N° d’ordre :………………

THESE

présentée

pour obtenir

LE TITRE DE DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE École doctorale : …SEVAB……………………………………………………..

Spécialité : …Microbiologie et Biocatalyse industrielles……………………

Par M…PUEL Olivier………………………………………………………………

Titre de la thèse …Bases moléculaires de la voie de biosynthèse de la patuline, mycotoxine produite par Byssochlamys nivea et Penicillium

griseofulvum… ………………………………………………………………………….

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Soutenue le …9 Janvier 2007 devant le jury composé de :

M. Le Professeur. Jean Paul Roustan Président

M. Le Professeur Ahmed Lebrihi. Directeur de thèse

M. Le Professeur Patrick Boiron Rapporteur

M ; Dr Christian Barreau Rapporteur

M. Dr Marcel Delaforge Membre

M Dr Pierre Galtier Membre

TITRE : Bases moléculaires de la voie de biosynthèse de la patuline, mycotoxine produite par Byssochlamys nivea et Penicillium griseofulvum RESUME : La patuline constitue un contaminant chimique toxique fréquemment rencontré dans les produits issus de la transformation des fruits, notamment des pommes. Cette toxine essentiellement produite par Penicillium expansum et Byssochlamys nivea fait l’objet d’une réglementation européenne récente (N°1425/2003). Contrairement à certaines mycotoxines règlementées telles que les aflatoxines, les trichothécènes ou les fumonisines, la génétique de la voie de biosynthèse de la patuline est fort mal connue, bien que cette voie ait été relativement bien caractérisée du point de vue chimique. Deux espèces toxinogènes, Byssochlamys nivea et Penicillium griseofulvum ont été étudiées en tant qu’espèces modèles. Trois gènes impliqués dans la synthèse de la patuline ont été isolés de B. nivea, et entièrement séquencés lors de ce travail. Le premier gène 6msas isolé code pour une polycétide synthase, l’acide 6-methylsalicylique synthase, intervenant au début de la cascade enzymatique conduisant à la synthèse de la patuline. Le deuxième gène idh coderait pour une alcool déshydrogénase impliquée dans la transformation de l’isoépoxydon en phyllostine, deux autres précurseurs de la patuline. En amont de ce dernier gène, sur le brin complémentaire, un gène abc codant pour un transporteur actif de la famille des ABC transporteurs a été localisé, isolé et entièrement séquencé chez Penicillium griseofulvum, puis chez B. nivea et P. expansum. La présence d’un tel gène ne semble pas aberrante puisqu’il a été montré que certains transporteurs actifs faisaient partie de l’arsenal de résistance développé par les champignons pour ne pas subir les effets délétères des toxines qu’ils synthétisent. D’après les données brutes du séquençage du génome d’Aspergillus clavatus, autre espèce de patuline, le complexe génique abc/idh serait distant de 10 kb du gène 6msas. L’analyse de la région avoisinant ces gènes dévoile l’existence chez A. clavatus d’un cluster de gènes constitué d’au moins 12 gènes en comptant les trois gènes préalablement identifiés, potentiellement impliqués dans la synthèse de la mycotoxine. Parmi ces gènes, plusieurs codent pour des enzymes dont l’implication semble évidente au regard des données actuellement disponibles sur la caractérisation chimique de la voie de biosynthèse de la patuline. Du point de vue application, ces travaux ont d’ores et déjà apportés des réponses concrètes à des problèmes industriels. Une étude réalisée sur un panel relativement divers de souches d’origine géographique différente de Byssochlamys nivea et Byssochlamys fulva, conclut à la non-production de patuline par B. fulva sur des bases analytiques et génétiques. Cette absence de production est due à l’absence d’au moins deux gènes, 6msas et idh. B fulva fréquemment isolé des fruits ne représente donc pas une source de contamination des pommes par la patuline dans les filières de transformation. Penicillium expansum et Byssochlamys nivea sont donc considérés comme les principales sources de contamination des pommes par la patuline. MOTS CLES : Mycotoxines, patuline, acide mycophenolique, Byssochlamys nivea, Byssochlamys fulva, Penicillium griseofulvum, Penicillium expansum, Acide 6-methylsalicylique synthase, isoépoxydon déshydrogénase, ABC transporteur

Molecular bases of patulin biosynthesis pathways in Byssochlamys nivea and Penicillium griseofulvum. Summary Patulin is toxic chemical contaminant produced by several species of mould (Penicillium griseofulvum, P.expansum, Byssochlamys nivea, Aspergillus clavatus…). Exposure to this mycotoxin is associated with immunological, neurological and gastrointestinal outcomes. Assessment of the health risks due to patulin consumption by humans lead many countries to regulate its amounts in food. In Europe, a maximum level has been established of 50 µg per kg for apple juice, cider and a maximum level of 10 µg/kg for all dietary products intended for infants and young children. Unlike other regulated mycotoxins (aflatoxins, trichothecens and fumonisines), the knowledge regarding the patulin biosynthesis is so far limited to the chemical characterization of patulin precursors and to the identification of two relevant genes from Penicillium griseofulvum (6-methylsalicylic acid synthase (6msas) and isoepoxydon dehydrogenase (idh). Two toxinogenic species Byssochlamys nivea and Penicillium griseofulvum have been studied in this work. Three genes (6msas, idh and abc) that belong to the patulin biosynthetic pathway were isolated, and wholly sequenced in B. nivea. These genes are coding respectively for 6-methylsalicylic acid synthase, the first enzyme involved in patulin biosynthesis, isoepoxydon dehydrogenase which allowed the isoepoxydon transformation in phyllostin and an ABC (ATP Binding Cassette) transporter. This latest gene is located on the anti-sense strand, upstream of the idh gene, and it has been isolated also from Penicillium griseofulvum and Penicillium expansum. This transporter could be responsible for the active efflux of endogenously produced patulin and contribute to self protection against patulin in producing fungi. After comparison with data from the Aspergillus clavatus genome sequencing program performed by TIGR (The Institute for Genomic Research), we noticed that the abc/idh genes complex and 6msas gene are 10 kb away from each other. We performed a bioinformatic analysis of the regions located upstream and downstream of this 10 kb size fragment, and established the presence of 9 additional genes. Their potential involvement in the synthesis of the toxin has been discussed. Finally, this fundamental work could answer to industrial problems. A study performed on 19 different strains of B. nivea and B. fulva showed that Byssochlamys fulva don’t produce patulin and that its inability to do so could be explained by the lack of both 6msas and idh genes. In conclusion, B. fulva clearly lacks several biochemical potencies to be responsible for the occurrence of patulin in fruits. Keywords: Mycotoxins, patulin, mycophenolic acid, Byssochlamys nivea, Byssochlamys fulva, Penicillium griseofulvum, Penicillium expansum,6-methylsalicylic acid synthase, isoepoxydon dehydrogenase, ABC transporter

A Sylvie Guillaume Antoine… … mieux vaut tard que jamais

Remerciements Le travail présenté dans cette thèse de doctorat a été effectué au sein du laboratoire de pharmacologie-toxicologie de l’INRA de Toulouse. Ce mémoire n’aurait pu voir le jour sans la participation laborieuse, le soutien, la bienveillance ou tout simplement la présence de nombreuses personnes. Je vais donc m’essayer à trouver les mots justes pour exprimer spécifiquement ma reconnaissance à tous ceux qui ont contribué de près ou de loin à ce travail. Je tiens avant tout à exprimer ma sincère gratitude à Madame Souria Tadrist, ma fidèle Souria qui, pendant quatre années, m’a épaulé quotidiennement, endurant parfois mon humeur difficilement supportable. Un grand merci pour ta gentillesse, pour ton soutien chaleureux et tes encouragements dans les moments de doutes. J’espère que ce document symbolisera au mieux le niveau d’engagement dont tu as fait preuve durant ces longues années. Que toutes les personnes qui ont acceptés de faire partie de mon jury reçoivent ici mes remerciements les plus sincères et ma sympathie. Je remercie Mr le Professeur Jean Paul Roustan pour avoir accepté de présider le Jury. Je remercie vivement Mr Christian Barreau et Mr Patrick Boiron d’avoir si gentiment accepté la lourde tache d’examiner ce travail et d’en être les rapporteurs. J’exprime toute ma reconnaissance à Pierre Galtier, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire, il y a de nombreuses années. Je suis extrêmement sensible à la confiance constate que vous avez témoigné à mon égard depuis le premier jour. Ma sincère reconnaissance s’adresse à Ahmed Lebrihi qui a bien voulu me faire l’honneur de diriger ma thèse. Toujours enthousiaste dès lors qu’est évoqué le métabolisme secondaire quelque soit le microorganisme considéré. Je tiens à porter une mention particulière à Marcel Delaforge qui spontanément m’a proposé comme entrée en matière de réaliser les analyses de spectrométrie de masse, point de départ d’une série de collaborations qui je l’espère dureront jusqu’à sa retraite. Merci Marcel, tu m’as beaucoup appris, j’espère avoir retenu quelque chose à ton contact. Je ne saurais oublier tous ceux qui m’ont apporté leurs savoirs faire, leurs aides techniques, leurs expérience, nécessaires pour la réalisation et le développement de ce travail. Qu’Isabelle Oswald trouve ici l’expression de ma reconnaissance pour tous ses conseils lors de la rédaction des articles. Merci pour ta disponibilité. Merci Nicolas (Loiseau) d’avoir accompagné mes premiers pas en spectrométrie de masse, de répondre toujours présent dès que j’ai un problème en chimie. Trouve l’expression de ma reconnaissance pour toutes ces discussions scientifiques que j’ai eue avec toi. Que soit également remercié Pascal Martin pour m’avoir fait bénéficier de ses compétences en statistique.

Une pensée particulière pour Neil qui a toujours corrigé mon anglais sans me culpabiliser quant à sa qualité. Je remercie également les stagiaires (Florent, Rachida, Myriam, Virginie, Eric, Adam, Elsa, Christelle et Clément) qui sont passés par le labo et qui m’ont apporté une aide précieuse tout le long de la thèse. Ma reconnaissance va également à tous mes collègues du labo qui par leur bonne humeur m’ont aidé à mener à bien ce travail. Je ne remercierais jamais assez Thierry Pineau pour son amitié et la confiance qu’il m’a toujours témoigné depuis ce jour du mois de mars 1988 où nos chemins se sont croisés.

Sommaire

TABLE DES MATIERES

____________________________________________________________ INTRODUCTION GENERALE : 2 ____________________________________________________________ DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES :

1. INTRODUCTION AUX MYCOTOXINES 5 2. LES POLYCETOACIDES ET POLYCETOACIDES SYNTHASES 9 2.1 Les polycétides (Polyketide) 9 2.2 Les Polycétides synthases 12 3. ORGANISATION DES GENES DES VOIES DE BIOSYNTHESE DE

METABOLITES SECONDAIRES 17 4. LA PATULINE 19

4.1 Espèces fongiques productrices de patuline 19 4.2 Biosynthèse de la patuline 24 4.2.1 Elucidation chimique et enzymatique de la voie de biosynthèse de la patuline 24 4.2.2 Premières étapes (Acetate → Gentisaldehyde) 25 4.2.3 Dernières étapes (Isopoxydon → Patuline) 29 4.2.4 Bases moléculaires de la voie de biosynthèse de la patuline 32 4.3 Paramètres influant sur la synthèse de la patuline 33 4.4 Occurrence de la patuline dans les aliments 35 4.5 Propriétés toxicologiques 40

4.5.1 Toxicocinétique 40 4.5.1.1 Devenir biologique de la patuline 40 4.5.1.2 Absorption et distribution 40 4.5.1.3 Liaison de la patuline aux protéines 41 4.5.1.4 Interaction avec les protéines de biotransformation 41

4.5.2 Toxicologie générale 42 4.5.2.1 Toxicité aigue 42 4.5.2.2 Toxicité chronique 43 4.5.3 Données relatives à la génotoxicité 44

4.5.3.1 Etudes in vivo 44 4.5.3.2 Etudes in vitro 44 4.5.4 Autres effets 45 4.5.4.1 Cytotoxicité 45 4.5.4.2 Embryotoxicité et tératogénèse 46 4.5.4.3 Immunotoxicité 47 4.5.5 Valeurs toxicologiques de référence 49 4.5.6 Valeurs toxicologiques d’aliments pour bétail contaminés 49

4.6 Etat de la contamination naturelle des denrées alimentaires par la patuline en Europe 50 4.7 Evaluation de l’exposition humaine à la patuline 52 4.8 Réglementation 55

________________________________________________________________________________ MATERIELS ET METHODES : 1. SOUCHES ET MILIEUX 57 1.1 Souches utilisées 57 1.2 Milieux de cultures 57 2. PRODUITS CHIMIQUES ET STANDARDS ANALYTIQUES 57

3. EXTRACTION DES METABOLITES SECONDAIRES PRESENTS DANS LES

SURNAGEANTS DE CULTURE 58

4. DETECTION CHROMATOGRAPHIQUE 59 5. ISOLEMENT DES GENES IMPLIQUES DANS LA VOIE DE BIOSYNTHESE

DE LA PATULINE 60 5.1 Préparation de l’ADN complémentaire (ADNc) 60 5.1.1 Extraction des ARNs totaux 60 5.1.2 Transcription inverse (la reverse transcription : RT) 61 5.2 Extraction des ADN Génomiques 62 5.3 Amplification de l’ADN : polymerase chain reaction (PCR) 63 5.4 Obtention des extrémités par Race-PCR 64 5.5 Purification et clonage des fragments d’intérêt 65 5.6 Séquençage des produits PCR 67 5.7 Contrôle de l‘identité des souches 68 5.8 Traitement des séquences nucléiques et protéiques 69

______________________________________________________________________ Partie I : PUBLICATION : Byssochlamys nivea as a source of mycophenolic acid (Applied and Environmental Microbiology, (2005) 71, p. 550-553) 1. INTRODUCTION 71 2. ARTICLE 72 ____________________________________________________________ Partie II : PUBLICATION : The inability of Byssochlamys fluva to produce patulin is related to absence of 6-methylsalicylique acid synthase and isopoxydon dehydrogenase genes ( International Journal of Food Microbiology, (2007), 115, p. 131-139) 1. INTRODUCTION 87 2. ARTICLE 89

________________________________________________________________________________ Partie III : Absence d’implication de l’acide 6-methylsalicylique synthase dans la synthèse de l’acide mycophénolique 1. SOUCHE UTILISEE ET CONDITIONS DE CULTURE 127 2. DETERMINATION DES POIDS SECS 128 3. EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUES 128 4. ANALYSE DES METABOLITES SECONDAIRES ET DOSAGES DE L'ACIDE MYCOPHENOLIQUE 128 5. RESULTATS ET DISCUSSION 128 5.1 Isolement d’un fragment de gene homologue de Bnpks de Byssochlamys nivea chez penicillium brevicompactum 132 5.2 Absence d’implication du gène Pp.pks durant la production d’acide mycophenolique 137 ________________________________________________________________________________ Partie IV : Isolement de trois gènes orthologues codants pour un ABC transporteur chez Byssochlamys nivea, Penicillium expansum et Penicillium griseofulvum 1. STRATEGIE D'AMPLIFICATION DU GENE abc CHEZ Penicillium griseofulvum, P.expansum ET Byssochlamys nivea 144 2. RESULTATS 151 3. DISCUSSION 156 _______________________________________________________________________________ DISCUSSION: Confrontation des séquences obtenues chez Byssochlamys nivea avec la base de données du génome d'Aspergillus clavatus 1. CARACTERISATION DU CLUSTER 162 2. HISTOIRE DU CLUSTER 167 3. PERSPECTIVE D’UN DEVELOPPEMENT DE KIT DE DETECTION 173 ________________________________________________________________________________ CONCLUSION GENERALE 175 ________________________________________________________________________________ REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 180 ANNEXES 200

Table des Illustrations

Figures Introduction Figure 1 : Origines métaboliques des toxines d'Aspergilus fumigatus 8 Figure 2 : Schéma hypothétique du fonctionnement de l'acide 6-méthylsalicylique synthase 14 Figure 3 : A Carte du groupe de gènes (cluster) impliqués dans la biosynthèse des aflatoxines chez A.flavus et A.parasiticus B Carte du groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse des trichothécènes chez F. sporotrichoïdes 18 Figure 4 : Structure de la patuline 19 Figure 5 : Voie de biosynthèse de la patuline et des composés apparentés 26 Figure 6 : Pomme contaminée par Penicillium expansum 36 Matériels et méthodes Figure 7 : Stratégie générale employée afin d'isoler, cloner et séquencer les gènes d'intérêt 61 Figure 8 : Préparation des ADN complémentaires en vue des clonages des extrémités 5' et 3' 66 Partie I Figure 9 : (fig1 publication I) HPLC traces of CHCl3 extracts of B. nivea culture filtrate (5th days) and UV spectra of metabolites detected in these cultures 84 Figure 10 : (fig2 publication I) Amount of mycophenolic and growth of B. nivea on Czapek- dextrose broth, during production kinetics 85 Partie II Figure 11 : (fig1 publication II) Strategy for B.nivea amplifications 119 Figure 12 : (fig2 publication II) Amount of patuline at mg/100ml of culture medium 120 Figure 13 : (fig3 publication II) Detection of Bnpks (6msas) and idh gene in B.nivea and B.fluva genomes 121 Figure 14 : (fig4 publication II) Amino acid alignment of β-ketoacyl synthase (KS), acyl transferase (AT) and acyl carrier proteïn (ACP) domains from the B.nivea PKS gene with type 1 PKS genes 122 Partie III Figure 15 : Voies de biosynthèse de l'acide mycophénolique 126 Figure 16 : Chromatogramme d'un extrait chloroformique d'un surnageant de culture de Penicillium brevicompactum lors du 4ème jour de la cinétique de production 130 Figure 17 : LC-MS d'un extrait d'un surnageant de culture de Penicillium brevicompactum NCPT 10, 2 jours à 25°C sans agitation 131 Figure 18 : Cinétique de production d'acide mycophénolique par Penicillium brevicompactum 132 Figure 19 : A Arbre construit par la méthode UPGMA à partir des séquences du domaine de la ketosynthase B Arbre construit par la méthode UPGMA à partir des séquences du site de l'acyl carrier 135

Figure 20 : Résultats de la PCR avec les amorces Pat1/Pat6 sur l'ADNc de Penicillium 138 brevicompactum Partie IV Figure 21 : Extrait de la séquence soumise à GenBank par l'équipe de M.Gaucher 144 Figure 22 : Alignement des séquences protéiques de différents ABC transporteurs présentant une forte homologie avec le début de l'ABC transporteur de Penicillium brevicompactum 146/147 Figure 23 : A Stratégie d'isolement du gène abc chez Penicillium griseofulvum B Stratégie d'isolement du gène abc chez Byssochlamys nivea C Stratégie d'isolement du gène abc chez Penicillium expansum 149 Figure 24 : A Chromatogramme d'un extrait chloroformique d'un surnageant de culture de Penicillium urticae B Etude de l'expression du gene abc de Penicillium griseofulvum par RT-PCR 152 Figure 25 : Profil d'hydrophobicité de la protéine de Penicillium griseofulvum 153 Figure 26 : A Alignement des séquences protéiques des ABC transporteurs isolés B Représentation tridimentionnelle de l'ABC transporteur dans la membrane plasmique 157 Discussion Figure 27 : Cyclisation du versiconal hémiacétal en versicolorine B 165 Figure 28 : Localisation des gènes isolés dans le cluster de la patuline, localisation des « phrases ouvertes de lecture » potentielles dans le genome d'A. clavatus. Implication éventuelle des protéines codées par ces gènes, dans la voir de biosynthèse de la patuline 166 Figure 29 : Voie de biosynthèse de l'acide térréique proposée par Read et al. 168 Figure 30 : Voie de biosynthèse de l'acide térréique réactualisée d'après les données du cluster. Localisation des « phrases ouvertes de lecture » potentielles dans le génome d'A.terreus. Implication éventuelle des protéines codées par ces gèbes, dans la voie de biosynthèse de l'acide térréique 169

Tableaux

Introduction Tableau 1 : Principales mycotoxicoses liées à la consommation d'aliments contaminés par des moisissures 7 Tableau 2 : Espèces de la famille des Trichocomaceae rapportées productrices de patuline 21 Tableau 3 : Estimation de l'exposition à la patuline de la population française à partir d'aliments « prêts à être consommés » 53 Partie II Tableau 4 : (tableau 1 publication II) Fungal strains used in this study 114-116 Partie IV Tableau 5 : Tableau des Amorces 150 Discussion Tableau 6 : Liste des « phases ouvertes de lecture » identifiées dans le fragment de 70kb contenant les gènes orthologues de 6msas, abc et idh 164

Nomenclature et Abréviations

ABC : Transporteur : ATP Biding Cassette Transporteur ACP : Acyl Carrier Protéine ADN : Acide Désoxyribonucléique (DNA en anglais) ARN : Acide Ribonucléique (RNA en anglais) AT : Acetyl Transférase CHS : Chalcone Synthase CYA : Czapek Yeast extract Agar DH : Déshydratase DMSO : Diméthyl Sulfoyl Oxyde EDTA : Acide Ethylène Diamine Tétraacétique ER : Enoyl Réductase ESI : Electro Spray Ionisation HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Pression IDH : Isoepoxydon Dehydrogénase ITS : Inter Transcribed Spacer KR : β-Ketoacyl réductase

KS : β- Ketoacyl Synthase LC : Chromatographie Liquide LC MS/MS : Chromatographie Liquide couplée à la Spectrométrie de Masse MDR : Multi drug Resistance MEA : Malt Extract Agar MFS : Major Facilitator Superfamily MPA : Mycophenolic Acid 6MSA : Acide 6 Methylsalicylique 6MSAS : Acide 6 Methylsalicylique Synthase NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Phosphate ORF : Open Reading Frame ( phase ouverte de lecture) PCR : Polymerase Chain Reaction PDA : Potatoes Dextrose Agar PDR : Pleitropoic Drug Resistance PKS : Polyketide Synthase RI : Retention Indice RPM : revolution per Minute RT : Reverse Transcription RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SSH-PCR : Suppression Substractive Hybridization Polymerase Chain Reaction TBE : Tris Borate EDTA UV : Ultra Violet

1

Introduction

2

De tout temps, les aliments ont fait l’objet d’une législation et ont été souvent soumis à des

inspections car les hommes ont toujours estimé qu’il fallait contrôler la qualité afin de

protéger la santé des consommateurs et empêcher la fraude commerciale. Divers vestiges

archéologiques ainsi que des textes antiques témoignent du souci qu’avaient les peuples des

différentes civilisations de l’Antiquité à s’assurer l’accès à des aliments sains. Ces outils de

contrôle n’ont pas cessé de s’améliorer durant l’histoire afin de répondre au mieux aux

changements sociétaux à travers le monde. Cette évolution, comme celle de la société en

général, a tendance à s’accélérer depuis le 19ieme siècle, en intégrant au plus vite les nouveaux

risques dès qu’ils sont identifiés. C’est le cas des mycotoxines produites par certaines

moisissures, qui font l’objet de diverses réglementations spécifiques après la découverte dans

les années 1960, des aflatoxines.

Les moisissures sont largement utilisées en industrie agroalimentaire où elles participent, sous

conditions maîtrisées, dans la transformation des matières premières alimentaires en produits

de hautes valeurs ajoutées (fromagerie, …). Cependant en marge de cet aspect bénéfique,

certaines moisissures peuvent devenir nuisibles en altérant non seulement les qualités

organoleptiques et nutritionnelles des denrées alimentaires mais aussi leurs qualités sanitaires

en synthétisant des métabolites secondaires (mycotoxines) provoquant des effets délétères

chez les organismes qui les ingèrent. Selon l’Organisation des Nations Unies pour

l’Alimentation et l’Agriculture environ 25 % des denrées alimentaires sont contaminées par

les mycotoxines. Ce « fléau » touche les denrées à tous les stades de la chaîne alimentaire,

entraînant des préjudices économiques considérables pour les différents acteurs des filières

concernées. Les conséquences sanitaires sont multiples: baisse des rendements et de la qualité

des grains, baisse du poids des volailles et du bétail, sensibilité accrue aux infections due à

l’affaiblissement des défenses immunitaires, mortalité accrue des animaux de rentes, induisant

des pertes économiques considérables.

3

Compte tenu de l’extrême stabilité des mycotoxines aux différents traitements disponibles

(thermique, chimique, …), les coûts de détoxification de produits contaminés par les

mycotoxines sont souvent onéreux et limités aux denrées destinées à la consommation

animale. Ces procédés ne peuvent donc pas se substituer aux bonnes pratiques agricoles et

d’élevage. Les mesures préventives font figures de derniers remparts contre d’éventuelle

colonisation d’un produit par une moisissure toxinogène et par sa contamination potentielle

par une mycotoxine. Afin d’établir les mesures appropriées, un considérable travail

fondamental doit être préalablement réalisé pour chaque toxine problématique. La production

des mycotoxines par les champignons étant la conséquence combinée de la composante

génétique de la souche étudiée et de son environnement, celui-ci consiste à identifier et

répertorier les espèces fongiques productrices, à identifier les gènes responsables de la

synthèse de la toxine indésirable, à comprendre la réactivité de ces gènes vis avis des

différents facteurs environnementaux auquel est confronté le champignon producteur tels que

la température, la teneur en eau, l’acidité, les éléments nutritifs présents …). Dès 5 grandes

familles de mycotoxines réglementées par l’Union Européenne (Aflatoxines, ochratoxines,

patuline, trichothécenes, fumonisines) la patuline reste avec l’ochratoxine A, la seule toxine

dont la voie de biosynthèses n’a pas été entièrement élucidée, tant sur le plan chimique que

sur le plan génétique. Le présent travail s’inscrit dans cette logique puisque seront

successivement décrits, la caractérisation des espèces Byssochlamys nivea et Byssochlamys

fulva, tant en terme moléculaire qu’en terme de métabolites secondaires produits, l’isolement

et le clonage de plusieurs gènes codant pour des enzymes intervenant dans la synthèse de la

patuline chez plusieurs espèces, Byssochlamys nivea, Penicillium griseofulvum, Penicillium

expansum, puis enfin, se basant les résultats acquis précédemment la description du groupe

de gènes ou cluster intervenant dans la voie de biosynthèse de la patuline chez A. clavatus.

4

Données bibliographiques

5

1. INTRODUCTION AUX MYCOTOXINES

Plus de deux mille métabolites secondaires d’origine fongique ont été identifiés après

production dans des conditions de laboratoire. Bien que déjà important et sans cesse croissant

le nombre de ces derniers est largement sous-estimé puisque les études ont porté sur un très

faible nombre d’espèces fongiques en regard du nombre incroyable d’espèces de

champignons existant sur le globe. D’après des extrapolations, il y aurait entre 1 et 1,5

millions d’espèces fongiques sur terre, dont 70 000 ont été, à ce jour, décrites (Hawksworth,

1991). Parmi ces 70 000, seulement 5% des espèces ont été étudiées pour quelques caractères

particuliers. Certaines espèces fongiques, notamment celles des genres Aspergillus,

Penicillium, Fusarium se révèlent de véritables usines métaboliques responsables de la

synthèse de pléthore de composés chimiques. Ces métabolites sont qualifiés de secondaires

pour deux raisons. Ils sont généralement produits par le champignon après sa phase de

croissance et ils ne jouent aucun rôle physiologique apparent. Rares sont les cas où une

fonction a pu être mise en évidence. A titre d’exemple, certains métabolites secondaires tels

que la mélanine ont été identifiés comme des pigments des spores, protégeant celles-ci contre

les irradiations U.V., des températures extrêmes et la lyse enzymatique (Butler et Day, 1998).

Outre ces propriétés, la mélanine se comporte aussi comme un facteur d’agréssivité. Produite

par Colletotrichum lagenarium et par Aspergillus fumigatus, elle va favoriser respectivement

l’infection des plantes par la première espèce (Takano et al, 1997) et la colonisation de l’autre

dans les poumons de souris (Langfelder et al, 1998)

Parmi le grand nombre de métabolites identifiés, certains possèdent des activités biologiques

voire cytotoxiques et provoquent des effets délétères chez les organismes qui les ingèrent.

Sans être exhaustif, les mycotoxines peuvent induire une toxicité au niveau de nombreux

organes, comme l’appareil reproducteur, le foie, la peau, les reins, le sang, le système gastro-

intestinal, le système immunitaire. Le tableau 1 présente les principales mycotoxicoses liés à

6

la consommation d’aliments contaminés par certains genres de moisissures. Historiquement,

les premières mycotoxicoses formellement reconnues sont les grandes crises d’ergotismes qui

sont survenues au Moyen Age en Europe et qui sont dues à l’ingestion d’alcaloïdes de l’ergot

du seigle. Le premier accident mycotoxicologique de la période moderne fut l’hécatombe de

plusieurs élevages de dindes début des années 60 provoquée par la consommation de

tourteaux d’arachides fortement contaminés par les aflatoxines. Cet évènement déclencha plus

de quatre décennies d’études sur les mycotoxines. Les dangers liés à l’ingestion de certaines

mycotoxines ont été suffisamment bien appréhendés pour inciter les pouvoirs publics et

notamment la Commission Européenne à édicter des textes réglementant la présence et la

concentration de certaines molécules dans les aliments à risques. Ces textes ne concernent

qu’un nombre très limité de molécules puisque sur les deux mille composés d’origine

fongique identifiés et la trentaine de composés dont la toxicité a été prouvée, seules les

aflatoxines, l’ochratoxine et la patuline faisaient l’objet d’une réglementation européenne

avant la mise en place récente de règlementations concernant les trichothécènes et la

fumonisine (Recommandation Europenne N°856/2005 du 6 Juin 2005).

Contrairement aux toxines bactériennes généralement de nature protéique, les mycotoxines

sont des produits terminaux de séries de réactions enzymatiques successives. Les voies de

biosynthèses sont longues et complexes et les réactions sont catalysées par des enzymes de

spécificité différente de celles du métabolisme primaire. Ces métabolites secondaires peuvent

être classés en plusieurs catégories biosynthétiques sur la base de la nature du premier

précurseur et de la première enzyme intervenant dans sa synthèse. Comme l’illustre la figure 1

pour les toxines d’Aspergillus fumigatus, ces composés dérivent de manière générale de

précurseurs issus du métabolisme primaire tels que l’acetyl-CoA, les acides aminés, les

terpènes, voire dans quelques rares cas d’intermédiaires du cycle des acides tricarboxyliques.

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Toxines Champignons toxinogènes

Denrées dans lesquelles se trouvent les toxines Symptômes

Patuline

Aspergillus clavatus

Penicillium expansum Byssochlamys nivea

Pommes, poires, cerises, bananes, pêches, abricots, raisins, céréales, ensilages

• Hémorragies pulmonaires

• Dégénérescence des neurones du cortex cérébral

Aflatoxines Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus

Soja, sorgho, noix, amandes, cacahuètes,

fruits secs, maïs

• Hépatites • Hépatone

Mycotoxines à effets

trémorgéniques

(pénitrèmes, verruculogènes, fumitrémorgine, territrème, etc.)

Aspergillus fumigatus Aspergillus terreus Penicillium crustosum Penicillium verruculosum

Fourrages • Tremblements nerveux • Paralysies

Ochratoxines

Aspergillus ochraceus Aspergillus carbonariusPenicillium verrucosum Penicilloium nordicum

Maïs, orge, blé, avoine, noix, vins • Lésions rénales

Fumonisines Fusarium verticillioides Fusarium proliferatum Maïs

• Nécrose des hémisphères cérébraux

• Troubles de la locomotion

Zéaralènone Fusarium graminearumet autres Fusarium

Blé, orge, maïs (bière, porridge), sorgho • Action œstrogène

Trichothécènes

Fusarium divers Stachybotrys atra Myrothecium roridum

Trichoderma

Maïs, orge, mélange alimentaire pour animaux

• Leucopénie • inflammation du

tractus digestif • Vomissements • Immunosuppresseur

Citrinine

Penicillium citrinum

Penicillium verrucosum

Penicillium expansum

Arachides, riz, grains, maïs, orge, blé • Lésions rénales

Sporidesmine Pithomyces chartarum Pâtures (herbes) • Oedème cutané

Tableau 1: Principales mycotoxicoses liées à la consommation d’aliments contaminés par des moisissures

8

Figure 1 : Origines métaboliques des toxines d’Aspergillus fumigatus

Acétate Mevalonate TerpenesPolycétoacides

OO

O

OOO

OCH3

CH3

CH3

CH3

Fumagillines

OCH3

O

OMeOC

COOH

O

CH3

CH3

Trypacidine

Pyruvate

glucose

Triol

Pentose

Shikimate

Acides amines aromatiquesTryptophane Phenylalanine

NO

O

S SN

CH3CH2OH

H

OHH

Gliotoxine

N

N

N

O

CH3O H HO

OHOH

O

H

OCH3

CH3

CH3

CH3

Verruculogene

N

NH

H HCH3CH3COO

CH3

Fumigaclavines

Sphingofungines

PKS

Peptide synthétase

Tryptoquivalines

OH OH

OH OHOH

O

N

N

NH

Acide Helvolique

O

CH3 CH3

CH3

CH3CH3

O

COOH

COOH

COOH

Acétate Mevalonate TerpenesPolycétoacides

OO

O

OOO

OCH3

CH3

CH3

CH3

OO

O

OOO

OCH3

CH3

CH3

CH3

Fumagillines

OCH3

O

OMeOC

COOH

O

CH3

CH3

Fumagillines

OCH3

O

OMeOC

COOH

O

CH3

CH3

Trypacidine

Pyruvate

glucose

Triol

Pentose

Shikimate

Acides amines aromatiquesTryptophane Phenylalanine

NO

O

S SN

CH3CH2OH

H

OHH

Gliotoxine

N

N

N

O

CH3O H HO

OHOH

O

H

OCH3

CH3

CH3

CH3

Verruculogene

N

NH

H HCH3CH3COO

CH3

Fumigaclavines

Sphingofungines

PKS

Peptide synthétase

Tryptoquivalines

OH OH

OH OHOH

O

N

N

NH

Acide Helvolique

O

CH3 CH3

CH3

CH3CH3

O

COOH

COOH

COOH

9

2. LES POLYCETOACIDES ET LES POLYCETOACIDES SYNTHASES

2.1 Les Polycétides (Polykétides)

De par le nombre de composés synthétisés, la voie métabolique des polycétides, issue du

métabolisme de l’acétate semble la principale chez les champignons. En effet il est intéressant

de souligner que sur les 5 familles de mycotoxines soumises à réglementation, seuls les

trichothécènes ne sont pas de nature polycétide. Si on observe attentivement les structures de

ces seuls composés, on est frappé par leur extraordinaire diversité, diversité d’autant plus

surprenante que l’unité de base, l’acétate est somme toute, structuralement très simple. Une

multitude d’activités biologiques découlera de cette variabilité structurale, expliquant le

tropisme et les effets différents de chaque toxine sur les organismes qui les ingèrent. Un

polycétide considéré pourra se comporter comme un antimicrobien, un antifongique, un

antiparasitaire, un antitumoral, un cytotoxique ou un immunodépresseur. Ce large spectre

d’activité est responsable de l’engouement de l’industrie pharmaceutique à leurs égards. La

vente combinée de plus de 40 médicaments de nature polycétide génère plus de 15 milliards

d’euros par an. Qu’ils soient d’origine fongique ou bactérienne, de nombreux polycétides

découverts par le passé connaissent une exploitation commerciale. A titre d’exemple, nous

pouvons citer l’erythromycine A, antibiotique antibactérien à large spectre, les avermectines,

antiparasitaires qui agissent à la fois sur les endo et ectoparasites, la lovastatine (Mevacor®)

utilisée afin d’abaisser les taux élevés de cholestérol total chez les patients atteints

d’hypercholestérolémie, la monensine A, anticoccidien employé en production laitière dans la

prévention de la coccidiose, l’acide mycophénolique (mycophenolate mofetil),

immunosuppresseur principalement employé afin de prémunir le rejet du greffon lors de

greffe de rein. Considéré pendant plusieurs décennies comme une mycotoxine, ce dernier

exemple illustre à merveille la définition du poison énoncée il y a plus de quatre siècle par

10

Paracelse dans son traité Von der Besucht « Toute substance est un poison, il n’y en a aucune

qui n’est pas un poison, seule la dose différentie un poison d’un remède » La patuline, autre

polycetoacide qui fait l’objet du présent travail n’échappe pas à cette définition puisque cette

mycotoxine a fait figure d’antibiotique potentiel, des essais cliniques ayant même été réalisés,

avant qu’elle n’acquiert son statut de mycotoxine.

Le terme polycétide désigne les composés naturels contenant des groupes cétone et/ou

hydroxy, séparés par un atome de carbone. Le processus de leurs synthèses ressemble à celui

des acides gras. Les deux classes de composés dérivent de la condensation d’acides

carboxyliques sous forme d’acétyl-coenzyme A (acétylCoA) et d’acyl-coenzymes A.

(AcylCoAs). L’acétylCoA sera l’unité de départ (Starter Unit) tandis que les acyl-coenzymes

A, généralement le malonyl-CoA, feront figure d’unité d’élongation. Deux différences

fondamentales existent entre les processus de synthèse de ces deux classes de composés. La

première réside dans le fait que certaines polycétides synthases requièrent un autre acide

carboxylique que la acétylCoA comme unité de départ, contrairement aux acides gras

synthases qui utilisent exclusivement de l’acétylcoA. La seconde réside dans le

fonctionnement même de ces enzymes. Si pour un acide gras, la réduction des groupements β-

cétones est systématiquement complète par un cycle bien défini de réactions (kétoréduction,

déshydratation, et enoylréduction) avant la prochaine condensation, un polycétide lui a un

niveau de réduction très variable due à la perte partielle ou totale de ces réductions. Lors de la

kétoréduction qui survient après une nouvelle condensation, le groupe β-cétone peut être

réduit par un site catalytique NADPH dépendant ou kétoréductase (KR). Le groupement

hydroxyl obtenu peut par la suite être déshydraté par une déshydratase (DH) pour générer un

groupement enoyl (-CH=CH-) Enfin un dernier site catalytique NADPH dépendant viendra

hydrogéner le groupement enoyl pour saturer totalement le groupement β-cétone de l’unité

d’élongation nouvellement incorporée. Le fonctionnement successif de ces sites catalytiques

11

implique que les activités DH et ER ne seront fonctionnelles que si l’activité kétoréductase est

effective. Pour les acides gras synthases, les cycles successifs de condensation et réductions

conduiront systématiquement à la synthèse de chaînes aliphatiques saturées. Par contre, pour

les polycétides synthases, le niveau de complexité du fonctionnement d’une polycétides

synthase considérée s’accroît d’autant plus que l’étape de réduction ne suit pas

nécessairement le même schéma après chaque condensation. De même, certaines polyketides

synthases peuvent intégrer d’autres sites catalytiques « facultatifs » tels que des méthyl

transférases qui permettent la fixation d’un groupement méthyle sur un atome de carbone. La

combinaison de ces deux phénomènes aboutit à la synthèse d’une incroyable diversité de

molécules.

Prenant en compte le niveau de réduction, Nicholson a introduit en 2001 une nouvelle façon

de classer les composés polycétides en instaurant trois catégories, les polycétides non réduits,

les polycétides moyennement réduits et les polycétides fortement réduits. Avant ce jour les

différents manuels traitant des métabolites secondaires avaient coutume de classer les

différents polycétides selon le nombre d’unités acétates qui les composent en tri, téta, penta,

hexa, …kétides.

Aucune étape de réduction ne survient au cours de la synthèse des polycétides non réduits.

L’exemple certainement le plus connu dans le monde des mycotoxines est l’acide

norsolorinique, premier précurseur des aflatoxines et de la sterigmatocystine. Parmi les autres

composés d’origine fongique, nous pouvons citer le 1, 3, 6, 8, tetrahydroxy naphtalène

(THN), précurseur de la melanine chez C. lagenarium, la citrinine chez Monascus ruber, la

bikaverine chez Gibberella fujikuroi.

Le seul exemple de polycétide partiellement réduit est l’acide 6 methylsalicylique, précurseur

de la patuline, qui nécessite pour sa synthèse d’un seul cycle de réduction aboutissant à la

formation d’un hydroxy.

12

Les exemples de polycétones hautement réduits sont beaucoup plus nombreux chez les

ascomycetes.

Il est important de signaler que certaines structures nécessitent l’action de plusieurs polycétide

synthases. C’est le cas de la lovastatine chez Aspergillus terreus composée de deux

polycétides, une nonakétide et une dikétide très fortement réduites (Hendrickson et al, 1999)

ainsi que de la zéaralénone produite par Gibberela zeae qui fait appel pour sa synthèse à deux

polycétide synthases. Bien que les deux polycétides ne soient pas caractérisés, l’analyse des

séquences proteiques des deux PKS présage qu’une des deux est fortement réduite tandis que

l’autre est non réduite (Kim et al, 2005, Gafford et Trail, 2006).

2.2 Les Polycétides synthases

L’enzyme requise pour la condensation des dérivés de Coenzymes A (CoA) acétylés pour

former un polycétide est appelé polycétide synthase (PKS). Jusqu’à récemment ces PKS

n’étaient recensées que chez les procaryotes et les champignons filamenteux. Il existe 3 types

de polycétides synthases. Vraisemblablement, les PKS ont évolués à partir des acides gras

synthases. Elles ont donc été classées très tôt selon leur similarité envers les deux types

d’acide gras synthases. La PKS type I présente une ressemblance prononcée avec les acide

gras synthases de Type I de vertébrés. Type II, si la similarité est plus forte envers les acide

gras synthases de type II des bactéries et des plantes. Les polycétide synthases du premier

type sont principalement rencontrées chez les champignons filamenteux et chez les bactéries,

et plus particulièrement chez les actinomycetes. Les PKS de type I d’origine bactérienne sont

de grosses protéines multifonctionnelles hétéromériques, qualifiées de modulaires. Les

enzymes bactériennes de ce type comporte des sites catalytiques actifs différents pour chaque

étape enzymatique. Il y aura autant de sites actifs sur l’ensemble des sous unités qu’il faut

d’étapes enzymatiques pour synthétiser le produit de l’enzyme. Les sites actifs sont

13

rassemblés en modules formés d’au moins trois domaines indispensables pour une

condensation, le domaine kétosynthase responsable de la réaction de condensation en tant que

telle, l’acyl carrier protéine (ACP), sorte de bras flexible qui maintient les intermédiaires

biosynthétisés jusqu’à la dernière étape réactionnelle. Et enfin le domaine acétyl transférase

(AT) qui apporte les unités d’élongation. A ceux-ci s’ajouter les sites optionnels participant

aux étapes de réductions, kétoréductase (KR), déshydratase (DH), l’énoyl réductase (ER). Ces

modules sont associés sur un même polypeptide et sont utilisés une seule fois durant

l’assemblage du polycétone. C’est ainsi que l’ordre successif des modules, leur nombre ainsi

que leur contenu (domaines fondamentaux et optionnels) conditionnent la structure finale du

polycétone par le choix des unités de structure, la longueur de la chaîne de carbones et le

nombre de cycles de réaction (Liou et Khosla, 2003).

La grande différence entre la PKS de type I bactérienne et fongique réside dans l’utilisation

itérative généralement partielle chez le champignon des différents domaines présent sur le

polypeptide. La combinaison d’activités réitérées et non réitérées suggère que les enzymes

fongiques de type I peuvent reconnaître la structure des intermédiaires et peuvent par

conséquent déterminer le moment où les réactions de réductions et déshydratations seront

effectives.

L’exemple le plus étudié de PKS fongique de type I est celui de l’acide 6-methylsalicylique

synthase (Figure 2). La 6-MSAS est une PKS qui contient les sites catalytiques suivants KS,

AT, DH, KR et ACP de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale (Beck et al, 1990).

La première PKS fongique a été purifiée au début d’année 1970 (Dimroth et al, 1970). La

protéine active est un tétramère constitué de 4 unités identiques de 190 kDa.

La réaction débute par une première condensation qui n’est pas suivie par une réaction de

réduction/ déshydratation. Une deuxième étape de condensation s’ensuit. Les activités

kétoréductase (KR) et déshydratase (DH) ne sont requises qu’une seule fois au cours de la

14

Figure 2 : Schéma hypothétique du fonctionnement de l’acide 6-méthylsalicylique synthase

Schéma en accord avec Dimroth et al, 1970

S-CO-CH3

S-CO-CH2-COOH E

E

ES-CO-CH2-CO-CH3

SH

malonyl-CoA

acetyl-CoA

ES-CO-CH2-CO-CH3

S-CO-CH2 -COOH

ES-H

S-CO- CH2 -CO - CH2 -CO-CH3

TRANSFERT DE L’ACETYL

CONDENSATION CO2

CO2

malonyl-CoA

TRANSFERT DU MALONYL

H2O

NADPH

REDUCTION

OH

COOH

CH3

CO

CH2

CH2

H

OHCH3

O

SH

S-E

E

H2O

DESHYDRATATION

S

S-H E

C O C H 2

C HC HC H 3

O

SH

S-

C O O C H 3

malonyl-CoA S-CO-CH2-COOH

S

TRANSFERT DU MALONYL

E

C O OC H 3

C O O

C H3

O

CO2

CONDENSATION

E SH

O H

C H 3

CYCLISATION

DESACYLATION

ACP

KS

S-CO-CH2-CO-CH3 ACP

SKS

ESKS

ACP SH

TRANSFERT DU MALONYL

KS

S C O ACP

E S-

S-HKS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

KS

ACP

CONDENSATION

15

synthèse de l’acide 6-methylsalicylique, quand l’intermédiaire 3-oxohexanoylthioester est

réduit et déshydraté en cis-5-oxo-3-hexenoylthioester.

Après la troisième condensation, la chaîne de polycétone se cyclise par le biais d’une

déshydratation et une énoylisation pour donner l’acide 6-methylsalicylique. La libération de

l’acide du site d’acyl carrier protéine ne nécessite pas l’action d’un domaine Thioestérase

impliqué dans l’hydrolyse du polycétone formé. Ce site de thioestérase est présent dans de

nombreuses PKS fongiques de type I tels que l’acide norsolorinique synthase. Dans le cas de

la-6MSAS, cela suggère la présence d’un mécanisme alternatif qui n’a pas encore été vérifié

expérimentalement.

De sa structure primaire déterminée par Beck, les domaines catalytiques KS, AT, KR, et ACP

ont pu être déterminés après alignement avec d’autres séquences d’acide gras synthétases et

de PKS. Le domaine DH est beaucoup plus incertain. Très récemment, une zone

indispensable à l’interaction entre deux sous-unités a été mise en évidence par co-expression

hétérologue de deux ORF amputée l’un à l’extrémité N-terminale et l’autre à l’extrémité C-

terminale (Moriguchi et al, 2006). Bien que le rendement d’acide 6-methylsalicylique chute

drastiquement, celui-ci peut être synthétysé à condition que cette région soit présente sur les

deux ORF. Cette région se situe entre les domaines DH et KR, entre les positions 1241 et

1262 de la séquence protéique de l’acide 6-methylsalicylique synthase ATX d’Aspergillus

terreus.

Les PKS de type II exclusivement bactérienne se présentent sous forme de complexe

multienzymatique. A la différence des PKS de type I, les différents domaines actifs sont sur

des polypeptides distincts. L’autre différence des PKS II réside dans le choix des unités de

départ autre que l’acetyl CoA tels que le malonyl-CoA, le methylmalony-CoA, le butiryl-

CoA, et le propionyl Co-A. Les gènes codant pour chaque polypeptide sont regroupés sous

forme de cluster afin d’être exprimés et traduits simultanément. L’actinorhodine, la

16

tétracenomycine, les tétracyclines et la daunorubicine font partie des nombreux exemples de

molécules issues de l’activité de polycétides synthases de type II.

Il existe un troisième type de PKS très distinct des PKS de type I et II. Sa grande particularité

réside dans l’absence de domaine ACP. Ainsi les esters CoA ne sont pas portés par l’ACP lors

des étapes réactionnelles. Les PKS de type III regroupent toutes les polycétides synthases de

plantes de type Chalcone synthase (CHS), 2-pyrone synthase, stylbène synthase. Ces

polyketides synthases sont essentielles pour la synthèse des phytoalexines anti-microbienne,

les pigments floraux anthocyaniniques et les inducteurs de la nodulation chez Rhyzobium.

Jusqu’à très récemment, les PKS de type III étaient considérées comme les polycétides

synthase du règne végétal, puisqu’aucune polycétide synthase homologue aux chalcone

synthase n’avait été isolée d’autres organismes. Depuis 1999, plusieurs gènes bactériens

codant pour des protéines similaires aux CHS ont été isolés. A titre d’exemple nous pouvons

citer le gène rppA qui code pour une enzyme responsable de la synthèse du 1,3,6,8

hydroxynaphthalene (Funa et al,1999). La synthèse du 1,3,6,8 tetrahydroxynaphthalene

illustre bien le concept de convergence évolutive puisque ce composé est synthétisé chez les

champignons par une polycétide synthase de type I (Fujii et al, 1999) et chez les Streptomyces

par une polycétide de type III.

Très récemment, 4 gènes codant pour des protéines synthases de type chalcone synthase ont

été isolés du génome d’Aspergillus oryzae (Seshime et al, 2005). L’analyse génomique

effectuée par la suite, révèle la présence d’une seule PKS de type III dans les génomes de

Neurospora crassa et de Fusarium graminearum, 3 dans les génomes de Magnaporthe grisea

et de Podospora anserina et 3 dans le génome du basidiomycete Phanerochaete

chrysosporium. Bien que présent dans le génome des champignons, ce type de PKS reste

17

marginal au regard du nombre de gènes codant pour des PKS de type I. A titre d’exemple, le

gènome de Fusarium graminearum recèle 16 PKS de ce type (Kroken et al, 2003).

3. ORGANISATION DES GENES DES VOIES DE BIOSYNTHESE DE

METABOLTITES SECONDAIRES

Généralement la voie de biosynthèse d’une toxine de nature polycétide ne se résume pas à la

seule implication d’une polycétide synthase. Ce premier précurseur polycétide ainsi

synthétisé, il sera selon la toxine considérée, successivement pris en charge, par des enzymes

de transformation aussi diverses que des cytochromes P450, des oxydoréductases, des

décarboxylases, des acétyltransférases, des O-méthyltransférases pour aboutir en fin de chaîne

à la synthèse d’un métabolite qui ne sera plus transformé, la toxine. Cette toxine généralement

délétère pour le champignon producteur sera alors évacuée hors de l’organisme.

Du point de vue moléculaire, toutes les enzymes fonctionnent au même moment de façon que

les nouveaux produits synthétisés soient pris en charge tour à tour par l’enzyme suivante dans

la cascade réactionnelle. Ce phénomène implique donc que les gènes codant pour ces

enzymes soient activés au même moment. La co-activation de tous les gènes impliqués dans

une voie, est rendue possible par l’organisation même de ces gènes sur l’un des chromosomes

de l’organisme producteur. En effet tous les gènes codant pour des enzymes sont regroupés à

l’intérieur d’une même région appelée « cluster » (Figure 3). Parmi ces gènes figure un gène

codant pour un facteur de régulation, généralement un activateur qui en réponse à un stimulus,

activera tous les gènes contigus à l’intérieur du cluster. La présence d’un tel facteur dans un

cluster de voie de biosynthèse ne constitue pas une obligation puisqu’il existe des exemples

de cluster ne possédant pas de facteur de régulation en son sein. C’est le cas du cluster de

gènes impliqués dans la synthèse des fumonisines.

18

Par contre il n’existe aucune exception dérogeant à la règle concernant l’organisation des

gènes impliqués dans la synthèse de métabolites secondaires quelques soient leurs natures,

qu’ils soient de nature polycétide (aflatoxines, fumonisines, sterigmatocystine) (Trail et al,

1995, Brown et al, 1996, Seo et al, 2001), terpénique (trichothécènes) (Hohn et al, 1993),

peptidique (alcaloïdes de l’ergot, paxilline, gliotoxine) (Tudzynski, 1999, Young et al, 2001,

Gardiner et Howlett, 2005)

Figure 3 : A. Carte du groupe de gènes impliqués dans la biosynthèse des trichotécènes chez F. sporotrichoides. B. Carte du groupe de gènes (cluster) impliqués dans la biosynthèse des aflatoxines chez A. flavus et A. parasiticus.

Tri8 Tri7 Tri3 Tri4 Tri6 Tri5 Tri9 Tri11 Tri12

Regulateur TRI6

vbs omtA ord2 ord1 avnA ver1 aad aflR fas nor1 pks A

AFLR

A

B

19

4. LA PATULINE

4.1 Espèces fongiques productrices de patuline

La patuline (Figure 4) possède une longue histoire. Elle a été découverte dans l’enthousiasme

général, durant l’effort de criblage de nouvelles molécules d’origine fongique dans le cadre de

la recherche de nouveaux antibiotiques suite à la découverte de la penicilline par Fleming

durant les années 1938-1943.

Avant sa découverte comme produit de Penicillium patulum (synonymes : Penicillium

urticae, Penicillium griseofulvum) par le groupe d’Harold Raistrick, elle a été détectée

indépendamment dans des extraits de culture de nombreuses espèces d’Aspergillus et de

Penicillium dont notamment, Penicillium expansum, Penicillium claviforme et Aspergillus

clavatus. Pour cette raison, cette molécule fut connue un temps sous plusieurs noms

(claviformine, clavacine, clavatine, expansine, leucopine, mycoine, penicidine et tercinine)

bien que de nos jours, seul le nom de patuline ait perduré.

OO

O OH

H

Figure 4: Structure de la patuline

A ce jour, la patuline a été isolée comme métabolite secondaire de diverses espèces

appartenant au genre Penicillium, Aspergillus, Paecilomyces et Byssochlamys. Une analyse

20

exhaustive de la littérature, faisant référence à d’anciens travaux comptabilise à plus de 60 les

espèces produisant cette toxine (Moake et al, 2005). La grande majorité des espèces

productrices de patuline appartient à la famille des trichocomaceae. Le tableau 2 recense les

différentes espèces de cette famille, qui ont été rapportées comme productrices de patuline.

Le principal genre producteur de patuline s’avère le genre Penicillium. Une étude récente sur

les métabolites secondaires excrétés par les Penicillium recense 13 espèces productrices

uniquement pour les espèces appartenant à Penicillium sous genre Penicillium. A l’intérieur

de ce sous genre, cette toxine est relativement fréquente au sein des sections Penicillium et

Roqueforti. Par contre, il est important de noter qu’aucune espèce de la section Viridicata ne

synthétise ce métabolite secondaire. Dans la section Roqueforti qui englobe trois espèces (P.

roqueforti, P. carneum et P. paneum), seules les deux dernières sont capables de synthétiser la

toxine, l’espèce Penicillium roqueforti sensus stricto, utilisée en fromagerie pour l’élaboration

de pâtes persillées ne produit pas de patuline (Boysen M. et al 1996, Nielsen K.F.et al , 2006).

Une grande majorité des espèces de la section Penicillium s’avère productrice de patuline : P.

expansum, P. marinum, P. sclerotigenum, P. dipodomyicola, P. griseofulvum, P.

concentricum, P. coprobium, P. glandicola (Syn : P. divergens, P. granulatum, P.

clavigerum, P. vulpinum, P. gladioli. Au sein de ce sous genre plusieurs espèces ont été

reportées productrices de patuline, mais leurs productions ont été infirmées par les auteurs de

l’étude précédente. Il s’agit des espèces P. aurentiogriseum, P. brevicompactum, P.

chrysogenum, P. commune (Syn, P.lanosum) , P. crustosum (Syn : P. terrestre), P.

echinulatum , P. hirsutum, P. italicum, P. verrucosum, P. viridicatum et Penicillium

roqueforti.

En revanche, peu d’espèces de Penicillium appartenant aux autres sous genres produisent de

la patuline, c’est le cas de Penicillium novae-zeelandiae, de P. melinii, d’Eupenicillium

lapidosum, d’E. javanicum, Penicillium lignorum, P. duclauxii.

21

Table 2: Espèces de la famille des Trichocomaceae, rapportées productrices de patuline

sous genre Penicillium

Section Coronata Penicillium brevicompactum Paterson et a l, 2003, Frisvad et al , 2004Section Chrysogena Penicillium chrysogenum Leistner et Pitt, 1977, Frisvad et al , 2004 Section Penicillium Penicillium clavigerum Svendsen et Frisvad, 1994, Frisvad et al , 2004 Penicillium concentricum Leistner et Eckardt, 1979, Frisvad et al , 2004 Penicillium coprobium Frisvad et Filtenborg, 1989, Frisvad et a l, 2004 Penicillium dipodomyicola Frisvad et al , 1987, Frisvad et al , 2004 Penicillium expansum Anslow et al , 1943, Frisvad et al , 2004 Penicillium gladioli Frisvad et al , 2004 Penicillium glandicola Frisvad et Filtenborg, 1989, Frisvad et al , 2004

Penicillium griseofulvum Anslow et al , 1943, Frisvad et al, 2004

Penicillium italicum Okeke et a l, 1993, Frisvad et al , 2004 Penicillium marinum Frisvad et al, 2004 Penicillium vulpinum Chain et al , 1942, Bergel et al , 1943, Frisvad et al , 2004 Penicillium sclerotigenium Frisvad et al , 2004Section Roqueforti Penicillium carneum Frisvad et Filtenborg, 1989, Boysen et al , 1996, Penicillium paneum Boysen et al , 1996, Penicillium roqueforti Olivigni et Bullerman, 1978, Boysen et al , 1996, Section Viridicata Penicillium aurentiogriseum Steiman et al , 1989, Frisvad et al , 2004 Penicillium commune Oh et al , 1998, Frisvad et al , 2004 Penicillium crustosum Northolt et al , 1978, Frisvad et al , 2004 Penicillium echinulatum Okeke et al , 1993, Frisvad et al , 2004 Penicillium hirsutum Okeke et al , 1993, Frisvad et al , 2004 Penicillium verrucosum Oh et al , 1998, Frisvad et al , 2004 Penicillium viridicatum Frank, 1972, Frisvad et al , 2004

Autres sous genres Pencillium duclauxii Okeke et a l, 1993 Eupenicillium javanicum Okeke et al , 1993 Eupenicillium lapidosum Mirchink, 1967 Penicillium lignorum Okeke et al ,1993 Penicillium melinii Abraham et Florey, 1949 Penicillium novae-zeelandiae Alfaro et al , 2003

PENICILLIUM

TRICHOCOMACEAE

RéferencesEspèces fongiques

non confirméenon confirméenon confirméenon confirméenon confirmée

Production de patuline

infirmée

infirmée

infirméeavérée

avéréeavérée

non confirmée

avérée

infirméeinfirmée

avérée

avérée

avéréeavérée

avérée

avéréeavérée

ASPERGILLUS

avéréeavérée

infirmée

infirmée

infirméeinfirméeinfirméeinfirmée

Section Clavati Aspergillus clavatus Wiesner, 1942, Varga et al , 2003 Aspergillus giganteus Florey et al , 1944, Varga et al , 2003

Aspergillus longivesisca Varga et al , 2003 Aspergillus pallidus Varga et al , 2003Section Terrei Aspergillus terreus Varga et al , 2005

Byssochlamys nivea Karow et Foster, 1944, Byssochlamys fulva Escoula, 1975, Rice et al , 1977

Avérée: Production de patuline constatée à partir de souches référencées dans les collections internationales, caractérisées et identifiées à l'aide de méthodes moléculaires et/ou de l'analyse du métabolisme secondaireInfirmée: Aucune trace détectée de patuline dans des cultures de souches dont l'identification a été vérifiée par l'outil moléculaire et/ou l'analyse du métabolisme secondaire

TRICHOCOMACEAE avérée

infirmée

non confirméenon confirmée

avéréeavéréeavérée

BYSSOCHLAMYS

ASPERGILLUS

22

Contrairement au genre Penicillium, le genre Aspergillus semble moins prolifique en termes

d’espèces productrices de patuline. A ce jour, on dénombre seulement cinq espèces réputées

productrices de la mycotoxine, Aspergillus clavatus, Aspergillus giganteus (Florey et al,

1944), Aspergillus longivesica, A. pallidus et Aspergillus terreus (Kent et Heatley, 1946). Les

premières mentions de production de patuline par une espèce d’Aspergillus datent de la

découverte de la toxine puisque c’est à partir de filtrats d’Aspergillus clavatus que Wiesner

rapporta, le premier, l’effet bactéricide d’une substance qui se révélera être la patuline

(Wiesner, 1942, Bergel et al, 1943). Il est important de préciser que les deux premières

espèces présentent des caractères morphologiques tellement similaires que les taxonomistes

ont longtemps hésité sur la validité de cette espèce, avant de confirmer le statut d’espèce à

l’avènement de la taxonomie moléculaire. Une révision taxonomique récente des espèces de

la section Clavati a montré que deux autres espèces A. pallidus et A. longivesica

phylogénétiquement proches de ces deux espèces, produisaient de la patuline (Varga et al,

2003). Jusqu’à la publication récente de l’étude conduite par Varga, il n’existait aucun travail

depuis plus de 35 ans faisant référence à la synthèse de la patuline par Aspergillus terreus,

espèce non apparentée au groupe Clavati, bien que celle-ci soit régulièrement mentionnée

(Varga et al, 2005). Reposant sur 75 souches caractérisées par l’outil moléculaire, cette étude

conclut de manière définitive qu’aucune espèce de la section Terrei, Aspergillus terreus

compris ne produit la patuline.

Enfin, au sein de la famille des trichocomaceae, un troisième groupe d’espèces associées à la

synthèse de la patuline a été identifié. Il s’agit de Paecilomyces variotii ainsi que deux

espèces du genre téléomorphe associé à Paecilomyces, Byssochlamys nivea et Byssochlamys

fulva. Karow et Foster avaient initialement rapporté qu’une espèce non identifiée de

Gymnoascus produisait de la patuline (Karow et Foster, 1944). Cette espèce fut plus tard

identifiée comme Byssochlamys nivea. Deux auteurs ont indépendamment décrit la production

23

de patuline par l’espèce Byssochlamys fulva (Escoula, 1975, Rice et al, 1977). Il est important

de souligner que ces descriptions reposent sur un très faible nombre de souches. En effet,

tandis que la première étude rapportait qu’une seule souche de B. fulva sur les 4 testées,

produisait de la patuline, la seconde étude n’en recensait que deux. Ces données ont été

maintes fois reprises dans de nombreuses publications consacrées à la patuline. Très

récemment, des travaux basés sur une caractérisation macro et micro-morphologique de

souches des deux espèces ont conclu à la non-production de patuline par B. fulva. Ces travaux

initient une controverse qui méritait d’être éclaircie, puisque B. fulva est décrite comme

l’espèce de Byssochlamys contaminant les fruits et les produits transformés à base de fruit

(Houbraken, 2006).

Bien que tous les membres de la famille des trichochomacea ne produisent pas

systématiquement la patuline, la faculté à synthétiser cette toxine semblerait être un caractère

spécifique de cette famille, s’il n’existait plusieurs mentions de production par quelques

espèces de la classe des Pezizomycotina telles que Alternaria tenuissima, Scopulariopsis flava

et Stemphylium sp. (Okeke et al, 1993). La production de patuline par la première espèce

citée semble douteuse, puisque Alternaria tenuissima qui fait figure d’espèce fongique

régulièrement étudiée pour ses métabolites secondaires, n’a fait l’objet d’aucune autre

mention sur son éventuelle capacité à synthétiser la toxine. Bien que le doute persiste pour

cette espèce, la production de patuline par des espèces non apparentées à la famille des

trichocomaceae ne doit pas être écartée, d’autant qu’il existe plusieurs exemples de

précurseurs ou de composés structuralement proches de la patuline produits par des espèces

appartenant à d’autres familles fongiques. C’est le cas de l’isoépoxydon et de la phyllostine,

précurseurs survenant tardivement lors de la synthèse de la patuline, qui sont respectivement

produits par Poronia punctata (Gloer et Truckenbrod, 1988) et Phyllosticta sp (Sakamura et

al, 1970, 1971). C’est aussi le cas de la longianone produite à partir de Xylaria longiana qui

24

partage avec la patuline la même voie de biosynthèse, jusqu’aux dernières étapes

réactionnelles (Edwards et al, 1999, Goss et al, 1999). Tous ces produits témoignent de la

présence dans les génomes de certains champignons, de nombreux gènes impliqués dans la

voie de biosynthèse de la patuline.

4.2 Biosynthèse de la patuline

La patuline est le nom trivial de la 4-hydroxy-4H-furo [3,2c] pyran-2(6H) one. Il s’agit d’une

lactone hydrosoluble de masse moléculaire de 154,12. Elle forme des cristaux incolores et

présente un point de fusion de 111°C (Windholz, 1983, Weast 1985). Elle est soluble dans de

nombreux solvants tels que l’éthanol, l’acétone, l’acétate d’éthyle, l’éther et le chloroforme,

mais totalement insoluble dans le benzène ou l’éther de pétrole. Son maximum d’absorbance

(λmax) se situe à 275 nm avec un coefficient d’absorption moléculaire (ε) de 16 600.

4.2.1 Elucidation chimique et enzymatique de la voie de biostnthèse de la patuline

Du point de vue strictement chimique, la voie de biosynthèse est relativement bien étudiée

bien qu’il existe certaines incertitudes sur l’implication de quelques composés comme

précurseurs directs. La figure 5 résume la voie de biosynthèse.

L’étude de la biosynthèse de la patuline est significative pour de multiples raisons. Tout

d’abord, l’hypothèse de Birch, selon laquelle l’acétate est l’unité de base dans la synthèse de

nombreux métabolites secondaires repose sur ses travaux mettant en évidence l’incorporation

d’acétate radiomarqué dans l’acide 6 méthylsalicylique (6MSA) (Birch et al, 1955). Ces

travaux ont confirmé l’existence d’une nouvelle classe de molécules naturelles suggérée par

Collie, les polycétides. Cette découverte a été importante parce qu’elle constituait la première

preuve que des cellules eucaryotes pouvaient synthétiser des noyaux aromatiques à partir de

l’acétate et non à partir de sucres issus de la voie de l’acide shikimique. Deuxièmement, la

25

première enzyme de la voie de biosynthèse, l’acide 6-methylsalicylique synthase (6MSAS) a

été la première polycétide synthase étudiée in vitro (Lynen et Tada, 1961). Enfin, les études

sur la production de la patuline en cultures immergées de P. urticae ont permis d’affirmer que

le métabolisme secondaire est un phénomène associé à la phase stationnaire, l’idiophase

survenant après la phase de croissance.

4.2.2 Premières étapes (Acétate→Gentisaldehyde)

La première étape de la production de la patuline réside en la formation de l’acide 6

méthylsalicylique, par condensation d’une molécule d’acétyl coA et de 3 molécules de

malonyl coA grâce à l’action d’une seule enzyme multifonctionnelle, l’acide 6-

methylsalicylique synthase (6MSAS). Les différents domaines catalytiques intervenant dans

les activités suivantes ont été identifiés sur la 6MSAS, l’acétyl/ malonyl transférase, la

ketoacyl synthase, la kétoréductase et la déhydratase. Cette enzyme est composée de quatre

chaînes polypeptidiques identiques d’un poids moléculaire de 176 kDa. La présence de

NADPH est essentielle pour la synthèse d’acide 6-methylslaicylique puisque en absence de

NADPH le produit exclusif de l’enzyme sera la lactone de l’acide triacétique (Spencer and

Jourdan, 1992).

Bu’Lock et Tanenbaum ont montré que le 6MSA spécifiquement marqué était converti en

patuline (Tanenbaum et Basset, 1958). Le nombre d’étapes enzymatiques permettant la

transformation du 6MSA en patuline est estimé à environ 10. Plusieurs méthodologies ont été

employées afin de déterminer l’identité des différents précurseurs directs de la patuline.

Plusieurs techniques faisant appel aux isotopes stables 2H, 13C ou radioactifs 3H, 14C ont été

mises au point et appliquées à l’élucidation de la voie de biosynthèse de la patuline. Forrester

et Gaucher (1972a) ont introduit une technique intéressante de marquage cinétique établissant

26

Figure 5. Voie de biosynthèse de la patuline et des composés apparentés. Les composés accompagnés d’un astérisque sont des précurseurs avérés de la patuline. Sont considérés comme des produits terminaux de cette matrice métabolique, l’acide m-hydroxybenzoique, l’acide gentisique, le toluquinol et la patuline (D’après Priest and Light, 1989 et Fedeshko, 1992)

COOH

CH3

OH

Acetyl-CoA+

3 malonyl-CoAAcide 6-methylsalicylique *

Acide 6-methylsalicyliqueSynthase

CH3

OHm-cresol *OH

OHNADPHNADP+

O2H2O

Acide 6-methylsalicylique decarboxylase

m-hydrobenzyl alcool *

NADPH NADP+

OH

OHOH

OH

H

O

m-hydrobenzaldehyde *

NADP+

NADPH O2

H2O

Gentisyl alcoolOH

H

OOH

NADP+

NADPH O2

H2O

Gentisylaldehyde *

NADPH NADP+

OH

OCH2OH

H

O

H

H

Isoepoxydon *

NADPH

NADP+

O

O

O

CH2OHH

H

Phyllostine *O

O

H

OH

O

OO

O OH

H

Neopatuline * Ascladiol * Patuline

J2

(Penicillium grisefulvum J1)(Phyllosticta sp. )

(Phyllosticta sp. )(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Byssochlamys nivea)

NADPH NADP+

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium careum, P. paneum)(Penicillium novae zelandiae)(Aspergillus clavatus)(Byssochlamys nivea)

(Penicillium griseofulvum)(Aspergillus clavatus)

NADPH NADP+

J1

NADP+

NADPH O2

H2O

Isoepoxydondéshydrogénase

OH

OH

CH3

Toluquinol

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium novae zeelandiae)(Phyllosticta sp. )

(Penicillium griseofulvum J2)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum S11)

(Poronia punctata)

OH

OH

OH

O

NADPHNADP+

O2H2O

Acide gentisique(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium paneum)

S11

OH

OH

O

NADPHNADP+

O2H2OAcide m-hydrobenzoique

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium novae zeelandiae)

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium paneum)

S15

CH2OH

O

O

CH2OH

COOH

CH3

OH

Acetyl-CoA+

3 malonyl-CoAAcide 6-methylsalicylique *

Acide 6-methylsalicyliqueSynthase

CH3

OHm-cresol *OH

OHNADPHNADP+

O2H2O

NADPHNADP+

O2H2O

Acide 6-methylsalicylique decarboxylase

m-hydrobenzyl alcool *

NADPH NADP+NADPH NADP+

OH

OHOH

OH

H

O

m-hydrobenzaldehyde *

NADP+

NADPH O2

H2ONADP+

NADPH O2

H2O

Gentisyl alcoolOH

H

OOH

NADP+

NADPH O2

H2ONADP+

NADPH O2

H2O

Gentisylaldehyde *

NADPH NADP+NADPH NADP+

OH

OCH2OH

H

O

H

H

Isoepoxydon *

NADPH

NADP+

NADPH

NADP+

O

O

O

CH2OHH

H

Phyllostine *O

O

H

OH

O

OO

O OH

H

Neopatuline * Ascladiol * Patuline

J2

(Penicillium grisefulvum J1)(Phyllosticta sp. )

(Phyllosticta sp. )(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Byssochlamys nivea)

NADPH NADP+NADPH NADP+

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium careum, P. paneum)(Penicillium novae zelandiae)(Aspergillus clavatus)(Byssochlamys nivea)

(Penicillium griseofulvum)(Aspergillus clavatus)

NADPH NADP+NADPH NADP+

J1

NADP+

NADPH O2

H2ONADP+

NADPH O2

H2O

Isoepoxydondéshydrogénase

OH

OH

CH3

Toluquinol

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium novae zeelandiae)(Phyllosticta sp. )

(Penicillium griseofulvum J2)

(Penicillium griseofulvum)

(Penicillium griseofulvum S11)

(Poronia punctata)

OH

OH

OH

O

NADPHNADP+

O2H2O

NADPHNADP+

O2H2O

Acide gentisique(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium paneum)

S11

OH

OH

O

NADPHNADP+

O2H2O

NADPHNADP+

O2H2OAcide m-hydrobenzoique

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium novae zeelandiae)

(Penicillium griseofulvum)(Penicillium carneum)(Penicillium paneum)

S15

CH2OH

O

O

CH2OH

27

le suivi du métabolisme du précurseur radiomarqué et l’apparition de nouveaux métabolites.

Durant la même période, une autre équipe a confirmé ces résultats, par des études in vivo à

l’aide de précurseurs deutérés (Scott et al, 1973).

Le premier précurseur, l’acide 6 méthylsalicylique, est dans un premier temps décarboxylé en

m-crésol, son groupement méthyle est ensuite oxydé pour former un groupement aldéhyde, le

noyaux aromatique ensuite hydroxylé pour aboutir au gentisylaldéhyde.

Tous ces produits sont structurellement très similaires à la 6MSA. A partir du gentisaldehyde,

il semble que la succession des différents précurseurs soit beaucoup plus floue. En effet, le

passage du gentisaldehyde en une structure bicyclique telle que la patuline nécessite

l’ouverture du noyau par un mécanisme pouvant être médié soit par une monooxygénase soit

par une dioxygénase comme cela peut survenir dans le monde bactérien. L’obtention et la

caractérisation de mutants (P3, S15, J2, J1 et S11) incapables de produire la patuline a permis

d’élucider en partie cette zone d’ombre, en facilitant l’isolement de quatre autres précurseurs

potentiels de la patuline, l’ (+)-isoepoxydon et la (-)-phyllostine (2-hydroxymethyl-5,6 epoxy-

1,4 benzoquinone), la néopatuline et l’ascladiol (Sekiguchi et Gaucher, 1978, Sekiguchi et

Gaucher, 1979a, Sekiguchi et Gaucher, 1979b, Sekiguchi et al, 1983). Tous pouvaient être

convertis in vivo ou in vitro en patuline.

L’ajout de [2-14C] acétate et de [G-3H] gentisaldehyde à des cultures du mutant J1 a permis de

vérifier l’incorporation de ces produits marquées dans la phyllostine. De même, la [14C]

phyllostine ajoutée dans une culture de la souche sauvage de P. urticae a été incorporée en

patuline. L’interconversion entre l’isoépoxydon et la phyllostine semblait probable, leur

relation structurale suggérant l’action d’une alcool déshydrogénase.

Plusieurs hypothèses ont été émises concernant l’identité du premier intermédiaire non

aromatique, soit la quinone époxydée (phyllostine) soit sa forme réduite (isoépoxydon),

conduisant à l’ouverture du cycle.

28

Plusieurs activités enzymatiques ont été caractérisées à partir d’extraits cellulaires bruts ou de

différentes préparations cellulaires. De même, plusieurs enzymes ont été partiellement ou

entièrement purifiées.

L‘acide 6-methylsalicylique décarboxylase a d'abord été purifiée séparément par Vogel et

Light (Vogel, 1971 et Light, 1969). Deux activités hydroxylase convertissant le m-crésol en

2.5 dihydroxytoluene (toluquinol) ou en m-hydroxybenzylalcool ont ensuite été détectées

dans des fractions séparées (Murphy, G et al, 1974). L’utilisation de précurseurs

radiomarqués a révélé que la methyl hydroxylation du m-crésol représentait une étape clé

dans la synthèse de la patuline. Une activité enzymatique permettant l’hydroxylation du m-

hydroxybenzyl alcool en gentisyl alcool a été caractérisée dans d’autres préparations

microsomales. Cette activité typique requiert l’oxygène moléculaire et un facteur réduit, le

NADPH. Son inhibition par le monoxyde de carbone suggère tout comme pour les deux

autres activités hydroxylases mises en évidence, l’implication d’un cytochrome P450. Un

faisceau de données tend à faire penser que cette activité m-hydroxybenzyl alcool

hydroxylase et l’activité m-crésol 2-hydroxylase décrites ci-dessus sont associées à une seule

et même enzyme (Murphy et al, 1975). En effet, l’hydroxylation de m-crésol en toluquinol

n’est remarquable qu’à très forte concentration en m-crésol suggérant une spécificité

imparfaite envers le m-hydroxylobenzyl alcool. La non-incorporation d’isotopes stables dans

la patuline issue d’une culture de Penicillium griseofulvum après ajout de toluquinol

trideutérée vient étayer la thèse que ce dernier métabolite n’est pas un précurseur direct de la

patuline mais plutôt un artefact enzymatique mineur.

Forrester et Gaucher (1972b) ont décrit une purification partiellement d’une alcool

déshydrogénase spécifique de la conversion du m-hydroxybenzyl alcool en m-

hydroxybenzaldehyde. Son pH optimum de 7,6 est très similaire des optima des autres

enzymes purifiées telles que l’acide 6-methylsalicylique synthase et l’acide 6-

29

methylsalicylique décarboxylase. Cette enzyme n’apparaît pas être constitutive et aucun

précurseur ne semble induire une quelconque augmentation du taux cellulaire en m-

hydroxybenzyl alcool déshydrogénase. De même, aucun produit situé en aval dans la voie de

biosynthèse n’exerce une rétro-inhibition à l’exception du gentisaldehyde.

Deux activités déshydrogénase inséparables catalysent la conversion réversible du m-

hydroxybenzyl alcool et du gentisyl alcool en leurs aldéhydes respectifs (Scott and Beadling,

1974). De façon inexpliquée la conversion aldéhyde en alcool est favorisée in vitro

contrairement au sens de la réaction constatée in vivo. La conversion du m-hydroxybenzyl

alcool en m-hydroxybenzaldehyde s’effectuant 9 fois plus vite que la conversion gentisyl

alcool en gentisaldehyde, cela suggère que la voie majeure de biosynthèse de patuline soit m-

crésol > m-hydroxylbenzyl alcool > m-hydroxybenzaldehyde> gentisaldehyde> patuline.

L’implication du m-hydroxybenzaldehyde à la place du gentisyl alcool est pourtant source de

controverse puisqu’aucune activité m-hydroxybenzaldehyde 2-hydroxylase n’a été isolée. En

revanche, l’absence de conversion du 3H gentisyl alcool dans des cultures de Penicillium

griseofulvum (Forrester et Gaucher, 1972a) et la grande efficacité du m-hydroxybenzaldéhyde

en tant que précurseur de la patuline tendent à plaider pour cette hypothèse (Scott et al, 1973).

Pourtant, l’importance du gentisyl alcool comme précurseur de patuline reste controversée

puisque Scott et Beadling (1974) ont montré que la vitesse de production de gentisaldehyde à

partir de gentisyl alcool dans des extraits bruts de P. griseofulvum était du même ordre de

grandeur que la vitesse de conversion du gentisaldehyde en patuline.

4.2.3 Dernières étapes (Isoepoxydon→Patuline)

L’isolement et la caractérisation à l’aide de mutants bloqués, de deux nouveaux intermédiaires

situés entre le gentisaldéhyde et la patuline, l’isoépoxydon (Sekiguchi et Gaucher, 1979a) et la

phyllostine (Sekiguchi et Gaucher, 1978) a conduit à la découverte d’une activité isoépoxydon

30

déshydrogénase NADP dépendante dans des extraits cellulaires préparés à partir de cultures

de la souche sauvage de Penicillium griseofulvum NRRL 2159A et des souches mutées J2, J1

et S11 (Sekiguchi et Gaucher, 1979b). Cette activité enzymatique permet l’interconversion

entre le (+) isoépoxydon et la (-) phyllostine de manière réversible. Cette enzyme cytosolique

possède une forte spécificité envers son substrat (isoépoxydon) et son co-facteur (NADP) et

se trouve totalement inhibée par l’ajout de 1mM de p-chlromercuribenzoate (PCMB). Cette

dernière caractéristique a permis de démontrer par l’ajout conjoint de phyllostine et de PCMB

et grâce à l’utilisation du mutant bloqué J2 incapable de synthétiser ces composés époxydés,

que la synthèse de la patuline necessite la transformation du gentisaldéhyde en isoépoxydon

converti lui-même en phyllostine. Ces dernières études ont permis d'identifier l’avant-dernier

précurseur de la patuline, la néopatuline (isopatuline) . L’étude approfondie du mutant J1 a

abouti à la caractérisation et à l’élucidation structurale de ce dernier composé qui s’accumule

à la place de la patuline (Sekiguchi et al, 1979). Ce métabolite peut exister sous deux formes

différentes, une forme ouverte à un seul cycle et une forme bicyclique. Peu de données sont

disponibles concernant une caractérisation enzymatique de la conversion de la phyllostine en

néopatuline. Cette conversion ne nécessite pas l’action d’un cofacteur (Fedeshko, 1992). Le

pH optimum d’activité de cette néopatuline synthase est proche de pH 5,5 contrairement à

toutes les autres enzymes intervenant plus tôt dans la voie de biosynthèse de la patuline. Il

apparaît après purification et migration électrophorètique que cette enzyme soit glycosylée.

Afin de déterminer si une glycosylation de l’enzyme est effective, une préparation purifiée

d’enzyme a été digérée avec de l’endoglycosidase F ou de la N-glycosidase F. D’après les

résultats de cette étude, il existerait au moins deux glycoformes. La glycosilation toutefois ne

semble pas être essentielle pour le bon fonctionnement de l’enzyme. Bien que rien ne soit

connu sur la compartimentalisation de la biosynthèse de la patuline, la différence de pH

optimum et la glycosylation de cette néopatuline synthase laisse suggérer que cette étape ou

31

même les dernières étapes de la biosynthèse ait lieu dans un compartiment différent de celui

où agissent les premières enzymes (acide 6-methylsalicylique synthase, acide 6-

methylsalicylique décarboxylase, m-hydroxybenzyl alcool hydroxylase, isoépoxydon

déshydrogénase).

La caractérisation poussée du mutant S15 a permis de mettre en évidence le dernier

précurseur avant la patuline, le (E)-ascladiol, composé précédemment isolé d’Aspergillus

clavatus, autre espèce productrice de patuline (Suzuki et al, 1971). Des cinétiques de

transformation de la néopatuline en (E)-ascladiol par des préparations cellulaires suggèrent

que la néopatuline est réduite en (E)-ascladiol en présence du cofacteur NADPH, puis

finalement oxydé en patuline (Sekiguchi et al, 1983).

Plus récemment, un extrait brut d’une culture catalysant l’époxydation du toluquinol et du

gentisyl alcool respectivement en desoxyphyllostine (2-methyl-5,6 epoxy 1,4 benzoquinone)

et en phyllostine a été isolé (Priest et Light, 1989). S’appuyant sur des nouvelles données, les

auteurs remettent en question le rôle du gentisaldehyde comme précurseur direct de la

patuline, puisqu’aucune conversion de gentisaldehyde par l’extrait n’est détectable. Ceci

serait en parfaite adéquation avec l’observation de Murphy et Lynen comme quoi

l’hydroxylation du m-hydrobenzaldehyde en gentisaldehyde n’a pu être démontrée

contrairement à l’hydroxylation du m-hydroxybenzyl alcool en gentisyl alcool. De même, ces

auteurs émettent des doutes concernant le statut de précurseur direct de l’isoépoxydon, ainsi

que l’implication des trois enzymes suivantes, la m-hydroxybenzyl alcool déshydrogénase, la

gentisyl alcool déshydrogénase et l’isoépoxydon deshydrogénase, en argumentant l’absence

d’isoépoxydon dans leurs extraits cellulaires.

En résumé, du point de vue strictement chimique, la voie quasi complète de la biosynthèse de

la patuline a pu être établie (figure 5). Il reste cependant une zone d’ombre dans l’implication

de certains métabolites sujets à controverse. De même, par la présence de certains composés

32

mineurs, artefacts enzymatiques, qui n’interviennent pas dans la synthèse de la patuline, cette

voie ressemble à l’heure actuelle plus à une matrice qu’à une voie linéaire. Dans le futur, la

découverte du « cluster » de gènes codant pour les enzymes impliquées dans cette voie,

permettra de lever ces incertitudes. En effet, dès l’isolement de ces gènes, des techniques

telles que l’expression hétérologues ou l’obtention de mutant monogénique par invalidation

de gènes permettra de confirmer ou d’infirmer les différentes hypothèses.

4.2.4 Bases moléculaires de la voie de biosynthèse de la patuline

A ce jour, la génétique de ces voies de biosynthèse est actuellement mal connue,

contrairement à celles d’autres mycotoxines majeures comme les aflatoxines, les

trichothécènes ou les fumonisines. Deux gènes de Penicillium griseofulvum ont pourtant été

isolés, séquencés et caractérisés. Le premier code pour la 6-MSAS (Beck et al, 1990, Wang et

al, 1991 ), le second pour l’isoépoxydon déshydrogénase (IDH) (Fedeshko, 1992). La

séquence du gène msas a été identifiée comme une phase ouverte de lecture de 5322 pb

codant pour une protéine de 1774 acides aminés et de 190 kDa. L’analyse de la séquence de

l’ADN complémentaire (cDNA) révèle la présence d’un intron de 69 pb. Comparée aux

séquences d’autres polycétide synthases d’origine fongique ou d’acides gras synthase de

mammifères, la séquence protéique présente de fortes similarités au niveau de régions codant

pour les sites catalytiques indispensables au fonctionnement de l’enzyme tels que la 2-oxoacyl

synthase (KS), la transacylase ou acetyl-malonyl transferase (AT), 2-oxoacylredctase (KR).

Un autre gène codant pour une acide 6-methylsalicylique synthase a été isolé chez Aspergillus

terreus indépendamment par deux équipes (Fujii et al, 1996, Pazoutova et al, 1997). Bien que

les deux gènes partagent de nombreuses caractéristiques communes (forte similarité

structurale, présence d’intron à la même position), leur expression diffèrent puisque le gène

d’Aspergillus terreus est exprimé en milieu de phase exponentielle de croissance

33

contrairement à celui de P. griseofulvum qui est exprimé en début de phase stationnaire.

Longtemps Aspergillus terreus fut soupçonné d’être un producteur de patuline avant que cela

ne soit infirmé par une étude récente (Varga et al, 2005). La présence d’un tel gène dans le

génome d’Aspergillus terreus suscite donc la curiosité. Ce gène ne peut être un pseudogène

puisque son expression hétérologue dans A. orizae conduit à la synthèse de l’acide 6-

methylsalicylique. L’implication de ce gène dans la synthèse d’un autre métabolite secondaire

produit par A. terreus, l’acide terreique, serait une hypothèse plausible. Pour autant, rien ne

permet d’écarter la possibilité d’une altération de la voie de biosynthèse de la patuline due à

une mutation ponctuelle conduisant à l’absence de patuline dans les cultures d’A. terreus.

Après purification de l’isoépoxydon deshydrogénase et séquençage de l’extrémité N

terminale, des sondes ont été dessinées pour isoler le gène idh d’une banque d’ADN

génomique. L’ARN messager a pour taille 1,3 kb environ et code pour 259 AA. Après

traduction, il apparaît que cette protéine appartient à une famille d’alcool deshydrogénases

catalysant l’hydrogénation d’alcool à chaînes courtes. Enfin le gène isolé contient 2 introns.

4.3 Paramètres influant sur la synthèse de la patuline

La production de patuline dépend comme nombreuses autres biosynthèses de mycotoxines,

des principaux facteurs environnementaux régissant la croissance fongique que sont la

température, l’activité en eau du substrat (aW) et la nature du substrat. La tolérance envers ces

facteurs dépend elle-même de l’espèce considérée. Les données disponibles dans la littérature

concernent quelques espèces, Penicillium griseofulvum, Penicillium expansum et

Byssochlamys nivea. Penicillium griseofulvum synthétise la patuline sur une plage de

températures s’étalant de 5 à 30°C avec un optimal à 25°C (Norstadt et McCalla, 1971). Pour

P. expansum, la plage de température est sensiblement identique puisque la patuline a été

produite aussi bien à 4°C dans des cidres qu’à 25°C dans des pommes avec, toutefois, des

34

teneurs 5 fois plus élevées à 25°C.

L’influence de la température et de l’activité en eau sur la croissance de Byssochlamys nivea

et la production de patuline dans des sirops de pommes durant un incubation de 44 jours a été

étudiée (Roland and Beuchat, 1984). L’aW à laquelle la moisissure est capable de produire la

patuline est de 0,978, 0,968 et 0,959 respectivement à 21, 30 et 37°C. La production de

patuline par les autres espèces telles qu’Aspergillus clavatus, Penicillium expansum et

Penicillium griseofulvum est confinée aux aW élevées supérieures à 0,95.

L’addition de sel d’ammonium pendant la synthèse des enzymes impliquées dans la

biosynthèse de la pauline cause une rapide diminution de l’activité spécifique des enzymes

impliquée dans la synthèse de la patuline d’environ 70% (Rollins et Gaucher, 1994). Une

concentration extracellulaire d’ion ammonium inférieure ou égale à 2,5 mM est requise pour

initier l’induction de la production de la patuline chez Penicillium griseofulvum. Cette

répression pourrait agir sur l’expression des gènes codant pour les enzymes de biosynthèse via

un facteur transcriptionnel. Ceci pourrait expliquer que le ratio carbone/azote bas observé

dans les produits laitiers soit aussi bien corrélé avec l’absence de patuline dans ces produits

(Stott et Bullerman, 1975). Fedeshko a identifié sur la séquence promotrice du gène idh

plusieurs sites potentiels de fixation d’un facteur de répression induit par l’azote, le facteur

NRFA (Fedeshko, 1992). L’expression hétérologue du site de fixation du gène NRFA de P.

griseofulfum ainsi que des essais de gel retard ont permis de confirmer que deux sites sur la

séquence promotrice du gene 6msas et quatre sites sur la séquence promotrice du gène idh se

fixent fortement au site de fixation à l’ADN du facteur NRFA (Ellis, 1996).

Des 8 ions métalliques étudiés, seul le manganèse influence fortement la production de

patuline. En effet,il a été montré que l’ajout de sels de manganèse augmentait la production de

patuline chez de nombreuses espèces de Penicillium (Dombrink-Kurtzman et Blackburn,

2005). L’absence totale de manganèse dans le milieu de culture, conduit à de très faible

35

rendement de production de patuline, mais à une surprenante accumulation du premier

précurseur l’acide 6-methylsalicylique (Scott et al, 1986a). Le manganèse exercerait un effet

spécifique sur la biosynthèse de la patuline en influençant au niveau transcriptionnel

l'apparition coordonnée des enzymes intervenant après la synthèse de l’acide 6-

methylsalicylique (Scott et al, 1986b).

4.4 Occurrence de la patuline dans les aliments

La production de patuline est couramment mais non exclusivement associée à la pourriture

molle de la pomme ou pourriture bleue, principalement causée par Penicillium expansum

(figure 6) Ce champignon considéré comme le principal responsable de cette pourriture dans

l’industrie de la pomme, affecte naturellement d’autres fruits (cerises, prunes, abricots,

pêches, nectarines poires, coings) causant le même type de lésions. Bien que la présence de

champignons producteurs de patuline sur des fruits ne signifie pas obligatoirement présence

de patuline, la patuline est régulièrement détectée sur des fruits atteints de lésions brunes,

comme les bananes, raisins, pêches, abricots, ananas ou cerises. De même, de nombreuses

études rapportent la présence naturelle de patuline dans différents produits de transformation

des fruits tels que les jus ou nectars de pommes, raisins, cerises, poires, ananas et fruits de la

passion, les compotes de pommes, de prunes, les confitures de fraises, cassis et myrtilles.

Afin d’évaluer le pouvoir toxinogène du substrat, des essais d’inoculation artificielle de

différents fruits, légumes et produits à base de légumes ont été réalisés avec des souches de

Penicillium expansum, P. griseofulvum et Byssochlamys nivea (Frank et al, 1977). Quand ces

substrats sont expérimentalement infectés par P. expansum et stockés à température ambiante,

la patuline est produite sur les pêches, abricots, prunes, bananes, fraises, melons, tomates ainsi

que sur divers produits dérivés de la tomate. La patuline n’est produite que si les fraises, les

bananes et les melons sont inoculés par P. griseofulvum. Enfin, Byssochlamys nivea, par sa

36

production de patuline, n’affecte que les melons d’Espagne et les pêches.

Figure 6 Pomme contaminée par Penicillium expansum

Les résultats d’essais d’inoculation artificielle de jus de cerises, de cassis et de raisins par P.

expansum (Larsen et al, 1998, Abrunhosa et al, 2001) laissent à penser que d’autres produits

d’origine végétale pourraient naturellement receler de la patuline, dont le vin. Des jus de

raisin et des vins produits à partir de deux cépages différents (Rauschling et Gamay) ont été

analysés afin de déterminer les teneurs en patuline et d'évaluer qualitativement la mycoflore

présente. La patuline a été présente dans les jus à des concentrations s’échelonnant entre 0,3 et

4,5 µg/L mais absente des jus partiellement fermentés et des vins (Scott et al, 1977). Ces

données suggèrent que la patuline est détruite ou convertie en d’autres composés durant la

fermentation. Des observations similaires ont été rapportées par plusieurs équipes (Harwig et

al, 1977, Stinson et al, 1978, Woller et Majerus, 1982) révélant que 99% de la patuline ajoutée

à des jus de pomme avant fermentation disparaissait, convertie en un composé hydrosoluble

non volatile (Stinson et al, 1979) . Une étude récente conduite à l’Université du Surrey en

Grande Bretagne a permis d’identifier ce composé comme le E-ascladiol (Moss et Long,

37

2002). La présence de sulfite (SO2) dans les moûts ajouté lors du procédé de vinification ou

généré par la conversion des sulfates présents dans les traitements phytosanitaires administrés

en champs, constitue aussi un facteur responsable de la disparition de la patuline (Pohland et

Allen, 1970). De même, il semblerait que les arômes de fruits ne soient pas affectés par des

problèmes de contamination puisqu’il a été montré que la patuline était une molécule non

volatile, absente des aromes de pommes après distillation de jus fortement contaminés

(Kryger, 2001).

D’une manière générale les différentes enquêtes réalisées montrent que les niveaux de

contamination que l’on retrouve dans les autres fruits sont bien plus faibles que ceux

observées dans les pommes.

Deux études ont montré que la patuline pouvait migrer au-delà de la zone contaminée. En

effet, le developpement fongique après l’inoculation de pommes saines par Penicellium

expansum, pouvait entraîner une diffusion de la patuline à l’intérieur de 1 à 2 cm de tissus

sain (Taniwaki et al, 1992, Rychlik et Schieberle., 2001). Contrairement à ce qui a été

observé pour la pomme, la mycotoxine pénètre plus facilement à travers les tomates infectées,

diffusant dans la totalité du fruit.

Plus le stockage des pommes est long, plus grand sera le risque de contamination par la

patuline. Ceci est particulièrement vrai pour les producteurs du Royaume-Uni qui observent

une augmentation de la concentration de patuline dans les jus produits durant les trois

derniers mois avant la nouvelle récolte de pommes (Corbett , 2003).

Les céréales, les malts et autres produits d’origine céréalière, aliments sujets aux

contaminations par la patuline ont fait l’objet de plusieurs enquêtes dans le nord de l’Europe

(Reiss, 1972, 1976, Lopez-Dias et Flannigan, 1997). Dans une étude finlandaise, 91 % des 23

échantillons de pains moisis contenaient 27 à 138 µg/kg de patuline selon les échantillons

(Tyllinen et al, 1977). Rychlik et Schieberle (2001) ont fait état de pains moisis contenant en

38

moyenne 45 µg/kg de patuline. L’inoculation artificielle par ces mêmes auteurs, de pains de

farine de blé avec une souche de Penicillium expansum a montré que la capacité de cette

espèce à synthétiser de la patuline sur un tel substrat était loin d’être négligeable (1600 ppb).

Compte tenu de l’ubiquité de ce microorganisme, le risque de contamination du pain par la

patuline ne devrait pas être sous-estimé.

De façon plus surprenante, la patuline a été aussi retrouvée dans des fromages de type

Cheddar (Bullerman et Olivigni, 1974) contaminés par une souche identifiée comme

Penicillium roqueforti, productrice à la fois de patuline et d’acide pénicillique. Sur la base des

connaissances actuelles, il est probable que cette souche atypique de Penicillium roqueforti

soit en fait une souche de Penicillium carneum, espèce de la section roqueforti difficilement

distinguable par observation et identification macroscopique de P. roqueforti. Plusieurs

enquêtes portant sur la recherche de mycotoxines dans les produits laitiers ont toutes révélé

l'absence totale de patuline dans ce type d’aliment, à l’exception d’une ancienne étude

rapportant la présence de patuline (30-355 µg/kg) dans divers fromages moisis avec une

incidence relativement limitée (Lafont et al, 1979). Il est maintenant bien établi que les

produits laitiers et plus particulièrement les fromages ne sont pas des milieux favorisant la

formation de patuline. Les tentatives d’inoculations artificielles de fromage par des souches

fongiques productrices se sont soldées par une absence de patuline en dépit d’une bonne

croissance des champignons. Quand bien même les résultats s’avéraient positifs, la patuline

est seulement détectée à de très faibles concentrations, et dans des conditions de température

avoisinant les 25°C. Le phénomène peut être expliqué d’une part par la pauvreté en sucres et

la relative richesse en protéine du substrat et d’autre part, par la très grande réactivité de la

patuline envers les groupements sulfydryl des molécules de cystéine et de gluthation présents

dans ce type de produit. Ce dernier phénomène aboutissant à la formation d’adduits est illustré

par le résultat d’études sur l’instabilité de la patuline dans des fromages de type Cheddar. Ces

39

études ont montré une diminution significative des quantités détectées de toxines après ajout

initial de toxine dans le fromage (Stott et Bullerman, 1976). De même Engel et Prokopek en

1980 ont montré que la patuline détectée dans des caillés fraîchement ensemencés avec des

souches de P. roqueforti (P. carneum) disparaissait durant l’affinage.

Les mêmes phénomènes peuvent expliquer l’absence de patuline dans les produits carnés, la

non production de patuline dans ce type de produit quand celui-ci est ensemencé par des

souches de Penicillium toxinogènes, ainsi que la totale instabilité de la patuline quand elle est

incorporée dans ces produits (Bailly et al, 2005).

Enfin pour clôturer la liste des aliments susceptibles d’être contaminés par la patuline, il ne

faut pas écarter certains substrats destinés à l’alimentation animale tels que les ensilages et les

fourrages (Escoula, 1977). Une enquête épidémiologique réalisée en France par Escoula

(1974) a montré que 59% des 34 ensilages de maïs testées contenaient de la patuline. La

présence simultanée d’acide byssochlamique montrait que Byssochlamys nivea était à

l’origine de la patuline. Outre cette espèce, plusieurs autres moisissures productrices de

patuline ont été isolées de ces substrats. Plus particulièrement, deux espèces de Penicillium

ont été suspectées d’être une source de la patuline dans les ensilages, P. glandicola (syn . P.

granulatum) et P. roqueforti.

Bien que Penicillium glandicola soit souvent abondant sur les fronts de coupe des ensilages,

aucune relation entre la présence de patuline et la contamination des fourrages ensilés par

cette espèce fongique n’a été établie. Ceci est en accord avec le fait que P. glandicola subit un

effet biostatique dans les conditions d’anaérobiose d’un ensilage et ne se développerait que

sur le front de coupe après ouverture du silo (Borkowska-Opacka et Escoula, 1977). Une

étude récente tenant compte des dernières avancées en taxonomie révèle que sur 52 souches

isolées d’ensilage et identifiée sur la base morphologique comme P. roqueforti, 48 sont des P.

roqueforti sensus stricto, 2 P. paneum et 2 P. expansum (Boysen et al ,2000). Une autre étude

40

montre que la majorité des souches retrouvées dans des fourrages ensilés sont des souches de

P. paneum tandis que la plupart des souches de P. roqueforti sont isolées préférentiellement

d’ensilage de maïs (Sumarah et al, 2005). Compte tenu de la non production de patuline par P.

roqueforti, il semblerait que P. paneum et P. expansum constituent des sources limitées de

patuline dans les ensilages de maïs mais des sources à surveiller dans les fourrages ensilés.

4.5 Propriétés toxicologiques

4.5.1 Toxicocinétique

4.5.1.1 Devenir biologique de la patuline :

La première étude (Dailey et al. 1977a) décrit le devenir d’une dose unique de 3mg/kg de 14C-

patuline administrée par voie orale chez le rat. Au cours des sept jours suivant le traitement,

36 et 49 % de la radioactivité sont éliminés respectivement par l’urine et les fèces, la majorité

étant éliminée dans les 24 premières heures. Seuls 2 à 3 % sont retenus dans le sang et les

principaux organes alors que 1 à 2 % sont excrétés sous forme ultime de 14CO2.

4.5.1.2 Absorption et distribution :

Une étude in situ sur modèle d’estomac perfusé de rat (Rychlik et al. 2004) a montré que 26 à

29 % de la patuline était absorbée en 55 minutes, à partir de concentrations luminales de 350

ou 3,5 mg/l. De cette quantité, 17 et 2 % étaient transférés vers la circulation alors que

seulement 3 et 0,06 % se retrouvaient dans le tissu gastrique. La disparition de la plus grande

partie de la toxine est attribuée à une réaction avec le glutathion intracellulaire, on assiste

d’ailleurs à une forte déplétion de ce tripeptide lors de l’exposition à la forte dose de patuline.

Utilisant un essai de dilution par isotope stable, une étude récente (Rychlik, 2003) a

mis en évidence l’absence de patuline sérique (< 200 ng/l) chez 5 consommateurs humains de

jus de pomme contenant un taux maximal admissible en toxine. Une étude complémentaire in

41

vitro sur le sang humain démontre qu’après addition de 100 µg de patuline à 9 ml de sang,

seulement 6,1 % de toxine étaient détectés à l’issue de 2 minutes d’incubation. Il est conclu

que même de fortes concentrations alimentaires en patuline puissent disparaître avant

d’atteindre d’autres tissus que le tractus digestif.

4.5.1.3 Liaison de la patuline aux protéines :

Trois études in vitro successives de Fliege et Metzler (1999, 2000a, 2000b) ont permis

d’identifier des produits d’addition de la patuline à divers résidus aminés de protéines.

D’abord, ces auteurs ont qualifié l’induction par la patuline de liaisons croisées (crosslinks)

intra ou intermoléculaires impliquant des chaînes latérales de cystéine, lysine ou histidine et

des groupements alpha aminés. Comme la patuline est censée exercer son effet de dommage

chromosomique à travers la formation d’adduits covalents à des thiols essentiels

intracellulaires, les mêmes auteurs ont identifiés 16 adduits à diverses molécules nucléophiles

dont le 4-bromothiophenol. Enfin les propriétés électrophiles de la patuline ont été étudiées

par la réaction non enzymatique avec le glutathion et son produit de dégradation, la N-acétyl-

L-cystéine. Ainsi trois adduits cycliques se forment avec le glutathion, provenant de l’activité

nucléophile des groupements alpha aminés des résidus d’acide glutamique et de cystéine du

tripeptide, induite lors de l’interaction avec la patuline.

4.5.1.4 Interaction avec les protéines de biotransformation :

Une étude ancienne (Siraj et al. 1980) a été entreprise chez la souris recevant la toxine par

voie intrapéritonéale, soit en administration unique (1, 3 ou 4,5 mg/kg), soit par injection

quotidienne de 1 mg/kg pendant 5 ou 14 jours. Si l’administration chronique ne conduit à

aucune variation des activités hépatiques de biotransformation, certaines inductions

apparaissent après injection unique. Ainsi, une augmentation de 12 % du cytochrome P450

42

total est relevée 48 heures après l’administration de 3 ou 4,5 mg/kg. Cette induction est

d’ailleurs associée à l’augmentation de certaines activités comme l’hydroxylation de l’aniline,

la déméthylation de l’aminopyrine et de l’éthylmorphine ou de la NADPH-cytochrome C

réductase. Il est conclu que la patuline est au plus un faible inducteur enzymatique.

Entreprise plus récemment, l’étude de Lewis et al. (1999) compare la cytotoxicité de

huit mycotoxines sur des cellules recombinantes d’origine humaine exprimant divers

cytochromes P450. Des neuf P450 introduits les P4501A2 et 3A4 s’avèrent les plus propices à

entraîner la formation de métabolites cytotoxiques. Seules les aflatoxines B1, G1 et

l’ochratoxine A sont réellement bioactivables par ces hémoprotéines. La patuline comme la

toxine T-2, l’acide cyclopiazonique, la fumonisine B1 ou le déoxynivalénol ne subit pas de

dégradation en métabolites cytotoxiques produits par ces P450. Considérée sur les cellules

témoins non recombinantes, la patuline n’est pas classée parmi les toxines les plus

cytotoxiques.

4.5.2 Toxicité générale

4.5.2.1 Toxicité aiguë :

Mesurée chez les rongeurs, les DL 50 par voie orale se situent entre 29 et 55 mg/kg chez le

rat, la souris ou le hamster, la volaille paraît moins sensible avec une DL50 de 170 mg/kg

chez le coq. Administrée par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée, la patuline

s’avère 3 à 6 fois plus toxique pour les mêmes espèces (Pfohl-Leszkowicz 1999). Chez toutes

les espèces, les signes toxiques correspondent à une neurotoxicité (agitation, convulsions)

associée à une congestion pulmonaire avec ulcération et inflammation intestinales.

Certains composés modulent ces propriétés, ainsi les inhibiteurs de cytochrome P450 comme

le SKF 525A augmentent fortement la toxicité de la patuline alors que les inducteurs

(phénobarbital, 3-methylcholanthrène) ne la modifient pas (Hayes et al. 1979). En revanche,

43

la cystéine associée à la patuline parvient à annuler ses effets toxiques et à augmenter la DL50

de 100 fois (Ciegler et al. 1976, Lindroth et von Wright, 1978).

4.5.2.2 Toxicité chronique :

Essentiellement étudiée chez le rat, l’administration orale à court terme de patuline conduit à

une perte pondérale, des altérations gastriques et intestinales avec perturbation de la fonction

rénale (Pfohl-Leszkowicz 1998). Une répétition de dose conduit à des signes de neurotoxicité

(tremblements, convulsions) et à une inhibition caractérisée d’enzymes (ATPase) dans

l’intestin et le cerveau avec des conséquences notamment en termes de métabolisme des

lipides (Devaraj et Devaraj, 1987).

Des tableaux cliniques comparables ont été décrits chez la souris, le hamster ou le poulet.

Chez le singe, aucun signe de toxicité n’a été observé après des traitements quotidiens par

0,005 ; 0,05 ou 0,5 mg/kg pendant 4 semaines. Seule l’administration orale de 5 mg/kg

entraîne un refus alimentaire au cours des trois derniers jours d’exposition (Garza et al. 1977).

Récemment, Selmanoğlu et Kockaya (2004) ont mesuré diverses activités hormonales

thyroïdiennes et testiculaires chez le rat recevant la patuline par voie orale à raison de 0,1

mg/kg/jour pendant 60 ou 90 jours. Un traitement de 60 jours provoque une augmentation du

niveau sérique en testostérone (66%) et une diminution de 17% du taux en hormone T4 alors

qu’il n’apparaît aucun changement pour les T3, TSH, LH et GH. Quand le traitement est

appliqué pendant 90 jours, des augmentations en testostérone (75%) et en LH (146%) sont

observées sans autre perturbation clinique. L’examen histologique des testicules démontre

œdème, fibrose, hyperplasie des cellules de Leydig et désorganisation de l’épithélium des

tubules séminifères. Au niveau de la thyroïde, on enregistre une infiltration des cellules

lymphoïdes et un élargissement du tissu interstitiel interfolliculaire. Selmanoğlu (2006) a

relevé à la fois une diminution du nombre de spermatozoïdes, des anomalies morphologiques

44

de ceux-ci ainsi que quelques changements histopathologiques de l’épididyme et de la

prostate.

Hormis cette dernière étude, la patuline est reconnue pour ne provoquer que des

désordres gastro-intestinaux avec ulcérations, distension et hémorragies, voire à plus forte

dose, des perturbations de la fonction rénale .

4.5.3 Données relatives à la génotoxicité 4.5.3.1 Etudes in vivo :

Les rares études de toxicité à long terme de la patuline (Osswald et al. 1978 ; Becci et al.

1981) ont mis en évidence l’absence de tumeurs chez des rats exposés à des doses orales

trihebdomadaires de 0,1 à 2,5 mg/kg pendant 74 à 104 semaines.

4.5.3.2 Etudes in vitro :

La patuline comme la citrinine ou l’ochratoxine A, ne provoque pas de mutations reverses

pour Salmonella Typhimurium TA102 (Wurgler et al. 1991). Testée parmi d’autres

mycotoxines par un test de SOS sur microplaque, la patuline comme la citrinine ou

l’ochratoxine (et à l’inverse de l’aflatoxine, la stérigmatocystine ou la versicolorine) est

négative (Sakai et al. 1992). Une comparaison entre la cytotoxicité et l’activité antitumorale

de la patuline et de ses adduits à la cystéine a été conduite sur des cellules murines de

leucémie (L1210 et P388). La cystéine réduit de 2 à 4 fois les propriétés antiprolifératives de

la patuline par addition sur les positions chimiques responsables de cette activité (Krivobok et

al. 1994).

Les effets aneuploïdogènes et clastogènes de la citrinine et de la patuline ont été comparés sur

cellules V79 de hamster en mesurant l’inhibition de l’assemblage des microtubules et

l’induction de l’arrêt mitotique et des micronoyaux. Les deux toxines inhibent la

45

polymérisation des microtubules, en revanche seule la patuline se lie de façon covalente aux

thiols des microtubules. A des concentrations n’induisant pas de cytotoxicité, l’arrêt de la

mitose et la présence de chromatides sœurs témoignent de l’effet aneuploïdogène des deux

toxines. Seule la patuline est reconnue clastogène car elle induit des micronoyaux contenant

des fragments non centrés reconnus par coloration de CREST. Ces propriétés pourraient

contribuer à la possible cancérogénicité de ces toxines (Pfeiffer et al. 1998).

Sur les mêmes cellules V79 et sur lymphocytes humains, Alves et al. (2000) ont montré

l’induction de dommages à l’ADN par la patuline à travers deux essais différents, l’induction

des micronoyaux (lymphocytes) et l’apparition d’aberrations chromosomiques (V79). Par

ailleurs, la présence de 80 µM d’acide ascorbique permet d’abolir la clastogénicité de 0,8 µM

de patuline.

Trois types cellulaires différents (CHO, HEK et lymphocytes humains) ont servi de support à

la comparaison des dommages oxydatifs et de risques génotoxiques induits par la citrinine et

la patuline (Liu et al. 2003). Seule la patuline provoque une augmentation dose-dépendante de

la fréquence des chromatides sœurs en CHO et lymphocytes. Elle accroît aussi le nombre

d’altérations de l’ADN en CHO et induit des coupures de l’ADN en HEK au-delà de 15 µM.

Ce travail démontre aussi que la patuline est clastogène et peut provoquer des dommages

oxydatifs sur l’ADN. En revanche la citrinine n’apparaît pas génotoxique pour HEK mais

contrairement à la patuline, augmente le niveau des ARN messagers des heat shock protéines

70.

4.5.4 Autres effets

4.5.4.1 Cytotoxicité

La cytotoxicité de la patuline a été mesurée sur des hépatocytes immortalisés de rat en

considérant la survenue de divers désordres oxydatifs (Barhoumi et Burghardt, 1996). La

46

toxine ajoutée à raison de 1; 2 ou 10 µM pendant 20 minutes a engendré le tableau

chronologique de réponses suivant : suppression des communications intercellulaires (gap

jonctions) et déplétion en glutathion intracellulaire / génération de radicaux oxygénés /

dépolarisation de la membrane des mitochondries / augmentation du calcium intracellulaire et

acidification cytoplasmique / dépolarisation de la membrane cellulaire.

Deux lignées cellulaires épithéliales humaines d’origine intestinale (HT-29 et Caco-2) ont été

exposées à des concentrations micromolaires en patuline (Mahfoud et al. 2002). Une

diminution rapide et importante de la résistance transépithéliale est enregistrée sans signe

apparent de cytotoxicité. Cet effet serait associé à la réactivité de la patuline à l’égard des

groupes thiols car la cystéine ou le glutathion préviennent ce désordre, lequel est potentialisé

par le sulfoximine de buthionine, un agent de déplétion du glutathion. De plus, cet effet est

mimé et potentialisé par l’oxyde de phenylarsine, un inhibiteur spécifique de la protéine

tyrosine phosphatase (PTP) dont le site actif contient un résidu cystéine en position 215. En

conséquence, il est suggéré que la patuline agisse par inactivation de ce site enzymatique dont

l’activité est essentielle dans la fonction de barrière de l’épithélium intestinal.

4.5.4.2 Embryotoxicité et tératogenèse

Dailey et al. (1977b) ont observé in vivo, une réduction de la taille des portées de rats soumis

à un traitement par la patuline, alors qu’à la deuxième génération il y a diminution du poids

des fœtus sans apparition de malformations. Une observation similaire a été effectuée par

Reddy et al. (1978) chez des rats recevant 1,5 mg/kg par voie intrapéritonéale ; la dose de 2

mg/kg provoque l’avortement de tous les embryons.

Chez la souris, une même dose orale a provoqué la mort de la progéniture avec des

hémorragies cérébrales, pulmonaires et cutanées (Osswald et al. 1978). Une plus forte dose

orale (3,8 mg/kg/jour pendant 12 jours) ne modifiait pas l’implantation embryonnaire et

47

n’entraîne aucune malformation, contrairement à l’intoxication intrapéritonéale qui se traduit

par des divisions palatines et des néphropathies (Roll et al. 1990).

Injectée dans la poche d’air de l’œuf de poule, la patuline peut provoquer une embryotoxicité

au delà de 24 µg par œuf, la cystéine co-administrée parvient à limiter cet effet (Ciegler et al.

1976).

L’effet embryotoxique de la patuline a été testé in vitro sur des cultures d’embryons de rat à

raison de 0 à 62 µM pendant 45 heures d’exposition (Smith et al. 1993). La plus forte

concentration s’avère létale au-delà de 40 heures, entraînant une diminution des protéines, de

l’ADN et du diamètre du sac vitellin ainsi qu’une augmentation du nombre de résorptions

embryonnaires. A de plus faibles concentrations, les anomalies incluent un retard de

croissance, une hypoplasie du mésencéphale et du télencéphale et une hyperplasie des

processus mandibulaires.

4.5.4.3 Immunotoxicité

De nombreuses études in vitro démontrent que la patuline inhibe de multiples fonctions des

macrophages. Ainsi, Sorenson et al. (1985) ont montré que la synthèse des protéines était

inhibée dans des macrophages alvéolaires de rat exposés in vitro et que la fonction

membranaire était aussi altérée par la patuline. Dans les mêmes cellules de souris, il a été

prouvé que la toxine diminuait significativement la production de radicaux oxygénés (O2.), la

fusion phagosome-lysosome et l’activité des lysosomes (Bourdiol et al. 1990).

Plus récemment, comparée à la citrinine et à la gliotoxine, la patuline ne parvenait à inhiber

que très modérément l’expression de l’interféron γ ou de l’interleukine 4 par les macrophages

humains (Wichmann et al. 2002). En effet, ces inhibitions n’étaient significatives que pour

des concentrations de 64 et 243 ng/ml respectivement, contre 10 ou 5 fois moins pour les deux

autres mycotoxines. Par ailleurs, Marin et al. (1998) utilisant des cellules EL-4 de thymome

48

ont démontré le caractère suppresseur de la patuline sur la production des interleukines 2 et 5,

à partir de concentrations de 500 ng/ml, ces effets intervenant toutefois pour des doses bien

plus fortes que pour la toxine T-2 testée dans le même essai.

Des études in vivo chez la souris ont démontré des effets variés sur le système immunitaire.

Ces effets incluaient une augmentation des lymphocytes T d’origine splénique associée à une

diminution des immunoglobulines sériques (Escoula et al. 1988b), une atténuation des

réponses d’hypersensibilité (Paucod et al., 1990) ou une augmentation des neutrophiles avec

résistance accrue à l’infection par Candida albicans passant d’un taux de mortalité de 80 %

chez les témoins à 50 % chez les traités (Escoula et al. 1988a).

Une étude à moyen terme sur la même espèce (0,08 à 2,56 mg/kg de patuline administrée

pendant 28 jours par voie orale) a démontré une diminution des leucocytes et notamment des

lymphocytes du sang périphérique (à 1,28 et 2,56 mg/kg), une augmentation des monocytes

et des cellules NK spléniques (dès 0,08 mg/kg), une augmentation des lymphocytes T

cytotoxiques (à 2,56 mg/kg) avec altération des taux en immunoglobulines et en CD3+, CD4+

CD8- et en CD4- CD8+ dans la rate. Toutefois, ces variations n’ont pas de conséquences

fonctionnelles et il n’y a pas de changement significatif dans la fonction immune des souris

traitées par la patuline pour des paramètres comme la réponse des anticorps aux globules

rouges de mouton (SRBC) ou la fonction cellulaire dite « natural killer ». Les auteurs

concluaient que la patuline n’altèrerait pas la réponse immunitaire à des niveaux

correspondant à l’exposition alimentaire humaine possible (Llewellyn et al. 1998).

Chez le rat comme chez le lapin, la patuline supprime l’explosion oxydative habituellement

décrite dans les macrophages péritonéaux (Escoula et al., 1988b) alors que l’augmentation des

neutrophiles serait attribuée par Mc Kinley et al. (1982) à l’inflammation gastro-intestinale

provoquée par la mycotoxine.

49

4.5.5 Valeurs toxicologiques de références

Concernant le caractère cancérogène de la patuline, cette toxine a été classée par

l’International Agency for Research on Cancer (IARC, 1986) dans le groupe 3 des produits

pour lesquels il est impossible de se prononcer quant à la cancérogénicité pour l’homme.

La détermination des valeurs de référence par le Comité mixte FAO/WHO d’experts sur les

additifs et contaminants alimentaires (JECFA) est fondée sur l’étude la plus sensible. Il s’agit

de celle entreprise par Becci et al. (1981) chez le rat recevant la toxine 3 fois par semaine

pendant 2 ans. Dans ce travail, les effets observés ont porté sur une diminution pondérale des

rats males et une mortalité par inflammation pulmonaire et laryngotrachéale accrue chez les

animaux des deux sexes exposés à 1,5 mg/kg.

En considérant cette étude, la dose sans effet a été établie à 43 µg/kg/j et un facteur de

sécurité de 100 a été retenu.

De ce fait, le JECFA (1995), le Conseil supérieur d’Hygiène Publique de France (CSHPF,

1999) et le Scientific Committee for Food (SCF, 2000) ont établi une dose journalière

maximum tolérable provisoire (DJMTP) pour la patuline de 0,4 µg/kg de poids corporel

calculée à partir d’effets combinés sur la reproduction, de ses effets toxiques à long terme et

de la cancérogénicité (NOEL, à 43 µg/kg de poids corporel et par jour).

Enfin, étant donné le caractère récent et inédit des études de Selmanoğlu (2004, 2006),

démontrant des perturbations endocriniennes chez des rats recevant de faibles doses de

patuline, ces résultats devront être confirmés sur le long terme car ils pourraient constituer la

base d’une réévaluation des doses de référence de la patuline.

4.5.6 Conséquences toxicologiques de la contamination d’aliments pour bétail

Les problèmes principaux actuellement identifiés se réfèrent aux ruminants. Parmi les

ensilages examinés par Escoula (1977), un certain nombre provenait d’exploitations dans

50

lesquelles des accidents graves avaient été observés chez les bovins ou les ovins qui les

consommaient, bien que les tableaux cliniques décrits manquaient de spécificité. Les

manifestations nerveuses furent les plus nombreuses. Furent également signalés des troubles

digestifs, des avortements et surtout une baisse des performances zootechniques.

D’autres accidents graves à symptomatologie nerveuse ont été observés chez des ruminants

recevant des aliments contaminés par Aspergillus clavatus ; ils ont été attribués à la présence

de patuline (Moreau, Moreau 1960, Jacquet et al, 1963). On a rendu la patuline responsable

des empoisonnements collectifs de bovins ayant entraîné la mort de plus de 100 vaches

recevant de l’orge malté contaminé par P. griseofulvum (Ukai et al, 1954) ou par Aspergillus

clavatus (Schultz et al, 1969). Chez la souris ou chez les bovins, l’administration orale de

grains de malt volontairement contaminés avec Penicillium griseofulvum a provoqué des

symptômes nerveux, des hémorragies cérébrales conduisant à la mort. Les résidus d’orges

maltés ont été particulièrement incriminés dans des accidents toxicologiques chez des ovins

ou des bovins présentant des troubles neurologiques (Gilmour et al, 1989, Schlosberg A. et al,

1991, Sabater-Villar, 2004, Loretti et al, 2003). Comme le laissaient supposer les lésions

pathologiques, Sabater-Villar et al (2004) ont isolé dans les aliments incriminés A. clavatus et

ont détecté des traces de patuline dans ces résidus d’orges. Des syndromes hémorragiques ont

été observés chez des bovins nourris avec des ensilages de mauvaise qualité contenant de la

patuline (Syrett 1979). Certains accidents toxicologiques à tableaux cliniques similaires ont

été attribués à d’autres métabolites secondaires non identifiés produits par Aspergillus

clavatus (Kellerman et al, 1976). Outre la patuline, A. clavatus produit d’autres molécules

telles que les tryptoquivalines, les tryptoquivalones, les cytochalasines, la glyantrypine et le

clavatol. Compte tenu de ces données, il est difficile d’incriminer la patuline comme la seule

et unique responsable de ces accidents de terrain. Toutefois, les manifestations toxicologiques

sont plutôt rares chez les ruminants alors que la présence de moisissures productrices de

51

patuline dans les ensilages est fréquente. De même, aucune pathologie associée à l’ingestion

de nourriture contaminée par la patuline n’a pu être attribué à cette toxine de façon exclusive

et certaine.

4.6 Etat de la contamination naturelle des denrées alimentaires par la

patuline en Europe.

En France, plusieurs enquêtes menées par la Direction Générale de la Concurrence, de la

Consommation et de la Répréssion des Fraudes (DGCCRF) ont été régulièrement entreprises

depuis une quinzaine d’années. Vingt-neuf échantillons de cidre et un échantillon de poiré ont

été analysés en 1991. Les prélèvements ont été effectués dans les principaux départements

producteurs de ce type de boissons alcoolisées le Calvados et l’Orne. Dix sept pourcents des

échantillons contenaient des taux supérieurs à 50 µg/L . En 1993, 3 échantillons de cidre doux

dépassaient la valeur limite recommandée de 50 µg/L. Les 25 jus de pommes analysés

présentaient des niveaux de contamination en dessous des valeurs seuils. En 2000, une

enquête préliminaire a été conduite sur 119 échantillons de produits à base de pomme ou de

poire (jus, pommeaux, cidres, compotes et préparations destinées aux enfants en bas age) dans

l’attente de la fixation de seuil règlementaire. Aucun jus, nectars, compotes et autre

préparation solides à base de pomme n’a présenté de niveaux de contamination

répréhensibles. La surprenante qualité des produits analysés a été attribuée à la sensibilisation

des industriels à la mise en place de la future réglementation. Généralement attentifs au

problème de la contamination éventuelle de leur filière par la patuline, les industriels

appliquent diverses mesures préventives et procédures de surveillance (mise en place de

cahier des charges vis-à-vis des fournisseurs, tri des fruits, dosage de la patuline sur les

produits finis). Bien qu’aucun cidre n’ait été déclaré impropre à la consommation, des

niveaux de contamination supérieurs à la norme en vigueur ont été relevés dans des apéritifs à

52

base de pomme. La contamination des apéritifs à base de cidre par la patuline semble être liée

aux mauvaises conditions dans lesquelles sont mises en œuvre des pratiques anciennes de

fabrication consistant à laisser mûrir les pommes en tas pour des raisons organoleptiques. La

dernière enquête en date de la DGCCRF fait état de 9 échantillons présentant une teneur en

patuline supérieure à la teneur maximale réglementaire de 50 µg/kg (teneurs comprises entre

71 et 1800 µg/kg). Parmi les boissons alcoolisées à base de pomme, 3 échantillons sur 25

contenaient des teneurs en patuline supérieure à la teneur règlementaire (79-150 et 200

µg/kg). Les non conformités constatées ont concerné exclusivement des produits fabriqués au

stade artisanal ou fermier.

4.7 Evaluation de l'exposition humaine à la patuline.

Une étude de la ration alimentaire totale a été entreprise en 2000, afin de connaître le niveau

de consommation et d’exposition de la population française à la patuline à partir d’aliments

« prêt à consommer » (Leblanc, 2004). Les résultats sur les niveaux de patuline retrouvés dans

les aliments analysés « tels que consommés » montrent que 16 échantillons, soit plus de 80%

des produits analysés présentent des niveaux de contamination inférieurs à la limite de

détection (Tableau 3). Deux échantillons, soit plus de 10% des produits analysés présentent

des niveaux de contamination compris entre la limite de détection et 50µg/kg. Il s’agit pour le

premier, d’un échantillon de jus de pomme à base de concentré et de cidre pour le deuxième.

Deux échantillons, soit environ 10% des produits analysés présentent une teneur supérieure à

50µg/kg. Il s’agit d’un échantillon de tartelette aux pommes (teneur de 60µg/kg) et d’un

échantillon de beignet aux pommes (teneur de 100µg/kg).

53

Table 3 : Estimation de l’exposition à la patuline de la population française à partir d’aliments « prêts à consommer » (D’après Leblanc JC et al, 2005)

Adultes (15 ans et plus) (n=1474)

Enfants (3 à 14 ans) (n=1018)

Nb. d’échant

illons

Consommation (g/jour)

Exposition (ng/kg p.ca./j)

Consommation (g/jour)

Exposition (ng/kg p.ca./j)

Groupe d’aliment

Moyenne de contaminati

on (µg/kg) Moyenne p95 Moyenne p95 %

Moyenne p95 Moyenne p95 %

Boissons alcoolisées 2 19,5 3,54 17,1

1,00 5,18 5,60

0,47 c -

0,33 0,00 1,10

BRSA b 2 20,5 2,25 c -

0,78 0,00 4,40

9,02 57,1

7,45 45,2 25,2

Compote et fruits cuits 4 15 6,08 42,9

1,44 9,60 8,10

6,61 42,9

4,17 22,0 14,1

Fruits 6 15 39,7 171

9,16 38,7 51,4

18,7 85,7

10,2 45,0 34,4

Pâtisserie 6 31,7 19,1 77,1

5,45 21,6 30,6

11,6 51,4

7,40 34,7 25,2

Total

20

71 233

18 57

100

46

150

30 106

100

a p.c. = poids corporel b Boissons Rafraîchissantes Sans Alcool (jus de pomme à base de concentré).

c Le tiret signifie qu’il y a moins de 5% de consommateurs pour le groupe d’aliment considéré et que la valeur au p95 est de 0

54

D’autres données concernant l’exposition humaine à l’échelle européenne ont été fournies par

les résultats publiés issus des tâches de coopération scientifique (Scoop 3.2.8, patuline). Les

données provenant des différents pays membres montrent peu de fortes contaminations, ce

qui laisse penser que les produits circulant dans l’Union sont globalement de très bonne

qualité concernant la présence éventuelle de patuline. Ces données confirment qu’à l’échelle

européenne, les pommes et autres produits à base de ce fruit, constituent les principaux

apports de patuline tant en terme d’occurrence que de niveau de contamination.

Dans le calcul d’exposition, les niveaux moyens de concentration utilisés dans le calcul des

apports correspondent à la moyenne pondérée de l’échantillon alimentaire composite pour les

deux saisons. Pour les deux études évoquées ci-dessus, les valeurs non détectées et les

valeurs inférieures à la limite de quantification ont été considérées comme égales à la moitié

de la limite de détection (LOD).

Le tableau 2 montre que l’apport moyen estimé pour la population française est de 18 ng/kg

p.c./j chez les adultes « normoévaluants » de 15 ans et plus et de 30 ng/kg p.c./j chez les

enfants de 3 à 14 ans. L’exposition au 95ème percentile est de 57 ng/kg p.c./j chez les adultes

et de 106 ng/kg p.c./j chez les enfants (équivalent DJT inférieur à 30%). Comparés à la

l’évaluation de l’étude européenne, les résultats d’exposition sont en moyenne plus importants

d’un facteur 10 pour les adultes et d’un facteur 5 pour les enfants. Cette différence est pour

l’essentiel due aux limites de détection plus importantes dans l’étude française et à une prise

en compte de vecteurs d’exposition alimentaire supplémentaires comme les fruits (pommes)

et les pâtisseries (tartelette et beignet aux pommes). Pour la population végétarienne, l’apport

moyen estimé est compris entre 34 et 50 ng/kg p.c./j en fonction des différents groupes

étudiés. Au 95ème percentile, l’exposition est comprise entre 90 et 120 ng/kg p.c./j soit un

équivalent DJT inférieur ou égal à 30%. En conclusion, en France, la proportion d’individus

dont l’apport théorique dépasse la dose journalière maximum tolérable provisoire (DJMTP)

55

de 400 ng/kg p.c/j est estimée à 0 % pour l’ensemble des populations étudiées.

4.8 Réglementation

Les nombreuses études et évaluations toxicologiques ont conduit les pouvoirs publics de

nombreux pays à édicter des normes règlementant les concentrations maximales tolérables en

patuline dans différents aliments. La patuline est la mycotoxine la plus règlementée après les

aflatoxines et l'ochratoxine A . Les pays européens ont été les premiers à être sensibilisés

puisque certaines nations ont imposé une concentration limite à ne pas dépasser de 50 µg/kg

(ppb) dès le début des années 80. Plusieurs pays, dont la France, ont par la suite promulgué

des recommandations plus contraignantes en abaissant les concentrations autorisées à des

valeurs comprises entre 25 et 35 µg/kg. Aujourd’hui les différentes recommandations

nationales sont en passe d’être harmonisées depuis que la Commission Européenne a instauré

une réglementation européenne en 2001 (Réglementation de la Commission n°466/2001). Il a

été décidé que la teneur maximale de patuline dans les jus de fruit (pur jus ou jus reconstitué à

base de concentré), les cidres, les spiritueux et autres boissons fermentées à base de pomme,

serait fixé à 50 µg/kg. Le taux maximal dans les produits solides à base de pomme tels que les

compotes serait abaissé à 25 µg/kg tandis que la législation concernant les produits à base de

pommes, destinés à la consommation des enfants et des nourrissons serait encore plus

drastique avec un seuil limite fixé à 10 µg/kg. Cette dernière législation n’est appliquée que

depuis Avril 2004 ((Réglementation de la Commission n°455/2004). Les Etats-Unis ont été

beaucoup plus lent à instaurer une réglementation sur la pauline mais aujourd’hui la United

States Food and Drug Admnistration (FDA) limite la concentration de patuline dans les jus

de pommes à 50 µg/L (USFDA, 2004).

56

MATERIELS ET METHODES

GENERAUX

57

1. SOUCHES ET MILIEUX

1.1 Souches utilisées Les souches productrices de patuline utilisées dans l’optique d’isoler les gènes ont été les

suivantes : Byssochlamys nivea NRRL 2615, Penicillium griseofulvum NRRL 2159A,

Penicillium expansum NCPT 44.

Les souches estampillées NRRL ont été fournies par le «Northern Region Research

Laboratory », (NRRL) de l’United State Department of Agriculture (USDA)., tandis que la

souche P. expansum NCPT44 a été isolée et identifiée par les équipes des laboratoires

d’accueil de baies de raisins. Les identités des souches ont été systématiquement contrôlées

par amplification et séquençage des espaces inter géniques codant pour les ARN ribosomaux

(ITS).

1.2 Milieux de culture

Les souches ont été ensemencées sur un milieu gélosé P.D.A (Potato Dextrose Agar) en boîte

de Petri (extrait de pomme de terre 1000ml, glucose 20g, agar), et incubées 7 jours à 25 °C

afin de favoriser la sporulation, à l’exception de la souche Byssochlamys nivea qui a été

incubée 21 jours à 25°C.

Les spores ont été récoltées et resuspendues dans 1 ml de tryptone-sel. Deux cent cinquante

microlitres de cette suspension sont utilisés pour ensemencer 100 millilitres de Czapek

glucose (Czapek-dox 35g, Glucose 8g, extrait de levure 2g) milieu favorisant la production de

la patuline.

2 PRODUITS CHIMIQUES ET STANDARDS ANALYTIQUES

Les solvants (Chloroforme, acétonitrile, acide acétique, méthanol, éthanol, isopropanol)

utilisés pour l’extraction et la détection des mycotoxines, et pour l’extraction des acides

58

nucléiques provenaient de la société Fisher et sont de qualité «chromatographie contrôlée ».

L’eau utilisée en HPLC comme phase mobile et en Biologie moléculaire est de qualité

ultrapure préparée avec le système de purification MilliQ (Millipore SA, Molsheim, France)

La patuline et l’acide mycophénolique employés comme étalons standards ont été fournis par

la société Sigma (Sigma, St Quentin Fallavier, France). Les autres standards ont été fournis

respectivement par P.M. Shoolingin-Jordan de l’Université de Southampton, Royaume-Uni et

Y. Ebizuka de l’Université de Tokyo, Tokyo, Japon pour l’acide 6-methylsalicylique ; H.

Fujimoto, Université de Chiba, Japon pour le 5,7 dihydroxy-4-methylphtalide ; J.D. White,

de l’Université de l’Etat de l’Oregon, U.S.A. pour l’acide byssochlamique, T. Anke, de

l’Université de Kaiserslautern, Allemagne pour l’acide orsellinique.

3. EXTRACTION DES METABOLITES SECONDAIRES PRESENTS

DANS LES SURNAGEANTS DE CULTURE

Les métabolites secondaires présents dans les surnageants de culture ont été extraits par

partition de phase en mettant en contact prolongé par agitation les 100 ml de surnageants

avec 70 ml de chloroforme (CHCl3). Une centrifugation pendant 20 min à 8000 RPM

(Rotation Par Minute) permet de bien séparer les deux phases (la phase aqueuse et la phase

chloroformique). La phase chloroformique a été prélevée et évaporée sous vide à l’aide d’un

évaporateur : Rotavapor (Büchi, Suisse) afin de réduire son volume à 2 ou 3 ml. Ce volume a

été transvasé dans un tube et évaporé à 60°C sous flux d’air comprimé à l’aide d’un

évaporateur Turbo vap LV (Zynark, Hopkinton, M.A Etats- Unis ), l’extrait a été resuspendu

avec 200 µl de méthanol (CH3OH). Cette resuspension fait généralement apparaître un

précipité qu’il est nécessaire d’éliminer afin d’éviter une réduction drastique de la durée de

vie de la colonne de l’HPLC. Une filtration a été réalisée à l’aide d’un filtre en

59

polytrifluoroéthyléne (PTFE 0.45µm) adaptable au bout d’une seringue (Sun International

Trading Wilmington Etats- Unis ). Un volume de 20µl de filtrat est analysé par HPLC.

4. DETECTION CHROMATOGRAPHIQUE

Le système chromatographique utilisé au laboratoire (Biotek, Milan, Italie) se compose d’un

système de pompage avec un formeur de gradient, une colonne, d’un injecteur et d’un

détecteur U.V à barrettes diodes permettant d’établir un spectre U.V (200 à 600 nm) pour

chaque composé sorti de la colonne. Les différents éléments sont reliés à un micro-ordinateur

de type P.C. sur lequel est installé un logiciel Kroma 2000 (Biotek, Milan, Italie). Celui-ci

fonctionnant sous environnement Windows NT permet de piloter automatiquement les

différents composants du système chromatographique. Il présente aussi toutes les fonctions

d’un intégrateur classique de chromatographie.

Un système de gradient de solvant, inspiré des travaux de J.C. Frisvad (Frisvad J.C., 1997) a

été développé afin d’établir des profils de métabolites secondaires des souches utilisées.

La phase mobile est composée de deux solvants : le solvant A (acide acétique 0.2 % dans

l’eau) et le solvant B (acétonitrile). Au temps t = 0, la part du solvant B représente 10% de la

phase mobile pour augmenter de façon linéaire pendant 30 minutes afin d’atteindre 50%, puis

90% de la phase mobile en 4 minutes supplémentaires. La composition de la phase mobile

reste constante durant 4 minutes. Enfin, les conditions initiales du système

chromatographique sont rétablies en dix minutes supplémentaires afin de rincer et de

rééquilibrer la colonne.

Une colonne C18 Zorbax C18 ODS 5µm, 150µm par 4mm (Bischoff, Leonberg, Allemagne)

puis Lichrospher C18 5µm, 150µm par 4.6 mm ont été utilisées comme phase stationnaire.

20µl d’extrait resuspendu et filtré sont injectés automatiquement dans le système de

chromatographie, pour chaque échantillon considéré.

60

5. ISOLEMENT DES GENES IMPLIQUES DANS LA VOIE DE

BIOSYNTHESE DE LA PATULINE.

La même stratégie générale a été appliquée à tous les gènes isolés et clonés lors de ce travail

(Figure 7). Elle repose sur le fait que les champignons possèdent des introns très courts. Cette

particularité permet d’utiliser comme matrice de départ l’ADN génomique. Cette stratégie a

consisté en premier lieu à isoler par PCR à l’aide d’amorces dégénérées à partir d’ADN

génomique, un fragment situé à l’intérieur du gène d’intérêt, puis de remonter de part et

d’autre du gène, en utilisant des couples hybrides, amorce spécifique/ amorce dégénérée

jusqu’à atteindre les régions avoisinant les codons « start » et « stop ». Les extrémités

codantes et non codantes respectives 5’UTR (5’untranslated region) et 3’UTR (3’untranslated

region) ont ensuite été isolées de l’ADN complémentaire par la technique de Race-PCR. Les

séquences des extrémités non traduites ainsi déterminées, des amorces spécifiques ont ensuite

été dessinées dans le but de séquencer entièrement l’ADN complémentaire afin de localiser

les introns éventuels.

5.1 Préparation de l’ADN complémentaire (ADNc) :

5.1.1 Extraction des ARNs totaux :

Les ARNs totaux ont été purifiés, à partir de 100 mg de mycélium, ces derniers ont été broyés

à l’aide d’un Potter dans 1ml de réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, Etats Unis ). Ce produit

est un mélange de phénol et d’isothiocyanate de guanidine exploitant la méthode de

Chomczynski et Sacchi qui permet de solubiliser les composants cellulaires tout en

préservant l’intégrité des ARNs (les acides ribonucléiques) (Chomczynski et Sacchi, 1987).

Les ARNs ont été séparés de l’ADN et des protéines par l’addition du chloroforme. La

solution a été alors homogénéisée 15 secondes par inversion manuelle puis incubée 2 à 3 mi-

61

Figure 7 : Stratégie générale employée afin d’isoler, cloner et séquencer les gènes d’intérêt.

nutes à température ambiante. Elle a enfin été centrifugée pendant 15 minutes à 14000 RPM

et à 4°C. La phase aqueuse (surnageant) a été récupérée et complétée par 500 µl

d’isopropanol de façon à précipiter les ARNs durant 10 minutes à température ambiante. Le

culot a été ensuite centrifugé 10 minutes à 14000 RPM et à 4° C. Ce dernier contenant les

ARNs a été rincé dans 500 µl d’éthanol à 75% afin d’éliminer l’isopropanol et les excès de

sels précipités. Après avoir centrifugé à 14000 RPM pendant 5 minutes, et éliminé le

surnageant, les ARNs sont resuspendus directement dans de l’eau autoclavée. Les ARNs sont

conservés à -80° C après dosage spectrophotométrique à 260nm et 280 nm.

5.1.2. Transcription inverse (la reverse transcription : RT):

Préalablement à la transcription inverse, les ARNs totaux sont systématiquement traités à la

désoxyribonucléase (DNAse) I afin d’éliminer les traces éventuelles d’ADN génomique.

Les transcription inverses ont été effectuées à partir de 5 µg d‘ARNs totaux dans un volume

total de 9 µl d’eau autoclavée. Les ARNm ont été transcrits en ADN complémentaires

(ADNc) grâce à transcriptase inverse RevertAid H minus M-MuLV (FBI Fermentas, Vilnius,

Lituanie). Après dénaturation à 70°C des structures secondaires des ARNs, l’ajout d’un

Start Stop

ADN Génomique

1eres étapes

- Amplification d’un fragment conservé à l’aide d‘amorces dégénérées. - Marche sur le gène

Start Stop

AAAAAAAAAAAAA

ADN complémentaire

2ieme étape

5’UTR 3’UTR Obtentions des extrémités par RACE-PCR

3ieme étape Séquençage du cDNA dans son entier Localisation des introns

Site Polyadénylation

Initiation transcription

Amorces dégénérés

Amorces spécifiques

Amorces 5’ GeneRacer

Amorces 3’ GeneRacer

62

oligonucléotide dT : (bys 3’) 5’- CTG TCA ACG ATA CGC TAA CGT AAC GGC ATG

ACA GGT GT (13)-3’, amorce la synthèse du premier brin d’ADNc en s’hybridant à la

séquence polyadénylée de tous les ARN messagers de la solution d’ARNs. L’hybridation a

été réalisée pendant 5 minutes à 37° C. L’ajout d’un inhibiteur des ribonucléases la Rnasine

(Promega, Madison, Etats-Unis) est nécessaire. 200 Unités de transcriptase inverse ont été

incorporés et l’ADNc a été synthétisé pendant 1 heure à 42° C. L’enzyme a été ensuite

détruite par chauffage à 85°C pendant 10 minutes. Le produit de la RT a été ensuite refroidi à

4°C, complété à 60 µl final d’eau autoclavée et conservé à –20°C. La qualité de la

transcription inverse et le niveau constitutif d’expression ont été contrôlés et évalués en

réalisant une PCR avec des amorces permettant d’amplifier un gène (exprimé de façon

constitutive) dit de « ménage », dans notre cas, il s’agit de la β- tubuline. Après alignements

des gènes et des séquences codantes de la beta-tubuline de certaines espèces d’ascomycetes

(Aspergillus flavus, Emericella nidulans, Penicillium digitatum, Leptosphaeria maculans,

Phaeosphaeria nodorum, Pestalotiopsis microspora), deux amorces ont été dessinées. Ces

amorces TubF (5’ CTC GAG CGT ATG AAC GTC TAC 3’) et TubR (5’ AAA CCC TGG

AGG CAG TCG C 3’) sont situées de part et d’autre du deuxième intron du gène de la β-

tubuline. La localisation de ces oligonucléotides permet ainsi de s’assurer de l’absence

d’ADN génomique dans les préparations d’ADN complémentaire.

5.2 Extraction des ADN Génomiques

Le protocole d’extraction d’ADN est basé sur la méthode publiée par Giradin et al, (Girardin

et al, 1993). Trois cent mg de mycélium sont broyés avec l’aide d’un potter. 5 ml de tampon

de lyse (20 mM Tris-HCL, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA pH8, 1% SDS) sont ajoutés au

broyat. Après une incubation d’une heure à 37°C en présence de proteinase K (50 µg/ml),

celle-ci est inactivée à 65°C durant 10 minutes. Les ADN sont extraits avec un mélange

63

phénol-chloroforme (7v/3v) pour précipiter les protéines. Afin d’éliminer toute trace d’ARN,

la phase aqueuse est traitée pendant 2 heures à 37°C à la RNAse. Après deux extractions

successives au chloroforme, l’ADN génomique est précipité à l’isopropanol. L’ADN

génomique ainsi précipité est rincé avec 100 µl d’éthanol à 70% afin d’éliminer les sels et les

traces d’isopropanol. Après séchage du culot, celui-ci est resuspendu dans 300 µl d’eau ultra

pure.

5.3 Amplification de l’ADN : Polymérase Chain Reaction (PCR) :

Les séquences des amorces spécifiques ou dégénérées, utilisées pour différentes

amplifications sont présentées dans chaque partie. Les différentes séquences dégénérées ont

été dessinées après alignement de plusieurs séquences protéiques homologues de PKS ou

d’ABC transporteurs d’origine fongique. Les séquences de certaines autres amorces ont été

extraites de la littérature. Toutes les amorces, sans exception, ont été sélectionnées, après

détermination de la température de fusion et après confrontation avec la banque de gène

GenBank, de sorte qu’elles n’aient aucune homologie significative non spécifique prévisible.

Les caractéristiques des amorces (température de fusion Tm, % de GC) ont été calculées par

le logiciel Oligonucléotide calculator disponible sur Internet :

(http://www.pitt.edu/~rsup/OligoCalc.html).

Hormis les quatre lettres (A,G,C,T) symbolisant traditionnellement les quatre bases

nucléotidiques, plusieurs autres abréviations ont été utilisées dans la description des amorces

dégénérées. Par convention M, R, Y, W, S, K, V, H, D, B, et N représente des mélanges de

nucléotidiques. M: A ou C, R: A ou G, Y: C ou T, W: A ou T, S : C ou G, K : G ou T , V: A

ou C ou G, H: A ou C ou T, D: A ou G ou T, B: C ou G ou T et N:A ou C ou G ou T.

Enfin une base neutre qui peut s’apparier avec les quatre bases conventionnelles a été incor-

porée dans certaines amorces. Cette base, l’inosine est symbolisée par la lettre I.

64

Toutes les réactions de PCR requises pour ce travail ont été réalisées à l’aide d’un thermo-

cycleur GenAmp 2400 (Applied Biosystems, Forster City, USA)

De façon générale, le mélange réactionnel des PCR effectuées était constitué comme suit: 300

ng ADN, 1,5 µl d’une solution 50 mM MgCl2 , 5 µl tampon 10X, 0.3µg de chaque amorce, 10

µmoles de chaque dntp ((déoxynucléotide tri phosphate) (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis) et

2.5 U de la Taq DNA polymérase (Invitrogen, Carlsbad, Etats-Unis), le tout dans un volume

réactionnel de 50 µl. Les conditions de PCR n’ont pas été identiques selon les fragments à

amplifier. Le nombre de cycles réactionnels effectués dépend de la matrice de départ. Si les

PCR sont réalisées à partir d’ADN génomique, le nombre est fixée à 40 cycles et à 45 cycles

pour de l’ADN complémentaire. La durée de l’étape d’élongation a été modifiée selon la taille

du fragment à amplifier. De même la température d’hybridation varie en fonction de la

température de fusion (Tm) des amorces. Aussi les conditions spécifiques de chaque PCR

seront rapportées dans les secteurs matériels et méthodes des différentes parties.

Les produits de PCR sont visualisés par électrophorèse sur gel d’agarose. Selon la taille

attendue du fragment amplifié, la concentration des gels a été adaptée: 3 % pour les fragments

inférieurs à 0,5 Kb, 1.2 % pour ceux de 0.5 à 3 Kb et les gels à 0.8% pour les fragments de

plus de 3 Kb. Les migrations ont été réalisées en tampon TBE (89 mM Tris Base 89 mM

Acide Borique, 2 mM EDTA).

5.4 Obtention des extrémités par Race-PCR

Pour amplifier l’extrémité 3’ de l’ADN complémentaire des gènes isolés lors de ce travail,

nous avons du recourir à la technique de la Race-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends-

Polymerase Chain Reaction) mise au point par Frohman (Frohman et al, 1988). L’amorce Bys

3’ a été synthétisée pour s’hybrider à la séquence polyA commune à tout ARN messager

(ARNm) et initier la synthèse de l’ADN complémentaire lors de l’étape de transcription

65

inverse. Par défaut, cette amorce a été systématiquement employée pour toute transcription

inverse effectuée, à la place des simples oligonucléotides (dT)12-19 disponibles dans le

commerce. Coté 5’, l’amorce contient une queue flottante sur laquelle viendra s’hybrider une

amorce lors de la réaction de PCR qui suit la réaction de transcription inverse

L’amplification des extrémités 5’ des gènes étudiés, a été réalisée à l’aide du kit GeneRacer

(Invitrogen, Carlsbad, USA). Ce kit est basé sur la « RNA ligase mediated- RACE) variante

de la RACE-PCR qui consiste à liguer un Oligonucléotide ARN sur les ARN messagers

préalablement déphosphorylés aux extrémités 5’ pour éliminer les ARN tronqués, puis traités

à la pyrophosphatase acide du tabac pour enlever la structure protectrice (coiffe constituée

d’une guanosine méthylée, la 7-méthylguanosine (m7-G)) en 5’. Cet oligonucléotide fournira

un site d’hybridation pour des amorces, après que les ARN messagers soient transcrits en

ADN complémentaires. Le principe des deux approches pour l’obtention des extrémités 5’ et

3’ est schématisé dans la figure 8. Après transcription inverse, les extrémités 5’ sont en effet

obtenues par amplification de l’ADNc en utilisant coté 5’,une amorce homologue à

l’oligonucléotide ARN ligué précédemment et coté 3’, une amorce 100% spécifique du gène

étudiée.

5.5. Purification et clonage des fragments d’intérêt

Le clonage des fragments amplifiés par PCR a été réalisé grâce au Kit de clonage TOPO TA

cloning (Invitrogen, Carlsbad, USA) et ceci en mettant à profit l’activité Adenine Terminal

Transférase de la Taq ADN polymérase, cette enzyme a ajouté systématiquement une

déoxyadénosine à l’extrémité 3’ des produits amplifiés. Afin d’optimiser cette incorporation,

les produits de PCR ont été incubés à 72°C (Température optimale de la Taq DNA

polymérase) pendant 10 minutes, juste après le dernier cycle d’amplification.

66

Le plasmide PCR2.1 TOPO est linéaire et porte un résidu thymidine (dT) non apparié à ses

extrémités 3’. Une topoisomérase est fixée de façon covalente à ce plasmide. Celle-ci permet

une ligation entre le vecteur et le produit PCR terminé en 3’ par un résidu adénine (dA). Les

clonages ont été entrepris selon les recommandations du fabriquant. Les plasmides ainsi

circularisés ont été ensuite introduits dans des cellules d’Escherichia coli souche Top10F’ par

Figure 8 : Préparation des ADN complémentaire en vue des clonages des extrémités 5’ et 3’.

choc thermique. Les bactéries contenant ce plasmide portant le gène de résistance à

l’ampicilline, ont été sélectionnées par étalement sur milieu sélectif Luria Bertani (LB :

tryptone10g/l, Yeast Extract 5g/l, Nacl 5g/l, agar 15g/l) contenant 100 µg /ml d’ampicilline .

Ce plasmide possède également le gène LacZ, composant de l’opéron lactose, qui code pour

la β-galactosidase.

ARN Totaux

1ere étape

-Traitement des ARN totaux à la phosphatase alcaline de veau (CIP)

ARN messagers

2ieme étape

Traitement des ARN messagerspar la pyrophosphatase du Tabac (TAP)

3ieme étapeLigation de l’oligonucléotide ARN

4ieme étapeTranscriptase inverseSynthèse du brin d’ADN complémentaire

ARNm tronquée AAAAAAAAAAAAAPO4

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-p

PO4 Autres ARN

CIP

CIP

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-PO4

TAP

ARNm AAAAAAAAAAAAAPO4Oligo RNA5’ 3’

RNA ligase

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

ARNm AAAAAAAAAAAAAOligo RNA5’ 3’5’TTTTTTTTTTTTTTTN

Transcriptase inverse

NNNNNNNNN

Préparation des ADN complémentaire en vue des clonages des extrémités 5’ et 3’

Bys 3’

ARN Totaux

1ere étape

-Traitement des ARN totaux à la phosphatase alcaline de veau (CIP)

ARN messagers

2ieme étape

Traitement des ARN messagerspar la pyrophosphatase du Tabac (TAP)

3ieme étapeLigation de l’oligonucléotide ARN

4ieme étapeTranscriptase inverseSynthèse du brin d’ADN complémentaire

ARNm tronquée AAAAAAAAAAAAAPO4

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-p

PO4 Autres ARN

CIP

CIP

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-PO4

TAP

ARNm AAAAAAAAAAAAAPO4Oligo RNA5’ 3’

RNA ligase

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’

ARNm AAAAAAAAAAAAAOligo RNA5’ 3’5’TTTTTTTTTTTTTTTN

Transcriptase inverse

NNNNNNNNN

Préparation des ADN complémentaire en vue des clonages des extrémités 5’ et 3’

ARN Totaux

1ere étape

-Traitement des ARN totaux à la phosphatase alcaline de veau (CIP)

ARN messagers

2ieme étape

Traitement des ARN messagerspar la pyrophosphatase du Tabac (TAP)

3ieme étapeLigation de l’oligonucléotide ARN

4ieme étapeTranscriptase inverseSynthèse du brin d’ADN complémentaire

ARNm tronquée AAAAAAAAAAAAAPO4 ARNm tronquée AAAAAAAAAAAAAPO4

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-p AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-p

PO4 Autres ARN

CIP

CIP

AAAAAAAAAAAAAARNmm7G-p-p-PO4

TAP

ARNm AAAAAAAAAAAAAPO4Oligo RNA5’ 3’

RNA ligase

5’ 3’

5’ 3’

5’ 3’5’ 3’

5’ 3’5’ 3’

5’ 3’5’ 3’

ARNm AAAAAAAAAAAAAOligo RNA5’ 3’5’TTTTTTTTTTTTTTTN

Transcriptase inverse

NNNNNNNNN

Préparation des ADN complémentaire en vue des clonages des extrémités 5’ et 3’

Bys 3’

67

Le site d’insertion du fragment se trouve dans la séquence de ce gène. Les clones ont été

détectés en présence de l’inducteur IPTG (Isopropyl 1 thio β-galactosidase ; 40mg/ml de LB)

et de 100mM de réactif X-gal (5 bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside).

Afin de vérifier la taille du fragment inséré, un criblage par PCR des clones positifs (colonies

blanches) sera réalisé à l’aide des amorces M13F et M13R.

Dans certains cas, le fragment PCR d’intérêt n’a pu être cloné sans une étape préalable

d’extraction à partir du gel, et ceci lorsque plusieurs bandes étaient visibles après détection

par électrophorèse. Dans ces conditions le recours à des kits de purification d’acides

nucléiques à partir de gel d’agarose de type QIAquick gel (Qiagen, Hiden, Allemagne) s’est

révélé nécessaire.

Les clones bactériens munis d’un insert de taille attendue ont été cultivés dans 250 ml de

bouillon de culture Terrific Broth supplémenté en ampicilline (100 µg/ ml de milieu).

L’isolement de l’ADN plasmidique a été réalisé par absorption sur résine à l’aide de la

technique Filter Maxi (Qiagen, Hiden, Allemagne).

5.6.. Séquençage des produits PCR :

Notre laboratoire ne disposant pas d’un séquenceur automatique, nous avons sous traité les

étapes de séquensage auprés de la société Génome Express S.A (Grenoble –France).

Techniquement la méthode employée pour le séquençage est celle mise au point par Sanger et

al en 1977, elle consiste en une synthèse d’un brin d’ADN complémentaire de celui à

séquencer, en présence des quatre déoxyribonucléotides. L’astuce de cette méthode réside en

l’addition des quatre 2’3’ didéoxyribonucléotides en quantité limitante. La réaction a été

menée en présence des quatre bases sous forme de didéoxyrinucléotides couplés à un

fluorochrome à très faible concentration. La nature du fluorochrome greffé est différente pour

68

chaque didéoxyribonucléotide. Le remplacement du groupement hydroxyl en 3’ par un

hydrogène, fait que ce didéoxynucleotide, dès qu’il a été incorporé lors de la synthèse du brin

complémentaire, ne peut plus contracter de liaison phosphodiester pour la poursuite de la

réaction. La synthèse de l’ADN est donc arrêtée. La concentration de ces didéoxynucleotides

étant très faible, leur incorporation aléatoire est rare. De ce fait, il sera produit autant de

fragments partiels que de sites.

Après la synthèse du brin complémentaire le produit de réaction de séquence a été déposé sur

un gel d’électrophorèse (polyacrylamide-urée). Un faisceau laser a été émis par le séquenceur

automatique et a stimulé les fragments qui se sont succédés dans une fenêtre au bas du gel.

La longueur d’onde émise (spécifique de chaque fluorochrome couplé au didéoxynucléotide

final) a été détectée et elle a signé la nature de la base en position finale pour un fragment de

cette taille. Les fragments successifs synthétisés de manière aléatoire diffèrent entre eux d’une

base.

5.7 Contrôle de l’identité des souches

Les souches étudiées lors de ce travail ont toutes été contrôlées soit par amplification et

séquençage des espaces géniques des ARN ribosomaux et/ou d’un fragment du gène codant

pour la β-tubuline, soit par analyse du profil des métabolites secondaire par HPLC. Dans le

cas d’une vérification d’identité par analyse des profils métaboliques, des profils de références

ont été préalablement validés sur des souches de collection caractérisées par l’outil

moléculaire. Pour l’obtention des séquences d’ITS, les conditions de PCR et les amorces

utilisées, ITS 4 (5’TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3’) et ITS 5 (5’ GGA AGT AAA

AGT CGT AAC AAG G 3’) ont été décrites précédemment par White et al 1990. Une petite

modification a toutefois été apportée, par l’incorporation de 5% de DMSO dans le mélange

réactionnel. Pour certaines souches de Byssochlamys nivea et B. fulva, l’amorce ITS 4 a été

69

remplacée par l’amorce ITS BYS (5’ TAC CTG ATC CGA GGT CAA CC 3’). Les fragments

du gène ont été générés à l’aide des oligonucléotides TUB F et Tub R précédemment cités.

5.8 Traitement des séquences nucléiques et protéiques

La détermination des cadres ouverts de lecture a été réalisée à l’aide du logiciel ORF

disponible sur le site du National Centre Biotechnology Information (NCBI)

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html). Le logiciel Traduction Multiple d’Infobiogen

(http://bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/traduc_in.pl) a permis de réaliser la

traduction de nos séquences.

Deux programmes ont été utilisés l’un pour les alignements entre séquences et l’autre pour

les comparaisons de séquences avec la banque de séquences GenBank : Ce sont

respectivement le logiciel Multalin du site du laboratoire de Génétique Cellulaire de l’INRA à

Toulouse (http://bioinfo.genopole-toulouse.prd.fr/multalin/) et le logiciel Blast du site NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.html).

70

Pa Partie I

Caractérisation des métabolites secondaires de Byssochlamys nivea

Olivier Puel , Souria Tadrist, Pierre Galtier, Isabelle P. Oswald, and Marcel Delaforge

Byssochlamys nivea as a Source of Mycophenolic Acid Applied and environmental microbiology (2005), 71, p.550-553

71

INTRODUCTION

En préambule à l’identification de gènes impliqués dans la biosynthèse de la patuline par

Byssochlamys nivea, des travaux de mise au point de méthodes analytiques ont été initiés afin

de suivre la patuline et ses précurseurs potentiels lors de la cinétique de production, et

finalement d’identifier les autres métabolites secondaires produits par cette espèce.

La synthèse de la patuline par Byssochlamys nivea repose sur une documentation relativement

importante. La première mention date de la seconde guerre mondiale puisque Karow et Foster

rapporte l’existence d’une substance antibiotique secrétée par une espèce de Gymnoascus. Peu

après la parution de cet article, la souche étudiée sera identifiée comme une souche de

Byssochlamys nivea, espèce découverte et caractérisée au début du 20ème siècle par Westling.

Depuis cette première mention, la production de patuline par Byssochlamys nivea a été

régulièrement rapportée (Escoula, 1975a ; Rice et al, 1977, Houbraken, 2006).

Comme la plupart des espèces fongiques, Byssochlamys nivea possède la capacité de produire

d’autres métabolites secondaires issus de voies de biosynthèse différentes. Ainsi

Byssochlamys nivea peut synthétiser l’acide byssochlamique, une toxine provenant du

métabolisme des acides tricarboxiliques, et non issue de l’action d’une polycétide synthase

(Escoula, 1975b).

Lors de ce travail, nous avons montré que toutes les souches de Byssochlamys nivea

produisent de l’acide mycophenolique, un immuno-suprésseur prometteur, utilisé en clinique

afin d’éviter le rejet de greffon lors de greffes de rein.

Deux précurseurs de ce composé de nature polycétide, l’acide 5-methylorsellinique et le 5.7-

dihydroxy-4-methylphthalide ont également été détectés dans tous les surnageants testés.

72

Byssochlamys nivea as a Source of Mycophenolic Acid

Olivier Puel 1*, Souria Tadrist1, Pierre Galtier1, Isabelle P. Oswald1, and Marcel Delaforge 2

1Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, Institut National de Recherche Agronomique,

Toulouse, France, 2 CNRS URA 2096, CEA Saclay DSV/DRM/SPI, Gif sur Yvette, France

Section: Mycology

Running title: Mycophenolic acid production by Byssochlamys

*Corresponding author. Mailing address: Laboratoire de Pharmacologie- Toxicologie,

Institut National de la Recherche Agronomique, 180 chemin de Tournefeuille, 31931

Toulouse Cedex 9, France. Tel : 33 561 285154; Fax : 33 561 285310; E-mail :

opuel@toulouse.inra.fr

73

Byssochlamys species are responsible for spoilage and degradation of fruits and silages,

and can also produce the mycotoxin patulin. We analyzed secondary metabolite

production by Byssochlamys nivea. Mycophenolic acid and its precursors, 5-

methylorsellinic acid, 5,7-dihydro 4-methylphthalide were identified in all of the B. nivea

strains that we examined.

74

Mycotoxins are secondary metabolites of fungi that may contaminate animal and human feeds

and that constitute a risk factor for human and animal health. Maize and grass silage are

frequently contaminated by fungal toxins such as patulin (7), roquefortine C (14, 19) and

mycophenolic acid (MPA) (20). In addition to its antimicrobial and antitumoral activities (1,

21), MPA also has immunosuppressive properties due to its inhibitory effect on inosine

5’monophosphate dehydrogenase (2, 3, 15). Although its acute toxicity appears to be low

(oral LD50 in rats is 700 mg/kg) (5), MPA could be a predisposing factor for infectious

diseases.

One of the most common molds isolated from silage, Penicillium roqueforti can

produce MPA. However, in a recent study of the natural occurrence of MPA contamination

in silage, only 42% of the MPA-positive samples were contaminated by P. roqueforti (18),

suggesting that one or more other fungal species also could synthesize this mycotoxin.

Monascus purpureus, Trichoderma viride, Geotrichum candidum, Paecilomyces variotii, and

Byssochlamys nivea are fungal species commonly recovered from ensiled maize (8, 16). B.

nivea can synthesize two other toxins, patulin (17) and byssochlamic acid (8).

The objectives of this study were to determine if B. nivea produced mycophenolic

acid, and whether this production could explain discrepancies observed in previous analyses

of silage samples.

Fungal strains and culture conditions. We used B. nivea strain NRRL 2615

(National Center for Agricultural Utilization Research, ARS-USDA, Peoria, Il). Ascospore

suspensions were used to inoculate three 1-L Roux flasks with 100 ml sterile Czapek-glucose

broth (7). These cultures were incubated at 25°C, in the dark, without shaking, for 1-42 days.

Other B. nivea strains used for these studies (strains numbers in parentheses indicates strains

from NRRL, Northern Region Research Laboratory [Peoria, Ill.], MUCL, Mycothèque de

l'Université Catholique de Louvain, [Louvain, Belgium], IHEM, Collection mycologique de

75

l'Institut d'Hygiene et d'Epidémiologie, [Brussels, Belgium], respectively) were as follows: B.

nivea (NRRL 5253, NRRL 1678, NRRL 5254, IHEM 3076, MUCL 39714).

Contamination control. Purity of the B.nivea NRRL 2615 culture on the eighth day

of incubation was verified by macroscopic and microscopic examination and by ITS rDNA

and 5.8 S rDNA amplification and sequencing. Genomic DNA was isolated as previously

described (13); primer pairs (ITS-5 and ITS-4) and PCR conditions were those of White et al

(20). Amplified fragments were cloned into the PCR 2.1 TOPO cloning vector.

Amplification products were sequenced once and cloned fragments were sequenced twice.

Amplified ITS DNA coding sequences (GenBank accession number AF486189) from these

cultures differed from those already deposited in GenBank (accession number U18361) at

three sites, two of which were gaps.

Dry weight determinations. Culture samples were filtered through tared Whatman

no. 1 filter paper. The washed cells were dried overnight in an oven at 70°C and cooled to

room temperature before weighing.

Chemical standards used for mycotoxin analysis. Patulin and mycophenolic acid

were purchased from Sigma (St. Louis, MO) and used without further purification. The

sources of the other secondary metabolites were: P. M. Shoolingin-Jordan, University of

Southampton, Southampton, United Kingdom, and Y. Ebizuka, Graduate School of

Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, Tokyo, Japan (6-methylsalicylic acid); H.

Fujimoto, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Chiba University, Chiba, Japan (5,7

dihydroxy-4-methylphthalide); J. D. White, Oregon State University, Corvallis, Oregon

(byssochlamic acid); and T. Anke, University of Kaiserslautern, Kaiserslautern, Germany

(orsellinic acid).

Extraction procedures. Filtered medium (100 ml), was adjusted to pH 2.0 with 2 M

H2SO4 and extracted with 70 ml ethyl acetate. The organic phase was evaporated in vacuo at

76

50°C. The residue was dissolved in 200 µl methanol, filtered through a 0.45 µm filter, and

injected (20 µl) into a chromatographic column.

HPLC and LC-MS/MS analysis. Mycotoxin analysis was performed by high

performance liquid chromatography (HPLC) with diode-array detection (HPLC-DAD) using

a 150 × 4 mm Zorbax ODS 5 µm C18 column. For secondary metabolites detection and

identification, HPLC analysis was performed with a linear elution gradient using 33 mM

acetic acid (solvent A) and acetonitrile (solvent B) according to Frisvad (10). For MPA

quantification, the gradient program was t = 0: 100% A, linear gradient to 10% B within 20

min, to 20% B in 10 min, to 90% B in 4 min, plateau for 4 min, and finally decrease within 7

min to 10% B. Liquid chromatography (LC)/mass spectrometry (MS) analysis were

performed on a HPLC-LCQ DUO Ion Trap ThermoFinnigan (San Jose, Calif.) equipped with

an electrospray ionization source (ESI). HPLC was performed on a 150 × 2.1 mm Kromasil

5C18 column. Twenty µl of the methanol suspension was injected directly into the LC

system. Gradient chromatography (run of 33 min) was performed with 17 mM acetic acid

acetonitrile as the mobile phase at a flow rate of 0.2 ml/min. The gradient started with 90% A

(17 mM acetic acid) for 2 min, then B (acetonitrile) was increased to 75% within 25 min, and

remained constant for 3 min before return to 90% A within 1 min and stabilization for 5 min.

ESI was performed at room temperature in a negative mode, the spray voltage was maintained

at 4.5 kV with the capillary temperature at 250°C using nitrogen 70 ml/min sheath and 20

ml/min gas flows. MS and MS2 tuning of the MS instrument were made with authentic 20 µM

MPA in 2.5 µl/min in 50/50 17 mM acetic acid/acetonitrile. The collision energy was set at

30%.

Six metabolites were detected and identified by HPLC and LC-MS analysis from

culture supernatants (Fig. 1), and the bracketed retention indices (RI) calculated for all

identified metabolites as described by Frisvad (11,12). Major metabolite I (RI=660) had the

77

retention index and UV spectrum of patulin. Other metabolites were identified on the basis of

their UV, MS and MS2 spectra, after comparison with reference standards. Metabolites II (RI

= 710), IV (R I= 783), and V (RI = 957) showed respectively a base peak at m/z 179, 151 and

319, and were identified as 5-7-dihydroxy-4-methylphthalide, 6-methylsalicylic acid, and

MPA. The MS2 fragments of these three acidic compounds had an important M-44 peak

resulting from carboxyl group cleavage. The MS2 peaks of metabolite V were observed at

m/z 287 (100%, M -methanol), 275 (77%, M -CO2), 269 (14%, M -H2O, -methanol) and 243

(20%, M -CO2, -methanol), 191 (49%), 179 (45%, metabolite II). Metabolite III (RI=763)

had a base peak at m/z 181 and its collision fragmentation led to fragments at m/z 137 and

121. These ions correspond to a decarboxylation and to the loss of a 60 amu fragment and are

consistent with the decarboxylated fragments observed in the MS-MS spectra of the orsellinic

acid and the 6-methylsalicylic acid standards, respectively. Metabolite III has one more

methyl group (Δ MS = 14) than orsellinic acid. On the basis of these data, metabolite III was

identified as 5-methylorsellinic acid. Metabolite VI (RI=1103) was identified as

byssochlamic acid after comparisons with UV and electron spray (EI) MS spectra data of a

reference compound. Indeed, this metabolite displayed a pseudo molecular weight at m/z 331.

The MS2 peaks were observed at m/z 287 (100%, M -CO2), 243 (3%, M -2 CO2), 259 (2%, M

-CO2, -C2H5) and 215 (4%, M -2 CO2 -C2H5). These six metabolites could be placed into

three biosynthetic pathways: patulin (patulin, 6-methylsalicylic acid), mycophenolic acid

(MPA and its two precursors, 5-methylorsellinic acid and 5-7dihydroxy-4-methylphthalide),

and byssochlamic acid (byssochlamic acid).

The first stable precursor of mycophenolic acid, 5-methylorsellinic acid was detected

from days 3-14 and 5-7-dihydroxy-4-methyl phthalide was identified from days 2-42. MPA

was first detected on day 2 and increased gradually until day 42. MPA concentration

increases with fungal mass (Fig. 2). A Pearson correlation coefficient was calculated between

78

MPA and the biomass (ρ = 0.763) and was found significant with a two-sided Gaussian test (p

< 0.001) as implemented by S-plus software (Insightful, Seattle, WA). Unlike most

secondary metabolites, which are formed in the idiophase after primary growth is complete,

MPA was produced continuously by B. nivea and was proportional to the fungal biomass.

MPA is produced in a similar manner by both batch and continuous flow cultures of P.

brevicompactum (6).

We tested MPA production by several strains of B. nivea. All of the B. nivea strains

produced MPA and its two precursors.

This report is the first of mycophenolic acid production by a Byssochlamys species.

Until now this compound was known only from cultures of a few Penicillium species. Thus,

B. nivea should be added to the list of fungi, including P. brevicompactum, P. roqueforti, P.

carneum and P. raciborskii, that are known to synthesize this toxin (4, 12). The origin of

MPA in silage has previously been attributed exclusively to P. roqueforti, the most common

fungal contaminant of silage. Like P. roqueforti, B. nivea can grow at very low oxygen

concentration and often is isolated from three- four-month-old silage (9), but further work is

needed to document the production of MPA by B. nivea in naturally contaminated silage.

The consumption of patulin or mycophenolic acid, or a combination of both, by

domesticated animals could substantially increase their susceptibility to infectious diseases.

The simultaneous exposure to additional toxins, e.g. roquefortine C, PR toxin, and

byssochlamic acid would increase the animal health risk even further, and the concomitant

isolation of B. nivea and P. roqueforti from a silage sample should serve as an indicator of

potentially increased toxin exposure.

79

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported in part by the National Institute of Agronomic Research program on

Mycotoxins (contract N° 00263), by a Midi–Pyrénées Regional grant (N° 01002728) and by a

Environment and Health 2002 grant (RD2003-009). We thank P.M. Shoolingin-Jordan, Y.

Ebizuka, H. Fujimoto, J.D. White and T. Anke for chemical standards; N. Ledger, T. Pineau

and P. Martin for critical comments on the manuscript; and S. Peterson, curator of the ARS

Culture Collection, for providing cultures of some of the strains examined.

80

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83

Figure legends

Figure 1. HPLC traces of CHCl3 extracts of B. nivea culture filtrate (5th day) and UV

spectra of metabolites detected in these cultures (in parentheses UV absorption (nm)):

Patuline (276 (100%)) [I], 5,7 dihydroxy-4-methylphthalide (216 (100%), 257, 296) [II], 5-

methylorsellinic acid (216 (100%), 260, 298) [III], 6-methylsalicylic acid (205 (100%), 240,

302) [IV], mycophenolic acid (214 (100%), 252, 303) [V], byssochlamic acid (204 (100%),

250) [VI]. In insert, sample of chromatogram of B. nivea culture filtrate (13 day); metabolite

VI (byssochlamic acid) is first detected on day 11.

Figure 2. Amount of mycophenolic and growth of B. nivea on Czapek-dextrose broth,

during production kinetics. and solid line, mycophenolic acid at mg/100 ml of culture

medium; ∆ and dashed line, dry weight as g/Roux flask.

84

Fig.1

0. 5. 10. 15. 20. 25. 30. 35. 40. 46.

25. 30.

0

1

3

4

6

7

9

12

13

15

16

10

I II III IV V VIm

Abs

Min.

85

Fig.2

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 10 20 30 40

0.

0.

0.8

0

0.

1.

Myc

ophe

nolic

aci

d

Mycelial dry w

eight

Culture age (days)

86

Partie II

Isolement de deux gènes impliqués dans la synthèse de la patuline chez Byssochlamys nivea

(Première application finalisée : la discrimination des souches de Byssochlamys fulva des souches de Byssochlamys nivea)

Olivier Puel , Souria Tadrist , Marcel Delaforge , Isabelle P. Oswald , Ahmed Lebrihi The inability of Byssochlamys fulva to produce patulin is related to absence of 6-

methylsalicylic acid synthase and isoepoxydon dehydrogenase genes International Journal of Food Microbiology (2007) 115, p. 131-139

87

INTRODUCTION Bien moins avancés que les études menées sur les bases moléculaires des voies de

biosynthèse des aflatoxines, des fumonisines et des trichothécènes, les travaux visant à

élucider les voies de biosynthèse de la patuline se résument à l’identification chez Penicillium

griseofulvum, de deux gènes, le gène codant pour l’acide 6-methylsalicylique synthase et

celui codant pour l’isoépoxydon déshydrogènase. La première enzyme, une polycétide

synthase, va participer dans la synthèse du premier précurseur stable de la patuline, l’acide 6-

methylsalicylique. Ce composé constitue le premier maillon d’une chaîne d’au moins 9

précurseurs avant la synthèse finale de la toxine.

A ce jour, on sait que tous les gènes intervenant dans la synthèse d’un métabolite secondaire

d’origine fongique, sont regroupés dans des régions précises des chromosomes dénommées

« cluster ». Le premier objectif de cette thèse a été d’isoler chez Byssochlamys nivea, les deux

gènes identifiés précédemment chez P. griseofulvum, car l’obtention de ces deux gènes est un

prérequis à la localisation des autres gènes impliqués dans la synthèse de la patuline.

Byssochlamys nivea constitue avec B. fulva les deux principales espèces du genre

Byssochlamys. Toutes deux sont réputées en tant qu’espèces productrices de patuline, bien

qu’une étude récente tend à remettre en question cette affirmation pour B. fulva (Houbraken et

al, 2006). De part leurs facultés à resister à des températures élevées et à se développer dans

des conditions appauvries en oxygène, ces deux espèces constituent des contaminants

significatifs des denrées alimentaires et plus particulièrement les conserves, les jus pasteurisés

à base de fruits. De même, ces caractéristiques expliquent le développement fréquent de B.

nivea dans les ensilages de maïs et de fourrage (Escoula, 1977), développement pouvant

provoquer des accidents toxicologiques dans les élevages.

Les gènes idh et 6msas ont été isolés du génome de Byssochlamys nivea puisque deux gènes

fortement exprimés durant la production de patuline par cette espèce, montrent de fortes

88

homologies avec leurs homologues de P. griseofulvum. Ces travaux ont d’ores et déjà apporté

des réponses concrètes à des problèmes industriels puisque ces deux gènes n’ont pas été

retrouvés dans le génome d’aucune souche de B. fulva, concluant de manière définitive à la

non-production de patuline par B. fulva et confirmant par l’outil moléculaire, les résultats

obtenus ,par Houbraken.

89

The inability of Byssochlamys fulva to produce patulin is related to absence of 6-

methylsalicylic acid synthase and isoepoxydon dehydrogenase genes

Olivier Puel 1,2 *, Souria Tadrist 1, Marcel Delaforge 3, Isabelle P. Oswald 1, Ahmed Lebrihi2

1 Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, Institut National de Recherche Agronomique,

180 chemin de Tournefeuille, BP 3, 31931 Toulouse, France.

2 Département Bioprocédés et Systèmes Microbiens, Laboratoire de Génie Chimique

UMR5503 (CNRS/INPT/UPS), Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Toulouse,

Institut National Polytechnique de Toulouse, 1, avenue de l’Agrobiopôle, BP32607, 31326

Castanet Tolosan, France.

3 CNRS URA 2096, CEA Saclay, 91191 DSV/DBJC, Gif sur Yvette, France

*Corresponding author. Tel.: 33 561 285154; Fax: 33 561 285310;

E-mail address: opuel@toulouse.inra.fr

(O.Puel)

90

Abstract

Byssochlamys species are responsible for spoilage and degradation of fruits and silages.

Under specific conditions they are able to produce mycotoxins. The aim of this study was to

evaluate the potential of 19 different strains of B. nivea and B. fulva to produce patulin in

relation with the presence of two genes involved in the patulin biosynthesis pathways in the

genome of these fungal strains. The strains were characterized by macroscopic, microscopic

examinations, internal transcribed spacer (ITS) rRNA and β-tubulin fragment amplification

and sequencing.

All of the 8 B. nivea strains tested produced patulin. By contrast, none of the 11 strains of B.

fulva produce this toxin. Two genes of the patulin biosynthetic pathway, a polyketide

synthase (pks) and the isoepoxydon dehydrogenase (idh) were cloned from B. nivea. The

deduced amino acid sequence of the polyketide synthase was 74% identical to the 6-

methylsalicylic acid synthase gene of Penicillium griseofulvum and had the five functional

domains characteristic of fungal type I polyketide synthases (beta-ketosynthase,

acyltransferase, dehydratase, beta-ketoreductase and acyl carrier protein). The complete

coding sequence of idh gene displayed after translation 88% of identity with Penicillium

griseofulvum IDH and 85% with P. expansum IDH, respectively. Both pks and idh

messengers were strongly co-expressed during the production of 6-methylsalicylic acid and

patulin. The presence of these genes was then investigated in the genome of B. nivea and B.

fulva strains by PCR. All B. nivea strains possess the two genes, by contrast none of the B.

fulva strains display these genes. The absence of 6-methylsalicylic acid and isoepoxydon

dehydrogenase genes can explain the inability of Byssochlamys fulva to produce patulin. In

conclusion, B. fulva don’t seem to be responsible for the occurrence of patulin by lack of

genes.

91

Keywords: Byssochlamys nivea; Byssochlamys fulva; patulin production; 6-methylsalicylic

acid; polyketide synthase; isoepoxydon dehydrogenase

92

1. Introduction

Byssochlamys nivea and Byssochlamys fulva are the two major species in the

Byssochlamys genus. They can degrade and spoil processed fruit products since they can grow

at low oxygen partial pressures and in acidic conditions (Taniwaki et al., 2001). The

ascospores of Byssochlamys species can withstand thermal processing treatments normally

given to fruits (Tournas, 1994) and may secrete pectin destroying enzymes that modify the

fruit texture (Reid, 1952). These species have been isolated from strawberries, plums,

gooseberries, black currants and apples, and also from heat-processed fruit products such as

sweet cider, fruit juices and bottled strawberries (Olliver and Rendle, 1934). Although

Byssochlamys species are not commonly reported from sources other than fruit based food,

there is however some favourable habitat as the corn silage where Byssochlamys nivea is

regularly isolated (Escoula, 1975).

Byssochlamys spp. also can produce toxins such as byssochlamic acid (King et al.,

1972), mycophenolic acid (Puel et al., 2005), byssotoxin A (Kramer et al., 1976), and patulin

(Rice et al., 1977). Patulin is a mycotoxin associated with immunological, neurological, and

gastrointestinal effects (Scott, 1974, Pitt, 1997). Assessment of the health risks due to patulin

consumption by humans lead many countries to regulate its amounts in food (Boutrif and

Canet, 1998). In Europe, a maximum level has been established of 50 µg per kg or ppb for

apple juice and cider, while maximum level has been reduced to 10µg/kg for all products

intended infants and young children (EU commission regulation, 2003).

Patulin is a polyketide metabolite as other many other major mycotoxins, e.g.

aflatoxins, fumonisins, and ochratoxin A. The biosynthetic pathways for these mycotoxins

often begin with a polyketide synthase (PKS) that is encoded by a gene located in a cluster of

genes related to mycotoxin production as already demonstrated for aflatoxins and fumonisins

(Seo et al., 2001, Yu et al., 2002). Knowledge of the patulin biosynthesis pathway is so far

93

limited to the identification of the 6-methylsalicylate synthase from Penicillium griseofulvum

(6MSAS) (Wang et al., 1991, Beck et al., 1990), and isoepoxydon dehydrogenase (IDH) gene

from Penicillium griseofulvum (Fedeshko, 1992) and Penicillium expansum (Dombrink-

Kutzman, 2005, White et al., 2005).

Since there is no current industrial process to detoxify a product contaminated with

patulin, ensuring the highest quality of fruit ingredients for direct consumption remains

essential. Isolating and identifying the genes responsible for patulin biosynthesis should

increase our understanding of the molecular mechanisms used to regulate toxin production by

different fungi. The identified genes can be used as a target for PCR-based methodologies to

detect the fungi responsible for producing the toxins in the foodstuffs. Indeed, rapid and

specific detection of the patulin producing fungi is important to ensure both the quality and

safety of fruits.

B. nivea can produce patulin from a number of natural substrates, including fruits and

heat-processed or fermented products such as fruit juice, cider and apple compote (Pitt and

Hocking, 1985). The patulin production by Byssochlamys fulva is still controversial. Patulin

was reported to be produced by B. fulva (Rice et al., 1977), while Houbraken et al (2006)

could not detect patulin production by any of the investigated B. fulva isolates.

Among both species, B. fulva is more frequently isolated in food than B. nivea (Pitt

and Hocking, 1985). It was thus important to analyse the production of patulin of these two

Byssochlamys genus in relation with the presence of gene involve in the patulin biosynthesis

in their genome.

Eight B. nivea and eleven B. fulva strains were characterized by macroscopic and

microscopic examinations, internal transcribed spacer (ITS) rRNA and β-tubulin gene

fragment amplification and sequencing, and by isolation of genes involved in patulin

biosynthesis pathway. Using this approach, we demonstrate that all tested B. fulva strains did

94

not produce patulin and lack of 6msas and idh genes which are expressed during 6-

methylsalicylic acid and patulin production by B. nivea. The lack of homologous genes in B.

fulva could explain the inability to produce patulin by B. fulva.

2. Materials and methods

2.1. Fungal strains and culture conditions

Fungal isolates (Table 1) were obtained from various fungal collections. The different

isolates were cultured on a Potato Dextrose Agar (PDA) medium (Fluka, Sigma-Aldrich, St

Louis, USA) at 25°C for 21 days in the dark. For patulin production checking, ascospore

suspensions made from this late culture, were used to inoculate one 1-L Roux flasks with 100

ml sterile Czapek-glucose broth (35 g Czapek medium (Difco, Detroit, Mi), 2 g yeast extract

(Fluka, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.), 8 g dextrose, and 1L distilled water) for each kinetic

point. These cultures were placed in an incubator in the dark at 25°C for one to twenty-one

days, without shaking. Each day, the supernatants were extracted and analyzed by pressure

liquid chromatography with diode-array detection (HPLC-DAD) and liquid chromatography

coupled with mass spectrometer (HPLC-MS). For DNA extraction, all isolates were

inoculated in YES broth and placed on a shaking incubator at 200 rpm at 25°C for 4 days. The

Byssochlamys nivea NRRL 2615 strain (National Center for Agricultural Utilization

Research, ARS-USDA, Peoria, IL) was examined for isolation, cloning and expression study

of patulin biosynthesis pathway genes. For 6MSAS and IDH transcription kinetics, ascospore

suspensions were used to inoculate three 1-L Roux flasks with 100 ml sterile Czapek-glucose

broth. These cultures were placed in an incubator in the dark at 25°C for one to forty-two

days. Total RNA was extracted from mycelia and supernatants were collected and analyzed

by HPLC.

95

2.2. Identity control

The identity of strains was verified by macroscopic and microscopic examination and

for several among it, by internal transcribed spacer (ITS) rRNA and 5.8S rRNA gene and

partial β-tubulin gene amplification and sequencing. Primer pairs (ITS-5 and ITS-4) and PCR

conditions were those described by White et al (1990). Primers Tub F (5’ CTC GAG CGT

ATG AAC GTC TAC 3’) and Tub R (5’AAA CCC TGG AGG CAG TCG C 3’) were used

for β-tubulin fragments. PCR products were cloned into the PCR 2.1 TOPO cloning vector

(Invitrogen, Carlsbad, Calif.) and sequenced.

2.3. Chemicals used for mycotoxins analysis

Patulin and mycophenolic acid were purchased from Sigma and used without further

purification. The sources of the other secondary metabolites were: P. M. Shoolingin-Jordan,

University of Southampton, Southampton, United Kingdom, and Y. Ebizuka, Graduate

School of Pharmaceutical Sciences, University of Tokyo, Tokyo, Japan (6-methylsalicylic

acid). All solvents used in extraction, liquid chromatography-DAD, and chromatography-

mass spectrometry were analytical grade. Water for high performance liquid chromatography

and molecular biology procedures was purified by using a Millipore MilliQ purification

system (Millipore SA, Molsheim, France).

2.4. Secondary metabolite analysis

Secondary metabolites analyses were performed at 1-7, 14, and 21 days. After

filtration, for each point, the pH of 100 ml collected medium was adjusted to 2.0 with 1 N

sulfuric acid and then were extracted with 70 ml ethyl acetate. The organic phase was

evaporated in vacuo at 50°C on a rotary evaporator. The residue was taken up in 200 µl

96

methanol, and this suspension filtered through a 0.45 µm filter before injection (20 µl) into

the chromatograph apparatus.

2.4.1. Detection by HPLC-DAD

Mycotoxin analysis was performed by high pressure liquid chromatography with

diode-array detection (Kontron Instruments, Milan, Italy) and a 150 mm × 4 mm Zorbax ODS

5 µm C18 column (Bischoff, Leonberg, Germany). HPLC analysis was performed with a

linear elution gradient using 33 mM acetic acid (solvent A) and acetonitrile (solvent B) with a

flow rate of 2 ml min-1. The gradient elution program was: 100% solvent A, increasing to

10% solvent B within 20 min, increasing to 20% B in 10 min, increasing to 90% B in 4 min,

remaining for 4 min at 90% B, then decreasing within 7 min to 10% B, and finally returning

to 100% A in 1 min.

For the detection and identification of the other secondary metabolites, the gradient

solvent system was slightly modified according to Frisvad (1987a). Standards of all

compounds were applied to confirm their identity. The bracketed alkylphenone retention

indices of secondary metabolites isolated from the cultures with LC-retention times of less

than 30 min were calculated on the basis of the time of retention (Frisvad and Thrane, 1987).

2.4.2. Mass spectrometry analysis

The HPLC-MS-MS instrument used was a LCQ DUO Ion Trap coupled with a HPLC

system from Thermo-Finnigan (San Jose, Calif.). HPLC was performed on a reverse phase

column 150 × 2.1 mm Kromasil 5C18 column. Twenty µl of the methanol suspension was

injected directly into the HPLC system. Gradient chromatography (run of 33 min) was

performed with 17 mM acetic acid in water (eluent A)-acetonitrile (eluent B) as the mobile

phases at a flow rate of 0.2 ml min-1. The program initiates with 90/10 eluent A/B for 2 min,

97

then eluent B was increased to 80% within 25 min, then held constant for 3 minutes, and

finally returned to 90/10 eluent A/B with in 1 min and allowed to reequilibrate for 5 min.

HPLC-MS measurements were performed using the electrospray ionization mode (ESI). ESI

was performed at room temperature in a negative mode, the tension was maintained at 4.5 kV

with the capillary temperature at 250°C. MS and MS-MS adjustments were made with

patulin. The collision energy was set at 30%.

2.5. Nucleic acids extraction

Genomic DNA was isolated as previously described (Girardin et al., 1993). RNA was

isolated from cultures grown in liquid Czapek-glucose medium by filtering the cultures

through Whatman no. 1 filter paper. One hundred mg of ground mycelium was added to 1 ml

of TRIZOL Reagent (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), vortexed, combined with 0.2 ml

chloroform, mixed again, incubated for 2 min at room temperature, and then centrifuged

(12000 × g, 4°C, 15 min.). RNA was precipitated from the resulting aqueous phase by adding

0.5 ml isopropyl alcohol, mixing, incubating 10 min at room temperature, and centrifuging

(12000 × g, 4°C, 10 min.). The pellet was washed with 75% ethanol and resuspended in 70 µl

sterile water. RNA was treated with DNAse (Amersham Biosciences, Little Chalfont, U. K.)

to digest traces of genomic DNA. Total RNA was used as the template to generate first strand

cDNAs in 20 µl reaction mixtures containing: 5 µg of total RNA, 820 ng of GeneRacer Oligo

dT primer (Invitrogen, Carlsbad, Calif.), 1× RT buffer, 40 U of RNAsin ribonuclease inhibitor

(Promega, Madison, WI), 0.1 M DTT, and 200 U MuLV reverse transcriptase (MBI

Fermentas, Vilnius, Lithuania).

2.6. Isolation and cloning of idh and 6msas genes

98

PCR was carried out in a GenAmp PCR System 2700 thermocycler (Applied

Biosystems, Forster city, USA), on genomic DNA and cDNA with Taq DNA polymerase

(Invitrogen). For 6msas gene, the degenerate MSAS type β ketoacyl synthase domain primers

LC3 and LC5c (Bingle et al., 1999) were used in order to isolate β ketoacyl synthase domain.

For the amplification of 5’ and 3’ contiguous fragments, the primers used were: 2F (5’- AGT

GCT GTC GCC CAG GAC GGG AAA ACG AAC G-3’), 2R (5’-GGI AAI CCC ATI GCI

GAI ACI CC-3’), 3F (5’-GGI GTI TCI GCI ATG GGI TTI CC-3’), 3R (5’-ACI GTC ATG

ACI GAG TCI ACI CC-3’), 4F (5’-GAT TCG CGG CTG TGT CGC CAA AG-3’), 5R (5’-

ATC CAC TGC GGT ACT TGG ACC C-3’), 6F (5’-GTC CGT TCA GAT TGT AGT ACA

GC-3’), 6R (5’-GGA TGA GTC CCA AGG AAG GG-3’). By using the Gene Racer Kit

(Invitrogen) as specified by the manufacturer, the 5’ and 3’ untranscribed regions (UTR)

were amplified by the method of Race-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends), as

previously described (Shen et al., 2004).

For idh gene, a first PCR was carried out from cDNA, using the specific Penicillium

griseofulvum IDH primers previously designed to amplify a 600 base pairs of this gene

(Paterson et al., 2003). These primers had the following sequence: IDH 1P (5’-CAA TGT

GTC GTA CTG TGC CC-3’), and IDH 2P (5’-ACC TTC AGT CGC TGT TCC TC-3’).

Following a same strategy, the 5’ and 3’ UTR were amplified by the method of Race-PCR.

The internal specific primers had the following sequence: B 5’1 (5’-GAA TGC AGT CCC

AAC AGC TCG G-3’), and B 3’1 (5’-AGA GTT CTT TCA TGG GTC GCG AGT TCT

ATC-3’). Two other primers G1 (5’-GAA AAA GCT ATG TTA GAA CTG AAG TTA AG-

3’), G2 (5’-GTC AAG AAG CTA AGA TTT GAT CTC A-3’) were used for amplify whole

gene from genomic DNA, in order to locate possible introns, after sequencing.

All amplified fragments were cloned into the PCR2.1 Topo cloning kit (Invitrogen).

Nucleotide sequences of both DNA strands were determined via ABI Prism dye (Applied

99

Biosystems, Foster city, Calif.) terminator cycle sequencing of templates consisting of maxi-

prep (Qiagen, Hilden, Germany) purified plasmids.

2.7. Expression study by Reverse transcriptase-PCR

Five µg of total RNA were used as the template to generate first strand cDNAs in 20

µl reaction mixtures, as previously described. PCR was performed with a Perkin-Elmer 2400

thermocycler, with Taq DNA polymerase and two specific primers. For 6msas gene, the

primer sequences, INT 1 (5’-GCT TCG TAG AGT CTC CAA GCC-3’) and INT 2 (5’-CAG

GAA ATA GCC ACG TGA AGT CG-3’) are located respectively upstream and downstream

of the only intron. For idh gene, the primers ISO EXP1 (5’-TCA TAA GAT GTT ACC TGA

AGG C-3’) and ISO EXP2 (5’-CTG CGA TAG AAC TCG CGA C-3’) are located

respectively upstream and downstream of the second intron. The PCR were performed with

the following conditions: initial denaturation at 94°C for 3 min, 30 cycles consisting of

denaturation at 94°C for 30 s, annealing at 55°C for 40 s, extension at 72°C for 40 s. After the

cycles the PCR reaction ended with an extension step at 72°C for 7 min. The amplification

products were separated in 1.2% agarose gels.

2.8. Detection of 6msas and idh genes

The presence of 6msas and idh genes in B. nivea and B. fulva strains genome was

investigated by PCR. Two primers pairs were used for each gene. The PCR were performed

respectively with INT1/INT2 and LC3/LC5c for 6msas gene, and ISO EXP1/ISO EXP2 and

IDH1P/IDH2P for idh genes, with the same conditions described above. The annealing

temperature was progressively decreased to 50°C for specific primers and to 45°C for

degenerated primers.

100

2.9. Nucleotide sequence accession number and sequence analysis

The 6msas and idh gene sequence of B. nivea were deposited in the GenBank database

with accession numbers AF360398 and AY532266, respectively. B. nivea and B. fulva β-

tubulin gene and ITS sequences were deposited in GenBank. The accession numbers are

shown in Table 1. Sequences were aligned with ClustalX (version 1.83) a multiple sequence

alignment computer program. Cladistic analyses were based on the Neighbor-joining method

as implemented by the MEGA 2.1 computer program with the P-distance model (Kumar et

al., 2001).

3. Results

3.1. Characterization of strains

Before to test several strains of B. nivea and B. fulva for patulin production, by HPLC

and LC-MS analysis, we verified their identity of strains by macro and microscopical

examination, sequencing and cloning ITS and β-tubulin gene fragments. The morphological

characters were checked for all strains. The characters of all tested strains are consistent with

the previous description of two species (Samson et al., 1974) and constant at species level,

excepted two B. fulva strains (NRRL 3849 and ATCC 24008) which display B. nivea

characters. All B. nivea strains share the same β-tubulin and ITS sequences with 100 %

similarity. These sequences differ in four transitions and 15 point mutations, respectively with

B. fulva ITS and β-tubulin sequences. Concerning the β-tubulin sequence, most differences

were located in intron level. Among B. fulva strains, two strains (NRRL 3849 and ATCC

24008) displays the B. nivea characteristic ITS and β-tubulin sequences.

3.2. Production of secondary metabolites by B. nivea and B. fulva strains

101

All of the 8 B. nivea strains tested produced patulin. Maximum patulin production

ranging from 0.01 to 1.6 mg ml-1 occurred at 7 days when comparing the levels of patulin at

nine different time points (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 and 21 days). Concerning strains formerly

identified as B. fulva, only two strains identified as B. nivea by their ITS and β-tubulin

sequences have shown patulin production with maximum to 0.6 mg ml-1 (NRRL 3849) and

0.01 mg ml-1 (ATCC 24008). For all other strains, no trace of patulin above than detection

limit value (0,5 ng ml-1) have been detected at different points of kinetics as well as in

cultures on CYA, MEA and PDA after incubation at 25°C during two weeks.

The identification of the other B. nivea secondary metabolites was reported previously

(Puel et al., 2005). All B. nivea strains produced 6 metabolites related to three biosynthetic

pathways: patulin (patulin, 6-methylsalicylic acid), mycophenolic acid (mycophenolic acid, 5-

methylorsellinic acid, 5-7 dihydroxy-4-methylphthalide) and byssochlamic acid

(byssochlamic acid). We studied secondary metabolites production by B. fulva, in the same

culture conditions. Among B. fulva strains tested, only two strains (NRRL 3848 and ATCC

24008) identified in this study as B. nivea, display a B. nivea typical secondary metabolites

profile. For all other B. fulva strains, only byssochlamic acid has been detected in B. fulva

cultures, among metabolites cited above. Two metabolites detected in the first days of B. fulva

cultures display a indole ring chromophore typical UV spectra.

3.3. Isolation of 6msas and idh genes in B. nivea.

Degenerate primers LC3/LC5c from two conserved amino acids regions in the β

ketoacyl synthase domain (Fig. 1) of the MSAS type PKS, were used to isolate a putative

PKS gene involved in patulin biosynthesis. With genomic DNA as the template, these primers

amplified a ~650 bp product which was 82 % similar at the amino acid level to the KS

domain from a P. griseofulvum MSAS (CAA39295). Two pairs of specific (5')/degenerate (3')

102

PCR primers (Fig. 1) were designed after aligning other MSAS-type PKS sequences listed in

GenBank, for the amplification of 3’contiguous fragments. The 5’UTR and 3’UTR were

amplified by RACE-PCR.

Based on nucleotide sequence analysis of six overlapping PCR fragments, we

identified a 5.3 kb open reading frame formerly named Bnpks, interrupted by a single intron.

The intron was in the 5' terminal portion of the sequence and was confirmed in comparisons

between the genomic DNA fragment and a cDNA fragment. As expected, the PCR product

amplified from the cDNA template was 59 bp smaller than that amplified from the genomic

DNA template. BLAST analysis indicated that the predicted 1778 amino-acid translation

product had significant similarity to numerous MSAS type PKSs. The highest level of

identity (74%) was with the MSAS of P. griseofulvum.

With the similar strategy, we amplified, cloned and sequenced another gene which

displays, after removal of two introns and translation, 89% of identity with IDH of

Penicillium griseofulvum (AAG13989) and 85% of identity with P. expansum IDH

(AAY85382-AAY85384). The whole transcript sequence began at 104 bp upstream of a

conventional start codon and finished at 37 bp of stop codon. The complete coding sequence

consisted of 780 pb sequence capable of encoding a protein of 259 amino acids. The gene has

shown two introns of 46 bp and 139 bp, containing respectively the Lariat sequences

GACTAAT and CTGACA. These sequences are identical to P. griseofulvum Lariat

sequences. Recently, a paper published by Dombrink-Kurtzman and Engberg mentioned the

isolation of this gene in several Byssochlamys nivea strains (DQ322207-DQ322214). All

strains examined had identical amino acid sequences with the sequence described in this

article whatever geographical origins (Dombrink-Kurtzman and Engberg, 2006). There was

also a strong similarity at amino acid level to a short chain alcohol dehydrogenase from

Gibberella zeae (EAA72834).

103

The expression of these genes in a surface culture of B. nivea was studied by RT-PCR.

The mRNA were co-expressed during patulin synthesis and more particularly during the first

ten days and peaked between days 2 and 5 (fig. 2), period when the patulin first precursor, 6

methylsalicylic acid have been also detected.

3.4. Presence of 6msas and idh genes in B. nivea and B. fulva

The presence of 6msas and idh was then investigated in our Byssochlamys collection

in relation with their production of patulin (Table 1). Among the tested isolates a perfect

correlation was observed between the presence of 6msas and idh gene and the patulin

production. Indeed, all strains identified as B. nivea in this study have shown two 374 and 445

bp fragments for 6msas and idh genes respectively, when these genes were amplified with

specific primers set while B. fulva strains did not produce any detectable amplification

fragments (Fig. 3). The similar results have been obtained when the PCR are performed with

degenerated primers.

4. Discussion

Several species of mold encompassing over few genera were earlier reported to

synthesize patulin. A recent exhaustive review echoes the old studies which reported patulin

production by a multitude of species related to not less 30 genera (Moake et al., 2005).

Several works based on analysis of secondary metabolites profiles or molecular

characterization, revise to low, the number of patulin producing species. For example, among

the following Aspergillus species, A. terreus, A. clavatus, A candidus, A. giganteus, E.

amstelodami, A. echinulatus, A. fumigatus, A parasiticus, A. repens, A. variecolor and A.

versicolor, a recent study established that only A. clavatus produce effectively patulin (Varga

104

et al., 2003). An overview regarding the species in Penicillium subgenus Penicillium after

checking a significant number of isolates, from each species and reidentification of certain

isolates, had determinate 13 patulin producing species: P. carneum, P. clavigerum, P.

concentricum, P. coprobium, P. dipodomyicola, P. expansum, P. glandicola, P. gladioli, P.

griseofulvum, P. marinum, P. paneum, P. sclerotigenum, P. vulpinum (Frisvad et al., 2004).

This list is often the result of splitting of one species in two or three novel species. For

example, this resulted in identifying in Penicillium roqueforti group, P. carneum and P.

paneum as patulin producer while P. roqueforti sensus stricto don’t synthesize patulin.

Regarding Byssochlamys species, the work which concluded that Byssochlamys fulva don’t

produce patulin is based only on morphologic characterization. In our study, the molecular

characterization allowed to re-identify 2 strains formerly identified as B. fulva. One of these,

the strain H36 deposited in American Type Culture Collection under number ATCC 24008

have been reported as patulin producing B. fulva strain by Rice et al. (1977). In Rice’s study,

strains of B. nivea have been demonstrated at higher potential to synthesize patulin than have

B. fulva strains. In fact, Rice et al found that two of ten strains of B. fulva produced patulin in

a laboratory medium. The second strains H25 (ATCC 36841) was identified as really B. fulva

by molecular characterization, but we could not detect patulin production neither for isolate

from ATCC nor isolate come from the laboratory which have isolated it, whatever conditions

and media used.

Although B. fulva is frequently cited as a source of patulin production, this data is

based on this single article. Recently, this became a controversial point, since a recent work

refutes this affirmation (Houbraken et al., 2006).

In order to check if B. fulva possess the genetic abilities to produce patulin, we

investigated the presence of two genes involved in patulin biosynthesis pathways, 6msas and

idh. In a first step, these genes were isolated, cloned and sequenced in B. nivea. The predicted

105

translation product of the Bnpks gene contains five putative functional domains of functional

domains characteristic of a fungal type 1 PKS. These domains were (from N terminus to C

terminus) β-ketoacyl synthase (KS), acyltransferase (AT), dehydratase (DH), β-ketoacyl

reductase (KR), and an acyl carrier protein (ACP) (Fig. 4). The deduced amino acid sequence

of Bnpks showed the highest homology to fungal 6-methylsalicylic acid synthases (MSASs)

from Penicillium griseofulvum (Beck et al., 1990), Aspergillus terreus (Fujii et al., 1996), A.

ochraceus (AY540947), Glarea lozoyensis (Lu et al., 2005). An unrooted radial tree of fungal

type I PKSs based on the amino acid sequences of three domains (KS, AT, ACP) common to

all fungal PKSs whose function has been identified, confirms that BNPKS is closely related to

the P. patulum 6MSAS which is involved in patulin production in this species (Fig. 4).

The strong homology with the P. patulum MSAS, the presence of the five functional

domains characteristic of 6-methylsalicylic acid synthase, the similar position of the sole

intron, and the expression during patulin production are consistent with the conclusion that

the gene we identified encodes a 6MSAS involved in patulin biosynthesis in B. nivea.

Recently, a primer pair specific for the idh gene has been developed and used

successfully to detect patulin producing abilities of penicillia (Paterson et al., 2000, Paterson

et al., 2003). These primers allowed us to isolate B. nivea idh gene. In order to evaluate this

specific ability in Aspergillus species, the same primers have been used. In all these studies,

all strains and species negative for the idh were shown not produce patulin. Paterson had

shown that all of the 50 strains which negative for idh gene, were negative for patulin

production. The contrary case is not true, since only 60% of strains positive for idh gene, were

positive for patulin production. Several phenomena could explain this observation. First, the

finding of particular gene doesn’t presuppose the presence of whole cluster which regroup all

genes involving in mycotoxin biosynthesis. This difference could also explain by the

alteration of signaling pathways which operate to regulate secondary metabolites synthesis, by

106

way of cluster genes activating (Calvo et al., 2002). Regarding Byssochlamys fulva, the

explanation is straightforward. The inability to produce patulin is related to absence of idh

gene.

Contrary to B. nivea, we didn’t detect also the patulin first precursor, 6 methylsalicylic

acid in B. fulva culture media, leading to suppose absence of 6msas gene in B. fulva. This

hypothesis was confirmed. It was first time that a method based on 6msas gene was used to

detect patulin producer species. Also in this case, the correlation between absence of specific

gene and absence of patulin production is remarkable.

The patulin non production by B. fulva is of an interest for food industry and more

particularly for manufacturers which make heat treated food such as apple juice.

Byssochlamys strains produce heat resistant ascospores that can survive pasteurization (Brown

and Smith, 1957) and can cause the risk of potential continued production of patulin within

the finished product, after heat treatment. The presence of patulin in finished juice can be

assigned to a frequent contamination of fruits by Penicillium expansum before pasteurization

or by a post treatment production of patulin by Byssochlamys nivea.

In conclusion, we demonstrated that B. fulva is unable to produce patulin, because this species

lacks at least two genes indispensable for patulin biosynthesis.

Acknowledgments

This work was supported in part by a Midi–Pyrenees Regional grant (no. 01002728), by

AFSSET grant ES-2005-012 and by a ADEME grant (n° 0275042). We thank P.M.

Shoolingin-Jordan, Y. Ebizuka, H. Fujimoto, J.D. White and T. Anke for chemical standards;

S. Peterson, curator of the ARS Culture Collection for providing cultures of some of the

strains examined, J. Churey of New York State Agricultural Experiment Station and E.

107

Pieckova from Slovak Technical University of Bratislava, for respectively the generous gift

of B. fulva H25 strain and MD01 B. fulva strain. We thank P. Galtier for his constant support.

108

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115

TABLE 1. Fungal strains used in this study

Byssochlamys

species strains designationsa GenBank acession numbers patulin production

( at day 7)

ITS Beta-tubulin mg/ml

Byssochlamys

nivea NRRL 2615 AF486189 AY738642 0,28

Byssochlamys

nivea NRRL 5253 NDb AY552782 0,30

Byssochlamys

nivea NRRL 1678 ND ND 1,61

Byssochlamys

nivea NRRL 5254 ND ND 0,03

Byssochlamys

nivea IHEM 3076 ND ND 0,02

Byssochlamys

niveaTc

MUCL 39714 CBS

100.11 DQ464362 DQ453962 0,54

Byssochlamys

nivead NRRL 3849 DQ459371 DQ459370 0,62

Byssochlamys

nivead ATCC 24008 DQ464363 AY560321 0,01

116

Byssochlamys

fulva NRRL 2975 AY560323 AY560322 -

Byssochlamys

fulva NRRL 1125 AY306013 DQ453961 -

Byssochlamys

fulva NRRL 3493 ND ND -

Byssochlamys

fulva NRRL 2614 AY560324 AY738640 -

Byssochlamys

fulva MUCL 14267 ND AY738641 -

Byssochlamys

fulva DSMZ 62097 ND DQ459369 -

Byssochlamys

fulva DSMZ 1808 ND ND -

Byssochlamys

fulva ATCC 36841 DQ459372 AY552783 -

Byssochlamys

fulva IHEM 17722 ND ND -

Byssochlamys

fulva NRRL A 2142 ND ND -

Byssochlamys MD01 ND ND -

117

fulva

a Sources of microorganisms are as follows: NRRL, Northern Region Research Laboratory,

Peoria, Ill; ATCC, American Type Culture Collection, Manassas, Va; DSMZ, Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany; MUCL,

Mycothèque de l'Université Catholique de Louvain, Louvain, Belgium; IHEM, Collection

mycologique de l'Institut d'Hygiene et d'Epidémiologie, Brussels, Belgium; MD, Mycology

Department, Institut of Preventive and Clinical Medecine, Bratislava, Slovakia.

b not

determinated

c T, neotype

d formerly identified as Byssochlamys fulva

118

Figure legends

Fig. 1. Strategy for B. nivea PKS gene fragment amplifications. (A). Four overlapping

genomic DNA fragments were amplified spanning 80% of the coding sequence. The 5’ and 3’

extremities of mRNA were obtained from cDNA by Race-PCR. Strategy for B.nivea IDH

gene (B). Three overlapping cDNA fragments were amplified. Two other primers G1 and G2

were used for amplify whole gene from genomic DNA, in order to locate introns. The

position and characteristics of the PCR primers for both are indicated.

Fig. 2. (A) Amount of patulin at mg/100 ml of culture medium; (B) Transcript levels of

Bnpks (6msas) gene detected by RT-PCR. Lanes 1 to 9, RT-PCR products amplified from

Czapek-dextrose broth cultures harvested at days 2 to 10, respectively; 10, Molecular weight

marker; 11, positive control T+ (20 ng genomic DNA template), 12 negative control T-

(genomic DNA template absent). (C) Transcript levels of idh gene detected by RT-PCR.

Lanes: 1, Molecular weight marker; 2 to 10, RT-PCR products amplified from Czapek-

dextrose broth cultures harvested at days 2 to 10, respectively; 11, positive control T+ (20 ng

genomic DNA template), 12 negative control T- (genomic DNA template absent), 13,

Molecular weight marker.

119

Fig. 3. Detection of Bnpks (6msas) and Idh gene in B. nivea and B. fulva genomes. (A)

Bnpks, PCR with INT1/INT2 primers set, (B) Idh, PCR with ISO EXP1/ ISO EXP2 primers.

Lane M, Molecular Weight Marker, 1, B. fulva NRRL 2975; 2, B. fulva NRRL 1125; 3, B.

fulva NRRL 3493; 4, B. fulva NRRL 2614; 5, B. fulva MUCL 14267; 6, B. fulva ATCC

36841; 7, B. fulva IHEM 17722; 8, B. fulva MD 01; 9, B. fulva DSMZ 62097, 10, B. nivea

NRRL 2615; 11 B. nivea NRRL 1678; 12, B. nivea NRRL 5254; 13 B. nivea NRRL3849; 14,

B. nivea IHEM 3076; 15, B. nivea ATCC 24008; 16, B. nivea NRRL 5253.

Fig. 4. (A) Amino acid alignment of β-ketoacyl synthase (KS), acyl transferase (AT) and acyl

carrier protein (ACP) domains from the B. nivea PKS gene with type I PKS genes. The B.

nivea PKS domain sequences were aligned with those of 6MSAS from P. patulum (Beck et

al., 1990), 6MSAS from A. terreus (Fujii et al., 1996), AVIM from S. viridochromogenes

(Gaisser et al., 1997), PKSL1 from A. parasiticus (Feng et al., 1995) , WA from A. nidulans

(Mayorga and Timberlake, 1992) , PKS4 from G. fujikuroi (Linnemannstöns et al., 2002) ,

FUM1 from G. moniliformis (Proctor et al., 1999), PKS1 from C. heterostrophus (Yang et

al., 1996), and LNKS from A. terreus (Hendrickson et al., 1999). The name of the genes in

the alignment and tree are preceded by two letters indicating the source species. (B).

Unrooted radial tree of fungal type I PKSs based on amino acid sequences of KS, AT and

ACP domains. A scale bar (divergence of 0.1). The presence of functional domains is given

beside the protein name. Included in the presentation are structures of metabolites

corresponding to genes quoted above. 1, 6-methylsalicylic acid; 2, orsellinic acid; 3,

lovastatin; 4, toxin T; 5, fumonisin B1; 6, bikaverin; 7, naphtopyrone WA; 8, aflatoxin B1.

120

Fig 1

AAAAAA

5’ 3’

1

2

3

45

66F 6R

3F 3R

4F2F 2R5R

Intron

Degenerated primersB.nivea specific primers

GeneRacer 3’primer

ATG

GeneRacer 5’primer

TAG

5549 bpLC5LC3

AAAAAA

5’ 3’

1

2

3

45

66F 6R

3F 3R

4F2F 2R5R

Intron

Degenerated primersB.nivea specific primers

GeneRacer 3’primer

ATG

GeneRacer 5’primer

TAG

5549 bpLC5LC3

A

IDH primers

B.nivea specific primers

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

B

AAAAAA5’

ATG TAG 3’ Intron Intron

1105 bp

Idh 1P Idh 2P

B 5’1 B 3’1

G1 G2

1

2 3

4

121

Fig 2

Patu

lin(m

g)

0 ,0

5 ,0

1 0 ,0

1 5 ,0

2 0 ,0

2 5 ,0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5d a y s

Bnpks

316 pb 374 bp2 3 4 5 6 7 8 9 10 M T+ T -

days

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T+ T- M

idh

445 bp306 pb

days

A

B

C

Patu

lin(m

g)

0 ,0

5 ,0

1 0 ,0

1 5 ,0

2 0 ,0

2 5 ,0

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5d a y s

BnpksBnpks

316 pb 374 bp2 3 4 5 6 7 8 9 10 M T+ T -

days

M 2 3 4 5 6 7 8 9 10 T+ T- M

idhidh

445 bp306 pb

days

A

B

C

A

B

C

122

Fig 3

idh

bnpks

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A

B

B.niveaB.fulva

445 bp

374 bp

idh

bnpks

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A

B

B.niveaB.fulva

idh

bnpks

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

idh

bnpks

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 M

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

A

B

B.niveaB.fulva

445 bp

374 bp

123

Fig.4

0.1

AtLNKS

SvAVIM

At6MSAS

BnPKS

Pp6MSAS

ApPKSL1

AnWA

GfPKS4

GmfUM1

ChPKS1

COOH

CH3

OH

1 KS,AT,DH,KR, ACP

COOH

CH3

OH

OH

2KS,AT,DH, ACP

4

OHOHO O OOH O OHO O O OOH

CH3CH3

O

CH3OH

OH OH

NH2CH3O

O

OHOOC

HOOC

HOOC

HOOC

5 KS, AT,DH,(MT), ER, KR, ACP

CH3

OCH3

OH

OH

O

COOH

3

6

O

OH OH O

OH CH3

OH

7

OCH3O O

O

OO

OCH3O O

O

OO

8

KS, AT, ACP, TE

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

GmFUM1

ChPKS1

AtLNKS

SvAVIM

GfPKS4

AnWA

ApPKSL1

BnPKS

At6MSASPp6MSAS

0.10.1

AtLNKS

SvAVIM

At6MSAS

BnPKS

Pp6MSAS

ApPKSL1

AnWA

GfPKS4

GmfUM1

ChPKS1

COOH

CH3

OH

1 KS,AT,DH,KR, ACP

COOH

CH3

OH

OH

COOH

CH3

OH

OH

2KS,AT,DH, ACP

4

OHOHO O OOH O OHO O O OOH

CH3CH3

O

CH3OH

OH OH

NH2CH3O

O

OHOOC

HOOC

HOOC

HOOC

5 KS, AT,DH,(MT), ER, KR, ACP

CH3

OCH3

OH

OH

O

COOH

3

6

O

OH OH O

OH CH3

OH

7

OCH3O O

O

OO

OCH3O O

O

OO

8

KS, AT, ACP, TE

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

GmFUM1

ChPKS1

AtLNKS

SvAVIM

GfPKS4

AnWA

ApPKSL1

BnPKS

At6MSASPp6MSAS

0.1

A

B

Acylβ-ketosynthase Acyl transferase Acyl carrier protein

0.1

AtLNKS

SvAVIM

At6MSAS

BnPKS

Pp6MSAS

ApPKSL1

AnWA

GfPKS4

GmfUM1

ChPKS1

COOH

CH3

OH

1 KS,AT,DH,KR, ACP

COOH

CH3

OH

OH

2KS,AT,DH, ACP

4

OHOHO O OOH O OHO O O OOH

CH3CH3

O

CH3OH

OH OH

NH2CH3O

O

OHOOC

HOOC

HOOC

HOOC

5 KS, AT,DH,(MT), ER, KR, ACP

CH3

OCH3

OH

OH

O

COOH

3

6

O

OH OH O

OH CH3

OH

7

OCH3O O

O

OO

OCH3O O

O

OO

8

KS, AT, ACP, TE

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

GmFUM1

ChPKS1

AtLNKS

SvAVIM

GfPKS4

AnWA

ApPKSL1

BnPKS

At6MSASPp6MSAS

0.10.1

AtLNKS

SvAVIM

At6MSAS

BnPKS

Pp6MSAS

ApPKSL1

AnWA

GfPKS4

GmfUM1

ChPKS1

COOH

CH3

OH

1 KS,AT,DH,KR, ACP

COOH

CH3

OH

OH

COOH

CH3

OH

OH

2KS,AT,DH, ACP

4

OHOHO O OOH O OHO O O OOH

CH3CH3

O

CH3OH

OH OH

NH2CH3O

O

OHOOC

HOOC

HOOC

HOOC

5 KS, AT,DH,(MT), ER, KR, ACP

CH3

OCH3

OH

OH

O

COOH

3

6

O

OH OH O

OH CH3

OH

7

OCH3O O

O

OO

OCH3O O

O

OO

8

KS, AT, ACP, TE

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

O

OH O

OH

O

O

CH3O OCH3

CH3

GmFUM1

ChPKS1

AtLNKS

SvAVIM

GfPKS4

AnWA

ApPKSL1

BnPKS

At6MSASPp6MSAS

0.1

A

B

Acylβ-ketosynthase Acyl transferase Acyl carrier protein

124

Partie III

Absence d’implication de l’acide 6-methylsalicylique synthase dans la synthese de l’acide mycophénolique

125

INTRODUCTION

La mise en évidence d’acide mycophénolique dans le surnageant de toutes les souches testées

de Byssochlamys nivea signifie que cette espèce synthétise un autre composé de nature

polycétide en plus de la patuline. En effet la voie de biosynthèse de ce composé est élucidée

depuis une vingtaine d’année (Figure 15). L’acide mycophénolique est un métabolite

secondaire de nature hybride composé d’un noyau aromatique d’origine polycétide et un

groupe aliphatique de nature terpénique. L’élucidation de la voie de biosynthèse de l’acide

mycophénolique a été appréhendée avec les méthodologies d’usage, appliquées dans le cadre

de l’étude du métabolisme secondaire, méthodologies fondées principalement sur le suivi de

précurseurs potentiels radiomarqués. Grâce à ces techniques, plusieurs composés ont

fermement été identifiés comme des précurseurs directs de l’acide mycophénolique. Le noyau

aromatique dérive vraisemblablement d’un premier précurseur, l’acide 5-methylorsellinique

(l’acide 2,4-dihydro -5,6-dimethylbenzoique). La forte incorporation d’ [1’ 14 C] acide 5-

methylorsellinique et de [7- 14 C] 5,7-dihydroxy-4-methylphthalide (Canonica et al, 1970) ne

laisse aucune équivoque sur leur implication directe dans la voie de biosynthèse de l’acide

mycophénolique. Par contre la très faible incorporation d’acide orsellinique et de 5,7

dihydroxyphthalide radiomarqués suggère que la méthylation du noyau benzénique survient

très tôt. Ces deux précurseurs avérés ont été détectés et identifiés aussi bien dans les

surnageants des cultures de Byssochlamys nivea que dans les cultures de Penicillium

brevicompactum. De même le très faible rendement d’incorporation du 7-hydroxy-5 methoxy-

4-methylphthalide plaide pour une méthylation du groupe hydroxy en position 5 comme

dernière étape. Vraisemblablement une farnesyl pyrophosphate transferase intervient après la

synthèse du noyau phthalide pour conduire au 6-farnesyl-5,7 dihydroxy-4-methylphthalide.

Les étapes suivantes sont beaucoup plus controversées. Deux mécanismes semblent intervenir

parallèlement dans la transformation du 6-farnesyl-5,7 dihydroxy-4-methylphthalide en acide

126

mycophénolique. Premièrement, ce nouveau composé serait oxydé en hydroxy cétone au

niveau de la double liaison centrale. L’ajout de ce dernier composé marqué au 13C, dans une

culture de P. brevicompactum, mène spécifiquement à la formation d’acide mycophénolique

avec un taux de conversion de 45% (Colombo et al, 1978). Deuxièmement soit par un

grignotage de l’extrémité du groupe farnesyl en deux étapes.

La découverte inopinée d’une autre tetrakétide remet en question le rôle supposé du gène

Bnpks précédemment isolé chez Byssochlamys nivea. En effet, ce gène est exprimé lors de la

synthèse de patuline et de l’acide mycophénolique. Les précurseurs directs respectifs de la

patuline et de l’acide 6-mycophénolique, l’acide 6-methylsalicylique et l’acide 5-

methylorsellinique sont structuralement très proches, puisque l’acide 5-methylorsellinique

possède un groupement méthyl et un groupement hydroxyl supplémentaire sur le noyau

aromatique. Il n’est donc pas exclu que ce gène soit impliqué dans la synthèse des deux

toxines. Les premières étapes de biosynthèse de l’acide mycophénolique seraient alors : Acide

6-methylsalicylique Acide orsellinique (hydroxy supplémentaire) Acide 5-

methylorsellinique (un methyl et un hydroxy). Cette hypothèse irait à l’encontre des résultats

obtenus par Bedford et al (1971) montrant que l’incorporation dans des cultures de P.

brevicompactum ne conduisait pas à la synthèse d’acide mycophénolique radiomarqué. Quant

à l’acide 6-methylsalicylique, une étude similaire n’a jamais été rapportée.

Afin de connaître l’implication de ce gène dans la production de l’une ou l’autre toxine, nous

avons recherché un gène homologue au gène Bnpks chez une autre espèce réputée productrice

d’acide mycophénolique qui ne synthétise pas la patuline, Penicillium brevicompactum

Dierckx.

127

Figure 15 : voies de biosynthèse de l’acide mycophénolique.

1. SOUCHE UTILISEE ET CONDITIONS DE CULTURE

Préalablement à tout travail, la souche utilisée NCPT 10 a été caractérisée par amplification et

séquençage des ITS afin de vérifier son appartenance à l’espèce Penicillium brevicompactum.

Sa séquence déposée dans GenBank (N° d’accession AF 521657) présente 100%

d’homologies avec les séquences d’ITS d’autres souches de Penicillium brevicompactum.

Après 7 jours de pré-cultures à 25°C sur milieux gélosés P.D.A, les spores ont été récoltées et

la suspension de spores a servi à l’inoculation de 3 fioles de Roux par point d’analyse,

contenant 100 ml de milieux Czapeck-glucose précédemment décrits. Ces cultures ont été

incubées à 25°C dans l’obscurité, sans agitation pendant 20 jours. Chaque jour, 3 fioles de

Roux ont été analysées et ce pendant 20 jours. Les surnageants ont été prélevés après filtration

O H

C H 3

C H 3

OH

C O O H

Acide 5 methylorsellinique

OH

OHCH3

O

O

5.7 dihydro 4 methylphtalide

Acétate

OH

OHCH3

O

O

CH3

CH3

CH3CH3

6 farnesyl 5.7 dihydro 4 methylphtalide

OH

CH3

O

O

CH3

HOOC

OH

Acide normethylmycophenolique

OH

CH3

O

O

CH3

HOOC

MeO

Acide mycophénolique

OH

OHCH3

O

O

CH3CH3

OH

O

OH

OHCH3

O

O

CH3

CH3

CH3CH3

OHO

128

et les mycéliums de 2 fioles ont été récoltés afin de déterminer le poids sec de la biomasse.

Les ARN totaux ont été extraits du mycélium issu de la troisième culture.

2. DETERMINATION DES POIDS SECS

Après filtration, les mycéliums lavés et égouttés ont été placés dans des vases à tare

préalablement tarés. Les cellules ont ensuite été séchées toute une nuit à une température de

70°C, puis refroidies à température ambiante avant la pesée.

3. EXTRACTION DES ACIDES NUCLEIQUES

Les procédures d’extraction d’ADN génomique, des ARN totaux et messagers ainsi que

l’obtention des ADN complémentaires ont été décrites dans la rubrique « Matériels et

méthodes généraux ».

4. ANALYSE DES METABOLITES SECONDAIRES ET DOSAGES DE

L’ACIDE MYCOPHENOLIQUE

L’analyse des mycotoxines a été réalisée par chromatographie liquide haute performance avec

détection spectrophotométrie grâce à un détecteur à barrettes de diodes. L’identité des

composés a été vérifiée par chromatographie-spectromètrie de masse. Les protocoles

d’extraction, de détection et d’identification des métabolites secondaires et du dosage d’acide

mycophénolique ont été décrits précédemment.

5. RESULATS ET DISCUSSION

Cinq métabolites connus issus des surnageant de culture ont été détectés et identifiés par

HPLC, quand Penicillium brevicompactum est cultivé dans les conditions propices à la

synthèse de patuline. Ces conditions ont été préalablement éprouvées pour différentes espèces

129

productrices de patuline, comme Penicillium griseofulvum, Penicillium expansum,

Byssochlamys nivea, Aspergillus clavatus. Les cinq métabolites identifiés sont : l’acide

mycophénolique, ses deux précurseurs directs l’acide 5-methylorsellinique, le 5,7 dihydroxy

4-methylphthalide, l’acide orsellinique et la brevianamide A, autres métabolites secondaires

réputés comme produits par Penicillium brevicompactum ( figure 16). Ce dernier métabolite a

été identifié par son spectre UV et son temps de rétention identique à celui d’un standard

authentique fourni par le Professeur R.M Williams de l’Université de l’Etat du Colorado. Ce

métabolite n’est pas de nature polycétide mais peptidique puisqu’il requiert pour sa synthèse

la condensation d’une molécule de tryptophane et d’une proline pour former un premier

précurseur stable, la brévianamide F, excluant catégoriquement une origine commune avec les

trois autres composés identifiés dans les surnageants de culture.

Plus surprenante est la présence d’acide orsellinique (figure 17). L’identité de ce composé a

été vérifiée de la même manière que la brévianamide A en comparant le temps de rétention, le

spectre UV ainsi que le spectre de masse à ceux d’un standard authentique. Aucune mention

d’une quelconque production d’acide orsellinique par Penicillium brevicompactum n’existe

dans la littérature. Aucun métabolite ayant comme précurseur avéré, l’acide orsellinique n’a

été également identifié chez Penicillium brevicompactum. La mise en évidence de ce

tétrakétide dans les surnageants de P. brevicompactum tend à renforcer l’hypothèse d’une

éventuelle implication d’une acide 6-méthylsalicylique synthase dans la synthèse de l’acide

mycophénolique.

Enfin, 3 composés très polaires ont été détectés en LC-MS, ayant respectivement des m/z de

209, 222 et 225. Bien que nous n’ayons pas pu vérifier leurs identités par manque de standard,

ces composés semblent être les phenols de Raistrick, respectivement l’acide 2,4 dihydroxy-6-

(2-oxopropyl) benzoique, l’acide 2,4 dihydroxy-6-(1-hydroxy-2oxopropyl) benzoique et

130

Figure 16 Chromatogramme d’un extrait chloroformique d’un surnageant de culture de Penicillium Brevicompactum lors du 4ième jour de la cinétique de production. Sont détectés l’acide mycophénolique ainsi que deux de ses précurseurs directs : l’acide 5 méthylorsellinique et le 5-7 dihydroxy 4 methylphtalide. 3 Un autre métabolite de P. brevicompactum a été identifié comme étant la brevianamide A.

Acide Mycophenolique

1

1

2

2

3

3

5-7 Dihydroxy 4-methylphtalide1

2 Acide 5 methyl orsellinique

OH

CH3

O

O

CH3

HOOC

MeO

OHCOOH

CH3

CH3

OH

OH

OHCH3

O

O

Acide Mycophenolique

1

1

2

2

3

3

5-7 Dihydroxy 4-methylphtalide1

2 Acide 5 methyl orsellinique

OH

CH3

O

O

CH3

HOOC

MeO

OHCOOH

CH3

CH3

OH

OH

OHCH3

O

O

131

Figure 17 : LC-MS d’un extrait d’un surnageant de culture de Penicillium brevicompactum NCPT 10, 2 jours à 25°C sans agitation. A : Absorbance totale. B Acide 5-methylorsellinique (m/z 181), C Acide orsellinique (m/z 167), D 5,7 dihydroxy-4-methylphthalide (m/z 179) l’acide 2,4 dihydroxy-6-(1,2 dioxopropyl) benzoique, composés connus pour être produit par

Penicillium brevicompactum

Les premiers précurseurs stables de l’acide mycophénolique ont été détectés du 2ieme jour

jusqu’au 5ième jour contrairement aux cultures de Byssochlamys nivea où ces deux composés

étaient présents tard dans la cinétique. Des traces d’acide mycophénolique ont été décelées

dès le premier jour, puis sa concentration a augmenté progressivement pour atteindre son

maximum au 11ième jour (figure 18). A partir du 11ième jour, l’acide mycophénolique voit sa

concentration diminuer graduellement. Comme la plus part des métabolites secondaires,

l’acide mycophénolique est produit en fin de phase exponentielle de croissance, bien qu’un

niveau basal soit présent dès les premiers jours de culture. Ceci contraste fortement avec

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26Time (min)

0

200000

400000

600000

uAU

5,36 9,243,26 5,72 12,5711,498,674,302,00 15,20

9,797,01 13,411,4618,1716,51

NL:6,37E5Total Scan PDA AFj3Pbrev

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26Time (min)

0

50

100

Rela

tive

Abun

danc

e 11,7011,55 11,77

11,80

11,937,177,105,88 11,527,21 12,11 14,972,43 15,80 17,53 19,30 21,24 24,41 25,54

NL:6,32E6m/z= 180,50-181,50 F: MS AFj3Pbrev

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26Time (min)

0500000

1000000

15000002000000

Inte

nsity

10,039,96

2,6610,129,84

2,73 10,22 13,143,49 5,71 7,75 15,112,63 16,14 18,24 19,49 21,27 22,64 25,51

NL:2,27E6m/z= 167,00-167,50 F: MS AFj3Pbrev

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26Time (min)

0

50

100

Rela

tive

Abun

danc

e 9,549,51 9,57

9,339,606,30 9,306,27 15,259,80

8,91 10,35 11,67 12,492,99 6,423,32 16,56 17,53 18,84 21,01 25,5722,872,31

NL:2,02E6m/z= 179,00-179,50 F: MS AFj3Pbrev

COOH

CH3

OH

OH

OH

CH3

CH3

OH

COOH

OH

OHCH3

O

O

A

B

C

D

132

Byssochlamy nivea qui, dans les même conditions, produit l’acide mycophénolique durant

toute sa croissance.

En adéquation avec ce qui est rapporté par la littérature, et contrairement à Byssochlamys

nivea, aucune trace de patuline n’a été décelée dans les surnageants durant toute la cinétique

de production de l’acide mycophénolique. Plus significatif, aucune trace d’acide 6-

methylsalicylique n’a été détectée.

Figure18 : Cinétique de production d’acide mycophénolique par Penicillium brevicompactum. Figurée en bleu la quantité exprimée en mg d’acide mycophénolique dans 100 ml de surnageant, en rouge le poids sec de mycélium par fiole de roux.

5.1 Isolement d’un fragment de gène homologue de Bnpks de

Byssochlamys.nivea, chez Penicillium brevicompactum

Afin de vérifier la présence d’un gène homologue au gène Bnpks précédemment isolé chez

Byssochlamys nivea, nous avons opté comme stratégie, d’amplifier et de séquencer deux

fragments situés aux extrémités du gène. Ces deux fragments correspondent à deux domaines

catalytiques indispensables au bon fonctionnement de l’enzyme, kétosynthase et acyl carrier

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 Jours

Poid

s sec

du

myc

eliu

m (

en g

)

Qua

ntité

d’a

cide

myc

ophe

noliq

ue

(en

mg)

dan

s 100

ml d

e su

rnag

eant

2,0

1,6

1,2

0,8

0,4

0

133

protéine, situés respectivement sur les extrémités 5’ et 3’. Deux amorces nucléotidiques

sélectionnées PAT 1 (5’ GTA GTG GGA ATG GCC TGC CG 3’) et PAT 6 (5’ GGT GAC

CAA TAT TGG GCT TGA TGG 3’) de la séquence du gène de la 6MSAS de Penicillium

griseofulvum ont été utilisées afin d’amplifier le fragment codant le domaine de la

kétosynthase (KS). La PCR a été réalisée à partir d’ADN génomique. Un fragment d’une

taille de 971 paires de bases a été amplifié à partir d’ADN génomique extrait d’une culture de

P.brevicompactum.

La séquence nucléotidique présentait 82 % d’homologie avec la séquence du gène codant

pour la 6-MSAS de Penicillium griseofulvum.

Après traduction, une séquence non interrompue de 323 résidus d’acides aminés a été obtenue

Suite à une recherche d’homologie cette séquence protéique présente une très forte

homologie, 81% d’identité et 89% de similarité avec la séquence protéique codée par la

Bnpks, 81% d’identité et 89% de similarité avec MSAS d’A. terreus, 80%d’identité et 87% de

similarité avec la MSAS de P. griseofulvum.

Concernant l’autre extrémité du gène, codant pour l’acyl carrier protéine, un couple

d’amorces dégénérées en 5’ (PKS-5’ (5’ GTI CTI GCI CCR AAG ATI GCI GG 3’)), et

spécifique en 3’ (PAT 4 (5’ GTG AAC AAA CGT GTT CAG TTT GAT TTG CGG 3’),

100% complémentaire de la séquence de P. griseofulvum, a été utilisée afin d’amplifier

initialement un fragment d’environ 1000 paires de bases. L’intensité de la bande obtenue

étant très faible, une deuxième étape de PCR nichée (nested PCR) a été requise à l’aide des

amorces PKS 5’ et PKS 3’1 (5’ACI GTC ATG ACI GAG TCI ACI CC 3’) afin d’obtenir un

fragment exploitable pour le séquençage. Le fragment d’ADN amplifié précédemment avec le

couple d’amorces dit externes (Pks5’/Pat4) sert de matrice pour cette PCR. Par cet artifice,

une partie du domaine ACP comprenant 578 paires de bases a été isolée, clonée et séquencée.

134

La séquence de 578 acides nucléiques présente une homologie de 87% avec la séquence du

gène codant pour la 6MSAS de Penicillium griseofulvum. Après traduction, la séquence

obtenue (197 acides aminés), présente 86% d’identité et 93% de similariré avec P.

grisefulvum, 72% d‘identité et 84% de similarité avec B. nivea, 59% d’identité et 74% de

similarité avec A. terreus.

Afin d’appréhender plus précisément la relation de parenté entre le gène Bnpks et les deux

extrémités ainsi isolées chez Penicillium brevicompactum, une analyse phylogénique a été

entreprise. Après traduction, les séquences protéiques ont chacune été alignées à celle de

bnpks ainsi qu’à des séquences d’acide 6-methylsalicylique synthases avérées (6MSAS de

Penicillium griseofulvum, ATX d’Aspergillus terreus, 6MSAS de Glarea lozoyensis) et des

protéines très homologues dites « 6MSAS like » dont la fonction réelle demeure inconnue, à

l’aide du logiciel Clustal-X. Pour l’extrémité 5’, quelques séquences non déposées dans

GenBank, isolées d’espèces de Penicillium producteur ou non producteur de patuline et

d’acide mycophénolique ont été rajoutées. C’est le cas des séquences de Penicillium paneum

(producteur de patuline), Penicillium carneum (patuline et acide mycophenolique),

Penicillium roqueforti (acide mycophénolique) et Penicillium aurentiogriseum (aucun des

deux). A ces séquences a été rajoutée la séquence la plus homologue à la séquence de la

6MSAS de P. griseofulvum et à BNPKS, présente dans le génome d’Aspergillus clavatus, une

des rares espèces d’Aspergillus productrices de patuline. Si on considère les deux extrémités,

quelque soit la méthode utilisée pour l’élaboration de l’arbre (méthode basée sur le calcul de

distances Neighbor-Joining, Minimum evolution, UPGMA) ou sur des méthodes basées sur

les caractères (Maximum Parcimony)), les séquences isolées des espèces productrices de

patuline et d’acide mycophénolique sont toutes regroupées dans un clade commun (figure 19).

Dans ce groupe figure les séquences des deux fragments isolés chez Penicillium

135

brevicompactum. Ce clade est lui-même, une composante d’un clade plus important

regroupant les acide 6-methylsalicylique synthases d’Aspergillus terreus et de Glarea

lozoyensis.

Figure 19 : A Arbre construit par la méthode UPGMA à partir des séquences du domaine de de la kétosynthase de : Pc.pks (Penicilium carneum), Pr.pks (P.roqueforti), Pp.pks (P.

Pc.pks

Pr.pks

Pp.pks

Pe.pks

Pf.pks

P.aurentiogriseum

Pg.6MSAS P22367

Pb.pks

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Aor.pks BAE65442

AP.PKSL2 AAC23536

P.nordicum

PG.pks2 AAB49684

Ao.pks AAS98200

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Col5 AAM70355

ChlB1 AAZ77673

AviM AAK83194

62

90

92

68

100

69

97

70

59

79

81

80

56

54

54

43

99

99

99

0,05

OO

O OH

H COOH

CH3

OH

6MSA

Patuline6 MSA

6MSAAcide orsellinique

Acide orsellinique

CAA65133

n.Pks AAP33839

a.pks

Séquences d’ascomycetes

Séquences d’actinomycetes

**

*

*

A Pc.pks

Pr.pks

Pp.pks

Pe.pks

Pf.pks

P.aurentiogriseum

Pg.6MSAS P22367

Pb.pks

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Aor.pks BAE65442

AP.PKSL2 AAC23536

P.nordicum

PG.pks2 AAB49684

Ao.pks AAS98200

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Col5 AAM70355

ChlB1 AAZ77673

AviM AAK83194

62

90

92

68

100

69

97

70

59

79

81

80

56

54

54

43

99

99

99

0,05

OO

O OH

H COOH

CH3

OH

6MSA

Patuline6 MSA

6MSAAcide orsellinique

Acide orsellinique

CAA65133

n.Pks AAP33839

a.pks

Séquences d’ascomycetes

Séquences d’actinomycetes

**

*

*

Pc.pks

Pr.pks

Pp.pks

Pe.pks

Pf.pks

P.aurentiogriseum

Pg.6MSAS P22367

Pb.pks

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Aor.pks BAE65442

AP.PKSL2 AAC23536

P.nordicum

PG.pks2 AAB49684

Ao.pks AAS98200

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Col5 AAM70355

ChlB1 AAZ77673

AviM AAK83194

62

90

92

68

100

69

97

70

59

79

81

80

56

54

54

43

99

99

99

0,05

OO

O OH

H COOH

CH3

OH

6MSA

Patuline6 MSA

6MSAAcide orsellinique

Acide orsellinique

CAA65133

n.Pks AAP33839

a.pks

Séquences d’ascomycetes

Séquences d’actinomycetes

Pc.pks

Pr.pks

Pp.pks

Pe.pks

Pf.pks

P.aurentiogriseum

Pg.6MSAS P22367

Pb.pks

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Aor.pks BAE65442

AP.PKSL2 AAC23536

P.nordicum

PG.pks2 AAB49684

Ao.pks AAS98200

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Col5 AAM70355

ChlB1 AAZ77673

AviM AAK83194

62

90

92

68

100

69

97

70

59

79

81

80

56

54

54

43

99

99

99

0,05

OO

O OH

H COOH

CH3

OH

6MSA

Patuline6 MSA

6MSAAcide orsellinique

Acide orsellinique

CAA65133

n.Pks AAP33839

a.pks

Séquences d’ascomycetes

Séquences d’actinomycetes

**

*

*

A

OO

O OH

H COOH

CH3

OH

P.brevicompactum

PG.MSAS P22367

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Ap.PKSL2 AAC23536

Aor.pks BAE65442

Phn.pks EAT91972

AO.pks AAS98200

PG.pks2 AAB49684

CHLB1 AAZ77673

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Cal05 AAM70355

AviM AAK83194

100

98

69

99

95

71

30

46

85

99

99

38

34

0,5

COOH

CH3

OH

OH

Acide orsellinique

6MSA

6MSA

6MSA

*

*

g.

O

g.

BO

O

O OH

H COOH

CH3

OH

P.brevicompactum

PG.MSAS P22367

A.clavatus Genome

Bnpks AAK48943

At.6MSAS BAA20102

Gl.6MSAS AAX35547

Ap.PKSL2 AAC23536

Aor.pks BAE65442

Phn.pks EAT91972

AO.pks AAS98200

PG.pks2 AAB49684

CHLB1 AAZ77673

Ch.pks25 AAR90279

Sc.PKS AAM77986

Cal05 AAM70355

AviM AAK83194

100

98

69

99

95

71

30

46

85

99

99

38

34

0,5

COOH

CH3

OH

OH

Acide orsellinique

6MSA

6MSA

6MSA

*

*

g.

O

g.

B

136

paneum), Pe.pks (P. expansum), Pf.pks (P. freii (Nicolaisen et al, 1997)), Pa.pks (P. aurentiogriseum), Pg.6MSAS (P. griseofulvum (Beck et al, 1990)), Pb.pks (P. brevicompactum (séquence obtenue dans ce présent travail)), A. clavatus (séquençage génome), Bn.pks, (Byssochlamys nivea), At.6MSAS ( Aspergillus terreus ( Fujii et al, 1996)), Gl.6MSAS (Glarea lozoyensis (Lu et al, 2005)), Aor.pks (A. oryzae, Machida et al, 2005)), Ap.PKSL2 (Aspergillus parasiticus (Feng et Leonard, 1995)), Pn.pks (Penicillium nordicum, (Karolewiez et Geisen, 2005)), Pg.pks2 (Penicillium griseofulvum, non publiée)), Ao.pks (Aspergillus ochraceus, (Dao et al, non publiée)), Ch.pks25 (Cochliobolus heterostrophus, Kroken et al, 2003)), Sc.pks (Streptomyces carzinostaticus, (Liu et al, 2005)), CalO5 (Micromonospora echinospora spp. Calichensis, (Ahlert et al, 2002)), ChlB1 (Streptomyces antibioticus,( Jia et al, 2006)), AviM (Streptomyces viridochromogenes, Gaisser et al, 1997) Phn.pks ( Phaeosphaeria nodorum, non publiée) B. Arbre construit par la méthode UPGMA à partir des séquences du site de l’acyl carrier proteine de : Pg.6MSAS (P. griseofulvum), Pb.pks (P. brevicompactum (séquence obtenue dans ce présent travail)), A. clavatus (séquençage génome), Bn.pks, (Byssochlamys nivea), At.6MSAS ( Aspergillus terreus), Gl.6MSAS (Glarea lozoyensis), Aor.pks (A. oryzae), Ap.PKSL2 (Aspergillus parasiticus), Pg.pks2 (Penicillium griseofulvum), Ao.pks (Aspergillus ochraceus), Ch.pks25 (Cochliobolus heterostrophus), Sc.pks (Streptomyces carzinostaticus), CalO5 (Micromonospora echinospora spp. Calichensis), ChlB1 (Streptomyces antibioticus), AviM (Streptomyces viridochromogenes, Gaisser et al, 1997) Phn.pks ( Phaeosphaeria nodorum, non publiée) En souligné en bleu, les espèces productrices de patuline. L’astérisque rouge signale les espèces productrices d’acide mycophénolique. Fléche en pointillé, 6MSAS suspectée.

En ce qui concerne l’extrémité 3’, les fortes valeurs de bootstrap pour les différentes branches

de ce clade, plaide en faveur d’une parenté effective. Ceci est le cas aussi mais dans une

moindre mesure (valeur de boostrap plus faible) pour l’extrémité 5’. Cette proche parenté est

renforcée par l’analyse des introns des différents gènes. En effet si on considère seulement les

séquences entières et si on analyse en détail la position des introns, nous remarquons que les

gènes 6msas de Penicillium griseofulvum, Bnpks, le gène pks de Penicillium freii et le gène

d’Aspergillus clavatus présentent un seul intron à la même position 88 en partant du codon

« start ». Le gène atx d’Aspergillus terreus codant lui aussi pour une 6MSAS, possède

également un seul intron, mais la séquence codante en amont de cet intron est plus longue

puisqu’elle code pour 41 acides aminés contre 29 pour les trois autres gènes. Quand au gène

de G. lozoyensis, il possède 3 introns, un localisé à 18 paires de bases du codon start, un

137

second qui s’aligne parfaitement avec celui des gènes précédents et un troisième distant d’une

centaine de bases.

Puisqu’il a été détecté un autre tetrakétide tel que l’acide orsellinique dans les surnageants de

culture de P. brevicompactum, deux séquences de gène codant pour des acides orsellinique

synthases ont été rajoutées. A ce jour aucun gène codant pour une telle enzyme n’a été isolé

d’une quelconque espèce de champignon. Les deux séquences rajoutées sont donc issues de

deux espèces d’actinomycetes, Streptomyces viridochromogenes et Micromonospora

echinospora. Il a été ajouté également le seul gène codant pour une 6MSAS isolé d’un

actinomycète.

5.2 Absence d’implication du gene Pp.pks durant la production d’acide

mycophénolique

Des préparations d’ADNc ont été réalisées en utilisant des ARNm extraits du second au 11ème

jour de culture sur milieu Czapek glucose, durant la production permanente d’acide

mycophénolique. Les couples d’amorces Pat1/Pat6 et Pks5’/Pks3’-1 ont été utilisées pour

étudier l’expression du gène codant pour ces domaines. Des PCR ont été effectuées avec ces

amorces sur cette matrice d’ADNc. L’amplification du gène qui code pour la β- tubuline a été

réalisée en parallèle avec les amorces Tub F et Tub R, celle-ci sert de témoin interne sur la

qualité et la quantité d’ADNc amplifié figure 20).

Il en résulte que les deux domaines KS et APC ne sont pas exprimés malgré leur présence

dans le gènome de Penicillium brevicompactum. L’absence d’expression de ces deux

domaines durant la synthèse d’acide 5-methylorsellinique, de 5,7 dihydroxy-4-

methylphthalide, d’acide mycophénolique indique que ce gène fortement homologue au gène

bnpks n’est pas impliqué dans la synthèse de l’acide mycophénolique.

138

Figure 20 : Résultat de la PCR avec les amorces Pat1/Pat6 sur le ADNc (du 2ième au 11ième jours) de P. brevicompactum .témoin positif l’ADNg de P. brevicompactum

Les données obtenues de l’analyse phylogénique montre que toutes les séquences issues

d’espèces productrices de patuline sont situés dans le même clade. Une donnée fondamentale

réside dans la présence, dans ce groupe, d’une séquence d’Aspergillus clavatus ( espèce

productrice de patuline), montrant la plus forte homologie avec la 6MSAS de Penicillium

griseofulvum. Cette séquence forme un groupe avec la séquence Bnpks confirmant que celui-

ci code bien pour l’acide 6-methylsalicylique synthase impliquée dans la synthèse de la

patuline. Puisque le gène de Penicillium brevicompactum est fortement homologue aux trois

autres et qu’il n’est pas exprimé lors de la production d’acide mycophénolique, par extension

le gène Bnpks lui aussi n’intervient pas dans la synthèse de ce métabolite secondaire.

Pourtant dans ce groupe, plusieurs séquences proviennent d’espèces ne synthétisant pas la

patuline. C’est le cas de Penicillium roqueforti, Penicillium freii, Penicillium aurentiogriseum

2 3 4 6 7 8 9 10 11 T+ T-2 3 4 6 7 8 9 10 11 T+ T-

Jours

139

et Penicillium brevicompactum. Si on analyse finement la seule séquence déposée dans

GenBank, celle de la polyketide synthase de Penicillium freii (Nicolaisen et al, 1997), on

s’aperçoit que la séquence codante est réduite à sa portion congrue, dû à la présence d’un

codon stop (TAG) prématuré. Le polypeptide résultant n’est constitué que d’un seul site

catalytique, le domaine de la ketosynthase. Les auteurs, malgré une tentative d’invalidation du

gène, n’ont observé aucun changement phénotypique (morphologique, métabolique) et donc

déterminé sa fonction physiologique. Par contre ils ont constaté que ce gène était transcrit en

ARNs messagers. Contrairement aux bactéries, les champignons ne possèdent pas de

polycétide synthase de type II modulaire. En effet, malgré le séquençage complet des

génomes de plus d’une dizaine d’espèces de champignons, aucune polycétide synthase de ce

type n’a été isolée. Puisque la présence des 3 domaines, kétosynthase (KS), acetyl transférase

(AT) et acyl carrier protein (ACP) sur le polypeptide est le minimum requis pour qu’une

polycétide synthase soit fonctionnelle, il est donc légitime de penser que dans ce cas précis,

nous sommes en présence d’un pseudogène de l’acide 6-methylsalicylique synthase impliquée

dans la synthèse de la patuline.

Les quatre espèces de Penicillium citées ci-dessus font toutes partie de la sous espèce

Penicillium, sous-espèce recensant 14 espèces réellement productrices de patuline. La

physionomie de l’arbre construit à partir des séquences du domaine de la ketosynthase

indique que Penicillium carneum, P. roqueforti et P. paneum sont fortement liés comme le

sont Penicillium freii et Penicillium aurentiogriseum entre elles. Ces liens sont aussi observés,

si on dresse des arbres phylogéniques basés sur les séquences d’ITS (Peterson, 2000, Skouboe

et al, 1999), de la beta-tubuline (Samson et al, 2004) ou de la calmoduline (Wang et Zhuang,

2006). Ces similitudes dans la physionomie des arbres impliquent que ce gène pourrait être

transmis verticalement (de radiation en radiation). Ceci est corroboré par une étude très

140

récente qui exclut tout transfert latéral du gène idh impliqué dans la synthèse de la patuline,

dans la sous-espèce Penicillium (Dombrink-Kurtzman, 2006).

Nous pouvons donc raisonnablement penser que les 3 séquences restantes sont aussi des

pseudogènes. Il a été montré par le présent travail que le gène de Penicillium brevicompactum

n’était pas exprimé quand cette espèce croît dans des conditions favorables à la synthèse de la

patuline, expliquant l’absence d’acide 6-methylsalicylique et de patuline. Par contre aucune

donnée sur une éventuelle expression des gènes de P. roqueforti et de P. aurentiogriseum

n’est actuellement disponible. Cependant la mise en évidence du gène idh chez ces 3 espèces,

bien que celles-ci ne produisent pas la patuline mérite d’être soulignée (Peterson et al, 2003,

Peterson et al, 2004). Ces données complémentaires tendent à renforcer l’idée que la totalité

du cluster regroupant les gènes impliqués dans la synthèse de la patuline est présente dans le

génome d’une grande majorité d’espèces de Penicillium sous espèce Penicillium et que le

transfert au cours de l’évolution se déroule de manière verticale et non horizontalement. Ceci

expliquerait pourquoi un grand nombre d’espèce de cette sous-espèce mais pas toutes

produisent de la patuline.

141

Partie IV

Isolement de trois gènes orthologues codants pour un ABC transporteur chez Byssochlamys nivea, Penicillium expansum

et Penicillium griseofulvum

142

INTRODUCTION

Il y a encore une décennie, il ne venait pas à l’esprit, à quiconque voulait appréhender l’étude

de voies de biosynthèse d’une toxine, que le transport de celle-ci puisse être un phénomène

étroitement lié à sa synthèse. La présence de toxine hors de la cellule implique de facto un

phénomène passif ou actif de transport. Pendant de nombreuses années, pour les molécules à

caractère hydrophobe comme la majorité des mycotoxines, il était convenu que l’efflux passif

suffisait à lui seul, à expliquer le passage des molécules à travers la bicouche lipidique de la

membrane cytoplasmique. Depuis le début de la dernière décennie, la découverte chez les

champignons de transporteurs actifs de type ATP Binding Cassette (ATP) transporteur ou

Major Facilitator Superfamilly (MFS) transporteur s’accumulent, la découverte pionnière

chez Saccharomyces cerevisiae, de la protéine STE6 homologue de la P-Glycoprotéine

Multidrug Resistance (MDR) ayant initié la série (Endicott et Ling, 1989). Le rythme soutenu

des découvertes a tendance aujourd’hui à s’accélérer avec les nombreux projets de

séquençage de génomes fongiques. Mais bien que le nombre de transporteurs découverts chez

les champignons ne cesse de se multiplier, la fonction de seulement un petit nombre d’entre

eux, a, à ce jour, été identifiée. La majorité de ces protéines contribuerait à la défense du

champignons vis-à-vis des molécules exogènes (xénobiotiques) susceptibles de pénétrer à

l’intérieur du champignon, en assurant leurs prises en charge et leurs excrétions hors de la

cellules. Ces transporteurs de manière générale ne présentent pas une spécificité exclusive

envers leur substrat conduisant à une relative polyvalence dans leur fonction excrétoire. Parmi

la minorité restante, la découverte de gène codant pour un transporteur MFS ou ABC à

l’intérieur de cluster de gènes impliqués dans la synthèse de mycotoxines telles que les

trichothécènes ou les fumonisines, a quelques peu modifié la perception que l’on avait de ce

type de pompe à efflux, notamment sur leurs fonctions et leurs spécificités. La présence de

tels gènes dans un « cluster » de voie de biosynthèse ne semble pas aberrante. Généralement

143

une toxine produite par un champignon est souvent toxique pour lui-même. Il a été montré

que certains transporteurs de la famille des ABC transporteurs ou de la famille des MFS

(Major Facilitator Superfamily) font partie de l’arsenal de résistance, développé par les

champignons pour ne pas subir eux-mêmes les effets délétères des toxines qu’ils synthétisent.

Les exemples les plus parlant sont les produits des gènes tri12 (MSF) (Alexander et al, 1999)

et Fum19 (ABC) (Proctor et al, 2003) présents au sein des clusters impliqués respectivement

dans les biosynthèses des trichothécènes et des fumonisines.

L’analyse approfondie de la séquence déposée dans GenBank par M. Gaucher (AF006680),

du gène idh codant pour l’isoépoxydon déshydrogénase chez Penicillium griseofulvum, nous

a conduit à la mise en évidence, en amont du gène idh, sur le brin complémentaire, du début

d’un gène susceptible de coder pour un ABC transporteur (figure 21).

Après avoir déterminé et enlevé manuellement les introns, nous obtenons une séquence

ininterrompue qui après traduction donne une séquence de 491 acides aminés. Cette

séquence protéique présente 54 % de similarité avec la proteine Brf1+ qui confère la

résistance à la brefeldine A chez Schizosaccharomyces pombe (Nagao et al, 1995), 52% de

similarité avec la protéine PMR1 de Penicillium digitatum (Nakaune et al, 1998), et 51% de

similarité avec la protéine atrF d’Aspergillus fumigatus (Slaven et al, 2002).

Nous décrivons dans cette partie l’obtention du reste de la séquence codante de cet ABC

transporteur de Penicillium griseofulvum. Afin de vérifier si ce gène fait bien partie intégrante

du cluster impliqué dans la synthèse de la patuline, nous décrivons également l’isolement de

gènes fortement homologues chez Byssochlamys nivea et Penicillium expansum. Ces gènes

sont comme celui de Penicillium griseofulvum, localisés en amont du gène idh.

144

1. STRATEGIE D’AMPLIFICATION DU GENE abc CHEZ Penicillium

griseofulvum, P. expansum ET Byssochlamys nivea

La stratégie employée afin d’isoler ces gènes a suivi la même démarche méthodologique

présentée dans la partie « Matériel et Méthodes généraux » et précédemment utilisée lors de

l’isolement des gènes 6msas et idh de B. nivea.

Pour choisir les oligonucléotides susceptibles d’être employés pour l’isolement de la fin du

gène chez P. griseofulvum et l’amplification du gène homologue chez les 2 autres espèces,

Figure 21: Extrait de la Séquence soumise à GENBANK par l’équipe de M. Gaucher (GenBank n°AF006680) en rouge l’ORF (open reading frame) du gene codant pour l’isoepoxydon deshydrogenase, en Bleu l’ORF d’un gene codant pour un ABC-Transporteur. Sont encadrés les codons start, soulignée la TATAA box. Soulignés en pointillés, figurent les introns.

Gene Idh Ge

ne a

bc (

ABC

tra

nspo

rteu

r)

145

nous avons en premier lieu inventorié les domaines protéiques susceptibles d’être conservé

chez les ABC transporteurs. Pour cela nous avons tout d’abord, réalisé un alignement du

début de l’ABC transporteurs avec les ABC transporteurs identifiés comme les plus

homologues. Au début de nos travaux, hormis les 3 transporteurs cités plus haut, les ABC

transporteurs présentant le plus d’homologie étaient l’ABC transporteur de Gibberella

pulicaris conférant à cette espèce une tolérance vis-à-vis des phytoalexines (rishitine,

lubimine) de la pomme de terre, (Fleissner et al, 2002), BcatrB de Botritys cinerea impliqué

dans la protection vis-à-vis du resveratrol (Schoonbeek et al, 2001), MFABC1 de Monilinia

fructicola (Schnabel et al, 2003) et PDR7 d’Arabidopsis thaliana, essentiellement présent au

niveau des racines de la plante (Van den Brûle et al, 2002). Depuis avec les efforts de

séquençage de génome entier, une multitude de protéines hypothétiques dont les fonctions

n’ont pas été caractérisées présentent à ce jour des scores d’homologie bien supérieurs.

En dépit de la rareté relative de l’époque en séquences homologues, plusieurs amorces ont été

dessinées à l’intérieur des zones très conservées, révélées par l’alignement réalisé à l’aide de

Multalin. Ces amorces sont localisées sur les domaines de fixation et d’hydrolyse des

molécules ATP, domaines indispensables au bon fonctionnement de ce type de pompes à

efflux. Plus précisément, les deux amorces ABC DEG R (5’- GAA IGT IGW RCA NCC

WSW ICC IGG- 3’) et ABC DEG 3R (5’- CKY TCI CCI CCI SWI ACW CCW C-3’) sont

respectivement situés sur le site Walker A et sur un domaine caractéristique des ABC

transporteurs dénommé signature ABC, du 1er domaine de fixation de l’ATP, tandis que les

amorces ABC DEG 1 ( 5’- ARW GTI GTY TTW CCI GCW CCI G- 3’) et ABC DEG 2 (5’

TCI ARA CCR GAI GTI GGY TCR TC – 3’) s’hybrident sur les séquences codant pour le

site Walker A et le site Walker B du deuxième domaine de fixation de l’ATP (figure 22).

Le processus aboutissant à l’acquisition du reste de la séquence du gène abc de Penicillium

griseofulvum, à la localisation des introns et à la détermination de l’intégralité de l’ARN

146

Figure 22: Alignement des séquences protéiques de différents ABC transporteurs présentant une forte homologie avec le début de l’ABC transporteur de Penicillium griseofulvum (Pg.ABC). Les autres séquences sont BRF1+ de Schizosaccharomyces pombe (Sc.Brf1+) , PMR1 de Penicillium digitatum, (Pd.PMR1), ABC de Gibberella pulicaris (Gp.abc), AtrF d’Aspergillus fumigatus, (Af.AtrF), MFABC1 de Monilinia fructicola, (Mf.abc1)

At

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AtABC DEG 3R

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AtrB

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AtrBABC DEG R

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AtABC DEG 3R

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AtrBABC DEG R

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At

147

Figure 22 suite : BcatrB de Botrytis cinerea (Bc.atrB), PDR7 d’Arabidopsis thaliana (At.PDR7). Localisation des oligonucléotides dégénérés utilisés lors de l’acquisition du reste de la séquence du gène de Penicillium griseofulvum et l’isolement des gènes homologues chez Penicillium expansum et Byssochlamys nivea

ABC DEG 1

ABC DEG 2

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ABC DEG 1

ABC DEG 2

ABC DEG 1

ABC DEG 2

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AtAt

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At

At

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At

At

At

At

148

messager s’est déroulé en 4 étapes successives comme l’illustre la figure 23 A. Tout d’abord,

à l’aide de l’oligonucléotide spécifique ABC 8 (5’ - GTT CTA CTC CGT CCT AGT GCC

CGC CCT GC - 3’) issu de la séquence (N° AF006680) déterminée par Fedeshko et Gaucher

(Fedeshko, 1992) et de l’amorce dégénérée ABC DEG 1, un premier fragment a été amplifié

à partir d’ADN génomique.

Après clonage et séquençage de ce fragment, l’amorce ABC PAT 3’1 (5’- GGA CTC AGA

CAA GAG CCG CAA TCT TGC ATG G -3’) complémentaire de son extrémité 3’ a été

dessinée et synthétisée pour permettre l’amplification du reste de la séquence codante ainsi

que l’extrémité 3’ non traduite ( 3’UTR), par RACE-PCR, à partir d’ADN complémentaire.

Sitôt la séquence déterminée, la même portion de gène a été isolée à l’aide des

oligonucléotides ABCGeno3'2 (5’- CCC CCG AAA CAA AAT TTT CTG TAG CCC AGG

GC- 3’) et ABCGeno3'1 ( 5’- CCC TTT GAC TAT CTA ACG AGA AAA CCA CCC- 3’) et

séquencée à partir d’ADN génomique afin de localiser les introns potentiels. Parallèlement, le

recours à la Race-PCR a été indispensable pour identifier le point d’initialisation de la

transcription (début de l’ARN messager). Nous avons utilisés respectivement l’amorce

spécifique ABC 7 (5’ - CTG AGA ATC CGCTGA GAA TGG – 3’) et l’oligonucléotide 5’

Gene Racer primer comme amorce antisens et amorce sens-codant.

La stratégie pour l’obtention des séquences de Byssochlamys nivea et de Penicillium

expansum est sensiblement la même à un détail prêt, l’absence de début du gène disponible.

Puisque nous ne disposions d’aucun début, l’option « Marche sur le Chromosome » a partir

du gène idh susceptible d’être adjacent s’est avérée la plus judicieuse (figure 23 B et C).

L’amorce IDH Fin 2 ( 5’- CCT CTC CCA TAC CCC GTG TAC CTC CTA GTT-3’) a été

dessinée à partir de la séquence du gène idh de P. expansum déterminé par White et al, 2006.

Les séquences des autres amorces sont présentées dans le tableau 5

149

Figure 23 Stratégie d’isolement du gène abc chez A : P.griseofulvum ; B :B.nivea C : P.expansum

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. griseofulvum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

5’

ABC 74

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

ABC8 ABC DEG11

2ABC PAT 3’1

ATG TAG

3’AAAAAA

3ABC PAT 3’1

abc

Encadrée, séquence initialement disponible dans GenBankN° AF006680

4763 pb

ADN génomique

ARN messager

ABC Geno 3’1

Stratégie d’isolement du gène abc chez Penicillium griseofulvum

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. griseofulvum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. griseofulvum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

5’

ABC 744

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

ABC8 ABC DEG11ABC8 ABC DEG111

2ABC PAT 3’1

22ABC PAT 3’1

ATGATG TAGTAG

3’AAAAAA

33ABC PAT 3’1

abc

Encadrée, séquence initialement disponible dans GenBankN° AF006680

4763 pb

ADN génomique

ARN messager

ABC Geno 3’1

Stratégie d’isolement du gène abc chez Penicillium griseofulvum

IDH fin 2 ABC DEG 3R1

Exp ABC 2 ABC DEG2

2

4Pexp Ext 3’2

3PE ABC 2 Cla ABC 3’2

ADN génomique

ARN messager

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. expansum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATG TAG

3’AAAAAAabc

4701 pb

Stratégie d’isolement du gène abc chez Penicillium expansum

IDH fin 2 ABC DEG 3R11

Exp ABC 2 ABC DEG2

22

4Pexp Ext 3’2

44Pexp Ext 3’2

3PE ABC 2 Cla ABC 3’2

33PE ABC 2 Cla ABC 3’2

ADN génomique

ARN messager

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. expansum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de P. expansum

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATG TAG

3’AAAAAAabc

4701 pb

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATGATG TAGTAG

3’AAAAAAabc

4701 pb

Stratégie d’isolement du gène abc chez Penicillium expansum

BYSSO ABC 5’25

Bysso ABC 1F ABC DEG2

2

3Bysso ABC Fin1 Cla ABC 3’1

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATG TAG

3’AAAAAAabc

4803 pb

4ABC Bysso Ext 1

IDH BYSSO 5’2 ABC DEG R1

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de B. nivea

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

ADN génomique

ARN messager

Stratégie d’isolement du gène abc chez Byssochlamys nivea

BYSSO ABC 5’255

Bysso ABC 1F ABC DEG2

22

3Bysso ABC Fin1 Cla ABC 3’1

33Bysso ABC Fin1 Cla ABC 3’1

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATG TAG

3’AAAAAAabc

4803 pb

idh654321

IntronIntron IntronIntronIntronIntron

abc

5’

ATGATG TAGTAG

3’AAAAAAabc

4803 pb

4ABC Bysso Ext 1

44ABC Bysso Ext 1

IDH BYSSO 5’2 ABC DEG R11

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de B. nivea

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

Amorces dégénérées

Amorces spécifique de la séquence de B. nivea

GeneRacer 5’primer

GeneRacer 3’’primer

ADN génomique

ARN messager

Stratégie d’isolement du gène abc chez Byssochlamys nivea

150

Amorces Séquences des amorces 5’ > 3’ IDH BYSSO 5’2 CGG GCT CTG TTG CCT TCA GG BYSSO ABC 5’2 CCT CAG GAT CGG TCG AGA TGG C BYSSO ABC 1F CAG GGA GAA ATG CTT CTC GTA ATC GG BYSSO ABC Fin 1 TGG GCG TGT CGG GCG CTG GAA AGA CCA CGC ABC BYSSO Ext 1 CAG GGT ATT TGT TCA ACC CAG AGA GCA CAG

ATT CC

Exp ABC 2 ATA TCA GCA GTG GGA AGT GGA ACA GGA GTA A

PE ABC 2 ATA TTG CCG ACG CCC TAG TTG GTG TCC

Pexp Ext 3’2 CAC CGC AAT ATT GGC GTT TTC ATC GGG

Cla ABC 3’1 ACC ATG GTG AAG TTG AAT GCR ATR AAC CC

Cla ABC 3’2 GGG CAA ATC CTG CAA CAC GTC CAC

Tableau 5 Les deux dernières amorces du tableau ont été sélectionnées en alignant la séquence nucléique

du gène ABC de P. griseofulvum et la séquence homologue issue de la base de donnée du

génome d’A. clavatus. L’utilisation de ces deux amorces a permis d’avancer suffisamment

sur le gène pour envisager une amplification efficace par Race-PCR de la fin de la séquence

codante et l’extrémité 3’ non codante, pour les gènes de B. nivea et de P. expansum.

Préalableement à l’obtention de la fin de la séquence du gène de l’ABC transporteur de

Penicillium griseofulvum, l’expression de ce gène a été vérifiée par RT-PCR durant la

production de patuline par P. griseofulvum, à l’aide des amorces suivantes ABC 2 (5'GGG

CCG TAG TAG ATC TGG CGA CC 3') et ABC 3 (5'CTT TCC GAC ATT GAC CGT CGC

GG 3') situées de part et d’autres du 3ième intron potentiel.

151

2. RESULTATS

Le gène adjacent au gène idh chez Penicillium griseofulvum est exprimé durant la synthèse

de la patuline puisqu’un transcrit est détecté du 3 au 6ieme jours d’une culture de P.

griseofulvum. L’analyse du profil en métabolites secondaires des surnageants correspondants

montre que la patuline est produite par le champignon simultanément de l’expression de ce

gène.

L’amplification conjointe d’ADN génomique et d’ADN complémentaire nous a permis de

déterminer la séquence nucléotidique de ce gène dans son intégralité. Le premier codon

d’initiation de traduction possible (ATG) de la séquence codante est situé à 53 acides

nucléiques de la première base de l’ARN messager. Il est suivi par un segment de nucléotides

formant un « cadre de lecture ouverte » de 4182 pb. Cette région peut coder pour 1393 acides

aminés. Le domaine codant de termine par un codon « stop » (TGA) qui suit immédiatement

le codon CAG codant pour une glutamine. Cette région codante est suivie par une séquence

non traduite du coté 3’ se terminant par une série de résidus adénine. Le segment poly A est

immédiatement précédé du signal de polyadénylation TATAAA courant chez les

champignons. La comparaison des séquences issues d’ADN génomique avec celles obtenues

à partir d’ADN complémentaire a permis de localiser 6 introns.

L’examen de la séquence protéique prédite de la séquence nucléique a fait apparaître plusieurs

éléments structuraux caractéristiques. En effet, l’analyse d’hydrophobicité (algorithme de

Kyte et Doolittle) a identifié une série de domaines extrêmement hydrophobes. Cette analyse

a pu en repérer 12, pouvant être regroupés en 6 paires distinctes (figure 24.) Par une vue

d’ensemble du profil d’hydrophobicité (figure 25), nous pouvons observer que cette protéine

est constituée de deux parties similaires. Une analyse d’homologie a confirmé que cette

protéine est constituée de deux moitiés homologues reliées par un segment de liaison.

152

Figure 24 A Chromatogramme d’un extrait chloroformique d’un surnageant de culture de Penicillium urticae lors du 5 ième jour de culture. Sont détectés la patuline ainsi que son premier précurseur stable, l’acide 6-methylsalicylique. B. Etude de l’expression du gene abc de Penicillium griseofulvum par RT-PCR, piste 1, M: marqueur de taille 1 kb ladder (invitrogen), piste 2, 3 ieme jour, piste 3, 4ièmejour, piste 4, 5ième jour, piste 5, 6ième jour, piste 6, Témoin positif, ADN génomique de P. griseofulvum.

Ces deux sous unités peuvent être divisées comme suit : une longue région hydrophile dans

l’extrémité NH2 suivie par une longue région hydrophobe coté extrémité COOH.

Comme le laissait supposer la forte homologie du début de la protéine avec des ABC

transporteurs, la recherche de domaines conservés révèle que le produit du gène abc possède

deux domaines de fixation de l’ATP situés chacun dans une des régions hydrophiles.

1

2

Patuline

2 Acide 6-methylsalicylique

1

OO

O OH

HCOOH

CH3

OH

M 3 4 5 6 M

A

B

1

22

Patuline

2 Acide 6-methylsalicylique

1

OO

O OH

HCOOH

CH3

OH

Patuline

2 Acide 6-methylsalicylique

1

OO

O OH

HCOOH

CH3

OH

M 3 4 5 6 M

A

B

T+

153

Figure 25 : profil d’hydrophobicité de la protéine de P. griseofulvum

En effet les domaines ABC hautement conservés contiennent 2 motifs Walker A et Walker B

ayant la caractéristique de lier les nucléotides, notamment l’ATP. Ces motifs sont séparés

d’environ 120 acides aminés et entre ces deux motifs, il existe une séquence spécifique des

ABC transporteurs qualifiée de signature ABC. Ces éléments ont tous trois été détectés dans

chaque sous unité. La séquence du premier motif Walker A (GKPGSGCT) ne correspond pas

totalement à la séquence consensus (G-(X)4-GK[T/S]) décrite par Walker (Walker et al,

1992), par contre le second motif (GVSGAGKT) est parfaitement conservé. Cette homologie

imparfaite au niveau du premier motif Walker A semble un trait commun des ABC

transporteurs d’origine fongique puisque toutes les séquences d’ABC transporteurs fongiques

154

ayant servi pour la sélection des amorces dégénérées possèdent une séquence consensus (G-

(X)4-GC[T/S]) où la lysine (K) est remplacé par une cystéine (C). Concernant le motif

Walker B et la signature ABC, les séquences sont beaucoup moins conservées par rapport aux

séquences consensus indiquées par Walker. Ceci constitue également une autre caractéristique

des ABC transporteurs fongiques. Pourtant le consensus 4 résidus hydrophobes suivis d’un

acide aspartique du site Walker B est conservé, aussi bien pour l’extrémité NH2 que pour

l’extrémité C-terminale. Enfin, le motif de la 1ere signarure ABC présente la séquence

concsensus typique décrite par Bairoch (Bairoch, 1992),

[LIVMFY]S[SG]GXXX[RKA][CIVMYA]X[LIVFM][AG]. Par contre le motif de la

signature ABC de l’extrémité C-terminale semble particulièrement dégénéré par rapport à la

séquence consensus.

La recherche d’homologie au niveau de la protéine entière montre une forte homologie

relative avec BRF1+ (36% d’identité, 56% de similarité) ainsi qu’avec de nombreux autres

ABC transporteurs fongiques. Plus généralement, cette protéine fait partie d’une famille

d’ATP transporteurs nommée PDR (Pleiotropic drug resistance) présents chez les

champignons, les plantes et les eucaryotes inférieurs. Il existe, en effet, plusieurs familles

d’ABC transporteurs en fonction de l’organisation des sites de fixation de l’ATP (ABC) vis à

vis des domaines transmembranaires (TMS). Bien qu’un grand nombre d’ABC transporteur

consiste seulement d’un seul tandem dans la configuration (ABC-TMS) ou dans la

configuration inverse, des protéines plus volumineuse existent, constituées de deux sous

unités (TMS-ABC)2 ou (ABC-TMS)2. Ces protéines sont regroupées en 4 sous-familles

majeures, les MDR (Multidrug Resistance), MRP ( MDR-associated protein), ABCA et PDR

(Pleitropoic drug resistance). Cette dernière famille est caractérisée par une configuration

(ABC-TMS)2 avec la région hydrophile contenant les sites de fixation de l’ATP proche de

l’extrémité NH2. Ceci est la configuration inverse observée dans les autres sous-familles

155

d’ABC transporteurs. Ce type de transporteurs présentant la topologie (ABC-TMS)2 est

totalement absent des mammifères.

Un gène homologue du gène abc de P. griseofulvum (PgABC) a été isolé chez les deux autres

espèces productrices de patuline. L’option méthodologique de la « marche sur le

chromosome » a permis de démontrer que la topologie du « cluster » est identique chez les

trois espèces. Le gène abc est bien situé en amont du gène idh sur le brin complémentaire.

Entre les espèces, seul change le nombre de base entre les codons « start » de deux gènes

puisque les longueurs respectives de cette région inter-génique sont de 440 pb chez P.

griseofulvum , 458 pb chez P. expansum et 525 pb chez B. nivea. De même la taille des

séquences codantes est différente selon l’espèce considérée. La protéine BnABC de B. nivea

est ainsi légèrement plus grande de 12 acides aminés par rapport à l’ABC transporteur de

P.griseofulvum. Quant à l’ABC transporteur de P. expansum (PeABC), il présente un acide

aminé supplémentaire par rapport à son homologue de P. griseofulvum. Après alignement des

séquences protéiques, nous pouvons observer que ces différences sont généralement localisées

dans les régions variables situées à l’extrémité NH2-terminale et dans la région reliant les

deux sous unités évoquées précédemment (figure 26).

Les gènes Bnabc et Peabc possèdent tout comme Pgabc, 6 introns situés également dans la

première moitié du gène à l’exception du 6ieme localisé à environ 250 pb du codon stop, la

position des jonctions intron/exon étant identiques à celle du gène Pgabc.

Les trois séquences protéiques ont été alignées avec la séquence d’Aspergillus clavatus

déduite des données disponibles du génome d’A. clavatus. Entre ces 4 séquences, les motifs

caractéristiques du domaine de fixation de l’ATP sont très conservées. Quelques anomalies

sont à remarquer sans pour autant que cela déroge au consensus décrit par Walter et Bairoch. :

une isoleucine remplace la leucine (L) dans le premier site Walker A chez B. nivea et A.

156

clavatus, une alanine à la place de la valine dans la signature ABC du premier domaine chez

B. nivea, une asparagine à la place de l’histidine toujours chez B.nivea. Plus surprenant est le

remplacement de l’arginine par la lysine chez les séquences issues des espèces de Penicillium.

Bienque celui-ci obeit toujours au consensus, il est extrêmement rare de retrouver cet acide

aminé à cette position pour les ABC de type PDR, puisque la recherche de domaine indique

un seul ABC transporteur, un transporteur de Dictyostelium discoideum

3. DISCUSSION

Aujourd’hui peu d’exemple de transporteurs actifs, qu’ils soient du type ATP Binding

Cassette (ABC) ou Major Facilitator Superfamilly (MFS), impliqués dans l’efflux de

métabolites secondaires endogènes sont décrit chez les plantes ou les champignons. Pourtant

le grand nombre de gènes codant pour des ABC transporteurs présent chez les plantes ainsi

que chez les champignons, l’implication d’ABC transporteurs dans l’efflux de produits

d’origine fongique et végétale chez les mammifères mènent à l’hypothèse que les

transporteurs fongiques ou végétaux contribuent largement aux transports membranaires des

métabolites secondaires endogènes. Chez les plantes, plusieurs ABC transporteurs participant

activement aux transports d’alcaloïdes endogènes ont été découverts. C’est le cas de CjMDR1

qui transporte la berberine à l’intérieur de la cellule, exemple unique à ce jour d’un ABC

transporteur responsable de l’entrée d’une molécule dans une cellule et non de l’efflux vers le

milieu extracellulaire, phénomène habituellement démontré (Shitan et al, 2003). De même la

possible excrétion du sclaréol, composé diterpénique par NpABC1, ABC transporteur de type

PDR de Nicotania plumbaginifolia, a été prouvée à l’aide d’inhibiteurs, (Jacinski et al, 2001).

Il a été démontré récemment que les anthocyanines précurseurs des pigments floraux, étaient

également pris en charge par des ABC transporteurs de type MRP du maïs (Goodman et al,

2004). Enfin comme autre exemple de composé végétal pris en charge par des ABC

157

Figure 26: A. Alignement des séquences protéiques des ABC transporteurs isolés de P. griseofulvum (Pg.ABC), P. expansum (Pe.ABC), Byssochlamys nivea (Bn.ABC) et du transporteur d’Aspergillus clavatus (Ac.ABC). La dernière séquence a été déterminée après avoir recherchépar Blast une séquence homologue à la séquence de l’ABC transporteur de P. griseofulvum dans la base de donnée du génome d’Aspergillus clavatus (AAKD03000002) . A près alignement de la séquence nucléique et recherche manuelle des introns, la séquence codante obtenue a été traduite.Encadrés en bleu les sites de fixation de l’ATP ainsi que la signature ABC, en rouge, les domaines transmembranaires.B. Représentation tridimensionnelle de l’ABC transporteur dans la membrane plasmique. La protéine est formée de 2 moitiés symétriques incluant six segments transmembranaires (TM) (cylindres numérotées de 1 à 12) et de deux sites de fixations à l’ATP.

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

TM 1 TM 2

TM 3 TM 4 TM 5

TM 6

TM 7 TM 8 TM 9

TM 10 TM 11

TM 12

A

NH2

Cytosol

Milieu extérieur

BFigure 26: A. Alignement des séquences protéiques des ABC transporteurs isolés de P. griseofulvum (Pg.ABC), P. expansum (Pe.ABC), Byssochlamys nivea (Bn.ABC) et du transporteur d’Aspergillus clavatus (Ac.ABC). La dernière séquence a été déterminée après avoir recherchépar Blast une séquence homologue à la séquence de l’ABC transporteur de P. griseofulvum dans la base de donnée du génome d’Aspergillus clavatus (AAKD03000002) . A près alignement de la séquence nucléique et recherche manuelle des introns, la séquence codante obtenue a été traduite.Encadrés en bleu les sites de fixation de l’ATP ainsi que la signature ABC, en rouge, les domaines transmembranaires.B. Représentation tridimensionnelle de l’ABC transporteur dans la membrane plasmique. La protéine est formée de 2 moitiés symétriques incluant six segments transmembranaires (TM) (cylindres numérotées de 1 à 12) et de deux sites de fixations à l’ATP.

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

TM 1 TM 2

TM 3 TM 4 TM 5

TM 6

TM 7 TM 8 TM 9

TM 10 TM 11

TM 12

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

Site Walker A

ABC Signature Site Walker B

TM 1 TM 2

TM 3 TM 4 TM 5

TM 6

TM 7 TM 8 TM 9

TM 10 TM 11

TM 12

A

NH2

Cytosol

Milieu extérieur

NH2NH2

Cytosol

Milieu extérieur

B

158

transporteurs à une seule sous unité (ABC-TMS), AtWBC12 chez Arabidopsis thaliana

(Pighin et al, 2004).

Le nombre d’exemple de prise en charge de métabolites endogènes par des transporteurs

actifs semble encore plus limité chez les champignons. Contrairement aux plantes, peu

d’études relatives à l’implication directe d’un transporteur spécifique dans le passage d’une

toxine à travers la membrane et la paroi fongique, ont été publiées. En effet la majorité des

ABC transporteurs caractérisés à ce jour participent au phénomène de résistance envers les

antifongiques, en assurant l’évacuation hors de la cellule de ces agents fongicides. C’est le cas

des différents ABC transporteurs, nous ayant servi pour la sélection des oligonucléotides. On

recense donc seulement qu’un nombre restreint d’exemples de transporteurs potentiellement

impliqués dans l’excrétion de toxines. Contrairement aux plantes où aucun gène codant pour

un ABC transporteurs n’a, à ce jour, été localisé près des gènes impliqués dans la synthèse de

leurs substrats, les transporteurs fongiques ont leurs gènes situés au cœur même

des « clusters » de gènes liés à la synthèse des toxines transportées. Deux de ces transporteurs,

TRI12 et GliA appartiennent à la famille des MFS transporteurs. Isolés respectivement de

Fusarium sporotrichoides et d’Aspergillus fumigatus, le premier transporte les trichothécénes

(Alexander et al, 1999) tandis que le second, suspecté d’assurer le transport de la gliotoxine

hors des cellules d’Aspergillus fumigatus, confère une tolérance accrue à la gliotoxine quand

des mutant SirA de Leptosphaeria maculans sont complémentés (Gardiner et al, 2005).

L’invalidation du gène tri12 provoque une diminution de la production de trichothécènes. Les

gènes de deux autres MFS ont été retrouvés à l’intérieur de clusters liés à la synthèse de

toxine. Il s’agit du gène ToxA indispensable pour l’efflux de la toxine HC chez Cochliobolus

carbonum.Ce gène est présent en deux copies dans le génome des souches productrices de C.

carbonum. Les tentatives de disruption des deux copies du gène ont toutes échouées,

suggérant un rôle protecteur indispensable vis-à-vis de la toxine produite (Pitkin et al, 1996).

159

Par contre AFLT dont le gène est localisé au cœur de cluster de biosynthèse des aflatoxines,

ne semble pas indispensable, puisque l’invalidation n’induit pas une diminution de production

d’aflatoxines chez Aspergillus parasiticus (Chang P-K. et al, 2004). De même, les facteurs de

régulation AFLR et AFLJ activant les différents gènes codant pour les enzymes participant à

la synthèse des aflatoxines, ne régulent pas l’expression de ce gène.

Actuellement les programmes de séquençage de génomes entiers révèlent que la présence de

gène d’ABC transporteurs dans des clusters liés à la synthèse de métabolites secondaires

constitue un phénomène beaucoup plus fréquent que ne laissent supposer les rares mentions

publiées. A titre d’exemple on comptabilise 7 gènes d’ABC transporteur sur les 26 clusters

suspectés être impliqués dans le métabolisme secondaire. Les transporteurs MSF sont en

revanche, beaucoup plus nombreux puisque 29 gènes de MFS transporteur sont recensés pour

l’ensemble de ces clusters (Nierman et al, 2005).

A ce jour, le gène d’ABC transporteur isolé dans les clusters de la patuline de P.

griseofulvum, P. expansum; B. nivea, A. clavatus est le troisième gène d’ABC transporteur

potentiellement impliqué dans l’efflux d’un métabolite secondaire d’origine fongique.

L’existence d’une autre « phase ouverte de lecture » en amont du gène idh sur le brin

complémentaire avait été pressentie par Fedeshko, (Fedeshko, 1992) mais face à la relative

pauvreté de la banque Genbank en séquences d’ABC transporteur, il n’avait pu en déterminer

l’identité. Très récemment un fragment du gène Peabc (715pb) a été isolé et les auteurs ont

montré à l’aide de la technique Suppression Substrative Hybridation (SSH)-PCR que ce gène

était exprimé lors de la production de patuline par P. expansum (White et al, 2006).

Le deux autres ABC transporteurs liés à une voie de biosynthèse, SirA et FUM19

respectivement isolé de Leptosphaeria maculans et de Fusarium verticilloides sont impliqués,

l’un dans l’efflux de la sirodesmine et l’autre dans celui des fumonisines.

160

La grande différence structurale entre ces 3 ABC transporteurs réside dans leurs

appartenances à différentes sous-familles. Tandis que SirA est de topologie (TMS-ABC)2 type

MDR, FUM19 présente une topologie type MDR avec 5 domaines transmembranaires

supplémentaires. PgABC et les différents gènes orthologues appartiennent à la famille PDR.

Comme pour AFLT et TRI12, l’invalidation des deux gènes indique clairement que SirA et

FUM19 contribuent clairement à une autoprotection des champignons producteurs vis-à-vis

de leurs toxines, mais que ces deux protéines ne sont nullement essentielles pour la

production des toxines. Ceci suggère l’existence d’un phénomène de compensation ou du

moins de redondance dans les mécanismes de sécrétion des toxines.

161

Discussion

Confrontation des séquences obtenues chez Byssochlamys nivea avec la base de donnée du génome d'Aspergillus

clavatus

162

1 CARACTERISATION DU CLUSTER

Après traduction des 3 gènes isolés chez Byssoclamys nivea, les séquences protéiques qui en

découlent ont été confrontées à la base de donnée contenant le génome complet d'Aspergillus

clavatus récemment disponible.

Trois gènes orthologues ont été détectés sur un fragment contigu de 17,2 kb. Le

positionnement du gène abc vis à vis du gène idh est identique pour les 4 espèces considérées

(P. griseofulvum, P. expansum, B. nivea et A. clavatus). Le gène 6MSAS situé en aval du

gène abc est distant d'environ 10 Kb. La présence de ces 3 gènes dans un fragment de 20 kb

environ, signifie que, les gènes impliqués sont organisés sous forme d'un cluster de gènes,

comme pour la quasi-totalité des voies de biosynthèse identifiées à ce jour chez les

champignons.

Une recherche de séquences codantes a été entreprise à l'intérieur d'un fragment de 70 Kb

environ contenant les 3 gènes identifiés lors de ce travail, afin d’identifier de nouveaux gènes

potentiellement impliqués dans la synthèse de la patuline. A l'intérieur de ce fragment ont été

recensés 20 « phases ouvertes de lecture » présentées dans le tableau 6.

Pour tout gène potentiel, les séquences protéiques obtenues après traduction, ont toutes été

comparées aux séquences déposées dans GenBank afin d'identifier le type de protéines codées

par ces gènes.

Un gène codant pour un facteur de régulation de type Zn(II)2cys6 à doigt de zinc, a été

identifié dans le fragment de 10 kb séparant les gènes 6msas et abc. La protéine AFLR du

cluster des aflatoxines chez Aspergillus parasiticus et Aspergillus flavus figure comme

l'exemple le plus connu, dans le domaine des mycotoxines, de ce type de facteur

transcriptionnel (Woloshuk et al 1994). Autre facteur à doigt de zinc, ZFR1 isolé de Fusarium

verticilloides active fortement la synthèse de fumonisine puisqu'une invalidation conduit à

une diminution de 90% de la fumonisine produite (Flaherty et Woloshuk). Contrairement à

163

AFLR, ce gène ne se situe pas à l'intérieur du cluster regroupant l'ensemble des gènes

structuraux impliqués dans la synthèse de la fumonisine. Mais l’implication de ce type de

facteur ne doit pas être réduit au seul métabolisme secondaire puisqu’il existe une pléthore de

processus secondaires orchestrés par cette famille de facteur de régulation. Parmi ces

processus on retrouvera le phénomène PDR (Pleitropic Drug Resistance) puisque les gènes

pdr5, Snq2 et yor1 codant pour des ABC transporteurs sont régulés positivement par deux

facteurs à doigt de zinc (MacPherson et al, 2006). L’éventuelle activation du gène codant pour

un ABC transporteur présent dans le cluster sera discutée ultérieurement.

Les 3 premiers gènes codent pour des protéines qui, par leurs fonctions et en toute logique, ne

semblent pas intervenir dans la synthèse de la patuline. Les gènes 1 et 2 codent pour les sous-

unités α et β d'une acide gras synthase, le gène 3 code pour une amidase. Les deux suivants

codent, l'un pour une protéine n'ayant pas d'homologue dont la fonction est connue à ce jour,

l'autre pour un facteur de régulation. L'implication de ces deux gènes ne peut donc pas être

écartée, même s'il existe déjà, dans le fragment délimité par 6msas et idh, un facteur de

régulation potentiel.

Les 10 gènes suivants, par contre, semblent bien faire partie du cluster de la patuline. Parmi

eux, les trois gènes initialement identifiés, 6msas, idh et abc. D’autres gènes codent pour des

protéines dont l'implication est évidente. Les cytochromes P450 interviendront l'un dans la

methyl hydroxylation du m-crésol, l'autre dans l'hydroxylation du m-hydroxybenzyl alcool en

gentisylalcool, conformément à ce qui avait été observé par Murphy (1974 et 1975).

L’implication de la GMC (Glucose-methanol-choline) oxydoréductase semble aussi

164

Gènes Famille de protéines Homologie Protéines présentant les plus fortes homologie identité/ Similarité

1 Acide gras synthase sous unité β 55% / 71% Protéine AN7880 A. nidulans2 Acide gras synthase sous unité α 47% / 62% Protéine AN7883 A. nidulans3 Amidase 69% / 80% Protéine EAL87139 A.fumigatus4 Protéine hypothétique 71% / 83% Protéine EAL87135 A. fumigatus5 Homeobox C2H2 transcription factor 65% / 78 % Protéine EAL87134 A. fumigatus6 Alcool Isoamyl oxidase 47% / 68% Protéine EAL87830 A. fumigatus7 Isoepoxydon deshydrogénase 94% / 96% IDH B. nivea8 ABC Transporteur 48 % / 66% Protéine BAE61142 A. oryzae9 C6-facteur 33 % / 51% Protéine EAQ93296 C. globosum

36 % / 53% Protéine EAU32822 A. terreus10 6MSAS 77% / 88% 6MSAS P. griseofulvum

63% / 75% 6MSAS EAU32819 A. terreus 11 Protéine hypothétique 67% / 81% Protéine EAU32820 A. terreus12 Cytochrome P450 62% / 75% Protéine EAU32821 A. terreus13 Cytochrome P450 57% / 71% Protéine EAU32821 A. terreus14 Amidase decarboylase 47% / 63% Protéine BAE62161 A. oryzae15 GMC oxydoreductase 58% / 73% Protéine EAQ93295 C. globosum

42% / 59% Versicolorine B Synthase VBS. A. parasiticus16 Alcool déshydrogénase 76% / 88% Protéine EAU36458 A. terreus17 MFS transporter 45% / 65% Protéine EAQ93297 C. globosum18 Carboxyl estérase 40% / 55 % Protéine BAE59437 A. oryzae19 Hypothetical proteine 86% / 96 % Protéine EAL87231 A. fumigatus20 NAD+ Kinase 86% / 96 % Protéine EAL87233 A. fumigatus

Tableau 6 : liste des « phases ouvertes de lectures » identifiées dans le fragment de 70kb contenant les gènes orthologues de 6msas, abc et idh

165

convaincante en raison de son homologie avec la versicolorine B synthase (VBS)

d’Aspergillus parasiticus (Silva et al, 1996). Cette enzyme indispensable dans la synthèse des

aflatoxines, catalyse la fermeture du 5ième cycle des aflatoxines par déshydratation du

versiconal hemiacétal, conduisant à la versicolorine B (figure 27). Par analogie la GMC

oxydoréductase identifiée chez A. clavatus participerait à la dernière étape, la cyclisation de

l’ascladiol en patuline.

Figure 27: Cyclisation du versiconal hémiacétal en versicolorine B

L’implication de l’alcool déshydrogénase codée par le gène 16 semble beaucoup plus

incertaine. La seule implication possible semblerait être la réduction de l’aldéhyde du

gentisaldéhyde dans les étapes non caractérisées à ce jour, étapes aboutissant à l’isoépoxydon.

Le gène 14 présente une faible homologie avec l’acide 2,6 dihydroxybenzoique décarboxylase

d’Agrobacterium tumefaciens (BAD61045) ( Ishii et al, 2004). La similitude entre l’acide 2,6

dihydroxybenzoique et l’acide 6-methylsalicylique est suffisamment frappante pour envisager

une éventuelle participation de cette enzyme dans la décarboxylation de l’acide 6-

methylsalicylique en m-crésol. Enfin l’implication de l’alcool isoamyl oxidase codée par le

gène 6 pourrait intervenir dans l’oxydation du gentisyl alcool en gentisaldehyde. L’mplication

de l’ensembles des gènes est illustré par la figure 28.

Par contre l’action de la carboxy estérase ainsi que celle de la protéine hypothétique codée par

le gène 11 demeurent mystérieuses. La présence d’un deuxième transporteur, en l’occurrence

O

O

OH

OH

OH

O OH OH

Versiconal hemiacétal

VBS

O

O

OH

OH

OH

O O

Versicolorine B

166

Figure 28 : Localisation des gènes isolés dans le cluster de la patuline, localisation des « phases ouvertes de lecture » potentielles dans le génome d’A. clavatus. Implication éventuelle des protéines codées par ces gènes, dans la voie de biosynthèse de la patuline un transporteur MFS, dans le cluster potentiel constitue une anomalie à éclaircir. Il est bien

évident qu’à ce jour les bornes du cluster ne sont que la résultante d’une hypothèse. Il est

donc impératif dans le futur de vérifier l’expression de tous ces gènes potentiels durant la

production de patuline, voire de vérifier la présence de tels gènes chez d’autres organismes

producteurs de la toxine. S’il s’avérait que les deux transporteurs soient liés à la synthèse de la

patuline, les deux premières questions à se poser seraient « A quoi peut bien servir ce

deuxième transporteur ? » mais aussi « Quel est le transporteur qui prend en charge la

patuline hors de la cellule ? »

Voie de biosynthèse de la patuline

abcIdh 6msas

Byssochlamys nivea : 6msas (Genbank AF360398)idh (Genbank AY532266), abc (Genbank EF028634 )

Penicillium urticae: abc (Genbank DQ413178 )Penicillium expansum: abc (Genbank EF051699)

10 kb

Aspergillus clavatus

PhyllostineO

O

H

OH

O

Neopatuline (Z) et (E)-Ascladiol

COOH

CH3

OHAcide 6-methylsalicylique

(6MSA)

CH3

OH

m-CresolOH

OH

m-hydroxybenzyl alcool

OH

OHOH

Gentisyl alcoolOH

OHCHO

Gentisyl aldehydeOH

OCH2OH

H

O

H

H Isoepoxydon

OO

O OH

H

Patuline

Acétate6MSAS

idh

Excrétion

ABC CH2OH

O

O

CH2OH

O

O

OCH2OHH

H

PhyllostineO

O

H

OH

O

Neopatuline (Z) et (E)-Ascladiol

COOH

CH3

OHAcide 6-methylsalicylique

(6MSA)

CH3

OH

m-CresolOH

OH

m-hydroxybenzyl alcool

OH

OHOH

Gentisyl alcoolOH

OHCHO

Gentisyl aldehydeOH

OCH2OH

H

O

H

H Isoepoxydon

OO

O OH

H

Patuline

Acétate6MSAS

idh

Excrétion

ABC CH2OH

O

O

CH2OH

O

O

OCH2OHH

H

Proteine Hypothétique

Isoamyl alcool oxydase

Facteur de régulation

GMC Oxydoreductase.

Cytochrome P450

MFS Transporteur

Carboxyl estérase

Decarboxylase

Alcool déshydrogénase

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Voie de biosynthèse de la patuline

abcIdh 6msasabcIdh 6msas

Byssochlamys nivea : 6msas (Genbank AF360398)idh (Genbank AY532266), abc (Genbank EF028634 )

Penicillium urticae: abc (Genbank DQ413178 )Penicillium expansum: abc (Genbank EF051699)

10 kb

Aspergillus clavatus

PhyllostineO

O

H

OH

O

Neopatuline (Z) et (E)-Ascladiol

COOH

CH3

OHAcide 6-methylsalicylique

(6MSA)

CH3

OH

m-CresolOH

OH

m-hydroxybenzyl alcool

OH

OHOH

Gentisyl alcoolOH

OHCHO

Gentisyl aldehydeOH

OCH2OH

H

O

H

H Isoepoxydon

OO

O OH

H

Patuline

Acétate6MSAS

idh

Excrétion

ABC CH2OH

O

O

CH2OH

O

O

OCH2OHH

H

PhyllostineO

O

H

OH

O

Neopatuline (Z) et (E)-Ascladiol

COOH

CH3

OHAcide 6-methylsalicylique

(6MSA)

CH3

OH

m-CresolOH

OH

m-hydroxybenzyl alcool

OH

OHOH

Gentisyl alcoolOH

OHCHO

Gentisyl aldehydeOH

OCH2OH

H

O

H

H Isoepoxydon

OO

O OH

H

Patuline

Acétate6MSAS

idh

Excrétion

ABC CH2OH

O

O

CH2OH

O

O

OCH2OHH

H

Proteine Hypothétique

Isoamyl alcool oxydase

Facteur de régulation

Proteine Hypothétique

Isoamyl alcool oxydase

Facteur de régulation

GMC Oxydoreductase.

Cytochrome P450

MFS Transporteur

Carboxyl estérase

Decarboxylase

Cytochrome P450

MFS Transporteur

Carboxyl estérase

Decarboxylase

Alcool déshydrogénase

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

167

2. HISTOIRE DU CLUSTER

Outre l’identité de certains gènes, la recherche d’homologie de gènes présents dans le cluster

et potentiellement impliqués dans la synthèse de la patuline chez A. clavatus a apporté des

informations sur l’histoire du cluster. En effet cette recherche a révélé que plusieurs gènes au

cœur du cluster (gènes 9 à 13) , présentaient de fortes homologies avec des gènes

d’Aspergillus terreus qui sont contigus sur le génome d’A. terreus. Parmi les gènes de cette

espèce, figure le gène atx (Fujii et al, 1996). Lors de notre étude de phylogénie, nous avons

montré que le produit de ce gène était proche du clade constitué de la 6MSAS de Penicillium

griseofulvum, de celles de Byssochlamys nivea et d’Aspergillus clavatus, ainsi que de 6MSAS

d’autres espèces de Penicillium productrices de patuline, sans toutefois se placer à l’intérieur

du clade.

De même des similitudes, mais aussi des différences au niveau de l’unique intron, nous

laissent supposer que ce gène est certes proche de Bnpks et 6msas de P. griseofulvum, codant

même pour une acide 6-methylsalicylique synthase (ce qui a été démontré par Fujii) mais ne

participe en aucun cas dans la synthèse de la patuline. A quoi donc peut bien servir cette acide

6-methylsalicylique synthase chez cette espèce ? Chez A. terreus, une autre voie de

biosynthèse nécessite l’action d’une acide 6-methylsalicylique synthase, celle de l’acide

térréique. En effet, des études d’incorporation d’intermédiaires potentiels radiomarqués ont

montré que l’acide 6-methylsalicylique était un intermédiaire de ce composé (Read et al,

1969). Une ébauche de voie métabolique a été dressée par Read et al, afin d’expliquer la

synthèse de l’acide térréique à partir d’acide 6-methylsalicylique. Cette ébauche présentée

dans la figure 29 bénéficie de l’identification d’un autre précurseur, la térrémutine isolée d’un

mutant ne produisant plus d’acide térréique. Par contre l’implication du m-crésol n’est fondée

sur aucune observation directe de ce produit. Il existe entre les deux voies de fortes

similitudes.

168

Figure 29 : Voie de biosynthèse de l’acide térréique proposée par Read et al, 1969

L’acide térréique semble en terme d’étapes enzymatiques, un composé beaucoup mois

complexe que la patuline. L’analyse du fragment d’A. terreus contenant les 4 gènes communs

avec le cluster d’A. clavatus nous indique qu’en plus de ces 4 gènes , il existerait trois gènes

contigus en aval du gène atx codant respectivement pour une GMC oxydoréductase, un

transporteur MFS et une monooxygénase très homologue avec les salicylate hydroxylases

bactériennes. Ces dernières possèdent la faculté de convertir l’acide salicylique en catechol

par une activité d’hydroxylation décarboxylase (Lee et al, 1996)

Si on envisage la voie de biosynthèse de l’acide térréique telle que l’ébauche Read et al, un

gène codant pour une décarboxylase devrait être présent, parmi les gènes communs entre les

deux clusters. Ce qui n’est pas le cas. De même aucune trace d’un gène homologue du gène

14 du cluster d’A. clavatus, suspecté d’intervenir dans la décarboxylation de l’acide 6-

méthylsalicylique en m-crésol, n’a été détecté dans le voisinage de ces 4 gènes. Ceci nous

conduit donc à penser que le m-crésol n’est pas un intermédiaire de l’acide térréique.

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

m-Cresol

TerremutineAcide térréique

OH

OH

CH3

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

Toluquinol

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

m-Cresol

TerremutineAcide térréique

OH

OH

CH3

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

m-Cresol

TerremutineAcide térréique

OH

OH

CH3

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

Toluquinol

169

La présence d’une enzyme similaire aux salicylate hydroxylases nous permet de supposer

qu’une hydroxylation décarboxylative via l’action de cette enzyme surviendrait, à la place

d’une décarboxylation de l’acide 6-méthylsalicylique en m-crésol (figure30)

Figure 30 : Voie de biosynthèse de l’acide térréique réactualisée d’après les données du cluster Localisation des « phases ouvertes de lecture » potentielles dans le génome d’A. terreus. Implication éventuelle des protéines codées par ces gènes, dans la voie de biosynthèse de l’acide térréique

Le cytochrome P450 commun aux deux voies interviendrait ensuite pour hydroxyler le 3-

méthylcatéchol ainsi formé pour donner le 3-hydroxy toluquinol. Dans la voie de la patuline,

l’enzyme homologue convertirait le m-hydroxybenzyl alcool en gentisyl alcool.

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

TerremutineAcide térréique

CH3

OHOH 3-methyl catéchol

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

Aspergillus terreusAtx

AtxSalicylate

hydroxylase

Cytochrome P450

Protéine Hypothétique

GMC oxydoréductase

??

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

TerremutineAcide térréique

CH3

OHOH 3-methyl catéchol

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

Aspergillus terreus

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

TerremutineAcide térréique

CH3

OHOH 3-methyl catéchol

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

OHOH

CH3

OHCH3

OH

O

OH

O

COOH

CH3

OH

O

O

CH3

OOH

Acétate

Acide 6-methylsalicylique(6MSA)

TerremutineAcide térréique

CH3

OHOH 3-methyl catéchol

3-hydroxy toluquinol(versicoline)

Aspergillus terreusAtx

AtxSalicylate

hydroxylase

Cytochrome P450

Protéine Hypothétique

GMC oxydoréductase

??

170

D’après les similitudes des deux voies, et par élimination, le gène 11 coderait enfin pour une

enzyme intervenant dans la conversion du gentisaldehyde en isoepoxydon.

Un point demeure pourtant obscur, si on observe attentivement les deux voies. En effet le

passage de la térrémutine en acide térréique ressemble étonnamment à la conversion de

l’isoépoxydon en phyllostine. Cette étape bien caractérisée par le passé, est catalysée par

l’isoépoxydon déshydrogénase, purifiée par Fedeshko. Ce même auteur a isolé le gène idh de

P. griseofulvum à partir de l’enzyme purifiée ; Pourtant aucun gène homologue n’a à ce jour

été identifié dans le génome d’Aspergillus terreus. Par contre un gène codant pour une GMC

oxydoréductase est présent juste en aval du gène Atx chez A. terreus. Agirait-elle en tant que

terremutine déshydrogènase ? A l’heure actuelle rien ne le laisse présager.

Conscient que le schéma décrit reste à ce jour que du domaine de la supposition, un gros

travail de création de mutants monogéniques devra être entrepris afin de démontrer étapes par

étapes l’identité de ces gènes et par la même occasion valider ces hypothèses.

Outre une forte homologie, trois des 4 gènes communs recensés entre les deux clusters sont

positionnés et orientés de la même manière sur les deux génomes. En amont du gène Atx, sont

localisés en anti-sens, le gène codant pour la protéine hypothétique, le gène codant pour le

cytochrome P450 et enfin le gène codant pour le facteur de régulation à doigt de zinc. Ce

dernier gène est localisé en aval du gène de 6msas chez A. clavatus, contrairement d’A.

terreus. La présence d’un bout de cluster potentiellement impliqué dans la synthèse d’un autre

métabolite secondaire a été suffisamment frappante pour nous inciter à analyser plus en détail

les parties flanquantes de cette partie du cluster. En effet, tout aussi troublants sont les gènes

codant respectivement pour le facteur de régulation C6 à doigt de zinc, le gène codant pour la

GMC oxydoréductase et le transporteur MFS. Ces trois gènes présentent une homologie,

groupés eux aussi dans un cluster.

171

Bien que ces données soient parcellaires, il semblerait que ce cluster de voie de biosynthèse,

soit une sorte de mosaïque, résultant d’incorporations successives de fragments de clusters

impliqués dans la synthèse de métabolites différents ainsi que de gènes isolés. Pour preuve,

les homologies significatives entre gènes contigus d’une espèce à l’autre. Bien qu’il soit trop

tôt pour ébaucher un quelconque historique de ce cluster, nous pouvons toutefois émettre

quelques hypothèses.

Si on analyse les parties flanquantes de part et d’autre du cluster, les gènes présentent de

fortes homologies avec des protéines d’Aspergillus fumigatus Ceci n’a rien d’étonnant

puisque A.clavatus figure parmi les espèces les plus proches d’Aspergillus fumigatus. A ce

jour, cette dernière espèce est l’espèce ayant vu son génome séquencé, la plus proche

d’A.clavatus.

Pour les gènes 19 et 20, les homologies sont extrêmement élevées (respectivement 96 et 94%

de similitude), trahissant la présence certaine de gènes vitaux pour le champignon.

Les protéines homologues chez Aspergillus fumigatus sont toutes localisées sur le

chromosome 2. Leurs n° d’accession (EAL87139 à titre d’exemple) reflètent leurs positions

les unes par rapport aux autres. Il est frappant de remarquer qu’il existe un écart d’environ

100 gènes entre les gènes situés sur la région flanquante amont du cluster (EAL87139-

EAL87134) et les gènes situés sur la région flanquante aval (EAL87231-EAL87233). Ces

gènes homologues chez Neosartorya fisherii sont distants d’environ 280 kb. Hors, nous

n’avons comptabilisé qu’une vingtaine de gènes, tous absents du génome d’Aspergillus

fumigatus sur une distance de 60 kb.

Cette région délimitée par les zones flanquantes du cluster, fait figure de région neutre,

autorisant l’incorporation de gènes, conférant un avantage pour le champignon mais en aucun

cas, vital pour lui. Il est donc logique de concevoir, qu’il ait pu y avoir, dans cette région, une

incorporation d’un premier cluster (complet ou partiel) homologue de celui de Chaetomium

172

globosum, suivie d’un second cluster (complet ou partiel) homologue de celui d’A.terreus. La

présence de gènes isolés non liés à ces deux clusters témoigne, peut être de l’incorporation

d’autres clusters, suivies de délétions de la quasi-totalité des gènes. Une duplication d’un gène

codant pour un P450 est, certainement survenue dans le cluster de la patuline, puisqu’il

n’existe aucune trace d’un second P450 dans le cluster de la térréine.

Sans pour autant retracer le cours des événements de façon précise, ces données nous

confirment combien l’organisation des clusters liés au métabolisme secondaire est plastique.

Que penser de l’absence des gènes 6msas et idh du génome de B. fulva quand l’espèce la plus

proche possède le cluster complet et fonctionnel pour la synthèse de la patuline ?

Le séquençage complet du génome d’Aspergillus fumigatus a permis de confirmer également,

l’absence totale du cluster de la patuline. Celui-ci semble, en partie, conservé chez les

Penicillium et plus particulièrement, chez la sous espèces penicillium où l’on comptabilise

plus de 13 espèces productrices. De même, certaines espèces non productrices de patuline,

possèdent une partie du cluster, puisque des fragments du gène codant pour l’acide 6

méthylsalicylique ont été amplifiés, clonés et séquencés chez Penicillium roqueforti,

Penicillium aurentiogriseum, Penicillium freii et Penicillium brevicompactum. Pour cette

dernière espèce, l’absence d’expression de ce gène, lors de cultures dans des conditions

habituellement favorables à la synthèse de la patuline, a été démontrée.

La non production de la patuline par Penicillium roqueforti demeure un mystère à élucider

étant donné que les deux espèces les plus proches (P.carneum et P.paneum) synthétisent la

toxine et que P.roqueforti possède une partie du cluster. Il est bien évident que la présence

d’un fragment de gène ne présuppose pas la présence du cluster complet.

Une des premières actions à entreprendre sera de comparer l’expression des 3 gènes isolés

lors de ce travail chez 3 espèces du groupe roqueforti durant une cinétique de production de

173

patuline, afin de vérifier la présence de ces 3 gènes chez P.roqueforti, si ces gènes sont

exprimés.

Enfin, l’étude phylogénétique a révélé un lien fort de parenté entre les différentes séquences

isolées des Penicillium renforçant l’idée que ces gènes constituent le témoignage de la

présence silencieuse du cluster entier ou partiel dans la quasi-totalité des espèces du sous

genre Penicillium. En effet ces espèces sont répartis dans plusieurs sections de ce sous genre,

P. roqueforti (section roqueforti), P. aurentiogriseum et P. freii (section viridicata), P.

brevicompactum (section coronata) d’après la classification établie sur la séquence du gène

codant pour la β-tubuline (Samson et, 2004)

3. PERSPECTIVES D’UN DEVELOPPEMENT DE KIT DE DETECTION

Du point de vue application, cette présence pourrait s’avérer problématique dans la

perspective éventuelle d’un développement d’une méthode de détection par PCR des espèces

réellement productrices de patuline. Il est d’ores et déjà clair que l’utilisation du gène 6msas

n’est pas envisageable dans cette perspective compte tenu du fait que le gène est présent dans

un trop grand nombre d’espèces de Penicillium non productrices et qu’il existe d’autres gènes

codant pour cette enzyme, impliqués dans d’autres voies métabolites, démultipliant le nombre

d’espèces recélant en leurs seins de tels gènes. De part la présence de versicoline, comme

précurseur de l’acide térréique, nous pouvons raisonnablement prédire par exemple

qu’Aspergillus versicolor producteur de versicoline devrait contenir dans son génome, un

gène très homologue au gène Atx d’Aspergillus terreus. Alors quel gène choisir ? Plusieurs

possibilités s’offrent à nous. La logique voudrait que l’on choisisse un gène codant pour une

enzyme beaucoup plus spécifique. Quelle enzyme serait la plus spécifique si ce n’est la

dernière, celle qui cyclise le (E) ascladiol en patuline. D’après nos suppositions, cette étape

serait prise en charge par la GMC oxydoréductase, codée par le gène 15. Mais il existe toutes

174

fois un grand nombre d’enzymes de ce type dans les organismes cellulaires, pour ne pas

écarter une hybridation non spécifique des sondes. Le choix d’une enzyme tout aussi

spécifique mais moins fréquente dans la nature, devrait s’avérer judicieuse. Bien entendu ce

choix dépend de la richesse relative des banques de données telles que GenBank, banques qui

à l’heure actuelle ne représentent qu’une goutte d’eau au regard de l’extraordinaire diversité

du vivant. A ce jour, compte tenu des séquences disponibles dans GenBank, seraient éligibles

l’amidase décarboxylase codée par le gène 14, la protéine hypothétique codée par le gène 11

et l’isoépoxydon déshydrogénase codée par le 7 Ce gène semble le plus prometteur puisqu’il

existe à l’heure actuelle que très peu d’exemples de protéines similaires dans le monde des

champignons.

Quoiqu’il en soit, en conclusion, la découverte du cluster tend à ouvrir un large champs de

perspectives dans le domaine du diagnostic.

175

Conclusion générale

176

L’objectif premier de ce travail entrepris au cour de cette thèse était d’identifier des gènes

intervenant dans la synthèse de la patuline en vue de développer ultérieurement des méthodes

de détection des moisissures productrices de patuline contaminant les denrées alimentaires. A

ce jour deux espèces posent de réels problèmes en termes économiques et sanitaires, dus à

leur capacité à produire la patuline. Le premier, Penicillium expansum constitue le principal

responsable de la présence de patuline dans les pommes et autres produits transformés à bases

de pommes. Le second, Bysssochlamys nivea contamine fréquemment les ensilages,

provoquant des accidents toxicologiques dans les élevages.

Initialement deux espèces modèles, Byssochlamys nivea et P. griseofulvum ont été choisies

afin d’isoler des gènes impliqués dans la biosynthèse de cette toxine, P. expansum ayant été

volontairement écarté en début d’étude, en raison d’un manque de reproductibilité dans sa

capacité à produire de la patuline in vitro. La stratégie a donc consisté à isoler en premier les

gènes chez les deux premières espèces avant d’envisager l’obtention des séquences chez P.

expansum.

Ce travail a permis d’isoler 3 gènes, entièrement séquencés et susceptibles d’intervenir

dans la voie de biosynthèse chez Byssochlamys nivea et un quatrième chez Penicillium

griseofulvum. Le premier gène isolé chez B. nivea code pour une polycétide synthase, l’acide

6-methylsalicylique synthase intervenant au début de la cascade enzymatique aboutissant à la

synthèse de la toxine. Le deuxième gène isolé coderait pour une alcool déshydrogénase

impliquée dans la transformation de l’isoepoxydon en phyllostine, deux précurseurs de la

patuline. Ce gène est exprimé durant la production de la patuline chez plusieurs espèces

productrices dont B. nivea, P. patulum et P. vulpinum. (données non présentées dans cette

thèse)

Parallèlement, une cinétique de production de patuline par Byssochlamys nivea sur 80

jours a été réalisée. Par HPLC, des profils métaboliques ont pu être dressés mettant en

177

évidence la production d’autres métabolites secondaires toxiques comme l’acide

byssochlamique ou l’acide mycophénolique. La production d’acide mycophénolique par une

espèce du genre Byssochlamys n’ayant jamais été décrite dans la littérature, la confirmation

par spectrométrie de masse de l’identité du composé suspect a été réalisée en collaboration

avec le CEA (M. Delaforge). Outre ces métabolites, l’acide 6-methylsalicylique, premier

précurseur de la patuline et produit direct de la 6-MSAS, a été détecté et identifié pendant les

4 premiers jours de la cinétique. Les ARN totaux ont été extraits à chaque point de la

cinétique et l’expression des gènes isolés a été évaluée par RT-PCR. Ces gènes sont fortement

exprimés les 4 premiers jours de culture puis le niveau d’expression décroit juqu’au 9ième

jours où leurs expressions ne sont plus détectées. La forte homologie avec la 6MSAS de P.

griseofulvum ainsi que la corrélation entre l’expression de ce gène et la présence d’acide 6-

methylsalicylique dans les surnageants de culture permettent raisonnablement d’identifier le

1er gène isolé chez B. nivea comme le gène de la 6MSAS.

Suspectant l’implication de l’acide 6-methylsalicylique synthase (6MSAS), dans la

synthèse de l’acide mycophénolique, une étude sur P. brevicompactum, espèce productrice

d’acide mycophénolique, mais non de patuline a été menée. L’identification d’un gène très

homologue à 6msas (Bnpks) chez cette espèce et la mise en évidence de sa non expression

lors de la synthèse d’acide mycophénolique par ce champignon, a conduit à invalider cette

hypothèse.

En amont du gène idh, sur le brin complémentaire, un gène codant pour un transporteur actif

de la famille des ABC transporteurs, a été localisé, isolé et entièrement séquencé chez B.

nivea et P. griseofulvum ainsi que chez P. expansum. La présence d’un gène codant pour un

ABC-transporteur, contigu à un gène codant pour une enzyme du métabolisme secondaire

178

n’est pas aberrante L’hypothèse d’une implication de cette pompe à efflux dans l’évacuation

de la toxine hors du champignon est émise.

Le séquençage du génome d’Aspergillus clavatus, autre espèce productrice de patuline

entrepris par le TIGR «The Institute from Genomic Research » laisse entrevoir une

formidable avancé dans l’étude des bases moléculaires de la patuline. Nous avons localisé les

gènes 6msas, idh et abc, à l’intérieur d’un cluster. Au sein de ce cluster, plusieurs autres

« phases ouvertes de lecture » ont été identifiées, codant respectivement pour des enzymes

dont l’implication semble évidente à la vue des connaissances actuelles sur la caractérisation

chimique de la voie de biosynthèse. En effet, d’après les travaux effectués il y a deux

décennies, portant sur l’élucidation structurale des précurseurs de la patuline, l’implication de

ces types d’enzymes est très probable.

Un long travail de création de mutants monogéniques est envisagée afin d’identifier le

rôle exact de ces différents gènes et ainsi valider le schéma théorique ébauché lors de ce

travail. La priorité sera donnée à l’invalidation du gène de régulation dans un premier temps.

D’ores et déjà des premiers mutants sont en cours de caractérisation.

De même afin de bien déterminer les bornes du cluster de la patuline, les différents

gènes « périphériques » seront recherchés, isolés et séquencés chez nos espèces modèles.

Applications finalisées

Les travaux relatifs à la patuline ont d’ores et déjà apporté des réponses concrètes à des

problèmes industriels. En effet, il était reconnu que les deux principales espèces de

Byssochlamys : B.nivea et B. fulva produisaient de la patuline. Or, une étude réalisée par

l’équipe sur un panel relativement divers de souches de ces espèces d’origine différente,

conclut à la non-production de patuline par B. fulva, sur des bases analytiques et génétiques.

Cette absence de production serait due à l’absence des deux gènes précédemment cités dans le

179

génome de cette espèce, si ce n’est à l’absence totale du cluster de gènes. B. fulva

fréquemment isolée de fruits ne représenterait donc pas une source de contamination par la

patuline, dans les filières de transformation. P. expansum est donc considéré comme la

principale, voire l’unique source de contamination des pommes par la patuline.

Il est donc important maintenant que le cluster de la patuline est en voie de caractérisation,

d’isoler les gènes orthologues chez cette espèce économiquement importante afin de

développer, à terme, des outils de détection permettant une meilleure maîtrise de la

contamination des pommes par la patuline.

180

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200

Annexes

201

Soumission séquence Gène Pgabc (DQ413178)

202

LOCUS bankit778173 4763 bp DNA linear PLN 22-FEB-2006 DEFINITION Penicillium griseofulvum ABC transporter gene, complete cds. ACCESSION 778173 VERSION KEYWORDS . SOURCE Penicillium griseofulvum ORGANISM Penicillium griseofulvum Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; mitosporic Trichocomaceae; Penicillium. REFERENCE 1 (bases 1 to 4763) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S., Oswald,I. and Lebrihi,A. TITLE Cloning and molecular characterization of Penicillium griseofulvum ABC transporter gene involved in Patulin biosynthesis JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 4763) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S., Oswald,I. and Lebrihi,A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (22-FEB-2006) Laboratoire de Pharmacologie-Toxicologie, INRA, 180 Chemin de Tournefeuille, Toulouse 31931 FEATURES Location/Qualifiers source 1..4763 /organism="Penicillium griseofulvum" /mol_type="genomic DNA" /strain="NRRL 2159A" /db_xref="taxon:5078" mRNA join(1..295,359..656,715..955,1016..2081,2135..2400, 2468..4409,4468..4593) 5'UTR 1..52 CDS join(53..295,359..656,715..955,1016..2081,2135..2400, 2468..4409,4468..4593) /codon_start=1 /protein_id="PROT_1_bankit778173" /translation="MVDNYHSSLDGAKTPIQSDGSVQKSDLVETDGPSSASSQIAAPT ESIADSVRNFLEIRQGSIPDDTGVIFDNISAVGSGTGSQDAPTVTSAAQSAFGLLSPL QNRQRKQYSRPILSGFSGTINSGEMLLVLGKPGSGCTTFLKTLSGLWDEYKEIQGELT LGGHLLQDVMAQRPQDILFCAESDDHFPTLTVAETLRFATRARCGPNVSAREIDTMVA QLAKLVGLSNVLNTKVGDAKIRGVSGGERRRVSLAEALATCARLICLDNPTHGLDSST AVEFMEMMREWTTQSRCVAAMSVYQASDAIVSYFDKVLVINSGRQIYYGPVQEAKAYF EDLGFECLSTTTIADFLNVMSADPDVRRAQENKENQVPRTAEEFERAFSASRIYQEMQ TSVQVAKERSKAHPSALVKASSFALPIWHQIWYCASRQFRIVTSDYSLWAVELTTIVI QSIVLGTLFRNQQRTTNSLFIFASSLFYSVLVPALQSMAEFGNGFAQRPLILKQKRYQ ISRPIAYALGLVTTDVVWKVAAICYNIPLYFLTGFQRTAGNFFTWFLIIYLEHLALSM FFRSVAIFSPNMHRAVLPVGVFFNMYVLYTGLYVPAPQMQVWLGWLRYLNPLYYAFES VMVNEFRDLSYQCSASDLAPAGPGYTDMANQVCTVVGSQPGNSLLSGASYIRAQYGFE

203

TSHLWRNVGINAALFIFFALCSGIGMEMLKTPAGKLATVFYKSGPRGIHRRDKVDSET GPVRETVEISGGQINGEHRSQEHQDSDKSHNLAWTNLCLDIKTKDGEQRLLNNLSGSV KSGQLKALMGVSGAGKTTLLNALAGRSIGTLTGTLALNGQVLPTFFRSRMGYVQQQDI HLPTQTVREALQMTARLRRPESISVAEKNAYVEKVIEWLNMEHIADALVGVPGAGLNL EQRKKVSIGVEMASKPEILFLDEPTSGLDGQSAMLIARLLRRLADSGQAILCTIHQPA AELIDQFDKLYLLSRGGNLVYDGPLGPRCHEAIQYFQPRSRPCGPEENPAEYFLSVIG AGSRNDAHMDWASLWNDSQQGKEREKVEQSLVPAVQQAPALEQQSLYSVPFHVQLWVV VQRTWLYYWREPDYVTSKLWMSVGNALLNSLTYLQSPNTERGAYNRVFSAFMSLIVGP PLGLQVQPRFVTLRDIFVHRERESLTYHWMAFVLAAFIVELPFTFLSSLVYWLLWYFP VGYFYAPSRAGYSFLMYELFGVFATSLAQLCASLMPNIEAAFAANGFFFMFCNTFAGT LSPKPVTPSGWRWFYNISPLFYLGEGVTVDVLQDLPIRCDESEVSIFHAANGTTCGQY AQEFLKSATGYLLNPASTADCQYCRYRDGQSYYQQYGYEFAHRHRNIGIFIGFIAFNF TMVLVMTYLTKTRRQ" exon 53..295 /note="Exon 1" intron 296..358 /note="Intron 1" exon 359..656 /note="Exon 2" intron 657..714 /note="Intron 2" exon 715..955 /note="exon 3" intron 956..1015 /note="Intron 3" exon 1016..2081 /note="Exon 4" intron 2082..2134 /note="Intron 4" exon 2135..2400 /note="Exon 5" intron 2401..2467 /note="Intron 5" exon 2468..4409 /note="Exon 6" intron 4410..4467 /note="Intron 6" exon 4468..4593 /note="Exon 7" 3'UTR 4594..4763 BASE COUNT 1150 a 1219 c 1187 g 1207 t ORIGIN 1 aatgtgattc tcgcacggta gggttgtgat agttttgctt cccatctcca taatggtaga 61 taattatcat tcgtcgctgg acggggcaaa gacacctatc cagtccgatg gatcagtgca 121 gaagtctgac ttggttgaga ccgatggacc gtcctcggca tcgtcacaga tcgcagctcc 181 aacggagtca atcgcagaca gcgttcgaaa cttccttgag atacgccagg gcagcattcc 241 agatgatacc ggtgtgatat ttgacaacat atcagccgtg ggaagtggaa ctggagtaag 301 tatcactggt tccaatcgag attccttact aggaagccat ttgattaatg cttggtagtc 361 acaagatgca cccactgtca cgtcggcggc tcaatcagcc tttgggctgt taagtcctct

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421 gcaaaacaga caaagaaagc agtattcccg acccattctc agcggattct caggcacgat 481 aaactccgga gaaatgttgc tggtattagg taaaccaggg agtgggtgta caactttcct 541 gaagacactg tcaggtctgt gggatgaata taaggagata cagggcgaac tcactctggg 601 tggccatctg ttgcaagatg ttatggcaca gcggccacaa gatattctct tttgcggtta 661 gccctcgctt attgctgatt tgtcctttga gaaacatact gatgcctcca ttagctgagt 721 ccgatgacca ctttccgaca ttgaccgtcg cggagaccct gcgttttgca accagagcac 781 gatgcggccc caacgtctcg gctcgtgaga ttgacacaat ggttgctcag ctggccaaac 841 tagttggtct ttcaaatgtc ctgaatacca aggtgggaga tgcgaagatt agaggagtga 901 gcggtggaga gcgacggcgt gtgtctctcg cggaggccct agccacctgt gcccggtaag 961 tggtcccttg tgctcaagta ccaatagtga ttcatcagct aatacatcct cacagtctga 1021 tctgcctgga taatccaaca cacggactgg actcgtccac agcggtcgaa tttatggaga 1081 tgatgcgcga gtggacgacg caaagtcgat gtgtggccgc gatgagcgtc tatcaagcca 1141 gtgatgccat tgtttcctac tttgataaag ttctggtgat caactctggt cgccagatct 1201 actacggccc ggtgcaggaa gcaaaggcat atttcgaaga tctcgggttt gagtgcttat 1261 caaccaccac tattgccgac ttcctcaatg tcatgtccgc tgatccagac gtgagacgag 1321 cccaggaaaa caaagaaaac caggttccac gaacagcgga agagtttgag cgtgcgttca 1381 gtgcgagtcg catctaccag gaaatgcaaa cgtcagttca ggtggccaag gagcgatcca 1441 aagctcaccc cagtgccctt gtcaaagcat catcttttgc tctacctatc tggcaccaga 1501 tttggtactg tgccagccgc caatttcgca tcgtcaccag tgattatagc ttgtgggcgg 1561 tggagctcac caccatcgtc atccagagta tagtattggg tacactgttc cggaaccagc 1621 agcgaactac aaattccctg tttatcttcg catcttcctt gttctactcc gtcctagtgc 1681 ccgccctgca gtccatggcg gaattcggta atggatttgc tcagcggccg ctcatcctga 1741 aacagaaacg atatcagata tctcgcccga ttgcctacgc gcttggcctg gtcacgacgg 1801 atgtcgtatg gaaggtagca gcgatctgtt ataatatccc cttatacttc ttgactggat 1861 tccaacggac cgctgggaac ttcttcacct ggtttttgat tatctacctg gagcatctcg 1921 ccttgtctat gttcttccgc tctgtcgcca tcttctctcc caacatgcat cgagccgtgc 1981 tcccggtggg agttttcttt aacatgtatg tcctttacac gggattatac gtgcctgcac 2041 cacagatgca agtatggctc gggtggttgc gatatctaaa tgtcagtgca gaccgtacca 2101 tatgatttgg attaaccacg ctaacatatc acagccccta tattacgcat ttgagtctgt 2161 gatggtaaat gaattcagag acctgagcta ccagtgcagt gcctcagatc tagccccagc 2221 agggccagga tataccgaca tggccaatca ggtctgtact gtagtaggat cgcagcctgg 2281 gaatagtctc ttgtccgggg cttcatacat tcgtgcccag tacggatttg aaacctccca 2341 cctctggcgg aatgtaggca ttaacgccgc cttgttcata ttctttgccc tttgctctgg 2401 gtaagtcacc aaatgctgaa ccctagtcct ccaagaacct caagactgac actttaaatt 2461 tgaacagaat cgggatggag atgctgaaaa cacctgcggg taaattggct accgtatttt 2521 ataagagcgg tccacgagga atacatcgcc gtgataaagt cgatagcgaa actggaccag 2581 tccgtgagac tgtggagata tctggtggcc aaatcaatgg cgaacatcgg tcacaagaac 2641 accaggactc tgacaagagc cacaatcttg catggaccaa tctttgtctc gacatcaaaa 2701 ccaaggatgg cgagcaacgt ctactgaaca acctaagcgg ctcggtcaaa agtggacaac 2761 tcaaggctct catgggagtt tcaggagccg gaaagacaac cctgttgaat gcactcgccg 2821 gtcgttccat cggcactctc acaggaacac tggcgctcaa cggtcaagtg ctccccacat 2881 tcttccgaag tcgaatgggc tacgtgcaac aacaggacat tcatcttccc acccagaccg 2941 tgcgtgaggc attgcagatg acagcgcgac ttcgacgccc agagtcaatc tccgtagcag 3001 aaaagaatgc ctacgtcgag aaagtgatcg aatggctgaa tatggaacac attgcagacg 3061 cccttgtcgg tgtcccaggg gccggactca accttgaaca acgaaagaaa gtcagtattg 3121 gcgtggagat ggcatcgaaa ccagagattc tcttcctgga tgaaccgact tctggtctcg 3181 atggtcaatc tgctatgttg attgctcgct tgcttcgtcg tctagcagac tcgggtcaag 3241 ctatcctgtg tacgattcat caaccggcag ccgagctcat cgaccagttt gacaagttgt 3301 atctgctgag ccgcggaggt aacttggttt atgatggtcc cttgggaccc cgctgccatg 3361 aggcaatcca gtatttccag ccacggagtc gcccctgtgg cccggaagag aacccagcag 3421 agtattttct gtcggtaatt ggtgctgggt ctcgaaacga cgcccatatg gactgggcta 3481 gtctctggaa tgacagtcag caaggcaagg agcgagagaa ggtggaacag agcctagtcc 3541 ctgccgtaca acaagcacca gcgctggagc aacagtcctt atattcagtg ccgttccatg 3601 tacagctgtg ggtggtggtt cagcgaacgt ggctctatta ctggagagag cctgattatg 3661 tcacgtcaaa gctctggatg agcgtcggca acgccctgct caactccctc acgtacctgc 3721 agtcccctaa cacggagcga ggagcgtaca atcgggtctt ctctgccttc atgtcactca 3781 ttgttggccc cccgctaggg ttgcaggtgc aaccgcgctt cgtaactcta cgggatatct 3841 ttgtccaccg ggagcgggag agcttaacat accactggat ggcgtttgtc ttggctgcat 3901 ttattgtgga attgcccttc acgttcctca gctcgcttgt ctattggcta ttgtggtact 3961 tccccgttgg ctatttctat gccccctcgc gcgcaggata cagtttcctc atgtacgagc 4021 tctttggtgt gtttgccacc agtctggctc agctgtgcgc atctctgatg cccaatatcg

205

4081 aggcagcctt tgcggccaac ggattcttct tcatgttctg caataccttc gcgggtacgc 4141 tttcaccaaa gccggtgaca ccctcgggct ggcgctggtt ttacaacatc tcccctctct 4201 tctatctggg tgagggcgtt actgtggacg tattgcagga tttgcccatc cgatgcgatg 4261 agtccgaggt ttcaatcttc cacgcggcga atggcaccac ctgtggtcaa tacgcccaag 4321 agttcttgaa aagtgccaca ggatatctac tcaaccccgc cagcacggca gattgtcaat 4381 actgtcggta ccgtgatgga caatcatacg taagtagttc tattcagaga gaaagtcaag 4441 acaatctgga aactaatcat tcactagtac caacaatatg gttatgagtt tgctcatcgg 4501 catcgaaaca ttggcatttt cattgggttt attgcattca acttcaccat ggttctggtt 4561 atgacctatc tcaccaaaac gcgccgtcag tgatggaaag ataggatcta ctctgctgta 4621 gccctgggct acagaaaatt ttgtttcggg ggtggttttc tcgttagata gtcaaagggt 4681 tagaaaatta cagaataata gagagatata aatttggata acctattttt cattggatta 4741 ttcgagtatc actctcagtc aca //

206

Soumission séquence Gène Bnabc (EF028634)

207

LOCUS bankit843525 5356 bp DNA linear PLN 27-SEP-2006 DEFINITION Byssochlamys nivea strain NRRL 2615 ABC transporter gene,complete cds. ACCESSION 843525 VERSION KEYWORDS . SOURCE Byssochlamys nivea ORGANISM Byssochlamys nivea Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; Byssochlamys. REFERENCE 1 (bases 1 to 5356) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S. and Lebrihi,A. TITLE Cloning and molecular characterization of Byssochlamys nivea ABC transporter gene involved in patulin biosynthesis JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 5356) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S., Noel,E. and Lebrihi,A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (27-SEP-2006) Laboratoire de pharmacologie-Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique, 180 chemin de Tournefeuille, Toulouse 31931, France FEATURES Location/Qualifiers source 1..5356 /organism="Byssochlamys nivea" /mol_type="genomic DNA" /strain="NRRL 2615" /db_xref="taxon:5093" CDS complement(<1..27) /note="start of Byssochlamys nivea Isoepoxydon dehydrogenase (IDH) gene (AAT00463), partial cds on the complementary strand" /codon_start=1 /protein_id="PROT_2_bankit843525" /translation="MVLETGLKG" 5'UTR complement(28..126) /note="5'UTR of IDH gene" mRNA join(468..819,875..1172,1221..1461,1520..2579,2637..2902, 2969..4931,4982..5356) exon 468..819 /note="Exon 1" CDS join(553..819,875..1172,1221..1461,1520..2579,2637..2902, 2969..4931,4982..5104) /codon_start=1 /protein_id="PROT_1_bankit843525" /translation="MSGHQLNLVTPDLVSHVTTENATPTPSRGSVRKEELIDKSASSE NSSQIPAGEAISEIVRKFFEARNASSQHATSIVFDNVSVEGSGTGSQAAPTIASAAKS GFGVLRPIQNRLGGQPSRPILRGFSGTIAQGEMLLVIGKPGSGCTTFLKTISSMWYEY KGVLGEITLGGHSLTEVAAKRPQDIVFCAESDDHFPTLTVAETLRFAMRARCGPEVPR STIDLMVYQLAKLMGLDSVLDTKVGDAYIRGVSGGERRRASLAEALLTCARLICLDNP

208

TNGLDSSTAVEFIEMMREWTTQSQCVTAMSVYQGSDAIIPYFDKVLVINSGRQIFYGK VSEAKGYFESLGFESLPTTTLSDFLNSMSADPEVRRVQEGREHQVPKSAAEFESAFRS SRFYQELQKSVQIAMGQTNNTAMVKERQFSLPVYLQIWYCACRQFRIITSDYSLWAIE PACIIVQSLVLGTLFRNQKHSTQSLFIFASALFYSVLVPALQSMSEFGNGFAQRPLIL KQKRYQLSSPTAYAYGLIMTDVVWKIAAILYNIPLYFLTGCQRSAGHFFTWFLIVYIE HLALSMFFRSVAVFSSNMHRAVLPVGIFFNMYVLYTGLYVPPPQMQVWLGWLRYLNPL YYAFESVMVNEFRNVSYRCSPSDLVPSGLGYTNIANQVCTVAGSHTGEQLVSGISYLQ AQYGFEKSHLWRNVGINAAIFVFLSFCSGIGMERLKTPAGRLATVFYHGDAANKLRGV GGESDTENGKITEDVPPEASRYGSKDTHHSGDQEQDKNHTLAWTDLRLDIKMKDTERR LLDNLSGWVKSGQLKALMGVSGAGKTTLLNALAGRSSAGTLTGTLALNGQLLPKSFRG RMGYVQQQDIHLPTQTVREALQMTARLRRSESIPLHEKHEYVERVIQWLDMEDIAEAL VGVPGAGLNLEQRKRVSIGVEMAAKPEILFLDEPTSGLDGQSAYSIVRLLRRLADSGQ AVVRTIHQPAAELIGTFDELYLLSRGGKLVYDGPLGMDCGKAIQYFEQHARPCGEKEN PAEYFLEVIGAGTRKEVQADWASLWRQSNLSKERQASEKKLVPADVQAPRPTSSDQQS LYAVPFYTQVAVVVRRTWLYYWREPDYVTSKLWMNVGNSLLNSLTYLQSPATQRGAYN RVFSAFMSLIVGPPLGLQVQPRFVTLREIFVHREKESLTYHWLAFVISAFVVELPYSF LTSLVYWLLWYFPVGYFATPSRAGYSFLMYELFAVFATSLAQLCASLMPNIEAAFAAN GFFFMFCNTFAGTLSPKPLTPSGWRWYYKISPLFYLGEGVTVDVLQDLPLHCQKDEVF VFRPANRTTCGQYAANFLQEATGYLFNPESTDSCQYCRYRDGQSYYLQWGYDFAHRYP NIGIFIGFIAFNFTMVLVMTYVTKIRR" intron 820..874 /note="intron 1" exon 875..1172 /note="Exon 2" intron 1173..1220 /note="Intron 2" exon 1221..1461 /note="Exon 3" intron 1462..1519 /note="Intron 3" exon 1520..2579 /note="Exon 4" intron 2580..2636 /note="Intron 4" exon 2637..2902 /note="Exon 5" intron 2903..2968 /note="Intron 5" exon 2969..4931 /note="Exon 6" intron 4932..4981 /note="intron 6"

209

exon 4982..5356 /note="Exon 7" polyA_site 5356 BASE COUNT 1298 a 1288 c 1346 g 1424 t ORIGIN 1 gcctttcagt cctgtttcca gaaccatctt gatgagttag attaaggtgt ctgctgaggg 61 acggggctga agctcggatg tcaatttgta ctgatgttta tcttaacttc agttctaaca 121 tagcttgaag gataagaccc tgtgagaagg acatactgtc ttataaagga actccaaaat 181 gcgtctcaag ggaatcatct aaatgaggcc aacctgcggc aactccctcg ggctaagagc 241 gacttgtaca gtatggtcca gatggattga acagcgctta cccgattcgg caatccagat 301 cgggactccg aaactccttg gggtaatgcg catcagtcag tcttggatta gaaaccgtgt 361 tgaacaggaa tagttcgact cttcactcat ccacagtgat gcttgctgtg cccatgatat 421 taacattgta tttttttttt actttgaact ctctccttcc tttcgctatg ggggacttga 481 aattctatca ccgttcatca aggcgctatc tcaacccact ggtttctagc gttcagcaca 541 aaactggtca ctatgtctgg ccatcagcta aacctggtaa cccctgacct tgtgtctcat 601 gtaactacag aaaatgctac gcctacgcca tctagaggat ctgtgcggaa agaggaattg 661 atcgataaaa gtgcttcatc tgaaaactcg tcacaaattc ctgcaggaga ggcgatttct 721 gaaattgtac ggaagttctt tgaggcccga aatgcatcca gccaacacgc aacaagcatt 781 gtgttcgaca acgtttctgt cgaaggtagc ggaacaggag tatgtacgac ccgtaaccga 841 cacaataggc gagaaatatt gacaagtggt gaagtctcaa gcagccccaa ctattgcatc 901 tgccgcgaaa tctggtttcg gtgtcctacg tcccattcaa aatcgcttgg gagggcagcc 961 atctcgaccg atcctgaggg ggttttcagg gaccatcgcc cagggagaaa tgcttctcgt 1021 aatcggaaaa cctggtagtg ggtgtaccac gtttctgaag acgatctcct ccatgtggta 1081 tgaatacaaa ggcgtccttg gtgaaatcac tctcggaggg cattccctga cggaggtggc 1141 tgcgaagcgc cctcaggaca ttgtgttctg cggtgagtct ggccagtgac tcgtactaga 1201 tatgagctga tgcatggtag ccgagtctga tgatcacttc ccaactctca cggtagcaga 1261 aacgttacgt tttgcgatgc gagcaagatg tggtccagaa gtaccgagga gtacgatcga 1321 tcttatggtc tatcagctgg caaagctcat gggccttgac agcgtcctcg atacaaaggt 1381 cggtgacgct tatattcgag gggttagtgg aggagagaga cggcgagctt ctttagcaga 1441 agcccttctc acatgcgctc ggtaagttgt ttcgccatta ttcgcggagt tgggaggaag 1501 ctgacggcag gctatatagt ctcatatgtc tggacaatcc gaccaacgga ctagactcct 1561 caactgcggt ggagttcatt gagatgatgc gcgagtggac tactcagagt cagtgcgtaa 1621 ctgccatgag cgtttatcaa ggcagcgatg caatcatacc ttacttcgat aaggtcctcg 1681 tgataaactc tggtcgtcaa attttctacg gcaaggtgag cgaggcgaaa ggatactttg 1741 aaagtttggg ctttgaaagt ttgccgacga cgactctttc ggattttttg aactccatgt 1801 ctgctgaccc agaggtacgg cgggtgcaag aagggcgaga acaccaggtt ccaaaaagtg 1861 ccgctgagtt cgaaagtgct tttcgaagca gccgattcta tcaagagctt cagaagtcgg 1921 tgcagatagc gatgggccag accaacaaca ctgcaatggt caaagagcga cagttttctc 1981 tccctgtcta tctgcagata tggtactgcg cctgccgtca attccggatc atcaccagtg 2041 attacagttt atgggcgatt gagccagcat gcatcattgt tcagagtttg gtgctgggaa 2101 cgttgttcag gaaccagaaa cattccaccc aatcgctctt catctttgca tcggctctgt 2161 tctattcggt actagtccct gctttgcagt caatgagcga atttggaaat ggatttgcac 2221 agagaccact tattctgaaa caaaaaagat accagctaag cagtcctact gcatatgcct 2281 atggcctcat catgacagac gtcgtgtgga agattgcagc aattctctac aacattccac 2341 tatatttttt gaccggctgt caacgatctg ctgggcactt cttcacttgg ttcctgatcg 2401 tctacataga gcatctggct ttgtcgatgt tcttcagatc tgttgcagtt ttctcgtcaa 2461 atatgcatcg agcagtgctc cccgttggca tctttttcaa tatgtatgta ctgtatacgg 2521 ggctctatgt tccccctcca cagatgcaag tgtggctggg atggttgcgg tatctaaatg 2581 taagtgcttg tctctgggta acacggccgg tctatacgtg agctaatgcc atatagccgt 2641 tgtactatgc ctttgaatcg gtcatggtca acgagtttcg aaatgtgagt tacagatgca 2701 gtccgtctga tcttgtacct tcgggcctag gatacacaaa tatagccaat caggtgtgca 2761 ctgttgctgg gtcacacacg ggagagcaac tggtgtccgg gatttcctat cttcaggcac 2821 agtacggatt tgagaaatca cacttgtgga ggaatgttgg gatcaacgct gctattttcg 2881 tctttttatc cttctgttct gggttagtat cctttcgtgg cgtctttgtt aaacactgtc 2941 ggatactaat cttgcattgc tctgttagca tcggaatgga gagactgaag actcctgctg 3001 gccgacttgc aacggttttc tatcatggag acgcggccaa caaattacgc ggtgttggcg 3061 gcgagtcaga cactgagaat ggaaaaatta ccgaggatgt acccccagaa gcgtcaaggt 3121 atggcagtaa ggacacgcat cattccggag accaagagca agacaagaac catactcttg 3181 cctggacaga tcttcgcctc gacatcaaaa tgaaagatac cgagagacgt ttgctcgaca 3241 acctgagcgg ttgggtaaag agtgggcagt tgaaagcatt gatgggcgtg tcgggcgctg 3301 gaaagaccac gctgctcaat gcactcgctg gccgttcctc agccggtaca ctaactggaa

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3361 cactggctct caacggccag cttctaccga aatcctttcg cggaaggatg ggttacgtcc 3421 agcaacagga tattcacctt cctacacaga ccgtcaggga agcgttacag atgacagctc 3481 gattgcgacg ctcagagtcc attccgttgc atgagaagca cgaatatgtc gaaagggtca 3541 tacagtggct cgacatggag gacattgctg aagctcttgt cggtgttcca ggtgccgggc 3601 tcaatcttga acagcggaag agagtaagta tcggtgttga gatggcggca aaaccggaaa 3661 ttctgttcct ggatgagcca acttctggtc ttgatggaca gtctgcctac tccattgtcc 3721 gacttctccg ccgcttggcc gattcgggcc aggctgttgt gcgcacaatc caccagccag 3781 ctgctgagct gatcggaacc tttgacgaac tgtacctcct cagccgaggt gggaaattgg 3841 tgtatgatgg tccccttggt atggattgcg gcaaggcaat tcaatatttc gagcagcatg 3901 ctaggccatg cggtgaaaaa gaaaacccgg ctgagtactt tttggaggtc atcggcgcgg 3961 gtacgcgtaa agaagttcaa gcagactggg ctagtctttg gcgacagagt aaccttagta 4021 aagagaggca ggcgtcggaa aagaagctgg tcccagcgga cgtccaagcg cccagaccta 4081 cttcttctga ccagcaatcg ctgtatgcag ttccctttta cacccaggtg gctgtggtgg 4141 tcagaaggac ctggctctac tattggagag aacctgatta tgtcacctca aagctgtgga 4201 tgaatgtagg aaactcgctg ctgaactcac ttacctacct ccagtcacca gccacgcagc 4261 gaggcgccta caaccgggtc ttctcggcat tcatgtcgct aattgttgga cctccacttg 4321 gtctccaggt ccaaccccga ttcgtgactc tccgcgagat cttcgttcac cgcgaaaagg 4381 agagtctgac gtaccactgg ctggcttttg ttatttcggc ttttgtcgtc gagctgccat 4441 actctttcct cacatcgctt gtgtattggc ttctctggta ctttcccgta ggttatttcg 4501 ctaccccatc acgggccggg tacagctttc tcatgtacga acttttcgcg gtgtttgcca 4561 cgagccttgc gcagctatgc gcatcactca tgccaaacat cgaagcagca tttgcggcga 4621 acggcttctt tttcatgttt tgcaacactt ttgcgggaac cctgtcgcca aaaccgttga 4681 ctccgtctgg ttggcggtgg tattataaaa tatctcctct attttacctg ggtgagggcg 4741 ttacggtaga tgtattgcaa gacttacccc tccattgcca aaaggatgaa gtcttcgtat 4801 tccggccggc gaataggact acctgtgggc agtatgctgc caatttcttg caagaggcca 4861 cagggtattt gttcaaccca gagagcacag attcctgcca atactgccgg tatcgtgatg 4921 gacaatctta tgtaagtcac aaccttaaac gacagcaagg aagcaactga ccatgggata 4981 gtatctgcaa tggggatatg attttgcaca tcggtatccg aacattggta tcttcatcgg 5041 ctttatcgcg tttaatttca ccatggttct cgtgatgact tacgtcacca aaattcgccg 5101 ataaaagccc agttatgtac ggtatttgtg ctttcacaaa atgatagatt ttgtttcgct 5161 gattgataga tgtttgcttc ggagtgttca cccttttgtc tggcgatgat ctgcgttccc 5221 attcgcattg ttgaaatccc agggtatggc ctggagtgtg tctatcccac ccagccctat 5281 caaaattatg cggtcaattc ctcgcataga tatccgtact ccatactaca agcaatccgc 5341 aatatctgat ctcaca //

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Soumission séquence Gène Peabc (EF051699)

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LOCUS bankit846563 5194 bp DNA linear PLN 09-OCT-2006 DEFINITION Penicillium expansum strain NCPT 44 ABC transporter gene, complete cds. ACCESSION 846563 VERSION KEYWORDS . SOURCE Penicillium expansum ORGANISM Penicillium expansum Eukaryota; Fungi; Ascomycota; Pezizomycotina; Eurotiomycetes; Eurotiales; Trichocomaceae; mitosporic Trichocomaceae; Penicillium. REFERENCE 1 (bases 1 to 5194) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S., Dauteloup,C. and Lebrihi,A. TITLE Cloning and molecular characterization of Penicillium expansum ABC transporter gene involved in patulin biosynthesis JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 5194) AUTHORS Puel,O., Tadrist,S., Dauteloup,C. and Lebrihi,A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (09-OCT-2006) Laboratoire de pharmacologie-Toxicologie, Institut National de la Recherche Agronomique, 180 chemin de Tournefeuille, Toulouse 31931, France COMMENT Bankit Comment: opuel@toulouse.inra.fr. FEATURES Location/Qualifiers source 1..5194 /organism="Penicillium expansum" /mol_type="genomic DNA" /strain="NCPT44" /db_xref="taxon:27334" CDS complement(<1..34) /note="Start of Penicillium expansum Isoepoxydon dehydrogenase (IDH) gene, partial cds on the complementary strand" /codon_start=2 /protein_id="PROT_1_bankit846563" /translation="MVLTTGLKGAH" CDS join(493..729,779..1076,1142..1382,1447..2512,2566..2831, 2899..4849,4920..5045) /codon_start=1 /protein_id="PROT_2_bankit846563" /translation="MVDNYHSSLDVAKTPIQSDADAQKSEAETEGPSSKSSQIAAGES IADSVRNFLELRQGGIPDDTGVVFDKISAVGSGTGSQDAPTVTSAAQSAFGLLSPLQN RQRKQYSRPILSGFSGTINPGEMLLVLGKPGSGCTTFLKTLSGLWDEYKEIQGELTLG GHPLLDVMKQRPQDILFCAESDDHFPTLTVAETLRFATRARCGPQVSAREIDTMVTQL AKLVGLGNVLNTKVGDAKIRGVSGGERRRVSLAEALATCARLICLDNPTHGLDSSTAV EFMEMMREWTTQSRCVAAMSVYQASDAIVSYFDKVLIINSGRQIYYGPVRDAKAYFED LGFECLSTTTVADFLNVMSADPDVRRAQENRENQVPRTAEEFERAFSASPIYQEMQKS

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VQVAKERFQTNPSPLVKTSAFALPIWHQIWYCAGRQFRIVTSDYSLWAVELATIVVQS LVLGTLFRNQQRTTSSLFIFASALFYSVLVPALQSMAEFGNGFAQRPLILKQKRYQIS RPIAYALGLVTTDVVWKVAAICYNIPLYFLTGFQRTAGNFFTWFLIIYLEHLALSMFF RSVAIFSPNMHRAVLPVGIFFNMYVLYTGLYVPAPQMQVWLGWLRYLNPLYYAFESVM VNEFRDLSYQCSASDPVPSGLGYNDMAHQVCAVVGSEPGDRLLSGASYIHAQYGFKTS HLWRNVGINAALFVFFALCSGIGMEMLKTPAGQLATVFYKSSPGVTHRRDKIDSETGQ DQGNESSEMSAGQSNDALRLQEHQGPDKSHNLAWTNLCLDIKTKEGDQRLLNNLSGSV KSGQLKALMGVSGAGKTTLLNALAGRSTIGNLTGTLALNGQVLPTFFRSRMGYVQQQD IHLPTQTVREALQMTARLRRPESISVADKNAYVEKVIEWLSMEHIADALVGVPGAGLN LEQRKKVSIGVEMASKPEILFLDEPTSGLDGQSAMLIARLLRRLADSGQAILCTIHQP AAELIDQFDKLYLLSRGGNLVYDGSLGTRCHEAIQYFQPRSRPCGPEENPAEYFLAVI GAGSRNDAHMDWASLWNDSEQGKEREKAEESLVPAAEQAPQLEQQSLYSVPFHVQLWV VVQRTWLYYWREPDYVNSKLWMSVGNSLLNSLTHLQSPNTERGAYNRVFSAFMSLIVG PPLGLQVQPRFVTLRDIFVHRERESLTYHWLAFVLSAFIVELPFTFLSSLVYWLLWYF PVGYFNAPSRAGYSFLMYELFGVFATSLAQLCASLMPNIEAAFAANGFFFMFCNTFAG TLSPKPVTPSGWRWFYNISPLFYLGEGVTVDVLQDLPIRCEESEVSIFYAVNGTTCGQ YAQDFLKTATGYLLNPASTTECQYCRYRDGQSYFQQYGYEFAHRHRNIGVFICFIAFN FTMVLVMTYLTKTRRH" exon 493..729 /note="Exon 1" intron 730..778 /note="Intron 1" exon 779..1076 /note="Exon 2" intron 1077..1141 /note="Intron 2" exon 1142..1382 /note="Exon 3" intron 1383..1446 /note="Intron 3" exon 1447..2512 /note="Exon 4" intron 2513..2565 /note="Intron 4" exon 2566..2831 /note="Exon 5" intron 2832..2898 /note="Intron 5" exon 2899..4849 /note="Exon 6" intron 4850..4919 /note="Intron 6" exon 4920..5194 /note="Exon 7"

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polyA_site 5194 BASE COUNT 1273 a 1316 c 1317 g 1288 t ORIGIN 1 atgggcgcct ttgagaccag ttgtgagaac catgattgtc aataaatttg aaaattgaaa 61 ttgaaattga aattggaatg taaatgggaa tgggaacaag tagaaaacag atcgaataaa 121 gagacttgaa agcggcgaaa taggttccgg cccccttcgg agttcgcagc atttgcttta 181 tagattggaa ataatcattg gctctaagac ccttggagag atacgctagg ccattcacct 241 tcgcattctc cctcgggcca cacgttgaaa gttggcccag aacacttacc cgattgggac 301 tgtctggaaa ctccgtaact cctttaggaa actcacgata tatctagatt ggacagcgaa 361 aggaggaaca ggagatgagc tattgttttg atgtcctttt gaactcgtcc atttccacat 421 tttctagtcg gcaatgtgat tcttggttaa tgaaggggtt gtgatagtat tgcaactttg 481 cctatcttca taatggtaga taattatcat tcgtcgttag acgtggcaaa gacacctatc 541 cagtccgatg ccgatgctca aaagtctgag gccgaaaccg aaggaccgtc gtcgaaatcg 601 tctcaaattg cagcagggga atcgattgca gacagtgtta ggaacttcct tgagctgcgt 661 cagggaggca ttcccgatga taccggggtg gtctttgaca aaatatcagc agtggggagt 721 ggaacaggag taagtaccac tgactccaac tgaaagcatc tcgactaact gttgatagtc 781 gcaagatgca cccaccgtca cgtcggcggc ccagtcggcc ttcgggctgt tgagtcctct 841 gcaaaacaga caaagaaaac agtactctcg acccatcctc agcggattct caggcacaat 901 caaccccgga gaaatgttgt tggtgctagg taaacccggg agtggatgta caacctttct 961 gaaaactctg tcggggctgt gggatgaata taaggagatc cagggagaac tcactctggg 1021 tggtcatcca ctgctagatg tgatgaaaca gcggccccaa gatattctct tctgcggtaa 1081 gtcctcgcgc tttttctgtt tggttctttt gaacacacac tgatagaaat gcctccctta 1141 gccgagtctg atgatcattt ccctacattg accgtggcag agaccctgcg ctttgcgacc 1201 agagcgcgct gcggtcccca agtctcggcc cgtgaaatag acacaatggt tactcagctg 1261 gcaaagctag ttggtcttgg gaatgtccta aataccaagg taggagatgc gaagattcgg 1321 ggagtcagtg gcggagagcg ccggcgagtg tctttggcgg aggccctggc cacctgtgcc 1381 cggtaagtga tctcttctgc tccagtatat accaatgatg attcatcaac tcatacattc 1441 ccacagccta atctgcctgg ataacccaac ccatggactg gactcatcca cggcggtcga 1501 attcatggag atgatgcgcg agtggacgac gcaaagtcga tgtgtggccg cgatgagcgt 1561 ctatcaagcc agtgatgcaa ttgtctccta ctttgacaaa gtcctcataa tcaattctgg 1621 tcgtcagatc tactatggcc cagtccggga cgcaaaggca tattttgaag atctcggatt 1681 tgagtgttta tcgaccacca ccgttgccga cttcctcaat gtgatgtccg ctgatccaga 1741 cgtgcgacga gcccaggaaa acagggaaaa ccaggtccca cgaactgcag aggagtttga 1801 gcgtgcgttt agtgccagcc ccatctacca ggagatgcaa aagtcggttc aggtggccaa 1861 ggagcgattc caaaccaacc ccagtcccct agtcaaaaca tcggcttttg ctctccctat 1921 ctggcatcag atttggtact gtgctggtcg ccaatttcgc attgtaacca gtgattatag 1981 cttgtgggcg gtagagctcg ccaccatcgt cgtccaaagt ctggtgctag gcacgctgtt 2041 ccgaaaccaa cagcgaacga ccagttccct gtttattttc gcatctgctt tgttctactc 2101 tgtcctggtc cctgccctgc agtcaatggc tgaatttggt aatgggttcg cccagagacc 2161 actcatcttg aaacaaaagc gataccagat ctctcgcccg attgcctacg cgctcggttt 2221 ggtcaccacg gacgtcgtgt ggaaggtggc cgcaatctgc tataatatcc ccctatactt 2281 cctgactgga tttcagcgga cggctgggaa cttcttcacc tggttcctaa tcatctacct 2341 ggagcatctc gccctctcaa tgttctttcg ctcagtagcc atcttctctc ccaacatgca 2401 tcgggccgtg ctcccggtgg gtattttctt caacatgtat gtcctataca cggggctcta 2461 cgtgcccgca ccacagatgc aagtatggct cgggtggttg cgatatctaa atgttagtgg 2521 agactgtacc atgaggtttg gataagttat gctaacatat gacagccctt atattatgcg 2581 tttgagtcag tgatggtgaa tgaattcaga gacctgagtt accagtgcag tgcctcggat 2641 ccggtcccat cgggtttggg atataacgac atggcccatc aggtctgtgc tgtagtggga 2701 tcagagcctg gagatcgtct cctgtctgga gcgtcgtaca ttcatgctca gtacggattc 2761 aaaacctctc acctctggag gaatgttgga atcaacgcgg ccctatttgt tttctttgcc 2821 ctttgctctg ggtaagtaat catgcactga agcctagtcc aaagagaaag tccaagactg 2881 acactgaaat ttgaacagaa tcgggatgga gatgctgaaa acacccgcgg gtcaattggc 2941 taccgtgttc tacaagagca gcccgggcgt aacacaccgc cgtgataaaa tcgatagcga 3001 aacaggacaa gaccaaggga atgaaagttc ggagatgtca gctggccaaa gcaatgacgc 3061 acttcggtta caagaacatc agggtcctga caagagccac aatcttgcat ggaccaacct 3121 ctgtctcgac atcaaaacca aggagggcga tcaacgtctg ctaaacaatc tgagtggttc 3181 agtcaagagt ggtcagctca aggctctgat gggtgtctcg ggtgccggca agacaaccct 3241 actgaatgca ctcgctggcc gttccaccat cggaaatctc actggaacac tagcgctcaa 3301 tggtcaagtg ctgccaacat tcttccgaag tcgaatgggc tacgtacaac agcaggatat 3361 tcatcttccc actcagaccg tgcgcgaggc attgcaaatg acagcacgac ttcgacgacc 3421 agagtccatc tccgtagcag acaagaatgc ctacgtcgag aaagtgattg agtggttgag

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