukazuju vrpce pri 1355 cm–1 i 1272 cm–1 u SERS spektru smjese spoja Sp s poli G,
92
koje odgovaraju vibracijama gvanina. Vrpca pri višem valnom broju posljedica je istezne
vibracije peteročlanog prstena baze, dok ona pri nižem valnom broju potječe od deformacije u
ravnini N9–H skupine gvanina.
U spektru smjese spoja Sp s poli C vrpca pri 1636 cm–1 pripisana je istezanju C5=C6
veze citozina, dok srednja vrpca pri 1302 cm–1 odgovara istezanju prstena. S obzirom da je
vrpca pri 794 cm–1 vrlo intenzivna, u odnosu na spektre ostalih smjesa s jednolančanim
polinukleotidima, pretpostavlja se da navedenoj vrpci, osim već spomenutih vibracija metilnih
skupina spermina i fosfata okosnice, doprinosi i disanje prstena citozina. U SERS spektru
spoja Sp s poli U nisu uočene vrpce koje bi upućivale na interakciju s dušičnom bazom ovog
RNA analoga.
4.4.2.2.2. SERS spektri spoja Sp s dvolančanim DNA/RNA polinukleotidima i ct-DNA
Pripravljene su smjese spoja Sp s polinukleotidima poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–
poli dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA u omjeru Sp/polinukleotid 1/20. Smjesama su
snimljeni SERS spektri koji su zatim asignirani (Slika 4.4.4, Tablica 4.4.3).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
1451
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(b)
(c)(d)
(e)
(a)
1335
73583
6
924
951
1034
1081
1403
1418
1334
732
798
797
795
796
1338
1121
1349
793
Slika 4.4.4. SERS spektri a) Sp, b) Sp/poli dAdT–poli dAdT, c) Sp/poli dGdC–poli dGdC, d)
Sp/poli rA–poli rU i e) Sp/ct-DNA; c(Sp) = 5×10–6 mol dm–3, Sp/poli 1/20.
93
Tablica 4.4.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja Sp i smjesama s dvolančanim DNA
i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,130,136
Valni broj / cm–1
VibracijaSpc = 1×10–4
mol dm–3
Spc = 5×10–6
mol dm–3
[Sp]/[poli] 1/20Sp/
poli dAdT–poli dAdT
Sp/poli dGdC–poli dGdC
Sp/poli rA–poli rU
Sp/ct-DNA
1588 1589 1590 1592 1596 1594 δ NH2
1549 1553 1565 1546 1559 1551 δ NH2
1445 1451sh 1448 1447 1447 1448 δ CH2
1416 1418 1415 1414 1411 1417 δ CH2
1396 1403 1394 1395 1394sh 1395 δ CH2; citrati
1349 gvanin
1335 1334 1338 adenin
1121 uracil
1083 1081 1090 1083 1088 1081 ν C–N; citrati
1035sh 1034 1035 1033 1038 1024 δ CH2, ν C–C; citrati
1017 δ CH2, ν C–C
948 951 950 948 947 948 δ CH2, ν C–C; citrati
836 836 834 835 830 837 δ CH2
798 793sh 798 797 795 796 δ CH2; ν O–P–O
732 735 732 732 733 δ C–N–H
732 adenin
238 217 241 239 241 239 ν Ag–N, Ag–Clγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; sh, rame
Intenzivne vrpce opažene pri 1335 cm–1 i 732 cm–1 u SERS spektru smjese spoja Sp i
dvolančanog polinukleotida poli dAdT–poli dAdT pripisane su vibracijama peteročlanog,
odnosno šesteročlanog prstena adenina. Svaki prsten baze sadrži po jedan slobodan dušikov
atom koji ne sudjeluje u Watson-Crickovom sparivanju i može sudjelovati u ostvarivanju
vodikove veze s poliaminom. S obzirom da se potencijalna vezna mjesta nalaze u različitim
utorima polinukleotida, pretpostavlja se vezanje spermina i u veliki i u mali utor adenin-timin
polinukleotida. Vezanje spermina u oba utora polinukleotida adenina i timina u skladu je s
rezultatima istraživanja interakcija biogenih poliamina s polinukleotidima Ramanovom
spektroskopijom.68 Dodatak poli dGdC–poli dGdC spoju Sp na koloidu 2 rezultira pojavom
slabe vrpce pri 1349 cm–1 u spektru, koja odgovara istezanju manjeg prstena u strukturi
94
dušične baze. Položaj dušikovog atoma u peteročlanom prstenu gvanina ukazuje na vezanje
spermina u veliki utor gvanin-citozin polinukleotida.
U spektru smjese spoja Sp s poli rA–poli rU opažena je intenzivna vrpca istezanja
peteročlanog prstena adenina pri 1334 cm–1. U odnosu na spektar spermina, uočeno je također
i vrlo široko rame pri 1121 cm–1 kojem doprinosi istezanje prstena uracila zajedno s
izvijanjem C5–H veze. Navedene vrpce upućuje na vezanje poliaminske molekule u veliki
utor dvolančanog RNA analoga.
Na vezanje molekula Sp u veliki utor nukleinske kiseline ukazuje vrlo slaba vrpca pri
1338 cm–1 u SERS spektru smjese s ct-DNA, koja odgovara istezanju peteročlanog prstena
adenina.
SERS spektri spojeva Sp, IM i PY i njihovih smjesa s dvolančanim polinukleotidima i
ct-DNA, ukazuju da se sva tri poliaminska spoja vežu s DNA/RNA polinukleotidima na isti
način, odnosno u mali i veliki utor adenin-timin polinukleotida, a samo u veliki utor gvanin-
citozin i adenin-uracil polinukleotida te ct-DNA. Pri tome interakcije istraživanih
poliaminskih molekula i polinukleotida obuhvaćaju elektrostatke interakcije između pozitivno
nabijenog dušika protoniranih amino skupina poliamina i negativnih fosfatnih skupina
okosnice polinukleotida te vodikove veze između vodikovih atoma amino skupina poliamina i
dušičnih baza polinukleotida. Aromatski prstenovi, imidazol i piridin, u strukturi IM i PY ne
utječu na mjesto vezanja poliaminskog spoja, s obzirom na utore polinukleotida, no doprinose
stabilnosti nastalih kompleksa.
4.5. Istraživanja sa spojevima PHENPOD i PYPOD
95
4.5.1. FT-Ramanovi spektri spojeva PHENPOD i PYPOD
Snimljeni su FT-Ramanovi spektri krutih uzoraka PHENPOD i PYPOD te njihovih
vodenih otopina koncentracije 6,5×10–4 mol dm–3. U spektrima krutina opažaju se intenzivne
vrpce vibracijskih modova istraživanih poliaminskih molekula, dok je koncentracija spojeva u
vodenim otopinama preniska za opažanje Ramanovih spektara (Slike 4.5.1 i 4.5.2).
U području viših valnih brojeva Ramanovog spektra krutog uzorka PHENPOD
dominiraju vrpce istezanja CH veza aromata pri 3061 cm–1 te CH veza alifatskih lanaca pri
2967 cm–1 i 2861 cm–1 (Slika 4.5.1, Tablica 4.5.1). Intenzivnim vrpcama između 1650 cm–1 i
1350 cm–1 doprinose istezne vibracije fenantrolinskog sustava i piridinskih prstenova te
deformacije metilenskih skupina. Pri 1300 cm–1 i 1271 cm–1 opažaju se vrpce deformacija u
ravnini C–H skupina fenantrolina. Intenzivna vrpca pri 1002 cm–1 pripisuje se disanju
piridina, dok jaka vrpca pri 708 cm–1 potječe od svijanja fenantrolina.137
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.5.1. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PHENPOD i b) vodene otopine
PHENPOD, c = 6,5×10–4 mol dm–3.
U Ramanovom spektru krutine PYPOD opažaju se intenzivna vrpca istezanja C–H
skupina piridinskih sustava pri 3061 cm–1 te jake vrpce antisimetričnog i simetričnog istezanja
96
C–H veza metilenskih skupina pri 2967 cm–1 odnosno 2861 cm–1 (Slika 4.5.2, Tablica
4.5.2).135 Istezanja piridinskih prstenova doprinose intenzivnim vrpcama pri 1581 cm–1 i 1254
cm–1, dok se vrlo intenzivna vrpca pri 1002 cm–1 pripisuje disanju aromatskih jedinica. Vrpce
u području 12001050 cm–1 potječu većinom od deformacija u ravnini C–H skupina piridina, a
one između 950 cm–1 i 700 cm–1 od svijanja odgovarajućih skupina izvan ravnine.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.5.2. FT-Ramanovi spektri a) krutog uzorka PYPOD i b) vodene otopine spoja
PYPOD, c = 6,5×10–4 mol dm–3.
4.5.2. SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD
97
4.5.2.1. Odabir koloida
U svrhu odabira prikladnog koloida za pripravu uzoraka, snimljeni su SERS spektri
spoja PHENPOD koncentracije 5×10–5 mol dm–3 u koloidnim suspenzijama srebra 1 i 2, u
kojima je opaženo pojačanje raspršenog zračenja ranije istraživanih spojeva (Slika 4.5.3).
U SERS spektrima uzoraka pripravljenim u obje koloidne suspenzije uočava se
pojačanje raspršenog zračenja molekula PHENPOD s površine metala, no intenzivnije kada
se spoj nalazi u suspenziji nanočestica srebra s citratnim ionima na površini. S obzirom na
svoj pozitivan naboj u mediju neutralne pH vrijednosti, pH(1) = 6,70 i pH(2) =7,69, spoj
PHENPOD se približava površini metala s koje se raspršeno zračenje pojačava. Za
pretpostaviti je, međutim, da ioni utječu na orijentaciju molekula na površini srebra, pri čemu
na koloidu srebra 2 molekule zauzimaju povoljniji položaj, koji u skladu s izbornim pravilima
na površini, rezultira većom promjenom polarizabilnosti i doprinosi pojačanju raspršenog
zračenja. Iz tog razloga uzorci spojeva PHENPOD i PYPOD za daljnja SERS istraživanja
pripravljeni su na koloidu 2.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.5.3. SERS spektri spoja PHENPOD na a) koloidu 2 i b) koloidu 1;
c(PHENPOD) = 5×10–6 mol dm–3.
4.5.2.2. Koncentracijska ovisnost
98
Snimljeni su SERS spektri spojeva PHENPOD i PYPOD u koloidnoj suspenziji
srebra 2 u koncentracijskom području 6,5×10–8–6,5×10–5 mol dm3 (Slike 4.5.4 i 4.5.5).
Smanjenjem koncentracije od 6,5×10–5 mol dm3 do 3,2×10–6 mol dm3 intenzitet vibracijskih
vrpci u spektrima se povećava, pri čemu dostiže svoj maksimum pri koncentraciji spoja
PHENPOD 6,5×10–6 mol dm3, odnosno spoja PYPOD 3,2×10–6 mol dm3. Uzorci
koncentracija nižih od 3,2×10–6 mol dm3 ne raspršuju zračenje te snimljeni spektri odgovaraju
spektru koloidne suspenzije 2. Nelinearna ovisnost intenziteta o koncentraciji spoja sa
suprotnim trendom ukazuje na utjecaj koncentracije molekula na njihov položaj na površini
nanočestica srebra. S obzirom da prema izbornim pravilima SERS spektroskopije raspršenju
zračenja najviše doprinose vibracije s promjenom polarizabilnosti okomito na površinu
metala, pri koncentraciji pri kojoj je raspršenje najviše pojačano, molekule su optimalno
položene. Pri većim koncentracijama molekule se tijesno smještaju na površini, pri čemu se
naginju u odnosu na površinu i raspršeno zračenje slabi. S druge strane, neopažanje
raspršenog zračenja pri niskim koncentracijama posljedica je malog broja molekula u sustavu,
ali i mogućnosti polaganja malobrojnih molekula paralelno površini metala, gdje promjena
polarizabilnosti ne doprinosi raspršenom zračenju.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)(e)(f)(g)
Slika 4.5.4. SERS spektri spoja PHENPOD: a) c = 6,5×10–5 mol dm3, b) c = 3,2×10–5 mol
dm3, c) c = 6,5×10–6 mol dm3, d) c = 3,2×10–6 mol dm3, e) c = 6,5×10–7 mol dm3, f) c =
3,2×10–7 mol dm3 i g) c = 6,5×10–8 mol dm3.
99
1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)(e)(f)
(g)
Slika 4.5.5. SERS spektri spoja PYPOD: a) c = 6,5×10–5 mol dm3, b) c = 3,2×10–5 mol dm3,
c) c = 6,5×10–6 mol dm3, d) c = 3,2×10–6 mol dm3, e) c = 6,5×10–7 mol dm3, f) c = 3,2×10–7
mol dm3 i g) c = 6,5×10–8 mol dm3.
U SERS spektru spoja PHENPOD uočavaju se većinom vrpce vibracijskih modova
fenantrolinskog i piridinskih sustava. U usporedbi s Ramanovim spektrom krutog uzorka
vrpca istezanja fenantrolina pomiče se s 1620 prema 1608 cm–1, dok se vrpca istezanja
piridina pri 1579 cm–1 u SERS spektru javlja pri 1590 cm–1. U SERS spektru dominira
intenzivna vrpca pri 1409 cm–1 pripisana vibraciji fenantrolina. Između 1100 i 900 cm–1
opažaju se vrpce vibracijskih modova piridina, koje ujedno karakteriziraju i SERS spektar
spoja PYPOD. Intenzivna vrpca pri 1003 cm–1 pripisuje se disanju piridina, dok vrpcama
srednjeg intenziteta u navedenom području doprinose svijanja u ravnini i izvan nje CH
skupina piridina. U području niskih valnih brojeva opažaju se vrpce pri 227 i 226 cm–1 za
PHENPOD odnosno PYPOD. Navedenim vrpcama doprinose istezanja AgCl veze između
nanočestica srebra i kloridnih iona iz sastava istraživanih spojeva, te AgN veze nastale
vezanjem molekula preko dušikovih atoma s površinom srebra. Za pretpostaviti je stoga da se
raspršeno zračenje pojačava i elektromagnetskim i kemijskim mehanizmom.
100
Tablica 4.5.1. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima
spoja PHENPOD različitih koncentracija.130,137
Valni broj / cm–1
VibracijaFT-Raman SERS
PHENPOD 6,5×10–5
mol dm–33,2×10–5
mol dm–36,5×10–6
mol dm–33,2×10–6
mol dm–3
3061 νas C–H piridin
2967 νas C–H (CH2)
2861 νs C–H (CH2)
1638 ν CC/CN fenantrolin
1620 1606 1607 1608 1609 ν fenantrolin
1579 1585 1589 1590 1586 ν piridin
1542 ν fenantrolin
1506 1502 1503 1503 1504 ν fenantrolin
1465 1446 1448 1445 1447 ν piridin, sc CH2
1423 ν fenantrolin
1408 1408 1408 1409 1410 ν fenantrolin
1356 ν piridin
1300 1298 1299 1298 1298 δip C–H fenantrolin, tw CH2
1271 δip C–H fenantrolin
1253 ν piridin
1155 δip C–H piridin
1089 1081 1092 1086 1083 δip C–H piridin
1066 δip C–H piridin
1002 1003 1003 1003 1004 ν piridin (disanje prstena)
952 950 947 950 951 δ piridin
932 922 926 924 924 δ fenantrolin
891 δoop C–H piridin
842 837 837 γ piridin
775 δoop C–H fenantrolin
735 739 739 735 737 δoop C–H fenantrolin
708 707 710 708 707 δoop C–H piridin
231 ν AgCl; ν AgN
227 227 227 ν AgCl; ν AgN γ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame; tw, savijanje; sc, striženje
101
Tablica 4.5.2. Vibracijske vrpce u FT-Ramanovom spektru krutog uzorka i SERS spektrima
spoja PYPOD različitih koncentracija.130,135
Valni broj / cm–1
VibracijaFT-Raman SERS
PYPOD 6,5×10–5
mol dm–33,2×10–5
mol dm–36,5×10–6
mol dm–33,2×10–6
mol dm–3
3069 νas C–H piridin
2965 νas C–H (CH2)
2866 νs C–H (CH2)
1596sh 1597 1596 1596 1595 ν piridin
1581 1579 1579 1579 1580 ν piridin
1460 1446 1441 ν piridin, sc CH2
1444sh ν piridin
1400 1400 citrati
1397 1391 1394 1398 1397 ν piridin
1353 ν piridin
1294 ν CC piridin, tw CH2
1254 1260 1263 1263 1259 ν piridin
1158 1152 1157 1159 1156 δip C–H piridin
1092 1089 1091 1081 1082 δip C–H piridin
1069 δip C–H piridin
1002 1003 1003 1005 1005 ν piridin (disanje prstena)
952sh 951 949 950 951 δoop C–H piridin
909 δoop C–H piridin
847 γ piridin
711 704 711 712 708 δoop C–H piridin
227 224 225 226 ν AgCl; ν AgNγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine; s, simetrično; as, antisimetrično; sh, rame; tw, savijanje; sc, striženje
4.5.2.3. Utjecaj pufera
Utjecaj kakodilatnog pufera, u kojem su pripravljene otopine polinukleotida, istražen
je snimanjem SERS spektara uzoraka spojeva PHENPOD odnosno PYPOD, c = 5×10–6 mol
dm–3, na koloidu 2, u prisutnosti kakodilatnog pufera u uzorku. U SERS spektrima uzoraka s
puferom nisu uočene nove vrpce koje bi potjecale od kakodilatnog pufera. Nešto intenzivnije i
oštrije vrpce istraživanih spojeva posljedica su agregacije nanočestica srebra ionima u sastavu
pufera. U spektru spoja PYPOD stoga su opažene i vrpce oko 1400 cm–1 koje su u spektru
uzorka bez pufera bile prekrivene anomalnom vrpcom citratnih iona.
102
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.5.6. SERS spektri spoja PHENPOD a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog
pufera; c(PHENPOD) = 5×10–6 mol dm3.
3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika 4.5.7. SERS spektri otopine PYPOD a) s kakodilatnim puferom i b) bez kakodilatnog
pufera; c(PYPOD) = 5×10–6 mol dm3.
4.5.2.4. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s polinukleotidima i ct-DNA
103
Pri istraživanju interakcija spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA
polinukleotidima i dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA pripravljene su
smjese u omjeru [spoj]/[polinukloetid] 1/20. Pri tome je koncentracija polinukleotida izražena
kao koncentracija fosfata iznosila 1×10–4 mol dm3, a koncentracija poliaminskih spojeva bila
je 5×10–6 mol dm3. Uzorci su pripravljeni u koloidnoj suspenziji srebra 2 dodatkom najprije
istraživanog spoja, a zatim odgovarajućeg polinukleotida.
4.5.2.4.1. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim RNA
polinukleotidima
Snimljeni su SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s jednolančanim
polinukleotidima adenina, gvanina, citozina i uracila te asiginirane vrpce u spektrima (Slike
4.5.8 i 4.5.9, Tablice 4.5.3 i 4.5.4).
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1328
1558
1608
1590 15
03
1408
1298
1089 10
02
710
740
789
1633
795
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika 4.5.8. SERS spektri a) PHENPOD, b) PHENPOD/poli A, c) PHENPOD/poli G, d)
PHENPOD/poli C i e) PHENPOD/poli U; c(PHENPOD) = 5×10–6 mol dm–3,
PHENPOD/poli 1/20.
U spektru smjese PHENPOD/poli A opažene su dvije vrpce koje odgovaraju
vibracijama dušične baze. Slaba vrpca pri 1558 cm–1 pripisana je svijanju NH2 skupine
104
adenina, dok vrpca srednjeg intenziteta pri 1328 cm–1 potječe od istezanja peteročlanog
prstena adenina. Dušikov atom manjeg prstena baze i amino skupina adenina potencijalna su
mjesta za stvaranje vodikovih veza s malim molekulama. Za pretpostaviti je da se
jednolančani polinukleotid adenina veže s molekulama PHENPOD na površini nanočestica
na način pri kojem su dušične baze usmjerene prema površini srebra, a fosfatna okosnica
položena u vodenom sloju uz površinu metala. U SERS spektru smjese spoja PHENPOD s
poli G nisu uočene vrpce vibracija dušične baze koje bi ukazivale na vezanje ovih malih
molekula s gvaninom.
Vrpce pri 1633 cm–1 i 789 cm–1 u SERS spektru smjese PHENPOD/poli C upućuju na
interakcije molekula PHENPOD s citozinom. Naime, vrpca nižem valnom broju odgovara
vibraciji disanja citozinskog prstena, dok vrpca pri 1633 cm–1 potječe od istezanja C5=C6
veze citozina. Slaba vrpca pri 795 cm–1 opažena je u spektru smjese PHENPOD s
polinukleotidom uracila i pripisana disanju prstena uracila.
Tablica 4.5.3. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PHENPOD i smjesama s
jednolančanim RNA polinukleotidima.18,136,137
Valni broj / cm1
105
1633 citozin
1608 1607 1607 1609 1607 ν fenantrolin
1590 1590 1587 1591 1589 ν piridin
1558 adenin
1503 1503 1503 1505 1503 ν fenantrolin
1444 1449 1448 1451 1448 ν piridin
1408 1409 1409 1411 1409 ν fenantrolin
1328 adenin
1298 1299 1297 1299 1298 δip C–H fenantrolin
1089 1089 1087 1095 1091 δip C–H piridin
1002 1003 1003 1005 1003 ν piridin (disanje prstena)
950 949 948 952 950 δ piridin
924 923 923 924 923 δ fenantrolin
837 833 831 831 834 γ piridin
795 uracil
789 citozin
740 741 741 741 741 δoop C–H fenantrolin
710 707 706 708 706 δoop C–H piridin
227 230 228 227 231 ν AgCl; ν AgNγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine
Za razliku od SERS spektara smjesa spoja PHENPOD s jednolančanim RNA
polinukleotidima, u spektrima smjesa spoja PYPOD uočava se veći broj vrpci koje potječu od
vibracijskih modova dušičnih baza, a posljedica su interakcija s polinukleotidima.
106
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1579
1446
1387
1260
1156 10
91
1006
950 70
772
1
1331
1493
1556
1269
1558 13
35
792
122312
97
1634
794
1240
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika 4.5.9. SERS spektri a) PYPOD, b) PYPOD/poli A, c) PYPOD/poli G, d) PYPOD/poli
C i e) PYPOD/poli U; c(PYPOD) = 5×10–6 mol dm–3, PYPOD/poli 1/20.
U SERS spektru smjese PYPOD/poli A rame pri 721 cm–1 pripisuje se disanju, a slaba
vrpca pri 1493 cm–1 istezanju veza šesteročlanog prstena adenina. Istezna vibracija prstena s
pet atoma doprinosi intenzivnoj vrpci pri 1331 cm–1. Vrpca pri 1556 cm–1 potječe od svijanja
amino skupine adenina. U spektru smjese spoja PYPOD s polinukleotidom gvanina rame pri
1269 cm–1 odgovara deformaciji u ravnini N9–H skupine, dok se vrpca pri 1335 cm–1 pripisuje
istezanju peteročlanog prstena dušične baze. Uslijed deformacije NH2 skupine gvanina uočava
se slaba vrpca pri 1558 cm–1.
Na interakcije spoja PYPOD s polinukleotidom citozina upućuju vrpce istezanja
prstena pri 1297 cm–1 i 792 cm–1, te vrpca svijanja izvan ravnine C5–H i C6–H skupina pri
1223 cm–1. Istezanje C5=C6 veze citozina rezultira vrpcom u spektru pri 1634 cm–1. U SERS
spektru smjese PYPOD/poli U vrpca disanja prstena uracila opaža se pri 794 cm–1, a vrpca
svijanja C–H skupina pri 1240 cm–1.
107
Tablica 4.5.4. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PYPOD i smjesama s
jednolančanim RNA polinukleotidima.18,135,136
Valni broj / cm–1
VibracijaPYPOD
[PYPOD]/[poli] 1/20PYPOD/
poli APYPOD/
poli GPYPOD/
poli CPYPOD/
poli U1634 citozin
1596 1598 1598 1602 1597 ν piridin
1579 1579 1578 1579 1579 ν piridin
1558 gvanin
1556 adenin
1493 adenin
1446 1454 1448 1444 1447 ν piridin
1400 1395 1395 1396 1392 citrati
1387 1382 1383 1382 1383 ν piridin
1335 gvanin
1331 adenin
1297 citozin
1269 gvanin
1260 1264 1260 1266 1266 ν piridin
1240 uracil
1223 citozin
1156 1156 1151 1157 1154 δip C–H piridin
1091 1090 1092 1089 1089 δip C–H piridin
1006 1003 1003 1002 1004 ν piridin (disanje prstena)
950 951 951 950 951 δoop C–H piridin
847 854 854 853 853 γ piridin
794 uracil
792 citozin
721 adenin
712 713 712 707 712 δoop C–H piridin
225 229 228 225 230 ν AgCl; ν AgNγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine
108
4.5.2.4.2. SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD i PYPOD s dvolančanim DNA i RNA
polinukleotidima te ct-DNA
Snimljeni su i asignirani SERS spektri smjesa spojeva PHENPOD odnosno PYPOD s
dvolančanim polinukleotidima zavojite strukture poli dAdT–poli dAdT, poli dGdC–poli
dGdC, poli rA–poli rU te ct-DNA (Slike 4.5.10 i 4.5.11, Tablice 4.5.5 i 4.5.7).
Nove vrpce koje ukazuju na interakcije spoja PHENPOD s polinukleotidima uočene
su jedino u SERS spektru smjese s poli dAdT–poli dAdT. Slabe vrpce pri 1324 cm–1 i 724 cm–
1 pripisane su vibracijama prstenova adenina koji imaju dušikove atome slobodne za vodikovo
vezanje i u velikom i u malom utoru. Iako RNA analog sadrži adenin u strukturi, u spektru
smjese spoja PHENPOD s poli rA–poli rU nazire se tek rame vibracije adenina pri 1326 cm–
1. S obzirom da u spektru smjese PHENPOD/poli rA–poli rU izostaje vrpca adenina pri
nižem valnom broju, za pretpostaviti je da se PHENPOD vrlo slabo veže samo u veliki utor
dvolančanog RNA polinukleotida.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1608
1590
1503
1408
1298
1089 10
02
740 71
072
4
1324
1326
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika 4.5.10. SERS spektri a) PHENPOD, b) PHENPOD/poli dAdT–poli dAdT,
c) PHENPOD/poli dGdC–poli dGdC, d) PHENPOD/poli rA–poli rU i e) PHENPOD/ct-
DNA; c(PHENPOD) = 5×10–6 mol dm–3, PHENPOD/poli 1/20.
109
U SERS spektrima smjesa spoja PHENPOD s gvanin-citozin polinukleotidom te s ct-
DNA nisu uočene nove vrpce. Budući da SERS spektri nisu ukazali na interakcije spoja
PHENPOD s jednolančanim polinukleotidom gvanina, a kisik karbonilne skupine citozina
sudjeluje u sparivanju dušičnih baza dvostruke uzvojnice, za očekivati je da se male molekule
neće vezati u utore poli dGdC–poli dGdC polinukleotida. Iako 58,1 % strukture ct-DNA čine
adenin-timin parovi baza prema kojima su molekule PHENPOD pokazale afinitet vezanja,
vrpce koji bi ukazale na interakcije sa skupinama u utorima nukleinske kiseline ne uočavaju
se u SERS spektru s ct-DNA.
Tablica 4.5.5. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PHENPOD i smjesama s
dvolančanim DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,136,137
Valni broj / cm–1
VibracijaPHENPOD
[PHENPOD]/[poli] 1/20PHENPOD/ poli dAdT–poli dAdT
PHENPOD/poli dGdC–poli dGdC
PHENPOD/poli rA–poli rU
PHENPOD/ct-DNA
1608 1607 1607 1608 1607 ν fenantrolin
1590 1589 1589 1590 1590 ν piridin
1503 1504 1503 1503 1503 ν fenantrolin
1444 1448 1448 1447 1448 ν piridin
1409 1411 1409 1410 1409 ν fenantrolin
1326 adenin
1324 adenin
1298 1298 1297 1298 1298 δip C–H fenantrolin
1089 1094 1092 1092 1092 δip C–H piridin
1002 1003 1002 1003 1003 ν piridin (disanje prstena)
950 950 950 948 950 δ piridin
924 923 924 926 924 δ fenantrolin
837 837 837 836 837 γ piridin
740 737sh 740 740 740 δoop C–H fenantrolin
724 adenin
710 708 706 708 706 δoop C–H piridin
227 232 229 234 229 ν AgCl; ν AgNγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine
110
S obzirom na prisutnost fenantrolinskog sustava u strukturi molekule PHENPOD,
vrlo sličnog fenantridinskom sustavu kojim se male molekule poput etidijeva bromida
interkaliraju u dvostruku uzvojnicu nukleinske kiseline,37 istraženo je interkaliranje spoja
PHENPOD s dvolančanim polinukleotidima. Na temelju SERS spektara interkalirajućih
spojeva s ct-DNA utvrđeno je da smanjenje Ramanovog intenziteta, kao posljedica umetanja
planarnog aromatskog sustava između parova baza nukleinske kiseline, upućuje na
interkaliranje.138 U svrhu opažanja promjene intenziteta raspršenog zračenja koje potječe od
fenantrolina, odabrana je intenzivna vrpca pri 1409 cm–1. Kako bi se uklonili faktori
instrumenta, kao što su promjenjiva snaga lasera i temperatura detektora, koji utječu na
intenzitet Ramanovog raspršenja, izračunati su omjeri intenziteta odgovarajućih vrpci u SERS
spektru. Budući da se piridinski prstenovi ne interkaliraju, intenzitet vrpce piridina pri 1003
cm–1 odabran je kao referentna vrijednost. Omjer intenziteta vrpci fenantrolina i piridina,
I1409/I1003, izračunat je u spektru spoja PHENPOD te u spektrima njegovih smjesa s
dvolančanim polinukleotidima (Tablica 4.5.6). Za spoj PHENPOD omjer intenziteta,
I1409/I1003, iznosio je 1,643, dok su vrijednosti za smjese s poli dAdT–poli dAdT i poli dGdC–
poli dGdC bile manje, 1,417 i 1,432, i kao takve upućivale na djelomično interkaliranje
fenantrolina u dvostruku uzvojnicu DNA analoga. Za razliku od vrijednosti u spektrima s
DNA polinukleotidima, omjer intenziteta u spektru smjese s poli rA–poli rU 1,769, nije
ukazivao na interkaliranje spoja PHENPOD u uzvojnicu RNA polinukleotida.
Tablica 4.5.6. Omjeri intenziteta vibracijskih vrpci fenantrolinskog sustava i piridinskih
prstenova u SERS spektrima spoja PHENPOD i njegovih smjesa s dvolančanim
polinukleotidima.
I1409/I1003
PHENPODPHENPOD/poli dAdT–poli dAdT
PHENPOD/poli dGdC–poli dGdC
PHENPOD/poli rA–poli rU
PHENPOD/ct-DNA
1,643 1,417 1,432 1,769 1,522
U spektru smjese spoja PYPOD s poli dAdT–poli dAdT, uz već dobro poznate vrpce
vibracija adenina pri 1332 cm–1 i 724 cm–1, opažena je i nova vrpca pri 1377 cm–1 koja je
pripisana simetričnoj deformaciji CH3 skupine timina u velikom utoru polinukleotida. Uz
vrpce koje upućuju na interakcije malih molekula s dušičnim bazama, vrpca pri 834 cm–1 koja
111
odgovara istezanju fosfodiesterske OPO veze, te porast intenziteta vrpce pri 1092 cm–1 kojoj
doprinosi simetrično istezanje veza fosfodioksi skupine, ukazuju na smještanje okosnice
polinukleotida blizu površine metala. Za pretpostaviti je da se molekule spoja PYPOD čvrsto
vežu u mali i veliki utor dvolančanog polinukleotida adenina i timina.
Usprkos opaženom vezanju s jednolančanim polinukleotidima gvanina, citozina i
uracila, u spektrima smjesa spoja PYPOD s dvolančanim polimerima gvanina i citozina te
adenina i uracila nisu uočene vibracijske vrpce koje bi ukazale na interakcije malih molekula
u utorima navedenih DNA i RNA analoga.
U spektru smjese spoja PYPOD s ct-DNA vrlo slabe vrpce 1377 cm–1 i 725 cm–1
posljedica su interakcija malih molekula sa sljedovima adenin-timina parova baza nukleinske
kiseline te ukazuju na vezanje spoja u mali i veliki utor dvostruke uzvojnice.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
1579
1446
1387
1260
1156 10
91
1006
950 70
772
4
1332
1377
725
834
1377
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
1092
Slika 4.5.11. SERS spektri a) PYPOD, b) PYPOD/poli dAdT–poli dAdT, c) PYPOD/poli
dGdC–poli dGdC, d) PYPOD/poli rA–poli rU i e) PYPOD/ct-DNA; c(PYPOD) = 5×10–6
mol dm–3, PYPOD/poli 1/20.
S obzirom da nije bilo moguće razlikovati vrpce vibracija središnjeg piridinskog
sustava i piridinskih prstenova u cikličkim strukturama na krajevima molekule, nije istraženo
vezanje piridina. Mali pomaci odgovarajućih vibracijskih vrpci, međutim, opaženi su u
112
spektrima s poli dAdT–poli dAdT i ct-DNA te se pripisuju vezanju u utore odgovarajućih
polinukleotida.
Tablica 4.5.7. Vibracijske vrpce u SERS spektrima spoja PYPOD i smjesama s dvolančanim
DNA i RNA polinukleotidima te ct-DNA.18,135,136
Valni broj / cm–1
VibracijaPYPOD
[PYPOD]/[poli] 1/20PYPOD/
poli dAdT–poli dAdT
PYPOD/poli dGdC–poli dGdC
PYPOD/poli rA–poli rU
PYPOD/ct-DNA
1597 1599 1597 1597 1599 ν piridin
1579 1580 1579 1580 1579 ν piridin
1446 1451 1447 1446 1450 ν piridin
1400 1396 1395 1396 1396 citrati
1383 1383 1383 1382 1384 ν piridin
1377 1377 timin
1332 adenin
1260 1264 1269 1261 1267 ν piridin
1156 1156 1151 1158 1158 δip C–H piridin
1091 1092 1090 1094 1092 δip C–H piridin,ν O–P‒O
1006 1005 1003 1005 1003 ν piridin(disanje prstena)
950 950 951 949 951 δoop C–H piridin
853 854 854 853 853 γ piridin
834 okosnica (ν O–P‒O)
725 adenin
724 adenin
712 713 712 712 713 δoop C–H piridin
235 230 228 233 228 ν AgCl; ν AgNγ, torzija; ν, istezanje; δ, deformacija; ip, u ravnini; oop, izvan ravnine
113
5. ZAKLJUČAK
Istraživane male molekule obuhvatile su interkalator s diazapirenskim sustavom u
strukturi (ADAP) te lančanu poliaminsku molekulu (Sp) i molekule (IM, PY, PHENPOD,
PYPOD) koje se zahvaljujući aminometilenskim lancima i aromatskim prstenovima s
dušikom preferirano vežu u utore, uz mogućnost djelomičnog interkaliranja fenantrolinskim
jedinicama.
U svrhu primjene metalnog supstrata nužnog za površinsko pojačanje raspršenog
zračenja, pripravljene su koloidne suspenzije srebra koje su se razlikovale prema veličini
nanočestica srebra i specijama na njihovoj površini. Pojačanje Ramanovog raspršenja malih
molekula opaženo je na koloidima srebra pripravljenim redukcijom srebrova nitrata s
hidroksilamin hidrokloridom i trinatrijevim citratom, koji su nosili negativan naboj kloridnih
iona odnosno citratnih iona i njihovih oksidacijskih produkata na površini metala. Uslijed
privlačnih elektrostatskih sila između negativnog naboja na površini nanočestica i pozitivnog
naboja u strukturi istraživanih molekula, molekule se smještaju blizu površine ili vežu s
površinom metala, pri čemu se raspršeno zračenje elektromagnetski i kemijski pojačava. Iako
su ioni na nanočesticama srebra pripravljenim redukcijom srebrove soli s
etilendiamintetraoctenom kiselinom također negativnog naboja, svojom veličinom sprječavaju
učinkovitu adsorpciju malih molekula na površinu. Prostornu barijeru između malih molekula
i površine metala čini neutralan sloj polimera koji stabilizira koloid srebra pripravljen
redukcijskim postupkom s natrijevim borhidridom, pri čemu pojačanje Ramanovog raspršenja
izostaje.
Snimljeni su i asignirani Ramanovi spektri krutih uzoraka svih istraživanih spojeva.
Milimolarne koncentracije njihovih vodenih otopina bile su nedovoljne za opažanje
normalnog Ramanovog raspršenja, međutim, u odgovarajućim koloidnim suspenzijama srebra
sve male molekule intenzivno su raspršivale zračenje pri mikromolarnim koncentracijama. U
prisutnosti kakodilatnog pufera nanočestice srebra agregiraju te se intenzitet raspršenog
zračenja molekula na površini metala dodatno pojačava.
S obzirom na izborna pravila na površini koja vrijede u SERS spektroskopiji,
promjena intenziteta raspršenog zračenja u koncentracijski ovisnim spektrima pripisana je
različitom smještaju molekula na površini metala uvjetovanom ravnotežom dimerizacije i
koncentracijom molekula na površini. Povećanje intenziteta sa smanjenjem koncentracije
spojeva ADAP te PHENPOD i PYPOD posljedica je pomaka ravnoteže dimerizacije prema
114
monomerima interkalirajućih molekula, odnosno smanjivanja broja malih molekula na
površini, koje se aromatskim sustavima smještaju okomito na površinu metala pri čemu
najjače raspršuju zračenje. Položaj molekula fleksibilnije strukture, IM i PY te Sp, na
nanočesticama srebra ne ovisi o koncentraciji te se intenzitet raspršenog zračenja smanjuje s
koncentracijom poliaminskih molekula.
Vodeći se činjenicom da se u SERS spektrima smjesa malih molekula s
polinukleotidima opažaju vrpce vibracija strukturnih dijelova polinukleotida koji sudjeluju u
interakcijama s molekulama na površini metala, predložena su vezna mjesta i načini vezanja
istraživanih molekula s jednolančanim RNA polinukleotidima, dvolančanim DNA i RNA
polinukleotidima te ct-DNA.
U SERS spektrima interkalatora i ct-DNA, međutim, na način vezanja ne upućuje
pojava vrpci vibracija nukleinske kiseline, već promjena intenziteta raspršenog zračenja.
Umetanjem diazapirenskog sustava molekule između parova baza uzvojnice, molekule spoja
ADAP udaljavaju se od metalne površine, pri čemu raspršeno zračenje slabi. Uz
interkaliranje, kao dominantan način vezanja, raspršenje zračenja opaženo pri ekvimolarnim
omjerima smjesa s ct-DNA upućuje na vezanje malih molekula s vanjske strane uzvojnice
potaknuto elektrostatskim interakcijama i vodikovim vezama s fosfatima i šećerom iz
okosnice.
SERS spektri poliaminskih spojeva s jednolančanim RNA polinukleotidima ukazuju
da sve istraživane male molekule ostvaruju interakcije, najvjerojatnije vodikovim vezama, s
dušičnim bazama poli A, poli G, poli C i poli U, osim spoja PHENPOD u čijem spektru nisu
opažene vrpce koje bi upućivale na vezanje s polinukleotidom gvanina.
Male molekule spojeva IM i PY vežu se i u mali i u veliki utor dvostruke uzvojnice
polinukleotida poli dAdT–poli dAdT, dok interakcije s dušičnim bazama stvaraju samo u
velikom utoru polinukleotida poli dGdC–poli dGdC i poli rA–poli rU. U malom utoru
polinukleotida koji sadrži gvanin i citozin, amino skupina gvanina sterički ometa vezanje
malih molekula, dok širi i plići mali utor dvolančanog RNA polinukleotida, u odnosu na mali
utor DNA analoga, onemogućava učinkovito vezanje malih molekula. Poliaminske molekule
vežu se samo u veliki utor ct-DNA.
Spoj Sp, koji po strukturi odgovara aminometilenskim poveznicama u strukturi
molekula IM i PY, veže se na isti način s DNA/RNA polinukleotidima kao i poliaminske
molekule s malim aromatskim jedinicama u strukturi. Elektrostatske interakcije između
pozitivno nabijenog dušika protoniranih amino skupina poliamina i negativnih fosfatnih
skupina okosnice polinukleotida te vodikove veze između vodikovih atoma amino skupina
115
poliamina i dušičnih baza polinukleotida odgovorne su za vezanje spermina u utore
polinukleotida.
Molekule spojeva složenije strukture PHENPOD i PYPOD, koje sadrže
aminometilenske lance s cikličkim sustavima s piridinom na krajevima, vezane na fenantrolin,
odnosno piridin, u središtu molekule, vežu se u mali i veliki utor dvolančanog polinukleotida
adenina i timina. Nije uočeno vezanje niti jednog od ova dva poliaminska spoja u utore
polinukleotida poli dGdC–poli dGdC, dok slabe vrpce u spektru spoja PHENPOD s poli rA–
poli rU ukazuju na slabe interakcije s dušičnim bazama u velikom utoru dvolančanog RNA
polinukleotida. Vezanje u utore ct-DNA opaženo je jedino za molekulu sa središnjim
piridinskim prstenom pri čemu se pretpostavlja smještanje malih molekula u veliki utor
nukleinske kiseline. Utvrđeno je, međutim, za spoj PHENPOD, da se osim vezanja u utore
adenin-timin polinukleotida, fenantrolinskim sustavom interkalira u dvostruku uzvojnicu
nekih DNA analoga.
116
6. LITERATURNA VRELA
1. P. Zhao, L.-C. Xu, J.-W. Huang, B. Fu, H.-C. Yu, W.-H. Zheng, J. Chen, J.-H. Yao, L.-N.
Ji, Bioorg. Chem. 36 (2008) 278–287.
2. R. M. Burger, K. Drlica, B. Birdsall, J. Biol. Chem. 269 (1994) 25978–25985.
3. S. Rauf, J. J. Gooding, K. Akhtar, M. A. Ghauri, M. Rahman, M. A. Anwar, A. M.
Khalid, J. Pharm. Biomed. Anal. 37 (2005) 205–217.
4. R. Aroca u Surface-enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West
Sussex, 2006.
5. R. Dahm, Hum. Genet. 122 (2008) 565–581.
6. M. E. Jones, Yale J. Biol. Med. 26 (1953) 80–97.
7. E. Chargaff, E. Vischer, R. Doniger, C. Green, F. Misani, J. Biol. Chem. 177 (1949) 405–
416.
8. A. D. Hershey, M. Chase, J. Gen. Physiol. 26 (1952) 36–56.
9. R. E. Franklin, R. G. Gosling, Nature 171 (1953) 740–741.
10. J. D. Watson, F. H. C. Crick, Nature 171 (1953) 737–738.
11. J. D. Watson, F. H. C. Crick, Nature 171 (1953) 964–967.
12. M. Meselson, F. W. Stahl, PNAS 44 (1958) 671–682.
13. J. H. Matthaei, O. W. Jones, R. G. Martin, M. W. Nirenberg, PNAS 48 (1962) 666–677.
14. J. G. Moffat, H. G. Khorana, J. Am. Chem. Soc. 83 (1961) 663–675.
15. R. W. Holley, G. A. Everett, J. T. Madison, A. Zamir, J. Biol. Chem. 240 (1965) 2122–
2128.
16. J. M. Berg, J. L. Tymoczko, L. Stryer, Biochemistry, Fifth edition, W. H. Freeman and
Company, New York, 2002.
17. S. C. Harvey, M. Prabhakaran, J. Am. Chem. Soc. 108 (1986) 6128–6136.
18. K. Nakamoto, M. Tsuboi, G. D. Strahan u Drug-DNA Interactions: Structures and
Spectra, John Wiley & Sons, New Jersey, 2008.
19. S. Neidle, Principles of Nucleic Acid Structure, Elsevier, London, 2008.
20. L. Clowney, S. C. Jain, A. R. Srinivasan, J. Westbrook, W. K. Olson, H. M. Berman, J.
Am. Chem. Soc. 118 (1996) 509–518.
21. J. Šponer, H. A. Gabb, J. Leszczynski, P. Hobza, Biophys. J. 73 (1997) 76–87.
22. C. F. Guerra, F. M. Bickelhaupt, J. G. Snijders, E. J. Baerends, J. Am. Chem. Soc. 122
(2000) 4117–4128.
117
23. A. Herbert, A. Rich, J. Biol. Chem. 271 (1996) 11595–11598.
24. H. Pearson, Nature 441 (2006) 398–401.
25. S. A. Gerbi, A.-K. Bielinsky. Curr. Opin. Genetics Dev. 12 (2002) 243–248.
26. a) C. Bailly, Curr. Med. Chem. 7 (2000) 39–58.;
b) D. A. Burden, N. Osheroff, Biochim. Biophys. Acta 1400 (1998) 139–154.;
c) R. Garcia-Carbonero, J. G. Supko, Clin. Cancer Res. 8 (2002) 641–661.
27. a) T. Hermann, E. Westhof, Curr. Opin. Biotechnol. 9 (1998) 66–73.;
b) L. Guan, M. D. Disney, ACS Chem. Biol. 7 (2012) 73–86.;
c) Y. Tor, Angew. Chem. Int. Ed. 38 (1999) 1579–1582.
28. R. Baliga, D. M. Crothers, PNAS 97 (2000) 7814–7818.
29. I. Ch. Gherghi, S. T. Girousi, A. N. Voulgaropoulos, R. Tzimou-Tsitouridou, Talanta 61
(2003) 103–112.
30. K. Shishido, S. Haruna, C. Yamamura, H. Iitsuka, H. Nemoto, Y. Shinohara, M. Shibuya,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 7 (1997) 2617–2622.
31. M. A. Fuertes, C. Alonso, J. M. Pérez, Chem. Rev. 103 (2003) 645–662.
32. L. S. Lerman, J. Mol. Biol. 3 (1961) 18–30.
33. L. Strekowski, B. Wilson, Mutat. Res. 623 (2007) 3–13.
34. Q. Gao, L. D. Williams, M. Egli, D. Rabinovich, S.-L. Chen, G. J. Quigley, A. Rich, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 2422–2426.
35. G. Bischoff, S. Hoffmann, Curr. Med. Chem. 9 (2002) 321–348.
36. S. Nafisi, A. A. Saboury, N. Keramat, J.-F. Neault, H.-A. Tajmir-Riahi, J. Mol. Struct.
827 (2007) 35–43.
37. C. Laughton, B. Luisi, J. Mol. Biol. 288 (1998) 953–963.
38. J. M. Benevides, G. J. Thomas Jr., Biochemistry 44 (2005) 2993–2999.
39. J. E. Coury, L. McFail-Isom, L. D. Williams, L. A. Bottomley, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
93 (1996) 12283–12286.
40. F. Sha, F.-M. Chen, Biophys. J. 79 (2000) 2095–2104.
41. R. D. Snyder, J. W. Green, Mutat. Res. 488 (2001) 151–169.
42. W. A. Denny, Curr. Med. Chem. 9 (2002) 1655–1665.
43. S. M. Nelson, L. R. Ferguson, W. A. Denny, Mutat. Res. 623 (2007) 24–40.
44. S. Neidle, Nat. Prod. Rep. 18 (2001) 291–309.
45. D. E. Wemmer, Biopolymers 52 (1999/2000) 197–211.
46. W. C. Tse, D. L. Boger, Chem. Biol. 11 (2004) 1607–1617.
47. J. Lah, G. Vesnaver, J. Mol. Biol. 342 (2004) 73–89.
118
48. P. Cozzi, Il Farmaco 55 (2000) 168–173.
49. L. D. Higgins, M. S. Searle, Chem. Commun. (1999) 1861–1862.
50. E. Gavathiotis, G. J. Sharman, M. S. Searle, Nucleic Acids Res. 28 (2000) 728–735.
51. D. Vlieghe, J. Sponer, L. Van Meervelt, Biochemistry 38 (1999) 16443–16451.
52. A. J. Hampshire, K. R. Fox, Biochimie 90 (2008) 988–998.
53. X. Cai, P. J. Gray Jr., D. D. Von Hoff, Cancer Treat. Rev. 35 (2009) 437–450.
54. R. Chen, C.-S. Liu, H. Zhang, Y. Guo, X.-H. Bu, M. Yang, J. Inorg. Biochem. 101 (2007)
412–421.
55. H. Xu, K.-C. Zheng, Y. Chen, Y.-Z. Li, L.-J. Lin, H. Li, P.-X. Zhang, L.-N. Ji, Dalton
Trans. (2003) 2260–2268.
56. C. J. Burrows, S. E. Rokita, Acc. Chem. Res. 27 (1994) 295–301.
57. Z. H. Siddik, Oncogene 22 (2003) 7265–7279.
58. A.-M. Florea, D. Büsselberg, Cancers 3 (2011) 1351–1371.
59. F. I. Raynaud, F. E. Boxall, P. M. Goddard, M. Valenti, M. Jones, B. A. Murrer, M.
Abrams, L. R. Kelland, Clin. Cancer Res. 3 (1997) 2063–2074.
60. H. T. Chifotides, K. R. Dunbar, Acc. Chem. Res. 38 (2005) 146–156.
61. J.-G. Liu, B.-H. Ye, H. Li, Q.-X. Zhen, L.-N. Ji, Y.-H. Fu, J. Inorg. Biochem. 76 (1999)
265–271.
62. Y.-G. Fang, J. Zhang, S.-Y. Chen, N. Jiang, H.-H. Lin, Y. Zhang, X.-Q. Yu, Bioorg. Med.
Chem. 15 (2007) 696–701.
63. A. J. Ruiz-Chica, A. Soriano, I. Tuñón, F. M. Sánchez-Jiménez, E. Silla, F. J. Ramírez,
Chem. Phys. 324 (2006) 579–590.
64. J. A. Collado, F. J. Ramírez, J. Raman Spectrosc. 30 (1999) 391–397.
65. K. Igarashi, K. Kashiwagi, Biochem. Biophys. Res. Commun. 271 (2000) 559–564.
66. H. C. Ha, J. D. Yager, P. A. Woster, R. A. Casero Jr., Biochem. Biophys. Res. Commun.
244 (1998) 298–303.
67. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, Biochim. Biophys. Acta
1628 (2003) 11–21.
68. H. Deng, V. A. Bloomfield, J. M. Benevides, G. J. Thomas Jr., Nucleic Acids Res. 28
(2000) 3379–3385.
69. U. Bachrach, Amino Acids 26 (2004) 307–309.
70. W. Wang, W. C. Ho, D. T. Dicker, C. MacKinnon, J. D. Winkler, R. Marmorstein, W. S.
El-Deiry, Canc. Biol. Ther. 4 (2005) 893–898.
119
71. A. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J. Raman Spectrosc.
35 (2004) 93–100.
72. L. Pérez-Flores, A. J. Ruiz-Chica, J. G. Delcros, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J.
Mol. Struct. 744–747 (2005) 699–704.
73. S. Marczi, LJ. Glavaš-Obrovac, T. Belovari, R. Stojković, S. Ivanković, V. Šerić, I.
Piantanida, M. Žinić, Cancer Chemother. Pharmacol. 62 (2008) 595–604.
74. T. M. Davis, W. D. Wilson, M. Eriksson, B. Nordén, A. N. Lane, M. E. Peek, L. D.
Williams, Methods Enzymol. 340 (2001) 22–290.
75. S. Bi, H. Zhang, C. Qiao, Y. Sun, C. Liu, Spectrochim. Acta A 69 (2008) 123–129.
76. H.-C. Becker, B. Nordén, J. Am. Chem. Soc. 119 (1997) 5798–5803.
77. F. Rosu, E. De Pauw, V. Gabelica, Biochimie 90 (2008) 1074–1087.
78. F. Araya, G. Huchet, I. McGroarty, G. G. Skellern, R. D. Waigh, Methods 42 (2007) 141–
149.
79. J. Ruiz-Chica, M. A. Medina, F. Sánchez-Jiménez, F. J. Ramírez, J. Mol. Struct. 408–481
(1999) 455–458.
80. W. Xie, Y. Ye, A. Shen, L. Zhou, Z. Lou, X. Wang, J. Hu, Vib. Spectrosc. 47 (2008) 119–
123.
81. G. Keresztury u Handbook of Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West
Sussex, 2002.
82. E. Smith, G. Dent, Modern Raman Spectroscopy − A Practical Approach, John Wiley &
Sons, West Sussex, 2005.
83. H. M. Pask, P. Dekker, R. P. Mildren, D. J. Spence, J. A. Piper, Prog. Quantum Electron.
32 (2008) 121–158.
84. F. Shuzhen, Z. Xingyu, W. Qingpu, L. Zhaojun, L. Lei, C. Zhenhua, C. Xiaohan, Z.
Xiaolei, Opt. Commun. 284 (2011) 1642–1644.
85. R. Aroca, Surface-Enhanced Vibrational Spectroscopy, John Wiley & Sons, West Sussex,
2006.
86. W. R. Browne, J. J. McGarvey, Coord. Chem. Rev. 251 (2007) 454–473.
87. T. Vo-Dinh, D. L. Stokes, G. D. Griffin, M. Volkan, U. J. Kim, M. I. Simon, J. Raman
Spectrosc. 30 (1999) 785–793.
88. G. McNay, D. Eustace, W. E. Smith, K. Faulds, D. Graham, Appl. Spectrosc. 65 (2011)
825–837.
89. J. Kneipp, H. Kneipp, K. Kneipp, Chem. Soc. Rev. 37 (2008) 1052–1060.
90. M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Chem. Phys. Lett. 26 (1974) 163–166.
120
91. D. L. Jeanmaire, R. P. Van Duyne, J. Electroanal. Chem. 84 (1977) 1–20.
92. M. G. Albrecht, J. A. Creighton, J. Am. Chem. Soc. 99 (1977) 5215–5217.
93. H. Ehrenreich, H. R. Philipp, Phys. Rev. 128 (1962) 1622–1629.
94. P. C. Lee, D. Meisel, J. Phys. Chem. 86 (1982) 3391–3395.
95. J. Zhou, J. Ral ston, R. Sedev, D. A. Beattie, J. Colloid Interface Sci. 331 (2009) 251–262.
96. a) L. Gao, Q. Huang, X.-Y. Li, S. Yang, Phys. Chem. Chem. Phys. 3 (2001) 1661–1665.
b) J.-L. Yao, J. Tang, D.-Y. Wu, D.-M. Sun, K.-H. Xue, B. Ren, B.-W. Mao, Z.-Q. Tian,
Surf. Sci. 514 (2002) 108–116.
97. J. A. Creighton, M. S. Alvarez, D. A. Weitz, S. Garoff, M. W. Kim, J. Phys. Chem. 87
(1983) 4793–4799.
98. B. H. Loo, J. Phys. Chem. 87 (1983) 3003–3007.
99. C. M. Coyle, G. Chumanov, P. W. Jagodzinski, J. Raman Spectrosc. 29 (1998) 757–762.
100. M. Meier, A. Wokaun, T. Vo-Dinh, J. Phys. Chem. 89 (1985) 1843–1846.
101. W. W. Yu, I. M. White, Anal. Chem. 82 (2010) 9626–9630.
102. X.-M. Lin, Y. Cui, Y.-H. Xu, B. Ren, Z.-Q. Tian, Anal. Bioanal. Chem. 394 (2009) 1729–
1745.
103. M. V. Cañamares, J. V. Garcia-Ramos, S. Sanchez-Cortes, M. Castillejo, M. Oujja, J.
Colloid Interface Sci. 326 (2008) 103–109.
104. C. H. Munro, W. E. Smith, M. Garner, J. Clarkson, P. C. White, Langmuir 11 (1995)
3712–3720.
105. P. D. Nallathamby, X.-H. N. Xu, Nanoscale 2 (2010) 942–952.
106. J. Chen, J.-M. Hu, Z.-S. Xu, R.-S. Sheng, Appl. Spectrosc. 47 (1993) 292–295.
107. R. F. Aroca, R. A. Alvarez-Puebla, N. Pieczonka, S. Sanchez-Cortez, J. V. Garcia-Ramos,
Adv. Colloid Interface Sci. 116 (2005) 45–61.
108. R. A. Alvarez-Puebla, E. Arceo, P. J. G. Goulet, J. J. Garrido, R. F. Aroca, J. Phys. Chem.
B 109 (2005) 3787–3792.
109. M. Moskovits, Rev. Mod. Phys. 57 (1985) 783–826.
110. P. Kambhampati, C. M. Child, M. C. Foster, A. Campion, J. Chem. Phys. 108 (1998)
5013–5026.
111. K. L. Kelly, E. Coronado, L. L. Zhao, G. C. Schatz, J. Phys. Chem. B 107 (2003) 668–
677.
112. W. L. Barnes, A. Dereux, T. W. Ebbesen, Nature 424 (2003) 824–830.
113. P. B. Johnson, R. W. Christy, Phys. Rev. B 6 (1972) 4370–4379.
121
114. M. Sun, S. Zhang, Y. Fang, Z. Yang, D. Wu, B. Dong, H. Xu, J. Phys. Chem. C 113
(2009) 19328–19334.
115. A. Campion, P. Kambhampati, Chem. Soc. Rev. 27 (1998) 241–250.
116. E. C. Le Rue, M. Meyer, E. Blackie, P. G. Etchegoin, J. Raman Spectrosc. 39 (2008)
1127–1134.
117. A. G. Brolo, D. E. Irish, B. D. Smith, J. Mol. Struct. 405 (1997) 29–44.
118. A. Otto, J. Raman Spectrosc. 36 (2005) 497–509.
119. P. Mohaparta, J. Food Res. 1 (2012) 3–12.
120. H. Wei, H. Xu, Appl. Phys. A 89 (2007) 273–275.
121. A. Murza, S. Alvarez-Méndez, S. Sanchez-Cortes, J. V. Garcia-Ramos, Biopolymers 72
(2003) 174–184.
122. H. Morjani, J.-F. Riou, I. Nabiev, F. Lavelle, M. Manfait, Cancer Res. 53 (1993) 4784–
4790.
123. G. Breuzard, J.-M. Millot, J.-F. Riou, M. Manfait, Anal. Chem. 75 (2003) 4305–4311.
124. C.-Y. Wu, W.-Y. Lo, C.-R. Chiu, T.-S. Yang, J. Raman Spectrosc. 37 (2006) 799–807.
125. I. Piantanida, B. S. Palm, M. Žinić, H.-J. Schneider, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2 (2001)
1808–1816.
126. A. Sornosa-Ten, M. T. Albelda, J. C. Frías, E. García-España, J. M. Llinares, A. Budimir,
I. Piantanida, Org. Biomol. Chem. 8 (2010) 2567–2574.
127. J. González, J. M. Llinares, R. Belda, J. Pitarch, C. Soriano, R. Tejero, B. Verdejo, E.
García-España, Org. Biomol. Chem. 8 (2010) 2367–2376.
128. V. Chiş, M. M. Venter, N. Leopold, O. Cozar, Vib. Spectrosc. 48 (2008) 210–214.
129. B. S. Palm, I. Piantanida, M. Žinić, H.–J. Schneider, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2
(2000) 385–392.
130. F. R. Dollish, W. G. Fateley, F. F. Bentley, Characteristic Raman Frequencies of Organic
Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1974.
131. S. Sánchez-Cotrés, J. V. García-Ramos, J. Raman Spectrosc. 29 (1998) 365–371.
132. P. Sett, M. ghosh, P. K. Mallick, J. Chowdhury, J. Raman Spectrosc. 39 (2008) 1878–
1889.
133. L. Rintoul, K. Crawford, H. F. Shurvell, P. M. Fredericks, Vib. Spectrosc. 15 (1997) 171–
177.
134. a) B. H. Loo, Y. Tse, K. Parsons, C. Adelman, A. El-Hage, Y. G. Lee, J. Raman
Spectrosc. 37 (2006) 299–304.
b) P. Naumov, M. Ristova, B. Šoptrajanov, M. Zugik, J. Mol. Struct. 598 (2001) 235–243.
122
135. a) T. D. Klots, Spectrochim. Acta A 54 (1998) 1481–1498.
b) D. H. Dressler, Y. Mastai, M. Rosenbluh, Y. Fleger, J. Mol. Struct. 935 (2009) 92–96.
136. a) J. M. Benevides, S. A. Overman, G.J. Thomas Jr., J. Raman Spectrosc. 36 (2005) 279–
299.
b) K.-H. Cho, J. Choo, S.-W. Joo, Spectrochim. Acta A 62 (2005) 1141–1145.
137. a) G. F. Diaz, M. M. Campos-Vallette, M. S. Saavedra, R. E. Clavijo, J. C. Canales, J.
Costamagna, J. Vargas, Vib. Spectrosc. 28 (2002) 223–234.
b) M. S. Atanassova, G. D. Dimitrov, Spectrochim. Acta A 59 (2003) 1655–1662.
138. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Matošević, I. Piantanida, Vib. Spectrosc. 57 (2011) 23–
29.
123
7. POPIS KRATICA I SIMBOLA
DNA – deoksiribonukleinska kiselina
RNA – ribonukleinska kiselina
A – adenin
G – gvanin
C – citozin
T – timin
U – uracil
UV – ultraljubičasto zračenje
VIS – vidljivo zračenje
SERS – površinski pojačano Ramanovo raspršenje
IR – infracrveno zračenje
NIR – blisko infracrveno zračenje
TEM – transmisijska elektronska mikroskopija
– istezna vibracija
– deformacijska vibracija
– torzija
s – simetrična vibracija
as – antisimetrična vibracija
ip – u ravnini
oop – izvan ravnine
sc – striženje
tw – uvijanje
wg – klaćenje
124
8. PRILOZI
3500 3000 2500 2000 1500 1000 5000,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
Slika P1. FT-Ramanovi spektri koloida 2 a) bez NaBH4 i b) s NaBH4.
3500 3000 2500 2000 1500 1000 500
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(i)
Slika P2.a) FT-Ramanov spektar koloida 2. SERS spektri na koloidu 2 b) poli A, c) poli G, d)
poli C, e) poli U, f) poli dAdT–poli dAdT, g) poli dGdC–poli dGdC, h) poli rA–poli rU i i) ct-
DNA.
xi
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika P3. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) IM, b) IM/poli A, c) IM/poli G,
d) IM/poli C i e) IM/poli U; c(IM) = 5×10–6 mol dm–3, IM/poli 1/20.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Slika P4. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) PY, b) PY/poli A, c) PY/poli G,
d) PY/poli C i e) PY/poli U; c(PY) = 5×10–6 mol dm–3, PY/poli 1/20.
xii
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
Slika P5. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) IM, b) IM/poli dAdT–poli
dAdT, c) IM/poli dGdC–poli dGdC, d) IM/poli rA–poli rU; c(IM) = 5×10–6 mol dm–3,
IM/poli 1/20.
1800 1600 1400 1200 1000 800 600
Ram
anov
inte
nzite
t
Valni broj / cm-1
(a)
(b)
(c)
(d)
Slika P6. SERS spektri na koloidu 2 u prisutnosti NaBH4: a) PY, b) PY/poli dAdT–poli
dAdT, c) PY/poli dGdC–poli dGdC, d) PY/poli rA–poli rU; c(PY) = 5×10–6 mol dm–3,
PY/poli 1/20.
xiii
9. ŽIVOTOPIS
Adriana Dijanošić je rođena 21. kolovoza 1984. godine u Varaždinu. Osnovnu školu je
završila u Ludbregu. 1999. godine upisuje Rudarsku i kemijsku školu u Varaždinu, smjer
kemijski tehničar. 2003. godine upisuje Prirodoslovno-matematički fakultet Sveučilišta u
Zagrebu koji završava 17.04.2008. godine i stječe titulu diplomiranog inženjera kemije. Od
02.06.2008. godine zaposlena je kao asistent-znanstveni novak u Zavodu za analitičku kemiju
Kemijskog odsjeka PMF-a. Iste godine upisuje Sveučilišni poslijediplomski doktorski studij
kemije. Doktorski rad izrađuje u Zavodu za analitičku kemiju Kemijskog odsjeka PMF-a pod
voditeljstvom doc. dr. sc. Snežane Miljanić u okviru projekta „Spektroskopska analiza
nezasićenih sustava i spojeva metala“.
Koautor je šest znanstvenih radova objavljenih u CC časopisima. Aktivno sudjeluje na
kongresima u Hrvatskoj i inozemstvu te je autor i koautor deset posterskih priopćenja. U
svrhu stručnog usavršavanja provela je mjesec dana u 2012. godini na Sveučilištu Eötvös
Loránd u Budimpešti.
Uz istraživački rad, sudjeluje i u nastavi kao asistent u osnovnim praktikumima
analitičke kemije. Neposredni je voditelj devet diplomskih radova. Uključena je u aktivnosti
popularizacije znanosti Kemijskog odsjeka PMF-a (Smotra Sveučilišta u Zagrebu, Otvoreni
dan Kemijskog odsjeka PMF-a).
Objavljeni radovi u CC časopisima:
1. S. Miljanić, A. Dijanošić, M. Kalac, M. Radić Stojković, I. Piantanida, D.
Pawlica, J. Eilmes, Surface-enhanced Raman scattering study of the binding
modes of a dibenzotetraaza[14]annulene derivative with DNA/RNA
polynucleotides, Croat. Chem. Acta 85 (2012) 577–584.
2. N. Galić, A. Dijanošić, D. Kontrec, S. Miljanić, Structural investigation of
aroylhydrazones in dimethylsulphoxide/water mixtures, Spectrochim. Acta A 95
(2012) 347353.
3. S. Miljanić, A. Dijanošić, K. Landeka, M. Radić Stojković, I. Piantanida, Binding
of phenanthridine-biguanide derivative with DNA/RNA polynucleotides studied
by surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS), Appl. Spectrosc. 66(1) (2012)
8289.
xiv
4. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Matošević, I. Piantanida, Intercalator-DNA
interactions revealed by NIR surface-enhanced Raman spectroscopy, Vib.
Spectrosc. 57 (2011) 23–29.
5. S. Miljanić, A. Dijanošić, I. Piantanida, Z. Meić, M. T. Albelda, A. Sornosa-Ten,
E. García-Espana, Surface-Enhanced Raman Study of the Interactions between
Tripodal Cationic Polyamines and Polynucleotides, Analyst 136 (2011) 3185–
3193.
6. S. Miljanić, A. Dijanošić, Z. Meić, Surface-Enhanced Raman Spectra of
Rhodamine 19 Octadecylamide, Spectrochim. Acta A 75 (2010) 10081012.
Kongresno priopćenje u CC časopisu:
1. G. Šinko, I. Vinković Vrček, S. Miljanić, A. Dijanošić, Interaction of silver
nanoparticles with cholinesterase, Abstracts of the 36th FEBS Congress,
Biochemistry for Tomorow's Medicine, The FEBS Journal 278 (2011) 433–433.
Posterska priopćenja na znanstvenim skupovima:
1. S. Miljanić, A. Dijanošić, M. Kalac, M. Radić Stojković, I. Piantanida, D.
Pawlica, J. Eilmes, Binding modes of a DBTAA derivative with DNA/RNA
polynucleotides revealed by SERS, 31th European Congress on Molecular
Spectroscopy – Book of Abstracts / Nagy-Pora, Katalin; Chis, Vasile; Astilean,
Simion; Cozar, Onuc (ur.), Cluj-Napoca, 2012, 210–210.
2. A. Dijanošić, S. Miljanić, J. Gonzales Garcia, E. Garcia-Espana, I. Piantanida,
Study of interactions between DNA/RNA nucleotides and PHENPOD by surface
enhanced Raman spectroscopy, 31th European Congress on Molecular
Spectroscopy – Book of Abstracts / Nagy-Pora, Katalin; Chis, Vasile; Astilean,
Simion; Cozar, Onuc (ur.), Cluj-Napoca, 2012, 176–176.
3. A. Dijanošić, N. Galić, S. Miljanić, Istraživanje strukture N'-(2-hidroksi-3-
metoksifenilmetiliden)-3-piridinkarbohidrazida u smjesama dimetilsulfoksida i
vode, Knjiga sažetaka IX. susreta mladih kemijskih inženjera / Sanja Martinez
(ur.), Zagreb, 2012, 127–127.
4. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Binding of cationic polyamines with
double-stranded polynucleotides studied by surface-enhanced Raman
spectroscopy, IX International Congress of Young Chemists – Book of Abstracts,
Krakow, 2011, 119–119.
xv
5. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Istraživanje interakcija između PYPOD i
polinukleotida primjenom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja, Knjiga
sažetaka XXII. Hrvatskog skupa kemičara i kemijskih inženjera / Tomašić, Vesna;
Maduna Valkaj, Karolina (ur.), Zagreb, 2011, 127–127.
6. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, I. Piantanida, Istraživanje interakcija između
poliamina IM i polinukleotida primjenom površinski pojačanog Ramanovog
raspršenja, Knjiga sažetaka VIII. Susreta mladih kemijskih inženjera / Bolf,
Nenad; Šoljić Jerbić, Ivana (ur.), Zagreb, 2010, 155155.
7. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, I. Piantanida, T. M. Albelda, A. Sornosa-Ten,
E. Garcia-Espana, Surface-enhanced Raman study of the interactions between
cationic polyamines and polynucleotides, 30th European Congress on Molecular
Spectroscopy – Book of Abstracts / Beccuci, Maurizio; Gellini Cristina, Schettino,
Vincenzo (ur.), Firenza, 2010, 136–136.
8. A. Dijanošić, S. Miljanić, I. Piantanida, Surface-enhanced Raman study of the
interactions between the intercalator ADAP and DNA, 10th International
Symposium and summer School on Bioanalysis – Book of Abstracts / Matković
Čalogović, Dubravka (ur.), Zagreb, 2010, 82–82.
9. A. Dijanošić, S. Miljanić, Z. Meić, Istraživanje ravnoteže rodaminskih boja
spektroskopijom površinski pojačanog Ramanovog raspršenja, Knjiga sažetaka
XXI. Hrvatskog skupa kemičara i kemijskih inženjera / Pičuljan, Katarina; Smolec,
Sonja (ur.), Zagreb, 2009, 159159.
xvi